KR20160091276A - Cdc 단백질 및 콜레스테롤 항체를 이용한 콜레스테롤 측정 방법 - Google Patents

Cdc 단백질 및 콜레스테롤 항체를 이용한 콜레스테롤 측정 방법 Download PDF

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Abstract

본원은 콜레스테롤 결합 단백질인 CDC (Cholesterol Dependent Cytolysin)와 HDL-C 또는 LDL-C를 특이적으로 인식하는 항체를 이용한 콜레스테롤 측정방법을 개시한다. 본원에 따른 방법은 저밀도 지질단백질 및 고밀도 지질단백질을 저비용으로 신속하게 측정이 가능하여, 이의 측정이 필요한 다양한 분야에 효과적으로 적용될 수 있다.

Description

CDC 단백질 및 콜레스테롤 항체를 이용한 콜레스테롤 측정 방법 {Method of measuring cholesterol level using CDC protein and antibody against cholesterol}
본원은 콜레스테롤 레벨 측정에 대한 기술분야로 구체적으로 면역학적인 방법으로 콜레스테롤 레벨을 측정하는 기술에 관한 것이다.
콜레스테롤은 대표적인 지방의 한 종류로 포도당과 함께 중요한 에너지원인 동시에 성호르몬, 부신 피질 호르몬의 중요한 원료가 되기도 한다. 콜레스테롤이 기능을 하기 위해서는 혈액을 통한 이동이 필요하지만, 물에 녹지 않기 때문에 혈액 내에서는 운반 단백질(Carrier Protein)에 의해서 이동한다. 이 콜레스테롤과 결합한 운반 단백질을 지질단백질(Lipoprotein) 이라고 하며, 이 지질단백질은 밀도(Density)에 따라서 크게 LDL(Low Density Lipoprotein: 저밀도 지질단백질)과 HDL(High Density Lipoprotein: 고밀도 지질단백질)로 분류한다.
LDL과 HDL 두 가지 모두 세포의 정상적인 기능에 꼭 필요하지만 적정 수준(정상 성인의 경우 HDL 60mg/dl 이상, LDL 130mg/dl 이하)에서 벗어나는 경우 질환으로 이어질 수 있으며 예를 들면 LDL이 과다한 경우 혈전이 생성되어 죽상동맥경화증(atherosclerosis)으로 발전되어 심장마비를 일으킬 수 있다. 뿐만 아니라 고혈압, 뇌졸중, 비만, 당뇨 등의 성인병을 일으키는 데 큰 영향을 미친다(William P. et al., Incidence of Coronary Heart Disease and Lipoprotein Cholesterol Levels: The Framingham Study., In JAMA, 1986., MR Law NW, SG Thompson. By how much and how quickly does reduction in serum cholesterol concentration lower risk of ischaemic heart disease, In BMJ, 1994.).
따라서 임상에서 혈중 콜레스테롤의 수치를 측정하고 이를 근거로 콜레스테롤 수치를 낮추기 위한 요법이 수행되고 있다.
기존의 콜레스테롤 측정 방법은 프리데발트 (Friedewald: LDL-c = TC-[HDL-c + TG/k], k = 5) 공식을 이용하여 계산하는 것이다. 하지만 위 공식은 백만명 이상을 대상으로 한 연구에서 그 부정확성이 보고되었다 (Martin SS et al., J Am Coll Cardiol. 2013 Aug 20;62(8):732-9; Larosa JC. J Am Coll Cardiol. 2013 Aug 20;62(8):740-1). 위 공식은 중성지방이 400mg/dL 이상이거나 검체에 지질단백질 중 거대입자인 킬로미크론(chylomicron; lipoprotein)이 다량 존재할 때 등의 경우에는 수치가 정확하지 않으며, 측정에도 상당한 시간이 소요되고 비용도 부담이 되는 수준이다.
한국 공개특허 2010-0091176호는 소입자 고비중 LDL 콜레스테롤의 정량 방법 및 키트에 관한 것으로, 포스포리파아제의 존재하에서 소입자 고비중 LDL 이외의 LDL 중의 콜레스테롤을 소거하는 공정과, 상기 공정에서 잔존하는 리포 단백 중의 콜레스테롤을 정량하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는, 피검체 시료 중의 소입자 고비중 LDL 콜레스테롤 정량 방법을 개시한다.
따라서 새로운 방법에 기반을 둔 신속하고 저비용의 고효율적인 콜레스테롤 측정방법의 개발이 필요하다.
본원에서는 CDC (Cholesterol Dependent Cytolysin) 및 콜레스테롤 항체를 이용하여 콜레스테롤을 정확하고 신속하게 측정하는 방법을 제공하고자 한다.
한 양태에서 본원은 콜레스테롤 농도 측정이 필요한 시료를 콜레스테롤 결합 단백질인 CDC (Cholesterol Dependent Cytolysin)와 접촉하는 단계로, 상기 접촉에 의해 상기 시료 중의 콜레스테롤과 CDC의 제 1 복합체가 형성되고; 상기 제 1 복합체를 상기 콜레스테롤을 특이적으로 인식하는 항체와 접촉하는 단계로, 상기 접촉에 의해 상기 제 1 복합체와 상기 항체로 형성되는 제 2 복합체가 형성되고; 그리고 상기 제 2 복합체를 검출하는 단계를 포함하는, CDC 및 항체를 이용한 인비트로에서 콜레스테롤 측정 방법을 제공한다.
대안적으로 본원은 또한 콜레스테롤 농도 측정이 필요한 시료를 상기 콜레스테롤을 특이적으로 인식하는 항체와 접촉하는 단계로, 상기 접촉에 의해 상기 시료 중의 콜레스테롤과 항체가 제 3 복합체를 형성하고; 상기 제 3 복합체를 상기 콜레스테롤에 특이적으로 결합하는 CDC (Cholesterol Dependent Cytolysin)와 접촉하는 단계로, 상기 접촉에 의해 상기 제 3 복합체와 상기 CDC로 형성되는 제 4 복합체가 형성되고; 그리고 상기 제 4 복합체를 검출하는 단계를 포함하는, CDC 및 항체를 이용한 인비트로에서 콜레스테롤 측정 방법을 제공한다.
본원에 따른 방법에서 콜레스테롤에 대한 결합력을 갖는 그람양성 박테리아 유래의 다양한 CDC가 사용될 수 있다.
본원에 따른 방법에서 CDC와 함께 사용되는 항체는 콜레스테롤을 특이적으로 인식하는 항체로 측정하고자 하는 콜레스테롤의 종류에 따라서 LDL 또는 HDL을 특이적으로 인식하는 다양한 유래 및/또는 종류의 항-LDL 항체 또는 항-HDL 항체가 사용될 수 있다.
본원에 따른 방법은 콜레스테롤 측정이 필요한 다양한 시료에 적용될 수 있으며, 예를 들면 전혈, 혈장 또는 혈청을 이용한 측정이 가능하다.
본원에 따른 방법은 다양한 분석 방식 예를 들면 ELISA 또는 측방유동 방식의 래피드 키트 등에 적용되어 사용될 수 있으며, 이를 위해 일 구현예에서 CDC는 고형지지체 상에 결합되어 있고, 복합체의 검출을 위해 콜레스테롤 항체는 검출가능한 물질로 표지되어 있거나, 또는 항체는 고형지지체 상에 결합되어 있고, 복합체의 검출을 위해 상기 CDC는 검출 가능한 물질로 표지될 수 있으나, 이로 제한하는 것은 아니다.
다른 양태에서 본원은 또한 콜레스테롤 결합 단백질인 CDC (Cholesterol Dependent Cytolysin) 및 LDL 항체 및/또는 HDL 항체를 포함하는 콜레스테롤 측정 키트를 제공한다.
또 다른 양태에서 본원은 또한 콜레스테롤 결합 단백질인 CDC (Cholesterol Dependent Cytolysin)를 항체와 함께 콜레스테롤 농도 측정에 사용하는 용도에 관한 것이다.
