CN105462935B - 抗卵巢癌单克隆抗体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了抗卵巢癌单克隆抗体及其应用。一株分泌抗人卵巢癌单克隆抗体的杂交瘤细胞株NM003‑1，2011年8月31日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：C201174。杂交瘤细胞株NM003‑1分泌的抗人卵巢癌的单克隆抗体NJ003‑1。本发明单抗NJ003‑1特异性抗原在卵巢癌组织中的表达高于卵巢良性疾病组织；在低分化患者该抗原的阳性表达率高于高分化患者。且单克隆抗体NJ003‐1能够有效抑制卵巢癌细胞SK‐OV‐3在软琼脂中的克隆形成，单抗NJ003‐1在裸鼠体内能显著抑制人卵巢癌移植瘤的生长。可见该单抗有望成为治疗卵巢癌的药物或制备成检测卵巢癌的诊断试剂。

Description

抗卵巢癌单克隆抗体及其应用

技术领域

本发明属于医学诊断领域，涉及抗卵巢癌单克隆抗体及其应用。

背景技术

卵巢癌是妇女生殖器官最常见的恶性肿瘤之一，发病率仅次于宫颈癌和宫体癌列居第三位，而病死率却高居首位，且近年来其发病率呈上升趋势，已成为严重威胁妇女生命的恶性疾病。由于卵巢解剖位置深处盆腔,发病隐匿，早期临床症状和体征不典型，就诊时约70％的患者已经是晚期，且多已出现转移，致使多数患者失去根治性手术的机会，导致卵巢癌五年存活率较低，不足30％。

糖链抗原125(CA125)是从上皮性卵巢癌抗原检测出可被单克隆抗体OC125结合的一种糖蛋白。自1981年首次发现就备受关注，是至今发现最早研究最广泛透彻的卵巢癌肿瘤标志物，目前是临床上最常用的指标。CA125具有不错的灵敏性，Goonewardene等报道可高达80％。但是其特异性不太高，因为CA125与胸膜等组织有共同抗原相关，CA125在其他恶性肿瘤(如子宫内膜癌、宫颈癌，肺癌等)及一些良性疾病中(如肝炎、盆腔炎，胰腺炎等)会有所升高。此外CA125在卵巢良性疾病甚至在正常卵巢组织中也会升高，同时卵巢癌的临床病理类型不同，CA125在卵巢癌组织中的表达水平也有不同；在卵巢浆液性囊腺癌中CA125具有较高表达，在非浆液性卵巢癌例如卵巢粘液性囊腺癌中较低表达。因此其特异性不高给临床工作者带来不少困惑，对于卵巢癌的诊断还需要发现特异性更高的肿瘤标志物。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一株分泌抗人卵巢癌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

本发明的另一目的是提供抗人卵巢癌单克隆抗体。

本发明的又一目的是提供该单克隆抗体的应用。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

一株分泌抗人卵巢癌单克隆抗体的杂交瘤细胞株NM003-1，于2011年8月31日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：C201174。

由所述的保藏号为CCTCC NO：C201174的杂交瘤细胞株NM003-1分泌的抗人卵巢癌的 单克隆抗体NJ003-1。

所述的单克隆抗体NJ003-1在制备卵巢癌诊断试剂中的应用；优选在制备卵巢癌辅助诊断试剂中的应用。

所述的辅助诊断试剂优选免疫组织化学检测试剂。

单克隆抗体NJ003-1的特异性抗原作为检测靶标在制备卵巢癌诊断试剂中的应用。

单克隆抗体NJ003-1在制备治疗卵巢癌的药物中的应用。

单克隆抗体NJ003-1的特异性抗原作为靶点在制备治疗卵巢癌的药物中的应用。

有益效果：

本发明以人卵巢癌SK‐OV‐3为免疫原，用杂交瘤技术，筛选到一株能够稳定分泌抗人卵巢癌单克隆抗体的杂交瘤细胞株NM003-1(CCTCC NO：C201174)。该杂交瘤(CCTCC NO：C201174)所分泌的单抗NJ003-1产量多、效价高，对卵巢癌细胞系有特异性反应，与正常卵巢细胞、健康人PBMC及其他一些常见的肿瘤细胞系(肺癌、肝癌、乳腺癌及结肠癌)无反应或低反应性。

