WO2019004875A1 - Мышиная гибридома ykl-39, клон 1в2 g4 - продуцент моноклонального антитела, обладающего специфичностью к цитоплазматическому антигену ykl-39 человека - Google Patents

Мышиная гибридома ykl-39, клон 1в2 g4 - продуцент моноклонального антитела, обладающего специфичностью к цитоплазматическому антигену ykl-39 человека Download PDF

Info

Publication number
WO2019004875A1
WO2019004875A1 PCT/RU2018/050043 RU2018050043W WO2019004875A1 WO 2019004875 A1 WO2019004875 A1 WO 2019004875A1 RU 2018050043 W RU2018050043 W RU 2018050043W WO 2019004875 A1 WO2019004875 A1 WO 2019004875A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
ykl
protein
clone
hybridoma
monoclonal antibody
Prior art date
Application number
PCT/RU2018/050043
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Алексей Николаевич ГРАЧЕВ
Ольга Владимировна КОВАЛЕВА
Дарья Викторовна САМОЙЛОВА
Сергей Николаевич КУРОЧКИН
Original Assignee
ОБЩЕСТВО С ОГРАНИЧЕННОЙ ОТВЕТСТВЕННОСТЬЮ "ПраймБиоМед"
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ОБЩЕСТВО С ОГРАНИЧЕННОЙ ОТВЕТСТВЕННОСТЬЮ "ПраймБиоМед" filed Critical ОБЩЕСТВО С ОГРАНИЧЕННОЙ ОТВЕТСТВЕННОСТЬЮ "ПраймБиоМед"
Publication of WO2019004875A1 publication Critical patent/WO2019004875A1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor

