WO2004040313A1 - 尿路上皮癌腫瘍マーカー - Google Patents

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WO2004040313A1
WO2004040313A1 PCT/JP2003/014016 JP0314016W WO2004040313A1 WO 2004040313 A1 WO2004040313 A1 WO 2004040313A1 JP 0314016 W JP0314016 W JP 0314016W WO 2004040313 A1 WO2004040313 A1 WO 2004040313A1
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WO
WIPO (PCT)
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antibody
protein
calreticulin
calreticulin protein
urothelial carcinoma
Prior art date
Application number
PCT/JP2003/014016
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Tatsuhiro Yoshiki
Susumu Kageyama
Original Assignee
Tss Biotech Inc.
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Filing date
Publication date
Application filed by Tss Biotech Inc. filed Critical Tss Biotech Inc.
Priority to US10/482,188 priority Critical patent/US7323312B2/en
Priority to DE60323685T priority patent/DE60323685D1/de
Priority to JP2004548110A priority patent/JP3626177B2/ja
Priority to EP03770099A priority patent/EP1605266B1/en
Priority to AU2003280694A priority patent/AU2003280694A1/en
Publication of WO2004040313A1 publication Critical patent/WO2004040313A1/ja

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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers

Definitions

  • the present invention relates to a protein useful for diagnosing urothelial carcinoma, and a method for detecting urothelial carcinoma by measuring the protein.
  • Urinary tract epithelial cancer (bladder cancer, renal pelvic and ureteral cancer, etc.) is the second most common urinary tract cancer after prostate cancer, and the number of bladder cancers alone in Japan is 7886 in males and 2697 in females (1994, The Cancer Research Foundation) killed 2856 men and 1277 women (1997, same). By the way, in the United States, it ranks fifth in male cancer patients in all areas. Since about 70% of these patients recur in the urinary tract, it is estimated that there will be tens of thousands of patients in Japan alone, including follow-up cases.
  • Urinary cytology which has been clinically applied since the oldest in history, represents a non-invasive test, but has excellent specificity (95 to 100%) — and low sensitivity (40 to 60%). ) The sensitivity is extremely poor, especially in well-differentiated cancers (0-15%). It has been reported that recently developed auxiliary diagnostic methods such as BTA (bladder tumor antigen) and NMP22 (nuclear matrix protein 22) have slightly improved sensitivity compared to urine cytology. However, false positives are likely to appear in gross hematuria and cystitis. Because of this low specificity, it has not reached a position beyond urine cytology.
  • BTA bladedder tumor antigen
  • NMP22 nuclear matrix protein 22
  • calreticulin protein was only reported as one of the expression enhancing spots obtained by proteome analysis (Cel is A, et al., Electrophoresis, 20 : 300-309, 1999), but it has not been studied as a tumor marker for urothelial carcinoma. Disclosure of the invention
  • An object of the present invention is to find a novel tumor marker for urothelial carcinoma and to provide a method capable of effectively detecting urothelial carcinoma.
  • the present inventors have conducted intensive studies to solve the above problems, and as a result, have found that the above problems can be solved by using calreticulin protein as a tumor marker and using an antibody that specifically reacts with the tumor marker.
  • the invention has been completed.
  • the present invention includes the following inventions.
  • a method for detecting urothelial carcinoma by measuring calreticulin protein in a sample (1) A method for detecting urothelial carcinoma by measuring calreticulin protein in a sample.
  • a diagnostic agent for urothelial carcinoma containing an antibody that specifically reacts with calreticulin protein or a fragment thereof.
  • a kit for diagnosing urothelial cancer comprising an antibody that specifically reacts with calreticulin protein or a fragment thereof.
  • proteomics proteome analysis
  • cDNA differential display for mRNA
  • non-urothelial carcinoma patients refer to patients who do not have urothelial carcinoma, such as patients with urolithiasis, prostate cancer, benign prostatic hyperplasia, renal cell carcinoma, and hypospadias Means That is, the present invention detects urothelial carcinoma by immunologically quantifying calreticulin protein in a sample using an antibody that specifically reacts with the calreticulin protein or a fragment thereof. About the method.
  • the method of detecting urothelial carcinoma of the present invention f method enables discrimination between a urothelial carcinoma patient and a non-urothelial carcinoma patient as described above.
  • Calreticulin (CRT) protein is a 46 kDa protein consisting of 400 amino acids located in the endoplasmic reticulum. In addition to being distributed in many tissues, this protein is conserved in a wide range of species, from higher plants to mammals. It was first discovered as a calcium-binding protein, but has recently attracted attention as a molecular chaperone. In addition, it is a very important protein for living organisms that has various functions such as cell adhesion, activation of gene expression by steroid hormone binding, and stress response. Antibodies of the invention
  • the antibody that can be used in the present invention is not particularly limited as long as it specifically reacts with calreticulin protein or a fragment thereof, and a monoclonal antibody or a polyclonal antibody can be used. Preferably. In particular, antibodies that react with the C-terminus of calreticulin protein are preferred. Globulin type of the antibody of the present invention is not intended to be particularly limited so long as it has the above characteristics, IgG, IgM, I g A , IgE, may be any of IgD, I gG and I g M is preferably .
  • SPA-600 StressGen
  • SPA-601 StressGen
  • Antibodies that specifically react with calreticulin protein can also be prepared by the method described below.
  • a protein to be used as an immunogen is prepared.
  • Calreticulin protein or a fragment thereof is used as the immunogenic protein.
  • the amino acid sequence of the calreticulin protein that can be used as an immunogen in the present invention and the cDNA sequence encoding the protein are respectively published in GenBank under the accession number AD000092. Therefore, using the published amino acid sequence information, a calreticulin protein fragment to be used as an immunogen is synthesized by a method known in the art, for example, a solid phase peptide synthesis method. be able to.
  • a carrier protein such as KLH or BSA.
  • a recombinant vector for calreticulin production can be obtained by ligating the above-published cDNA sequence to an appropriate vector, and a transformant is a calreticulin-recombinant recombinant vector for calreticulin protein. Can be obtained by introducing it into a host such that it can be expressed.
  • a phage or a plasmid capable of autonomously growing in a host microorganism is used.
  • Plasmid DNA includes Escherichia coli-derived plasmids (eg, pET21a, pGEX4T, pUC118, pUC119, pUC18, pUC19), Bacillus subtilis-derived plasmids (eg, pUBHO, pTP5, etc.), and yeast-derived plasmids (eg, YEpl3, YEp24, YCp50, etc.) and phage DNA include fly phage (Lgtll, ⁇ , etc.). Furthermore, animal viruses such as vaccinia virus and insect virus vectors such as baculovirus can also be used.
  • Escherichia coli-derived plasmids eg, pET21a, pGEX4T, pUC118, pUC119, pUC18, pUC19
  • Bacillus subtilis-derived plasmids eg, pUBHO, pTP5, etc.
  • the purified DNA is digested with an appropriate restriction enzyme, inserted into an appropriate vector DNA restriction enzyme site or multicloning site, and ligated to the vector. A method is adopted.
  • calreticulin-producing recombinant vectors used in mammalian cells include promoters, calreticulin cDNA, cis-elements such as enhancers, splicing signals, and poly-A addition signals, if desired.
  • a selection marker, a ribosome binding sequence (SD sequence) and the like may be linked.
  • a known DNA ligase is used to link the DNA fragment and the vector fragment. Then, the DNA fragment and the vector fragment are annealed and ligated to prepare a recombinant vector for calreticulin production.
  • the host used for the transformation is not particularly limited as long as it can express the calreticulin protein.
  • bacteria Esscherichia coli, Bacillus subtilis, etc.
  • yeast yeast
  • animal cells COS cells, CH0 cells, etc.
  • insect cells can be mentioned.
  • the recombinant vector for calreticulin production is capable of autonomous replication in the bacterium, and at the same time, a promoter, a ribosomal binding sequence, calreticulin DNA, and a transcription termination sequence are used. It is preferable that it is composed of In addition, a gene that controls a promoter may be included. Examples of Escherichia coli include Escherichia coli BRL, and examples of Bacillus subtilis include Bacillus subtilis. Any promoter can be used as long as it can be expressed in a host such as E. coli.
  • the method for introducing a recombinant vector into bacteria is not particularly limited as long as it is a method for introducing DNA into bacteria. For example, a method using calcium ions, Electroporation method and the like can be mentioned.
  • calreticulin protein can be produced in accordance with a method known in the art.
  • Calreticulin protein used as an immunogen in the present invention culturing the transformant prepared above, and c "culture" which can be obtained by collecting from the culture, the culture supernatant, cultured It refers to any of cells, cultured cells, or crushed cells or cells.
  • the method for culturing the above transformant in a medium is performed according to a usual method used for culturing a host.
  • the culture medium for culturing transformants obtained using microorganisms such as Escherichia coli and yeast as a host contains a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts, and the like that can be used by the microorganisms, so that the cultivation of the transformants is efficient.
  • a natural medium or a synthetic medium may be used as long as the medium can be performed in a controlled manner.
  • Culture is usually performed at 37 ° C for 6 to 24 hours under aerobic conditions such as shaking culture or aeration and stirring culture. During the culture period, the pH is kept near neutral. The pH is adjusted using an inorganic or organic acid, an alkaline solution, or the like. During the culture, an antibiotic such as ampicillin-tetracycline may be added to the medium as needed.
  • calreticulin protein When calreticulin protein is produced in the cells or cells after the culture, the proteins are extracted by disrupting the cells or cells. When the calreticulin protein is produced outside the cells or outside the cells, the cells or cells are removed by force centrifugation or the like using the culture solution as it is. Thereafter, common biochemical methods used for the isolation and purification of proteins, such as ammonium sulfate precipitation, gel chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography, etc., are used alone or in appropriate combination. The calreticulin protein can be isolated and purified from the culture.
  • calreticulin protein has been obtained can be confirmed by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis or the like.
  • an adjuvant may be added for effective immunization.
  • the adjuvant include commercially available complete Freund's adjuvant and incomplete Freund's adjuvant, and any of these may be mixed.
  • the immunogen obtained as described above is administered to mammals, for example, rats, mice (for example, BALB of inbred mice), and egrets.