免疫组织化学结果显示，NJ003-1特异性抗原在卵巢癌组织中的表达高于卵巢良性疾病组织(85.4％vs.3.3％，p<0.001)。进一步分析发现：在低分化患者该抗原的阳性表达率高于中高分化患者(93.3％vs.67.5％，p<0.05)；且该抗原的阳性表达率随TNM分期的升高而升高，Ⅲ～Ⅳ期卵巢癌患者组织中的阳性率高于Ⅰ～Ⅱ期组(97.1％vs.81.2％，p<0.05)；有淋巴结转移的患者其阳性率高于无淋巴结转移者(96.7％vs.81.0％，p<0.05)，差异均有统计学意义。NJ003-1特异性抗原的表达与卵巢癌患者的年龄、肿瘤的大小，组织学类型无显著关系。可见，NJ003-1的特异性抗原有望成为诊断卵巢癌和预测患者预后的新的肿瘤标志物，其单克隆抗体NJ003-1在卵巢癌诊断制剂中应用。

此外，单克隆抗体NJ003-1能够有效抑制卵巢癌细胞SK‐OV‐3在软琼脂中的克隆形成，并且其抑制程度与抗体的作用浓度呈正相关。单抗NJ003-1在裸鼠体内能显著抑制人卵巢癌移植瘤的生长，并且其抑制程度与抗体的作用浓度呈正相关。表明单克隆抗体NJ003-1有望成为治疗卵巢癌的药物。

附图说明

图1单抗NJ003-1抑制SK-OV-3移植瘤的生长

图A肿瘤生长曲线，图B平均肿瘤重量，图C各组切除肿瘤。

生物材料保藏信息

杂交瘤细胞株NM003-1于2011年8月31日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉，武汉大学，保藏号为CCTCC NO：C201174。

具体实施方式

实施例1杂交瘤的制备

1.1动物免疫 取6～8周雌性BALB/c小鼠，每只用卵巢癌细胞1～2×10⁶SK-OV-3细胞/次腹腔注射免疫4次，每次间隔3周。每次免疫前均进行小鼠内眦采血，间接细胞ELISA法检测小鼠血清抗体效价，待免疫小鼠血清抗体滴度达到最大并不再升高时取鼠脾细胞进行融合，融合前3d加强免疫1次。

1.2间接细胞ELISA试验 于96孔板上接种2×10⁵/孔的SK-OV-3细胞(上海拜力生物科技有限公司)，至细胞生长融合达80％，95％乙醇固定，PBS洗3次，0.2％Triton-X-100通透20min，再用50g/L BSA 37℃封闭2h，依次加入不同稀释度的免疫小鼠血清100μL，37℃温育1h，再经PBS洗3次后，加入1：1000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG 100μL，37℃温育45min，经PBS洗涤后，加入TMB显色液，37℃温育10min后终止反应，用酶标仪测定450nm时吸光度(A)值，以未免疫小鼠血清(1:1000)作为阴性对照。

1.3细胞融合 取免疫小鼠脾脏研磨制成细胞悬液，与处于对数生长期的骨髓瘤细胞SP2/0进行融合(姚晓玲,柳晓燕,吴强,等.人肺癌相关单克隆抗体的制备及其抗原的纯化[J].中国免疫学杂志,2006,22(12):1140-1145.)，首次融合960孔，融合1周后出现细胞克隆，有800孔生长杂交瘤细胞，融合率约为83％。按照1.2中的方法进行间接细胞ELISA试验筛选阳性杂交瘤细胞(将1.2间接细胞ELISA试验中的免疫小鼠血清替换为杂交瘤细胞培养上清)，进行转种和4次有限稀释法亚克隆，获得稳定分泌抗SK-OV-3单抗且阳性最强的2株杂交瘤细胞株NM003-1及NM003-2。

实施例2单抗腹水的制备及纯化

取8～10周龄雌性BALB/c小鼠腹腔注射0.5mL石蜡油，10d后分别腹腔注射生长良好的杂交瘤细胞NM003-1及NM003-2约1×10⁶/只，1～2周后抽吸腹水，37℃1h后，4℃过夜，次日分别将腹水离心，经Protein G亲和层析柱纯化，得到纯化的单克隆抗体NJ003-1及NJ003-2。