Definitions

  • Mouse ibridoma YKL-39, clone IB2 G4 is a producer of a monoclonal antibody that has specificity for the human cytoplasmic antigen YKL-39.
  • the invention relates to biotechnology, biology and medicine and is intended to detect human cytoplasmic protein YKL-39 (CHI3L2) in the blood plasma of cancer patients by ELISA, in neoplastic cells and glioblastoma cell lines, and other tissues by immunocytochemical, immunohistochemical and immunofluorescent methods, as well as by the method immunoblotting for research and clinical laboratory purposes.
  • CHI3L2 human cytoplasmic protein YKL-39
  • the problem of diagnosis including early cancer, based on a blood test is relevant for the last 20 years.
  • markers for diagnosis proteins, nucleic acids, vesicles secreted by tumor cells and tumor cells are used. This diagnosis is carried out by enzyme immunoassay and allows you to identify the disease at the initial stage. Standard immunocytochemical methods of analysis, using antibodies to known proteins-markers of tumor biopsy, allow us to classify the type of tumors and assess the degree of their malignancy (MA Fingers, NM Anichkov. Pathological anatomy. - M .: Meditsina, 2001).
  • Immunohistochemical staining with monoclonal antibodies of highly specific cellular proteins in combination with the immunoperoxidase method allows not only to evaluate low differentiation tumors, tumors of unknown origin, more accurately distinguish tumors of various tissue origins (Clinical Oncology: study guide / edited by P. Bryusov, P. N. Zubareva - SPb .: SpecLit, 2012. - 455 s: il.), But also allows you to choose the appropriate treatment methods.
  • chitinase-like proteins are proteins formed in the zone of inflammation and tumor growth. Recently, certain members of the family have been studied as potential biomarkers for various human diseases, including solid tumors (gliomas, prostate cancer and ovarian cancer). To date, there is no clinically relevant and accessible method for determining the concentrations of these biomarkers in circulating blood.
  • One of the characterized proteins is YKL-39.
  • YKL-39 also known as chitinase-3-like protein 2 (CHI3L2), is a secretory protein of chondrocytes belonging to the glycosyl hydrolase family 18. Its highest expression is observed in chondrocytes, synoviocytes, lungs and heart, as well as macrophages.
  • SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) 995-998). It is not found in the spleen, pancreas and liver. YKL-39 can also be expressed in the developing brain and placenta. An increased level of expression of the YKL-39 gene is also shown in patients with Alzheimer's disease and in glioblasomes (Colton, S. A., Mott, R. T., Sharpe, N., Xu, Q., Van Nostrand, W. E. and Vitek, MP (2006). Expression Profiles for Macro Models for Alternatives and Models for Adaptation (J, Neuroinflammation 3, 27).
  • the objective of the invention is the expansion of the range of monoclonal antibodies with specificity for the human YKL-39 protein used for immunodiagnostics and prognostic evaluation of the course of human tumor diseases.
  • mice hybridoma YKL-39, clone 1B2 G4 a producer of the first-onset for patients with CI, identifying YKL-39 using enzyme immunoassay, immunocytochemistry, immunohistochemistry, immunofluorescence and immunoblotting, obtained by immunizing a Balb line and using a 10-in.
  • the monoclonal antibodies to human YKL-39 protein produced by hybridoma 1B2 G4 have a selective ability to bind the human YKL-39 protein in an enzyme immunoassay (Table 1), on immunoblot ( Figure 4), on a cellular one ( Figure 2, Fig. 3) and tissue levels (on paraffin sections) ( Figure 1), and expand the existing available range of monoclonal antibodies to the YKL-39 protein. It should also be noted that each newly obtained hybridoma is unique. Monoclonal antibodies produced by different hybridomas, differ in their primary structure, in specificity to different antigenic determinants, affinity, and other properties. Therefore, obtaining as many monoclonal antibodies as possible to the human YKL-39 protein is important from a scientific and practical point of view.
  • the technical result of the invention consists in obtaining a line of a hybrid of mouse IB2 G4, producing monoclonal antibodies available to domestic clinical diagnostic laboratories to the human cytoplasmic antigen YKL-39, suitable for ELISA, immunocytochemistry, immunohistochemistry, immunoblotting and immunofluorescence.
  • Mouse hybridoma YKL-39, clone IB2 G4 was prepared as follows:
  • the human YKL-39 gene (the nucleotide sequence of human YKL-39 cDNA is available in the GeneBank database at http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/ with the sequence number M_004000.2) is amplified on a cDNA matrix obtained from mRNA of cell line LN229 using gene-specific primers (YKL-39 F3006 Xho ACTTCTCGAGACCATGGGAGCAACCACC, YKL-39 R3006 Hind
  • coli cells strain BL21 DE3 was chemically transformed with the obtained plasmid pET45b (+) - YKL-39, sown on LB agar plates containing 100 ⁇ g / ml ampicillin, and incubated at 37 ° C for 16 hours. Next, 50 ml of LB medium transferred a single colony and increased at 37 ° C for 16 h with constant stirring. Further, from the night culture, the expression of proteins in E. coli BL21 DE3 bacteria was stimulated with IPTG at a final concentration of 1 mM for 4-5 hours at 37 ° C. After the time of stimulation, the bacterial cells were lysed, sonified using ultrasound and subjected to a cleaning procedure.
  • inclusion bodies were extracted with 5M urea in PBST for 1 hour at room temperature. There was no dissolution of the target proteins, however, many impurities were separated and a significant decrease in the mass of the inclusion bodies was observed.
  • a buffer of the following composition was used for the lysis of Taurus inclusion: (Arginine - 0.5 M, Urea - 6 M, Tris - 20 mM, pH 10.0, Dithiothreitol - 50 mM, EDTA - 5 mM, Glycine 10 mM). Lysis was carried out for 12 hours at + 4 ° C. The solution was centrifuged at 10,000 rpm for 5 minutes at + 4 ° C. If a precipitate remained, it was re-extracted / g of lysis buffer volume, followed by centrifugation and pooling of the supernatants.
  • Protein refolding was performed by transferring gelfiltration on a Sephadex G-25 column to the buffer of the following composition, followed by incubation for 12-36 hours at 4 ° C: (NaCL - 0.5 M, Urea 4 (1) M *, Arginine - 0.5 (0.05) M *, EDTA - 1 mM, Cysteamine - 10 mM, Imidazole - 2 mM, PBST - up to 50 ml. * - the initial values (in brackets) according to the results of the experiment were corrected upwards)). Further purification of the proteins was performed by metal chelate chromatography (IMAC) on a GMAS Sepharose 6 Fast Flow column (GEHealthCare, 17-0921-08).
  • IMAC metal chelate chromatography
  • proteins were transferred by gel filtration on a Sephadex G-25 column to an IMAC buffer of the following composition: (NaCL — 0.5 M, Urea — 1 M, Imidazole — 5 mM, Arginine — 50 mM, PBST — up to 50 ml).
  • the protein was applied to a F AC Sepharose 6 Fast Flow column, equilibrated with the buffer of the above composition.
  • the column was washed with a stepwise imidazole concentration gradient. It was found that up to an imidazole concentration of 20 mM, the visible elution of the target protein does not occur. Effective elution of the YKL-39 protein with minimal impurities occurs at 75 mM imidazole.
  • the YKL-39 protein obtained as a result of the purification procedure was used as an antigen for further immunization of mice.