  • mammals for example, rats, mice (for example, BALB of inbred mice), and egrets.
  • Immunization is primarily performed by injecting the immunogen intravenously, subcutaneously, or intraperitoneally.
  • the interval of immunization is not particularly limited.
  • booster immunization is performed 2 to 6 times, preferably 3 to 4 times at intervals of several days to several weeks, preferably at intervals of 1 to 4 weeks.
  • the antibody titer in the serum of the immunized animal is repeatedly measured by ELISA (Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay), etc., and when the antibody titer reaches a plateau, the immunogen is injected intravenously or intraperitoneally. And make the final immunization.
  • the antibody-producing cells are collected 2 to 5 days, preferably 3 days after the last immunization.
  • Antibody-producing cells include spleen cells, lymph node cells, peripheral blood cells and the like, with spleen cells or local lymph node cells being preferred.
  • the myeloma cells to be fused with the antibody-producing cells generally available cell lines of animals such as mice can be used.
  • the cell line used has drug selectivity and cannot survive in HAT selection medium (including hypoxanthine, aminopterin and thymine) in the unfused state, but can only survive in the state fused to antibody-producing cells. Those having properties are preferred.
  • the cell line is derived from an animal of the same strain as the immunized animal.
  • myeloma cells include a hypoxanthine 'guanine' phosphoribosyl 'transferase (HGPRT) deficient cell line derived from BALB mouse, P3X63-Ag.
  • HGPRT hypoxanthine 'guanine' phosphoribosyl 'transferase
  • the myeloma cells are fused with the antibody-producing cells.
  • Cell fusion is performed in an animal cell culture medium such as serum-free DMEM or RPMI-1640 medium.
  • Live cells and myeoma cells are mixed at a ratio of about 1: 1 to 20: 1, and a fusion reaction is performed in the presence of a cell fusion promoter.
  • a cell fusion promoter polyethylene dalicol having an average molecular weight of 1,500 to 4,000 daltons or the like can be used at a concentration of about 10 to 80%.
  • an auxiliary agent such as dimethyl sulfoxide may be used in combination to increase the fusion efficiency.
  • antibody-producing cells and myeloma cells can be fused using a commercially available cell fusion device utilizing electrical stimulation (for example, electoral portation).
  • Select the desired hybridoma from the cells after cell fusion treatment As a method, after appropriately diluting the cell suspension with, for example, RPMI-1640 medium containing fetal calf serum, spread about 2 ⁇ 10 5 cells / well on a microtiter plate, and add a selective medium to each well. In addition, culture is performed after replacing the selection medium appropriately.
  • the culturing temperature is 20 to 40 ° C, preferably about 37 ° C.
  • TK thymidine-kinase
  • HAT medium hypoxanthine / aminopterin / thymidine
  • a screening is performed to determine whether the target antibody is present in the culture supernatant of the grown hybridoma. Screening of hybridomas may be performed according to a conventional method, and is not particularly limited. For example, a part of the culture supernatant contained in a well grown as a hybridoma is collected and subjected to enzyme immunoassay (EIA; Enzyme Immuno Assay and ELISA), radioimmunoassay (RIA; Radio Immuno Assay), etc. Can be done.
  • EIA Enzyme Immuno Assay and ELISA
  • RIA Radio Immuno Assay
  • the hybridoma of the present invention is a monoclonal antibody that is stable in culture in a basic medium such as RPMI1640 or DMEM and specifically reacts with calreticulin protein derived from urothelial carcinoma. It produces and secretes
  • the hybridomas are cultured in animal cell culture medium such as RPMI-1640 medium containing 10% fetal calf serum, MEM medium or serum-free medium under normal culture conditions (for example, 37 ° C, 5% C0 2 concentration) in cultured 2-10 days to obtain the culture supernatant antibody.
  • animal cell culture medium such as RPMI-1640 medium containing 10% fetal calf serum, MEM medium or serum-free medium under normal culture conditions (for example, 37 ° C, 5% C0 2 concentration) in cultured 2-10 days to obtain the culture supernatant antibody.
  • ascites formation method about 1 ⁇ 10 7 hybridomas are administered intraperitoneally to mammals and allogeneic animals derived from myeloma cells, and the hybridomas are grown in large quantities. One to two weeks later, ascites fluid or serum is collected.
  • mice are immunized in the same manner as described above, and after 6 to 60 days from the last immunization date, the antibodies are detected by enzyme immunoassay (EIA and ELISA), radioimmunoassay (RIA), etc.
  • EIA and ELISA enzyme immunoassay
  • RIA radioimmunoassay
  • the titer is measured and blood is collected on the day that shows the highest antibody titer to obtain antiserum. Thereafter, the reactivity of the polyclonal antibody in the antiserum is measured by ELISA or the like.
  • the method for detecting urothelial carcinoma of the present invention is characterized by immunologically measuring calreticulin protein derived from urothelial carcinoma cells under test using the above-described antibody. I do.
  • the detection includes both checking the presence or absence of calreticulin protein in a sample and measuring the amount thereof.
  • urothelial carcinoma refers to a cancer that occurs in the transitional epithelium in the calyx, renal pelvis, ureter, bladder, and urethra.
  • urothelial cancer include, for example, bladder cancer, renal pelvis cancer, ureter cancer, and urethral cancer, and the present invention is particularly preferably used in the detection of bladder cancer.
  • the detection method of the present invention can be carried out by a method using an antibody, that is, any method as long as it is an immunological assay, wherein the antibody of the present invention can be used as the antibody used in the assay.
  • Enzyme immunoassay (ELISA, EIA), fluorescence immunoassay, Radioimmunoassay (RIA), luminescence immunoassay, immunoturbidimetry, immunoturbidimetry, latex agglutination, latex turbidimetry, hemagglutination, particle agglutination, Western blot, etc.
  • the detection method is implemented.
  • the sample to be tested in the detection method of the present invention is not particularly limited as long as it is a biological sample that may contain calreticulin protein derived from urothelial carcinoma.
  • calreticulin protein derived from urothelial carcinoma examples include blood, serum, plasma, lymphocyte culture supernatant, urine, cerebrospinal fluid, saliva, sweat, ascites, and the like, and cell or organ extracts can also be used.
  • measured values of calreticulin protein obtained in samples such as urine and serum are useful as indicators of urothelial carcinoma.
  • the method for detecting urothelial cancer of the present invention can be detected not only in cancer tissue but also in urine, and thus is very useful as a simple detection method.
  • the detection method of the present invention is performed by an immunoassay using a label such as an enzyme immunoassay, a fluorescence immunoassay, a radioimmunoassay, or a luminescence immunoassay
  • the antibody of the present invention is immobilized.
  • the solid support is composed of materials such as polystyrene, polycarbonate, polyvinyltoluene, polypropylene, polyethylene, polyvinyl chloride, nylon, polymethacrylate, latex, gelatin, agarose, senorelose, sepharose, glass, metal, ceramics, and magnetic materials.
  • Insoluble carriers in the form of beads, microplates, test tubes, sticks or test pieces can be used.
  • the solid phase can be formed by binding the solid phase carrier and the antibody or sample component of the present invention according to a known method such as a physical adsorption method, a chemical binding method, or a combination thereof.
  • the antibody in order to easily detect the reaction between the antibody of the present invention and calreticulin protein derived from urothelial carcinoma cells in a sample, the antibody is directly labeled by labeling the antibody of the present invention. Detection or indirectly by using a labeled secondary antibody. In the detection method of the present invention, in terms of sensitivity, it is preferable to use the latter indirect detection (for example, the sandwich method).
  • peroxidase POD
  • a ⁇ / caliphophosphatase a ⁇ / caliphophosphatase
  • _galactosidase perease
  • catalase glucose oxidase
  • lactate dehydrogenase amylase or biotin-avidin complex
  • fluorescein isothiocyanate fluorescein isothiocyanate, tetramethylrhodamine isotiosocyanate, substituted rhodamine isotiosinate, dichlorotriazine isothiosinate, Alexa480 or AlexaFluor488
  • tritium iodine- 125, iodine- 131, or the like can be used.
  • the luminescence immunoassay may use NADH-F ⁇ H 2 -luciferase system, oleminol-hydrogen peroxide-POD system, acridinium ester system, dioxetane compound system, or the like.
  • the binding method between the labeling substance and the antibody may be a known method such as the dartartaldehyde method, maleimide method, pyridyl disulfide method or periodate method in the case of the enzyme immunoassay, or the radioimmunoassay in the case of the radioimmunoassay.
  • Known methods such as the chloramine T method and the Porton Hunter method can be used.
  • the operation method for the measurement is a well-known method.
  • the components in the sample are immobilized and contacted with the labeled antibody of the present invention to form a complex of calreticulin protein and the antibody of the present invention. Let it. Then, unbound labeled antibody is separated by washing, and the amount of calreticulin protein in the sample can be measured from the amount of bound labeled antibody or the amount of unbound labeled antibody.
  • the antibody of the present invention is reacted with a sample (primary reaction), and further reacted with a labeled secondary antibody (secondary reaction).
  • the primary reaction and the secondary reaction may be performed in the reverse order, may be performed simultaneously, or may be performed at a different time.
  • the immobilized calreticulin protein-antibody-labeled secondary antibody complex of the present invention, or the immobilized antibody-calreticulin protein-labeled secondary antibody of the present invention A complex of antibodies forms. And unbound
  • the labeled secondary antibody is washed and separated, and the amount of calreticulin protein in the sample can be measured from the amount of bound labeled secondary antibody or the amount of unbound labeled secondary antibody.
  • a labeling enzyme is reacted with a substrate under the optimum conditions, and the amount of the reaction product is measured by an optical method or the like.
  • the fluorescence intensity by a fluorescent substance label is measured
  • the amount of radioactivity by a radioactive substance label is measured.
  • the luminescence immunoassay the amount of luminescence by the luminescence reaction system is measured.
  • the detection method of the present invention comprises the steps of: producing an immunocomplex aggregate such as an immunoturbidimetry, latex agglutination reaction, latex nephelometry, hemagglutination reaction or particle agglutination reaction, and transmitting or scattering the light by an optical method.
