ES2373149T3 - Procedimiento para el aislamiento de arn a partir de especímenes de tejido fijados con formalina e incluidos en parafina. - Google Patents

Procedimiento para el aislamiento de arn a partir de especímenes de tejido fijados con formalina e incluidos en parafina. Download PDF

Info

Publication number
ES2373149T3
ES2373149T3 ES06123097T ES06123097T ES2373149T3 ES 2373149 T3 ES2373149 T3 ES 2373149T3 ES 06123097 T ES06123097 T ES 06123097T ES 06123097 T ES06123097 T ES 06123097T ES 2373149 T3 ES2373149 T3 ES 2373149T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
rna
sample
solution
tissue
chaotropic
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
ES06123097T
Other languages
English (en)
Inventor
Kathleen Danenberg
Peter Danenberg
Steven Swenson
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University of Southern California USC
Original Assignee
University of Southern California USC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by University of Southern California USC filed Critical University of Southern California USC
Application granted granted Critical
Publication of ES2373149T3 publication Critical patent/ES2373149T3/es
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

Un procedimiento para la recuperación de ARN de una muestra de tejido fijada con formalina e incluida en parafina, que comprende: calentar la muestra en una solución caotrópica que comprende una concentración efectiva de un agente caotrópico a una temperatura en el intervalo de aproximadamente 50 a aproximadamente 100 °C durante un período de tiempo de aproximadamente a aproximadamente 120 minutos; y recuperar dicho ARN a partir de dicha solución caotrópica, en la que la solución caotrópica es urea, formamida, yoduro de potasio y tiocianato de potasio.