본원은 콜레스테롤 결합 단백질인 CDC (Cholesterol Dependent Cytolysin)를 이용한 콜레스테롤 측정방법을 개시한다. 본원에 따른 방법은 저밀도 지질단백질 및 고밀도 지질단백질을 저비용으로 신속하고 간단하게 측정하는 것이 가능하여, 기존의 방법을 대체하여 이의 측정이 필요한 다양한 분야에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본원의 일 구현예에 따른 CDC 및 콜레스테롤 항체를 이용한 콜레스테롤 측정방법의 모식도이다.
도 2는 본원의 또 다른 구현예에 따른 CDC 및 콜레스테롤 항체를 이용한 콜레스테롤 측정방법의 모식도이다.
도 3a는 본원에 따른 일 구현예에서 제조된 HDL에 대한 항체를 SDS-PAGE로 분석한 결과이다.
도 3b는 도 3a의 HDL 항체의 농도를 측정한 결과이다.
도 4a는 본원에 따른 일 구현예에서 제작된 LDL에 대한 항체를 SDS-PAGE로 분석한 결과이다.
도 4b는 도 4a의 LDL 항체의 농도를 측정한 결과이다.
도 5는 본원의 일 구현예에서 제조된 CDC의 하나인 PLY의 핵산서열 및 이를 세포에서 발현하고 분리 정제한 후 SDS-PAGE로 분석한 결과이다.
도 6은 본원의 일 구현예에서 제조된 CDC의 하나인 PFO의 핵산서열 및 이를 세포에서 발현하고 분리 정제한 후 SDS-PAGE로 분석한 결과이다.
도 7은 본원의 일 구현예에서 제조된 CDC의 하나인 LLO의 핵산서열 및 이를 세포에서 발현하고 분리 정제한 후 SDS-PAGE로 분석한 결과이다.
도 8은 본원의 일 구현예에서 제조된 CDC의 하나인 SLO_D4의 핵산서열 및 이를 세포에서 발현하고 분리 정제한 후 SDS-PAGE로 분석한 결과이다.
도 9는 본원의 일 구현예에서 제조된 CDC의 하나인 SLO의 핵산서열 및 이를 세포에서 발현하고 분리 정제한 후 SDS-PAGE로 분석한 결과이다.
도 10은 본원에서 제조된 CDC (SLO, SLO_D4, LLO, PFO, PLY)를 사용하여 콜레스테롤과 결합시킨 후 HDL-C의 주된 단백질인 Apo A-I을 검출하는 항체 (#11C1)을 이용하여 HDL-C을 측정한 결과이다.
도 11은 본원에서 제조된 CDC (SLO, SLO_D4, LLO, PFO, PLY)를 사용하여 콜레스테롤과 결합시킨 후 LDL-C의 주된 단백질인 Apo B-100을 detection하는 항체 (#4C2)을 이용하여 LDL-C을 측정한 결과이다.
도 12는 본원에서 제조된 CDC 단백질 및 LDL 항체를 이용하여 실검체에서 콜레스테롤 농도를 Rapid kit를 이용하여 측정한 후 기존의 두 종류의 장비를 이용하여 판독한 결과로, 두 장비에서 판독한 결과의 상관관계를 나타내는 그래프이다.
본원은 CDC (Cholesterol Dependent Cytolysin)와 LDL 또는 HDL에 대한 항체를 이용하여 시료 중의 콜레스테롤 농도를 측정할 수 있다는 발상에 근거한 것이다.
본원에 채용되는 CDC (Cholesterol Dependent Cytolysin)는 그람양성 박테리아에서 분비되는 베타-배럴(Barrel) 형태의 독소 단백질 패밀리를 일컫는 것이다. 이는 표적세포에 결합을 하여 베타-배럴 형태의 단백질을 세포막으로 삽입하여 구멍을 뚫는 방식으로 작용한다. 이러한 구멍형성을 위해서 필요한 성분이 세포막에 존재하는 콜레스테롤로, CDC는 일반적으로 세포막에 존재하는 콜레스테롤에 강하게 (strong affinity) 결합한다.
본원에서는 예기치 않은 노력을 통해, 재조합 CDC를 이용하여 세포막이 아닌, 생물학적 시료 중에 존재하는 콜레스테롤을 측정할 수 있는 기술을 개발하였다.
따라서 한 양태에서 본원은 콜레스테롤 농도 측정이 필요한 시료를 콜레스테롤 결합 단백질인 CDC (Cholesterol Dependent Cytolysin)와 접촉하는 단계로, 상기 접촉에 의해 상기 시료 중의 콜레스테롤과 CDC의 제 1 복합체가 형성되고; 상기 제 1 복합체를 상기 콜레스테롤 또는 CDC를 특이적으로 인식하는 항체와 접촉하는 단계로, 상기 접촉에 의해 상기 제 1 복합체와 상기 항체로 형성되는 제 2 복합체가 형성되고; 그리고 상기 형성된 제 2 복합체를 검출하는 단계를 포함하는, CDC를 이용한 인비트로에서 콜레스테롤을 측정 방법에 관한 것이다.
본원에 따른 방법은 콜레스테롤 측정이 요구되는 시료를 CDC 와 1차로 반응을 시켜 제 1 복합체를 만든 후, 이 복합체를 콜레스테롤을 특이적으로 인식하는 항체를 이용하여 제 2 복합체를 만든다. 이어 CDC 또는 콜레스테롤을 인식하는 항체를 이용하여 제 2 복합체를 인비트로에서 측정하여 콜레스테롤의 농도를 결정할 수 있는 방법이다.
본원에 사용되는 CDC는 콜레스테롤에 친화도를 갖고 있는 다양한 그람양성 박테리아로 부터 유래된 것이 사용될 수 있다. 예를 들면 하기와 같은 CDC를 포함할 수 있으며, 각 CDC의 아미노산 서열은 공지된 것으로 예를 들면 괄호안의 접근 번호로 공지된 DB에서 찾을 수 있다: Bacillus anthracis 유래의 ALO (Anthrolysin O) (예를 들면 UniProt Accession NO: Q81N62), B. thurigiensis 유래의 TLO (Thuringiensilysin O) (예를 들면 NCBI Accession NO: YP_037419); B. cereus 유래의 CLO (Cereolysin O) (예를 들면 NCBI Accession NO: YP_002369889.1), B. weihenstephanensis 유래의 WLO (Weihenstephanensilysin) (예를 들면 NCBI Accession NO: ABY46062), Listeria monocytogenes 유래의 LLO (Listeriolysin O) (예를 들면 NCBI GenBank Accession NO: ABH07645), L. seeligeri 유래의 LSO (Seeligeriolysin O) (예를 들면 Uniprot Accession NO: P31830.1), L. ivanovii 유래의 ILO (Ivanolysin) (예를 들면 NCBI GenBank Accession NO: AAR97343.1), Lysinibacillus sphaericus 유래의 SPH (Sphaericolysin) (예를 들면 NCBI Accession NO: YP_001699692.1), Paenibacillus alvei 유래의 ALV (Alveolysin) (예를 들면 Uniprot Accession NO: P23564), Brevibacillus brevis 유래의 BVL (Brevilysin) (예를 들면 NCBI Accession NO: YP_002770211.1), Streptococcus dysgalactiae 유래의 SLOe (Streptolysin Oe) (예를 들면 NCBI GenBank Accession NO: BAD77791), S. pyogenes 유래의 SLO (Streptolysin O) (예를 들면 NCBI Accession NO: NP_268546.1), S. canis 유래의 SLOc (Streptolysin Oc) (예를 들면 Uniprot Accession NO: Q53957), S. pseudonemoniae 유래의 PSY (Pseudopneumolysin) (예를 들면 NCBI GenBank Accession NO: ACJ76900), S. pneumoniae 유래의 PLY (Pneumolysin) (예를 들면 NCBI GenBank Accession NO: ABO21366.1), S. mitis 유래의 MLY (Mitilysin) (예를 들면 NCBI GenBank Accession NO: ABK58695), S. suis 유래의 SLY (Suilysin) (예를 들면 NCBI GenBank Accession NO: ABE66337.1), S. intermedius 유래의 ILY (Intermedilysin) (예를 들면 NCBI GenBank Accession NO: BAE16324.1), S. mitis 유래의 LLY (Lectinolysin) (예를 들면 NCBI GenBank Accession NO: BAE72438.1), Clostridium perfringens 유래의 PFO (Perfringolysin O) (예를 들면 NCBI Accession NO: NP_561079), C. butyricum 유래의 BRY (Butyriculysin) (예를 들면 NCBI Accession NO: ZP_02950902.1), C. tetani 유래의 TLY (Tetanolysin O) (예를 들면 NCBI Accession NO: NP_782466.1), C. botulinum B 유래의 BLYb (Botulinolysin B) (예를 들면 NCBI Accession NO: YP_001886995.1), C. botulinum E3 유래의 BLYe (Botulinolysin E3) (예를 들면 NCBI Accession NO: YP_001921918.1), C. botulinum C 유래의 BLYc (Botulinolysin C) (예를 들면 NCBI Accession NO: ZP_02620972.1), C. novyi 유래의 NVL (Novyilysin) (예를 들면 NCBI Accession NO: YP_878174.1), Gardenella vaginallis 유래의 VLY (Vaginolysin) (예를 들면 UniProt Accesion NO: B2YGA4), Arcanobacterium pyogenes 유래의 PLO (Pyolysin) (예를 들면 NCBI GenBank Accession NO: AAC45754.1)와 같은 CDC가 사용될 수 있으나 이로 제한하는 것은 아니다.