  • an immunocomplex aggregate such as an immunoturbidimetry, latex agglutination reaction, latex nephelometry, hemagglutination reaction or particle agglutination reaction
  • a phosphate buffer, a glycine buffer, a Tris buffer, a Good buffer, or the like can be used as a solvent, and a reaction accelerator such as polyethylene glycol or the like can be used.
  • Non-specific reaction inhibitors may be included.
  • the antibody of the present invention is immobilized as a primary antibody on an insoluble carrier.
  • the solid-phase surface on which the antigen is not adsorbed is blocked by a protein (eg, serum of puppies, serum albumin, gelatin, etc.) unrelated to the antigen.
  • the test sample is brought into contact with the immobilized primary antibody.
  • a labeled secondary antibody that reacts with the calreticulin protein is brought into contact with a site different from the primary antibody, and a signal from the label is detected.
  • the “secondary antibody that reacts with calreticulin protein at a site different from the primary antibody” used here is not particularly limited as long as it recognizes a site other than the binding site between the primary antibody and calreticulin protein.
  • any of polyclonal antibodies, antisera, and monoclonal antibodies may be used, and fragments (Fab, F (ab ') 2 , Fab', etc.) of these antibodies may be used. it can.
  • a plurality of types of monoclonal antibodies may be used as the secondary antibody.
  • the antibody of the present invention is labeled to form a secondary antibody, and an antibody that reacts with calreticulin protein at a site different from the antibody of the present invention is immobilized as a primary antibody on an insoluble carrier, Bringing the test sample into contact with the immobilized primary antibody, A signal from the label may be detected by contacting the antibody of the present invention with a label as a secondary antibody.
  • the antibodies of the present invention as described above, to react Karureti Cullin the protein specifically derived from the urothelial cancer cell, a diagnostic agent c present invention which can be used as a diagnostic agent for cancer, the present invention Therefore, calreticulin derived from urothelial carcinoma cells contained in a sample collected from an individual suspected of suffering from urothelial carcinoma using the diagnostic agent of the present invention. By detecting the protein, the individual can be diagnosed as having urothelial cancer.
  • the diagnostic agent of the present invention can be used in any means as long as it is a means for performing an immunological measurement.However, a simple and convenient method such as a test strip for immunochromatography known in the art can be used. By using them in combination, cancer can be diagnosed more easily and quickly.
  • the test strip for immunochromatography includes, for example, a sample receiving portion made of a material that easily absorbs a sample, a reagent portion containing the diagnostic agent of the present invention, a developing portion in which a reactant between the sample and the diagnostic agent moves, and a developing portion. It is composed of a labeling part for coloring the reacted product, a presenting part for developing the colored reactant, and the like, and can have the same form as a pregnancy diagnostic drug.
  • the sample receiving section absorbs the sample and causes the sample to reach the reagent section. Subsequently, in the reagent section, a reaction between the urothelial carcinoma cell-derived calreticulin protein in the sample and the antibody of the present invention occurs, and the reacted complex moves through the developing section and reaches the labeling section. In the labeled part, the reaction between the above-mentioned reaction complex and the labeled secondary antibody occurs, and when the reactant with the labeled secondary antibody develops to the display part, coloration is recognized.
  • the immunochromatographic test strips described above do not pose any pain or danger to the user, so they can be used for monitoring at home, and the results can be examined and treated at the level of each medical institution. (Surgical resection, etc.), which can lead to prevention of metastasis and recurrence.
  • this test strip can be mass-produced inexpensively by a manufacturing method as described in, for example, JP-A-10-54830.
  • the diagnostic agent of the present invention in combination with a diagnostic agent for a known tumor marker of urothelial carcinoma, a more reliable diagnosis can be made.
  • Urothelial carcinoma diagnostic kit Urothelial carcinoma diagnostic kit
  • the present invention also relates to a kit for diagnosing urothelial carcinoma, comprising an antibody that specifically reacts with calreticulin protein or a fragment thereof.
  • the antibody may be bound to a solid support as described above.
  • the kit of the present invention may include a labeled secondary antibody, a carrier, a washing buffer, a sample diluent, an enzyme substrate, a reaction terminating solution, a calreticulin protein as a purified standard substance, and the like.
  • FIG. 1 shows the imunobout motifs of urine from patients with urothelial carcinoma with various degrees of differentiation and various tumor diameters, after one-dimensional electrophoresis, transferred to PVDF membrane and performed using SPA-600 antibody.
  • FIG. G1 to G3 represent the degree of differentiation (ie, malignancy) of the type of urothelial carcinoma histologically classified as transitional cell carcinoma, and SC.C means squamous epidermoid carcinoma, I to V represent the results of urine cytology, and the numerical values represent the tumor diameter.
  • tissue lysate comprising Tel (Nacalai tesque Inc.) was added, homogenized, and centrifuged at 15,000 rpm for 10 minutes to obtain a supernatant as a tissue lysate.
  • desalting treatment was performed using a MicroSpin G-25 Column (Amersham Bioscience). Protein quantification was performed by the Bradford method using serum albumin (Pierce) as a standard substance.
  • Isoelectric focusing was performed on IPGphor (Amersham Bioscience).
  • the fixed gel pH gel rooster strip gel used various pH ranges (18 cm, pH 4-7, 6-9, 4-5, 4.5-5.5, 5-6, 5.5). ⁇ 6.7).
  • the protein content per gel is 80 ⁇ g (pH 4 to 7) and 120 ⁇ (pH 4 to 5, 4.5 to 5.5, 5-6, 5.5-6.7, 6-9) were loaded and electrophoresed at 8,000 V until they reached 32,000 Vh, 60, and OOOVh, respectively.
  • lmg protein nogel was used regardless of the pH range.
  • the strip gel after the isoelectric focusing was equilibrated for 30 minutes with a buffer consisting of 50 mM Tris-HCl pH 6.8, 8 M urea, 30% glycerol, 2% SDS, and 2% DTT.
  • a 12.5% homogeneous polyacrylamide gel of 22 ⁇ 20 ⁇ 0.1 cm was used and electrophoresed on a 20 mA Z gel.
  • the electrophoresis buffer used was 25 mM Tris-base, 192 mM glycine, 0.1% SDS.
  • the gel was fixed with 30% ethanol and 10% acetic acid, washed with 20% ethanol and ultrapure water, and sensitized with 0.02% sodium thiosulfate. After silver reaction with a 0.2% silver nitrate solution, rinsing with ultrapure water, development was performed with 0.025% formalin, 0.001% sodium thiosulfate, and 3% potassium carbonate. To stop color development, 2.5% acetic acid, 0.4M Tris-base was used.
  • the gel image was captured with a reflected light flatbed scanner. Spot detection is performed automatically by the two-dimensional electrophoresis gel analysis software PDQUEST Ver5.1 (pdi). The detection function (silver stain mode) was used, and spots that were missed due to this were visually added.
  • the method was modified from the method of Gharahdaghi et al. (Electrophoresis, 1999).
  • the excised gel was desilvered with a 15 mM pherocyanic acid rim, 50 mM sodium thiosulfate.
  • the cysteine residue was reductively alkylated with lOmM DTT and 50 mM lodoacetamide, and then treated with trypsin (Promega, sequencing grade) at -37 ° C.
  • the digested peptide fragment solution was recovered and desalted and concentrated using a ZipTip C18 column (Mil lipore). Next, the mixture was mixed with a matrix (a saturated solution of ⁇ -cyano-4-hydroxycetic acid), dropped on a sample plate of a mass spectrometer, and dried.
  • Voyager RP PerSeptive Biosystems
  • MALDI / T0F-MS MALDI / T0F-MS
  • the des-Arg-Bradykinin (904.468 (Charge + l)) ACTH (18-39 cl ips) (246.2) was used as an external standard for the calibration, and two trypsin autolysates (842. 510, 2211.1.1) were used.
  • Protein identification was performed by peptide mass fingerprinting (PMF method). Two types of peptide mass databases, MS_Fit and PeptideSearch, were used together. The peptide mass was monoisotopic and the tolerance was within ⁇ 100 ppm.
  • Antibody dilution was 10,000-fold for SPA-601, 20,000-fold for SPA-600, 10,000-fold for HRP-labeled anti-mouse IgG antibody (MBL), and 50,000 for HRP-labeled anti-Egret IgG antibody (Vector). Doubled. For washing and dilution of the antibody, 10 mM Tris-HCl pH 7.4, 100 mM NaC1, 0.1% Tween20 was used. For detection of the band, chemiluminescence from ECL (Amersham Bioscience) was used and exposed to X-ray film.
  • proteins were transferred to a Sekeprot PVDF membrane (BioRad) using a buffer containing aminocaproic acid using a Multiphor II NovaBlot Kit (Amersham Bioscience) using a buffer containing aminocaproic acid. Staining of the PVDF membrane was performed with CBBR250. The target spot was cut out, and the N-terminal sequence was determined by Edman degradation. In N-terminal amino acid sequence analysis, the EPAVYFKEQF sequence was obtained for both of these spots. This was consistent with the primary structure of the human reticular ulin protein No. 1-10.
  • the calreticulin protein band on the X-ray film was imaged with a transmitted light flatbed scanner and quantified using the image analysis software Scion Image (Scion Co.). At this time, the intensity of the band obtained from 1 g of the Hela cell extract was set to 1.0 unit.
  • a comparison between normal epithelial tissue and cancer tissue from the same case collected from a total cystectomy specimen showed a stronger calreticulin protein band in the cancer.
  • Example 3 Detection of urinary calreticulin protein
  • one-dimensional electrophoresis was performed in the same manner as described above, then transferred to a PVDF membrane, and subjected to immunoblot using the SPA-600 antibody.
  • Negative reactive predictive value 101/109 92.7% urine calreticulin protein was detected in urinary cytology patients with positive urothelial carcinoma and patients with negative urothelial carcinoma, respectively. The results obtained from the detection were compared. The results are shown in Table 2 below. Table 2 Relationship with urine cytology results in urothelial carcinoma cases
  • Fig. 1 shows the results of the immunoblot.
  • the method of the present invention can detect calreticulin protein even when the size of the cancer is small or the malignancy is low, and thereby, urothelial carcinoma can be detected. .