  • the resulting hybridomas were dispersed in three 96-well plates of 150 ⁇ l of suspension per well and left for 10 days after which they were tested by ELISA. As a result of testing, 21 clones that bind antigen were selected. The first clone was performed for all clones. According to the results of the ELISA for interaction with a full-sized recombinant Ykl-39, 3 subclones were sown for 21 clones, and then strong subclones were selected. As a result, 19 clones were selected and frozen.
  • ELISA-selected antibodies were then tested by immunocytochemistry and immunofluorescence. Anti-bodies of all 4 clones were tested on LN229 culture cells. Only antibodies alone showed a clear binding to the YKL-39 antigen in cells as granules in the cytoplasm - clone IB2 G4 (Figs. 2, 3).
  • Antibodies to the YKL-39 protein, clone IB2 G4 was tested by immunohistochemistry on sections of a normal kidney (Fig. 1). A clear cytoplasmic staining of renal tubular cells was observed.
  • Fig. 4 immunoblotting was performed (Fig. 4) to test antibodies on total lysates of the glioblastoma cell line LN229 and it was shown that antibodies to Ykl-39, clone IB2 G4, bind Ykl-39 protein.
  • the antibodies produced by Ykl-39 hybridoma, clone IB2 G4 were tested by enzyme immunoassay, immunocytochemistry, indirect immunofluorescence, immunoblotting on total lysates of the cell line LN229, containing YKL-39 protein.
  • Antibodies bind to the full-length protein Ykl-39, with the non-conserved sequence Ykl-39, with the applicum-terminal sequence Ykl- 39, specifically work in immunocytochemistry on LN229 cells, immunohistochemistry on kidney tissues, and immunoblotting on total LN229 lysates.
  • Mouse hybrid ohm YKL-39, clone 1B2 G4 - producing monoclonal antibody YKL-39 - has the following characteristics:
  • Culture has the form of a suspension, where cells are collected in conglomerates and weakly attached to the substrate.
  • the routine cultivation of hybridoma cells YKL-39, clone 1B2 G4 The culture medium is RPMI-1640 (NuOope, USA), 7.5% fetal calf serum FetalClone 1 (NuOope, USA), 4 mM L-glutamine , 100 mcg / ml gentamicin. Cultivation conditions: 37 ° C, absolute humidity and 5% C0 2 in the atmosphere. Passing frequency - every 3-4 days, the multiplicity of sieving 1: 5-1: 10.
  • Bacteria, fungi, yeast and mycoplasma were not detected in culture.
  • the isotype monoclonal antibody YKL-39, clone 1B2 G4 a monoclonal antibody secreted by a hybrid of ohm 1B2 G4, belongs to the IgG2b class immunoglobulins.
  • a monoclonal antibody detects YKL-39 protein in human kidney tissues ( Figure 1), in a number of cell lines of different tissue origin, for example, in the LN229 line (glioblastoma) ( Figures 2, 3).
  • Antibody V2 G4 also recognizes recombinant YKL-39 in total cell lysates of the glioblastoma cell line LN229 on immunoblots ( Figure 4).
  • the monoclonal antibody produced by hybridoma 1B2 G4 is recommended for specific detection of YKL-39 antigen in blood and other fluids by enzyme immunoassay, in tissues containing this antigen by immunohistochemistry, and also in the cytoplasm of human glioblastoma neoplastic cells by immunocytochemistry, immunofluorescence.
  • FIG. 1 The specificity of the antibody YKL-39, clone 1B2 G4, produced by hybridoma 1B2 G4, to YKL-39 protein in kidney cells, detected by immunohistochemistry.
  • secondary antibodies to mouse immunoglobulins conjugated with horseradish polymer peroxidase (PrimeBioMed, Russia) and DAB substrate, as described in Example 1, were used.
  • Specific granule coloring of the cytoplasm of tubular cells in a paraffin section formalin-fixed tissue indicates the presence of cells expressing YKL-39.
  • FIG. 2 The specificity of the antibody produced by hybridoma 1B2 G4 to the YKL-39 protein in human cells of the LN229 line, detected by immunofluorescence. Arrows indicate antibody-stained 1B2 G4 YKL-39, located in the vesicles of epithelial cells of the LN229 line.
  • secondary antibodies to mouse immunoglobulins conjugated with the fluorochrome Alexa Fluor 488 (Molecular Probes, USA) were used, as described in Example 2.
  • Fig.Z The specificity of the antibody produced by hybridoma YKL-39, clone 1B2 G4, to the YKL-39 protein in human cells of the LN229 line, detected by immunocytochemistry. Dark dots are the antibody-stained antigen YKL-39, located in the vesicles of the LN229 cell line.
  • secondary antibodies to mouse immunoglobulins conjugated with horseradish polymer peroxidase (PrimeBioMed, Russia) and DAB substrate were used as described in Example 2.
  • FIG. 4 The specificity of the antibody produced by hybridoma YKL-39, clone 1B2 G4, to the YKL-39 protein on total lysates of the glioblastoma cell line LN229 is detected on immunoblots. Binding of YKL-39 protein with 1B2 G4 antibody after protein transfer to the membrane. Protein lysates were prepared, and the membrane was developed as described in Example 3. The electrophoretic mobility of the protein corresponds to the calculated one.
  • Example 1 Preparation of sections for immunohistochemical detection of the YKL-39 protein.
  • Immunohistochemistry was performed on an operating material fixed with 10% neutral formalin buffered with phosphate buffer for 24 hours. After histological wiring, the material is embedded in paraffin and then sections of 2-4 microns thick are prepared. Sections are mounted on special high adhesive glass (SuperFrost Plus, ApexLab) and dried for 18 hours at 37 ° C.
  • Paraffin is then removed from the sections in three shifts of xylene, for 10 minutes in each shift.
  • Endogenous peroxidase blocking is carried out in 3% hydrogen peroxide for 10 minutes.
  • Sections are incubated with YKL-39 antibodies, clone IB2 G4, and then with antibodies to mouse immunoglobulins conjugated with horseradish peroxidase polymer (PrimeBioMed, Russia). Coloring is manifested by adding substrate DAB Chromogen for 5-10 minutes (PrimeBioMed, Russia). The result is shown in FIG.
  • Example 2 Methods of fixing cells to detect the YKL-39 protein in the reaction of indirect immunofluorescence and immunocytochemistry.
  • Cells are fixed by placing in 3.7% paraformaldehyde for 15 minutes, with subsequent washing in PBS (PanEco, Russia) for 10 min. After fixation and washing, the cells are incubated with YKL-39 antibody, clone IB2 G4 for 1 hour at room temperature, and then with goat antibodies to mouse immunoglobulins conjugated with A1echa488 fluorochrome (Jacksonlmmunoresearch, USA), or polymeric horseradish peroxidase (Primary). or 15 min, respectively, at room temperature.
  • Example 3 The method of obtaining total cell lysates and detecting the native protein YKL-39 by immunoblotting.
  • 5x 10 5 cells of the LN229 line are lysed on ice in a buffer containing 50 tM Tris- (hydroxymethyl) -aminomethane (pH 7.5), 150 mM NaCl, 10% glycerol, 0.5% Triton X-100 and a cocktail of protease inhibitors (Roche, USA) .
  • the total protein concentration in the lysates is determined by the Bradford method using the Protein Assay Kit (Bio-Rad, USA), following the manufacturer's recommendations.
  • the gel is then incubated in a blotting buffer containing 50 mM Tris- (hydroxymethyl) -aminomethane, 38 mM glycine, 0.1% SDS and 20% methanol.
  • the transfer of proteins to the nitrocellulose membrane (0.22 ⁇ m, Millipore, USA) is carried out at a constant current of 250 mA 60 minutes.
  • the membrane is blocked with 5% milk (Bio-Rad, USA) for 1 hour, incubated with YKL-39 antibodies, clone IB2 G4 (overnight at + 4 ° C), and then with antibodies to mouse immunoglobulins conjugated with horseradish peroxidase (dilution 1: 5000, Abeam, USA) -1 hour.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