实施例3单抗的鉴定

3.1单抗Ig亚类的鉴定：纯化单抗用PBS 1:10000稀释，按照测定试剂盒说明书操作。单抗NJ003-1及NJ003-2的亚类均为IgG，轻链为κ链。

3.2单抗效价的测定：分别将纯化的单抗NJ003-1及NJ003-2用PBS倍比稀释，分别取100μL加入包被有SK-OV-3细胞的96孔板中，用间接细胞ELISA法测定A₄₅₀值，能与包被细胞发生免疫反应的单抗最大稀释度即为其效价。单克隆抗体NJ003-1效价为8×10⁵，单克隆抗体NJ003-2效价为4×10⁵。将杂交瘤细胞株NM003-1于2011年8月31日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为武汉，武汉大学，保藏号为CCTCC NO：C201174。

3.3染色体鉴定：将对数生长的杂交瘤细胞NM003-1秋水仙碱处理8h,再收集细胞，经离心甩片在玻片上,用0.075mol/L KCl低渗处理,用甲醇冰醋酸固定液固定,经10％Giemsa染色10min,镜下检测染色体。杂交瘤细胞的染色体数目范围为100～106条，因为小鼠细胞的染色体数目为40条，而SP2/0细胞染色体数目平均为62～68条，证明杂交瘤细胞中的染色体来自免疫小鼠的脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞SP2/0，均属杂交瘤细胞染色体核型。

3.4单抗特异性的鉴定：用纯化的单抗NJ003-1与6种细胞系及健康人PBMC分别做间接细胞ELISA分析，观察有无阳性反应。结果显示，单抗NJ003-1仅对卵巢癌细胞抗原具有较强反应，对其他肿瘤细胞(SPCA-1、HepG2、Colo 205、ZR-75-30)抗原、人正常卵巢细胞抗原及健康人PBMC均无反应。

实施例4

1.标本来源

实验标本的组织来源于南京市第一医院和江苏省中医院2013-2015年行卵巢切除手术的患者(130例卵巢癌，30例卵巢良性疾病)。所有患者经病理检查确诊且术前均未经放疗、化疗或其他治疗。查找相应的肿瘤组织石蜡标本，所有标本均经10％福尔马林固定和普通石蜡包埋，由南京市第一医院和江苏省中医院病理科存档并提供。30例卵巢良性疾病包含15例卵巢良性肿瘤，15例卵巢良性囊肿；在130例卵巢癌患者中，年龄从29岁到80岁，囊括91例卵巢浆液性囊腺癌、16例卵巢子宫内膜样癌、17例卵巢癌粘液性囊腺癌，6例卵巢透明细胞癌。按照2004年WHO卵巢癌分类标准对所收集的卵巢癌标本进行分化程度评估，40例中高分化癌，90例低分化癌。按照2014版AJCC癌症分期手册的标准进行TNM分期，早期(Ⅰ期～Ⅱ期)96例，晚期(Ⅲ期～Ⅳ期)34例；100例无淋巴结转移者，30例有淋巴结转移者,所有纳入研究的的卵巢癌病人的详细资料见表1。

表1 卵巢癌病人基本资料

2.免疫组织化学染色

免疫组织化学染色具体流程参考韩月,王芳,徐婷,吴蕾等.NJ001-1特异性抗原在肺腺癌中的表达及临床意义[J].中华检验医学杂志.2013,36(10):895-898。一抗为单克隆抗体NJ003-1，以1％的PBS缓冲液代替一抗作为阴性对照，确诊卵巢癌切片作为阳性对照。快捷型酶标羊抗鼠/兔IgG聚合物购自福州迈新生物技术开发公司；DAB显色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

结果判定：根据肿瘤细胞内棕黄色阳性反应百分率和染色程度进行综合判定分析。阳性百分率为在高倍视野下，每200个肿瘤细胞中阳性细胞所占百分比，随机做5次。阳性率计分标准：0分(阳性百分率0％)，1分(1～33％)，2分(34-66％)，3分(67～100％)。染色程度记分标准：无染色，浅黄色，棕黄色，棕褐色分别计为0，1，2，3分。两种方法得分的乘积为0，1，2，3，4，6，9。将得分结果分为-(0)，+(1，2)，++(3，4)，+++(6，9)四个等级，