  • urothelial carcinoma can be effectively detected by a simple and inexpensive method, early detection, diagnosis and treatment of urothelial carcinoma become possible.
  • urothelial carcinoma can be detected noninvasively using urine of a patient, so that urothelial carcinoma can be detected simply and quickly.

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Abstract

本発明は、カルレティキュリン蛋白質又はその断片と特異的に反応する抗体を用いて、試料中のカルレティキュリン蛋白質を免疫学的に測定し、尿路上皮癌を検出する方法に関する。

Description

明 細 書 尿路上皮癌腫瘍マーカー 技術分野
本発明は、 尿路上皮癌の診断に有用な蛋白質、 及ぴ該蛋白質を測定することに よる尿路上皮癌の検出方法に関する。 背景技術
尿路上皮癌 （膀胱癌 ·腎盂尿管癌等） は尿路性器癌では前立腺癌に次いで罹患 者が多く、 膀胱癌だけでもわが国の年間罹患数は男 7886人、 女 2697人 （1994年、 がん研究振興財団） 、 死亡数は男 2856人、 女 1277人 （1997年、 同） に上る。 ちな みに、 米国では全領域の男性癌患者の第'五位を占める。 これらの患者の約 70%が 尿路内再発を繰り返すことから、 経過観察症例を含めて国内だけで常時数万人に およぶ患者数が推測される。 また、 検診では一般男子の約 3%、 女子の 7%に赤血 球 5個以上 視野の血尿が認められ、 尿路上皮癌のスクリーニング対象者は膨大 な数に上る。 通常、 内視鏡検査が確定診断の決め手となるが、 侵襲的な上に高コ ス トであるためマススクリーニングに不向きである。 したがって、 非侵襲的で多 数の検体に対応可能で、 かつ、 感度 ·特異性ともに優れた診断法の開発が急務で あった。
歴史的に最も古くから臨床応用されている尿細胞診は非侵襲的検査の代表であ るが、 特異性に優れている （95〜100%) —方で、 感度は低く （40〜60%) 、 殊 に高分化癌ではその感度は著しく不良である （0〜15%) 。 最近登場した BTA (bl adder tumor antigen ；膀胱腫瘍抗原） や NMP22 (核マトリ ックスプロテイン 2 2) などの補助診断法は、 尿細胞診に比べ感度がやや向上しているとも報告され ているが、 肉眼的血尿や膀胱炎などで偽陽性が出やすい。 この低い特異性のため に、 尿細胞診を越える地位には至っていない。
—方、 癌研究領域では、 肝細胞癌 （Yoon GS, et al. , Cancer Res, 60： 1117-1 120， 2000 及び Yu LR, et al. , Electrophoresis, 21 : 3058-3068， 2000 参照） や乳癌 (Bini L， et al. , Electrophoresi s, 18 : 2832-2841, 1997 参照） などで カルレティキュリン蛋白質と称される蛋白質の発現増強が見出されている。 しか し、 尿路上皮癌については、 カルレティキュリン蛋白質は、 プロテオーム解析で 得られた発現増強スポッ トの 1つとして報告されているに過ぎず （Cel is A, et al. , Electrophoresis, 20 : 300-309， 1999参照） 、 尿路上皮癌の腫瘍マーカーと しての検討は行われていない。 発明の開示
本発明の課題は、 新規な尿路上皮癌腫瘍マーカーを見出し、 尿路上皮癌を効果 的に検出できる方法を提供することである。
本発明者らは、 上記課題を解決すべく鋭意検討の結果、 カルレティキュリン蛋 白質を腫瘍マーカーとして、 これに特異的に反応する抗体を用いることにより、 上記課題が解決できることを見いだし、 本発明を完成するに至った。
すなわち、 本発明は、 以下の発明を包含する。
( 1 ) 試料中のカルレティキュリン蛋白質を測定することにより、 尿路上皮癌を 検出する方法。
( 2 ) カルレティキュリン蛋白質又はその断片と特異的に反応する抗体を用いて、 試料中のカルレティキュリン蛋白質を免疫学的に測定し、 尿路上皮癌を検出する 方法。
( 3 ) 試料が尿である、 （1 ) 又は （2 ) に記載の方法。
( 4 ) カルレティキュリン蛋白質又はその断片と特異的に反応する抗体を含む尿 路上皮癌診断薬。
( 5 ) カルレティキユリン蛋白質又はその断片と特異的に反応する抗体を含む尿 路上皮癌診断用キット。
候補物質のスクリーニング方法については、 mRNA (cDNA) を対象にしたデファ レンシャルディスプレイではなく、 発現蛋白質を直接解析するプロテオミクス (プロテオーム解析） を選択した。 すなわち、 正常組織に比べて癌組織で特異的 又は有意に発現増加する癌性変化蛋白質を検索同定し、 次に、 体液中におけるそ れらの蛋白質発現量を検討することとした。 この理由は、 ①現時点での安定した 定量的検出系の測定対象は、 遺伝子ではなく蛋白質であること、 ② mRNA (cDNA) 量と蛋白質量の相関係数は必ずしも高くないこと、 すなわち遺伝子レベルでの発 現量の差が必ずしも蛋白質レベルでは確認できないこと、 ③発見された mRNAにつ いて、 必ずしも蛋白質としての存在を証明できないこと、 ④一部の遺伝子は、 転 写レベルよりむしろ翻訳レベルで制御されていること、 ⑤翻訳後の蛋白質修飾や 周辺環境の影響による量の変化は、 遺伝子レベルの実験では理論的に把握不可能 であること、 などによる。 要は、 最終標的は蛋白質なので、 最初から、 現行の解 析システムの検出感度以上に存在する蛋白質に焦点を絞る、 という発想である。 以上の方針に基づき、 本発明者らは、 正常尿路上皮細胞と比較して尿路上皮癌 細胞において発現が増強する蛋白質について、 プロテオーム解析によりスクリー ニングを行った。 その結果、 全長カルレティキュリン蛋白質が、 正常尿路上皮組 織と癌組織の間で発現量に差が強く認められることが明らかとなった。 さらに、 本発明者らは、 非尿路上皮癌患者と尿路上皮癌患者の尿におけるカルレティキュ リン蛋白質の量を免疫学的方法によって測定したところ、 カルレティキュリン蛋 白質は、 尿路上皮癌患者の尿において高度の特異性及び感度をもって検出される ことを見出した。 ここで、 非尿路上皮癌患者とは、 尿路上皮癌に罹患していない 患者を指し、 例えば、 尿路結石症、 前立腺癌、 前立腺肥大症、 腎細胞癌、 尿道下 裂に罹患した患者を意味する。 すなわち、 本発明は、 上記カルレティキユリン蛋 白質又はその断片と特異的に反応する抗体を用いて、 試料中のカルレティキュリ ン蛋白質を免疫学的に定量することにより尿路上皮癌を検出する方法に関する。 また本発明の尿路上皮癌の検出方 f法は、 尿路上皮癌患者と上記のような非尿路上 皮癌患者の識別を可能にするものである。
カルレティキュリン蛋白質
カルレティキュリン （Calreticulin (CRT) ) 蛋白質とは、 小胞体に局在する アミノ酸 400残基からなる 46 kDaの蛋白質である。 この蛋白質は、 多くの組織に 分布しているだけでなく、 高等植物から哺乳類まで幅広い種に保存されている。 当初はカルシウム結合蛋白質として発見されたが、 最近では分子シャペロンとし ての機能が注目されている。 その他、 細胞接着、 ステロイ ドホルモン結合による 遺伝子発現の活性化、 ス トレス応答など多彩な機能を持つ、 生物にとって非常に 重要な蛋白質である。 本発明の抗体
本発明において使用できる抗体としては、 カルレティキュリン蛋白質又はその 断片と特異的に反応するものであれば特に限定されず、 モノクローナル抗体でも ポリクローナル抗体でも使用することができるが、 モノクローナル抗体を使用す るのが好ましい。 特に、 カルレティキュリ ン蛋白質の C末端と反応する抗体が好 ましい。 本発明の抗体のグロブリンタイプは、 上記特徴を有するものである限り 特に限定されるものではなく、 IgG、 IgM、 IgA、 IgE、 IgDのいずれでもよいが、 I gG及び IgMが好ましい。 ポリクローナル抗体として、 SPA - 600 (StressGen)、 モノ クローナル抗体として、 SPA - 601 (StressGen)等を使用することができる。 また、 カルレティキュリン蛋白質と特異的に反応する抗体は、 以下に記載するような方 法によって作製することもできる。
(1) 免疫原の調製
本発明のモノクローナル抗体を作製するにあたり、 免疫原 （抗原） となるため の蛋白質を調製する。 免疫原蛋白質としては、 カルレティキュリン蛋白質又はそ の断片を用いる。 本発明において免疫原として使用可能なカルレティキユリン蛋 白質のァミノ酸配列及び該蛋白質をコードする cDNA配列は、 それぞれ GenBankに おいてァクセッション番号 AD000092として公開されている。 従って、 公開されて いるアミノ酸配列情報を利用して、 当技術分野で公知の手法、 例えば固相ぺプチ ド合成法などにより、 免疫原として使用するためのカルレティキュリン蛋白質断 片を合成することができる。 免疫原としてカルレティキュリン蛋白質断片を使用 する場合は、 KLH、 BSAなどのキャリアータンパク質に連結させて使用するのが好 ましい。
また、 公知の遺伝子組換え手法を利用して、 カルレティキュリン蛋白質をコー ドする cDNAの情報を用いてカルレティキュリン蛋白質を生産することも可能であ る。 以下、 組換え手法を用いたカルレティキュリン蛋白質の生産に関して説明す る。