Изобретение относится к биотехнологии, биологии и медицине. В описании представлена мышиная гибридома YKL-39, клон 1В2 G4, продуцент моноклонального антитела, выявляющего цитоплазматический белок человека YKL-39, методами иммуноферментного анализа, иммуноцитохимии, иммуногистохимии, иммуноблоттинга и иммунофлуоресценции. Гибридома получена путем иммунизации мышей линии Balb/c полноразмерным рекомбинантным белком YKL-39 человека, и последующей гибридизацией сенсибилизированных спленоцитов иммунизированных мышей с клетками мышиной миеломы линии sp2/0 с помощью 50%-ного раствора полиэтиленгликоля с молекулярной массой 1500. Тестирование гибридомных клонов проводилось методом иммуноферментного анализа. Полученная гибридома секретирует моноклональное антитело, клон 1В2 G4, специфичное к цитоплазматическому белку человека YKL-39. Продуцируемые гибридомой антитела могут быть потенциально использованы для диагностики глиобластом.

Description

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Мышиная г ибридома YKL-39, клон 1В2 G4 - продуцент моноклонального антитела, обладающего специфичностью к цитоплазматическому антигену YKL-39 человека.
Изобретение относится к биотехнологии, биологии и медицине и предназначено для выявления цитоплазматического белка человека YKL-39 (CHI3L2) в плазме крови онкологических больных методом ИФА, в неопластических клетках и клеточных линиях глиобластомы и др. тканей иммуноцитохимическим, иммуногистохимическим и иммунофлуоресцентным методами, а также методом иммуноблоттинга для научно- исследовательских и клинико-лабораторных целей.
На сегодняшний день антитела являются мощным инструментом для изучения фундаментальных вопросов, направленных на выяснение функций белков человека в норме и при патологиях.
Проблема диагностики, в том числе ранней, онкологических заболеваний, основанная на анализе крови является актуальной последние 20 лет. В качестве маркеров для диагностики используются белки, нуклеиновые кислоты, везикулы, секретируемые опухолевыми клетками и сами опухолевые клетки. Такая диагностика проводится методом иммуноферментного анализа и позволяет выявлять заболевания на начальной стадии. Стандартные иммуноцитохимические методы анализа, с использованием антител к известным белкам-маркерам биоптата опухоли позволяют классифицировать тип новообразований и оценить степень их злокачественности (М.А. Пальцев, Н.М. Аничков. Патологическая анатомия. - М.: Медицина, 2001). Иммуногистохимическая окраска моноклональными антителами высокоспецифичных клеточных белков в сочетании с иммунопероксидазным методом позволяет не только оценивать опухоли низкой степени дифференцировки, опухоли неизвестного происхождения, более точно различать опухоли различного тканевого происхождения (Клиническая онкология: учебное пособие / под ред. П. Г. Брюсова, П.Н. Зубаревой. - СПб.: СпецЛит, 2012. - 455 с: ил.), но и позволяет выбрать соответствующие методы лечения.
Хитиназоподобные белки у млекопитающих — белки, образующиеся в зоне воспаления и опухолевого роста. В последнее время отдельные представители семейства изучаются как потенциальные биомаркеры различных заболеваний человека, в том числе солидных опухолей (глиомы, рака предстательной железы и яичников). На сегодняшний день не существует клинически релевантного и доступного метода определения концентраций этих биомаркеров в циркулирующей крови. Одним из охарактеризованных белков является YKL-39. YKL-39, также известный как хитиназа-3 -подобный белок 2 (CHI3L2), представляет собой секреторный белок хондроцитов, принадлежащих к семейству гликозилгидролазы 18. Его самая высокая экспрессия наблюдается в хондроцитах, синовиоцитах, легких и сердце, а также макрофагах. На сегодняшний день он может считаться маркером остеоартрита в синовиальной жидкости и сыворотки крови (Ни, В., Trinh, К., Figueira, W. F. and Price, P. A. (1996). Isolation and sequence of a novel human chondrocyte protein related to mammalian members of the chitinase protein family. J Biol Chem 271, 19415-19420; Steck, E., Breit, S., Breusch, S. J., Axt, M. and Richter, W. (2002). Enhanced expression of the human chitinase 3-like 2 gene (YKL-39) but not chitinase 3-like 1 gene (YKL- 40) in osteoarthritic cartilage. Biochem Biophys Res Commun 299, 109-115; Knorr, Т., Obermayr, F., Bartnik, E., Zien, A. and Aigner, T. (2003). YKL-39 (chitinase 3- like protein 2), but not YKL- 40 (chitinase 3-like protein 1), is up regulated in osteoarthritic chondrocytes. Ann Rheum Dis 62,
1
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) 995-998). Он не обнаруживается в селезенке, поджелудочной железе и печени. YKL-39 также может экспрессироваться в развивающемся мозге и плаценте. Также повышенный уровень экспрессии гена YKL-39 показан у пациентов с болезнью Альцгеймера и в глиобласомах (Colton, С. А., Mott, R. Т., Sharpe, Н., Xu, Q., Van Nostrand, W. Е. and Vitek, M. P. (2006). Expression profiles for macrophage alternative activation genes in AD and in mouse models of AD. J Neuroinflammation 3, 27). Какую функциональную роль может выполняет данный белок в глиобластомах на данный момент не известно, однако предполагается, что он может отвечать за пролиферативную способность клеток и ремоделирование внеклеточного матрикса (Miyatake, К., Tsuji, К., Yamaga, М., Yamada, J., Matsukura, Y., Abula, К., Sekiya, I. and Muneta, T. (2013). Human YKL39 (chitinase 3-like protein 2), an osteoarthritis- associated gene, enhances proliferation and type II collagen expression in ATDC5 cells. Biochem Biophys Res Commun 431, 52-57). За счет того, что данный белок секретируем, на него возлагают надежды как на потенциальный маркер глиобластом. Существуют публикации, в которых показано, что внесение хитиназоподобных белков в панель маркеров различных тестов приводит к повышению как чувствительности, так и специфичности тестов. Данная характеристика хитиназоподобных белков существенно расширяет их область применения.