CDC는 상술한 바와 같이 콜레스테롤에 흡착하여 세포막에 구멍을 뚫고 세포안으로 들어가 세포를 융해(lysis) 하는 특징을 가지고 있다. 따라서 본원은 콜레스테롤과의 결합에 초점을 맞추고 있기 때문에, 본원의 실시예에서 구현된 LLO, PFO, PLY, SLO 이외에도 상술한 바와 같은 다양한 그람 양성 박테리아 유래의 다양한 CDC가 사용될 수 있다.
이러한 CDC 단백질은 당업계에 공지된 유전자 재조합 방법 예를 들면 해당 유전자 증폭 및 박테리아에서의 발현과 같은 방법을 이용하여 제조될 수 있으며, 예를 들면 본원 실시예에 기재된 방법을 이용하여 제조될 수 있다.
본원에 따른 방법은 콜레스테롤 농도 측정이 필요한 다양한 시료, 예를 들면 콜레스테롤 농도 측정이 필요한 대상체, 예를 들면 포유류, 특히 사람 유래로, 예를 들면 전혈, 혈장 또는 혈청을 포함하나 이로 제한하는 것은 아니다.
다른 구현예에서 본원에 따른 방법에 사용되는 시료는 콜레스테롤을 포함하는 시료로 특별히 제한되는 것은 아니나, 예를 들면 전혈, 혈장 또는 혈청을 포함하나 이로 제한하는 것은 아니다.
본원에서 측정하고자 하는 콜레스테롤은 그 기능을 위해 혈액을 통한 이동이 필요하고, 물에 녹지 않기 때문에 혈액 내에서는 운반 단백질(Carrier Protein)에 의해서 이동된다. 이 콜레스테롤과 결합한 운반 단백질이 지질단백질(Lipoprotein)로 이는 밀도(Density)에 따라서 크게 LDL(Low Density Lipoprotein: 저밀도 지질단백질)과 HDL(High Density Lipoprotein: 고밀도 지질단백질)로 분류되며, 임상에의 적용을 위해서는 LDL, HDL 및 총콜레스테롤의 농도 측정이 필요하다.
본원에 따른 방법에서는 콜레스테롤과 결합된 CDC 복합체를 LDL 또는 HDL에 특이적인 항체와의 반응을 통해 각각의 농도를 측정할 수 있다.
대안적으로 본원에 따른 방법에서는 콜레스테롤과 결합된 CDC 복합체를 사용된 CDC에 특이적인 항체와의 반응을 통해 각각의 농도를 측정할 수 있다.
본원에 따른 일 구현예에서 CDC는 시료 중의 콜레스테롤과 결합하여 제 1 복합체를 형성하고 이 복합체 중의 LDL 또는 HDL를 이에 각각 특이적인 항체와 결합하여 제 2 복합체를 형성하고, 상기 제 2 복합체의 검출을 통해 각각의 농도를 측정한다.
대안적으로 본원에 따른 다른 구현예에서, 시료 중의 검출하고자 하는 콜레스테롤을 LDL 또는 HDL에 특이적인 항체와 먼저 결합하여 제 3 복합체를 형성하고, 이어 제 3 복합체 중의 콜레스테롤을 CDC와 결합하여 제 4 복합체를 형성하고, 제 4 복합체의 검출을 통해 각각의 농도를 측정한다.
제 2 복합체 또는 후술하는 제 4 복합체의 검출은 공지된 다양한 기술을 이용하여 수행될 수 있으며, 예를 들면 콜레스테롤 결합 항체를 후술하는 바와 검출가능한 물질로 표지하여 표지 물질에 의해 발생되는 신호를 직접 판독하여 검출할 수 있거나 또는 상기 항체를 인식하는 별개의 발색 가능한 항체를 사용하여 이 항체에 의한 신호를 판독하여 간접적으로 검출할 수 있다.
이런 측면에서 본원은 또한 콜레스테롤 농도 측정이 필요한 시료를 상기 콜레스테롤을 특이적으로 인식하는 항체와 접촉하는 단계로, 상기 접촉에 의해 상기 시료 중의 콜레스테롤과 항체가 제 3 복합체를 형성하고; 상기 제 3 복합체를 상기 콜레스테롤에 특이적으로 결합하는 CDC (Cholesterol Dependent Cytolysin)와 접촉하는 단계로, 상기 접촉에 의해 상기 제 3 복합체와 상기 CDC로 형성되는 제 4 복합체가 형성되고; 그리고 상기 제 4 복합체를 검출하는 단계를 포함하는, CDC를 이용한 인비트로에서 콜레스테롤 측정 방법에 관한 것이다.
본원에 따른 방법은 항원-항체 결합을 기반으로 하는 다양한 면역분석 방법에 적용될 수 있다.
본원에 따른 방법에 사용되는 항체는 LDL, HDL, 또는 상기 지질단백질에 포함된 특정 아포단백질, 예를 들면 LDL의 경우 아포 100 단백질을 특이적으로 인식하는 것이 사용될 수 있다. 이러한 항체는 시중에서 구입할 수 있거나, 공지된 방법에 따라 제조될 수 있으며, 예를 들면 본원 실시예에 기재된 방법을 참조하여 제조될 수 있다. 또한 항체는 모노클로날 또는 폴리클로날을 포함한다. 또한 항체는 전장 항체, 항체단편, 앱타머(aptamer), 아비머(avidity multimer) 또는 펩티도모방체(peptidomimetics)를 포함한다.
일 구현예에서는 ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay)가 사용된다. ELISA는 생물학적 시료 중의 미세한 양 (통상 나노그램 미만)으로 존재하는 특정 성분 (항원)을 검출 또는 정량하는 방법이다. 예를 들면 불활성의 폴리머에 생물학적 시료 중의 검출하고자 하는 물질에 특이적으로 결합하는 단백질을 직접 결합시키고, 여기에 상기 생물학적 물질을 반응시켜 복합체를 형성하고 상기 복합체는 항체와 결합시켜 검출한다. 항체는 검출을 위해 후술하는 바와 같이 특정 기질과 작용 시 색을 변하게 하거나 발광을 하게 하는 효소와 결합되어 있으며, 이를 이용하여 목적하는 물질을 정량하는 방식이다. 이 경우 본원에 따른 CDC는 폴리머(고상 지지체)에 결합되어 있고, 여기에 콜레스테롤을 결합시킨 후, 결합된 콜레스테롤을 LDL 또는 HDL 항체를 이용하여 검출하는 방식이며, 상기 항체는 검출을 위해 적절하게 표지되어 있거나 또는 상기 항체를 검출할 수 있는, 표지된 항체와 추가로 결합하게 하여 검출하게 된다. 또 다른 예에서는 LDL 또는 HDL 항체가 불활성의 폴리머 지지체에 결합되어 있으며 여기에 생물학적 시료를 적용하여 상기 항체에 결합시킨다. 결합되지 않은 시료는 제거하고, 여기에 상기 콜레스테롤에 결합하는 CDC 항체를 적용하는 방식이다.