其中++，+++判定为阳性表达。

3.统计学方法

采用χ²检验进行数据的比较，设定p<0.05为差异有统计学意义。所有数据应用SPSS18.0统计软件进行分析。

4.结果

4.1 NJ003-1特异性抗原在卵巢癌及卵巢良性疾病组织中的表达

本实验组织标本包括130例卵巢癌及30例卵巢良性疾病组织，所有免疫组化检测结果见表2-表3。

表2 卵巢癌患者石蜡组织切片NJ003‐1特异性抗原免疫组化结果一览表

表3 卵巢良性疾病患者石蜡组织切片中NJ003‐1特异性抗原免疫组化结果一览表

NJ003-1特异性抗原的表达以细胞浆为主，与之前的研究结果一致。在绝大部分卵巢良性疾病组织中未见该抗原表达，少量组织呈微弱表达；卵巢癌组织中可见大部分出现较多棕黄色或棕褐色颗粒，显示该抗原的表达明显增强。

NJ003-1特异性抗原在130例卵巢癌及30例卵巢良性疾病中的阳性率分别为85.4％和3.3％，差异有统计学意义(P<0.001，表4)。

表4：NJ003-1特异性抗原在良恶性卵巢组织中的表达

4.2 NJ003-1特异性抗原的表达与卵巢癌临床病理特征的关系

如表5所示，低分化卵巢癌患者组织中NJ003-1特异性抗原的阳性表达率显著高于中高分化组(93.3％vs.67.5％，p<0.05)，且该抗原的阳性表达率随TNM分期的升高而升高，Ⅲ～Ⅳ期卵巢癌患者组织中的阳性率高于Ⅰ～Ⅱ期组(97.1％vs.81.2％，p<0.05)；有淋巴结转移的患者其阳性率高于无淋巴结转移者(96.7％vs.81.0％，p<0.05)，差异均有统计学意义。NJ003-1特异性抗原的表达与卵巢癌患者的年龄、肿瘤的大小，组织学类型无显著关系。

表5 NJ003-1特异性抗原的表达与卵巢癌患者临床病理特征之间的关系

上述实验结果表明：NJ003-1特异性抗原在大部分卵巢癌组织中表达水平较高，且特异性很高，而在卵巢良性疾病组织中表达较弱，提示该抗原可能会影响卵巢癌的进展。进一步的分析证实，NJ003-1特异性抗原的表达与卵巢癌的分化程度、临床分期及淋巴转移有着密切的关系。可见，该抗原的高表达可能提示肿瘤侵袭性与转移能力较强。因此，该抗原可以作为卵巢癌实验诊断的分子靶标，特别是用于良恶性卵巢肿瘤的鉴别诊断。

实施例5软琼脂克隆形成实验

1、方法

生理盐水制备3％琼脂糖溶液，高压蒸汽灭菌。在6孔细胞培养板中制备双层凝胶琼脂。底层为支持层，将含10％FBS的MCcoy’5A培养基与3％琼脂糖按5：1比例混合，配制成含0.5％琼脂糖的培养基，2ml/孔，加入6孔板中，室温冷却凝固。收集处于对数生长期的SK-OV-3细胞，用培养基制成单细胞悬液，37℃保温，取适量的单细胞悬液与3％琼脂糖溶液、不同浓度单克隆抗体NJ003-1溶液充分混合，2ml/孔，铺板制成含0.3％琼脂糖的上层琼脂，每孔含有2×10⁴个细胞，抗体终浓度分别为0、200μg/ml、400μg/ml、800μg/ml、1600μg/ml和2000μg/ml，每剂量设3个平行孔。常温下待琼脂凝固后，将培养板移入37℃、5％CO₂培养箱中培养2周。倒置显微镜下计数，将≥50个细胞的集落判定为一个克隆，计算克隆形成率、抑制率。克隆形成率＝(克隆数/接种细胞数)×100％；抑制率＝(1-实验组克隆形成率/对照组克隆形成率)×100％。

2、结果

在双层琼脂培养基中，对照组SK-OV-3细胞生长旺盛，一般7-10天可形成细胞集落，2周后观察，集落数量多且明显增大。单抗NJ003-1作用后的细胞形成集落显著减少，且集落远小于对照组，部分细胞不能在软琼脂中生长形成集落，呈单个散在的细胞。