Для выявления белка YKL-39 у человека на сегодняшний день существует несколько доступных коммерческих как поликлональных, так и моноклональных антител. Известные мышиные и кроличьи гибридомы, продуцирующие моноклональные антитела к цитоплазматическому антигену YKL-39 человека, были получены при иммунизации животных как полноразмерным рекомбинантным белком YKL-39 человека, так и различными рекомбинантными и синтетическими полипептидными участками белка YKL- 39 человека. К недостаткам описанных клонов относятся дороговизна моноклональных антител, продуцируемых данными гибридомами, ввиду их зарубежного происхождения, а также отсутствие для некоторых из них данных о тестировании в реакциях иммуногистохимии, иммунофлуоресценции, использующихся в ежедневной клинико- диагностической практике, а также иммуноблоттинге.
Задачей изобретения является расширение ассортимента моноклональных антител, обладающих специфичностью к белку YKL-39 человека, использующихся для иммунодиагностики и прогностической оценки течения опухолевых заболеваний у человека.
Поставленная задача решается за счет мышиной гибридомы YKL-39, клон 1В2 G4 - продуцента моноклонального антитела, выявляющего YKL-39 методами иммуноферментного анализа, иммуноцитохимии, иммуногистохимии, иммунофлуоресценции и иммуноблоттинга, полученной путем иммунизации мышей линии Balb/c рекомбинантным полноразмерным белком, и слиянием сенсибилизированных спленоцитов иммунизированных мышей с клетками мышиной миеломы линии sp2/0 с помощью полиэтиленгликоля с молекулярной массой 1500.
Продуцируемые гибридомой 1В2 G4 моноклональные антитела к белку YKL-39 человека обладают селективной способностью связывать белок YKL-39 человека в иммуноферментном анализе (Таб.1), на иммуноблотах (Фиг.4), на клеточном (Фиг.2, Фиг.З) и тканевом уровнях (на парафиновых срезах) (Фиг.1), и расширяют существующий доступный ассортимент моноклональных антител к белку YKL-39. Также следует отметить, что каждая вновь полученная гибридома уникальна. Моноклональные антитела, продуцируемые разными гибридомами, различаются по своей первичной структуре, по специфичности к различным антигенным детерминантам, аффинности и другим свойствам. Поэтому получение как можно большего количества моноклональных антител к белку YKL-39 человека важно с научной и практической точки зрения.
Технический результат изобретения заключается в получении линии гибридом мыши 1В2 G4, продуцирующей доступные для отечественных клинико-диагностических лабораторий моноклональные антитела к цитоплазматическому антигену YKL-39 человека, пригодных для иммуноферментного анализа, иммуноцитохимии, иммуногистохимии, иммуноблоттинга и иммунофлуоресценции, и позволяющие использоваться для диагностики глиобластом.
Мышиную гибридому YKL-39, клон 1В2 G4 получали следующим образом:
Для получения бактериального штамма, экспрессирующего рекомбинантный белок YKL-39, его кодирующая последовательность была заклонирована в вектор рЕТ45Ь(+). Ген YKL-39 человека (нуклеотидная последовательность кДНК YKL-39 человека доступны в базе данных GeneBank по адресу http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/ с порядковым номером M_004000.2) амплифицируют на матрице кДНК, полученной из мРНК клеток линии LN229 с использованием ген-специфических праймеров (YKL-39 F3006 Xho ACTTCTCGAGACCATGGGAGCAACCACC, YKL-39 R3006 Hind
TAGAAAGCTTCAAGGAGCCAAGGCTTC, встроенные сайты эндонуклеаз рестрикции Xhol/Hindlll). Амплифицированные фрагменты ДНК очищали и клонировали в вектор рЕТ45Ь(+) по сайтам, созданным эндонуклеазами рестрикции. В результате была получена плазмида, несущая ген белка YKL-39 человека. Плазмиду тестировали на наличие нуклеотидных замен методом автоматического секвенирования ДНК. Компетентные клетки Е. coli штамм BL21 DE3 химически трансформировали полученной плазмидой pET45b(+)-YKL-39, высевали на чашки с LB-агаром, содержащим 100 мкг/мл ампициллина, и инкубировали при 37°С в течение 16 ч. Далее в 50 мл среды LB переносили единичную колонию и наращивали при 37°С в течение 16 ч при постоянном перемешивании. Далее из ночной культуры экспрессию белков в бактериях E.coli BL21 DE3 стимулировали с помощью IPTG в конечной концентрации 1мМ в течение 4-5 часов при 37°С. По истечении времени стимуляции клетки бактерий были лизированы, сонифицированы с помощью ультразвука и подвержены процедуре очистки.
На первой стадии тельца включения экстрагировались 5М мочевиной в PBST в течение 1 часа при комнатной температуре. При этом не происходило растворения целевых белков, однако отделялось множество примесей и наблюдалось значительное уменьшение массы осадка телец включения.
На второй стадии для лизиса телец включения был использован буфер следующего состава: (Аргинин - 0.5 М, Мочевина - 6 М, Трис - 20 мМ, рН 10.0, Дитиотреитол - 50 мМ, ЭДТА - 5 мМ, Глицин 10 мМ). Лизис осуществляли в течение 12 часов при +4°С. Раствор центрифугировали при 10 000 об/мин в течение 5 минут при +4°С. Если оставался осадок, его повторно экстрагировали /г объема лизирующего буфера с последующем центрифугированием и объединением супернатантов. Рефолдинг белков проводили путем перевода гельфильтрацией на колонке Сефадекса G-25 в буфер следующего состава с последующей инкубацией в течение 12-36 часов при 4°С: (NaCL - 0.5 М, Мочевина 4 (1) М*, Аргинин - 0.5 (0.05) М*, ЭДТА - 1 мМ, Цистеамин - 10 мМ, Имидазол - 2 мМ, PBST - до 50 мл. *- начальные значения (в скобках) по результатам эксперимента были корректированы в сторону увеличения)). Дальнейшую очистку белков производили метал- хелатной хроматографией (IMAC) на колонке ГМАС Sepharose 6 Fast Flow (GEHealthCare, 17-0921-08). Для этого белки переводили гельфильтрацией на колонке Сефадекса G-25 в IMAC-буфер следующего состава: (NaCL - 0.5 М, Мочевина - 1М, Имидазол - 5 мМ, Аргинин - 50 мМ, PBST - до 50 мл). Белок наносили на колонку F AC Sepharose 6 Fast Flow, уравновешенную буфером, приведенного выше состава. Колонку промывали ступенчатым градиентом концентрации имидазола. Было установлено, что до концентрации имидазола 20 мМ видимой элюции целевого белка не происходит. Эффективная элюция белка YKL-39 с минимальными примесями происходит при 75 мМ имидазола. Полученный в результате процедуры очистки белок YKL-39 был использован в качестве антигена для дальнейшей иммунизации мышей.