カルレティキュリン生産用組換えベクターは、 上記公開されている cDNA配列を 適当なベクターに連結することにより得ることができ、 形質転換体は、 カルレテ ィキユリン生産用組換えベクターを、 カルレティキユリン蛋白質が発現し得るよ うに宿主中に導入することにより得ることができる。 ベクターには、 宿主微生物で自律的に増殖し得るファージ又はプラスミ ドが使 用される。 プラスミ ド DNAとしては、 大腸菌由来のプラスミ ド （例えば pET21a， pGEX4T, pUC118, pUC119， pUC18, pUC19等） 、 枯草菌由来のプラスミ ド （例えば pUBHO, pTP5等）、 酵母由来のプラスミ ド （例えば YEpl3， YEp24, YCp50等）など が挙げられ、 ファージ DNAとしてはえファージ （ L gtll、 λ ΖΑΡ等） が挙げられる。 さらに、 ワクシニアウィルスなどの動物ウィルス、 バキュロウィルスなどの昆虫 ウィルスベクターを用いることもできる。
ベクターにカルレティキュリン cDNAを揷入するには、 まず、 精製された DNAを 適当な制限酵素で切断し、 適当なベクター DNAの制限酵素部位又はマルチクロー ニングサイトに挿入してベクターに連結する方法などが採用される。
その他、 哺乳動物細胞において用いられるカルレティキュリン生産用組換えべ クタ一には、 プロモーター、 カルレティキュリン cDNAのほ力、 所望によりェンハ ンサ一などのシスエレメント、 スプライシングシグナル、 ポリ A付加シグナル、 選択マーカー、 リボソーム結合配列 （SD配列） などが連結されていてもよい。
DNA断片とベクター断片とを連結させるには、 公知の DNAリガーゼを用いる。 そ して、 DNA断片とベクター断片とをアニーリングさせた後連結させ、 カルレティ キュリン生産用組換えベクターを作製する。
形質転換に使用する宿主としては、 カルレティキュリン蛋白質を発現できるも のであれば特に限定されるものではない。 例えば、 細菌 （大腸菌、 枯草菌等） 、 酵母、 動物細胞 （COS細胞、 CH0細胞等） 、 昆虫細胞が挙げられる。
一例として、 細菌を宿主とする場合は、 カルレティキュリン生産用組換えべク ターが該細菌中で自律複製可能であると同時に、 プロモーター、 リボゾーム結合 配列、 カルレティキュリン DNA、 転写終結配列により構成されていることが好ま しい。 また、 プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。 大腸菌とし ては、 例えばエツシエリヒア .コリ（Escherichia coli) BRLなどが挙げられ、 枯 草菌としては、 例えばバチルス .ズブチリス（Bacillus subtilis)などが挙げら れる。 プロモーターは、 大腸菌等の宿主中で発現できるものであればいずれを用 いてもよい。 細菌への組換えベクターの導入方法は、 細菌に DNAを導入する方法 であれば特に限定されるものではない。 例えばカルシウムイオンを用いる方法、 エレク トロポレーシヨン法等が挙げられる。
酵母、 動物細胞、 昆虫細胞などを宿主とする場合には、 同様に、 当技術分野で 公知の手法に従って、 カルレティキュリン蛋白質を生産することができる。
本発明において免疫原として使用するカルレティキュリン蛋白質は、 上記作製 した形質転換体を培養し、 その培養物から採取することにより得ることができる c 「培養物」 とは、 培養上清、 培養細胞、 培養菌体、 又は細胞若しくは菌体の破碎 物のいずれをも意味するものである。 上記形質転換体を培地で培養する方法は、 宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。
大腸菌や酵母菌等の微生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地と しては、 微生物が資化し得る炭素源、 窒素源、 無機塩類等を含有し、 形質転換体 の培養を効率的に行うことができる培地であれば、 天然培地、 合成培地のいずれ を用いてもよい。
培養は、 通常、 振盪培養又は通気攪拌培養などの好気的条件下、 37°Cで 6〜24 時間行う。 培養期間中、 pHは中性付近に保持する。 PHの調整は、 無機又は有機酸、 アルカリ溶液等を用いて行う。 培養中は必要に応じてアンピシリンゃテトラサイ クリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
培養後、 カルレティキュリン蛋白質が菌体内又は細胞内に生産される場合には、 菌体又は細胞を破碎することにより蛋白質を抽出する。 また、 カルレティキユリ ン蛋白質が菌体外又は細胞外に生産される場合には、 培養液をそのまま使用する 力 遠心分離等により菌体又は細胞を除去する。 その後、 蛋白質の単離精製に用 いられる一般的な生化学的方法、 例えば硫酸アンモニゥム沈殿、 ゲルクロマトグ ラフィー、 イオン交換クロマトグラフィー、 ァフィ二ティークロマトグラフィー 等を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、 前記培養物中からカルレテ ィキユリン蛋白質を単離精製することができる。
カルレティキュリン蛋白質が得られたか否かは、 SDS-ポリアクリルアミ ドゲル 電気泳動等により確認することができる。
次に、 得られた蛋白質を緩衝液に溶解して免疫原を調製する。 なお、 必要であ れば、 免疫を効果的に行うためにアジュバントを添カ卩してもよい。 アジュバント としては、 市販の完全フロイントアジュバント、 不完全フロイントアジュバント 等が挙げられ、 これらの何れのものを混合してもよい。 (2) モノクローナル抗体の作製
①免疫及び抗体産生細胞の採取
上記のようにして得られた免疫原を、 哺乳動物、 例えばラット、 マウス （例え ば近交系マウスの BALBん） 、 ゥサギなどに投与する。 免疫原の 1回の投与量は、 免疫動物の種類、 投与経路などにより適宜決定されるものであるが、 動物 1匹当 たり約 50〜200 μ εである。 免疫は、 主として静脈内、 皮下、 腹腔内に免疫原を注 入することにより行われる。 また、 免疫の間隔は特に限定されず、 初回免疫後、 数日から数週間間隔で、 好ましくは 1〜4週間間隔で、 2〜6回、 好ましくは 3〜4回 追加免疫を行う。 初回免疫の後、 免疫動物の血清中の抗体価の測定を ELISA (Enz yme-Linked Immuno Sorbent Assay) 法等により繰り返し行い、 抗体価がプラト 一に達したときは、 免疫原を静脈内又は腹腔内に注射し、 最終免疫とする。 そし て、 最終免疫の日から 2〜5日後、 好ましくは 3日後に、 抗体産生細胞を採取する。 抗体産生細胞としては、 脾臓細胞、 リンパ節細胞、 末梢血細胞等が挙げられるが、 脾臓細胞又は局所リンパ節細胞が好ましい。
②細胞融合
ハイプリ ドーマを得るため、 上述のように免疫動物から得た抗体産生細胞とミ ェ口一マ細胞との細胞融合を行う。
抗体産生細胞と融合させるミエローマ細胞としては、 マウスなどの動物の一般 に入手可能な株化細胞を使用することができる。 使用する細胞株としては、 薬剤 選択性を有し、 未融合の状態では HAT選択培地 （ヒポキサンチン、 アミノプテリ ン、 チミンを含む） で生存できず、 抗体産生細胞と融合した状態でのみ生存でき る性質を有するものが好ましい。 また株化細胞は、 免疫動物と同種系の動物に由 来するものが好ましい。 ミエローマ細胞の具体例としては、 BALBんマウス由来の ヒポキサンチン ' グァニン 'ホスホリボシル ' トランスフェラーゼ （HGPRT) 欠 損細胞株である、 P3X63 - Ag. 8株 （ATCC TIB9) 、 P3X63-Ag. 8. U1株 （癌研究リサ一 チソースバンク （JCRB) 9085) 、 P3/NSI/1- Ag4-1株 （JCRB 0009) 、 P3x63Ag8. 65 3株 (JCRB 0028) 又は Sp2/0 - Agl4株 (JCRB 0029) などが挙げられる。
次に、 上記ミエローマ細胞と抗体産生細胞とを細胞融合させる。 細胞融合は、 血清を含まない DMEM、 RPMI-1640 培地などの動物細胞培養用培地中で、 抗体産 生細胞とミエ口一マ細胞とを約 1 ： 1〜20： 1の割合で混合し、 細胞融合促進剤 の存在下にて融合反応を行う。 細胞融合促進剤として、 平均分子量 1，500〜4，00 0ダルトンのポリエチレンダリコール等を約 10〜80%の濃度で使用することがで きる。 また場合によっては、 融合効率を高めるために、 ジメチルスルホキシドな どの補助剤を併用してもよい。 さらに、 電気刺激 （例えばエレク ト口ポレーショ ン） を利用した市販の細胞融合装置を用いて抗体産生細胞とミエローマ細胞とを 融合させることもできる。
③ハイプリ ドーマの選別及びクローニング
細胞融合処理後の細胞から目的とするハイプリ ドーマを選別する。 その方法と して、 細胞懸濁液を、 例えばゥシ胎児血清含有 RPMI- 1640培地などで適当に希釈 後、 マイクロタイタープレート上に 2 X 105個/ゥエル程度まき、 各ゥエルに選択 培地を加え、 以後適当に選択培地を交換して培養を行う。 培養温度は、 20〜40°C、 好ましくは約 37°Cである。 ミエローマ細胞が HGPRT欠損株又はチミジンキナー ゼ （TK) 欠損株のものである場合には、 ヒポキサンチン ·アミノプテリン 'チミ ジンを含む選択培地 （HAT培地） を用いることにより、 抗体産生能を有する細胞 とミエローマ細胞のハイブリ ドーマのみを選択的に培養し、 増殖させることがで きる。 その結果、 選択培地で培養開始後、 約 14日前後から生育してくる細胞をハ ィプリ ドーマとして得ることができる。
