IT201900000651A1 - Tecnologia di trasferimento genico - Google Patents
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Description
Descrizione dell’Invenzione Industriale avente per titolo:
“TECNOLOGIA DI TRASFERIMENTO GENICO”
DESCRIZIONE
La presente invenzione si riferisce ad un sistema di trasferimento genico per il trattamento di pazienti affetti da disordini genetici, in particolare da dislipidemie genetiche.
Come noto l’ipercolesterolemia familiare (FH) è la più frequente tra le cause genetiche di dislipidemia, il più importante fattore che predispone per una malattia coronarica precoce; questa patologia è caratterizzata da elevati livelli di colesterolo che si accumula nelle pareti arteriose causando ateromi che possono portare a ischemia.
Sono note terapie farmacologiche per il trattamento di tali patologie, che implicano un trattamento farmacologico a vita del paziente.
A tal proposito negli anni ‘90, è stato tentato un approccio di terapia genica ex vivo per l’FH con un vettore retrovirale che ha portato a risultati deludenti che, pur avendo precluso un ulteriore sviluppo clinico dell’approccio ex vivo, hanno confermato la fattibilità e la sicurezza della terapia genica LDLR negli esseri umani (Grossman M, et al 1995). Un numero di vettori e costrutti transgenici diversi sono stati successivamente testati in ambito pre-clinico, tuttavia nessuno ha raggiunto un'espressione genica stabile con effetti metabolici duraturi (Van Craeyveld E. et al 2011). Negli ultimi anni sono stati sviluppati diversi approcci di terapia genica per l’FH, consistenti nella somministrazione endovena di vettori virali che infettano epatociti e permettono l’espressione epatica di transgeni terapeutici. Questi approcci hanno però una potenziale tossicità che non li renderebbe sicuri in un eventuale utilizzo clinico pertanto lo sviluppo di strategie per migliorare l'espressione del transgene e ridurre al minimo la risposta immunitaria è attualmente in corso (Ezim A. et al 2016). Le somministrazioni di vettori per la produzione di proteine terapeutiche in tessuti più accessibili, come ad esempio il muscolo, indurrebbero una minore risposta infiammatoria sistemica e rappresenterebbero un approccio certamente più sicuro da un punto di vista clinico (Jenny A. Greig, 2016).
Sono altresì note soluzioni atte ad abbassare il livello di colesterolo, come descritto nei seguenti documenti brevettuali KR20160091276, CN105037554, US2013017250, EP0640620 e finalizzati al trattamento di dislipidemia, come descritto nei seguenti documenti brevettuali WO9916458, RU2127115.
Altresì sono noti una pluralità di documenti brevettuali relativi al trattamento di tali disordini genetici, caratterizzati dall’utilizzo di: - una pluralità di polipeptidi secreti in combinazione con vescicole di membrane, come descritto in US2012321653;
- un polinucleotide codificante una proteina chimerica e il relativo vettore comprendente il polinucleotide, come descritto in US2002110869;
- un anticorpo monoclonale chimerico modificato, come descritto in WO9114438;
- una pluralità di molecole ricombinanti , come descritto in WO9211383; ed
- una pluralità di proteine chimeriche, come descritto nel documento brevettuale WO9639510.
E’ noto l’uso di proteine chimeriche costituite da una porzione del recettore delle lipoproteine a bassa densità (LDL) e da una porzione del recettore della transferrina, espresse da cellule di mammiferi, circolanti nel sangue atte a ridurre il colesterolo delle lipoproteine a bassa densità (LDL).
Scopo della presente invenzione è risolvere i suddetti problemi della tecnica anteriore fornendo una tecnologia di trasferimento genico atta a sviluppare una proteina secreta espressa da un vettore virale.
Un altro scopo della presente invenzione è fornire una tecnologia di trasferimento genico per il trattamento di pazienti affetti da disordini genetici.
Un ulteriore scopo della presente invenzione è fornire una tecnologia di trasferimento genico in grado di sviluppare una proteina secreta internalizzata nelle cellule di un paziente mediante recettori TfR1 e TfR2.
Un ultimo scopo della presente invenzione è somministrare per via intramuscolare il vettore virale, incrementando lo sviluppo delle proteine secrete.