본원에 따른 방법에서, CDC, 또는 HDL 또는 LDL 항체는 상술한 바와 같이 구체적으로 적용되는 방법에 따라서 고상 지지체에 결합되어 있거나 또한 검출을 위한 적절한 물질로 표지될 수 있다. 고상 지지체는 불활성의 표면을 갖으며, CDC 또는 항체가 결합될 수 있는 표면으로 예를 들면 글라스, 플라스틱 (예를 들면 폴리스티렌), 폴리사카라이드, 나일론 또는 나이트로셀룰로스로 제작된 비드, 막, 슬라이드 또는 마이크로타이터플레이트를 포함하나, 이로 제한하는 것은 아니다.
본원에 따른 CDC 또는 항체는 검출가능한 표지물질로 표지될 수 있으며, 표지물질은 분광학적, 광학적, 광화학적, 생화학적, 효소적, 전기적 및/또는 면역화학적 방법과 같은 임의의 적절한 방법을 이용하여 검출가능한 신호를 방출할 수 있는 물질을 의미한다. 이러한 물질은 예를 들면 형광모이어티, 화학발광 모이어티, 생발광모이어티, 자성입자, 효소, 기질, 방사능 및 발색단 물질을 포함한다.
본원에 따른 CDC 또는 항체는 직접 또는 간접 검출이 가능한 표지물질 예를 들면 3H 또는 125I와 같은 방사선 물질, 형광물질, 화학발광물질, 햅텐, 바이오틴, 디그옥시제닌 등으로 표지되어 정성 또는 정량적으로 검출될 수 있거나, 또는 기질과의 작용을 통해 발색 또는 발광이 가능한 호스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼라인 포스파타제, 말레이트 데하이드로게나아제와 같은 효소와 컨쥬게이션된 항체와의 결합을 통해 정성 또는 정량적으로 검출될 수 있다. 상기와 같은 색의 강도 또는 발광 강도를 측정하여 검출물질에 결합된 항체 또는 CDC의 양을 결정하고 이로부터 생물학적 시료 중의 목적하는 특정 성분을 정량할 수 있다. 예를 들면 Biochemistry, 2nd edition, B.D. Hames and N.M. Hooper, Springer-Verlag New York 2000, pages 112-114에 기재된 것을 참조할 수 있다.
본원에 따른 다른 구현예에서는 측방유동분석 (Lateral flow assay)에 기반을 둔 래피드 키트가 사용된다. 이 경우 CDC, 또는 LDL 또는 HDL 항체가 기질, 예를 들면 유리 슬라이드의 표면 또는 나이트로셀룰로스 막에 부착되어 제공될 수 있다. 측방유동분석에 기반한 래피드 키트는 POCT (Point of care test) 분야에서 널리 이용되는 기술로, 예를 들면 본원에 따른 CDC가 나이트로셀룰로스와 같은 고상 지지체에 결합되어 있고, 여기에, 혈청과 같은 시료와 HDL 또는 LDL 항체를 미리 반응시킨 반응물을 막의 일 말단에 접촉시킨다. 접촉에 의해 시료가 모세관 현상에 의해 지지체 상을 이동하고 이 과정에서 콜레스테롤은 지지체에 고정된 CDC와 결합하고, 콜레스테롤에 결합된 항체에 접합된 표지물질에서 발색되는 신호를 검출하여 콜레스테롤 농도를 측정한다.
다른 양태에서 본원은 또한 콜레스테롤 결합 단백질인 CDC (Cholesterol Dependent Cytolysin)와 LDL 항체 및/또는 HDL 항체를 포함하는 콜레스테롤 측정 키트에 관한 것이다. 본원에 따른 키트에 포함되는 성분 및 본원에 따른 키트에 적용될 수 있는 분석 방법은 앞서 기재한 바를 참고 할 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위해서 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
실험재료
단일 항체 생산 및 정제, 생쥐는 BALB/c 6-8주령, 암컷을 사용하였다. Human HDL과 LDL은 ProSpec사에서 구매하였으며(미국), complete Freund’s adjuvant과 Freund’s incomplete adjuvant는 MP Biomedicals사에서 구매하였다(미국). Fetal bovine serum (FBS)와 Dulbecco’s Modified Eagle Medium(4.5g/L D-Glucose, L-Glutamine, 110mg/L sodium pyruvate), HAT supplement, HT supplement, Antibiotics는 Gibco사에서 구매하였다(미국). PEG1500 (Polyethylene Glycol 1500)은 Roche사의 제품을 사용하였다(스위스). 이때 배지는 10% FBS되게 하여 사용하였다. Pristane (2,6,10,14-tetrametheylepentadecane)과 Protein G Immobilized on agarose는 Sigma사의 제품을 사용하였다(미국).
Isotyping을 위하여, Pierce™ Rapid Mouse Antibody Isotyping Kits (Quickly determine mouse monoclonal antibody (MAb) class and subclass identity.)를 사용하였다.
ELISA에서 2차 항체로는 KPL사의 anti-mouse IgG-HRP를 사용하였으며(미국), TMB/E 용액은 EMD Millipore Corporation사의 것을 사용하였다(미국). Streptavidin-HRP는 R&D systems사의 제품을 사용하였다(미국). 블락킹 완충액은 0.1% PBS/T에 1% BSA를 첨가하여 제조하였다.
카트리지 제작 및 형광 컨쥬게이션에서, NC 막은 Millipore사의 HFB13504을 sample pad는 Whatman사의 903을 absorbent pad는 우리캠의 TN415를 사용하였다. 형광 컨쥬게이션에 사용된 FPR-648은 bioActs사의 제품을 사용하였다. DDB는 1% BSA, 0.1% Tween-20, 0.1% NaN3 in 0.1% PBST pH 7.4 이며, 이 DDB에 1 ㎍/ml anti-LDL #4c2, 50 ng/ml anti-DNP #3A6G9를 넣고 DB를 제조하였다.
실시예 1. HDL 및 LDL 항체 생산
실시예 1-1. 면역
생쥐의 면역 반응을 일으키기 위하여 구입한 LDL을 쥐의 복강에 주사하였다. 첫 번째 면역은 human LDL, HDL 200㎍/200㎕에 complete Freund’s adjuvant 100㎕을 넣고 섞어준 후 BALB/c 생쥐에 300㎕/마리 되게 복강 주사(I.P, Intraperitoneally) 하였다. 첫 주사 10일 후부터는 HDL, LDL Freund’s incomplete adjuvant와 섞어 주사하는데 이를 10일 간격으로 3-4차례 반복하고, 세포 융합 시 adjuvant 없이 HDL, LDL 500㎍/300㎕ 복강 주사하였다.
실시예 1-2. 보조세포(Feeder cell) 준비
세포융합 하루 전에 7-8주된 BALB/c 생쥐를 CO2로 치사 후 외피를 벗겨 복강 내에 11.6% 수크로스 5ml를 주사 후 1분 동안 복강 마사지를 해주어 다시 주사기로 macrophage가 붙은 수크로스를 회수하였다. 시험관로 옮겨 1500 rpm에서 1분간의 원심분리를 통해 보조세포를 얻었다. 이를 HAT complete DMEM에 현탁하여 세포배양 96웰 플레이트 5판에 140㎕/well씩 분주하여 37℃ CO2 인큐베이터에서 하룻동안 배양하였다.
실시예 1-3. 세포융합
면역세포인 B 세포를 준비하기 위한 과정이다. HDL 및 LDL로 면역시킨 생쥐의 지라를 적출하여, incomplete DMEM에 넣고 배양접시 위에서 가위와 핀셋을 이용하여 잘게 찢어주었다. 이를 시험관으로 옮겨 5분간 침전시켜 큰 조직을 제외한 상층액을 분리해 새로운 시험관으로 옮겼다.