Description

Procedimiento para el aislamiento de ARN a partir de especímenes de tejido fijados con formalina e incluidos en parafina
Apoyo gubernamental
El gobierno tiene ciertos derechos en la presente invención en virtud el número de asignación R01 CA 71716 del Instituto Nacional del Cáncer de los Institutos Nacionales de Salud.
Campo de la invención
La presente invención se refiere al campo de la purificación de ARN, ADN y proteínas de muestras de tejido biológico.
Antecedentes
La determinación de los niveles de expresión génica en los tejidos es de gran importancia para el diagnóstico exacto de enfermedades en seres humanos y se utiliza cada vez más para determinar el curso del tratamiento de un paciente. Los procedimientos farmacogenómicos pueden identificar pacientes propensos a responder a un fármaco en particular y pueden abrir el camino a nuevos enfoques terapéuticos.
Por ejemplo, la timidilato sintasa (TS) es una enzima integral en la biosíntesis de ADN en la que cataliza la metilación reductiva de monofosfato de desoxiuridina (dUMP) a monofosfato de desoxitimidina (dTMP) y proporciona la única vía para la síntesis de novo de nucleótidos de pirimidina en la célula (Johnston et al., 1995). La timidilato sintasa es una diana para los fármacos quimioterapéuticos, más comúnmente el agente antifolato 5-fluorouracilo (5-FU). Como el agente más efectivo para el tratamiento de los cánceres de colon, cabeza y cuello y mama, la acción primaria del 5-FU es inhibir la actividad de TS, lo que resulta en una disminución de los niveles intracelulares de timina y en consecuencia provoca la muerte celular.
Se ha informado una variación considerable en la expresión de TS entre especímenes clínicos tumorales de tumores primarios (Johnston et al. 1995; Lenz et al. 1995) y metástasis (Farrugia et al. 1997; Leichmann et al. 1997). En el cáncer colorrectal, por ejemplo, la tasa de expresión de TS en el tejido tumoral con respecto al tejido de la mucosa gastrointestinal normal ha abarcado de 2 a 10 (Ardalan y Zang, 1996).
La timidilato sintasa también es conocida por tener importancia clínica en el desarrollo de resistencia tumoral, como se ha demostrado mediante estudios que han mostrado inducción aguda de la proteína de TS y aumento en los niveles de enzimas TS en células neoplásicas después de la exposición a 5-FU (Spears et al., 1982, Swain y col 1989). La capacidad de un tumor de sobreexpresar TS en forma aguda en respuesta a agentes citotóxicos como 5-FU puede desempeñar un rol en el desarrollo de resistencia a fluorouracilo. Estudios anteriores han mostrado que los niveles de proteína TS se correlacionan directamente con la efectividad de la terapia con 5-FU, que existe una correlación directa entre la proteína y la expresión de ARN (Jackman et al., 1985) y que la expresión de TS es un marcador pronóstico potente en el cáncer colorrectal y de mama (Jackman et al. 1985; Horikoshi et al. 1992).
En la enfermedad metastásica avanzada, se ha demostrado que el ARNm de TS elevado, cuantificado por RT-PCR, y la expresión de proteína de TS elevada predicen mala respuesta a la terapia basada en fluoropirimidinas para los cánceres colorrectal (Johnston et al., 1995, Farrugia et al., 1997, Leichman et al., 1997), gástrico (Lenz et al., 1995, Alexander et al., 1995), y de cabeza y cuello (Johnston et al., 1997). Estuvo presente a menudo una considerable superposición entre respondedores y no respondedores en la categoría de TS baja, pero los pacientes con niveles de TS por encima de la mediana fueron en su mayoría no respondedores. El valor predictivo de la sobreexpresión de TS puede ser aún mayor si se combina con otras características moleculares como niveles de dihidropirimidina deshidrogenasa (DPD) y expresión de timidina fosforilasa (TP), estado de error de replicación positivo (RER+) (Kitchens y Berger, 1997), y estado de p53 (Lenz et al., 1997). Los estudios realizados hasta la fecha que han evaluado la expresión de TS en tumores humanos sugieren que la capacidad para predecir la respuesta y el resultado basado en la expresión de TS en tumores humanos pueden brindar la oportunidad en el futuro de seleccionar a los pacientes más susceptibles de beneficiarse de la terapia dirigida a TS.
Hasta ahora, los estudios de expresión génica tisular cuantitativa que incluyen los de expresión de TS se han limitado a la amplificación de ARN por transcriptasa reversa reacción en cadena de polimerasa (RT-PCR) a partir de tejido congelado. Sin embargo, la mayoría de las muestras patológicas no están preparadas como tejidos congelados, sino que habitualmente son fijadas con formalina e incluidas en parafina (FFPE) para permitir el análisis histológico y el almacenamiento para archivo. Los niveles de expresión génica pueden ser monitoreados semicuantitativamente e indirectamente en estas muestras fijadas e incluidas mediante el uso de tinción inmunohistoquímica para monitorear los niveles de expresión de proteínas. Debido a que las muestras incluidas en parafina están ampliamente disponibles, son necesarios procedimientos rápidos y confiables para el aislamiento de ácidos nucleicos, en especial de ARN, a partir de dichas muestras.
55 E06123097 01-12-2011
Existen un número de técnicas para la purificación de ARN de muestras biológicas, pero ninguna es fiable para el aislamiento de ARN de muestras FFPE. Por ejemplo, Chomczynski (Patente de EE.UU. Núm. 5.346.994) describe un procedimiento para la purificación de ARN de tejidos basado en una separación en fase líquida usando fenol e isotiocianato de guanidina. Una muestra biológica se homogeneiza en una solución acuosa de fenol e isotiocianato de guanidina y el homogeneizado de esta se mezcla con cloroformo. Después de la centrifugación, el homogeneizado se separa en una fase orgánica, una interfase y una fase acuosa. Las proteínas son secuestradas en la fase orgánica, el ADN en la interfase, y el ARN en la fase acuosa. El ARN puede ser precipitado de la fase acuosa. Este procedimiento no permite el aislamiento fiable de ARN de muestras de tejido fijadas con formalina e incluidas en parafina.
Otras técnicas conocidas para el aislamiento de ARN suelen utilizar sales de guanidina o extracción con fenol, como se describe por ejemplo en Sambrook, J. et al., (1989) en las pág. 7.3-7.24, y en Ausubel, F. M. et al., (1994) en las pág. 4.0.3-4.4.7. Sin embargo, ninguno de los procedimientos conocidos proporciona resultados cuantitativos reproducibles en el aislamiento de ARN a partir de muestras de tejido incluidas en parafina.
Las técnicas para el aislamiento de ARN a partir de tejidos incluidos en parafina son particularmente necesarias para el estudio de la expresión génica en tejidos tumorales. Los niveles de expresión de ciertos receptores o enzimas pueden indicar la probabilidad de éxito de un tratamiento en particular.
Los estudios de expresión génica de TS verdaderamente cuantitativos se han limitado a RT-PCR a partir de tejido congelado, mientras que el monitoreo semi-cuantitativo de control de la expresión de proteína de TS en material patológico de archivo fijado en portaobjetos de vidrio ha estado disponible a través de la tinción inmunohistoquímica. Debido a las limitaciones en el aislamiento de ARN a partir de material patológico de archivo, no se dispone hasta el momento de técnicas cuantitativas para medir los niveles de expresión génica de estas muestras.
Sumario
Un aspecto de la presente invención es proporcionar un procedimiento fiable para el aislamiento de ARN, ADN o proteínas de muestras de tejidos biológicos. La invención también proporciona procedimientos simples, eficientes y reproducibles para el aislamiento de ARN, ADN o proteínas de tejidos que han sido incluidos en parafina.
La invención proporciona procedimientos de purificación de ARN a partir de una muestra de tejido biológico mediante el calentamiento de la muestra durante aproximadamente 5 a aproximadamente 120 minutos a una temperatura de entre aproximadamente 50 y aproximadamente 100ºC en una solución de una concentración efectiva de un agente caotrópico. En una realización, el agente caotrópico es un compuesto de guanidinio. El ARN se recupera a partir de dicha solución. Por ejemplo, la recuperación de ARN puede realizarse por extracción con cloroformo.
En un procedimiento de la invención, el ARN es aislado de una muestra patológica de archivo. En una realización, una muestra incluida en parafina es primero desparafinada. Un procedimiento de desparafinización ejemplar comprende lavar la muestra parafinada con un disolvente orgánico, preferentemente xileno. Las muestras desparafinadas pueden ser rehidratadas con una solución acuosa de un alcohol inferior. Los alcoholes inferiores adecuados incluyen metanol, etanol, propanoles y butanoles. En una realización, las muestras desparafinadas se rehidratan con lavados sucesivos con soluciones de concentración de alcohol decreciente. En otra realización, la muestra es desparafinada y rehidratada simultáneamente.
Las muestras desparafinadas pueden homogeneizarse utilizando medios mecánicos, sónicos u otros tipos de homogeneización. En una realización, las muestras rehidratadas se homogeneizan en una solución que comprende un agente caotrópico, como tiocianato de guanidinio (también comercializado como isotiocianato de guanidinio).
Las muestras homogeneizadas se calientan a una temperatura en el intervalo de aproximadamente 50 a aproximadamente 100 °C en una solución caotrópica, que comprende una cantidad efectiva de un agente caotrópico. En una realización, el agente caotrópico es un compuesto de guanidinio. Un agente caotrópico preferido es tiocianato de guanidinio.
El ARN se recupera a continuación de la solución, por ejemplo, mediante extracción con fenol cloroformo, cromatografía de intercambio iónico o cromatografía de exclusión por tamaño.
El ARN puede entonces ser purificado utilizando técnicas de extracción, electroforesis, cromatografía, precipitación u otras técnicas adecuadas.
El ARN aislado por los procedimientos de la invención es adecuado para un número de aplicaciones en biología molecular que incluyen transcripción reversa con cebadores aleatorios para proporcionar bibliotecas de ADNc.
Puede utilizarse ARN purificado para determinar el nivel de expresión génica en una muestra de tejido fijada con formalina e incluida en parafina mediante amplificación por transcripción reversa, reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR). Utilizando los cebadores de PCR apropiados, puede determinarse el nivel de expresión de cualquier ARN mensajero por los procedimientos de la invención. La técnica cuantitativa de RT-PCR permite la
50 E06123097 01-12-2011
comparación de los niveles de expresión de proteína (mediante inmunohistoquímica) con los niveles de expresión génica (mediante RT-PCR) en la misma muestra incluida en parafina.
Los procedimientos de la invención son aplicables a una amplia gama de tipos de tejidos y tumores y genes diana y por lo tanto pueden ser utilizados para la evaluación del tratamiento y como herramienta de diagnóstico en una gama de cánceres que incluyen de mama, cabeza y cuello, esófago, colorrectal, y otros. Un gen preferido particularmente por los procedimientos de la invención es el gen de timidilato sintasa. Los procedimientos de la invención lograron la cuantificación reproducible de la expresión génica de TS en tejidos FFPE, comparable a la derivada de tejido congelado.
Breve descripción de las figuras
La Figura 1 muestra el nivel de �-actina y expresión de TS a diversos tiempos de calentamiento. Estos datos muestran que sin la etapa de calentamiento, hay un rendimiento mínimo de ARN extraído de la parafina.
La Figura 2 muestra el nivel de expresión de �-actina en tejido normal (N) o tumoral (T) de pacientes con cáncer colorrectal según lo determinado por PCR cuantitativa a partir de ARN extraído a 95 °C durante cero a 40 minutos. Estos datos sugieren 30 minutos como el tiempo de calentamiento óptimo.
La Figura 3 muestra el efecto de la temperatura y el tiempo en la producción de ARN de �-actina y en el aislamiento de ADN. Estos datos muestran que a tiempos de calentamiento mayores (entre 60 y 120 minutos), el ARN sufre degradación mientras que hay un aumento en la contaminación de ADN capaz de generar una señal de ADN en la PCR. Las barras representan valores de experimentos por triplicado realizados en los distintos tiempos y temperaturas indicados.
La Figura 4 muestra el efecto de diferentes soluciones de calentamiento en el rendimiento del ARN aislado. Estos datos muestran que el caotropo en la solución, en este caso isotiocianato de guanidinio (GITC), es el componente esencial de la solución de extracción de ARN, sin el cual el rendimiento del ARN extraído es al menos 10 veces menor.
La Figura 5 muestra una comparación de la expresión génica relativa de TS a partir de pellets celulares incluidos en parafina (barras de color blanco) y congelados (barras de color negro) de seis líneas celulares. Estos datos muestran que el análisis de ARN extraído de parafina refleja de forma fiable valores de expresión génica en tejido fresco-congelado.
La Figura 6 muestra una comparación de los niveles de expresión génica de TS en tejidos de colon normal o tumoral y tumoral de esófago que estaban fijados con formalina e incluidos en parafina o congelados.
La Figura 7 muestra proporciones de TS/�-actina determinadas en secciones en parafina de pacientes cuya respuesta a 5-FU/LV se vinculó previamente a la expresión génica de TS.
La Figura 8 muestra los niveles de expresión de cuatro genes marcadores de malignidad (TS; timidina fosforilasa (TP); ciclooxigenasa-2 (COX-2); y factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF)) en muestras de FFPE de un cáncer de colon primario y una metástasis hepática que recurrieron un año más tarde en el mismo paciente. Estos datos muestran que, como era de esperar, tres de los cuatro marcadores de malignidad se encuentran elevados en el tejido tumoral metastásico.
Descripción detallada
Los procedimientos de la presente invención incluyen la purificación del ARN de muestras biológicas. En una realización, las muestras son muestras de tejido incluidas en parafina y el procedimiento comprende la desparafinación de las muestras incluidas, la homogeneización del tejido desparafinado y el calentamiento del tejido homogeneizado a una temperatura en el intervalo de aproximadamente 50 a aproximadamente 100 °C durante un período de tiempo de entre aproximadamente 5 minutos a aproximadamente 120 minutos en una solución caotrópica que contiene una cantidad efectiva de un compuesto de guanidinio. Esta etapa de calentamiento aumenta la cantidad de ADNc que es amplificado a partir de la muestra en hasta 1000 veces más que los especímenes que no son calentados.