I suddetti ed altri scopi e vantaggi dell’invenzione, quali risulteranno dal seguito della descrizione, vengono raggiunti con una tecnologia di trasferimento genico come quello descritto nella rivendicazione 1. Forme di realizzazione preferite e varianti non banali della presente invenzione formano l’oggetto delle rivendicazioni dipendenti.
Resta inteso che tutte le rivendicazioni allegate formano parte integrante della presente descrizione.
Risulterà immediatamente ovvio che si potranno apportare a quanto descritto innumerevoli varianti e modifiche (per esempio relative a forma, dimensioni, disposizioni e parti con funzionalità equivalenti) senza discostarsi dal campo di protezione dell'invenzione come appare dalle rivendicazioni allegate.
La presente invenzione verrà meglio descritta da alcune forme preferite di realizzazione, fornite a titolo esemplificativo e non limitativo, con riferimento ai disegni allegati, nei quali:
- la FIG. 1 mostra una rappresentazione schematica della tecnologia di trasferimento genico secondo la presente invenzione;
- la FIG. 2 mostra una rappresentazione schematica di un plasmide precursore di un vettore virale secondo la presente invenzione;
- la FIG. 3 mostra una rappresentazione schematica di una realizzazione di un vettore virale secondo la presente invenzione;
- la FIG. 4 mostra evidenze sperimentali relativamente all’attuazione della tecnologia di trasferimento genico secondo la presente invenzione; - la FIG. 5 mostra una rappresentazione di un vettore virale ricoperto da un polimero secondo la presente invenzione;
- la FIG. 6 mostra una rappresentazione di una proteina secreta sviluppata dalla tecnologia di trasferimento genico secondo la presente invenzione; e
- le FIGG. 7-13 mostrano evidenze sperimentali relativamente all’attuazione in un modello murino della tecnologia di trasferimento genico secondo la presente invenzione.
E’ riportato in letteratura scientifica che l'espressione di un transgene, nei primati non umani dopo una singola somministrazione di un vettore virale, persiste per un periodo fino a 7 anni per tutti gli animali infetti senza effetti avversi a lungo termine.
Di conseguenza, facendo riferimento alle Figure, è descritta una tecnologia di trasferimento genico, per il trattamento di pazienti affetti da disordini genetici, quali, ad esempio, dislipidemie genetiche o altre analoghe, progettata a sviluppare almeno una proteina secreta 10, quale, ad esempio, una proteina chimerica, espressa da un vettore virale, quale, ad esempio un vettore retrovirale, o adenovirale, o herpes simplex, o adenoassociato, o altro analogo.
In particolare, tale proteina secreta 10 è progettata per ridurre il colesterolo di una pluralità di lipoproteine 5 a bassa densità (LDL) in pazienti affetti da dislipidemie genetiche, legando tale pluralità di lipoproteine 5 e provocandone l’internalizzazione nelle cellule, per via intramuscolare 7.
Tale tecnologia, secondo la presente invenzione, comprende principalmente le fasi di: - produzione del vettore virale 1;
- eventuale sviluppo di una modifica chimica 6, quale, ad esempio, una reazione di PEGhilazione sul vettore virale 1, come mostrato in FIG. 5, con un glicole polietilenico, atto a ridurre un’attivazione residua della risposta immunitaria innata nel vettore virale 1, eliminandone la tossicità residua e favorendone la relativa somministrazione umana senza compromettere l'efficienza epatica di trasduzione del vettore virale; e
- sviluppo ed uso della proteina secreta 10.
Vantaggiosamente, il vettore virale 1 è privato di sequenze di codifica virale, impedendo al vettore virale 1 di produrre proteine necessarie alla propria replicazione; tale vettore virale 1 è ottenuto da almeno un plasmide, quale, ad esempio, pLBL1, o altro analogo, costituito da una molecola di DNA circolare a doppia elica in grado di replicarsi indipendentemente dal cromosoma.
Vantaggiosamente, nel plasmide è inserito un promotore 3, quale ad esempio, un promotore della creatin chinasi mCK, o altro analogo atto a favorire l’espressione muscolo-specifica della proteina creatin chinasi; almeno un elemento di regolazione positiva; porzioni di un gene di interesse trascritte dalle RNA polimerasi durante il processo di trascrizione; ed un sito di inizio del processo di trascrizione.