다음으로 세포융합에 사용할 골수종 암 세포로는 SP2/O를 이용하였고, 75T cm²에 confluency가 75% 이상 되게 배양해 1500 rpm에서 5분간 원심 분리하여 침전물만을 얻어 준비해둔 B 세포와 섞고 이를 1500 rpm에서 1분간 원심 분리하여 침전물만을 풀어 준비해 두었다. 여기에 PEG1500 (Polyethylene Glycol 1500) 1ml를 90초 동안 나눠 넣어주었다. 이때 보다 잘 융합되도록 흔들어주었다. PEG를 다 넣으면 다시 시험관을 90초 동안 흔들어준 후 complete DMEM(40ml)을 10분 동안 천천히 넣어주었다. 이를 1500 rpm에서 1분간 원심분리를 한 후 침전물을 HAT complete DMEM에 현탁하여 보조세포를 깔아놓은 플레이트에 140㎕/well씩 분주하여 37℃ CO2 인큐베이터에서 배양하였다.
실시예 1-4. 스크리닝
1차 스크리닝은 세포융합 후 콜로니 생성이 관찰되면 배지를 제거한 후 새로운 HAT complete DMEM으로 280㎕/well씩 분주하여 갈아주었다. 콜로니가 충분히 자라면 Indirect ELISA로 스크리닝하였다. HDL, LDL 1㎍/ml를 50㎕/well씩 분주하여 37℃에서 2시간 동안 배양한 다음 1XPBST로 3번 씻어준 후 블락킹 완충액을 각 200㎕/well씩 분주하여 37℃ 인큐베이터에 1시간 동안 배양시켰다. 0.1% PBST로 3번 씻어준 다음 1st 항체로 세포융합 한 세포가 있는 배지를 50㎕/well씩 분주하여 37℃ 인큐베이터에 1시간 동안 배양시켰다. 0.1% PBST로 3번 씻어준 후 2nd 항체로 anti-goat mouse IgG HRP를 200ng/ml로 희석하여 50㎕/well씩 분주 후 37℃에서 1시간 동안 배양시켰다. 0.1% PBST로 3번 씻어준 다음 TMB/E 용액을 100㎕/well씩 분주하여 상온에서 15분 동안 배양하여 ELSIA 판독기로 630nm에서 흡광도를 측정하여 값이 1.0 이상 나온 세포만을 골라내었다. 골라낸 세포들은 세포배양 24웰 플레이트로 옮기고, HAT complete DMEM을 채워준 후 37℃ CO2에서 배양하였다. 이 세포들의 상태를 관찰하면서 세포가 충분히 자라면 2차 스크리닝을 진행(1st 스크리닝 방법과 동일)하여 O.D. 650nm에서 값이 1 이상이 나오는 세포를 6웰 플레이트로 옮겨 주었다. 이와 같이 3차 및 4차 스크리닝을 진행하여 75T cm² 플라스크로 옮겨준 후 계대 배양하여 일부 모세포를 동결보관하였다.
실시예 1-5. 클로닝 및 계대 배양
클로닝 과정을 통해 항체를 만들어내는 균질한 세포 콜로니를 분리하였다. 첫 번째로 보조세포를 96웰 플레이트에 넣고 37℃ CO2에서 하룻동안 배양하였다. 다음으로 배양중인 모세포의 수를 계산하여 96웰 플레이트의 각 웰에 한 개의 세포만이 들어갈 수 있도록 희석하여 140㎕/well씩 분주한 후 37℃ CO2에서 배양하여 콜로니를 수득하였다. 이어 간접 ELISA를 이용하여 신호가 높은 단세포를 선별한 후, 96웰, 24웰, 6웰 플레이트, 25cm² T 플라스크 및 마지막으로 75cm² T 플라스크로 옮겨가면 계대배양하였다.
실시예 1-6. 마우스 실험
BALB/C 생쥐에 pristane을 300㎕/마리 되게 주사하여 마우스의 면역체계를 망가뜨리도록 유도시켰다. 7일 후 융합한 세포를 1X 10^6되게 incomplete DMEM에 희석시켜 마우스 복강에 300㎕/마리씩 복강 내 주사를 하였다. 주사 후 복수(ascites fluid)가 생성이 되면 마우스를 CO2로 흡입마취 시켜 외피를 박리하여 주사기로 복강내의 복수를 채취하였다. 채취한 복수는 3500 rpm에서 15분간 원심 분리를 통하여 조직 및 지질 등을 제거하고 상층 액만 새로운 시험관에 옮겨 -20℃에 얼려 보관하였다.
실시예 1-7. 단일클론항체 정제 및 확인
채취한 복수를 상온에서 녹인 후 12000 rpm에서 40분간 원심분리를 진행해 남아 있는 지질을 없앴다. 여기서 얻은 상층 액에 55% 암모늄설페이트를 넣어 녹였다. 이를 4℃에서 overnight 해 15000 rpm에서 40분간 원심 분리하여 침전물만을 취하여 1X PBS (pH 7.4)로 복수가 있었던 양 만큼 넣어 풀어준 뒤 desalt를 위하여 투석을 시행하였다. 이때 투석 완충액으로 1X PBS pH 7.4를 사용하여 3시간에 한번씩 완충액을 바꿔주며 총 4번간의 투석을 진행하였다. 컬럼에 protein-G를 넣어 채워주고 투석이 끝난 복수는 1X PBS pH7.4로 5배 희석하여 컬럼에 흘려주어 protein-G에 붙어주었다. 결합하지 않은 단백질들을 제거해 주기 위해 1X PBS pH7.4로 씻어준 후 100mM glycine 완충액 pH2.5를 컬럼에 넣어 각 시험관에 3ml씩 정제하였다. 중화완충액은 1M Tris-Cl pH 8.0을 사용하였다.
Glycine을 제거하기 위하여 1X PBS pH 7.4에서 투석을 진행하였다. 정제된 항체는 SDS-PAGE gel로 확인하여 중쇄와 경쇄(중쇄 50-55kDa, 경쇄 20-25kDa)이 있는 것을 확인하고 ELISA를 진행하였다. 96웰 ELSA 플레이트에 HDL, LDL 1㎍/ml를 50㎕/well씩 분주하여 37℃ 인큐베이터에 2시간 동안 배양한 다음 0.1% PBST로 3번 씻어준 후 블락킹 완충액을 각 200㎕/well씩 분주하여 37℃ 인큐베이터에 1시간 동안 배양하였다. 0.1% PBST로 3번 씻어준 다음 1st 항체로 정제한 1㎍/ml부터 1/2씩 순차적 희석을 시켜 50㎕/well씩 분주하여 37℃ 인큐베이터에 1시간 동안 배양하였다. 0.1% PBST로 3번 씻어준 후 2nd 항체로 anti-goat mouse IgG HRP를 200ng/ml로 희석하여 50㎕/well씩 분주하여 37℃ 인큐베이터에 1시간 동안 배양하였다. 1XPBST로 3번 씻어준 다음 TMB/E 용액을 100㎕/well씩 분주하여 상온에서 15분 동안 배양하여 ELSIA 판독기로 O.D. 650 nm에서 측정하여 항체의 활성을 확인하였다. 결과는 도 3 및 4에 기재되어 있다. 그 결과 정제된 항체는 모두 경쇄 및 중쇄를 포함하고 있었으며 각각의 상응하는 항원에 특이적으로 반응하는 것으로 나타났다.
실시예 2. CDC (Cholesterol dependent cytolysin ) 제조
실시예 2-1. Pneumolysin (PLY)의 제조
Pneumolysin(PLY)는 스트렙토코커스 뉴모니아(Streptococcus pneumoniae)에서 생산되는데, 재조합 rPLY를 생산하는데 적합한 아미노산 서열(NCBI ID: WP_001284361.1)을 가지고 있다. 상기 아미노산서열은 Bioneer사(한국)에서 유전자를 최적화하고 합성하는데 사용되었다.