Si bien el tejido tumoral congelado no está ampliamente disponible, los bloques de parafina se preparan de forma rutinaria a partir de cada tipo tumoral después de la cirugía, lo que permite realizar investigaciones retrospectivas a gran escala de la expresión de TS y la respuesta a la quimioterapia.
Por otra parte, la técnica puede aplicarse a cualquiera de una amplia gama de tipos de tumores y a una gama ilimitada de genes diana. Esto tiene consecuencias para la preparación futura de “perfiles de expresión génica” de tumores individuales, en los que podrían determinarse los niveles de expresión en muestras de pacientes individuales para una gama de genes que se sabe que influyen en el resultado clínico y la respuesta a diversos agentes quimioterápicos. La PCR automatizada en tiempo real de una muestra FFPE permite dirigir el tratamiento a tumores individuales.
55 E06123097 01-12-2011
Muestras de tejidos
El ARN puede ser aislado de cualquier muestra biológica usando los procedimientos de la invención. Las muestras biológicas suelen fijarse con un fijador. Comúnmente se utilizan fijadores de aldehídos como formalina (formaldehído) y glutaraldehído. Las muestras de tejido fijadas utilizando otras técnicas de fijación como inmersión en alcohol (Battifora y Kopinski, J. Histochem. Cytochem. (1986) 34:1095) también son adecuadas. Las muestras utilizadas son también incluidas en parafina. Puede aislarse ARN de cualquier muestra de tejido biológico incluida en parafina mediante los procedimientos de la invención. En una realización, las muestras son fijadas con formalina e incluidas en parafina.
Desparafinación de las muestras
La desparafinación elimina la mayor parte de la parafina de las muestras incluidas en parafina. Se conoce un número de técnicas para la desparafinación y cualquier técnica adecuada puede utilizarse con la presente invención. El procedimiento preferido de la invención utiliza un lavado con un disolvente orgánico para disolver la parafina. Estos disolventes son capaces de eliminar la parafina efectivamente de la muestra de tejido sin afectar en forma adversa el aislamiento del ARN. Los disolventes adecuados pueden elegirse de disolventes como benceno, tolueno, etilbenceno, xilenos y mezclas de los mismos. Un xileno es el disolvente preferido para su uso en los procedimientos de la invención. Los disolventes solos o en combinación en los procedimientos de la invención son preferentemente de alta pureza, por lo general superior al 99%.
La parafina normalmente se elimina mediante el lavado con un disolvente orgánico, con mezclado enérgico seguido por centrifugación. Las muestras se centrifugan a una velocidad suficiente para hacer que el tejido forme un pellet en el tubo, usualmente a aproximadamente 10.000 a 20.000 x g. Después de la centrifugación, se descarta el sobrenadante de disolvente orgánico. Un experto en la técnica de la histología reconocerá que el volumen de disolvente orgánico utilizado y el número de lavados necesarios dependerá del tamaño de la muestra y la cantidad de parafina a eliminar. Cuanta más parafina haya que eliminar, serán necesarios más lavados. Por lo general, una muestra será lavada entre 1 y 10 veces y preferentemente entre aproximadamente dos y aproximadamente cuatro veces. Un volumen común de disolvente orgánico es de aproximadamente 500 1l para un espécimen de tejido de 10 1m.
Pueden utilizarse también otros procedimientos para desparafinación conocidos para el experto en la técnica en el procedimiento de la invención. Estos procedimientos incluyen la fusión directa (Banerjee et al., 1995).
Las muestras son preferentemente rehidratadas después de la desparafinación. El procedimiento preferido para la rehidratación es un lavado gradual con soluciones acuosas de alcoholes inferiores de concentración decreciente. El etanol es el alcohol inferior preferido para la rehidratación. Otros alcoholes también pueden ser adecuados para su uso con la invención, incluyendo metanol, isopropanol y otros alcoholes similares en el intervalo de C1-C5. La muestra se mezcla enérgicamente en forma alternativa con soluciones alcohólicas y se centrifuga. En una modalidad preferida, el intervalo de concentración del alcohol se disminuye gradualmente de aproximadamente 100% a aproximadamente 70% en agua durante aproximadamente tres a cinco pasos incrementales, en los que el cambio en la concentración de la solución en cada paso es usualmente menor que aproximadamente 10% (es decir, la secuencia: 100%, 95%, 90%, 80%, 70%). En otra realización, la desparafinación y la rehidratación se llevan a cabo simultáneamente utilizando un reactivo como EZ-DEWAX (BioGenex, San Ramon, CA)
Homogeneización
Las muestras desparafinadas, rehidratadas pueden homogeneizarse mediante cualquier técnica estándar mecánica, sónica u otra adecuada. La homogeneización del tejido se lleva a cabo preferentemente con un homogeneizador de tejidos mecánico de acuerdo con procedimientos estándar. Un número de homogeneizadores disponibles comercialmente son adecuados para su uso con la invención incluyendo: homogeneizador Ultra-Turrax (IKAWorks, Inc., Wilmington, NC); Tissumizer (Tekmar-Dohrmann, Cincinnati, OH); y Polytron (Brinkmann, Westbury, NY).
En una realización, la muestra se homogeniza en presencia de un agente caotrópico. Los agentes caotrópicos se eligen de manera que el ARN en una concentración efectiva es purificado a partir de una muestra incluida en parafina en una cantidad mayor que aproximadamente 10 veces la aislada en ausencia de un agente caotrópico. Los agentes caotrópicos incluyen: compuestos de guanidinio, urea, formamida, ioduro de potasio, tiocianato de potasio y compuestos similares. El agente caotrópico preferido para los procedimientos de la invención es un compuesto de guanidinio, como isotiocianato de guanidinio (también comercializado como tiocianato de guanidinio) y clorhidrato de guanidinio. Numerosos contraiones aniónicos son útiles, y un experto en la materia puede preparar muchas sales de guanidinio con estos aniones apropiados. La solución de guanidinio utilizada en la invención por lo general tiene una concentración en el intervalo de aproximadamente 1 a aproximadamente 5M, con un valor preferido de aproximadamente 4M. Si el ARN ya está en solución, la solución de guanidinio puede ser de mayor concentración de modo que la concentración final alcanzada en la muestra esté en el intervalo de 1 a 5M. La solución de guanidinio también está preferentemente tamponada a un pH de aproximadamente 3 a aproximadamente 6, más preferentemente aproximadamente 4, con un tampón bioquímico adecuado como Tris-Cl. La solución caotrópica
50 E06123097 01-12-2011
también puede contener agentes reductores, como ditiotreitol (DTT) y -mercaptoetanol (BME). La solución caotrópica también puede contener inhibidores de ARNasa.
Calentamiento
Las muestras se calientan en la solución caotrópica a una temperatura de aproximadamente 60 °C a aproximadamente 100 °C durante aproximadamente 5 mi nutos a aproximadamente 2 horas. Como alternativa, las muestras se calientan en la solución caotrópica a una temperatura de aproximadamente 50 °C a aproximad amente 100 °C durante aproximadamente 5 minutos a aproxima damente 2 horas. Los tiempos de calentamiento suelen ser elegidos de modo que la cantidad de ARN purificado es de al menos aproximadamente 100 veces mayor que para las muestras sin calentar, y más preferentemente aproximadamente 1000 veces mayor. En una realización preferida, la muestra se calienta durante aproximadamente 20 minutos a una temperatura de aproximadamente 75 a aproximadamente 100 °C. Más preferentemente, la mue stra se calienta durante 30 a 60 minutos a aproximadamente 95 °C.
Recuperación de ARN
El ARN puede ser recuperado de la solución caotrópica después del calentamiento mediante cualquier técnica adecuada que da como resultado el aislamiento del ARN a partir de al menos un componente de la solución caotrópica. El ARN puede ser recuperado de la solución caotrópica por extracción con un disolvente orgánico, extracción con cloroformo, extracción con fenol-cloroformo, precipitación con etanol, isopropanol o cualquier otro alcohol inferior, mediante cromatografía incluyendo cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de exclusión por tamaño, cromatografía en gel de sílice y cromatografía de fase reversa, o por procedimientos electroforéticos, incluyendo electroforesis en gel de poliacrilamida y electroforesis en gel de agarosa, como será evidente para un experto en la técnica. El ARN se recupera preferentemente de la solución caotrópica mediante extracción con fenol cloroformo.
Después de la recuperación del ARN, este puede opcionalmente ser purificado aún más. La purificación adicional resulta en ARN que está sustancialmente libre de contaminación por ADN o proteínas. La purificación adicional puede ser realizada por cualquiera de las técnicas mencionadas anteriormente para la recuperación de ARN. El ARN es purificado preferentemente por precipitación utilizando un alcohol inferior, especialmente con etanol o con isopropanol. La precipitación se lleva a cabo preferentemente en presencia de un vehículo como glucógeno que facilita la precipitación.
Recuperación de ADN y proteínas
Los procedimientos de la invención también pueden utilizarse para purificar ADN o proteínas de la muestra de tejido. Después de mezclar una muestra con un disolvente orgánico, como cloroformo, y después de la centrifugación, la solución tiene tres fases, una fase orgánica inferior, una interfase y una fase acuosa superior. Con un agente caotrópico apropiado, en particular con un compuesto de guanidinio, los componentes biológicos de la muestra se segregarán en las tres fases. La fase acuosa superior contendrá ARN, mientras que la interfase contendrá ADN y la fase orgánica contendrá proteínas. Un experto en la técnica reconocerá que los procedimientos de la invención son adecuados para la recuperación de las fases de ADN y proteína, así como de la que contiene ARN. La recuperación del ADN es potenciada por los procedimientos de la invención.
ARN purificado
El ARN purificado por los procedimientos de la invención es adecuado para una variedad de propósitos y procedimientos de biología molecular, que incluyen entre otros: transcripción reversa a ADNc; producción de ADNc marcado con radioactividad; fluorescencia o de alguna otra manera para el análisis de chips de genes, microarreglos de oligonucleótidos y similares; electroforesis mediante gel de acrilamida o agarosa; purificación por cromatografía (por ejemplo, intercambio iónico, gel de sílice, fase reversa, o cromatografía de exclusión por tamaño); hibridación con sondas de ácidos nucleicos; y fragmentación mediante medios mecánicos, sónicos u otros.
Ejemplos
Materiales y procedimientos
Estos materiales y procedimientos son comunes a los siguientes ejemplos.
Preparación de la muestra. Las características de las líneas celulares humanas SK1, H157, A431, HT29, HCC298 y HH30 se han descrito previamente. Las células fueron retiradas de sus monocapas por tripsinización y se agruparon en pellets por centrifugación a 3000 rpm durante 5 minutos. Los pellets celulares fueron congelados -70 °C o fijados con formalina durante 24 horas, a continuación incluidos en parafina.
Se obtuvieron secciones representativas de tejido tumoral en el momento de la cirugía, se fijaron con formalina e incluyeron en parafina mediante procedimientos comunes a la mayoría de los laboratorios de patología clínica. Se cortaron secciones transversales de tejido (5 1m) utilizando un microtomo.
45 E06123097 01-12-2011
Aislamiento de ARN. Se aisló el ARN de los tejidos incluidos en parafina de la siguiente manera. Se colocó una sección individual de tejido parafinado de 5 1m en un tubo Eppendorf y se desparafinó mediante dos lavados de 15 minutos con xileno. El tejido fue rehidratado mediante lavados sucesivos de 15 minutos con alcoholes graduados (100%, 95%, 80% y 70%). El pellet resultante se suspendió en isotiocianato de guanidina 4M con sarcosina 0,5% y ditiotreitol (DTT) 20 mM. La suspensión se homogeneizó y después se calentó a partir de aproximadamente 50 a aproximadamente 95 °C durante 0-60 minutos; se incl uyó un punto de tiempo de calentamiento de cero como un control para cada muestra. Se añadió acetato de sodio (pH 4,0) a 0,2 M y la solución se extrajo con fenol/cloroformo y se precipitó con isopropanol y 10 mg de glucógeno. Después de la centrifugación (13000 rpm, 4 °C, 15 min) el ARN precipitado se lavó dos veces con 1 ml de etanol 75% y a continuación se resuspendió en agua libre de ARNasa.
Transcripción reversa (RT). Después de calentar, el ARN total fue convertido a ADNc utilizando hexámeros al azar. Las condiciones de RT fueron como las que han sido descritas previamente para tejido congelado (Horikoshi et al., 1992). Se prepararon controles omitiendo la transcriptasa reversa (No RT) para cada muestra.
Cuantificación por PCR en tiempo real de la expresión génica de TS y -actina utilizando la Máquina de PCR Perkin Elmer Cetus 7700 (Taqman). La cuantificación de los niveles de ARNm se llevó a cabo utilizando una PCR en tiempo real basada en un procedimiento de detección de fluorescencia como se describió previamente (Heid et al. 1996; Eads et al. 1999). El ADNc fue preparado como se describió anteriormente. El ADNc de interés y el ADNc de referencia fueron amplificados por separado utilizando una sonda con un colorante reportero fluorescente 5’ (6FAM) y un colorante inactivador 3’ (TAMRA). La actividad de 5’-exonucleasa de la TAQ polimerasa escinde la sonda y libera la molécula reportera, cuya fluorescencia es detectada por el Sistema de Detección de Secuencias ABI Prism (Taqman). Después de cruzar un umbral de detección de fluorescencia, la amplificación por PCR da como resultado una señal fluorescente proporcional a la cantidad de producto generado por PCR. La concentración inicial de la plantilla se determinó a partir del número de ciclo en el cual la señal fluorescente cruzó un umbral en la fase exponencial de la reacción de PCR. La expresión génica relativa se determinó sobre la base de los ciclos de umbral del gen de interés y el gen de referencia. El uso de un gen de referencia evita la necesidad de cuantificar el ARN directamente, lo que podría ser una importante fuente de error.
Las secuencias del cebador y de la sonda fueron las siguientes: TS: Secuencia Núm. 1 GGC CTC GGT GTG CCT TT; Secuencia Núm. 2 AAC ATC GCC AGC TAC GCC CTG C; Secuencia Núm. 3 GAT GTG CGC AAT CAT GTA CGT. -actina: Secuencia Núm. 4 TGA GCG CGG CTA CAG CTT; Secuencia Núm. 5 ACC ACC ACG GCC GAG CGG; Secuencia Núm. 6 TCC TTA ATG TCA CGC ACG ATT T. Para los experimentos de PCR en tiempo real, como se mencionó anteriormente, los oligonucleótidos reporteros (Secuencias Núm. 2 y 5) fueron marcados en 5’ con 6FAM y marcados en 3’ con TAMRA.