Первичную иммунизацию проводили мышам Balb/c (самкам, 18 гр), вводя около 30 мкг антигена (рекомбинантный белок Ykl-39) с полным адъювантом Фрейнда (1 : 1) в лапы и в холку. Бустирование антигеном с неполным адъювантом Фрейнда проводили через две недели после первичной иммунизации. Гибридизацию (слияние) спленоцитов мышей с клеточной линией Sp 2/0 делали через 3 дня (на 4-й день) после бустирования с помощью PEG 1500. В среду для посадки гибридом (RPMI-1640 с 15% FetalClone I) добавляли HAT в соответствии с рекомендациями производителя. Полученные гибридомы были рассажены на три 96-луночные планшета по 150 мкл суспензии в лунку и оставлены на 10 дней после чего были протестированы методом ИФА. В результате тестирования отобран 21 клон, хорошо связывающий антиген. Проведено первое клонирование для всех клонов. По результатам ИФА на взаимодействие с полноразмерным рекомбинантным Ykl-39 отсажено по 3 субклона для 21 клона, а затем отобраны сильные субклоны. В результате отобрано и заморожено 19 клонов. В качестве дополнительных ИФА-тестов были тесты на взаимодействие с неконсервативными последовательностями (NCR) YKL-39, YKL-40, SI- CLP, с N и С-концевыми частями YKL-39, с полноразмерным YKL-40, пептидом 2 YKL-39 (226-241), пептидом 4 SI-CLP (259-276). По результатам ИФА-тестов, показывающих взаимодействие антител с другими антигенами было отобрано для наработки антител и заморозки 4 финальных клона: 1А12А4, 1С12А4, 1D1A1, 1B2G4 (Таб. 1).
Затем отобранные по ИФА антитела тестировали методом иммуноцитохимии и иммунофлуоресценции. Антиетела всех 4 клонов протестировали на клетках культуры LN229. Только одни антитела показали четкое связывание с антигеном YKL-39 в клетках в виде гранул в цитоплазме - клон 1В2 G4 (Фиг. 2, 3).
Антитела к белку YKL-39, клон 1В2 G4 тестировали методом иммуногистохимии на срезах нормальной почки (Фиг. 1). Наблюдалась четкая цитоплазматическая окраска клеток почечных канальцев.
Дополнительно был проведен иммуноблоттинг (Фиг. 4) для проверки антител на тотальных лизатах клеточной линии глиобластомы LN229 и показано, что антитела к Ykl- 39, клон 1В2 G4 связывают белок Ykl-39.
Таким образом антитела, продуцируемые гибридомой Ykl-39, клон 1В2 G4, тестировали методами иммуноферментного анализа, иммуноцитохимии, непрямой иммунофлуоресценции, иммуноблоттинга на тотальных лизатах клеточной линии LN229, содержащей белок YKL-39. Антитела связываются с полноразмерным белком Ykl-39, с неконсервативной последовательностью Ykl-39, с Ν-концевой последовательностью Ykl- 39, специфически работают в иммуноцитохимии на клетках LN229, иммуногистохимии на тканях почки и иммуноблоттинге на тотальных лизатах LN229.
Мышиная гибрид ома YKL-39, клон 1В2 G4 - продуцент моноклонального антитела YKL-39 - имеет следующие характеристики:
Морфологические признаки: Культура имеет вид суспензии, где клетки собраны в конгломераты и слабо прикрепляются к субстрату.
Условия рутинного культивирования клеток гибридомы YKL-39, клон 1В2 G4: Среда для культивирования - RPMI-1640 («НуОопе», США), 7,5% эмбриональной телячьей сыворотки FetalClone 1 («НуОопе», США), 4 мМ L-глутамина, 100 мкг/мл гентамицина. Условия культивирования: 37°С, абсолютная влажность и 5% С02 в атмосфере. Частота пассирования - каждые 3-4 суток, кратность рассева 1 :5-1 : 10.
Способ криоконсервирования клеток гибридомы YKL-39, клон 1В2 G4. В суспензию клеток в кондиционированной среде добавляют 7-10% ДМСО («ПанЭко», Россия). Криопробирки с суспензией клеток перемешивают и помещают на сутки в холодильник на -80°С, затем переносят в жидкий азот для длительного хранения. Жизнеспособность клеток после размораживания 80%. После размораживания клетки культивируют при плотности 0.2-0.3 106 кл/мл.
Бактерии, грибы, дрожжи и микоплазма в культуре не обнаружены.
Изотип моноклонального антитела YKL-39, клон 1В2 G4: моноклональное антитело, секретируемое гибрид омой 1В2 G4, относится к иммуноглобулинам класса IgG2b.
Специфичность моноклонального антитела YKL-39, клон 1В2 G4. Моноклональное антитело выявляет белок YKL-39 в тканях почки человека (Фиг.1), в ряде клеточных линий разного тканевого происхождения, например, в линии LN229 (глиобластома) (Фиг.2, 3). Антитело 1В2 G4 также узнает рекомбинантный YKL-39 в тотальных клеточных лизатах клеточной линии глиобластомы LN229 на иммуноблотах (Фиг.4).
Оптимальные разведения антител YKL-39, клон 1В2 G4, определяемые в супернатанте методом иммуногистохимии - 1 : 1, методом непрямой иммунофлуоресценции - 1 :2, методом иммуноблотов - 1 :2.
Продуцируемое гибридомой 1В2 G4 моноклональное антитело рекомендуется для специфического выявления антигена YKL-39 в крови и прочих жидкостях методом иммуноферментного анализа, в тканях, содержащих данный антиген - методом иммуногистохимии, а также в цитоплазме неопластических клеток глиобластомы человека методами иммуноцитохимии, иммунофлуоресценции, иммуноблоттинга.
Изобретение иллюстрируют следующие фотографии и таблица:
Таб. 1. ИФА, показывающий связывание антител к Ykl-39, клон 1В2 G4 помимо полноразмерного Ykl-39 с различными антигенами: неконсервативными последовательностями (NCR) YKL-39, YKL-40, SI-CLP, с N и С-концевыми частями YKL- 39, с полноразмерным YKL-40, пептидом 2 YKL-39 (226-241), пептидом 4 SI-CLP (259-276).
Фиг. 1. Специфичность антитела YKL-39, клон 1В2 G4, продуцируемого гибридомой 1В2 G4, к белку YKL-39 в клетках почки, выявляемая методом иммуногистохимии. Для детекции связавшихся с антигеном антител, были использованы вторичные антитела к иммуноглобулинам мыши, конъюгированные с полимерной пероксидазой хрена (ПраймБиоМед, Россия) и субстрат ДАБ, как описано в Примере 1. Специфическая гранулярная окраска цитоплазмы клеток канальцев на парафиновом срезе ткани, фиксированном формалином, свидетельствует о наличии клеток, экспрессирующих YKL-39.
