WO2022069780A1 - Método para el diagnóstico y/o pronóstico de esofagitis eosinofílica basado en biomarcadores salivales - Google Patents

Método para el diagnóstico y/o pronóstico de esofagitis eosinofílica basado en biomarcadores salivales Download PDF

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Luis BUJANDA FERNÁNDEZ DE PIEROLA
Koldo GARCÍA ETXEBARRIA
Alfredo LUCENDO VILLARIN
Ainara CASTELLANOS RUBIO
Jose Ramón BILBAO CATALA
Maialen SEBASTIÁN DE LA CRUZ
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Servicio De Salud De Castilla-La Mancha
Administración General Comunidad Autónoma De Euskadi
Consorcio Centro de Investigación Biomédica en Red, M.P.
Universidad Del País Vasco/Euskal Herriko Unibertsitatea
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Definitions

  • the present invention is within the field of diagnosis and/or prognosis of eosinophilic esophagitis (EoE) in saliva, specifically in the diagnosis and/or prognosis by detecting and quantifying the expression level of EoE biomarker genes present in the saliva of subjects.
  • EoE eosinophilic esophagitis
  • Eosinophilic esophagitis is an inflammatory disease characterized by a high number of eosinophils in the esophagus. It causes symptoms such as difficulty swallowing, esophageal food impaction, vomiting, heartburn or regurgitation. In addition, in children, EoE causes food refusal, chest or abdominal pain, irritability, and poor weight gain. Such variable symptoms could be confused with those of other digestive pathologies, such as gastroesophageal reflux disease or celiac disease. Although the exact cause of the disease is unknown, it is known to be a multifactorial pathology to which genetic and environmental factors contribute, the most accepted environmental factors being food allergens.
  • EoE is increasing in incidence and prevalence at a high rate, which may be due in part to increased recognition and awareness of symptoms, but also due to environmental and etiologic changes (Dellon, E. S. and Hirano, I, Gastroenterology 2018; 154( 2): 319-332). Due to this increase, EoE has become an important cause of upper gastrointestinal morbidity in children and adults.
  • EoE One of the problems related to EoE is the delay in diagnosis and consequent delay in treatment.
  • the late diagnosis of the disease and the persistence of a chronic inflammatory response in the esophagus cause phenomena of fibrous remodeling of the esophagus, with collagen deposition in the wall of the esophagus and the formation of strictures, the frequency of which is directly related to the time of evolution of the disease. symptoms and diagnostic delay.
  • an early diagnosis of the disease can positively affect its clinical course.
  • a better understanding of the progressive nature of the disease, its symptom burden over time, and the impact of current therapies on symptom resolution are crucial to guide current clinical practice.
  • Document US2017006711 discloses several possible biomarkers for EoE, as well as a diagnostic method where the concentration of eotaxin-3 in the blood of a patient is analyzed where an elevated level of eotaxin-3 compared to reference values is indicative of EoE.
  • Document US20160304960 discloses a method to differentiate between EoE and chronic esophagitis through the analysis of gene expression levels in a patient's esophageal biopsy.
  • Document WO2015142739 discloses a diagnostic and/or prognostic method that consists in determining the patient's genotype for genetic variants that are associated with the development of EoE.
  • the inventors have detected several EoE biomarkers whose expression level changes significantly in patients suffering from EoE and furthermore said change in expression level is detectable, quickly and efficiently, in a patient's saliva sample. This has allowed the inventors to develop a simple and rapid method of diagnosis and/or prognosis of EoE, and which also allows determining the response to EoE treatment, from a saliva sample, thus avoiding invasive procedures to obtain biological samples. such as biopsies, with which to make the diagnosis and/or prognosis.
  • the present invention refers to biomarkers of EoE, especially the HIPK3, CAST and/or ABHD4 genes in saliva samples, as well as methods of diagnosis and/or prognosis and/or determination of response to EoE treatment using of these biomarkers.
  • a first aspect of the present invention refers to the use of the expression levels of the biomarker HIPK3, CAST and/or ABHD4 for the in vitro diagnosis and/or prognosis of EoE in a saliva sample isolated from a subject, from now on forward the diagnostic use of the invention, preferably where the prognosis is to determine if the subject is in active or remission phase of the disease.
  • Another aspect of the present invention relates to the use of the expression levels of the biomarker HIPK3, CAST and/or ABHD4 to determine in vitro the response to EoE treatment in a saliva sample isolated from a subject, hereinafter the response use of the invention.
  • HIPK3 refers to the human homeodomain-interacting protein kinase 3 gene and comprises SEQ ID NO: 1.
  • the HIPK3 gene encodes for the HIPK3 protein which has 6 isoforms and variants, isoform 2 (V3) (NCBI protein database accession number: NP 001041665.1), isoform 2 (V2) (Accession number: NP 001265091.1), ⁇ soform 2 (V4) (Accession number: PN 001265092.1 ), ⁇ soform 1 (V1 ) (Accession number: PN 005725.3 ), ⁇ soform X1 (Accession number: XP 005252786.1 ), ⁇ soform X1 (Accession number: XP 016872565.1).
  • the expression level is of a gene with at least 85% identity with the HIPK3 gene comprising SEQ ID NO: 1, preferably 86%, 87%, 88%, 89% , 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100% identity.
  • identity refers to the ratio of identical amino acids or nucleotides between two compared peptides/proteins or nucleotide sequences, respectively, along their entire sequence.
  • Methods for comparing sequences are known in the state of the art, and include, without limitation, the BLASTP or BLASTN programs, ClustalW and FASTA. Peptides, proteins or nucleotide sequences with Percentage identities of at least 85% will maintain the same properties as the sequence to which they refer.
  • ABHD4 (Accession number: ENSG00000100439.10) refers to the human gene encoding the abhydrolase domain containing 4,N-acyl phospholipase B- and comprising SEQ ID NO: 2.
  • the ABHD4 gene codes for the ABHD4 protein (Accession number: NP 071343.2) which has an isoform (Accession number: XP 005268043.1).
  • the expression level is of a gene with at least 85% identity with the ABHD4 gene comprising SEQ ID NO: 2, preferably 86%, 87%, 88%, 89% , 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100% identity.
  • the CAST gene has accession number: ENSG000001531 13.23 in GenBank.
  • the diagnostic use of the invention or the response use of the invention further comprises the use of the expression levels of at least one of the biomarkers selected from the list consisting of: PRR15L (number of number: ENSG00000167183.3), SATB1 (accession number: ENSG00000182568.17), SCIN (accession number: ENSG00000006747.15) and any combination thereof, i.e., diagnostic use of the invention or response use of The invention comprises the expression levels of HIPK3 and CAST, HIPK3 and PRR15L, HIPK3 and SATB1, HIPK3 and SCIN, HIPK3 and CAST and SATB1, HIPK3 and CAST and SCIN, HIPK3 and CAST and CAST, HIPK3 and CAST and CAST, HIPK3 and CAST
  • CAST refers to the human gene that codes for Calpastatin, an inhibitor of calcium-dependent cysteine protease and that comprises SEQ ID NO: 3.
  • the CAST gene codes for the CAST protein which has 21 isoforms, ⁇ soform f (Accession Number: NM 001042440.5), ⁇ soform g (Accession Number: NM 001042441.3), ⁇ soform h (Accession Number: NM 001042442.3), ⁇ soform i (Accession Number: NM 001042443.2), ⁇ soform form j (Access number:
  • NM 001042444.2 ⁇ soforma k (Accession Number: NM 001042445.2), ⁇ soforma I (Accession Number: NM 001042446.2), ⁇ soforma m (Accession Number:
  • NM 001190442.1 ⁇ soform n (Accession Number: NM 001284212.3), ⁇ soform o (Accession Number: NM 001284213.3), ⁇ soform p (Accession Number:
  • NM 001330626.2 ⁇ soform q (Accession Number: NM 001330627.2), ⁇ soform r (Accession Number: NM 001330628.2), ⁇ soform s (Accession Number: NM 001330629.2), ⁇ soform t (Accession Number: NM 001330630.1 ), ⁇ soform u (Accession Number: NM 001330632.1 ), ⁇ soform v (Accession Number: NM 001330633.1 ), ⁇ soform w (Accession Number: NM 001330634.1 ), ⁇ soform x (Accession Number: NM 001375317.1 ), isoform a (Accession Number: NM 001750.7) and isoform b (Accession Number: NM_173060.4).
  • the expression level is of a gene with at least 85% identity with the CAST gene comprising SEQ ID NO: 3, preferably 86%, 87%, 88%, 89% , 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100% identity.
  • SATB1 refers to the human gene comprising SEQ ID NO: 4.
  • the SATB1 gene codes for the SATB1 protein which has 8 isoforms and variants, isoform 1 (V2) (Access number: NP 001 124482.1 ), ⁇ soforma 2 (V3) (Accession number: PN 001182399.1 ), ⁇ soforma 2 (Accession number: PN 001309800.1 ), ⁇ soforma 1 (Accession number: PN 001309801 .1 ), ⁇ soforma 1 (Accession number : NP 001309802.1 ), isoform 1 (Accession number: NP 001309803.1 ), isoform 1 (Accession number: NP 001309804.1 ) and isoform 3 (Accession number: NP 001309805.1 ).
  • the expression level is of a gene with at least 85% identity with the SATB1 gene that comprises SEQ ID NO: 4, preferably 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99 % or 100% identity.
  • SCIN refers to the human gene that encodes scinderin, a protein that cleaves and caps actin in a Ca(2+)-dependent manner and that comprises SEQ ID NO: 5.
  • the SCIN gene encodes the SCIN protein which has 2 isoforms and variants, isoform 1 (Accession number: NP 001 106177.1 ) and isoform 2 (Accession number: NP_149119.1 ).
  • the expression level is of a gene with at least 85% identity with the SCIN gene comprising SEQ ID NO: 5, preferably 86%, 87%, 88%, 89% , 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100% identity.
  • PRR15L refers to the human gene encoding a proline-rich protein and comprising SEQ ID NO: 6.
  • the PRR15L gene encodes the PRR15L protein which has 5 isoforms, isoform 1 (Accession number: NP 077296.1 ), ⁇ soform X1 (Accession number: XP 005257723.1 ), ⁇ soform X1 (Accession number: XP 005257720.1 ), ⁇ soform X1 (Accession number: XP 005257721 .1 ), ⁇ soform X1 (Accession number: XP005257722.1).
  • the expression level is of a gene with at least 85% identity with the PRR15L gene comprising SEQ ID NO: 6, preferably 86%, 87%, 88%, 89% , 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100% identity.
  • biomarker refers to a gene whose transcription and/or translation produces a substance whose presence can be objectively determined and quantified in a saliva sample and which is used as an indicator of the presence/ absence of the disease and/or its prognosis.
  • biomarkers described in the present invention are also used as indicators of response to EoE treatment.
  • Disease biomarkers can be detected and/or quantified, meaning that their presence/absence can be detected and/or changes in their quantity or concentration detected.
  • biomarker expression levels in the present invention refers to the process by which information encoded by nucleic acids in genes is transcribed and/or translated into functional products. Such transcription and/or translation can give rise to functional proteins or ribonucleotides (RNAs) such as messenger RNA (mRNA), transfer RNA (tRNA), small nuclear RNAs, or complementary DNA (cDNA).
  • RNAs ribonucleotides
  • mRNA messenger RNA
  • tRNA transfer RNA
  • cDNA complementary DNA
  • expression levels refer to the amount of said proteins, RNAs, cDNAs or protein fragments, RNAs and cDNAs that are present in a sample or obtained from a sample and that can be quantified by units of mass per volume (i.e., milligrams/milliliter) or molar units by volume (i.e., millimoles/milliliter).
  • determining the expression levels of the biomarkers comprises measuring the level of cDNA, or a fragment thereof, the level of mRNA, or a fragment thereof, and/or the level of the protein(s), or a fragment of said protein(s) of the biomarker(s).
  • mRNA fragment or "cDNA fragment” is understood as the nucleotide sequence of the genes associated with the biomarkers that comprise one or more nucleotides absent from the 3' and/or 5' ends with respect to the complete nucleotide sequence of the genes associated with the biomarkers.
  • the biomarker fragment is a sequence fragment that is selected from the list consisting of: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, and any combination thereof.
  • fragment of the biomarker protein is understood as the amino acid sequence of the protein(s) of the biomarker(s) that comprises one or more amino acids absent from its amino end terminal or carboxyl terminal with respect to the complete amino acid sequence of the protein(s) encoded by the biomarker gene(s).
  • the biomarker protein fragment is a fragment of the protein sequence encoded by the sequence selected from the list consisting of: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 , SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, and any combination thereof.
  • diagnosis is understood as the procedure by which a certain disease, nosological entity, syndrome, or any health-disease condition is identified, through the analysis of a series of clinical parameters or characteristic symptoms of said disease, and that distinguish it from other diseases with similar clinical pictures.