Para cada PCR, se incluyó un control “Sin Transcriptasa Reversa” (NRT o No RT). El propósito de esta reacción fue corregir cualquier amplificación de fondo derivada de contaminación por ADN genómico residual. Por lo tanto, cada valor global de TS y -actina se calcula como el valor de RT menos el valor de NRT (RT-NRT).
Análisis estadístico. Se realizaron comparaciones no paramétricas de medias de prueba para determinar si las diferencias en los niveles de TS entre el tejido congelado y las muestras FFPE del mismo tumor eran significativas o no significativas.
Ejemplo 1
Procedimiento general de aislamiento de ARN
Se extrajo el ARN de tejido incluido en parafina mediante el siguiente procedimiento general.
A. Desparafinación e hidratación de las secciones:
(1)
Se coloca una porción de una sección de aproximadamente 10 1m en un tubo de centrífuga de plástico de 1,5 ml.
(2)
Se añaden 600 1l de xileno y la mezcla se agita enérgicamente durante aproximadamente 10 minutos a temperatura ambiente (aproximadamente 20 a 25 °C).
(3)
La muestra se centrifuga durante aproximadamente 7 minutos a temperatura ambiente a la máxima velocidad de la centrífuga de laboratorio (aproximadamente 10-20.000 x g).
(4)
Los pasos 2 y 3 se repiten hasta que la mayoría de la parafina se ha disuelto. Normalmente se requieren dos o más veces dependiendo de la cantidad de parafina incluida en la porción de la muestra original.
(5)
La solución de xileno se elimina agitando enérgicamente con un alcohol inferior, preferentemente con etanol 100% (aproximadamente 600 1l) durante aproximadamente 3 minutos.
(6)
El tubo se centrifuga durante aproximadamente 7 minutos como en el paso (3). El sobrenadante se decanta y se desecha. El pellet se torna de color blanco.
45 E06123097 01-12-2011
(7)
Los pasos 5 y 6 se repiten con soluciones de etanol sucesivamente más diluidas: en primer lugar con etanol aproximadamente 95%, a continuación, con aproximadamente 80% y, finalmente, con etanol aproximadamente 70%.
(8)
La muestra se centrifuga durante 7 minutos a temperatura ambiente como en el paso (3). El sobrenadante se desecha y se deja secar el pellet a temperatura ambiente durante aproximadamente 5 minutos.
B.
Aislamiento del ARN con fenol-cloroformo
(1)
Se añaden 400 1l de solución de isotiocianato de guanidina que incluye sarcosina 0,5% y 8 1l de ditiotreitol 1M.
(2)
La muestra se homogeniza a continuación con un homogenizador de tejidos (Ultra-Turrax, IKA-Works, Inc., Wilmington, NC) durante aproximadamente 2 a 3 minutos, mientras se aumenta gradualmente la velocidad de baja velocidad (velocidad 1) a alta velocidad (velocidad 5).
(3)
La muestra se calienta a continuación a aproximadamente 95 °C durante aproximadamente 50-20 minuto s. Es preferente perforar la tapa del tubo que contiene la muestra con una aguja de calibre fino antes de calentar. Como alternativa, la tapa puede ser fijada con una abrazadera de plástico o con una película para laboratorio.
(4)
La muestra se extrae a continuación con 50 1l de acetato de sodio 2M a pH 4,0 y 600 1l de fenol/cloroformo/alcohol isoamílico (10:1,93:0,036), recién preparada mezclando 18 ml de fenol con 3,6 ml de una solución 1:49 de alcohol isoamílico:cloroformo. La solución se agita enérgicamente durante aproximadamente 10 segundos y después se enfría en hielo durante aproximadamente 15 minutos.
(5)
La solución se centrifuga durante aproximadamente 7 minutos a velocidad máxima. La fase superior (acuosa) se transfiere a un tubo nuevo.
(6)
El ARN se precipita con aproximadamente 10 1l de glucógeno y con 400 1l de isopropanol durante 30 minutos a 20 °C.
(7)
El ARN se reúne en un pellet por centrifugación durante aproximadamente 7 minutos en una centrífuga de laboratorio a velocidad máxima; el sobrenadante se decanta y se desecha; y el precipitado se lava con aproximadamente 500 1l de etanol 70 a 75%.
(8)
La muestra se centrifuga nuevamente durante 7 minutos a velocidad máxima. El sobrenadante se decanta y el pellet se seca al aire. El pellet se disuelve a continuación en un tampón apropiado para experimentos adicionales (por ejemplo, 50 1l de Tris cloruro 5 mM Tris, pH 8,0).
Ejemplo 2
Tiempo de calentamiento
Este ejemplo ilustra el efecto del tiempo de calentamiento en el rendimiento del ARN.
Como se ilustra en la Figura 1, el calentamiento de la solución caotrópica a 95 °C antes de la precipi tación y la transcripción reversa aumentó significativamente la eficiencia de la detección de las dianas TS y -actina. Cuando no se incluyó una etapa de calentamiento no pudieron detectarse TS ni -actina (puntos de tiempo 0 min.). Después de 20 minutos a 95 °C ambos transcriptos fueron det ectables; un aumento adicional del tiempo de calentamiento a 60 minutos dio como resultado un aumento de 3 veces en la sensibilidad de la detección para TS y un aumento de 4,5 veces para -actina. (NRT = Control Sin Transcriptasa Reversa, RT-NRT = nivel relativo global de expresión génica, es decir, Transcriptasa Reversa menos Sin Transcriptasa Reversa).
La Figura 2 ilustra la cantidad de expresión de ARN del gen de la -actina en tejido normal (N) y tumoral (T). Las muestras fueron calentadas a 95 °C durante períodos que abarcan de cero a 40 minutos. Se observa un tiempo de calentamiento preferido de aproximadamente 30 minutos para la mayoría de las muestras.
La Figura 3 muestra que a tiempos de calentamiento mayores que aproximadamente 60 minutos, la cantidad de ARN extraído comienza a disminuir, lo que sugiere la degradación térmica del ARN, mientras que la cantidad de ADN extraído comienza a aumentar. Esto no es deseable debido a que la presencia de ADN puede dar una señal de PCR falsa en algunos casos.
Ejemplo 3
Soluciones de calentamiento
Este ejemplo ilustra que el calentamiento de la solución de ARN en presencia de un agente caotrópico es importante para obtener rendimientos elevados de ARN. Este fue un experimento de RT-PCR que utilizó la detección de la expresión de genes de -actina como una medida de las cantidades relativas de ARN aisladas en varias soluciones.
55 E06123097 01-12-2011
Se trataron especímenes clínicos de muestras de tejido FFPE de cáncer de esófago de acuerdo con los procedimientos descritos anteriormente, con la excepción de que el pellet inicial obtenido después de la desparafinación fue disuelto o suspendido en isotiocianato de guanidinio (GITC) 4M, isotiocianato de guanidinio 4M + -mercaptoetanol 100 1M (GITC + BME), isotiocianato de guanidinio 4M + ditiotreitol 20 1M (GITC + DTT) o tampón Tris-Cl (10 mM pH 7,5) o tampón Tris-Cl + DTT 20 1M (Tris/Cl + DTT). Las muestras se calentaron a continuación a 95 °C durante 30 minutos o no se cal entaron (0 min, 95 °C). Las muestras en Tris/Cl fue ron tratadas a continuación con isotiocianato de guanidinio 4M. Los niveles de ARN se determinaron por RT-PCR y detección por PCR en tiempo real de -actina. Como se mostró en la Figura 4, la presencia del agente caotrópico isotiocianato de guanidinio en el calentamiento fue importante para la recuperación de alto rendimiento del ARN. La presencia de un agente reductor, como DTT o BME, no es esencial para la recuperación de alto rendimiento del ARN. La solución de isotiocianato de guanidinio 4M contiene Tris-HCl 50 mM (pH 7,5), EDTA 25 mM y sarcosina 0,5%.
Ejemplo 4
Comparación de valores de expresión génica determinados en tejido FFPE y congelado de los mismos orígenes
Este ejemplo muestra que los procedimientos de la presente invención proporcionan valores de expresión génica de muestras fijadas con formalina e incluidas en parafina equivalentes a los obtenidos a partir de tejido congelado.
Se trataron con FFPE muestras de seis líneas celulares y se realizó la cuantificación de TS utilizando los procedimientos de la invención (incluyendo el calentamiento a 95 °C durante 30 minutos). Los valores d e TS relativos resultantes (Figura 5) se compararon con los obtenidos a partir de pellets de células congeladas usando procedimientos conocidos. Los niveles relativos de expresión de TS fueron 3,0-19,5 (media = 8,5) en las células congeladas versus 3,0-25,0 (media = 9,0) en las muestras FFPE. El análisis estadístico de la diferencia entre las dos medias reveló un valor de p de 0,726, lo que indica que no hay diferencia significativa en los valores de TS obtenidos de pellets de células congeladas utilizando los procedimientos de RT-PCR originales y los obtenidos a partir de pellets de células FFPE utilizando los procedimientos de la invención.
Los niveles de expresión de ARN en muestras de tejidos tumorales y de tejidos normales (no tumorales) también fueron equivalentes independientemente de si las muestras fueron fijadas con formalina e incluidas en parafina o congeladas. Se compararon 5 tejidos de colon normales y 6 tumorales y 4 tejidos tumorales esofágicos en cuanto a la expresión génica relativa de TS en tejido en parafina y congelado (FT) pareado como anteriormente. Los resultados se ilustran en la Figura 6. No se encontró diferencia significativa entre los niveles de TS en muestras de tejido congelado y los valores de TS hallados en muestras FFPE del mismo tejido. Esto fue cierto para los tipos de tejido de colon y de esófago (media de las muestras de colon FT = 3,46, media de las muestras de colon FFPE = 3,06, p = 0,395; media de las muestras de esófago FT = 13,9, media de las muestras de esófago FFPE = 15,93, p = 0,21).
Ejemplo 5
Comparación de niveles de TS en tejidos tumorales respondedor y no respondedor
Correlación de los niveles de TS en muestras de tejido congelado y FFPE pareadas con respuesta a 5FU/leucovorina (LV) en cáncer de colon en estadio IV. Informes anteriores basados en datos de RT-PCR derivados de tejido congelado encontraron que niveles elevados de TS en los tumores (expresión génica relativa � 4,0) eran indicadores de mala respuesta al tratamiento para TS. Los tumores respondedores podían ser caracterizados como aquellos que expresan niveles más bajos de TS. Se determinaron las proporciones de TS/ -actina en secciones en parafina de 17 pacientes cuya respuesta a 5-FU/LV había sido vinculada previamente a la expresión génica de TS a través del análisis de muestras de tejido congelado (Figura 7). De los 17, 6 eran conocidos por ser respondedores a TS y 11 eran conocidos por haber sido poco respondedores al tratamiento para TS. Se halló que los resultados de TS con tejido en parafina pareado también predijeron la respuesta a este tratamiento (media de FT respondedor = 2,87, media de FFPE respondedor = 2,37, p = 0,641: media de FT respondedor = 7,66, media de FFPE no respondedor = 7,84, p = 0,537). No hubo diferencia significativa entre los niveles de TS derivados de tejido congelado y los derivados de tejidos FFPE pareados.
Ejemplo 6
Niveles de expresión génica de TS en cáncer de colon primario y metástasis hepática
Este ejemplo muestra un análisis de TS, y la expresión de otros genes, en un tumor primario de colon y en una metástasis hepática recurrente del mismo paciente.
La Figura 8 muestra los niveles de expresión de cuatro genes: TS; TP; ciclooxigenasa-2 (COX-2); y factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) en muestras de FFPE de un cáncer de colon primario y una metástasis hepática (met) del mismo paciente que recurrió un año más tarde. Los hallazgos sugieren que, si bien el tumor primario fue sensible a la terapia con 5-FU (TS = 2.32), la metástasis será refractaria (TS met 11,58). Los niveles de expresión de COX-2 y VEGF se correlacionan con las indicaciones publicadas en que su expresión se incrementa en la enfermedad agresiva, y son co-regulados. (Cox-2 primario = 1,35; COX-2 met = 5,4; VEGF primario = 5,02;
E06123097 01-12-2011
VEGF met = 14,4). Se aisló el ARN como se describe a partir de una sección de 5 1m FFPE del cáncer de colon primario y de una sección FFPE de la metástasis hepática. La expresión relativa del gen de TS en el tumor primario respondedor fue de 2,32 comparado con 11,58 en la enfermedad metastásica (Figura 8). Este aumento de 5 veces en la expresión de TS, según lo determinado por los procedimientos de RT-PCR informados en la presente memoria, indica que la enfermedad secundaria no responderá al 5-FU y sugiere que un tratamiento alternativo como CPT-11 puede ser apropiado.
Referencias
Ardalan, B. and Dang, Z. (1996) Proc. Annu. Meet. Am. Assoc. Cancer Res. 37:A1376.
Ausubel, F. M. et al., “Current Protocols In Molecular Biology”, John Wiley & Sons, Inc., vol. 1, pp. 2.2.1-2.4.5 (1994).
Bannerjee, S.K., Makdisi, W.F., Weston, A.P., Mitchell, S.M., and Campbell, D.R. (1995) Biotechniques, 18:768-773.
Chomczynski et al., “Single-Step Method of RNA Isolation by Acid Guanidinium Thiocyanate-Phenol- Chloroform Extraction,” Analytical Biochemistry, 162:156-159 (1987).
Eads, C.A., Danenberg, K.D., Kawakami, K., Saltz, L.B., Danenberg, P.V. and Laird, P.W. (1999) CpG island hypermethylation in humancolorectal tumors is not associated with DNA methyltransferse overexpression. Cancer Res., 59: 2302-2306.
Farrugia, D. Cunningham D. Danenberg P. Danenberg K. Metzger R. Mitchell F. MacVicar D. McCarthy K. Aherne GW. Norman A. Jackman AL. (1997) Proc. Annu. Meet Am. Assoc. Cancer Res. 38:A4132.
Heid, C.A., Stevens, J., Livak, K.J. and Williams, P.M. (1996) Real-time quantitative PCR. Genome Res. 6:986-994.
Horikoshi, T., Danenberg, K.D., Stadlbauer, T.H.W., Volkenandt, M., Shea,L.L.C., Aigner, K., Gustavsson, B., Leichman, L., Frösing, R., Ray, M.,Gibson, N.W., Spears, C.P. and Danenberg, P.V. Quantitation of thymidylate synthase, dihydrofolate reductase, and DT-diaphorase gene expression in human tumors using the polymerase chain reaction. Cancer Res., 52: 108-116, 1992.
Jackman, A.L., Jones, T.R., Calvert, A.H. Experimental and Clinical Progress in Cancer Chemotherapy (F.M. Muggia ED.) Martinus Nijhoff, Boston (1985).
Johnston, P.G., Lenz, H.J., Leichman, C.G., Danenberg, K.D., Allegra, C.J., Danenberg, P.V., Leichman, L. (1995) Cancer Research 55:1407-1412.
Leichman, C.G., Lenz, H.J., Leichman, L., Danenberg, K., Baranda, J., Groshen, S., Boswell, W., Metzger, R., Tan, M., Danenberg, P.V. (1997) J. Clinical Oncology. 15(10):3223-9.
Lenz, H.J., Danenberg, K.D., Leichman, C.G., Florentine, B., Johnston, P.G., Groshen, S., Zhou, L., Xiong, Y.P., Danenberg, P.V. and Leichman, L.P. (1998) Clinical Cancer Research. 4(5):1227-34.
Sambrook, J. et al., “Molecular Cloning”, Cold Spring Harbor Press, 2nd Ed., pp. 9.14-9.23 (1989).
Spears, C. P., Shahinian, A. H., Moran, R. G., Heidelberger, C., and Corbett, T. H. (1982) Cancer Res. 42, 450-456; Keyomarsi, K., and Moran, R. G. (1988) J. Biol. Chem. 263, 14402-14409.
Swain, S. M., Lippman, M. E., Egan, E. F., Drake, J. C., Steinberg, S. M., and Allegra, C. J. (1989) J. Clin. Oncol. 7, 890-899.
45 E06123097 01-12-2011