次に、 増殖してきたハイプリ ドーマの培養上清中に、 目的とする抗体が存在す るか否かをスクリーニングする。 ハイプリ ドーマのスクリーニングは、 通常の方 法に従えばよく、 特に限定されない。 例えば、 ハイプリ ドーマとして生育したゥ エルに含まれる培養上清の一部を採取し、 酵素免疫測定法 （EIA； Enzyme Immuno Assay, 及ぴ ELISA) 、 放射免疫測定法 （RIA； Radio Immuno Assay) 等によって 行うことができる。
融合細胞のクローユングは、 限界希釈法等により行い、 最終的にモノクローナ ル抗体産生細胞であるハイプリ ドーマを樹立する。 本発明のハイブリ ドーマは、 後述するように、 RPMI1640、 DMEM等の基本培地中での培養において安定であり、 尿路上皮癌に由来するカルレティキュリン蛋白質と特異的に反応するモノクロ一 ナル抗体を産生、 分泌するものである。
④モノクローナル抗体の採取 樹立したハイプリ ドーマからモノクローナル抗体を採取する方法として、 通常 の細胞培養法又は腹水形成法等を採用することができる。
細胞培養法においては、 ハイプリ ドーマを 10%ゥシ胎児血清含有 RPMI- 1640培 地、 MEM培地又は無血清培地等の動物細胞培養培地中で、 通常の培養条件 （例え ば 37°C， 5% C02濃度） で 2〜10日間培養し、 その培養上清から抗体を取得する。 腹水形成法の場合は、 ミエローマ細胞由来の哺乳動物と同種系動物の腹腔内に ハイブリ ドーマを約 1 X 107個投与し、 ハイブリ ドーマを大量に増殖させる。 そ して、 1〜2週間後に腹水又は血清を採取する。
上記抗体の採取方法において、 抗体の精製が必要とされる場合は、 硫安塩析法、 イオン交換クロマトグラフィー、 ァフィ二ティークロマトグラフィー、 ゲルクロ マトグラフィーなどの公知の方法を適宜に選択して、 又はこれらを組み合わせる ことにより、 精製された本発明のモノク口ーナル抗体を得ることができる。
(3) ポリクローナル抗体の作製
ポリクローナル抗体を作製する場合は、 前記と同様に動物を免疫し、 最終の免 疫日から 6〜60日後に、 酵素免疫測定法 （EIA及び ELISA) 、 放射免疫測定法 （RI A) 等で抗体価を測定し、 最大の抗体価を示した日に採血し、 抗血清を得る。 そ の後は、 抗血清中のポリクローナル抗体の反応性を ELISA法などで測定する。
尿路上皮癌の検出方法
本発明の尿路上皮癌の検出方法は、 上記のような抗体を用いて、 試科中の尿路 上皮癌細胞に由来するカルレティキュリン蛋白質を免疫学的に測定することを特 徴とする。 本明細書において、 検出とは、 試料中におけるカルレティキユリン蛋 白質の有無を調べること、 及びその量を測定することの双方を含む。
本明細書において尿路上皮癌とは、 腎杯、 腎盂、 尿管、 膀胱、 尿道にある移行 上皮部に発生する癌を意味する。 尿路上皮癌の例としては、 例えば、 膀胱癌、 腎 盂癌、 尿管癌、 尿道癌が挙げられ、 本発明は、 特に、 膀胱癌の検出において好ま しく使用される。
本発明の検出方法は、 抗体を用いる測定法、 すなわち免疫学的測定法であれば いずれの方法においても、 その測定法で使用される抗体として本発明の上記抗体 を用いることができ、 例えば、 酵素免疫測定法 （ELISA、 EIA) 、 蛍光免疫測定法、 放射免疫測定法 （RIA) 、 発光免疫測定法、 免疫比濁法、 免疫比ろう法、 ラテ ックス凝集反応、 ラテックス比濁法、 赤血球凝集反応、 粒子凝集反応又はウェス タンプロット法等により本発明の検出方法は実施される。
本発明の検出方法において被検対象となる試料としては、 尿路上皮癌に由来す るカルレティキュリン蛋白質が含まれる可能性のある生体試料であれば特に限定 されるものではない。 例えば、 血液、 血清、 血漿、 リンパ球培養上清、 尿、 髄液、 唾液、 汗、 腹水などが挙げられ、 細胞又は臓器の抽出液等も使用することができ る。 特に、 尿、 血清のような試料において得られたカルレティキュリン蛋白質の 測定値は、 尿路上皮癌の指標として有用である。 このように、 本発明の尿路上皮 癌の検出方法は、 癌組織だけでなく尿において検出可能であることから、 簡便な 検出方法として非常に有用である。
本発明の検出方法を、 酵素免疫測定法、 蛍光免疫測定法、 放射免疫測定法又は 発光免疫測定法等の標識を用いた免疫測定法により実施する場合には、 本発明の 抗体を固相化するか、 又は試料中の成分を固相化して、 それらの免疫学的反応を 行うことが好ましい。
固相担体としては、 ポリスチレン、 ポリカーボネート、 ポリビニルトルエン、 ポリプロピレン、 ポリエチレン、 ポリ塩化ビュル、 ナイロン、 ポリメタタリ レー ト、 ラテックス、 ゼラチン、 ァガロース、 セノレロース、 セファロース、 ガラス、 金属、 セラミックス又は磁性体等の材質よりなるビーズ、 マイクロプレート、 試 験管、 スティック又は試験片等の形状の不溶性担体を用いることができる。 固相 化は、 固相担体と本発明の抗体又は試料成分とを物理的吸着法、 化学的結合法又 はこれらの併用等の公知の方法に従って結合させることにより行うことができる。 本発明においては、 本発明の抗体と、 試料中の尿路上皮癌細胞に由来するカル レティキュリン蛋白質との反応を容易に検出するために、 本発明の抗体を標識す ることにより該反応を直接検出するか、 又は標識二次抗体を用いることにより間 接的に検出する。 本発明の検出方法においては、 感度の点で、 後者の間接的検出 (例えばサンドィツチ法など） を利用することが好ましい。
標識物質としては、 酵素免疫測定法の場合には、 ペルォキシダーゼ （POD) 、 ア^/カリホスファターゼ、 _ガラク トシダーゼ、 ゥレアーゼ、 カタラーゼ、 グ ルコースォキシダーゼ、 乳酸脱水素酵素、 アミラーゼ又はピオチン一アビジン複 合体等を、 蛍光免疫測定法の場合には、 フルォレセインイソチオシァネート、 テ トラメチルローダミンィソチオシァネート、 置換ローダミンィソチオシァネート、 ジクロロトリアジンイソチオシァネート、 Alexa480又は AlexaFluor488等を、 そ して放射免疫測定法の場合には、 トリチウム、 ヨウ素125又はヨウ素131等を用いる ことができる。 また、 発光免疫測定法は、 NADH— F丽H2—ルシフェラーゼ系、 ノレ ミノール一過酸化水素一 POD系、 ァクリジニゥムエステル系又はジォキセタン化 合物系等を用いることができる。
標識物質と抗体との結合法は、 酵素免疫測定法の場合にはダルタルアルデヒ ド 法、 マレイミ ド法、 ピリジルジスルフイ ド法又は過ヨウ素酸法等の公知の方法を、 放射免疫測定法の場合にはクロラミン T法、 ポルトンハンター法等の公知の方法 を用いることができる。
測定の操作法は、 公知の方法 （日本臨床病理学会編 「臨床病理臨時増刊特集第
5 3号 臨床検査のためのィムノアツセィー技術と応用一」 ， 臨床病理刊行会， 1 9 8 3年， 石川榮治ら編 「酵素免疫測定法」 ， 第 3版， 医学書院， 1 9 8 7年, 北川常廣ら編 「蛋白質核酸酵素別冊 N o . 3 1 酵素免疫測定法」 ， 共立出版， 1 9 8 7年， 入江實編 「ラジオィムノアツセィ」 ， 講談社サイェンティフイク， 1 9 7 4年， 入江實編 「続ラジオィムノアツセィ」 ， 講談社サイェンティフイク， 1 9 7 9年） により行うことができる。
例えば、 本発明の抗体を直接標識する場合には、 試料中の成分を固相化し、 標 識した本発明の抗体と接触させて、 カルレティキュリ ン蛋白質一本発明の抗体の 複合体を形成させる。 そして未結合の標識抗体を洗浄分離して、 結合標識抗体量 又は未結合標識抗体量より試料中のカルレティキュリン蛋白質量を測定すること ができる。
また例えば、 標識二次抗体を用いる場合には、 本発明の抗体と試料とを反応さ せ （一次反応） 、 さらに標識二次抗体を反応させる （二次反応） 。 一次反応と二 次反応は逆の順序で行ってもよいし、 同時に行ってもよいし、 又は時間をずらし て行ってもよい。 一次反応及び二次反応により、 固相化したカルレティキュリン 蛋白質一本発明の抗体一標識二次抗体の複合体、 又は固相化した本発明の抗体一 カルレティキュリン蛋白質一標識二次抗体の複合体が形成する。 そして未結合の 標識二次抗体を洗浄分離して、 結合標識二次抗体量又は未結合標識二次抗体量よ り試料中のカルレティキュリン蛋白質量を測定することができる。
具体的には、 酵素免疫測定法の場合は標識酵素にその至適条件下で基質を反応 させ、 その反応生成物の量を光学的方法等により測定する。 蛍光免疫測定法の場 合には蛍光物質標識による蛍光強度を、 放射免疫測定法の場合には放射性物質標 識による放射能量を測定する。 発光免疫測定法の場合は発光反応系による発光量 を測定する。
本発明の検出方法は、 免疫比濁法、 ラテックス凝集反応、 ラテックス比濁法、 赤血球凝集反応又は粒子凝集反応等の免疫複合体凝集物の生成を、 その透過光や 散乱光を光学的方法により測るか、 目視的に測る測定法により実施する場合には、 溶媒としてリン酸緩衝液、 グリシン緩衝液、 トリス緩衝液又はグッド緩衝液等を 用いることができ、 更にポリエチレングリコール等の反応促進剤や非特異的反応 抑制剤を含ませてもよい。
以下に、 本発明の検出法の好ましい実施態様の一例を示す。 最初に、 本発明の 抗体を一次抗体として不溶性担体に固定する。 そして好ましくは、 抗原が吸着し ていない固相表面を、 抗原とは無関係の蛋白質 （仔ゥシ血清、 ゥシ血清アルブミ ン、 ゼラチンなど） によりブロッキングする。 続いて、 固定化された一次抗体と 被検試料とを接触させる。 次いで、 上記一次抗体と異なる部位で、 カルレティキ ュリン蛋白質と反応する標識二次抗体とを接触させ、 該標識からの信号を検出す る。