  • the disease to be identified is EoE
  • the clinical parameter is the level of expression of the biomarkers described in the present invention.
  • prognosis in the present invention refers to the procedure by which the probability or possibility that a subject develops a certain disease, nosological entity, syndrome, or any health-disease condition is determined, through the analysis of a series of clinical parameters or characteristic symptoms of said disease, and that distinguish it from other diseases with similar clinical pictures.
  • the disease to be identified is EoE
  • the clinical parameter is the level of expression of the biomarkers described in the present invention.
  • prognosis in the present invention also refers to the determination of the probability or possibility that said disease, in the present invention EoE, proceeds to the next stage of its development, in a progression without clinical intervention.
  • such a prognostic assessment may not typically be correct for 100% of the subjects to be diagnosed.
  • the term requires that a statistically significant portion of the subjects can be identified as having the disease or having a predisposition to it.
  • the amount that is statistically significant can be established by a person skilled in the art through the use of different statistical tools, for example, but not limited to, by determining confidence intervals, determining the significance value P, Student's test or discriminant functions. Fisher's, Mann-Whitney nonparametric measures, Spearman's correlation, logistic regression, linear regression, area under the ROC curve (AUC).
  • the confidence intervals are at least 90%, at least 95%, at least 97%, at least 98%, or at least 99%.
  • the p value is less than 0.1, 0.05, 0.01, 0.005 or 0.0001.
  • the present invention allows the disease to be correctly detected differentially in at least 70%, more preferably in at least 80%, much more preferably in at least 90% of the subjects of a certain group or population analyzed.
  • the term "prognosis", in the present invention also encompasses the determination of whether the subject is in the active or remitted phase of the disease.
  • response to treatment refers to the procedure by which it is determined whether a subject who has been diagnosed with a disease will have a "favorable response to treatment", that is, by analyzing a series of clinical parameters or characteristic symptoms of said disease, the favorable evolution of said disease in response to treatment can be determined, where in the present invention a favorable evolution implies a reduction in the number of eosinophils in the wall of the esophagus.
  • said disease is EoE and the clinical parameters are the biomarkers of the present invention.
  • EEES Validated EoE Endoscopic Reference Score
  • the EREES score ranges from 0 to 9, with higher scores indicating more severe endoscopic findings. It may also be measured by the clinical impact of dysphagia with the EoE Symptom Activity Index (EEsAI) which also incorporates avoidance and dietary modification (scores range from 0 to 100, with higher scores indicating more severe symptoms; a score ⁇ 20 indicates remission of symptoms). As will be understood by those skilled in the art, such a determination, although preferred, may not typically be correct for 100% of the subjects to be diagnosed. Expression, however, requires that a statistically significant portion of the subjects can be identified as having a reduction in eosinophil numbers to less than 15 cells per high power field.
  • EEsAI EoE Symptom Activity Index
  • the amount that is statistically significant can be established by a person skilled in the art through the use of different statistical tools, for example, but not limited to, by determining confidence intervals, determining the significance value P, Student's test or Fisher's discriminant functions, non-parametric measures Mann-Whitney correlation, Spearman's correlation, logistic regression, linear regression, area under the ROC curve (AUC).
  • the confidence intervals are at least 90%, at least 95%, at least 97%, at least 98%, or at least 99%.
  • the p value is less than 0.1, 0.05, 0.01, 0.005 or 0.0001.
  • the present invention allows to correctly detect the response to favorable treatment differentially in at least 70%, more preferably in at least 80%, much more preferably in at least 90% of the subjects of a certain group or population. analyzed.
  • the expression "the number of eosinophils in the wall of the esophagus has been reduced to 15 cells or less per high-power field" as used in the present invention refers to the histopathology technique where eosinophils are identified in tissue isolated from the esophagus. subject using light microscopy, where the magnification is at least 40 times.
  • treatment refers to combating the effects caused as a consequence of the disease or pathological condition of interest in a subject (preferably a mammal and, more preferably, a human), including: i) Inhibit the disease or pathological condition, that is, stop its development;
  • EoE eosinophilic esophagitis
  • EoE is an inflammatory disease characterized by a high number of eosinophils in the esophagus. It causes dizzy symptoms, all of them related to a dysfunction of the esophagus, such as difficulty swallowing (dysphagia), food impactions, nausea, vomiting, heartburn or a burning sensation that extends from the epigastrium to the thorax and cervical region, reduced intake, chest or abdominal pain, regurgitation, or weight loss.
  • EoE chronic inflammation that characterizes EoE may develop progressive fibrostenosis and may include stricture of the esophageal lumen.
  • EoE is characterized by a dense infiltration of eosinophilic-type white blood cells in the epithelial lining of the esophagus.
  • EoE is usually determined by an allergic reaction to ingested food.
  • Eosinophils are inflammatory cells that release a variety of chemical signals that inflame the surrounding esophageal tissue.
  • sample is understood as a part or small quantity of a thing that is considered representative of the whole and that is taken or separated from it to subject it to study, analysis or experimentation.
  • said study, analysis or experimentation refers to the determination of the expression level of the biomarkers described in the present invention in a saliva sample.
  • biomarkers it is also an object of the present invention to use methods that allow the detection and/or quantification of the biomarkers identified as targets for the diagnosis and/or prognosis of EoE, or to determine the response to the treatment of EoE.
  • another aspect of the present invention is an in vitro diagnostic or prognostic method of EoE in a subject, hereinafter the diagnostic method of the invention, where the method comprises: a) identifying and quantifying the expression levels of the biomarker HIPK3, CAST and/or ABHD4 in a saliva sample isolated from the subject; and b) comparing the expression levels obtained in step (a) with reference values, where a reduction in the expression levels of the HIPK3, CAST and/or ABHD4 biomarker in the subject's sample with respect to the reference values for said biomarker , is indicative of suffering from or being predisposed to suffering from EoE, and where preferably the prognosis is to determine whether the subject is in the active or remission phase of the disease.
  • step (a) the expression levels of at least one of the biomarkers selected from the list consisting of: PRR15L, SATB1, SCIN and any of their combinations, and where a reduction in expression levels of at least one of the biomarkers in the subject's sample with respect to the reference values for each of them, is indicative of suffering from or being predisposed to suffering from EoE.
  • Another aspect of the present invention relates to a method for determining in vitro the response to EoE treatment in a subject, hereinafter the response method of the invention, where the method comprises: a) identifying and quantifying the HIPK3, CAST, and/or ABHD4 biomarker expression levels in a saliva sample isolated from the subject; and b) comparing the expression levels obtained in step (a) with values obtained for the subject before starting treatment, where an increase in the expression levels of the HIPK3, CAST and/or ABHD4 biomarker in the subject's sample with respect to the values obtained before starting treatment is indicative of a favorable response to treatment.
  • step (a) the expression levels of at least one of the biomarkers that are selected from the list consisting of: PRR15L, SATB1, SCIN and any of their combinations, where an increase in the expression levels of at least one of the biomarkers in the subject's sample with respect to the values obtained before starting treatment, is indicative of a favorable response to treatment.
  • the expression levels of the biomarkers HIPK3, CAST, ABHD4, PRR15L, SATB1 and SCIN are identified and quantified.
  • the expression levels of the biomarkers ABDH4, HIPK3, CAST and optionally PRL15 are identified and quantified to determine if the subject is in the active or remission phase of the disease.
  • the expression levels of the biomarkers of the invention are decreased in those subjects suffering from EoE in remission phase with respect to those subjects suffering from EoE in active phase where the expression levels are higher than in the first group.
  • diagnosis “prognosis”, “treatment response”, “favorable treatment response”, “eosinophilic esophagitis (EoE)”, “biomarker expression levels”, “HIPK3”, “ABHD4”, “CAST” , “PRR15L”, “SATB1", “SCIN” and “sample” have been defined above in relation to the use of the invention and said definitions, as well as the combinations of biomarkers previously described, are valid for the present aspect of the invention and your preferred embodiments.
  • subject refers to any animal, preferably a mammal and includes, but is not limited to, domestic and farm animals, primates, and humans.
  • the subject is a mammal, preferably a human of any gender, age, or race.
  • identify in the method of the invention refers to reporting or detecting the expression of the biomarker(s) described in the present invention in the saliva sample.
  • quantify in the method of the invention refers to the determination of quantity, number, or concentration in unit volume, of the expression level of the biomarker or biomarkers described in the present invention in the saliva sample.
  • the expression “identify and quantify the expression levels” of step a) refers to the procedure of reporting and/or determining the amount of the expression level of the biomarker(s) described in the present invention, by the detection and/or determination of the amount of mRNA, or a fragment of mRNA, cDNA or a fragment of cDNA, or of the protein or a fragment of the protein, encoded by the biomarker(s) described in the present invention.
  • step (a) is carried out by quantifying the levels of protein, messenger RNA or complementary DNA.
  • mRNA fragment mRNA fragment
  • cDNA fragment cDNA fragment
  • protein fragment protein fragment
  • the saliva sample can be treated to physically or mechanically disrupt the cell or tissue structure, releasing the intracellular components into an aqueous or organic solution to isolate and prepare nucleic acids.
  • Nucleic acids are extracted by procedures known to those skilled in the art and commercially available (Sambroock, J., et al. 2012, "Molecular cloning: a Laboratory Manual", 4th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, Vol 1-3.).
  • the quantification of the expression of the biomarkers is carried out.
  • any conventional method can be used within the framework of the invention to detect and quantify the levels of mRNA of the biomarkers or their corresponding cDNA.
  • the mRNA levels of said biomarkers can be quantified by using conventional methods, for example, methods that comprise the amplification of the mRNA and the quantification of the product of the amplification of said mRNA, such as electrophoresis and staining, or alternatively, by means of Southern blot and use of appropriate probes, northern blot and use of specific probes for the mRNA of the biomarker of interest or its corresponding cDNA, mapping with nuclease S1, RT-PCR, hybridization, microarrays, etc.
  • the quantification of messenger RNA levels is carried out by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR).
  • the levels of the cDNA corresponding to the mRNA of the biomarker or biomarkers can also be quantified using conventional techniques; in this case, the method of the invention includes a step of synthesis of the corresponding cDNA by reverse transcription (RT) of the corresponding mRNA followed by amplification and quantification of the product of the amplification of said cDNA.
  • RT reverse transcription
  • Conventional methods of quantifying expression levels can be found, for example, in Sambrook et al. cited ad supra.
  • the quantification of the expression levels is carried out by means of a quantitative polymerase chain reaction (PCR), a DNA or RNA array, or RNA-Seq or Massive Sequencing applied to the study of RNA.
  • the saliva sample isolated from the subject has to be treated to extract the proteins.
  • Methods for extracting or isolating proteins are known to those skilled in the art and are commercially available (Sambroock, J., et al. 2012, cited ad supra).
  • Protein levels can be quantified by any conventional method that allows said protein to be detected and quantified in a sample from a subject.
  • the levels of said protein can be quantified, for example, by using antibodies capable of binding to the target protein and subsequent quantification of the complexes formed.
  • Antibody is understood as a glycoprotein of the gamma globulin type that forms part of the humoral immune system that binds specifically to an antigen.
  • the term “antibody” as used herein includes monoclonal antibodies, polyclonal antibodies, recombinant antibody fragments, combibodies, Fab and scFv fragments of antibodies, as well as ligand-binding domains.
  • label refers to a composition capable of producing a detectable signal indicative of the presence of the labeled molecule.
  • suitable labels include, without limitation, radioisotopes, nucleotide chromophores, enzymes, substrates, fluorescent molecules, chemiluminescent moieties, magnetic particles, bioluminescent moieties, and the like.
  • a label is any composition detectable by spectroscopic, photochemical, biochemical, immunochemical, electrical, optical, or chemical means.
  • assays there are a wide variety of known assays that can be used in the present invention, using unlabeled antibodies (primary antibody) and labeled antibodies (secondary antibody); these techniques include Western-blot or Western blot, ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay RIA (radioimmunoassay), competitive EIA (competitive enzyme-linked immunosorbent assay), DAS-ELISA (double antibody sandwich ELISA), immunocytochemical and immunohistochemical techniques, techniques based on the use of of protein biochips or microarrays that include specific antibodies or assays based on colloidal precipitation in formats such as dipsticks Other ways to detect and quantify proteins include affinity chromatography techniques, ligand binding assays, mass spectrometry, etc.
  • any antibody or reagent known to bind to the target protein with high affinity can be used to detect the amount of it.
  • antibodies or reagents capable of binding to said target protein include, without limitation, polyclonal sera, hybridoma supernatants or monoclonal antibodies, antibody fragments, Fv, Fab, Fab' and F(ab')2, scFv, diabodies, triabodies, tetrabodies and humanized antibodies.