Фиг. 2. Специфичность антитела, продуцируемого гибридомой 1В2 G4, к белку YKL-39 в клетках человека линии LN229, выявляемая методом иммунофлуоресценции. Стрелками обозначен окрашенный антителом 1В2 G4 YKL-39, располагающийся в везикулах эпителиальных клеток линии LN229. Для выявления связавшихся с антигеном антител использовались вторичные антитела к иммуноглобулинам мыши, конъюгированные с флуорохромом Alexa Fluor 488 (Molecular Probes, США), как описано в Примере 2.
Фиг.З. Специфичность антитела, продуцируемого гибридомой YKL-39, клон 1В2 G4, к белку YKL-39 в клетках человека линии LN229, выявляемая методом иммуноцитохимии. Темные точки представляют собой окрашенный антителом антиген YKL-39, располагающийся в везикулах клеток линии LN229. Для выявления связавшихся с антигеном антител использовались вторичные антитела к иммуноглобулинам мыши, конъюгированные с полимерной пероксидазой хрена (ПраймБиоМед, Россия) и субстрат ДАБ как описано в Примере 2.
Фиг. 4. Специфичность антитела, продуцируемого гибридомой YKL-39, клон 1В2 G4, к белку YKL-39 на тотальных лизатах клеточной линии глиобластомы LN229 выявляется на иммуноблотах. Связывание белка YKL-39 антителом 1В2 G4 после переноса белков на мембрану. Белковые лизаты приготовлены, а мембрана проявлена, как описано в Примере 3. Электрофоретическая подвижность белка соответствует расчетной.
Изобретение иллюстрируют следующие примеры:
Пример 1. Приготовление срезов для иммуногистохимического выявления белка YKL-39.
Иммуногистохимическое исследование проводят на операционном материале, фиксированном 10%-ным нейтральным формалином, забуференным фосфатным буфером, в течение 24 часов. После гистологической проводки материал заливают в парафин и затем готовят срезы толщиной 2-4 мкм. Срезы монтируют на специальные высокоадгезивные стекла (SuperFrost Plus, ApexLab) и высушивают в течение 18 часов при температуре 37°С.
Парафин далее удаляют со срезов в трех сменах ксилола, по 10 мин в каждой смене. Проводят срезы через спирты с объемной долей изопропанола 100% (I), 100% (II), 70%, 50% по 5 мин в каждом и промывают в дистиллированной воде. Блокировка эндогенной пероксидазы проводится в 3% перекиси водорода 10 минут. Срезы инкубируют с антителами YKL-39, клон 1В2 G4, а затем с антителами к иммуноглобулинам мыши, конъюгированными с полимерной пероксидазой хрена (ПраймБиоМед, Россия). Окрашивание проявляется при добавлении субстрата ДАБ хромогена на 5-10 минут (ПраймБиоМед, Россия). Результат представлен на Фиг.1.
Пример 2. Способы фиксации клеток для выявления белка YKL-39 в реакции непрямой иммунофлуоресценции и иммуноцитохимии.
Культуру LN229 выращивают на покровных стеклах до достижения 30% конфлуентности. Клетки фиксируют, помещая в 3,7% параформальдегид на 15 мин, с последующей промывкой в PBS (ПанЭко, Россия) на 10 мин. После фиксации и промывок клетки инкубируют с антителом YKL-39, клон 1В2 G4 1 ч при комнатной температуре, а затем с козьими антителами к иммуноглобулинам мыши, конъюгированными с флуорохромом А1еха488 (Jacksonlmmunoresearch, США), или полимерной пероксидазой хрена (ПраймБиоМед, Россия) 40 или 15 мин, соответственно, при комнатной температуре. Для визуализации окрашивания в нефлуоресцентном методе добавляют субстрат ДАБ хромоген на 5-10 минут (ПраймБиоМед, Россия) Препараты заключают в среду для заключения на водной основе и изучают в микроскоп Olympus ВХ53 (Cheminst, Германия), сопряженный с 2 мп камерой Infinity 2 (Lumenera, США), используя объективы U PlanFL N х40/ЧА 0.75 и U PlanFL N х ЮО/ЧА 1.30. Для иммунофлуоресценции используются фильтры, U-FUNA и U-FGNA (Olympus, Япония). Результаты представлены на Фиг. 2 и 3.
Пример 3. Способ получения тотальных клеточных лизатов и выявления нативного белка YKL-39 методом иммуноблоттинга.
5х 105 клеток линии LN229 лизируют на льду в буфере, содержащем 50 тМ Трис- (гидроксиметил)-аминометана (рН 7.5), 150 mM NaCl, 10% глицерина, 0.5% Тритона Х-100 и коктейль протеазных ингибиторов (Roche, США). Суммарную концентрацию белков в лизатах определяют по методу Бредфорд с помощью Protein Assay Kit (Bio-Rad, США), следуя рекомендациям производителя.
Перед электрофоретическим разделением к приготовленным лизатам добавляют 5х- ный буфер Лэммли, содержащий 250 мМ Трис-(гидроксиметил)-аминометана (рН 6.8), 50% глицерина, 10% додецилсульфата натрия (ДСН), 500 мМ бета-меркаптоэтанола, 0.5% бромфенолового синего. Образцы подвергают термической обработке при 95°С 5 мин. В каждую лунку 10% полиакриламидного геля с ДСН (ПААГ-ДСН) наносят лизаты, содержащие не менее 15 мкг суммарного белка. Электрофоретическое разделение белков в ПААГ-ДСН проводят 30 мин при 60 В и 60 мин при 120 В для дальнейшего разделения в электрофорезной камере. Далее гель инкубируют в буфере для проведения блоттинга, содержащем 50 мМ Трис-(гидроксиметил)-аминометана, 38 мМ глицина, 0.1% ДСН и 20% метанола. Перенос белков на нитроцеллюлозную мембрану (0.22 мкм, Millipore, США) проводят при постоянной силе тока 250 мА 60 мин. Мембрану блокируют 5% молоком (Bio- Rad, США) 1 час, инкубируют с антителами YKL-39, клон 1В2 G4 (ночь при +4°С), а затем с антителами к иммуноглобулинам мыши, конъюгированными с пероксидазой хрена (разведение 1 :5000, Abeam, США) -1 час. Сухое молоко (Bio-Rad, США) и антитела разводят в буфере TBST, содержащем 20 мМ Трис-(гидроксиметил)-аминометана (рН 7.6), 150 мМ NaCl, 0.05% Твина-20. Мембрану проявляют методом хемилюминесценции, используя набор ECL+Plus (Millipore, Великобритания) согласно инструкции производителя. Хемилюминесцентную реакцию регистрируют на приборе ChemiDoc MP (Bio-Rad, UK) с последующей обработкой с помощью программы ChemiDoc XRS+ imaging systems. Результаты представлены на Фиг.4.