ここで用いる 「一次抗体と異なる部位で、 カルレティキュリン蛋白質と反応す る二次抗体」 は、 一次抗体とカルレティキュリン蛋白質との結合部位以外の部位 を認識する抗体であれば特に制限はなく、 免疫原の種類を問わず、 ポリクローナ ル抗体、 抗血清、 モノクローナル抗体のいずれでもよく、 またこれらの抗体のフ ラグメント （Fab、 F (ab' ) 2、 Fab'等） を用いることもできる。 更に、 二次抗体と して複数種のモノクローナル抗体を用いてもよい。
またこれとは逆に、 本発明の抗体に標識を付して二次抗体とし、 本発明の抗体 と異なる部位で、 カルレティキユリン蛋白質と反応する抗体を一次抗体として不 溶性担体に固定し、 この固定化された一次抗体と被検試料とを接触させ、 次いで、 二次抗体として標識を付した本発明の抗体とを接触させ、 前記標識からの信号を 検出してもよい。
尿路上皮癌の診断薬
また本発明の抗体は、 上述したように、 尿路上皮癌細胞に由来するカルレティ キュリン蛋白質と特異的に反応するため、 癌の診断薬として用いることができる c 本発明の診断薬は、 本発明の抗体を含むものであり、 従って、 本発明の診断薬 を用いて、 尿路上皮癌への罹患が疑われる個体から採取した試料中に含まれる尿 路上皮癌細胞に由来するカルレティキュリン蛋白質を検出することによって、 該 個体の尿路上皮癌の罹患を診断することができる。
また本発明の診断薬は、 免疫学的測定を行うための手段であればいずれの手段 においても利用することができるが、 当技術分野で公知の免疫クロマト用テスト ストリップなどの簡便な.手段と組み合わせて用いることによって、 さらに簡便か つ迅速に癌を診断することができる。 免疫クロマト用テス トストリップとは、 例 えば、 試料を吸収しやすい材料からなる試料受容部、 本発明の診断薬を含有する 試薬部、 試料と診断薬との反応物が移動する展開部、 展開してきた反応物を呈色 する標識部、 呈色された反応物が展開してくる提示部などから構成されるもので あり、 妊娠診断薬と同様の形態とすることができる。 まず、 試料受容部に試料を 与えると、 試料受容部は試料を吸収して試料を試薬部にまで到達させる。 続いて、 試薬部において、 試料中の尿路上皮癌細胞由来のカルレティキュリン蛋白質と本 発明の抗体との反応が起こり、 反応した複合体が展開部を移動して標識部に到達 する。 標識部においては、 上記反応複合体と標識二次抗体との反応が起こって、 その標識二次抗体との反応物が提示部にまで展開すると呈色が認められることに なる。
上記免疫クロマト用テス トストリップは、 使用者に対し苦痛や試薬使用による 危険性を一切与えないものであるため、 家庭におけるモニターに使用することが でき、 その結果を各医療機関レベルで精査 ·治療 （外科的切除等） し、 転移，再 発予防に結びつけることが可能となる。 また現在、 このテス トストリップは、 例 えば特開平 10 - 54830号公報に記載されるような製造方法により安価に大量生産で きるものである。 また、 本発明の診断薬と既知の尿路上皮癌の腫瘍マーカーに対する診断薬とを 組み合わせて使用することにより、 さらに信頼性の高い診断が可能になる。 尿路上皮癌診断用キット
本発明はまた、 カルレティキュリン蛋白質又はその断片と特異的に反応する抗 体を含む尿路上皮癌診断用キットに関する。 本発明のキットにおいて抗体は、 上 記のような固相担体に結合されていてもよい。 さらに本発明のキットは、 標識二 次抗体、 担体、 洗浄バッファー、 試料希釈液、 酵素基質、 反応停止液、 精製され た標準物質としてのカルレティキュリン蛋白質等を含みうる。 図面の簡単な説明
図 1は、 様々な分化度及び様々な腫瘍径の尿路上皮癌を有する患者の尿につい て、 一次元電気泳動後、 PVDF膜に転写し SPA-600抗体を用いて行ったィムノブ口 ットの結果を示したものである。 G1〜G3は尿路上皮癌の中で組織学的に移行上皮 癌に分類されるタイプの癌種の分化度 （すなわち悪性度） を表し、 SC.Cは扁平上 皮癌を意味し、 class I〜Vは尿細胞診による結果を表し、 数値は腫瘍径を表す。
本明細書は、 本願の優先権の基礎である特願平 2 0 0 2 - 3 2 0 3 5 5号の明細書及ぴ Z又は図面に記載された内容を包含する。 発明を実施するための最良の形態
以下、 実施例により、 本発明を更に具体的に説明するが、 本発明の範囲はこれ らによって限定されるものではない。
実施例 1 プロテオーム解析による癌性変化蛋白質のスクリーニング
( 1 ) 試料調製
試科として、 膀胱移行上皮癌 3例 （手術：経尿道的膀胱腫瘍切除術 2例、 膀胱 全摘除術 1例；異型度： Grade2-1例、 Grade3- 2例） の手術標本を使用した。 対照 として、 前立腺肥大症に対する恥骨後式前立腺摘除術で得られた正常膀胱粘膜
(2例） 、 及ぴ腎細胞癌に対する腎摘除術で得られた正常尿管 （1例） を用いた。
8M尿素、 2% CHAPS, 1% ジチオスレィ トール （DTT)、 0. 5% Pharmalyte 3-10 (Amersham Bioscience)、 10% グリセロール、 1% プロテアーゼインヒビターカク テル （Nacalai tesque Inc. ) からなる組織溶解液を加えホモジナイズし、 15, 00 0 rpmで 10分間遠心した上清を組織の可溶化液とした。 次の等電点電気泳動を高 電圧下で行うために MicroSpin G-25 Column (Amersham Bioscience)で脱塩処理 を施した。 ゥシ血清アルブミン（Pierce)を標準物質として Bradford法による蛋白 質定量を行った。
( 2 ) 一次元目等電点電気泳動
等電点電気泳動は IPGphor (Amersham Bioscience)で行った。 固定ィヒ pH勾酉己ス トリップゲルは、 種々の pHレンジを使用した （18cm、 pH 4〜7、 6〜9、 4〜5、 4. 5 〜5. 5、 5〜6、 5. 5〜6· 7) 。 ゲノレイメージ角军析用には pHレンジに応じて、 それぞ れゲル 1本当たり蛋白質量 80 μ g (pH 4〜7) と 120 μ § (pH 4〜5、 4· 5〜5. 5、 5〜6、 5. 5〜6. 7、 6〜9) をロードし、 電圧 8， 000Vでそれぞれ 32， 000Vh、 60， OOOVhに達す るまで泳動した。 蛋白質同定用の場合には、 pHレンジにかかわらず蛋白質量 lmg ノゲルとした。
( 3 ) 固定化 pH勾配ストリップゲルの SDS処理
等電点電気泳動後のストリップゲルを、 50mM Tris-HCl pH 6. 8、 8M 尿素、 30% グリセ口ール、 2% SDS、 2% DTTからなるパッファ一で 30分間平衡化した。
( 4 ) 二次元目 SDSポリアクリルァミ ドゲル電気泳動
二次元目は 22 X 20 X 0. lcmの 12. 5% 均一ポリアクリルアミ ドゲルを用い、 20mA Zゲルで電気泳動した。 泳動バッファ一は 25mM Tris-base、 192mM グリシン、 0. 1% SDSを使用した。
( 5 ) 銀染色 （非グルタルアルデヒ ド固定）
30% エタノール、 10% 酢酸でゲルを固定し、 20% エタノール及ぴ超純水で洗浄 したのち、 0. 02% チォ硫酸ナトリウムで増感した。 0. 2% 硝酸銀溶液で銀反応さ せ、 超純水でリンスしたのち、 0. 025% ホルマリン、 0. 001% チォ硫酸ナトリウム、 3% 炭酸カリゥムで現像した。 発色の停止には 2. 5% 酢酸、 0. 4M Tris-base を使 用した。
( 6 ) ゲルイメージ取り込みとスポット検出
反射光フラットベッドスキャナーで、 ゲルイメージを取り込んだ。 スポットの 検出は、 二次元電気泳動ゲル解析ソフトウェア PDQUEST Ver5. 1 (pdi社） の自動 検出機能 （silver stain mode) を用いて行い、 さらにこれで認識漏れとなった スポッ トを目視で追加した。
( 7 ) 正常組織と癌組織のゲルイメージの比較
癌 3例と対照 3例のスポット比較は目視で行った。 両群を比較した際に、 各群の 全例に共通して出現 ·増強又は消失 ·減弱が見られるものだけを、 発現に変化の あるスポットとして選別した。
( 8 ) ゲル内消化、 脱塩濃縮法
Gharahdaghiらの方法 (Electrophoresis, 1999) を改変して行った。 切り出し たゲルを、 15 mM フエリシアン化力リ ゥム、 50mM チォ硫酸ナトリゥムで脱銀し た。 lOmM DTT及び 50mM ョードアセトアミ ドでシスティン残基を還元アルキル化 したのち、 トリプシン （Promega, sequencing grade) で 37°Cにてー晚酵素処理 した。 分解されたペプチド断片溶液を回収し ZipTip C18カラム （Mil lipore) で 脱塩濃縮した。 次にマトリックス （α -シァノ -4-ヒ ドロキシケィヒ酸飽和溶液） と混合し、 質量分析計のサンプルプレートに滴下し乾燥させた。
( 9 ) MALDI/T0F- MSによる質量分析
質量分析計は、 MALDI/T0F- MSである Voyager RP (PerSeptive Biosystems) を リフレタ トロンモード及び遅延イオン引出しモードで使用した。 キヤリプレーシ ヨン用の外部標準物質に des- Arg- Bradykinin (904. 468 (Charge+ l) ) ACTH (1 8 - 39 cl ips) (2465. 2)を、 内部標準として 2つのトリプシン自己消化物 （842. 510， 2211. 1) を用いた。
(10) 質量分析データベースによる蛋白質同定
蛋白質同定は、 ペプチドマスフィンガープリント法 （PMF法） で行った。 ぺプ チドマスデータベースは、 MS_Fitと PeptideSearchの 2種類を併用した。 ペプチド マスは monoisotopic、 許容誤差は ± lOOppm以内とした。
(結果）
狭い pHレンジの二次元電気泳動ゲルにおいて癌組織で著しい発現が見られる 15 個のスポット群を識別し、 このうち PMF法によりカルレティキュリン蛋白質を含 む 9スポッ トの蛋白質名を同定した。