  • the term "reference values" in step b) of the diagnostic method of the invention refers to the values of the expression level of the biomarker HIPK3, CAST and/or ABHD4, or of the biomarkers PRR15L, SATB1 and SCIN, considered normal. in subjects without EoE. These values can be obtained through the quantification of the expression levels of said biomarkers from saliva samples isolated from subjects who do not suffer from EoE and representatives of the population in which the subject susceptible to having or suffering from the disease is found. .
  • the expression "compare the expression levels obtained in step (a) with reference values” in the diagnostic method of the invention refers to the process or procedure of relating, examining or verifying the values obtained for the expression level of the biomarkers, and compare or verify the values obtained in step a) with the values that are expected to be obtained for subjects who do not suffer from the disease, where, according to the diagnostic method of the invention, "a reduction in the expression levels of HIPK3 , CAST and/or ABHD4 in the subject's sample with respect to the reference values for said biomarker, is indicative of suffering from or being predisposed to suffering from EoE”.
  • reduction refers to a decrease, decrease or lowering of the expression level values obtained for a subject suffering from or susceptible to suffering from EoE when these values are equated with the reference values, that is, with values of a subject without EoE.
  • “reduction” in the level of expression is understood when the expression levels of the biomarker are at least 0.1-fold, 0.5-fold, 1-fold, 5-fold, 10-fold, 20-fold, 30-fold. , 40-fold, 50-fold, 60-fold, 70-fold, 80-fold, 90-fold, 100-fold, or even higher relative to biomarker expression levels in a subject not suffering from EoE.
  • the expression "compare the expression levels obtained in step (a) with values obtained before starting treatment” in the response method of the invention refers to the process or procedure of relating, examining or verifying the values obtained for the level of expression of the biomarkers, and compare or verify the values obtained in step a) with the values obtained for said biomarkers, preferably by the diagnostic method of the invention, before starting treatment, where, according to the response method, the invention, "an increase in the expression levels of the biomarker HIPK3, CAST and/or ABHD4 in the subject's sample with respect to the values obtained before starting treatment, is indicative of a favorable response to treatment".
  • the term “increase” refers to an increase, growth or rise in the expression level values obtained for a subject suffering from EoE after starting treatment when these values are equated with the values obtained for the same biomarkers before the treatment. Subject starts treatment.
  • “increase” in the expression level is understood when the expression levels of the biomarker are at least 1.1-fold, 1.5-fold, 2-fold, 5-fold, 10-fold, 20-fold, 30-fold. , 40-fold, 50-fold, 60-fold, 70-fold, 80-fold, 90-fold, 100-fold, or even higher relative to the biomarker expression levels of the subject before starting treatment.
  • the implementation of the uses and methods of the invention comprises the use of probes, primers and/or antibodies, which can form part of a kit.
  • kits or devices for the in vitro diagnosis and/or prognosis of EoE, or for the determination of the response to in vitro treatment of EoE comprising probes, primers and/or specific antibodies for the identification and quantification of the expression levels of the biomarker HIPK3, CAST and/or ABHD4 in isolated saliva samples.
  • the kit of the invention further comprises probes, primers and/or antibodies for the detection of the expression levels of at least one biomarker that is selected from the list consisting of: PRR15L, SATB1, SCIN and any of its combinations.
  • the probes are selected from the list consisting of: SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 25, and any of their combinations.
  • the primers are selected from the list consisting of: SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14 , SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21 , SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, and any combination thereof.
  • probe is understood as the nucleic acid molecule whose nucleotide sequence hybridizes specifically with the nucleotide sequence of the target biomarker.
  • specifically hybridized refers to conditions that allow hybridization of two polynucleotides under highly or moderately stringent conditions.
  • High stringency conditions generally involve: (1) low ionic strength and high temperature for washing, for example 0.015M sodium chloride/0.0015M sodium citrate / 0.1% sodium dodecyl sulfate at 50°C , (2) use during hybridization of a denaturing agent, such as formamide, eg, 50% (v/v) formamide with 0.1% bovine serum albumin/0.1% Ficoll/0.1 % polyvinylpyrrolidone/50 mM sodium phosphate buffer at pH 6.5 with 750 mM sodium chloride, 75 mM sodium citrate at 42°C , or (3) use of 50% formamide, 5xSSC (0.75 M NaCl, 0.075 M sodium citrate), 50 mM sodium phosphate (pH 6.8), 0.1% sodium pyrophosphate, 5 times Denhardt's solution, sonicated salmon sperm DNA (50 mg/mL), 0.1 % SDS, and 10% dextran sulfate at 42°C , with washes at
  • “Conditions moderately stringent tests” include the use of less stringent wash solution and hybridization conditions than those described above. How to carry out hybridization of two nucleotide sequences can be found in Sambroock, J., et al. 2012, cited ad supra.
  • the probes are doubly labeled probes.
  • the term "dual-labeled probe” refers to a single-stranded oligonucleotide sequence that has a label, a quencher (label that absorbs the signal from another label), and a probe sequence arranged between the two labels, and in which marker and quencher are close enough together that the quencher prevents the marker from emitting a detectable signal.
  • the probe sequence generally includes a sequence that is sensitive to Taq polymerase. Typically the probe comprises 20-30 nucleotides, preferably 20-24 nucleotides. Marker molecules and quencher molecules are available commercially. Non-limiting examples are the 6-carboxyfluorescein marker molecule (FAM) and the Iowa Black quenchers (lABkFQ) and ZEN from Integrated DNA Technologies.
  • FAM 6-carboxyfluorescein marker molecule
  • lABkFQ Iowa Black quenchers
  • the probes are triple-labeled probes.
  • the term "triple-labeled probes" refers to a double-labeled probe that additionally contains a second internal quencher located between nucleotides 9 and 10 of the probe sequence.
  • a non-limiting example of an internal quencher is the ZEN from Integrated DNA Technologies.
  • the kit may comprise other useful components in the implementation of the present invention, such as buffers, delivery vehicles, material supports, positive and/or negative control components, etc. .
  • such controls comprise the probes, primers and/or antibodies with modifications for use as controls, for example, probes, primers and/or antibodies that do not recognize the HIPK3 biomarker and/or the rest of the biomarkers described in the present invention.
  • the kits may also include instructions for practicing the object of the invention. These instructions may be present in the aforementioned kits in a variety of ways, one or more of which may be present in the kit.
  • a suitable medium or substrate e.g. e.g., a sheet or sheets of paper on which information is printed, on kit packaging, on a package insert, etc.
  • a suitable medium or substrate e.g. e.g., a sheet or sheets of paper on which information is printed, on kit packaging, on a package insert, etc.
  • Another medium would be a computer-readable medium, eg CD, USB, etc., on which the information has been recorded.
  • Another medium that may be present is a website address that can be used over the Internet to access information at a remote site. Any convenient medium may be present in the kits.
  • kits of the invention for the in vitro diagnosis and/or prognosis of EoE in an isolated sample of saliva from a subject, preferably a human being.
  • Still another aspect of the invention refers to the use of the kit of the invention to determine the response to EoE treatment in an isolated sample of saliva from a subject, preferably a human being.
  • the terms and expressions used in the kit of the invention and in the uses of the kit of the invention, its preferred embodiments were previously defined in relation to the aspects of use and the method of the invention, such definitions being valid and applicable with reference to the invention kit.
  • Fig. 1 Relative expression of differentially expressed genes in saliva.
  • CTRL controls
  • EoE patients with eosinophilic esophagitis.
  • Data represent the mean and standard error for 10 samples from each group. Differences calculated using the t-Student test. *p ⁇ 0.05; **p ⁇ 0.01.
  • Fig. 2. ROC curves of differentially expressed genes.
  • AUC area under the curve.
  • Fig. 3 The expression of candidate genes has been quantified by RT-qPCR using 8ng of RNA per sample and gene. The relative expression values of the candidate genes are shown in this figure. The expression of the candidate genes has been normalized against the expression of GAPDH by the 2 -AACt method. Gene expression in saliva from 73 patients with active EoE, 46 patients with EoE in remission, and 73 control patients was analyzed. + ⁇ 0.1 ; *p ⁇ 0.05;**p ⁇ 0.01 using the t-student test.
  • Fig. 4 Expression values of each candidate gene were combined using logistic regression formulas. In this way, new P-values were obtained for each sample.
  • the P values are shown considering the expression of the six candidate genes (ABDH4, CAST, HIPK3, PRR15L, SATB1 and SCIN) in patients with active EoE and control patients. *p ⁇ 0.05 by t-student.
  • Fig. 5 Expression values of each candidate gene were combined using logistic regression formulas. In this way, new P-values were obtained for each sample.
  • AUC area under the curve
  • Example 1 Analysis of the genes that present reduced expression in patients
  • the recruitment process was carried out through the Gastroenterology Service of the Hospital Universitario Donostia and the Hospital General de Tornellos, where potential patients were screened for their participation in the study.
  • Inclusion criteria o Patients diagnosed with Eosinophilic Esophagitis (EoE), who have presented esophageal impaction and who have at least 15 eosinophils per field in the histological biopsy.
  • EoE Eosinophilic Esophagitis
  • Exclusion criteria o Achalasia or scleroderma; o Evidence of causes other than EoE for esophageal eosinophilia o History of esophageal surgery at any time or esophageal dilation procedures in the last 8 weeks prior to screening o Any relevant systemic disease such as ischemic heart disease, renal failure, chronic lung disease , chronic liver disease, neoplasia, etc. o Patients receiving systemic glucocorticosteroids, immunosuppressants, biological drugs, topical glucocorticosteroids, for another type of disease.
  • Endoscopy findings of the esophagus were classified according to the modified Endoscopic Reference Score (EREFS) classification system, summing the scores of the 5 main fields (edema, exudates, sulci, strictures, and rings). A total score and global assessment of endoscopic EoE activity were made and classified as none, mild, moderate, or severe.
  • ERP Endoscopic Reference Score
  • Saliva samples were collected from EoE cases and healthy controls. The cases used are patients diagnosed by histology of eosinophilic esophagitis without treatment or without response to treatment. The controls did not have no inflammatory disease. Saliva samples from each participant were collected using the DNA/RNA ShieldTM Collection Tube w/ Swab kit (Zymo) following the manufacturer's instructions. Selection of candidate genes
  • RNAseq results deposited in the “GEO” database with the code GSE113341 were analyzed. Based on these data, the expression levels of esophageal biopsies between EoE and healthy controls were compared and a Mann-Whitney U test was performed. Of all the genes analyzed, 69 showed significant differential expression after using False correction.
  • Table 1 Differentially expressed genes and accession numbers.
  • RNA extraction was performed using the DirectZol Miniprep RNA purification kit (Zymo) following the manufacturer's instructions. Briefly, 500ul of saliva sample was subtracted and 1.5 ml of Trizol was mixed. The same volume of ethanol was added and the RNA was cleaned using the column provided in the kit. The RNA was resuspended in 30ul of RNase-free water and the concentration was measured by UV spectrometry using a Nanodrop ND-1000.
  • RT-QPCR was performed using the Quantitec Probe RT-PCR kit (Qiagen) and specific probes for each gene (IDT, Table 2). GAPDH, RPLPO and 18S genes were used as endogenous controls. Reactions were run in duplicate in 5 microliter volumes in 384-well plates using 5ng RNA per reaction in a BioRad CFX thermal cycler.
  • results were analyzed by the deltaCt method to calculate relative expression.
  • the expression of the candidate genes that were detectable in saliva was calculated using the mean of the three endogenous genes.
  • Statistical analyzes were performed using a t-Student and values less than 0.05 were considered significant.
  • 29 of the analyzed genes were detected in the saliva samples. Only those genes that were expressed in at least 60% of the analyzed samples were considered for the analysis. 6 of the 29 genes detected have a significantly reduced relative expression in patients with EoE (Fig. 1). In a validation cohort that included 37 confirmed EoE patients from Hospital Universitario Donostia and Hospital General de Tomelloso and 27 healthy controls, the decrease in HIPK3 and ABHD4 gene expression was confirmed (Fig. 1). In addition, it is observed how the expression of the biomarkers HIPK3 and ABHD4 in saliva, each of them separately, present a sensitivity greater than 75% (79%) and a specificity greater than 60% (65%) with an area under the curve ROC greater than 0.85 (Fig. 2).
  • the expression of the candidate genes was quantified by RT-qPCR using 8ng of RNA per sample and gene. Relative expression values of the candidate genes are shown in Figure 3.
  • the expression of the candidate genes is normalized against GAPDH expression by the 2 -AACt method. Gene expression was analyzed in saliva samples from 73 patients with active EoE, 46 patients with EoE in remission, and 73 control patients. + ⁇ 0.1 ; *p ⁇ 0.05;**p ⁇ 0.01 using the t-student test.