상기 유전자를 PCR로 증폭하여 도 5의 상단에 기재된 바와 같이 pET21a내 BamHI/XhoI 효소 사이트내로 클론시켜 최종적으로 발현호스트인 BL-21 DE3 Star로 트랜스폼시켜, 발현 균주를 선택하였다. pET-21a.ply_BL21 DE3 star 균주를 O/N에서 배양시켜 Amp+ cam를 함유하는 4.2 L LB 배지내에서 37℃, 200rpm에서 서브-컬쳐하였다. OD600이 0.5가 되었을 때, 상기 배양액을 30℃에서 4시간동안 IPTG로 유도시켜 최종농도 20mM이 되도록 하였다. 상기 세포를 하베스트하였다. 그 후 프로테아제 저해제인 DNase 및 RNase 존재하에서 150ml native 정제 버퍼에 상기 박테리아 펠렛을 재서스페젼시켰다. 이어 80% 강도(amplitude), 10s 초 초음파 처리, 10s rest cycles로 10X 소니케이트하였다. 총 융해물을 10000rpm, 30분간 원심분리하였다. 10ml의 50% TALON resin (Clonetech)을 20ml 정제 컬럼내로 피펫팅하였다. 레진은 완전히 안정화시켜(5-10분) 유출시켰다. 40ml의 멸균 증류수를 사용하여 컬럼을 거꾸로 하여 태핑시켜 상기 레진을 재서스펜젼시켰다. 10ml의 Native purification Buffer (50 mM NaH2PO4, pH 8.0; 0.5 M NaCl)를 사용하여 컬럼을 거꾸로 하여 태핑시켜 상기 레진을 재서스펜젼시켰다. 상기 레진을 안정화시킨 후 상청액을 따라내었다. 한번 더 반복하였다.
150ml의 융해물을 native 조건에서 제조하여 10mM 이미다졸로 대체시켰다. 상기 융해물을 준비된 레진과 혼합한 후 1시간동안 롤러에서 믹스하였다. 상기 레진을 다시 컬럼내로 옮긴 후 안정화시켰다. 얻은 flow를 다시 안정화된 레진에 넣은 후 분획을 모았다. 상기 컬럼을 30ml Native Wash Buffer (50mM NaH2PO4, pH 8.0; 0.5 M NaCl, 20mM 이미다졸)으로 적용시킨 후 5번 유출시켰다. SDS-PAGE analysis을 하기 위하여 4℃에 상청액을 저장하였다. 상기 컬럼은 20ml Native Elution Buffer (50mM NaH2PO4, pH 8.0; 0.5 M NaCl, 250mM 이미다졸)로 용출시킨 후 PBS(G+E, pH 7.4)로 교환된 centricon ultra-filtration (10,000 MWCO)을 하였다. Pneumolysin 재조합 단백질은 하기 도 5의 하단에 기재된 바와 같이 native 상태하에서 성공적으로 정제되었다.
실시예 2-2. Perfringolysin O ( PFO )의 제조
Perfringolysin O (PFO)은 클로스트리듐 퍼프리젠(Clostridium perfringens)에서 생산되는데, 재조합 PFO를 생산하는데 적합한 아미노산 서열(NCBI ID: WP_003467630.1)을 가지고 있다. 상기 아미노산서열은 재조합 rPFO를 생산하는데 사용되었다. 상기 아미노산서열은 Bioneer사(한국)에서 유전자를 최적화하고 합성하는데 사용되었다.
상기 유전자는 PCR로 증폭하여 도 6의 상단에 기재된 바와 같이 pET21a (Novagen) 내 BamHI/XhoI 효소 사이트내로 클론시켜 최종적으로 발현호스트인 BL-21 DE3 Star로 트랜스폼시켜, 발현 균주를 선택하였다. pET-21a.pfo_BL-21 DE3 star 균주를 O/N에서 배양하여 Kan + cam를 함유하는 5.4 L LB 배지내에서 37℃, 200rpm에서 서브-컬쳐하였다. OD600이 0.5가 되었을 때, 상기 배양액을 30℃에서 4시간동안 IPTG로 유도시켜 최종농도 0.2mM이 되도록 하였다. 상기 세포를 하베스트하였다. 그 후 프로테아제 저해제인 DNase 및 RNase 존재하에서 150ml native 정제 버퍼에 상기 박테리아 펠렛을 재서스펜젼시켰다. 80% amplitude, 10s sonication, 10s rest cycles로 10X 소니케이트하였다. 총 융해물을 10000rpm, 30분간 원심분리하였다. 10ml의 50% TALON resin (Clonetech)을 20ml 정제 컬럼내로 피펫팅하였다. 레진은 완전히 안정화시켜(5-10분) 유출시켰다. 40ml의 멸균 증류수를 사용하여 컬럼을 거꾸로 하여 태핑시켜 상기 레진을 재서스펜젼시켰다. 상층액을 따라내기 전에 먼저 레진을 안정화시켰다. 10ml의 Native purification Buffer (50mM NaH2PO4, pH 8.0; 0.5 M NaCl)를 사용하여 컬럼을 거꾸로 하여 태핑시켜 상기 레진을 재서스펜젼시켰다. 상기 레진을 안정화시킨 후 상청액을 따라내었다. 한번 더 반복하였다.
150ml의 융해물을 native 조건에서 제조하여 10mM 이미다졸로 대체시켰다. 상기 융해물을 준비된 레진과 혼합한 후 1시간동안 롤러에서 믹스하였다. 상기 레진을 다시 컬럼내로 옮긴 후 안정화시켰다. 얻은 flow를 다시 안정화된 레진에 넣은 후 분획을 모았다. 상기 컬럼을 30ml Native Wash Buffer (50mM NaH2PO4, pH 8.0; 0.5 M NaCl, 20mM 이미다졸)으로 적용시킨 후 5번 유출시켰다. SDS-PAGE analysis을 하기 위하여 4℃에 상청액을 저장하였다. 상기 컬럼은 20ml Native Elution Buffer (50mM NaH2PO4, pH 8.0; 0.5 M NaCl, 250mM 이미다졸)로 용출시킨 후 PBS(G+E, pH 7.4)로 교환된 centricon ultra-filtration (10,000 MWCO)을 하였다. 재조합 Perfringolysin O은 도 6의 하단에 기재된 바와 같이 native 상태하에서 성공적으로 정제되었다.
실시예 2-3 Listeriolysin O ( LLO ) 정제
Listeriolysin O (LLO)은 리스테리아 모노사이토젠(Listeria monocytogenes)에서 생산되는데, 재조합 rLLO를 생산하는데 적합한 아미노산 서열(NCBI ID: WP_003722731.1)을 가지고 있다. 상기 아미노산서열은 재조합 rPFO를 생산하는데 사용되었다. 상기 아미노산서열은 Bioneer사(한국)에서 유전자를 최적화하고 합성하는데 사용되었다.
상기 유전자를 PCR로 증폭하여 도 7의 상단에 개시된 바와 같이 pET21a내 BamHI/XhoI 효소 사이트내로 클론시켜 최종적으로 발현호스트인 Codon plus(RIPL)로 트랜스폼시켜, 발현 균주를 선택하였다. pET-21a.LLO_Codon Plus(RIPL) 균주를 O/N에서 배양하여 Amp + cam를 함유하는 500mL LB 배지내에서 37℃, 200rpm에서 서브-컬쳐하였다. OD600이 0.5가 되었을 때, 상기 배양액을 18℃에서 IPTG로 유도시켜 최종농도 0.2mM이 되도록 하였다. 상기 세포를 하베스트하였다. 그 후 프로테아제 저해제인 DNase 및 RNase 존재하에서 20ml native 정제 버퍼에 상기 박테리아 펠렛을 재서스펜젼시켰다. 상기 세포를 하베스트하였다. 그 후 프로테아제 저해제인 DNase 및 RNase 존재하에서 150ml native 정제 버퍼에 상기 박테리아 펠렛을 재서스펜젼시켰다. 80% amplitude, 10s sonication, 10s rest cycles로 10X 소니케이트하였다. 총 융해물을 12000rpm, 30분간 원심분리하였다. 5ml의 50% TALON resin (Clonetech)을 20ml 정제 컬럼내로 피펫팅하였다. 레진은 완전히 안정화시켜(5-10분) 유출시켰다. 10ml의 멸균 증류수를 사용하여 컬럼을 거꾸로 하여 태핑시켜 상기 레진을 재서스펜젼시켰다. 상층액을 따라내기 전에 먼저 레진을 안정화시켰다. 5ml의 Native purification Buffer (50mM NaH2PO4, pH 8.0; 0.5 M NaCl)를 사용하여 컬럼을 거꾸로 하여 태핑시켜 상기 레진을 재서스펜젼시켰다. 상기 레진을 안정화시켠 후 상청액을 따라내었다. 한번 더 반복하였다.