Claims

ФОРМУЛА
Мышиная гибридома YKL-39, клон 1В2 G4 - продуцент моноклонального антитела, узнающего белок Ykl-39 методом иммуноферментного анализа, а также в неопластических клетках глиобластомы и в клетках других органов, содержащих данный антиген, методами иммуноцитохимии, иммуногистохимии, иммуноблотирования и иммунофлуоресценции, полученная путем иммунизации мышей линии Balb/c полноразмерным рекомбинантным белком YKL-39 человека и слиянием сенсибилизированных спленоцитов иммунизированных мышей с клетками мышиной миеломы линии sp2/0 с помощью 50%- ного раствора полиэтиленгликоля с молекулярной массой 1500.
8
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
PCT/RU2018/050043 2017-06-28 2018-04-18 Мышиная гибридома ykl-39, клон 1в2 g4 - продуцент моноклонального антитела, обладающего специфичностью к цитоплазматическому антигену ykl-39 человека WO2019004875A1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2017122831A RU2667423C1 (ru) 2017-06-28 2017-06-28 Мышиная гибридома ykl-39, клон 1b2 g4 - продуцент моноклонального антитела, обладающего специфичностью к цитоплазматическому антигену ykl-39 человека
RU2017122831 2017-06-28

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2019004875A1 true WO2019004875A1 (ru) 2019-01-03

Family

ID=63580369

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU2018/050043 WO2019004875A1 (ru) 2017-06-28 2018-04-18 Мышиная гибридома ykl-39, клон 1в2 g4 - продуцент моноклонального антитела, обладающего специфичностью к цитоплазматическому антигену ykl-39 человека

Country Status (2)

Country Link
RU (1) RU2667423C1 (ru)
WO (1) WO2019004875A1 (ru)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2728228C1 (ru) * 2019-12-23 2020-07-28 ОБЩЕСТВО С ОГРАНИЧЕННОЙ ОТВЕТСТВЕННОСТЬЮ "ПраймБиоМед" Мышиная гибридома YKL-40, клон 2G8 C10 - продуцент моноклонального антитела, обладающего специфичностью к цитоплазмотическим антигенам YKL-39, YKL-40 и SI-CLP человека

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070122413A1 (en) * 2005-11-28 2007-05-31 Sivakumar Pallavur V Il-21 antagonists

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2233290C2 (ru) * 1998-07-23 2004-07-27 Акцо Нобель Н.В. Новые пептиды для применения в иммунотерапии аутоиммунных заболеваний

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070122413A1 (en) * 2005-11-28 2007-05-31 Sivakumar Pallavur V Il-21 antagonists

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHEHRNOSHEI D.A. ET AL.: "Metody immunoanaliza, osnovannye na primenenii mechenykh komponentov, uchebno-metodicheskoe posobie", BGMU, 2007, Minsk, pages 28 *
RANOK A. ET AL.: "Human Cartilage Chitinase 3-like Protein 2: Cloning, Expression, and Production of Polyclonal and Monoclonal Antibodies for Osteoarthritis Detection and Identification of Potential Binding Partners", MONOCLONAL ANTIBODIES IN IMMUNODIAGNOSIS AND IMMUNOTHERAPY, vol. 32, no. 5, 2013, pages 317 - 325, XP055402849, DOI: 10.1089/mab.2013.0016 *

Also Published As

Publication number Publication date
RU2667423C1 (ru) 2018-09-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6324970B2 (ja) 抗ウロプラキンｉｉ抗体システムおよび方法
US7867725B2 (en) Monoclonal antibodies against osteopontin
WO2004040313A1 (ja) 尿路上皮癌腫瘍マーカー
JP2015092192A (ja) 膀胱癌の診断
KR101495225B1 (ko) Ast 양의 측정을 통한 간 질환 진단, 예후 또는 모니터링 키트 및 방법
KR101777259B1 (ko) En2 단백질을 특이적으로 인식하는 단클론 항체 또는 이를 함유하는 전립선암 진단용 조성물
CA2847109A1 (en) Marker for detecting colorectal cancer or esophageal cancer and method for examining such cancer
RU2667423C1 (ru) Мышиная гибридома ykl-39, клон 1b2 g4 - продуцент моноклонального антитела, обладающего специфичностью к цитоплазматическому антигену ykl-39 человека
WO2011108626A1 (ja) 胃癌検出用マーカー及び胃癌検出方法
RU2728228C1 (ru) Мышиная гибридома YKL-40, клон 2G8 C10 - продуцент моноклонального антитела, обладающего специфичностью к цитоплазмотическим антигенам YKL-39, YKL-40 и SI-CLP человека
US11746146B2 (en) Antibody composition specifically recognizing an immunogenic fragment peptide of EN2 protein
RU2714685C1 (ru) Мышиная гибридома SI-CLP, клон 3D4 - продуцент моноклонального антитела, обладающего специфичностью к белку SI-CLP
JP2014115186A (ja) 胃癌、肺癌及び／又は食道癌の検出方法
JP2022128212A (ja) モノクローナル抗体、サイトケラチン１８フラグメントの測定試薬、試薬キットおよび測定方法
RU2788714C1 (ru) Мышиная гибридома PU.1, клон 4G6 - продуцент моноклонального антитела, обладающего специфичностью к белку PU.1 человека
RU2435850C1 (ru) Мышиная гибридома р56 - продуцент моноклонального антитела, обладающего специфичностью к ядерному антигену пролиферирующих клеток pcna человека
KR20160091276A (ko) Cdc 단백질 및 콜레스테롤 항체를 이용한 콜레스테롤 측정 방법
WO2022080305A1 (ja) 抗ｐｔｄｓｓ２抗体
RU2636042C1 (ru) Мышиная гибридома AMACR, клон G8 - продуцент моноклонального антитела, обладающего специфичностью к альфа-метилацил-коэнзим A рацемазе (AMACR) человека
JP2012018119A (ja) 大腸癌検出用マーカーおよびそれを用いた大腸癌検出方法
US9127054B2 (en) Immunoassay of cofilin 1 protein
JP4451784B2 (ja) 前立腺癌腫瘍マーカー
EP0803065B1 (en) A-protein as a diagnostic of cancer
EP2205977A1 (en) Use of tenascin-w as a biomarker for colon cancer
WO2013031757A1 (ja) 膵癌、乳癌、肺癌又は前立腺癌の検出用マーカー及び検査方法

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 18824364

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 18824364

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1