  • AUC area under the curve

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Abstract

La presente invención se encuentra dentro del campo del diagnóstico y/o pronóstico de esofagitis eosinofílica (EoE) en saliva, en concreto en el diagnóstico y/o pronóstico por detección y cuantificación del nivel de expresión de genes biomarcadores de EoE presentes en la saliva de sujetos.

Description

DESCRIPCIÓN
Método para el diagnóstico y/o pronóstico de esofagitis eosinofílica en saliva
La presente invención se encuentra dentro del campo del diagnóstico y/o pronóstico de esofagitis eosinofílica (EoE) en saliva, en concreto en el diagnóstico y/o pronóstico por detección y cuantificación del nivel de expresión de genes biomarcadores de EoE presentes en la saliva de sujetos.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
La esofagitis eosinofílica (EoE) es una enfermedad inflamatoria caracterizada por un elevado número de eosinófilos en el esófago. Provoca síntomas como dificultad para para tragar, impactación alimentaria esofágica, vómitos, pirosis o regurgitación. Además, en los niños la EoE provoca rechazo al alimento, dolor torácico o abdominal, irritabilidad y un bajo aumento de peso. Tales síntomas variables se podrían confundir con los de otras patologías digestivas, como la enfermedad por reflujo gastroesofágica o la enfermedad celiaca. Aunque se desconoce la causa exacta de la enfermedad, se sabe que es una patología multifactorial a la que contribuyen factores genéticos y ambientales, siendo los factores ambientales más aceptados los alérgenos alimentarios.
La EoE está aumentando en incidencia y prevalencia a un ritmo alto, lo que puede deberse en parte a un mayor reconocimiento y conciencia de los síntomas, pero además a cambios ambientales y etiológicos (Dellon, E. S. y Hirano, I, Gastroenterology 2018; 154(2): 319-332). Debido a este aumento la EoE se ha convertido en una causa importante de morbilidad gastrointestinal superior en niños y adultos.
Uno de los problemas relacionados con la EoE está en el retraso en el diagnóstico y consecuente retraso en el tratamiento. El diagnóstico tardío de la enfermedad y la persistencia de una respuesta inflamatoria crónica en el esófago origina fenómenos de remodelación fibrosa del esófago, con depósito de colágeno en la pared del esófago y formación de estenosis, cuya frecuencia se relaciona directamente con el tiempo de evolución de los síntomas y el retraso diagnóstico. Así, un diagnóstico temprano de la enfermedad puede afectar positivamente a su curso clínico. Una mejor comprensión de la naturaleza progresiva de la enfermedad, su carga de síntomas a lo largo del tiempo y el impacto de las terapias actuales en la resolución de los síntomas son cruciales para dirigir la práctica clínica actual.
Los criterios actuales de diagnóstico de EoE requieren la realización de una endoscopia esofágica además de una biopsia esofágica para confirmar la presencia de infiltraciones de eosinófilos en el esófago ante un paciente con síntomas compatibles, haciendo que el proceso diagnóstico se extienda en el tiempo y sea altamente invasivo (Dellon et al., Gastroenterology. 2018; 155(4): 1022-1033).
Se han realizado vahos trabajos para encontrar biomarcadores de EoE y métodos de diagnóstico y/o pronóstico de EoE que sean menos invasivos y más sencillos y rápidos de realizar. El documento US2017006711 divulga vahos posibles biomarcadores para EoE, así como un método de diagnóstico donde se analiza la concentración de eotaxina- 3 en la sangre de un paciente donde un nivel elevado de eotaxina-3 en comparación con valores de referencia es indicativo de EoE. El documento US20160304960 divulga un método para diferenciar entre EoE y esofagitis crónica a través del análisis de los niveles de expresión de genes en una biopsia esofágica del paciente. El documento WO2015142739 divulga un método de diagnóstico y/o pronóstico que consiste en determinar el genotipo del paciente para vahantes genéticas que están asociadas con el desarrollo de EoE.
Los métodos de diagnóstico y/o pronostico mencionados, son métodos invasivos, necesitan equipamiento y personal altamente especializado, y/o necesitan de análisis de datos complicados y engorrosos. Así, de acuerdo con lo anteriormente expuesto, es necesario desarrollar un método de diagnóstico alternativo que permita la detección de EoE de modo rápido, simple y no invasivo.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
Los inventores han detectado vahos biomarcadores de EoE cuyo nivel de expresión cambia significativamente en pacientes que sufren de EoE y que además dicho cambio del nivel de expresión es detectable, de manera rápida y eficaz, en una muestra de saliva del paciente. Esto ha permitido a los inventores desarrollar un método simple y rápido de diagnóstico y/o pronóstico de EoE, y que además permite determinar la respuesta al tratamiento de EoE, a partir de una muestra de saliva, evitando así procedimientos invasivos para obtener muestras biológicas, como biopsias, con las cuales realizar el diagnóstico y/o pronóstico. Así, la presente invención hace referencia a biomarcadores de EoE, especialmente los genes HIPK3, CAST y/o ABHD4 en muestras de saliva, así como a métodos de diagnóstico y/o pronóstico y/o de determinación de respuesta al tratamiento de EoE haciendo uso de dichos biomarcadores.
Un primer aspecto de la presente invención se refiere al uso de los niveles de expresión del biomarcador HIPK3, CAST y/o ABHD4 para el diagnóstico y/o el pronóstico in vitro de EoE en una muestra de saliva aislada de un sujeto, de ahora en adelante el uso diagnóstico de la invención, preferiblemente donde el pronóstico es para determinar si el sujeto está en fase activa o de remisión de la enfermedad.
Otro aspecto de la presente invención se refiere al uso de los niveles de expresión del biomarcador HIPK3, CAST y/o ABHD4 para determinar in vitro la respuesta al tratamiento de la EoE en una muestra de saliva aislada de un sujeto, de ahora en adelante el uso de respuesta de la invención.
El término “HIPK3” (número de acceso: ENSG00000110422.12) hace referencia al gen humano de la proteína cinasa 3 que interactúa con homeodominios - Homeodomain- interacting protein kinase 3 y que comprende la SEQ ID NO: 1. El gen HIPK3 codifica para la proteína HIPK3 la cual tiene 6 ¡soformas y vahantes, ¡soforma 2 (V3) (Número de acceso a la base de datos NCBI protein: NP 001041665.1 ), ¡soforma 2 (V2) (Número de acceso: NP 001265091.1 ), ¡soforma 2 (V4) (Número de acceso: NP 001265092.1 ), ¡soforma 1 (V1 ) (Número de acceso: NP 005725.3 ), ¡soforma X1 (Número de acceso: XP 005252786.1 ), ¡soforma X1 (Número de acceso: XP 016872565.1 ). En una realización particular del uso de la invención el nivel de expresión es de un gen con al menos un 85% identidad con el gen HIPK3 que comprende la SEQ ID NO: 1 , preferiblemente un 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% identidad.
El término "identidad" en la presente invención hace referencia a la proporción de aminoácidos o nucleótidos idénticos entre dos péptidos/proteínas o secuencias de nucleótidos comparados, respectivamente, a lo largo de su secuencia completa. Los métodos para comparar secuencias son conocidos en el estado del arte, e incluyen, sin limitación, a los programas BLASTP o BLASTN, ClustalW y FASTA. Se puede considerar que los péptidos, las proteínas o las secuencias de nucleótidos con identidades porcentuales de al menos el 85% mantendrán las mismas propiedades que la secuencia a la que se refieren.
El término “ABHD4” (número de acceso: ENSG00000100439.10) hace referencia al gen humano que codifica la dominio de la abhidrolasa que contiene 4, N-actil fosfolipasa B - abhydrolase domain containing 4, N-acyl phospholipase B- y que comprende la SEQ ID NO: 2. El gen ABHD4 codifica para la proteína ABHD4 (Número de acceso: NP 071343.2) la cual tiene una ¡soforma (número de acceso: XP 005268043.1 ). En una realización particular del uso de la invención el nivel de expresión es de un gen con al menos un 85% identidad con el gen ABHD4 que comprende la SEQ ID NO: 2, preferiblemente un 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% identidad.
El gen CAST tiene el número de acceso: ENSG000001531 13.23 en GenBank.
Además de los genes HIPK3, CAST y ABHD4, los inventores también detectaron otros biomarcadores en muestras de saliva aisladas, los cuales en combinación con HIPK3, CAST y/o ABHD4, permiten el diagnóstico y/o pronóstico de EoE. Así, en una realización particular, el uso de diagnóstico de la invención o el uso de respuesta de la invención comprende además el uso de los niveles de expresión de al menos uno de los biomarcadores seleccionados de la lista que consiste en: PRR15L (número de acceso: ENSG00000167183.3), SATB1 (número de acceso: ENSG00000182568.17), SCIN (número de acceso: ENSG00000006747.15) y cualquiera de sus combinaciones, es decir, el uso de diagnóstico de la invención o el uso de respuesta de la invención comprende los niveles de expresión de HIPK3 y CAST, HIPK3 y PRR15L, HIPK3 y SATB1 ,HIPK3 y SCIN, HIPK3 y CAST y SATB1 , HIPK3 y CAST y SCIN, HIPK3 y CAST y PRR15L, HIPK3 y SATB1 y SCIN, HIPK3 y SATB1 y PRR15L, HIPK3 y SCIN y PRR15L, HIPK3 y CAST y SATB1 y SCIN, HIPK3 y CAST y SATB1 y PRR15L, HIPK3 y CAST y SCIN y PRR15L, HIPK3 y SATB1 y SCIN y PRR15L, ABHD4 y CAST, ABHD4 y PRR15L, ABHD4 y SATB1 , ABHD4 y SCIN, ABHD4 y CAST y SATB1 , ABHD4 y CAST y SCIN, ABHD4 y CAST y PRR15L, ABHD4 y SATB1 y SCIN, ABHD4 y SATB1 y PRR15L, ABHD4 y SCIN y PRR15L, ABHD4 y CAST y SATB1 y SCIN, ABHD4 y CAST y SATB1 y PRR15L, ABHD4 y CAST y SCIN y PRR15L, ABHD4 y SATB1 y SCIN y PRR15L, ABHD4 y CAST y SATB1 y SCIN y PRR15L, HIPK3 y ABHD4, HIPK3 y ABHD4 y CAST, HIPK3 y ABHD4 y SATB1 , HIPK3 y ABHD4 y SCIN, HIPK3 y ABHD4 y PRR15L, HIPK3 y ABHD4 y CAST y SATB1 , HIPK3 y ABHD4 y CAST y SCIN, HIPK3 y ABHD4 y CAST y PRR15L, HIPK3 y ABHD4 y SATB1 y SCIN, HIPK3 y ABHD4 y SATB1 y PRR15L, HIPK3 y ABHD4 y SCIN Y PRR15L, HIPK3 y ABHD4 y CAST y SATB1 y SCIN, HIPK3 y ABHD4 y CAST y SATB1 y PRR15L, HIPK3 y ABHD4 y CAST y SCIN y PRR15L, HIPK3 y ABHD4 y SATB1 y SCIN y PRR15L o HIPK3 y ABHD4 y CAST y SATB1 y SCIN y PRR15L.
El término “CAST” hace referenda al gen humano que codifica la Calpastatina, un inhibidor de la proteasa cisteínica dependiente de calcio y que comprende la SEQ ID NO: 3. El gen CAST codifica para la proteína CAST la cual tiene 21 ¡soformas, ¡soforma f (Número de acceso: NM 001042440.5), ¡soforma g (Número de acceso: NM 001042441 .3), ¡soforma h (Número de acceso: NM 001042442.3), ¡soforma i (Número de acceso: NM 001042443.2), ¡soforma j (Número de acceso:
NM 001042444.2), ¡soforma k (Número de acceso: NM 001042445.2), ¡soforma I (Número de acceso: NM 001042446.2), ¡soforma m (Número de acceso:
NM 001190442.1 ), ¡soforma n (Número de acceso: NM 001284212.3), ¡soforma o (Número de acceso: NM 001284213.3), ¡soforma p (Número de acceso:
NM 001330626.2), ¡soforma q (Número de acceso: NM 001330627.2), ¡soforma r (Número de acceso: NM 001330628.2), ¡soforma s (Número de acceso: NM 001330629.2), ¡soforma t (Número de acceso: NM 001330630.1 ), ¡soforma u (Número de acceso: NM 001330632.1 ), ¡soforma v (Número de acceso: NM 001330633.1 ), ¡soforma w (Número de acceso: NM 001330634.1 ), ¡soforma x (Número de acceso: NM 001375317.1 ), ¡soforma a (Número de acceso: NM 001750.7) e ¡soforma b (Número de acceso: NM_173060.4). En una realización particular del uso de la invención el nivel de expresión es de un gen con al menos un 85% identidad con el gen CAST que comprende la SEQ ID NO: 3, preferiblemente un 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% identidad.