Nel plasmide a valle del promotore 3 è inserita e clonata mediante enzimi di restrizione, quali, ad esempio, ClaI e SacI, una sequenza di DNA atta a codificare per una proteina secreta 10, quale, ad esempio, una proteina chimerica mLDLR/mTf.
Eventualmente, nel plasmide a valle del promotore 3 mCK sono disposti un elemento regolatorio post–trascrizionale del virus dell’epatite di Woodchuck WPRE, progettato ad aumentare la quantità di RNA nucleare e citoplasmatico non impiantato influenzando positivamente la quantità di proteina secreta 10 sviluppata.
Di conseguenza, una ligazione dei sopra descritti elementi inseriti nel plasmide permette di ottenere, come mostrato in FIG. 2, un plasmide precursore 2, quale, ad esempio, pLBL1-mCK-mLDLR/mTf, o pLBL1-mCK-mLDLR/mTf WPRE polyAas, o altro analogo che rappresenta un precursore del vettore virale 1, atto alla produzione del vettore virale 1 stesso.
Come mostrato in FIG. 3 a titolo esemplificativo e non limitativo, il vettore virale 1 è un vettore adenovirale di tipo helper-dependent, quale, ad esempio, pΔ21mCK mLDLR/mTf, o altro analogo, ottenuto mediante la ligazione del plasmide precursore 2 e di un plasmide contenente una struttura virale, quale, ad esempio, pΔ21, o altra analoga, mediante l’azione di un enzima di restrizione, quale, ad esempio, AscI o altro analogo.
Come mostrato in FIG. 5, è stato eseguito un test di verifica sulla funzionalità del plasmide precursore 2 trasfettando cellule muscolari murine (C2C12), trattate con differenti mezzi di crescita 11a, 11b, 11c, in funzione di un antigene 12a, quale, ad esempio, αLDLR o altro analogo, e di un antigene di controllo 12b, quale, ad esempio, αGAPDH o altro analogo.
In particolare, nel trattamento di dislipidemie genetiche, come mostrato schematicamente in FIG. 6, la proteina secreta 10, mediante la tecnologia di trasferimento genico secondo la presente invenzione, espressa mediante il vettore adenovirale di tipo helper-dependent sotto il controllo di un promotore 3 muscolo specifico, è una proteina di fusione tra le lipoproteine 5 a bassa densità (LDL) e una pluralità di glicoproteine 14, quali, ad esempio la trasferrina, essendo dotata sul lato N terminale di un recettore 15 (LDLR) atto a legare le lipoproteine a bassa densità 5 (LDL) e sul lato C terminale due o più glicoproteine 14 atte a connettersi con i recettori 4 delle glicoproteine internalizzati per mezzo endocitosi nel fegato o in altri tessuti, quali, ad esempio, TfR1 e TfR2.
Infine, è mostrato nelle FIGG. 7-13, a titolo esemplificativo, un esempio di attuazione della tecnologia di trasferimento genico secondo la presente invenzione, in un modello murino di ipercolesterolemia familiare, mediante le seguenti fasi operative:
- predisposizione di un primo campione di cavie, quali, ad esempio, topi, ratti o altri analoghi, deficienti del recettore delle LDL trattati con il vettore virale 1 esprimente la proteina secreta 10, e predisposizione di un secondo campione di cavie trattati con soluzione fisiologica atto a fungere da campione di controllo;
- prelevamento di una pluralità di campioni di aorta, come mostrato in FIG. 7, dal primo campione di cavie durante un intervallo temporale distribuito preferibilmente su 12 settimane;
- determinazioni sieriche 13a di colesterolo totale, HDl, LDL, trigliceridi, ecc. presenti nei campioni prelevati dal primo campione di cavie, come mostrato nelle FIGG. 9 - 12;
- misurazione di un’area di lesione arterosclerotica 16a indotta sul primo campione di cavie, come mostrato in FIG. 13;
- prelevamento di una pluralità di campioni di aorta, come mostrato in FIG. 8, dal secondo campione di cavie durante un intervallo temporale preferibilmente distribuito su 12 settimane;
- determinazioni sieriche 13b di colesterolo totale, HDl, LDL, trigliceridi, ecc. presenti nei campioni prelevati dal secondo campione di cavie, come mostrato nelle FIGG. 9 - 12; e
- misurazione di un’area di lesione arterosclerotica 16b indotta sul secondo campione di cavie, come mostrato in FIG. 13.