20ml의 융해물을 native 조건에서 제조하여 준비된 레진과 혼합한 후 1시간동안 롤러에서 믹스하였다. 상기 레진을 다시 컬럼내로 옮긴 후 안정화시켰다. 얻은 flow를 다시 안정화된 레진에 넣은 후 분획을 모았다. 상기 컬럼을 15ml Native Wash Buffer (50mM NaH2PO4, pH 8.0; 0.5 M NaCl, 20mM 이미다졸)로 적용시킨 후 5번 유출시켰다. SDS-PAGE analysis을 하기 위하여 4℃에 상청액을 저장하였다. 상기 컬럼은 10ml Native Elution Buffer (50mM NaH2PO4, pH 8.0; 0.5 M NaCl, 250mM 이미다졸)로 용출시킨 후 PBS(G+E, pH 7.4)로 교환된 centricon ultra-filtration (10,000 MWCO)을 하였다. 재조합 LLO 재조합 단백질은 도 7의 하단에 기재된 바와 같이 native 상태하에서 성공적으로 정제되었다. 대량 스케일 발현 및 정제의 native 정제 프로토콜로 사용하기에 상기 절차에서 얻은 수율은 적합하였다.
실시예 2-4 rSLO D4의 발현 및 정제
SLO은 총 4개의 도메인으로 이루어져 있는데 이중 N-말단의 도메인 4는 콜레스테롤과 결합하는 SH기를 포함하고 있다. SLO의 3차원 구조로 인해, 도메인 4의 SH-기가 노출되지 않는 경우를 고려하여 도메인 4만을 선택하여 재조합 단백질을 만들었다.
SLO 분자의 E.coli에서 발현시키기 위하여 유전자를 최적화하여, GeneArt(Invitrogen)로 합성하였다. pET100 클론으로 얻었다. 상기 클론을 E.coli, BL-21 Star 내로 트랜스폼시켜, 단일 콜로니를 분리하여 발현 클론을 선택하였다. pET100.SLO D4-BL-21 star 균주를 O/N 배양하여 Amp + cam를 함유하는 4.2L LB 배지내에서 37℃, 200rpm에서 서브-컬쳐하였다. OD600이 0.5가 되었을 때, 상기 배양액을 4시간동안 30℃에서 IPTG로 유도시켜 최종농도 0.2mM이 되도록 하였다. 상기 세포를 하베스트하였다. 그 후 프로테아제 저해제인 DNase 및 RNase 존재하에서 150ml native 정제 버퍼에 상기 박테리아 펠렛을 재서스펜젼시켰다. 상기 세포를 하베스트하였다. 80% amplitude, 10s sonication, 10s rest cycles로 10X 소니케이트하였다. 총 융해물을 10000rpm, 30분간 원심분리하였다. 10ml의 50% TALON resin (Clonetech)을 20ml 정제 컬럼내로 피펫팅하였다. 레진은 완전히 안정화시켜(5-10분) 유출시켰다. 100ml의 멸균 증류수를 사용하여 컬럼을 거꾸로 하여 태핑시켜 상기 레진을 재서스펜젼시켰다. 상층액을 따라내기 전에 먼저 레진을 안정화시켰다. 20ml의 Native purification Buffer (50mM NaH2PO4, pH 8.0; 0.5 M NaCl)를 사용하여 컬럼을 거꾸로 하여 태핑시켜 상기 레진을 재서스펜젼시켰다. 상기 레진을 안정화시켠 후 상청액을 따라내었다. 한번 더 반복하였다.
150ml의 융해물을 native 조건에서 제조하여 10mM 이미다졸로 대체하였다. 상기 융해물을 준비된 레진과 혼합한 후 1시간동안 롤러에서 믹스하였다. 상기 레진을 다시 컬럼내로 옮긴 후 안정화시켰다. 얻은 flow를 다시 안정화된 레진에 넣은 후 분획을 모았다. 상기 컬럼을 40ml Native Wash Buffer (50mM NaH2PO4, pH 8.0; 0.5 M NaCl, 20mM 이미다졸)로 적용시킨 후 5번 유출시켰다. SDS-PAGE 분석을 하기 위하여 4℃에 상청액을 저장하였다. 상기 컬럼은 20ml Native Elution Buffer (50mM NaH2PO4, pH 8.0; 0.5 M NaCl, 250mM 이미다졸)로 용출시킨 후 PBS(G+E, pH 7.4)로 교환된 centricon ultra-filtration (5,000 MWCO)을 하였다. 그 결과 도 8에 기재된 바와 같이 재조합 SLO D4가 native 상태하에서 성공적으로 정제되었다.
실시예 2-5 SLO 발현 및 정제
도 9에 기재된 바와 같이 SLO 재조합 단백질을 코딩하는 유전자를 PCR로 증폭하여 pET21a 벡터에 클로닝하고 이를 하는 E.coli에 형질전환하여 LB 배지에서 37℃에서 250rpm으로 배양하였다. 흡광도가 0.5-0.7일 때 IPTG를 0.1mM되게 넣어준 후 3시간 동안 배양하였다. 그런 다음 원심분리로 세포를 수확하고, 이를 lysis buffer(10mM sodium phosphate, 0.5M NaCl, 10mM 2-mercaptoethanol, 10mM EDTA, pH 7.0 with NaOH)와 protease inhibitor를 넣고 supersonic device(SONICS and MATERIALS INC, USA)를 이용하여 세포를 융해하였다. 그런 다음 SDS-PAGE gel에 걸어 발현을 확인하였다. 단백질은 Ion-exchange chromatography 방법으로 정제하여 사용하였다. 결과는 도 9에 기재되어 있다.
실시예 2-6 SLO D4 단백질의 표지
단백질과 바이오틴을 농도비 10:1로(100㎕) 섞고 1M sodium bicabonate를 총 양의 1/10(10㎕)넣어 준 후 4℃에서 overnight시켰다. 컬럼에 1ml의 DEAE sephadex™G-25를 packing하기 위해서 컬럼에 resin을 넣고 3000rpm에서 20분간 원심분리 하여 완충액들을 제거한 후 biotinylation한 SLO를 컬럼에 넣고 2000rpm에서 20분간 원심분리 하였다.
SLO 재조합 단백질이 바이오틴화되었는지 확인하기 위하여 ELISA를 시행하였다. SLO-biotin을 2㎍/ml 부터 1/2씩 순차적 희석을 하여 8웰 strip에 50㎕/well씩 분주하였다. 이를 37℃ 인큐베이터에 2시간동안 배양한 다음 1XPBST로 3번 씻어준 후 1X 블락킹 완충액을 각 200㎕/well씩 분주하여 37℃ 인큐베이터에 1시간동안 배양시켰다. 1XPBST로 3번 씻어준 후 항체로 streptavidin-HRP를 1/200 희석하여 50㎕/well씩 분주하여 37℃ 인큐베이터에 1시간동안 배양시켰다. 1XPBST로 3번 씻어준 다음 TMB/E 용액을 50㎕/well씩 분주하여 상온에서 15분동안 배양하여 ELSIA 판독기로 630nm에서 흡광도를 측정하여 바이오틴화되었는지를 확인 하였다.
실시예 3. 면역학적 방법을 이용한 콜레스테롤 측정
실시예 3-1. ELISA를 이용한 콜레스테롤 측정방법
상기 실시예 1에서 제조된 항체 및 실시예 2에서 제조된 CDC 각 단백질을 이용하여 콜레스테롤을 측정하였다. 각각의 CDC에 콜레스테롤을 결합시킨 후 anti-HDL-C 항체 (#11C1) 또는 anti-LDL-C 항체 (#4C2)이용하여 각각 HDL-C 및 LDL-C를 측정하였다.