El término “SATB1” hace referencia al gen humano que comprende la SEQ ID NO: 4. El gen SATB1 codifica para la proteína SATB1 la cual tiene 8 ¡soformas y variantes, ¡soforma 1 (V2) (Número de acceso: NP 001 124482.1 ), ¡soforma 2 (V3) (Número de acceso: NP 001182399.1 ), ¡soforma 2 (Número de acceso: NP 001309800.1 ), ¡soforma 1 (Número de acceso: NP 001309801 .1 ), ¡soforma 1 (Número de acceso: NP 001309802.1 ), ¡soforma 1 (Número de acceso: NP 001309803.1 ), ¡soforma 1 (Número de acceso: NP 001309804.1 ) e ¡soforma 3 (Número de acceso: NP 001309805.1 ). En una realización particular del uso de la invención el nivel de expresión es de un gen con al menos un 85% identidad con el gen SATB1 que comprende la SEQ ID NO: 4, preferiblemente un 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% identidad.
El término “SCIN” hace referencia al gen humano que codifica la scinderina, una proteína que corta y tapa la actina de modo dependiente de Ca(2+) y que comprende la SEQ ID NO: 5. El gen SCIN codifica para la proteína SCIN la cual tiene 2 ¡soformas y vahantes, ¡soforma 1 (Número de acceso: NP 001 106177.1 ) e ¡soforma 2 (Número de acceso: NP_149119.1 ). En una realización particular del uso de la invención el nivel de expresión es de un gen con al menos un 85% identidad con el gen SCIN que comprende la SEQ ID NO: 5, preferiblemente un 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% identidad.
El término “PRR15L” hace referencia al gen humano que codifica una proteína rica en prolina y que comprende la SEQ ID NO: 6. El gen PRR15L codifica para la proteína PRR15L la cual tiene 5 ¡soformas, ¡soforma 1 (Número de acceso: NP 077296.1 ), ¡soforma X1 (Número de acceso: XP 005257723.1 ), ¡soforma X1 (Número de acceso: XP 005257720.1 ), ¡soforma X1 (Número de acceso: XP 005257721 .1 ), ¡soforma X1 (Número de acceso: XP 005257722.1 ). En una realización particular del uso de la invención el nivel de expresión es de un gen con al menos un 85% identidad con el gen PRR15L que comprende la SEQ ID NO: 6, preferiblemente un 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% identidad.
El experto en la materia entiende que las mutaciones en la secuencia de nucleótidos de los genes que dan lugar a sustituciones conservativas de aminoácidos en posiciones no críticas para la funcionalidad de la proteína son mutaciones evolutivamente neutras que no afectan a su estructura global ni a su funcionalidad, dando lugar a vahantes de la proteína. Dichas variantes caen dentro del ámbito de la presente invención, es decir, aquellas vahantes de la proteínas codificadas por los genes HIPK3, ABHD4, CAST, SATB1 , SCIN y PRR15L que presentan inserciones, deleciones o modificaciones de uno o más aminoácidos con respecto a la secuencias SEQ ID NO: 1 - 6, respetivamente.
El término "biomarcador", tal como se utiliza en la presente invención hace referencia a un gen cuya transcripción y/o traducción produce una sustancia cuya presencia puede determinarse y cuantificarse objetivamente en una muestra de saliva y que se utiliza como indicador de la presencia/ausencia de la enfermedad y/o del pronóstico de la misma. Además, los biomarcadores descritos en la presente invención también se utilizan como indicadores de la respuesta al tratamiento de EoE. Los biomarcadores de la enfermedad pueden ser detectados y/o cuantificados, lo que significa que se puede detectar su presencia/ausencia y/o detectar cambios en su cantidad o concentración.
La expresión “niveles de expresión del biomarcador” en la presente invención hace referencia al proceso por medio del cual la información codificada por los ácidos nucleicos en los genes es transcripta y/o traducida en productos funcionales. Tal transcripción y/o traducción puede originar proteínas o ácidos ribonucleótidos (ARN) funcionales como ARN mensajero (ARNm), ARN de transferencia (ARNt), pequeños ARN nucleares o ADN complementar (ADNc). Así, los niveles de expresión se refieren a la cantidad de dichas proteínas, ARNs, ADNc o fragmentos de proteínas, ARNs y ADNc que están presentes en una muestra o se obtienen de una muestra y que se pueden cuantificar por unidades de masa por volumen (i.e., miligramos/mililitro) o unidades molares por volumen (i.e., milimoles/mililitro). Métodos para cuantificar los niveles de expresión de los biomarcadores son descritos más abajo en esta descripción en relación a los métodos de la invención, siendo igualmente válidos en relación al uso de la invención.
Así, en una realización preferida del uso diagnóstico de la invención o del uso de respuesta de la invención, la determinación de los niveles de expresión de los biomarcadores comprende medir el nivel de ADNc, o un fragmento del mismo, el nivel de ARNm, o un fragmento del mismo, y/o el nivel de la proteína(s), o un fragmento de dicha(s) proteína(s) de lo(s) biomarcador(es).
En la presente invención se entiende por “fragmento de ARNm” o “fragmento de ADNc” a la secuencia de nucleótidos de los genes asociados a los biomarcadores que comprenden uno o más nucleótidos ausentes de los extremos 3’ y/o 5’ con respecto a la secuencia de nucleótidos completa del genes asociados a los biomarcadorores. En una realización preferida del uso de diagnóstico de la invención o del uso de respuesta de la invención, el fragmento del biomarcador es un fragmento de la secuencia que se selecciona de la lista que consiste en: SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO:6, y cualquiera de sus combinanciones.
De forma análoga, en la presente invención se entiende por “fragmento de la proteína del biomarcador” a la secuencia de aminoácidos de la(s) proteína(s) de lo(s) biomarcador(es) que comprende uno o más aminoácidos ausentes de su extremo amino terminal o carboxilo terminal con respecto a la secuencia de aminoácidos completa de la proteína la(s) codificada(s) pelo(s) gen(es) biomarcador(es). En una realización preferida, el fragmento de la proteína del biomarcador es un fragmento de la secuencia proteica codificada por la secuencia que se selecciona de la lista que consiste en: SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO:6, y cualquiera de sus combinándonos.
En la presente invención se entiende por “diagnóstico” el procedimiento por el cual se identifica una determinada enfermedad, entidad nosológica, síndrome, o cualquier condición de salud-enfermedad, mediante el análisis de una serie de parámetros clínicos o síntomas característicos de dicha enfermedad, y que la distinguen de otras enfermedades con cuadros clínicos semejantes. En la presente invención la enfermedad a identificar es EoE, y el parámetro clínico es el nivel de expression de los biomarcadores descritos en la presente invención.
El término “pronóstico” en la presente invención se refiere al procedimiento por el cual se determina la probabilidad o posibilidad de que un sujeto desarrolle una determinada enfermedad, entidad nosológica, síndrome, o cualquier condición de salud-enfermedad, mediante el análisis de una serie de parámetros clínicos o síntomas característicos de dicha enfermedad, y que la distinguen de otras enfermedades con cuadros clínicos semejantes. En la presente invención la enfermedad a identificar es EoE, y el parámetro clínico es el nivel de expression de los biomarcadores descritos en la presente invención. Además, el término “pronóstico” en la presente invención también se refiere a la determinación de la probabilidad o posibilidad de que dicha enfermedad, en la presente invención EoE, prosiga al estado siguiente de su desarrollo, en una progresión sin intervención clínica. Como entenderán los expertos en la materia, tal valoración de pronóstico, aunque se prefiere que sea, normalmente puede no ser correcta para el 100% de los sujetos que se va a diagnosticar. El término, sin embargo, requiere que una parte estadísticamente significativa de los sujetos se pueda identificar como que padecen la enfermedad o que tienen predisposición a la misma. La cantidad que es estadísticamente significativa puede ser establecida por un experto en la materia mediante el uso de diferentes herramientas estadísticas, por ejemplo, pero sin limitarse, mediante la determinación de intervalos de confianza, determinación del valor significación P, test de Student o funciones discriminantes de Fisher, medidas no paramétricas de Mann Whitney, correlación de Spearman, regresión logística, regresión lineal, área bajo la curva de ROC (AUC). Preferiblemente, los intervalos de confianza son al menos del 90%, al menos del 95%, al menos del 97%, al menos del 98% o al menos del 99%. Preferiblemente, el valor de p es menor de 0,1 , de 0,05, de 0,01 , de 0,005 o de 0,0001. Preferiblemente, la presente invención permite detectar correctamente la enfermedad de forma diferencial en al menos el 70%, más preferiblemente en al menos el 80%, mucho más preferiblemente en al menos el 90% de los sujetos de un determinado grupo o población analizada. El término “pronóstico”, en la presente invención, también engloba la determinación de si el sujeto está en fase activa o de remisión de la enfermedad.
El término “respuesta al tratamiento” tal como se usa en la presente invención hace referencia al procedimiento por cual se determina si un sujeto al cual se ha diagnosticado una enfermedad tendrá una “respuesta a tratamiento favorable”, es decir, mediante el análisis de una serie de parámetros clínicos o síntomas característicos de dicha enfermedad se puede determinar la evolución favorable de dicha enfermedad en respuesta al tratamiento, donde en la presente invención una evolución favorable implica una reducción en el número de eosinófilos en la pared del esófago. En la presente invención dicha enfermedad es EoE y los parámetros clínicos son los biomarcadores de la presente invención. Dichos parámetros clínicos permiten determinar si hay una posibilidad de 60 % o más de que habrá una respuesta a tratamiento favorable, es decir, si el número de eosinófilos en la pared del esófago se ha reducido a 15 o menos eosinófilos por campo de gran aumento preferiblemente transcurridos 3 meses desde el diagnóstico inicial o de la no respuesta al tratamiento. La respuesta también se podrá medir por los hallazgos endoscópicos de EoE, medidos con la puntuación de referencia endoscópica de EoE validada (EREES). Este puntaje cuantifica cinco hallazgos endoscópicos clave: exudados (puntaje 0-2), anillos esofágicos (puntaje 0-3), edema (puntaje 0-1 ), surcos (puntaje 0-2) y estenosis (puntaje 0-1 ). El puntaje EREES varía de 0 a 9, con puntajes más altos que indican hallazgos endoscópicos más severos. También se podrá medir por la repercusión clínica de la disfagia con el índice de actividad de síntomas EoE (EEsAI) que también incorpora evitación y modificación de la dieta (los puntajes varían de 0 a 100, con puntajes más altos indican síntomas más graves; un puntaje <20 indica remisión de los síntomas). Como entenderán los expertos en la materia, tal determinación, aunque se prefiere que sea, normalmente puede no ser correcta para el 100% de los sujetos que se va a diagnosticar. La expression, sin embargo, requiere que una parte estadísticamente significativa de los sujetos se pueda identificar como que tendrán una reducción del número de eosinófilos a menos de 15 células por campo de gran aumento. La cantidad que es estadísticamente significativa puede ser establecida por un experto en la materia mediante el uso de diferentes herramientas estadísticas, por ejemplo, pero sin limitarse, mediante la determinación de intervalos de confianza, determinación del valor significación P, test de Student o funciones discriminantes de Fisher, medidas no paramétricas de Mann Whitney, correlación de Spearman, regresión logística, regresión lineal, área bajo la curva de ROC (AUC). Preferiblemente, los intervalos de confianza son al menos del 90%, al menos del 95%, al menos del 97%, al menos del 98% o al menos del 99%. Preferiblemente, el valor de p es menor de 0,1 , de 0,05, de 0,01 , de 0,005 o de 0,0001 . Preferiblemente, la presente invención permite detectar correctamente la respuesta a tratamiento favorable de forma diferencial en al menos el 70%, más preferiblemente en al menos el 80%, mucho más preferiblemente en al menos el 90% de los sujetos de un determinado grupo o población analizada.
La expression “el número de eosinófilos en la pared del esófago se ha reducido a 15 células o menos por campo de gran aumento” tal como se utiliza en la presente invención hace referencia a la técnica de histopatologia donde se identifican eosinófilos en el tejido aislado del sujeto recurriendo a microscopía óptica, en donde el aumento de magnificación es de al menos 40 veces.
El término "tratamiento", tal como se utiliza en la presente invención, se refiere a combatir los efectos causados como consecuencia de la enfermedad o condición patológica de interés en un sujeto (preferentemente un mamífero y, más preferentemente, un humano), incluyendo: i) Inhibir la enfermedad o condición patológica, es decir, detener su desarrollo;
¡i) Aliviar la enfermedad o el estado patológico, es decir, provocar la regresión de la enfermedad o el estado patológico o su sintomatología; iii) Estabilizar la enfermedad o el estado patológico.