Di conseguenza, come mostrato nelle FIGG. 9-13, l’iniezione della proteina secreta 10 mediante somministrazione del vettore adenovirale di tipo helper-dependent, ha determinato la regressione della lesione aterosclerotica, ed un abbassamento di colesterolo totale, HDl, LDL, trigliceridi nel primo campione di cavie.
Si sono descritte alcune forme preferite di attuazione dell’invenzione, ma naturalmente esse sono suscettibili di ulteriori modifiche e varianti nell’ambito della medesima idea inventiva. In particolare, agli esperti nel ramo risulteranno immediatamente evidenti numerose varianti e modifiche, funzionalmente equivalenti alle precedenti, che ricadono nel campo di protezione dell'invenzione come evidenziato nelle rivendicazioni allegate.
Claims (8)
- RIVENDICAZIONI 1. Tecnologia di trasferimento genico per il trattamento di pazienti affetti da disordini genetici, progettata per sviluppare almeno una proteina secreta (10), caratterizzata dal fatto che detta proteina secreta (10) è espressa da un vettore virale (1).
- 2. Tecnologia secondo la rivendicazione precedente, caratterizzata dal fatto di comprendere: - produzione di detto vettore virale (1); - eventuale sviluppo di una modifica chimica (6) su detto vettore virale (1); e - sviluppo ed uso di detta proteina secreta (10).
- 3. Tecnologia secondo la rivendicazione 1 o 2, caratterizzata dal fatto che detto vettore virale 1 è ottenuto da almeno un plasmide, ed in detto plasmide sono inseriti: - almeno un promotore (3); - almeno un elemento di regolazione positiva; - una pluralità di porzioni di un gene di interesse trascritte dalle RNA polimerasi durante almeno un processo di trascrizione; - almeno un sito di inizio di detto processo di trascrizione; ed - una sequenza di DNA, progettata per codificare per detta proteina secreta (10), inserita a valle di detto promotore (3) e clonata mediante una pluralità di enzimi di restrizione.
- 4. Tecnologia secondo la rivendicazione precedente, caratterizzata dal fatto che una ligazione di detto promotore (3), detto elemento di regolazione positiva e detta sequenza di DNA, inseriti in detto plasmide, è progettata per ottenere un plasmide precursore (2) di detto vettore virale (1).
- 5. Tecnologia secondo la rivendicazione 1, caratterizzata dal fatto che detto vettore virale (1) è un vettore adenovirale di tipo helperdependent ottenuto mediante una ligazione di detto plasmide precursore (2) e di almeno un plasmide contenente una struttura virale, mediante l’azione di un enzima di restrizione.
- 6. Tecnologia secondo la rivendicazione 2, caratterizzata dal fatto che detta modifica chimica (6) su detto vettore virale (1) è una reazione di PEGhilazione con un glicole polietilenico, progettato per ridurre un’attivazione residua della risposta immunitaria innata in detto vettore virale (1), eliminandone la tossicità residua e favorendone la relativa somministrazione umana senza compromettere l'efficienza epatica di trasduzione di detto vettore virale.
- 7. Proteina secreta (10) ottenuta mediante una tecnologia di trasferimento genico secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, caratterizzata dal fatto che detta proteina secreta (10) è una proteina di fusione tra lipoproteine a bassa densità, LDL (5) e una pluralità di glicoproteine (14), progettata per ridurre il colesterolo di detta pluralità di lipoproteine a bassa densità, LDL (5) in pazienti affetti da dislipidemie genetiche.
- 8. Proteina secreta (10) secondo la rivendicazione precedente, caratterizzata dal fatto di essere dotata sul lato N terminale di un recettore, LDLR (15) progettato per legare le lipoproteine a bassa densità, LDL (5) e sul lato C terminale di due o più glicoproteine (14) progettate per connettersi con i recettori TfR1 e TfR2 (4) di detta pluralità di glicoproteine (14) internalizzate per mezzo di endocitosi.
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