Claims (23)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un procedimiento para la recuperación de ARN de una muestra de tejido fijada con formalina e incluida en parafina, que comprende:
    calentar la muestra en una solución caotrópica que comprende una concentración efectiva de un agente caotrópico a una temperatura en el intervalo de aproximadamente 50 a aproximadamente 100 °C durante un período de tiempo de aproximadamente 5 a aproximadamente 120 minutos; y
    recuperar dicho ARN a partir de dicha solución caotrópica,
    en la que la solución caotrópica es urea, formamida, yoduro de potasio y tiocianato de potasio.
  2. 2.
    El procedimiento de la reivindicación 1, que comprende además desparafinar la muestra.
  3. 3.
    El procedimiento de cualquier reivindicación precedente que comprende además rehidratar la muestra antes del calentamiento.
  4. 4.
    El procedimiento de cualquier reivindicación precedente que comprende además homogeneizar dicha muestra antes del calentamiento.
  5. 5.
    El procedimiento de cualquier reivindicación 1 a 4 para la recuperación de ARN a partir de una muestra de tejido biológico en la que dicho ARN es recuperado por extracción a partir de dicha solución caotrópica con un disolvente orgánico insoluble en agua.
  6. 6.
    El procedimiento de la reivindicación 5 en el que dicho disolvente orgánico insoluble en agua consiste esencialmente de cloroformo.
  7. 7.
    El procedimiento de la reivindicación 6 que además comprende purificar dicho ARN.
  8. 8.
    El procedimiento de la reivindicación 7 en el que dicho ARN es purificado por precipitación con etanol.
  9. 9.
    El procedimiento de cualquier reivindicación precedente en el que dicho período de tiempo es de aproximadamente 10 a aproximadamente 60 minutos.
  10. 10.
    El procedimiento de cualquier reivindicación precedente en el que dicho período de tiempo es de aproximadamente 30 a aproximadamente 60 minutos.
  11. 11.
    El procedimiento de cualquier reivindicación precedente en el que dicha temperatura está en el intervalo de aproximadamente 75 a aproximadamente 100 °C.
  12. 12.
    El procedimiento de cualquier reivindicación precedente en el que dicha temperatura está en el intervalo de aproximadamente 85 a aproximadamente 100 °C.
  13. 13.
    El procedimiento de cualquier reivindicación precedente en el que dicha solución caotrópica tiene un pH de aproximadamente 3-6.
  14. 14.
    El procedimiento de la reivindicación 13 en el que dicha solución caotrópica tiene un pH de aproximadamente 4.
  15. 15.
    El procedimiento de cualquier reivindicación precedente en el que dicha solución caotrópica comprende además un agente reductor.
  16. 16.
    El procedimiento de la reivindicación 15 en el que dicho agente reductor se selecciona de -mercaptoetanol y ditiotreitol.
  17. 17.
    El procedimiento de cualquier reivindicación precedente en el que dicho ARN se utiliza para determinar el nivel de expresión de un gen diana.
  18. 18.
    El procedimiento de cualquier reivindicación precedente en el que dicho ARN es además sometido a un procedimiento seleccionado del grupo que consiste de transcripción reversa, transcripción reversa y reacción en cadena de la polimerasa, electroforesis, cromatografía, hibridación con una sonda de ácido nucleico, y fragmentación.
  19. 19.
    El procedimiento de la reivindicación 18, en el que el ARN se somete a transcripción reversa y el ADNc así producido es marcado.
  20. 20.
    El procedimiento de la reivindicación 19, en el que el ADNc marcado se utiliza en un chip génico o un análisis de microarreglos.
  21. 21.
    Un procedimiento para la medición cuantitativa de la expresión génica de genes diana que comprende la recuperación de ARN mediante un procedimiento como el reivindicado en cualquier reivindicación precedente, que comprende además:
    convertir el ARN purificado a ADNc mediante una reacción de transcripción reversa;
    5 someter el ADNc a una reacción de PCR en una solución de reacción en cadena de la polimerasa que comprende una sonda de oligonucleótidos adecuada para amplificar al menos una secuencia específica, una polimerasa y un fluorocromo;
    medir el cambio que se produce en la intensidad de la fluorescencia como resultado de la reacción de PCR; y
    10 determinar, sobre la base del cambio en la intensidad de la fluorescencia, la cantidad de un ácido nucleico que tiene una secuencia específica presente en la muestra.
  22. 22. Un procedimiento para determinar el nivel de expresión de un gen diana en una muestra de tejido fijada incluida en parafina que comprende:
    desparafinar la muestra de tejido para obtener una muestra desparafinada;
    15 aislar el ARNm de la muestra desparafinada calentando primero la muestra de tejido desparafinada en una solución que comprende una concentración efectiva de un agente caotrópico a una temperatura en el intervalo de 50 a 100 °C y recuperar dicho ARNm de d icha solución; y
    determinar la cantidad de ARNm de un gen diana en relación con la cantidad de ARNm de un gen de control interno.
    20 23. El procedimiento de la reivindicación 22 en el que el gen de control interno es -actina.
  23. 24. El procedimiento de la reivindicación 22 en el que el gen diana es Timidilato Sintasa (TS).
ES06123097T 1999-12-20 2000-10-31 Procedimiento para el aislamiento de arn a partir de especímenes de tejido fijados con formalina e incluidos en parafina. Expired - Lifetime ES2373149T3 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US469338 1995-06-06
US09/469,338 US6248535B1 (en) 1999-12-20 1999-12-20 Method for isolation of RNA from formalin-fixed paraffin-embedded tissue specimens