Como se ha referido la enfermedad que se diagnostica, pronostica o determina la respuesta al tratamiento en la presente invención es la “esofagitis eosinofílica” o “EoE”. La EoE es una enfermedad inflamatoria caracterizada por un elevado número de eosinófilos en el esófago. Provoca síntomas vahados todos ellos referidos a una disfunción del esófago, como dificultad en tragar (disfagia), impactaciones alimentarias, náuseas, vómitos, pirosis o sensación de quemazón que se extiende desde el epigastrio hacia el tórax y región cervical, reducción de la ingesta, dolor torácico o abdominal, regurgitación, o pérdida de peso. Sin intervención clínica la inflamación crónica que caracteriza la EoE puede desarrollar una fibrostenosis progresiva y puede incluir la estenosis de la luz del esófago. A nivel tisular, la EoE se caracteriza por una infiltración densa de glóbulos blancos del tipo eosinófilo en el revestimiento epitelial del esófago. La EoE generalmente viene determinada por una reacción alérgica a los alimentos ingeridos. Los eosinófilos son células inflamatorias que liberan una variedad de señales químicas que inflaman el tejido esofágico circundante.
En la presente invención se entiende por “muestra” a una parte o cantidad pequeña de una cosa que se considera representativa del total y que se toma o se separa de ella para someterla a estudio, análisis o experimentación. En la presente invención, dicho estudio, análisis o experimentación hace referencia a la determinación del nivel de expresión de los biomarcadores descritos en la presente invención en una muestra de saliva.
Para hacer uso del nivel de expresión de los biomarcadores mencionados anteriormente es también un objeto de la presente invención métodos que permitan la detección y/o cuantificación de los biomarcadores identificados como dianas para el diagnóstico y/o pronóstico de EoE, o para determinar la respuesta al tratamiento de la EoE.
Así, otro aspecto de la presente invención es un método de diagnóstico o pronóstico ¡n vitro de EoE en un sujeto, de ahora adelante el método diagnóstico de la invención, donde el método comprende: a) identificar y cuantificar los niveles de expresión del biomarcador HIPK3, CAST y/o ABHD4 en una muestra de saliva aislada del sujeto; y b) comparar los niveles de expresión obtenidos en la etapa (a) con valores de referencia, donde una reducción en los niveles de expresión del biomarcador HIPK3, CAST y/o ABHD4 en la muestra del sujeto respecto a los valores de referencia para dicho biomarcador, es indicativo de padecer o estar predispuesto a padecer EoE, y donde preferiblemente el pronóstico es para determinar si el sujeto está en fase activa o de remisión de la enfermedad.
En una realización preferida del método de diagnóstico de la invención en la etapa (a) se identifican y cuantifican además los niveles de expresión de al menos uno de los biomarcadores que se selecciona de la lista que consiste en: PRR15L, SATB1 , SCIN y cualquiera de sus combinaciones, y donde una reducción en los niveles de expresión de al menos uno de los biomarcadores en la muestra del sujeto respecto a los valores de referenda para cada uno de ellos, es indicativo de padecer o estar predispuesto a padecer EoE.
Otro aspecto de la presente invención se relaciona con un método para determinar ¡n vitro la respuesta al tratamiento de la EoE en un sujeto, de ahora en adelante el método de respuesta de la invención, donde el método comprende: a) identificar y cuantificar los niveles de expresión del biomarcador HIPK3, CAST y/o ABHD4 en una muestra de saliva aislada del sujeto; y b) comparar los niveles de expresión obtenidos en la etapa (a) con valores obtenidos para el sujeto antes de iniciar el tratamiento, donde un aumento en los niveles de expresión del biomarcador HIPK3, CAST y/o ABHD4 en la muestra del sujeto respecto a los valores obtenidos antes de iniciar el tratamiento es indicativo de una respuesta a tratamiento favorable.
En una realización preferida del método de respuesta de la invención en la etapa (a) se identifican y cuantifican además los niveles de expresión de al menos uno de los biomarcadores que se seleccionan de la lista que consiste en: PRR15L, SATB1 , SCIN y cualquiera de sus combinaciones, donde un aumento en los niveles de expresión de al menos uno de los biomarcadores en la muestra del sujeto respecto a los valores obtenidos antes de iniciar el tratamiento, es indicativo de una respuesta a tratamiento favorable.
En una realización preferida de los usos y métodos de la presente invención, se identifican y cuantifican los niveles de expresión de los biomarcadores HIPK3, CAST, ABHD4, PRR15L, SATB1 y SCIN.
En otra realización preferida de los usos y métodos de la presente invención, se identifican y cuantifican los niveles de expresión de los biomarcadores ABDH4, HIPK3, CAST y opcionalmente PRL15 para determinar si el sujeto está en fase activa o de remisión de la enfermedad.
Los niveles de expresión de los biomarcadores de la invención se encuentran disminuidos en aquellos sujetos que padecen EoE en fase de remisión con respecto a aquellos sujetos que padecen EoE en fase activa donde los niveles de expresión están más elevados que en el primer grupo. Los términos “diagnóstico”, “pronóstico”, “respuesta al tratamiento”, “respuesta a tratamiento favorable”, “esofagitis eosinofílica (EoE)”, “niveles de expresión del biomarcador”, “HIPK3”, “ABHD4”, “CAST”, “PRR15L”, “SATB1”, “SCIN” y “muestra” se han definido anteriormente con relación al uso de la invención y dichas definiciones, así como las combinaciones de biomarcadores descritas previamente, son válidas para el presente aspecto de la invención y sus realizaciones preferidas.
El término “sujeto”, tal como se utiliza en la presente descripción, hace referencia a cualquier animal, preferiblemente un mamífero e incluye, pero no se limita a, animales domésticos y de granja, primates, y humanos. En una realización preferida, el sujeto es un mamífero, preferibelmente un humano de cualquier sexo, edad o raza.
El término “identificar” en el método de la invención se refiere al reportar o detectar la expresión del o de los biomarcadores descritos en la presente invención en la muestra de saliva. El término “cuantificar” en el método de la invención se refiere a la determinación de cantidad, número, o concentración en unidad de volumen, del nivel de expresión del o de los biomarcadores descritos en la presente invención en la muestra de saliva.
Así, en el método de diagnóstico la invención o en el método de respuesta de la invención la expresión “identificar y cuantificar los niveles de expresión” de la etapa a) se refiere al procedimiento de reportar y/o determinar la cantidad del nivel de expresión del o de los biomarcadores descritos en la presente invención, por la detección y/o determinación de la cantidad del ARNm, o un fragmento del ARNm, ADNc o un fragmento del ADNc, o de la proteína o un fragmento de la proteína, codificados por el o los biomarcadores descritos en la presente invención. Así, en una realización particular del método de diagnóstico la invención o del método de respuesta de la invención la etapa (a) se lleva a cabo mediante cuantificación de los niveles de proteína, de ARN mensajero o del ADN complementario.
Los términos “fragmento de ARNm”, “fragmento de ADNc” y “fragmento de proteína” se han definido anteriormente en relación al uso de diagnóstico de la invención y al uso de respuesta de la invención y dichas definiciones son válidas para el presente aspecto.
Si la cuantificación de la expresión de los biomarcadores va a realizarse a partir del ADNc o el ARNm, primero es necesaria la extracción del ácido nucleico de la muestra de saliva aislada del sujeto. Para este fin, la muestra de saliva se puede tratar para disgregar de forma física o mecánica la estructura del tejido o la célula, liberando los componentes intracelulares en una solución acuosa u orgánica para aislar y preparar los ácidos nucleicos. Los ácidos nucleicos se extraen mediante procedimientos conocidos para el experto en la materia y disponibles comercialmente (Sambroock, J., et al. 2012, "Molecular cloning: a Laboratory Manual", 4th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y., Vol. 1 -3.).
Una vez extraído los ácidos nucleicos se procede a realizar la cuantificación de la expresión de los biomarcadores. Prácticamente cualquier método convencional puede ser utilizado dentro del marco de la invención para detectar y cuantificar los niveles de ARNm de los biomarcadores o de sus ADNc correspondiente. A modo ilustrativo, no limitativo, los niveles de ARNm de dichos biomarcadores pueden ser cuantificados mediante el empleo de métodos convencionales, por ejemplo, métodos que comprenden la amplificación del ARNm y la cuantificación del producto de la amplificación de dicho ARNm, tales como electroforesis y tinción, o alternativamente, mediante Southern blot y empleo de sondas apropiadas, northern blot y empleo de sondas específicas del ARNm del biomaracador de interés o de su ADNc correspondiente, mapeo con la nucleasa S1 , RT-PCR, hibridación, microarrays, etc. En una realización preferida del método de diagnóstico de la invención o del método de respuesta de la invención la cuantificación de los niveles de ARN mensajero se lleva a cabo por reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa (RT-PCR).
Análogamente, los niveles del ADNc correspondiente al ARNm del biomarcador o biomarcadores también pueden ser cuantificados mediante el empleo de técnicas convencionales; en este caso, el método de la invención incluye una etapa de síntesis del correspondiente ADNc mediante transcripción inversa (RT) del ARNm correspondiente seguida de amplificación y cuantificación del producto de la amplificación de dicho ADNc. Métodos convencionales de cuantificar los niveles de expresión pueden encontrarse, por ejemplo, en Sambrook et al. citado ad supra. En una realización preferida, la cuantificación de los niveles de expresión se realiza mediante una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) cuantitativa, un array de ADN o ARN, o RNA-Seq o Secuenciación Masiva aplicada al estudio de ARN.
Si la cuantificación de la expresión del biomarcador o de los biomarcadores va a realizarse a partir de la proteína codificada por el gen asociado al biomarcador, entonces la muestra de saliva aislada del sujeto tiene que ser tratada para extraer las proteínas. Métodos para extraer o aislar proteínas son conocidos para el experto en la materia y están disponibles comercialmente (Sambroock, J., et al. 2012, citado ad supra).
Los niveles de proteína pueden ser cuantificados mediante cualquier método convencional que permita detectar y cuantificar dicha proteína en una muestra de un sujeto. A modo ilustrativo, no limitativo, los niveles de dicha proteína pueden cuantificarse, por ejemplo, mediante el empleo de anticuerpos con capacidad de unirse a la proteína diana y la posterior cuantificación de los complejos formados.
Se entiende por “anticuerpo” a una glicoproteína del tipo gamma globulina que forma parte del sistema inmunitario humoral que se une de forma específica a un antígeno. El término anticuerpo, tal como aquí se utiliza, incluye anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, fragmentos recombinantes de anticuerpos, combibodies, fragmentos Fab y scFv de anticuerpos, así como los dominios de unión a ligando.
Los anticuerpos que se emplean en estos ensayos pueden estar marcados o no. Los términos "marca" o "marcado" se refieren a una composición capaz de producir una señal detectable indicativa de la presencia de la molécula marcada. Ejemplos ilustrativos de marcadores adecuados incluyen, sin limitar a, radioisótopos, cromóforos de nucleótidos, enzimas, sustratos, moléculas fluorescentes, restos quimioluminiscentes, partículas magnéticas, restos bioluminescentes, y similares. Como tal, una marca es cualquier composición detectable por medios espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, inmunoquímicos, eléctricos, ópticos o químicos. Existe una amplia variedad de ensayos conocidos que se pueden utilizar en la presente invención, que utilizan anticuerpos no marcados (anticuerpo primario) y anticuerpos marcados (anticuerpo secundario); entre estas técnicas se incluyen el Western-blot o transferencia Western, ELISA (enzimoinmunoensayo RIA (radioinmunoensayo), EIA competitivo (enzimoinmunoensayo competitivo), DAS-ELISA (ELISA tipo sándwich con doble anticuerpo), técnicas inmunocitoquímicas e inmunohistoquímicas, técnicas basadas en el empleo de biochips o microarrays de proteínas que incluyan anticuerpos específicos o ensayos basados en precipitación coloidal en formatos tales como dipsticks. Otras maneras para detectar y cuantificar proteínas, incluyen técnicas de cromatografía de afinidad, ensayos de unión a ligando, espectrometría de masas etc. Cuando se usa un método inmunológico, se puede usar cualquier anticuerpo o reactivo que se sabe se une a la proteína diana con alta afinidad para detectar la cantidad de la misma. Ejemplos de anticuerpos o reactivos con capacidad de unirse a dicha la proteína diana incluyen, sin limitarse a, sueros policlonales, sobrenadantes de hibridomas o anticuerpos monoclonales, fragmentos de anticuerpos, Fv, Fab, Fab' y F(ab')2, scFv, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos y anticuerpos humanizados.
El término “valores de referencia” en la etapa b) del método de diagnóstico de la invención hace referencia a los valores del nivel de expresión del biomarcador HIPK3, CAST y/o ABHD4, o de los biomarcadores PRR15L, SATB1 y SCIN, considerados normales en sujetos que no padecen de EoE. Estos valores pueden ser obtenidos a través de la cuantificación de los niveles de expresión de dichos biomarcadores a partir de muestras de saliva aisladas de sujetos que no padecen de EoE y representantes de la populación en la cual se encuentre el sujeto susceptible de tener o padecer enfermedad.