软琼脂克隆形成实验表明：单克隆抗体NJ003-1能够有效抑制卵巢癌细胞SK-OV-3在软琼脂中的克隆形成，并且其抑制程度与抗体的作用浓度呈正相关。200μg/ml单抗作用2周后克隆抑制率为29.79％，400μg/ml单抗组抑制率达65.96％，而800μg/ml或更高浓度的单抗组几乎无克隆生长(表6)。统计分析发现：200μg/ml和400μg/ml单抗组克隆数与对照组相比显著减少(P<0.001，P<0.001)，200μg/ml单抗组和400μg/ml单抗组克隆数相比也有显著差异(P<0.001)。

表6 单抗NJ003‐1对SK‐OV‐3软琼脂克隆形成的影响(n＝3)

注：a.克隆形成率＝(克隆数/接种细胞数)×100％

b.克隆抑制率＝(1‐实验组克隆形成率/对照组克隆形成率)×100％

*P<0.001，与对照组比；^P<0.001，与200μg/ml单抗组比

实施例6裸鼠移植瘤模型实验

1、方法：

25只裸鼠随机分为5组，设为生理盐水组、单抗组(200μg、400μg、800μg 3组)和单抗对照组，每组5只。生理盐水组和单抗组裸鼠经右侧腋部皮下接种SK-OV-3细胞悬液，2×10⁶个细胞/只。单抗组接种当天开始腹腔注射200μl不同浓度的单抗溶液，分别含200μg、400μg、800μg单抗，前5天每天注射1次，之后每隔3天注射1次，连续2周(累计注射9次)。生理盐水组以等体积的生理盐水代替单抗溶液，注射时间和途径相同。单抗对照组5只裸鼠仅在腹腔注射200μl单抗溶液，800μg单抗/只，抗体的注射时间同单抗组。每日观察小鼠活动、精神状况、进食情况及肿块出现时间等并记录。自皮下结节出现起，游标卡尺测量移植瘤长径(a)及短径(b)，移植瘤体积V＝ab²/2。自接种肿瘤细胞3周后，裸鼠颈椎脱臼处死，解剖分离肿瘤并称取瘤重、计算抑瘤率。抑瘤率＝(1–单抗组平均瘤重/生理盐水组平均瘤重)×100％。

2、结果：

接种细胞后第9天，生理盐水组种植区最先出现肉眼可见的小结节，之后2天单抗组出现小结节，成瘤率达100％。从第13天起测量肿瘤体积，观察至第21天。各组小鼠平均肿瘤体积表现为：随着时间延长而增长，第17天起400μg、800μg单抗组与生理盐水组相比，肿瘤体积的增长速度即有明显延缓，至观察结束时，差异持续存在(P<0.001，P<0.001，图1A)。接种细胞3周后处死小鼠，分离肿瘤并称量肿瘤重量。生理盐水组、200μg、400μg、800μg单抗组平均瘤重分别为(1.98±0.32)g，(1.61±0.28)g，(1.19±0.21)g和(1.11±0.19)g。单因素方差分析进行组间比较，四组小鼠肿瘤重量具有统计学差异(F＝12.46,P<0.001)；两两比较发现400μg、800μg单抗组平均瘤重显著低于生理盐水组(P＝0.002,P<0.001)；200μg单抗组与800μg单抗组间也存在显著差异(P＝0.011)。200μg、400μg、800μg单抗组抑瘤率 由低至高分别为18.69％、39.90％和43.94％(图1B、C)。800μg单抗对照组小鼠观察至实验结束，全部存活，生活状态正常，食欲旺盛，行动自如，始终未见异常改变。

结果表明：单抗NJ003‐1在体内能显著抑制人卵巢癌移植瘤的生长。

Claims (6)

1.一株分泌抗人卵巢癌单克隆抗体的杂交瘤细胞株NM003-1，于2011年8月31日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：C201174。

2.由权利要求1所述的保藏号为CCTCC NO：C201174的杂交瘤细胞株NM003-1分泌的抗人卵巢癌的单克隆抗体NJ003-1。

3.权利要求2所述的单克隆抗体NJ003-1在制备卵巢癌诊断试剂中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于权利要求2所述的单克隆抗体NJ003-1在制备卵巢癌辅助诊断试剂中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于所述的辅助诊断试剂包括免疫组织化学检测试剂。

6.权利要求2所述的单克隆抗体NJ003-1在制备治疗卵巢癌的药物中的应用。