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2373149T3 true ES2373149T3 (es) 2012-01-31

Family

ID=23863395

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES06123097T Expired - Lifetime ES2373149T3 (es) 1999-12-20 2000-10-31 Procedimiento para el aislamiento de arn a partir de especímenes de tejido fijados con formalina e incluidos en parafina.

Country Status (20)

Country Link
US (8) US6248535B1 (es)
EP (3) EP2363477A3 (es)
JP (1) JP2003525033A (es)
KR (1) KR100723328B1 (es)
CN (2) CN1269959C (es)
AR (1) AR027036A1 (es)
AT (2) ATE523590T1 (es)
AU (2) AU784565C (es)
BR (1) BR0016569A (es)
CA (1) CA2394618C (es)
DE (1) DE60032634T2 (es)
DK (1) DK1743939T3 (es)
EA (2) EA006827B1 (es)
ES (1) ES2373149T3 (es)
HK (2) HK1055446A1 (es)
IL (2) IL150116A0 (es)
MX (1) MXPA02006145A (es)
NO (1) NO330802B1 (es)
TW (1) TWI277652B (es)
WO (1) WO2001046402A1 (es)

Families Citing this family (209)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6793890B2 (en) 1997-08-20 2004-09-21 The University Of Miami Rapid tissue processor
DK1005633T3 (da) * 1997-08-20 2008-12-15 Univ Miami Vævsfikserings-dehydratiserings-fedtfjernelses-imprægneringsmetode med höj kvalitet og kontinuerligt gennemlöb
US6960439B2 (en) 1999-06-28 2005-11-01 Source Precision Medicine, Inc. Identification, monitoring and treatment of disease and characterization of biological condition using gene expression profiles
US6248535B1 (en) * 1999-12-20 2001-06-19 University Of Southern California Method for isolation of RNA from formalin-fixed paraffin-embedded tissue specimens
US20060166227A1 (en) * 2000-06-20 2006-07-27 Stephen Kingsmore Protein expression profiling
US6582919B2 (en) 2001-06-11 2003-06-24 Response Genetics, Inc. Method of determining epidermal growth factor receptor and HER2-neu gene expression and correlation of levels thereof with survival rates
US6602670B2 (en) * 2000-12-01 2003-08-05 Response Genetics, Inc. Method of determining a chemotherapeutic regimen based on ERCC1 expression
US7049059B2 (en) 2000-12-01 2006-05-23 Response Genetics, Inc. Method of determining a chemotherapeutic regimen based on ERCC1 and TS expression
US6518416B1 (en) 2000-12-01 2003-02-11 Response Genetics, Inc. Method of determining a chemotherapeutic regimen based on ERCC1 expression
ES2394630T3 (es) * 2000-12-01 2013-02-04 Response Genetics, Inc. Método de determinación de la expresión génica del receptor del factor de crecimiento epidérmico y HER2-NEU y niveles de correlación de la misma con las tasas de supervivencia
US20020142328A1 (en) 2000-12-01 2002-10-03 Danenberg Kathleen D. Method of determining a chemotherapeutic regimen by assaying gene expression in primary tumors
US6956111B2 (en) 2001-03-02 2005-10-18 Response Genetics, Inc. Method of determining dihydropyrimidine dehydrogenase gene expression
US6686155B2 (en) * 2001-06-14 2004-02-03 Response Genetics, Inc. Method of determining a chemotherapeutic regimen based on glutathione-S-transferase pi expression
US20040091857A1 (en) * 2001-07-20 2004-05-13 Nallur Girish N. Gene expression profiling
ES2636974T3 (es) * 2001-10-12 2017-10-10 Becton, Dickinson And Company Aparato de tipo cesta para el transporte de muestras biológicas
JP4213588B2 (ja) * 2001-10-12 2009-01-21 ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニー 生体試料を輸送する方法及び装置
KR20040064275A (ko) 2001-11-09 2004-07-16 소스 프리시전 메디슨, 인코포레이티드 유전자 발현 프로파일을 이용한 질병의 동정, 모니터링,치료 및 생물학적 상태의 확인
US7553619B2 (en) * 2002-02-08 2009-06-30 Qiagen Gmbh Detection method using dissociated rolling circle amplification
JP2005519624A (ja) * 2002-03-13 2005-07-07 ジェノミック ヘルス， インコーポレイテッド 生検腫瘍組織での遺伝子発現プロファイリング
US7662553B2 (en) 2002-07-31 2010-02-16 University Of Southern California Polymorphisms in the ERCC1 gene for predicting treatment outcome
US7364846B2 (en) 2002-10-11 2008-04-29 Molecular Devices Corporation Gene expression profiling from FFPE samples
CN100374576C (zh) * 2002-10-11 2008-03-12 阿克丘勒斯生物科学股份有限公司 来自ffpe样品的基因表达分布图
EP1572105B1 (en) * 2002-11-14 2011-08-31 John Wayne Cancer Institute Detection of micro metastasis of melanoma and breast cancer in paraffin-embedded tumor draining lymph nodes by multimaker quantitative rt-pcr
US8039218B2 (en) * 2002-11-14 2011-10-18 John Wayne Cancer Institute Detection of cancer cells in body fluids
JP4606879B2 (ja) 2002-11-15 2011-01-05 ジェノミック ヘルス， インコーポレイテッド Ｅｇｆｒ陽性癌の遺伝子発現プロファイリング
US9487823B2 (en) 2002-12-20 2016-11-08 Qiagen Gmbh Nucleic acid amplification
US20040231909A1 (en) 2003-01-15 2004-11-25 Tai-Yang Luh Motorized vehicle having forward and backward differential structure
EP1597391B1 (en) * 2003-02-20 2008-10-29 Genomic Health, Inc. Use of intronic rna to measure gene expression
ES2428941T3 (es) * 2003-03-10 2013-11-12 Expression Pathology, Inc. Preparación líquida de tejidos a partir de muestras biológicas, tejidos y células procesadas histopatológicamente
US8043834B2 (en) 2003-03-31 2011-10-25 Qiagen Gmbh Universal reagents for rolling circle amplification and methods of use
US7267950B2 (en) * 2003-05-01 2007-09-11 Veridex, Lcc Rapid extraction of RNA from cells and tissues
AU2004248140A1 (en) * 2003-05-30 2004-12-23 Cedars-Sinai Medical Center Gene expression markers for response to EGFR inhibitor drugs
US20040248103A1 (en) * 2003-06-04 2004-12-09 Feaver William John Proximity-mediated rolling circle amplification
PL3470535T3 (pl) * 2003-06-24 2020-08-24 Genomic Health, Inc. Prognozowanie prawdopodobieństwa ponownego wystąpienia raka
US7526387B2 (en) 2003-07-10 2009-04-28 Genomic Health, Inc. Expression profile algorithm and test for cancer prognosis
US8062897B2 (en) 2003-07-21 2011-11-22 Aureon Laboratories, Inc. Diagnostic histopathology using multiplex gene expression FISH
CN1878866B (zh) * 2003-07-25 2012-08-01 安比恩股份有限公司 用于从固定的样品中制备rna的方法和组合物
US20050059024A1 (en) 2003-07-25 2005-03-17 Ambion, Inc. Methods and compositions for isolating small RNA molecules
US20050042660A1 (en) * 2003-07-31 2005-02-24 Hall Gerald Edward Devices and methods for isolating RNA
EP2216415B2 (en) * 2003-08-01 2017-01-04 Life Technologies Corporation Methods for preparing short RNA molecules
EP1678327A4 (en) * 2003-10-16 2007-10-10 Genomic Health Inc QRT-PCR TEST SYSTEM FOR GENE EXPRESSION PROFILING
US7470401B2 (en) * 2003-10-24 2008-12-30 The University Of Miami Simplified tissue processing
MXPA06005424A (es) 2003-11-13 2007-01-25 Univ Georgia Res Found Metodos para caracterizar virus de enfermedad bursal infecciosa.
DE602004031368D1 (de) * 2003-12-23 2011-03-24 Genomic Health Inc Universelle vervielfältigung von fragmentierter rns
US7871769B2 (en) 2004-04-09 2011-01-18 Genomic Health, Inc. Gene expression markers for predicting response to chemotherapy
US7794932B2 (en) 2004-04-16 2010-09-14 Piotr Chomczynski Reagents and methods for isolation of purified RNA
CA2563613A1 (en) * 2004-04-16 2005-12-08 Wei-Sing Chu Device for extracting biological molecules from tissue specimens
US20050239055A1 (en) * 2004-04-22 2005-10-27 Mariani Brian D Enterovirus primers and probes
US7332597B2 (en) * 2004-06-28 2008-02-19 University Of Kentucky Research Foundation Primers and probe to identify mycobacterium tuberculosis complex
WO2006012361A2 (en) 2004-07-01 2006-02-02 University Of Southern California Genetic markers for predicting disease and treatment outcome
US20060099605A1 (en) * 2004-11-11 2006-05-11 Hall Gerald E Jr Devices and methods for isolating RNA
DE102004047772B4 (de) * 2004-09-30 2018-12-13 Infineon Technologies Ag Lateraler Halbleitertransistor
WO2006039563A2 (en) 2004-09-30 2006-04-13 Epigenomics Ag Method for providing dna fragments derived from an archived sample
CA3061785A1 (en) * 2004-11-05 2006-05-18 Genomic Health, Inc. Predicting response to chemotherapy using gene expression markers
CA2585561C (en) * 2004-11-05 2018-07-17 Genomic Health, Inc. Esr1, pgr, bcl2 and scube2 group score as indicators of breast cancer prognosis and prediction of treatment response
US20060141481A1 (en) * 2004-12-27 2006-06-29 Mariani Brian D HSV-1 and HSV-2 primers and probes
US7541144B2 (en) * 2005-01-31 2009-06-02 Agilent Technologies, Inc. RNA labeling method
US8309303B2 (en) 2005-04-01 2012-11-13 Qiagen Gmbh Reverse transcription and amplification of RNA with simultaneous degradation of DNA
US7449297B2 (en) * 2005-04-14 2008-11-11 Euclid Diagnostics Llc Methods of copying the methylation pattern of DNA during isothermal amplification and microarrays
KR20080026093A (ko) * 2005-05-04 2008-03-24 유니버시티 오브 사우스 플로리다 암 환자의 치료 반응을 예측하는 방법
US20060270843A1 (en) * 2005-05-26 2006-11-30 Hall Gerald E Jr Methods for isolation of nucleic acids
US20060269929A1 (en) * 2005-05-26 2006-11-30 Hall Gerald E Jr Methods and kits for DNA purification on polymeric membranes at low ionic strength
US7544471B2 (en) 2005-07-30 2009-06-09 Agilent Technologies, Inc. Preparing RNA from a wax-embedded tissue specimen
US20070054168A1 (en) * 2005-09-06 2007-03-08 Hao Chang Zinc/air cell
EP1762627A1 (de) 2005-09-09 2007-03-14 Qiagen GmbH Verfahren zur Aktivierung einer Nukleinsäure für eine Polymerase-Reaktion
EP1777291A1 (en) * 2005-10-20 2007-04-25 Fundacion para la Investigacion Clinica y Molecular del Cancer de Pulmon Method for the isolation of mRNA from formalin fixed, paraffin-embedded tissue
US20070092883A1 (en) * 2005-10-26 2007-04-26 De Luwe Hoek Octrooien B.V. Methylation specific multiplex ligation-dependent probe amplification (MS-MLPA)
DE102005060738A1 (de) * 2005-12-16 2007-06-21 Qiagen Gmbh Verfahren zur Extraktion von Biomolekülen aus fixierten Geweben
CN100366632C (zh) * 2005-12-28 2008-02-06 南方医科大学 一种石蜡包埋组织提取蛋白质的方法
JP2010508512A (ja) * 2006-10-27 2010-03-18 ジョージ メイソン インテレクチュアル プロパティーズ，インコーポレイテッド オブ フェアファックス，バージニア 転移性結腸直腸癌のアッセイ
EP2147119B1 (en) * 2007-05-03 2011-05-25 Roche Diagnostics GmbH SINGLE-CELL mRNA QUANTIFICATION WITH REAL-TIME RT-PCR
WO2008157316A1 (en) * 2007-06-14 2008-12-24 Creighton University Improved method for rna isolation
ES2401475T3 (es) * 2007-06-15 2013-04-19 University Of South Florida Métodos de diagnóstico y tratamiento del cáncer
EP2173874A2 (en) 2007-06-22 2010-04-14 Response Genetics, Inc Methods for isolating long fragment rna from fixed samples
CA2704499C (en) 2007-11-07 2020-03-10 Genentech, Inc. Methods and compositions for assessing responsiveness of b-cell lymphoma to treatment with anti-cd40 antibodies
US9051603B2 (en) * 2008-04-15 2015-06-09 Universität Bern Method for optimized isolation of RNA from fixed tissue
US20090298172A1 (en) 2008-05-28 2009-12-03 Steven Paul Wheeler Histological specimen treatment apparatus and method
DE102008029356A1 (de) * 2008-06-20 2009-12-24 Siemens Healthcare Diagnostics Gmbh Verfahren zur Aufreinigung von Nukleinsäuren, insbesondere aus fixiertem Gewebe
WO2010012464A1 (en) * 2008-08-01 2010-02-04 Roche Diagnostics Gmbh Improved lysis and reverse transcription for mrna quantification
US8288122B2 (en) * 2008-12-03 2012-10-16 The United States Of America As Represented By The Department Of Veterans Affairs Pressure-assisted molecular recovery (PAMR) of biomolecules, pressure-assisted antigen retrieval (PAAR), and pressure-assisted tissue histology (PATH)
EP2193831A1 (de) 2008-12-05 2010-06-09 Qiagen GmbH Parallel-Extraktion von unterschiedlichen Biomolekülen aus Formalin-fixiertem Gewebe
DE102008061714A1 (de) 2008-12-12 2010-06-17 Siemens Healthcare Diagnostics Inc., Deerfield Verfahren zur Aufreinigung von Nukleinsäuren, inbesondere aus fixiertem Gewebe
US8846878B1 (en) 2009-01-23 2014-09-30 Cubrc Corporation Method and device for isolating a protein sample
EP2210936A1 (en) * 2009-01-27 2010-07-28 Curetis AG Processing and analysis of viscous liquid biological samples
BRPI1011394A8 (pt) * 2009-04-18 2018-06-26 Genentech Inc método para avaliação de responsividade de linforma de células b ao tratamento com anticorpos anti-cd40
WO2010123626A1 (en) 2009-04-24 2010-10-28 University Of Southern California Cd133 polymorphisms and expression predict clinical outcome in patients with cancer
DE102009031434B4 (de) 2009-07-01 2015-03-05 Axagarius Gmbh & Co. Kg Verwendung eines Kits für die Isolierung von Biomolekülen aus biologischen Proben sowie Kit hierfür
DK2480660T5 (da) 2009-09-23 2020-11-09 Danisco Us Inc Hidtil ukendte glycosylhydrolaseenzymer og anvendelser heraf
US8329360B2 (en) 2009-12-04 2012-12-11 Taiwan Semiconductor Manufacturing Company, Ltd. Method and apparatus of providing overlay
JP2013515482A (ja) 2009-12-23 2013-05-09 ダニスコ・ユーエス・インク 同時糖化発酵反応の効率を改善するための方法
EP2521778B1 (en) * 2010-01-04 2014-03-19 QIAGEN Gaithersburg, Inc. Methods, compositions, and kits for recovery of nucleic acids or proteins from fixed tissue samples
DK2539449T3 (en) 2010-02-26 2018-08-06 Qiagen Gmbh PROCEDURE FOR PARALLEL ISOLATION AND CLEANING RNA AND DNA
US20190300945A1 (en) 2010-04-05 2019-10-03 Prognosys Biosciences, Inc. Spatially Encoded Biological Assays
US10787701B2 (en) 2010-04-05 2020-09-29 Prognosys Biosciences, Inc. Spatially encoded biological assays
WO2011124705A1 (en) 2010-04-08 2011-10-13 Qiagen Gmbh Method for isolating and purifying nucleic acids
EP2556158B1 (en) 2010-04-08 2019-12-18 Qiagen GmbH Chromatographic device and method for isolating and purifying nucleic acids
CN102869790B (zh) 2010-04-12 2014-11-26 反应遗传有限公司 Kras引物和探针
EP2388324A1 (de) * 2010-05-20 2011-11-23 Siemens Healthcare Diagnostics Inc. Kontrollmaterial für Nukleinsäureteste
EP2395082A1 (en) * 2010-06-14 2011-12-14 QIAGEN GmbH Extraction of nucleic acids from wax-embedded samples
EP2627984B1 (en) * 2010-10-12 2017-08-16 Life Technologies Corporation Method of preparing quality control material for ffpe
KR101420094B1 (ko) * 2010-10-27 2014-07-17 (주)바이오니아 다양한 생체시료분석을 위한 전자동실시간정량증폭장비, 다양한 생체시료분석을 위한 자동정제 및 반응준비 장치, 전자동 핵산정제 및 실시간 정량 유전자증폭 방법, 전자동 핵산정제방법, 실시간정량ｐｃｒ을 이용한 병원균의 전자동 생균수검사방법, 정량면역ｐｃｒ을 이용한 전자동 항원농도획득방법 및 타겟항원에 라벨링된 부착용 타겟핵산의 정제방법
TWI425977B (zh) 2010-11-24 2014-02-11 Ind Tech Res Inst 將福馬林固定石蠟包埋之組織進行脫蠟的方法與其套組
EP2468862A1 (en) * 2010-12-23 2012-06-27 Qiagen GmbH Method and kit for processing wax-embedded biological samples
CN102146112B (zh) * 2011-01-25 2013-07-10 天根生化科技（北京）有限公司 从福尔马林固定石蜡包埋组织中提取脱氧核糖核酸的方法
WO2012117294A2 (en) * 2011-02-28 2012-09-07 Dako Denmark A/S Two phase immiscible system for the pretreatment of embedded biological samples
CN102181431B (zh) * 2011-03-11 2012-12-26 大连医科大学 从石蜡包埋组织中提取总rna的方法
CN103842515A (zh) 2011-03-17 2014-06-04 丹尼斯科美国公司 降低糖化过程的粘度的方法
WO2012135125A1 (en) * 2011-03-28 2012-10-04 Geron Corporation Telomere length measurement in formalin-fixed, paraffin embedded (ffpe) samples by quantitative pcr
GB201106254D0 (en) 2011-04-13 2011-05-25 Frisen Jonas Method and product
EP2744916A4 (en) 2011-07-13 2015-06-17 Primeradx Inc MULTIMODAL METHODS FOR SIMULTANEOUS DETECTION AND QUANTIFICATION OF MULTIPLE NUCLEIC ACIDS IN A SAMPLE
FR2982278A1 (fr) 2011-11-03 2013-05-10 Assist Publ Hopitaux De Paris Procede de classification d'echantillons de tissus fixes et inclus en paraffine
WO2013074927A1 (en) * 2011-11-16 2013-05-23 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Method for isolating total rna from cells
JP2014533952A (ja) 2011-11-17 2014-12-18 リーアニクス・インコーポレイテッドＲｈｅｏｎｉｘ， Ｉｎｃ． 微小流体装置、方法および応用
CN103571824B (zh) 2012-08-09 2016-04-13 财团法人工业技术研究院 用于分离核酸的组合物及方法
US10233440B2 (en) 2012-09-28 2019-03-19 Cepheid Methods for DNA and RNA extraction from fixed paraffin-embedded tissue samples
CN104884625A (zh) 2012-10-15 2015-09-02 先锋国际良种公司 增强cry内毒素的活性的方法和组合物
WO2014071182A1 (en) 2012-11-01 2014-05-08 Massachusetts Institute Of Technology Directed evolution of synthetic gene cluster
EP2730653A1 (en) 2012-11-07 2014-05-14 QIAGEN GmbH Method for lysing a fixed biological sample
US9200327B2 (en) 2012-11-30 2015-12-01 Geron Corporation Diagnostic markers for treating cell proliferative disorders with telomerase inhibitors
MX369750B (es) 2013-03-14 2019-11-20 Pioneer Hi Bred Int Composiciones y metodos para controlar plagas de insectos.
EP2971000A4 (en) 2013-03-15 2016-11-23 Pioneer Hi Bred Int PHI-4 POLYPEPTIDES AND METHOD FOR THEIR USE
KR101748867B1 (ko) * 2013-04-19 2017-06-20 주식회사 젠큐릭스 조기 유방암 예후 예측 진단용 자동화 시스템
EP3013984B1 (en) 2013-06-25 2023-03-22 Prognosys Biosciences, Inc. Methods for determining spatial patterns of biological targets in a sample
US10006045B2 (en) 2013-08-16 2018-06-26 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Insecticidal proteins and methods for their use
CA3175967A1 (en) 2013-09-13 2015-03-19 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Insecticidal proteins and methods for their use
WO2015120270A1 (en) 2014-02-07 2015-08-13 Pioneer Hi Bred International, Inc. Insecticidal proteins and methods for their use
CA2939156A1 (en) 2014-02-07 2015-08-13 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Insecticidal proteins and methods for their use
WO2016000237A1 (en) 2014-07-03 2016-01-07 Pioneer Overseas Corporation Plants having enhanced tolerance to insect pests and related constructs and methods involving insect tolerance genes
WO2016044092A1 (en) 2014-09-17 2016-03-24 Pioneer Hi Bred International Inc Compositions and methods to control insect pests
CN113372421A (zh) 2014-10-16 2021-09-10 先锋国际良种公司 杀昆虫蛋白及其使用方法
DE102014118532B4 (de) 2014-12-12 2017-03-23 Axagarius Gmbh & Co. Kg Vorrichtung mit einer Filterschicht und Verfahren zur Gewinnung von Nukleinsäuren aus Formalin-fixierten und in Paraffin eingebetteten Proben
WO2016109799A2 (en) * 2014-12-31 2016-07-07 The Rockefeller University Method of rna isolation from clinical samples
CN107529763B (zh) 2015-03-11 2021-08-20 先锋国际良种公司 Pip-72的杀昆虫组合及使用方法
EP3901282B1 (en) 2015-04-10 2023-06-28 Spatial Transcriptomics AB Spatially distinguished, multiplex nucleic acid analysis of biological specimens
US10365189B2 (en) 2015-05-07 2019-07-30 Steven Wheeler Histological specimen treatment
CN116333064A (zh) 2015-05-19 2023-06-27 先锋国际良种公司 杀昆虫蛋白及其使用方法
EA033170B1 (ru) * 2015-05-21 2019-09-30 Государственное Учреждение Образования "Белорусская Медицинская Академия Последипломного Образования" (Гуо "Белмапо") Способ определения экспрессии гена gstm1 в образцах из парафин-фиксированных срезов опухолевой ткани молочной железы
US10647995B2 (en) 2015-06-16 2020-05-12 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Compositions and methods to control insect pests
KR102461443B1 (ko) 2015-07-13 2022-10-31 피벗 바이오, 인크. 식물 형질 개선을 위한 방법 및 조성물
AU2016298048B2 (en) 2015-07-24 2022-08-04 Cepheid Compositions and methods for DNA and RNA extraction from tissue samples
US11198709B2 (en) 2015-08-06 2021-12-14 E. I. Du Pont De Nemours And Company Plant derived insecticidal proteins and methods for their use
CA2992488A1 (en) 2015-08-28 2017-03-09 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Ochrobactrum-mediated transformation of plants
US11479516B2 (en) 2015-10-05 2022-10-25 Massachusetts Institute Of Technology Nitrogen fixation using refactored NIF clusters
KR101749419B1 (ko) 2015-10-15 2017-07-03 주식회사 어큐진 파라핀포매된 샘플로부터 dna를 추출하는 방법
RU2743169C2 (ru) 2015-11-06 2021-02-15 Вентана Медикал Системз, Инк. Репрезентативная диагностика
EP3390431A1 (en) 2015-12-18 2018-10-24 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Insecticidal proteins and methods for their use
US11781151B2 (en) 2016-04-14 2023-10-10 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Insecticidal CRY1B variants having improved activity spectrum and uses thereof
CA3021391A1 (en) 2016-04-19 2017-10-26 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Insecticidal combinations of polypeptides having improved activity spectrum and uses thereof
MX2018013249A (es) 2016-05-04 2019-02-13 Pioneer Hi Bred Int Proteinas insecticidas y metodos para sus usos.
US20190185867A1 (en) 2016-06-16 2019-06-20 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Compositions and methods to control insect pests
CN116334123A (zh) 2016-06-24 2023-06-27 先锋国际良种公司 植物调节元件及其使用方法
US11155829B2 (en) 2016-07-01 2021-10-26 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Insecticidal proteins from plants and methods for their use
WO2018013333A1 (en) 2016-07-12 2018-01-18 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Compositions and methods to control insect pests
US11021716B2 (en) 2016-11-01 2021-06-01 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Insecticidal proteins and methods for their use
CA3044404A1 (en) 2016-12-14 2018-06-21 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Insecticidal proteins and methods for their use
WO2018118811A1 (en) 2016-12-22 2018-06-28 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Insecticidal proteins and methods for their use
JP6877550B2 (ja) * 2016-12-22 2021-05-26 ヴェンタナ メディカル システムズ， インク． 組織試料用の全自動核酸抽出方法
CA3049258A1 (en) 2017-01-12 2018-07-19 Pivot Bio, Inc. Methods and compositions for improving plant traits
WO2018140214A1 (en) 2017-01-24 2018-08-02 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Nematicidal protein from pseudomonas
US20190390219A1 (en) 2017-02-08 2019-12-26 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Insecticidal combinations of plant derived insecticidal proteins and methods for their use
BR112019024827A2 (pt) 2017-05-26 2020-06-16 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Construto de dna, planta transgênica ou progênie da mesma, composição e método para controlar uma população de pragas de insetos
CN107271239A (zh) * 2017-07-06 2017-10-20 浙江大学 一种溶解石蜡组织切片的方法及应用
US20200165626A1 (en) 2017-10-13 2020-05-28 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Virus-induced gene silencing technology for insect control in maize
EP3701040A4 (en) 2017-10-25 2021-08-25 Pivot Bio, Inc. METHODS AND COMPOSITIONS FOR IMPROVING GENETICALLY MODIFIED MICROBES THAT BIND NITROGEN
KR20200123144A (ko) 2018-02-22 2020-10-28 지머젠 인코포레이티드 바실러스가 농축된 게놈 라이브러리를 생성하고 새로운 cry 독소를 동정하기 위한 방법
WO2019169150A1 (en) 2018-03-02 2019-09-06 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Plant health assay
AR114446A1 (es) 2018-03-02 2020-09-09 Zymergen Inc Plataforma de descubrimiento de proteínas insecticidas, y proteínas insecticidas descubiertas a partir de la misma
BR112020023800A2 (pt) 2018-05-22 2021-02-23 Pioneer Hi-Bred International, Inc. elementos reguladores de planta e métodos de uso dos mesmos
EP3814302A4 (en) 2018-06-27 2022-06-29 Pivot Bio, Inc. Agricultural compositions comprising remodeled nitrogen fixing microbes
AU2019332792A1 (en) 2018-08-29 2021-01-28 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Insecticidal proteins and methods for their use
SG11202105824RA (en) 2018-12-10 2021-06-29 10X Genomics Inc Imaging system hardware
US11649485B2 (en) 2019-01-06 2023-05-16 10X Genomics, Inc. Generating capture probes for spatial analysis
US11926867B2 (en) 2019-01-06 2024-03-12 10X Genomics, Inc. Generating capture probes for spatial analysis
EP3976820A1 (en) 2019-05-30 2022-04-06 10X Genomics, Inc. Methods of detecting spatial heterogeneity of a biological sample
CN110376036A (zh) * 2019-07-30 2019-10-25 河南赛诺特生物技术有限公司 一种肿瘤细胞系免疫组化对照品的制备方法及肿瘤细胞系免疫组化对照品
CN110361242B (zh) * 2019-08-14 2022-01-18 武汉赛维尔生物科技有限公司 一种用于眼球组织的固定液以及眼球组织制片的预处理方法
WO2021076346A1 (en) 2019-10-18 2021-04-22 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Maize event dp-202216-6 and dp-023211-2 stack
EP4025711A2 (en) 2019-11-08 2022-07-13 10X Genomics, Inc. Enhancing specificity of analyte binding
EP3891300B1 (en) 2019-12-23 2023-03-29 10X Genomics, Inc. Methods for spatial analysis using rna-templated ligation
US20210190770A1 (en) 2019-12-23 2021-06-24 10X Genomics, Inc. Compositions and methods for using fixed biological samples in partition-based assays
CN115135984A (zh) 2019-12-23 2022-09-30 10X基因组学有限公司 可逆固定试剂及其使用方法
US11702693B2 (en) 2020-01-21 2023-07-18 10X Genomics, Inc. Methods for printing cells and generating arrays of barcoded cells
US11732299B2 (en) 2020-01-21 2023-08-22 10X Genomics, Inc. Spatial assays with perturbed cells
US11898205B2 (en) 2020-02-03 2024-02-13 10X Genomics, Inc. Increasing capture efficiency of spatial assays
TW202142114A (zh) 2020-02-04 2021-11-16 美商陶氏農業科學公司 具有殺有害生物效用之組成物及與其相關之方法
US11732300B2 (en) 2020-02-05 2023-08-22 10X Genomics, Inc. Increasing efficiency of spatial analysis in a biological sample
US11891654B2 (en) 2020-02-24 2024-02-06 10X Genomics, Inc. Methods of making gene expression libraries
CN115335519A (zh) 2020-03-31 2022-11-11 凯杰有限公司 从固定的生物样品纯化核酸
WO2021207610A1 (en) 2020-04-10 2021-10-14 10X Genomics, Inc. Cold protease treatment method for preparing biological samples
WO2021212042A1 (en) 2020-04-16 2021-10-21 10X Genomics, Inc. Compositions and methods for use with fixed samples
WO2021216708A1 (en) 2020-04-22 2021-10-28 10X Genomics, Inc. Methods for spatial analysis using targeted rna depletion
EP4153775A1 (en) 2020-05-22 2023-03-29 10X Genomics, Inc. Simultaneous spatio-temporal measurement of gene expression and cellular activity
EP4153776A1 (en) 2020-05-22 2023-03-29 10X Genomics, Inc. Spatial analysis to detect sequence variants
WO2021252499A1 (en) 2020-06-08 2021-12-16 10X Genomics, Inc. Methods of determining a surgical margin and methods of use thereof
WO2021263111A1 (en) 2020-06-25 2021-12-30 10X Genomics, Inc. Spatial analysis of dna methylation
US11981960B1 (en) 2020-07-06 2024-05-14 10X Genomics, Inc. Spatial analysis utilizing degradable hydrogels
US11761038B1 (en) 2020-07-06 2023-09-19 10X Genomics, Inc. Methods for identifying a location of an RNA in a biological sample
US20230235352A1 (en) 2020-07-14 2023-07-27 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Insecticidal proteins and methods for their use
WO2022025965A1 (en) 2020-07-31 2022-02-03 10X Genomics, Inc. De-crosslinking compounds and methods of use for spatial analysis
CA3189603A1 (en) 2020-08-10 2022-01-17 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Plant regulatory elements and methods of use thereof
US11981958B1 (en) 2020-08-20 2024-05-14 10X Genomics, Inc. Methods for spatial analysis using DNA capture
US11926822B1 (en) 2020-09-23 2024-03-12 10X Genomics, Inc. Three-dimensional spatial analysis
EP4244379A1 (en) 2020-11-13 2023-09-20 10X Genomics, Inc. Nano-partitions (encapsulated nucleic acid processing enzymes) for cell-lysis and multiple reactions in partition-based assays
US11827935B1 (en) 2020-11-19 2023-11-28 10X Genomics, Inc. Methods for spatial analysis using rolling circle amplification and detection probes
WO2022140028A1 (en) 2020-12-21 2022-06-30 10X Genomics, Inc. Methods, compositions, and systems for capturing probes and/or barcodes
US20230071935A1 (en) * 2021-08-25 2023-03-09 Matchstick Technologies, Inc. Microplate cycling thermo sonicator with programmable ultrasound, heating, and cooling for multi-analytical applications
EP4196605A1 (en) 2021-09-01 2023-06-21 10X Genomics, Inc. Methods, compositions, and kits for blocking a capture probe on a spatial array
TW202345696A (zh) 2022-05-18 2023-12-01 美商科迪華農業科技有限責任公司 具有殺有害生物效用之組成物及與其相關的方法
US20240035071A1 (en) 2022-06-17 2024-02-01 10X Genomics, Inc. Catalytic de-crosslinking of samples for in situ analysis