La expresión “comparar los niveles de expresión obtenidos en la etapa (a) con valores de referencia” en el método de diagnóstico de la invención hace referencia al proceso o procedimiento de relacionar, examinar o verificar los valores obtenidos para el nivel de expresión de los biomarcadores, y equiparar o verificar los valores obtenidos en la etapa a) con los valores que se esperan obtener para sujetos que no padecen la enfermedad, donde, según el método de diagnóstico de la invención, “una reducción en los niveles de expresión de HIPK3, CAST y/o ABHD4 en la muestra del sujeto respecto a los valores de referencia para dicho biomarcador, es indicativo de padecer o estar predispuesto a padecer EoE”.
El término “reducción” hace referencia a un decrecimiento, disminución o rebaja de los valores del nivel de expresión obtenidos para un sujeto que padece o es susceptible de padecer de EoE cuando estos valores son equiparados con los valores de referencia, es decir, con valores de un sujeto que no padece de EoE. En particular, se entiende “reducción” del nivel de expresión, cuando los niveles de expresión del biomarcador son de, al menos, 0,1 veces, 0,5 veces, 1 veces, 5 veces, 10 veces, 20 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces, 60 veces, 70 veces, 80 veces, 90 veces, 100 veces o incluso más con respecto a los niveles de expresión del biomarcador en un sujeto que no padece de EoE. La expresión “comparar los niveles de expresión obtenidos en la etapa (a) con valores obtenidos antes de iniciar el tratamiento” en el método de respuesta de la invención hace referencia al proceso o procedimiento de relacionar, examinar o verificar los valores obtenidos para el nivel de expresión de los biomarcadores, y equiparar o verificar los valores obtenidos en la etapa a) con los valores obtenidos para dichos biomarcadores, preferiblemente por el método de diagnóstico de la invención, antes de iniciar el tratamiento, donde, según el método de respuesta la invención, “un aumento en los niveles de expresión del biomarcador HIPK3, CAST y/o ABHD4 en la muestra del sujeto respecto a los valores obtenidos antes de iniciar el tratamiento, es indicativo de una respuesta a tratamiento favorable”.
El término “aumento” hace referencia a un incremento, crecimiento o subida de los valores del nivel de expresión obtenidos para un sujeto que padece de EoE después de iniciar tratamiento cuando estos valores son equiparados con los valores obtenidos para los mismos biomarcadores antes de que el sujeto inicie el tratamiento. En particular, se entiende “aumento” del nivel de expresión, cuando los niveles de expresión del biomarcador son de, al menos, 1 ,1 veces, 1 ,5 veces, 2 veces, 5 veces, 10 veces, 20 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces, 60 veces, 70 veces, 80 veces, 90 veces, 100 veces o incluso más con respecto a los niveles de expresión del biomarcador del sujeto antes de iniciar tratamiento.
La puesta en práctica de los usos y los métodos de la invención comprende el empleo de sondas, cebadores y/o anticuerpos, los cuáles puede formar parte de un kit.
Así, otro aspecto de la invención es un kit o dispositivo, de ahora en adelante el kit de la invención, para el diagnóstico y/o pronóstico in vitro de EoE, o para la determinación de la respuesta al tratamiento in vitro de EoE que comprende sondas, cebadores y/o anticuerpos específicos para la identificación y cuantificación de los niveles de expresión del biomarcador HIPK3, CAST y/o ABHD4 en muestras aisladas de saliva.
En una realización preferida el kit de la invención además comprende sondas, cebadores y/o anticuerpos para la detección de los niveles de expresión de al menos un biomarcador que se selecciona de la lista que consiste en: PRR15L, SATB1 , SCIN y cualquiera de sus combinaciones. En otra realización particular del kit de la invención las sondas se seleccionan de la lista que consiste en: SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 25, y cualquiera de sus combinaciones. En aún otra realización particular del kit de la invención los cebadores se seleccionan de la lista que consiste en: SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 , SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21 , SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, y cualquiera de sus combinaciones.
En la presente invención se entiende por “sonda” a la molécula de ácido nucleico cuya secuencia de nucleótidos híbrida de forma específica con la secuencia de nucleótidos del biomarcador diana. La expresión “híbrida de forma específica”, tal como se usa aquí, se refiere a las condiciones que permiten la hibridación de dos polinucleótidos en condicionales altamente o moderadamente rigurosas. Condiciones de alta rigurosidad implican, en general: (1 ) fuerza iónica baja y alta temperatura para el lavado, por ejemplo de cloruro de sodio 0,015M/citrato de sodio 0,0015M/0,1 % dodecil sulfato de sodio a 50eC, (2) empleo durante la hibridación de un agente de desnaturalización, tales como formamida, por ejemplo, el 50% (v/v) formamida con 0,1 % de albúmina de suero bovino/0,1 % Ficoll/0, 1 % polivinilpirrolidone/tampón fosfato de sodio 50 mM a pH 6,5 con cloruro de sodio a 750 mM, 75 mM de citrato de sodio a 42eC, o (3) empleo de 50% de formamida, 5xSSC (0,75 M NaCI, 0,075 M citrato de sodio), fosfato sódico 50mM (pH 6,8), 0,1% de pirofosfato de sodio, 5 veces solución de Denhardt, ADN de esperma de salmón sonicado (50 mg/mL), 0,1 % SDS, y el 10% de sulfato de dextrano a 42eC, con lavados a 42eC en 0,2xSSC (cloruro sódico/citrato de sodio) y el 50% de formamida, seguido de un lavado de alto rigor que consiste en 0,1xSSC que contiene EDTA a 55eC. “Condiciones moderadamente rigurosas” incluyen el uso de solución de lavado y las condiciones de hibridación menos estrictas que las descritas anteriormente. Como llevar a cabo la hibridación de dos secuencias de nucleótidos puede encontrarse en Sambroock, J., et al. 2012, citado ad supra.
En una realización preferida del kit de la invención las sondas son sondas doblemente marcadas. El término "sonda doblemente marcadas" se refiere a una secuencia de oligonucleótidos de una sola hebra que tiene un marcador, un quencher (marcador que absorbe la señal de otro marcador) y una secuencia de sonda dispuestas entre los dos marcadores, y en la que marcador y el quencher están lo suficientemente próximos como para que el quencher impida que el marcador emita una señal detectable. La secuencia de la sonda generalmente incluye una secuencia que es sensible a la Taq polimerasa. Típicamente, la sonda comprende 20-30 nucleótidos, preferentemente 20- 24 nucleótidos. Moléculas marcadoras y moléculas quencher están disponibles comercialmente. Ejemplos, no limitantes, so la molécula marcadora 6- carboxyfluoresceina (FAM) y los quencher Iowa Black (lABkFQ) y ZEN de la empresa Integrated DNA Technologies.
En otra realización preferida del kit de la invención las sondas son sondas triplemente marcadas. El término “sondas triplemente marcadas” hace referencia a una sonda doblemente marcada que además contiene un segundo quencher interno localizado entre los nucleótidos 9 y 10 de la secuencia de la sonda. Un ejemplo no limitante de un quencher interno es el ZEN de la empresa Integrated DNA Technologies.
Además de sondas, cebadores y/o anticuerpos, el kit puede comprender otros componentes útiles en la puesta en práctica de la presente invención, tales como, buffers, vehículos de entrega, soportes del material, componentes de controles positivos y/o negativos, etc. Opcionalmente, tales controles comprenden las sondas, cebadores y/o anticuerpos con modificaciones para su uso como controles, por ejemplo, sondas, cebadores y/o anticuerpos que no reconocen el biomarcador HIPK3 y/o el resto de los biomarcadores descritos en la presente invención. Además de los componentes mencionados, los kits podrán incluir también instrucciones para practicar el objeto de la invención. Estas instrucciones pueden estar presentes en los kits mencionados en una variedad de formas, uno o más de los cuales pueden estar presentes en el kit. Una forma en la que estas instrucciones pueden estar presentes es como información impresa en un medio o sustrato adecuado, p. ej., una hoja o hojas de papel en las que se imprime la información, en el embalaje del kit, en un inserto de paquete, etc. Otro medio sería un medio legible por ordenador, por ejemplo, un CD, un USB, etc., en el que se haya registrado la información. Otro medio que puede estar presente es una dirección de sitio web que puede utilizarse a través de Internet para acceder a la información en un sitio remoto. Cualquier medio conveniente puede estar presente en los kits.
Otro aspecto de la invención hace referencia al uso del del kit de la invención para el diagnóstico y/o pronóstico in vitro de EoE en una muestra aislada de saliva de un sujeto, preferiblemente un ser humano.
Aún otro aspecto de la invención hace referencia al uso del kit de la invención para determinar la respuesta al tratamiento de EoE en una muestra aislada de saliva de un sujeto, preferiblemente un ser humano. Los términos y expresiones utilizados en el kit de la invención y en los usos del kit de la invención, sus realizaciones preferidas fueron definidos anteriormente en relación a los aspectos de uso y al método de la invención, siendo tales definiciones validas y aplicables en referencia al kit de la invención.
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus vahantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y figuras se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Fig. 1. Expresión relativa de los genes diferencialmente expresados en saliva. CTRL: controles, EoE: pacientes con esofagitis eosinofílica. Los datos representan la media y el error standard en 10 muestras de cada grupo. Diferencias calculadas mediante test t- Student. *p<0,05; **p<0,01.
Fig. 2. Curvas ROC de los genes diferencialmente expresados. AUC: área bajo la curva.
Fig. 3. Se ha cuantificado la expresión de los genes candidato mediante RT-qPCR utilizando 8ng de RNA por muestra y gen. En esta figura se muestran los valores de expresión relativa de los genes candidato. La expresión de los genes candidato se ha normalizado frente a la expresión de GAPDH mediante el método 2-AACt. Se ha analizado la expresión génica en salivas de 73 pacientes con EoE activa, 46 pacientes con EoE en remisión y 73 pacientes control. +<0,1 ; *p<0,05; **p<0,01 mediante la prueba de t- student.
Fig. 4. Se combinaron los valores de expresión de cada gen candidato mediante fórmulas de regresión logística. De este modo se obtuvieron nuevos valores P para cada muestra. A la izquierda se muestran los valores P teniendo en cuenta la expresión de los seis genes candidato (ABDH4, CAST, HIPK3, PRR15L, SATB1 y SCIN) en pacientes con EoE activa y pacientes control. *p<0,05 mediante t-student. A la derecha, los valores P se han representado mediante una Curva ROC obteniendo un área bajo la curva (AUC) de 0.6748 y valores estadísticos significativos (p=0.03858). Fig. 5. Se combinaron los valores de expresión de cada gen candidato mediante fórmulas de regresión logística. De este modo se obtuvieron nuevos valores P para cada muestra. En A) se muestran los resultados tras la combinación de los seis genes candidatos (ABDH4, CAST, HIPK3, PRR15L, SATB1 y SCIN); en B) tras la combinación de cuatro genes candidato (ABDH4, CAST, HIPK3 y PRR15L); y en C) tras la combinación de tres genes candidato (ABDH4, CAST e HIPK3). A la izquierda se muestran los valores P teniendo en cuenta la expresión de los genes candidato incluidos en cada combinación en pacientes con EoE activa y con EoE en remisión. **p<0,01 mediante t-student. A la derecha, los valores P se han representado mediante Curvas ROC combinadas obteniendo un área bajo la curva (AUC) de 0.7136; 0.6684; y 0.6476; y valores estadísticos significativos de p=0.01796; p=0.02463; y p=0.01384 en A), B) y C) respectivamente.
EJEMPLOS
A continuación, se ¡lustrará la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores, que ponen de manifiesto los aspectos de la presente inveción.
Ejemplo 1 : Análisis de los genes que presentan expresión reducida en pacientes
Material v métodos
Reclutamiento
El proceso de reclutamiento se llevó a cabo a través del Servicio de Gastroenterología del Hospital Universitario Donostia y del Hospital General de Tornellos, donde se hizo un cribado de los potenciales pacientes para su participación en el estudio.
Se reclutaron voluntarios mayores de edad que cumplían con las características necesarias para llevar a cabo el estudio.
Los criterios de inclusión/exclusión para el reclutamiento de los participantes fueron los siguientes:
• Criterios de inclusión: o Pacientes diagnosticados de Esofagitis Eosinofilica (EoE), que hayan presentado ¡mpactación esofágica y que en la biopsia histológica tengan al menos 15 eosinófilos por campo.