実施例 2 腫瘍マーカーとしての有用性の検討
( 1 ) 二次元ィムノプロッ トによるカルレティキュリン蛋白質スポッ トの確認 リコンビナントヒ トカルレティキュリン蛋白質に対するモノクローナル抗体 SPA- 601 (StressGen) 及びヒ トカルレティキュリン蛋白質- C末端の合成ペプチドを免 疫原としたポリクローナル抗体 SPA- 600 (StressGen) を用いて、 二次元電気泳動 後のゲルから転写した Immobilon PVDF膜 （Mi llipore) に対しィムノブロッ トを 行った。 ブロッキングは Super Block Blocking Solution in TBS (Pierce)で 4。C にてー晚行った。 抗体の希釈は SPA-601は 10, 000倍、 SPA- 600は 20, 000倍、 HRP 標識抗マウス IgG抗体 （MBL) は 10, 000倍、 HRP標識抗ゥサギ IgG抗体 （Vector) は 50， 000倍とした。 洗浄及び抗体の希釈には 10mM Tris-HCl pH 7. 4、 lOOmM NaC 1、 0. 1% Tween20を使用した。 パンドの検出には ECL (Amersham Bioscience) に よる化学発光を使用し、 X線フィルムに感光させた。
その結果、 尿路上皮癌組織で抗体 SPA - 601による二次元 -ィムノブロット （pH 4 〜7) では、 カルレティキュリン蛋白質と一致する約 pi 4. 3、 55 kDaのスポット 以外にも約 pi 4. 5、 40 kDaの弱いスポットが検出された。 一方、 正常尿路上皮組 織では逆にカルレティキュリン蛋白質スポットは非常に弱く、 40 kDaのスポット が強く現れた。
また、 泳動後のゲル力 ら、 Multiphor II NovaBlot Kit (Amersham Bioscienc e) でアミノカプロン酸を含むバッファーを用い、 シーケプロッ ト PVDF膜 （BioR ad) に蛋白質を転写した。 PVDF膜の染色は CBBR250で行った。 目的のスポッ トを 切り出し、 エドマン分解による N末端配列を決定した。 N末端アミノ酸配列解析で は、 これら両スポットとも EPAVYFKEQFの配列が得られた。 これは、 ヒ トカルレテ ィキユリン蛋白質の一次構造の 1〜10番と一致した。
さらにカルレティキュリン蛋白質の C末端を認識する抗体 SPA-600による二次 元 -ィムノブ口ットではカルレティキュリン蛋白質と一致するスポッ トしか認め られず、 40 kDaのカルレティキュリ ン蛋白質は C末端側のいずれかの部位で切断 された分子種であると考えられた。 ここまでの結果から、 正常尿路上皮組織と癌 組織の間で発現量に差が強く認められるのは、 pi 4. 3、 55 kDaの全長カルレティ キュリン蛋白質であると考えられたため、 以後のノ検討を C末端認識の SPA- 600抗体 を用いて行うこととした。
( 2 ) SPA- 600抗体による免疫沈降 多数検体での評価を行う前に、 SPA- 600抗体で検出できるカルレティキュリン 蛋白質の他の分子種、 特に癌特異的な分子種が見られないかどうかを確認するた めに、 カルレティキユリン蛋白質の C末端を認識する SPA- 600抗体で免疫沈降実験 を行った。 尿路上皮癌組織を 50mM Tris-HCl pH 8. 0、 150mM NaCl、 1% Triton X- 100、 0. 5% デォキシコレート、 0. 1% SDS (RIPA バッファー） にプロテアーゼ阻 害剤を添加したもので可溶化した。 抗体結合用担体には Protein A Sepharose (P harmacia) を用いた。 対照実験として抗体の代わりに正常ゥサギ血清を使用した。 免疫沈降終了後の担体-抗体-沈降物複合体に SDS-サンプルバッファー （62. 5mM T ris-HCl pH 6. 8、 10% グリセロール、 2% SDS、 1% DTT) を加えて溶出し、 遠心後 の上清を 8%均一ゲルで SDS- PAGEを行い、 さらにゲルを銀染色した。 また、 SPA - 6 01抗体を用いてィムノブ口ットを行った。
SPA - 600抗体による沈降物のうち、 SPA- 601抗体によるィムノブロットで検出し 得たカルレティキュリン蛋白質バンドは 1つであり、 他の分子種の存在を疑わせ る所見はなかった。'
( 3 ) 正常尿路上皮組織及ぴ尿路上皮癌組織におけるカルレティキュリン蛋白質 のィムノプロット
尿路上皮癌 22検体と正常尿路上皮組織 10検体を上記と同様にバッファ一で可溶 ィ匕し、 蛋白質定量を行った。 SDS-サンプルバッファーによる希釈で、 各レーンの 蛋白質量が l i gとなるようにした。 8% 均一ゲルによる SDS - PAGEで蛋白質を分離 し、 SPA- 600抗体によるィムノブロットを施行した。 バンドの定量化のために、 H eLa細胞抽出物 （StressGen) l /z gを同時に泳動した。
X線フィルム上のカルレティキュリン蛋白質バンドを透過光型フラットべッド スキャナーで撮像し、 画像解析ソフトウェア Scion Image (Scion Co. )を用いて 定量化した。 その際、 1 gの Hela細胞抽出物から得られるバンドの強度を 1. 0 un it とした。
SPA - 600抗体によるィムノプロットで組織可溶化液 l gより得られるカルレテ ィキュリン蛋白質のバンド強度はそれぞれ、 正常尿路上皮組織で 0. 40 ±0. 32 uni t (mean土 SD) 、 癌組織で 1. 02 ± 0. 39 unitであった （p=0. 00014) 。 膀胱全摘標 本から採取した同一症例由来の正常上皮組織と癌組織との比較でも、 癌の方でよ り強いカルレティキュリン蛋白質バンドを認めた。 実施例 3 尿中カルレティキュリン蛋白質の検出
尿中に存在するカルレティキュリン蛋白質を検出するために、 上記と同様に一 次元電気泳動後、 PVDF膜に転写し SPA - 600抗体を用いてィムノブロットを実施し た。
尿中カルレティキュリン蛋白質の発現量比較には、 尿路上皮癌患者尿 27検体、 非尿路上皮癌患者尿 123検体を使用した。 これらの検体は、 採取後、 測定に供す るまで凍結保存した。 ここで非尿路上皮癌患者尿としては、 尿路上皮癌には罹患 していないが、 前立腺肥大症、 前立腺癌、 尿路感染症、 腎細胞癌、 尿路結石、 特 発性血尿等に罹患している患者の尿を使用した。
その結果、 検討した非尿路上皮癌患者尿 123検体では、 22例 （17. 9%) でのみ 弱いカルレティキュリン蛋白質のバンドがィムノブ口ットで検出された。 それに 対して、 27例の尿路上皮癌患者尿では 19例 （70. 4%) でカルレティキュリン蛋白 質バンドが検出された。 結果を以下の表 1に示す。 表
カルレティキュリン
尿路上皮癌 陽性 陰性
Figure imgf000021_0001
あり 19 8 27
なし 22 101 1 23
+ 41 109 150
19/27 70.4%
特異度 101 /123 82.1 %
陽性反応的中率 19/41 46.3%
陰性反応的中率 101 /109 92.7% さらに、 尿細胞診で陽性の尿路上皮癌患者及び陰性の尿路上皮癌患者のそれぞ れについて、 尿中カルレティキュリン蛋白質の検出を行い、 両検出で得られた結 果を比較した。 結果を以下の表 2に示す。 表 2尿路上皮癌症例での尿細胞診結果との関係
カルレティキュリン 細胞診 陽性 陰性 陽性率
陽性（IV' V ) 11 4 73.3%
陰性（I〜！ I) 8 4 66.7%
19 8 この表 2の結果は、 尿細胞診で陰性とされる尿路上皮癌症例についても、 本発 明の方法によって癌を検出できることを意味する。
さらに、 様々な分化度及び様々な腫瘍径の尿路上皮癌を有する患者の尿につい て、 同様に、 一次元電気泳動後、 PVDF膜に転写し SPA- 600抗体を用いてィムノブ 口ットを実施した。 ィムノブロットの結果を図 1に示す。
図 1の結果から、 本発明の方法では、 癌の大きさが小さい場合や悪性度が低い 場合であってもカルレティキュリン蛋白質が検出され、 それによつて尿路上皮癌 を検出できることがわかる。
以上の結果から、 カルレティキュリン蛋白質が、 尿路上皮癌患者の尿中におい て、 高感度かつ特異的に検出されることが明らかである。 従って、 本発明の方法 により、 患者の尿中のカルレティキュリン蛋白質を測定することにより、 尿路上 皮癌を効率的に検出することができることが明らかとなった。
本明細書中で引用した全ての刊行物、 特言午及び特許出願をそのまま参考として本明細書中 にとり A Lるものとする。 産業上の利用の可能性
本発明により、 簡易かつ安価な方法で、 尿路上皮癌を効果的に検出することが できるため、 尿路上皮癌の早期発見、 診断及ぴ治療が可能になる。 また、 本発明 の方法により、 患者の尿を用いて尿路上皮癌を非侵襲的に検出できるため、 尿路 上皮癌を簡便かつ迅速に検出することが可能になる。

Claims

請 求 の 範 囲
1 . 試料中のカルレティキュリン蛋白質を測定することにより、 尿路上皮癌を 検出する方法。
2 . カルレティキュリン蛋白質又はその断片と特異的に反応する抗体を用いて、 試料中のカルレティキュリン蛋白質を免疫学的に測定し、 尿路上皮癌を検 出する方法。
3 . 試料が尿である、 請求の範囲第 1項に記載の方法。
4 . 試料が尿である、 請求の範囲第 2項に記載の方法。
5 . カルレティキュリン蛋白質又はその断片と特異的に反応する抗体を含む尿 路上皮癌診断薬。
6 . カルレティキュリン蛋白質又はその断片と特異的に反応する抗体を含む尿 路上皮癌診断用キット。
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