Family Cites Families (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4830969A (en) 1981-08-31 1989-05-16 The Research Foundation Of State University Of New York Process for the rapid and simple isolation of nucleic acids
US4843155A (en) 1987-11-19 1989-06-27 Piotr Chomczynski Product and process for isolating RNA
US5128247A (en) 1989-08-14 1992-07-07 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods for isolation of nucleic acids from eukaryotic and prokaryotic sources
US5654179A (en) * 1990-11-14 1997-08-05 Hri Research, Inc. Nucleic acid preparation methods
US5284940A (en) 1990-11-14 1994-02-08 Hri Research, Inc. Preparation for nucleic acid samples
US5620852A (en) 1990-11-14 1997-04-15 Hri Research, Inc. Nucleic acid preparation methods
US5346994A (en) * 1992-01-28 1994-09-13 Piotr Chomczynski Shelf-stable product and process for isolating RNA, DNA and proteins
US5502166A (en) 1992-02-26 1996-03-26 Mitsubishi Chemical Corporation NMDH receptor proteins and genes encoding the same
WO1994018156A1 (en) 1993-02-01 1994-08-18 University Of Iowa Research Foundation Quartenary amine surfactants and methods of using same in isolation of rna
US5876978A (en) * 1993-04-06 1999-03-02 Medical College Of Ohio Method for quantitative measurement of gene expression using multiplex competitive reverse transcriptase-polymerase chain reaction
US5637687A (en) 1993-08-31 1997-06-10 Wiggins; James C. Methods and compositions for isolating nucleic acids
US5643767A (en) 1994-05-02 1997-07-01 The Rockefeller University Process for isolating cellular components
US5942391A (en) * 1994-06-22 1999-08-24 Mount Sinai School Of Medicine Nucleic acid amplification method: ramification-extension amplification method (RAM)
US5876924A (en) * 1994-06-22 1999-03-02 Mount Sinai School Of Medicine Nucleic acid amplification method hybridization signal amplification method (HSAM)
CA2153215A1 (en) 1994-07-06 1996-01-07 Lu Wang Treatment of paraffin embedded tissue for gene analysis
US5763169A (en) * 1995-01-13 1998-06-09 Chiron Diagnostics Corporation Nucleic acid probes for the detection and identification of fungi
US5707802A (en) * 1995-01-13 1998-01-13 Ciba Corning Diagnostics Corp. Nucleic acid probes for the detection and identification of fungi
US5777099A (en) 1995-02-24 1998-07-07 Biotecx Laboratories, Inc. RNA separation
US5945515A (en) 1995-07-31 1999-08-31 Chomczynski; Piotr Product and process for isolating DNA, RNA and proteins
US5998151A (en) 1995-12-01 1999-12-07 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Methods for predicting the efficacy of a chemotherapeutic regimen for gastrointestinal cancers using antibodies specific for thymidylate synthase
US20020090642A1 (en) * 1995-12-11 2002-07-11 Patrick G. Johnston Methods for determining the prognosis of breast cancer using antibodies specific for thymidylate synthase
DE29601618U1 (de) 1996-01-31 1996-07-04 Invitek Gmbh Vorrichtung zur gleichzeitigen multiplen Isolierung
EP0791654A1 (en) 1996-02-21 1997-08-27 Jürgen A. Dr. Richt Polypeptides corresponding to the amino acid sequences of proteins p57 or p9.5 of Borna disease virus, nucleic acid fragments coding therefore and their use for diagnostic and immunization purposes
EP0912726A4 (en) 1996-05-10 2001-07-18 Phylomed Corp METHODS FOR OXIDIZING BISULFIDE LINKS WITH OZONE
JP2001522238A (ja) * 1997-03-31 2001-11-13 アボツト・ラボラトリーズ 胃腸管の疾患の検出に有用な試薬および方法
IL145422A0 (en) * 1999-03-18 2002-06-30 Exiqon As One step sample preparation and detection of nucleic acids in complex in biological samples
US6248535B1 (en) * 1999-12-20 2001-06-19 University Of Southern California Method for isolation of RNA from formalin-fixed paraffin-embedded tissue specimens