• Criterios de exclusión: o Acalasia o esclerodermia; o Evidencia de causas distintas de EoE para la eosinof ilia esofágica o Antecedentes de cirugía esofágica en cualquier momento o de procedimientos de dilatación esofágica en las últimas 8 semanas antes de la detección o Cualquier enfermedad sistémica relevante como cardiopatía isquémica, insuficiencia renal, enfermedad crónica pulmonar, hepatopatía crónica, neosplasia, etc o Pacientes que reciban glucocorticosteroides sistémicos, inmunosupresores, medicamentos biológicos, glucocorticosteroides tópicos, por otro tipo de enfermedad.
Aquellas personas interesadas en participar en el estudio y que cumplían con los criterios de inclusión, fueron informados de forma oral y escrita de los datos relevantes del estudio y decidieron si participar o no una vez tenían conocimiento claro del estudio. El permiso para realizar el estudio se tramitó por el Comité Ético de Investigación del Área Sanitaria de Gipuzkoa (Código de Protocolo: BUJ-BIO-2020-01 ), y por el Comité de Etica de Investigación Clínica del Hosptital General La Mancha Centro (Código de protocolo 137-C).
Recogida datos
En todos los pacientes incluidos se obtuvieron, además de los datos clínicos habituales de información demográfica, datos del informe endoscópico y de anatomía patológica. Se recopilaron datos de seguimiento clínico, endoscópico e histológico de cara a detección de recibidas; y se contabilizó el número máximo de eosinófilos en cualquiera de los puntos del esófago.
Los hallazgos de la endoscopia del esófago se clasificaron de acuerdo con el sistema de clasificación de puntuación de referencia endoscópica (EREFS) modificado, sumando las puntuaciones de los 5 campos principales (edema, exudados, surcos, estenosis y anillos). Se hizo una puntuación total y una evaluación global de la actividad endoscópica de EoE y se clasificaron como ninguna, leve, moderada o grave.
Recogida de muestras
Se recogieron muestras de saliva de casos con EoE y controles sanos. Los casos utilizados son pacientes diagnosticados por medio de histología de esofagitis eosinofílica sin tratamiento o sin respuesta al tratamiento. Los controles no presentaban ninguna enfermedad inflamatoria. Las muestras de saliva cada participante se recogieron mediante el kit DNA/RNA Shield™ Collection Tube w/ Swab (Zymo) siguiendo las instrucciones del fabricante. Selección de genes candidato
Para seleccionar los genes a estudiar se analizaron resultados de RNAseq depositados en la base de datos “GEO” con el código GSE113341. Partiendo de esos datos, se compararon los niveles de expresión de biopsias de esófago entre EoE y controles sanos y se realizó un test U de Mann-Whitney. De todos los genes analizados 69 mostraron expresión diferencial significativa después de utilizar corrección False
Discovery Rate, genes que fueron utilizados para posteriores análisis de expresión (Tabla 1 ).
Tabla 1 : Genes expresados diferencialmente y números de accesión.
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Extracción de RNA
La extracción de RNA se realizó utilizando el kit DirectZol Miniprep RNA purification kit (Zymo) siguiendo las instrucciones del fabricante. Brevemente, se sustrajeron 500ul de muestra de saliva y se mezclaron 1 ,5 mi de Trizol. Se añadió el mismo volumen de etanol y se procedió a la limpieza del RNA mediante la columna provista en el kit. El RNA se resuspendió en 30ul de agua libre de RNAsas y la concentración se midió mediante espectrometría UV utilizando un Nanodrop ND-1000.
RT-QPCR
La RT-QPCR se realizó utilizando el kit Quantitec Probe RT-PCR (Qiagen) y sondas especificas para cada gen (IDT, Tabla 2). Se utilizaron los genes GAPDH, RPLPO y 18S como controles endógenos. Las reacciones se corrieron en duplicado en volúmenes de 5 microlitros en placas de 384 pocilios utilizando 5ng de RNA por reacción en un termociclador BioRad CFX.
Análisis de los resultados
Los resultados se analizaron mediante el método deltaCt para calcular exrpresión relativa. La expresión de los genes candidatos que fueron detectadles en saliva se calculo utilizando la media de los tres genes endógenos. Los análisis estadísticos se realizaron mediante una t-Student y los valores menores de 0,05 se consideraron significativos.
Resultados
29 de los genes analizados fueron detectados en las muestras de saliva. Solo se consideraron para el análisis aquellos genes que se expresaron en al menos un 60% de las muestras analizadas. 6 de los 29 genes detectados presentan una expresión relativa significativamente reducida en los pacientes con EoE (Fig. 1 ). En una cohorte de validación en la que se incluyen 37 pacientes confirmados de EoE del Hospital Universitario Donostia y del Hospital General de Tomelloso y 27 controles sanos, se confirmó la disminución en la expresión de los genes HIPK3 y ABHD4 (Fig. 1). Además, se observa como la expresión de los biomarcadores HIPK3 y ABHD4 en saliva, cada uno de ellos por separado, presentan una sensibilidad superior al 75% (79%) una especificidad superior al 60% (65%) con un área bajo la curva ROC superior al 0.85 (Fig. 2).
Tabla 2: Sondas y cebadores para los genes indicados
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Además, se cuantificó la expresión de los genes candidato mediante RT-qPCR utilizando 8ng de RNA por muestra y gen. En la figura 3 se muestran los valores de expresión relativa de los genes candidato. La expresión de los genes candidato se normalizó frente a la expresión de GAPDH mediante el método 2-AACt. Se analizó la expresión génica en muestras de saliva de 73 pacientes con EoE activa, 46 pacientes con EoE en remisión y 73 pacientes control. +<0,1 ; *p<0,05; **p<0,01 mediante la prueba de t-student.
Se combinaron los valores de expresión de cada gen candidato mediante fórmulas de regresión logística. De este modo se obtuvieron nuevos valores P para cada muestra (Fig. 4). A la izquierda de la figura 4 se muestran los valores P teniendo en cuenta la expresión de los seis genes candidato (ABDH4, CAST, HIPK3, PRR15L, SATB1 y SCIN) en pacientes con EoE activa y pacientes control. *p<0,05 mediante t-student. A la derecha de la figura 4, los valores P se han representado mediante una Curva ROC obteniendo un área bajo la curva (AUC) de 0.6748 y valores estadísticos significativos (p=0.03858).
Por último, se combinaron los valores de expresión de cada gen candidato mediante fórmulas de regresión logística. De este modo se obtuvieron nuevos valores P para cada muestra (Fig.5). En A) se muestran los resultados tras la combinación de los seis genes candidatos (ABDH4, CAST, HIPK3, PRR15L, SATB1 y SCIN); en B) tras la combinación de cuatro genes candidato (ABDH4, CAST, HIPK3 y PRR15L); y en C) tras la combinación de tres genes candidato (ABDH4, CAST e HIPK3). A la izquierda se muestran los valores P teniendo en cuenta la expresión de los genes candidato incluidos en cada combinación en pacientes con EoE activa y con EoE en remisión. **p<0,01 mediante t-student. A la derecha, los valores P se han representado mediante Curvas ROC combinadas obteniendo un área bajo la curva (AUC) de 0.7136; 0.6684; y 0.6476; y valores estadísticos significativos de p=0.01796; p=0.02463; y p=0.01384 en A), B) y C) respectivamente.

Claims

28 REIVINDICACIONES
1 . Uso de los niveles de expresión del biomarcador HIPK3, CAST y/o ABHD4 para el diagnóstico y/o el pronóstico in vitro de esofagitis eosinofílica (EoE) en una muestra de saliva aislada de un sujeto, preferiblemente donde el pronóstico es para determinar si el sujeto está en fase activa o de remisión de la enfermedad.
2. Uso de los niveles de expresión del biomarcador HIPK3, CAST y/o ABHD4 para determinar in vitro la respuesta al tratamiento de EoE en una muestra de saliva aislada de un sujeto.
3. Uso según la reivindicación 1 o 2 que comprende además los niveles de expresión de al menos uno de los biomarcadores seleccionados de la lista que consiste en: PRR15L, SATB1 , SCIN y cualquiera de sus combinaciones.
4. Uso según la reivindicación 1 o 2 que comprende los niveles de expresión de los biomarcadores HIPK3, CAST, ABHD4, PRR15L, SATB1 y SCIN.
5. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 3, que comprende los niveles de expresión de los biomarcadores ABDH4, HIPK3, CAST y opcionalmente PRL15 para determinar si el sujeto está en fase activa o de remisión de la enfermedad.
6. Método de diagnóstico y/o pronóstico in vitro de EoE en un sujeto, donde el método comprende: a) identificar y cuantificar los niveles de expresión del biomarcador HIPK3, CAST y/o ABHD4 en una muestra de saliva aislada del sujeto; y b) comparar los niveles de expresión obtenidos en la etapa (a) con valores de referencia, donde una reducción en los niveles de expresión del biomarcador HIPK3, CAST y/o ABHD4 en la muestra del sujeto respecto a los valores de referencia para dicho biomarcador, es indicativo de padecer o estar predispuesto a padecer EoE, y donde preferiblemente el pronóstico es para determinar si el sujeto está en fase activa o de remisión de la enfermedad.
7. El método según la reivindicación 6, donde en la etapa (a) se identifican y cuantifican además los niveles de expresión de al menos un biomarcador que se selecciona de la lista que consiste en: PRR15L, SATB1 , SCIN y cualquiera de sus combinaciones, y donde una reducción en los niveles de expresión de al menos uno de los biomarcadores en la muestra del sujeto respecto a los valores de referencia para cada uno de ellos, es indicativo de padecer o estar predispuesto a padecer EoE.
8. El método según cualquiera de las reivindicaciones 6 ó 7, donde en la etapa (a) se identifican y cuantifican los niveles de expresión de los biomarcadores ABDH4, HIPK3, CAST y opcionalmente PRL15 para determinar si el sujeto está en fase activa o de remisión de la enfermedad.
9. El método según cualquiera de las reivindicaciones 6 ó 7, donde en la etapa (a) se identifican y cuantifican los niveles de expresión de los biomarcadores HIPK3, CAST, ABHD4, PRR15L, SATB1 y SCIN.
10. Método para determinar in vitro la respuesta al tratamiento de EoE en un sujeto, donde el método comprende: a) identificar y cuantificar los niveles de expresión del biomarcador HIPK3, CAST y/o ABHD4 en una muestra de saliva aislada del sujeto; y b) comparar los niveles de expresión obtenidos en la etapa (a) con valores obtenidos antes de iniciar el tratamiento para EoE, donde un aumento en los niveles de expresión del biomarcador HIPK3, CAST y/o ABHD4 en la muestra del sujeto respecto a los valores obtenidos antes de iniciar el tratamiento para EoE, es indicativo de una respuesta a tratamiento favorable.
11. El método según la reivindicación 10, donde en la etapa (a) se identifican y cuantifican además los niveles de expresión de al menos un biomarcador que se selecciona de la lista que consiste en: PRR15L, SATB1 , SCIN y cualquiera de sus combinaciones, y donde un aumento en los niveles de expresión de al menos uno de los biomarcadores en la muestra del sujeto respecto a los valores obtenidos antes de iniciar el tratamiento para EoE es indicativo de una respuesta a tratamiento favorable.
12. El método según cualquiera de las reivindicaciones 10 u 1 1 , donde en la etapa (a) se identifican y cuantifican los niveles de expresión de los biomarcadores HIPK3, CAST, ABHD4, PRR15L, SATB1 y SCIN.
13. El método según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 12 donde la etapa (a) se lleva a cabo mediante cuantificación de los niveles de proteína, de ARN mensajero o del ADN complementario.
14. El método según la reivindicación 13, donde la cuantificación de los niveles de proteína se lleva a cabo por Western blotting o ensayo inmunoenzimático.
15. El método según la reivindicación 13, donde la cuantificación de los niveles de ARN mensajero se lleva a cabo por reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa.
16. El método según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 15, donde el sujeto es un mamífero, preferiblemente un humano.
17. Uso in vitro de un kit o dispositivo para el diagnóstico y/o pronóstico de EoE que comprende sondas, cebadores y/o anticuerpos específicos para la identificación y cuantificación de los niveles de expresión del biomarcador HIPK3, CAST y/o ABHD4 en una muestra aislada de saliva de un sujeto.
18. Uso in vitro de un kit o dispositivo para determinar la respuesta al tratamiento de EoE que comprende sondas, cebadores y/o anticuerpos específicos para la identificación y cuantificación de los niveles de expresión del biomarcador HIPK3, CAST y/o ABHD4 en una muestra aislada de saliva de un sujeto.
19. Uso según la reivindicación 17 o 18 donde además el kit o dispositivo comprende sondas, cebadores y/o anticuerpos específicos para la identificación y cuantificación de los niveles de expresión de al menos un biomarcador que se selecciona de la lista que consiste en: PRR15L, SATB1 , SCIN y cualquiera de sus combinaciones.
20. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 17 a 19, donde el sujeto es un mamífero, preferiblemente un humano.
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