구체적으로 8웰 ELISA strips에 상기 제조된 각 SLO, SLO_D4, PLY, PFO, LLO를 1㎍/ml로 50㎕/well씩 분주하여 37℃에서 2시간 동안 배양하였다. 이어 0.1% PBST로 3번 씻어준 후 블락킹 완충액을 각 200㎕/well씩 분주하여 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 이어 PBST로 3번 씻어준 다음 HDL 또는 LDL을 2㎍/ml부터 2ng/ml까지 연속 희석하여 1시간 동안 37℃에서 배양하였다. 0.1% PBST로 3번 씻어준 후 실시예 1에서 제작된 항체를 각 1㎍/ml으로 50㎕/well씩 분주하여 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 이어 0.1% PBST로 3번 씻어준 후 2차 항체로 anti-goat mouse IgG HRP를 200ng/ml로 희석하여 50㎕/well씩 분주하여 37℃ 인큐베이터에 1시간 동안 배양하였다. 0.1% PBST로 3번 씻어준 다음 TMB/E 용액을 100㎕/well씩 분주하여 상온에서 15분 동안 배양 후 ELSIA 판독기로 O.D. 650 nm에서 측정하여 확인하였다. 결과는 도 10 및 도 11에 기재되어 있다.
도 10은 5종류의 CDC (SLO, SLO_D4, LLO, PFO, PLY)를 사용하여 콜레스테롤과 결합시킨 후 HDL-C의 주된 단백질인 Apo A-I을 검출하는 항체 (#11C1)을 이용하여 HDL-C을 측정한 결과이다. 모든 CDC를 캡쳐로 사용하였을 때 HDL-C에 대해 농도의존적인 결과를 보였으며 30ng/ml까지 측정 가능한 것으로 나타났다.
도 11은 5종류의 CDC (SLO, SLO_D4, LLO, PFO, PLY)를 사용하여 콜레스테롤과 결합시킨 후 LDL-C의 주된 단백질인 Apo B-100을 detection하는 항체 (#4C2)을 이용하여 LDL-C을 측정한 결과이다. LDL-C에 대해 농도의존적인 결과를 보였으며, 60ng/ml의 LDL-C까지 측정 가능한 결과를 보였다.
실시예 3-2. Rapid kit 상에서의 콜레스테롤 측정
NC 막에 CDC (PLY)를 캡쳐로 준비하고 검출항체로 LDL항체를 (#4C2)을 사용하여 실검체에서 LDL-C의 수치를 측정하였다.
구체적으로 NC 막(135) 29mm에 2.6mg/ml PLY, 34mm에 1mg/ml DNP-BSA를 그어 37℃에서 1시간 동안 말린 후 20% 이하 습도로 유지되는 데시케이터에서 밤새 이차 건조하였다. 이를 903 sample pad와 T415 absorbent pad를 사용하여 조립하였다.
선정된 anti-LDL #4c2에 0.1M sodium bicarbonate를 넣어 준 후 FPR-648을 무게 비율로 Ab:형광 = 10:1넣고 4℃에서 overnight 후 sephadex G-25를 이용해 형광과 접합된 항체만을 분리하였다. 이 항체를 DDB 에 넣어 DB를 만들었다.
카트리지 테스트는 DB 1000㎕에 실검체 1㎕를 넣고 10회 흔들어 섞은 후 sample pad에 75㎕를 넣고 15분간 반응시켰다. 15분 후 iChroma® (바디텍메드)를 이용하여 판독하였다. 여기서 기준장비로 사용된 Hitachi 장비 (Hitachi 7020, Japan)사용하여 같은 실검체 혈청을 두 기계를 이용하여 측정 후 비교하였다. 비교장비로 사용된 Hitachi와의 상관관계는 0.87로 나타났으며, 임상적 특이성은 88%, 민감성은 95%로 나와 실제 LDL-콜레스테롤을 측정하는데 사용할 수 있다는 것을 보여준다. 결과는 도 12 및 아래 표에 기재되어 있다. 비교장비로 사용된 Hitachi와의 correlation은 0.87로 나타났으며, 임상 특이도는 88%, 민감도는 95%로 실제 LDL-C를 측정하는데 사용할 수 있음을 나타낸다.
[표 1]
Figure pat00001

Claims (10)

  1. 콜레스테롤 농도 측정이 필요한 시료를 콜레스테롤 결합 단백질인 CDC (Cholesterol Dependent Cytolysin)와 접촉하는 단계로, 상기 접촉에 의해 상기 시료 중의 콜레스테롤과 CDC의 제 1 복합체가 형성되고;
    상기 제 1 복합체를 상기 콜레스테롤 또는 상기 CDC를 특이적으로 인식하는 항체와 접촉하는 단계로, 상기 접촉에 의해 상기 제 1 복합체와 상기 항체로 형성되는 제 2 복합체가 형성되고; 그리고
    상기 제 2 복합체를 검출하는 단계를 포함하는, CDC 및 항체를 이용한 인비트로에서 콜레스테롤 측정 방법.
  2. 콜레스테롤 농도 측정이 필요한 시료를 상기 콜레스테롤을 특이적으로 인식하는 항체와 접촉하는 단계로, 상기 접촉에 의해 상기 시료 중의 콜레스테롤과 항체가 제 3 복합체를 형성하고;
    상기 제 3 복합체를 상기 콜레스테롤에 특이적으로 결합하는 CDC (Cholesterol Dependent Cytolysin)와 접촉하는 단계로, 상기 접촉에 의해 상기 제 3 복합체와 상기 CDC로 형성되는 제 4 복합체가 형성되고; 그리고
    상기 제 4 복합체를 검출하는 단계를 포함하는, CDC 및 항체를 이용한 인비트로에서 콜레스테롤 측정 방법.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 CDC는 Bacilus anthracis 유래의 ALO (Anthrolysin O), B. thurigiensis 유래의 TLO (Thuringiensilysin O); B. cereus 유래의 CLO (Cereolysin O), B. weihenstephanensis 유래의 WLO (Weihenstephanensilysin), Listeria monocytogenes 유래의 LLO (Listeriolysin O), L. seeligeri 유래의 LSO (Seeligeriolysin O), L. ivanovii 유래의 ILO (Ivanolysin), Lysinibacillus sphaericus 유래의 SPH (Sphaericolysin), Paenibacillus alvei 유래의 ALV (Alveolysin), Brevibacillus brevis 유래의 BVL (Brevilysin), Streptococcus dysgalactiae 유래의 SLOe (Streptolysin Oe), S. pyogenes 유래의 SLO (Streptolysin O), S. canis 유래의 SLOc (Streptolysin Oc), S. pseudonemoniae 유래의 PSY (Pseudopneumolysin), S. pneumoniae 유래의 PLY (Pneumolysin), S. mitis 유래의 MLY (Mitilysin), S. suis 유래의 SLY (Suilysin), S. intermedius 유래의 ILY (Intermedilysin), S. mitis 유래의 LLY (Lectinolysin), Clostridium perfringens 유래의 PFO (Perfringolysin O), C. butyricum 유래의 BRY (Butyriculysin), C. tetani 유래의 TLY (Tetanolysin O), C. botulinum B 유래의 BLYb (Botulinolysin B), C. botulinum E3 유래의 BLYe (Botulinolysin E3), C. botulinum C 유래의 BLYc (Botulinolysin C), C. novyi 유래의 NVL (Novyilysin), Gardenella vaginallis 유래의 VLY (Vaginolysin), 및 Arcanobacterium pyogenes 유래의 PLO (Pyolysin)로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
  4. 제 3 항에 있어서,
    상기 CDC는 LLO (Listeriolysin O), PFO (Perfringolysin O), PLY (Pneumolysin), 또는 SLO (Streptolysin O) 또는 SLO (Streptolysin O)의 4번 도메인인 SLO-4인, 방법.
  5. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 콜레스테롤을 특이적으로 인식하는 항체는 항-LDL 항체 또는 항-HDL 항체인, 방법.
  6. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 콜레스테롤 측정이 필요한 시료는 전혈, 혈장 또는 혈청인, 방법.
  7. 제 1 항에 있어서,
    상기 CDC는 고형지지체 상에 결합되어 있고, 상기 항체는 검출가능한 물질로 표지된 것인, 방법.
  8. 제 2 항에 있어서,
    상기 항체는 고형지지체 상에 결합되어 있고, 상기 CDC는 검출 가능한 물질로 표지된 것인, 방법.
  9. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 방법은 샌드위치 방식의 ELISA 또는 측방유동분석 방식으로 수행되는 것인, 방법.
  10. 콜레스테롤 결합 단백질인 CDC (Cholesterol Dependent Cytolysin) 및 LDL 항체 또는 HDL 항체를 포함하는 콜레스테롤 측정 키트.
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