Also Published As

Publication number Publication date
CA2394618A1 (en) 2001-06-28
HK1098178A1 (en) 2007-07-13
CN1269959C (zh) 2006-08-16
US6248535B1 (en) 2001-06-19
DE60032634T2 (de) 2007-10-04
IL150116A (en) 2012-01-31
US6428963B2 (en) 2002-08-06
EA008832B1 (ru) 2007-08-31
AU2006202986A1 (en) 2006-08-10
MXPA02006145A (es) 2004-08-23
US20020009795A1 (en) 2002-01-24
US7919280B2 (en) 2011-04-05
EP1743939A2 (en) 2007-01-17
DK1743939T3 (da) 2011-12-12
EA200200698A1 (ru) 2003-12-25
US20010029018A1 (en) 2001-10-11
US20090035761A1 (en) 2009-02-05
AU1578501A (en) 2001-07-03
AU2006202986B2 (en) 2008-12-04
KR100723328B1 (ko) 2007-05-31
CN1420927A (zh) 2003-05-28
WO2001046402A1 (en) 2001-06-28
US20040018551A1 (en) 2004-01-29
CA2394618C (en) 2013-05-07
NO330802B1 (no) 2011-07-18
EP1743939A3 (en) 2007-05-09
US7960147B2 (en) 2011-06-14
ATE349518T1 (de) 2007-01-15
JP2003525033A (ja) 2003-08-26
EP2363477A3 (en) 2013-07-31
US6613518B2 (en) 2003-09-02
US20020009794A1 (en) 2002-01-24
US7998707B2 (en) 2011-08-16
DE60032634D1 (de) 2007-02-08
EA200501772A1 (ru) 2006-10-27
ATE523590T1 (de) 2011-09-15
CN1891836B (zh) 2010-04-21
AU784565C (en) 2007-02-01
US20040091910A1 (en) 2004-05-13
EP1743939B1 (en) 2011-09-07
AR027036A1 (es) 2003-03-12
EP2363477A2 (en) 2011-09-07
EP1242594A1 (en) 2002-09-25
CN1891836A (zh) 2007-01-10
TWI277652B (en) 2007-04-01
NO20022945D0 (no) 2002-06-19
EA006827B1 (ru) 2006-04-28
KR20030027878A (ko) 2003-04-07
US20060199197A1 (en) 2006-09-07
EP1242594B1 (en) 2006-12-27
NO20022945L (no) 2002-08-06
IL150116A0 (en) 2002-12-01
US6610488B2 (en) 2003-08-26
AU784565B2 (en) 2006-05-04
HK1055446A1 (en) 2004-01-09
BR0016569A (pt) 2003-07-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2373149T3 (es) Procedimiento para el aislamiento de arn a partir de especímenes de tejido fijados con formalina e incluidos en parafina.
CN110177886B (zh) 基于胃癌生物学特征的集群分类及预后预测系统
ES2243047T3 (es) Deteccion sistematica diferencial cualitativa.
Hussain et al. NSun2-mediated cytosine-5 methylation of vault noncoding RNA determines its processing into regulatory small RNAs
US8785120B2 (en) Method for the treatment of a sample containing biomolecules
ES2360113T3 (es) Amplificación universal de rna fragmentado.
CN110157785A (zh) 一种单细胞rna测序文库构建方法
WO2011017089A1 (en) Mirna inhibition of six1 expression
CN108949991B (zh) Loc105369370在直肠腺癌诊断、治疗中的应用
CN108841964B (zh) Loc105370108在直肠腺癌诊治中的应用
WO2024110458A1 (en) Lnc-znf30-3 as cancer biomarker and therapeutic target
WO2022096768A1 (es) Método de fabricación de librerías de mirnas para secuenciación paralela masiva
Peters Molecular analyses of the transcriptome and angiogenesis