ES2401475T3 - Métodos de diagnóstico y tratamiento del cáncer - Google Patents

Abstract

Un método para predecir la respuesta de un sujeto a un tratamiento que comprendela administración de gemcitabina y pemetrexed, el método comprendiendo; a. la determinación de un nivel de expresión génica de ribonucleótido reductasaM1 (RRM1) y timidilato sintasa (TS) en una muestra del tumor del sujeto; y b. la predicción de la respuesta del sujeto al tratamiento en función del nivel deexpresión génica de RRM1 y de TS en la muestra de tumor; en la cualsi el nivel de la expresión génica de RRM1 es menor o igual a un nivel dereferencia de expresión génica de RRM1; y si el nivel de expresión génica de TS es menor que o igual a un nivel dereferencia de expresión génica de TS; es probable que el sujeto tenga una respuesta positiva al tratamiento.

Description

METODOS DE DIAGNOSTICO Y TRATAMIENTO DEL CANCER

REIVINDICACION DE PRIORIDAD

[0001] Esta solicitud reivindica los beneficios de la Solicitud de Patente Provisional estadounidense numeros de serie 60/944, 157, presentada el 15 de junio de 2007, y 61/039, 555, presentada el 26 de marzo de 2008.

INVESTIGACION O DESARROLLO FINANCIADO POR EL GO8IERNO FEDERAL [0002] Esta invenci6n se ha realizado con apoyo del gobierno con la subvenci6n numero RO1 CA102726 otorgada por el Instituto Nacional de Cancer de los Institutos Nacionales de Salud de los Estados Unidos. El Gobierno tiene determinados derechos en la invenci6n.

CAMPO TECNICO

[0003] Esta invenci6n se refiere a metodos de diagn6stico y tratamiento del cancer, por ejemplo, carcinoma de pulm6n de celulas no pequefas.

ANTECEDENTES

[0004] El cancer de pulm6n es la causa mas comun de muerte por cancer en los Estados Unidos. El cancer de pulm6n de celulas no pequefas (CPCNP) es el tipo mas comun de cancer de pulm6n, representando mas del 80% de los canceres de pulm6n. Por lo general, crece y se propaga mas lentamente que el cancer de pulm6n de celulas pequefas (CPCP). Hay tres formas principales de CPCNP, que incluyen adenocarcinomas, que normalmente se encuentran en un area exterior del pulm6n; carcinomas de celulas escamosas, que normalmente se encuentran en el centro del pulm6n junto a un bronquio; y carcinomas de celulas grandes, que pueden ocurrir en cualquier parte del pulm6n y tienden a crecer y propagarse mas rapidamente que los otros dos tipos de CPCNP. Vease, por ejemplo, Travis et al., Cancer 75 (Suppl. 1):191202 (1995). [0005] El trabajo reciente ha demostrado que los genes implicados en el metabolismo de nucle6tidos y reparaci6n del ADN son determinantes importantes del comportamiento fenotipico del cancer de pulm6n de celulas no pequefas (CPCNP) de estadio inicial. Especificamente, la ribonucle6tido reductasa M1 (RRM1), la subunidad reguladora de la ribonucle6tido reductasa, y ERCC1, un componente de la nucleasa 5' implicado en la reparaci6n por escisi6n de nucle6tidos, son pron6sticos de la evoluci6n de los pacientes (8epler et al, J Clin Oncol; 22:1878-1885 (2004); Simon et al, Chest 127(3):978-83 (2005); Olaussen et al, N Engl J Med 355:983-991 (2006); Zheng et al, N Engl J Med. 356:800-808 (2007)). Los niveles altos de ARNm y de expresi6n de proteinas de esos genes estan asociados con una supervivencia larga de los pacientes y una formaci6n de metastasis reducida en modelos animales (Gautam et al., Oncogene 22:2135-2142 (2063)). Ademas, se ha descubierto que los niveles altos de RRM1 en animales transgenicos protegen contra la formaci6n del tumor de pulm6n inducido por carcin6geno (Gautam et al., Cancer Res. 66:6497-6502 (2006)). [0006] Giovannetti et al, Molecular Pharmacology vol. 68, nO: 1, julio de 2005, paginas 110-118 revela que la sensibilidad a la gemcitabina esta correlacionada con la expresi6n de RRM1 en cultivo celular y que se ha encontrado una correlaci6n similar entre pemetrexed y la expresi6n de la timidilato sintasa (TS). La publicaci6n sugiere que estos hallazgos pueden tener implicaciones en el disefo racional de los regimenes farmacol6gicos futuros que incorporen gemcitabina y pemetrexed. [0007] Rosell et al, Oncology, vol. 18, nO: 13, suplemento 8, noviembre de 2004, paginas 17-76 indica que la evaluaci6n de los niveles de expresi6n de ARNm de RRM1 y de TS podria seleccionar pacientes que se beneficien de combinaciones de gemcitabina o pemetrexed. 8REVE RESUMEN DE LA INVENCION [0008] De acuerdo con la presente invenci6n, se proporciona un metodo para predecir la respuesta de un sujeto a un tratamiento que comprende la administraci6n de gemcitabina y pemetrexed, siendo el metodo como se expone en la reivindicaci6n independiente 1. Mas caracteristicas de la invenci6n se describen en las reivindicaciones dependientes. [0009] La presente invenci6n se basa en el descubrimiento de que los niveles de expresi6n de la timidilato sintasa (TS) son pron6sticos de evoluci6n en sujetos con CPCNP, por ejemplo, CPCNP de estadio inicial (estadio I). Ademas, el nivel de expresi6n de TS y de RRM1 esta correlacionado con la respuesta al tratamiento preoperatorio con una combinaci6n sin platino, concretamente gemcitabina y pemetrexed, en pacientes con CPCNP resecable quirurgicamente. [0010] Por lo tanto, se describen en este documento metodos de predicci6n de resultados en sujetos con CPCNP, por ejemplo, CPCNP de estadio inicial (estadio I). [0011] Tambien se describen metodos de selecci6n de pacientes para tratamiento perioperatorio, por ejemplo, tratamiento pre- o postoperatorio, con agente antimetabolito sin platino, por ejemplo, gemcitabina y pernetrexed o uno de los dos. El metodo incluye la determinaci6n de los niveles de expresi6n intratumoral de TS, o de TS y RRM1, y la selecci6n de un paciente en funci6n de los niveles de expresi6n. [0012] En otro aspecto, la revelaci6n proporciona metodos para seleccionar una quimioterapia apropiada para un sujeto. Los metodos incluyen la obtenci6n de una

muestra de tumor del sujeto, la determinaci6n de un nivel de expresi6n genica de la ribonucle6tido reductasa M1 (RRM1) yla timidilato sintasa (TS) en la muestra del tumor y la selecci6n de una quimioterapia apropiada en funci6n de los niveles de expresi6n de RRM1 y de TS. Si los niveles de expresi6n de RRM1 y de TS son 5 menores o igual que la mediana del nivel de expresi6n de RRM1 de una cohorte de referencia, se selecciona una quimioterapia que comprende gemcitabina y pemetrexed. En algunos modos de realizaci6n, los metodos tambien incluyen la administraci6n de la quimioterapia apropiada seleccionada al sujeto. En algunos modos de realizaci6n, los metodos tambien pueden incluir la administraci6n de un

10 segundo agente quimioterapeutico al sujeto, por ejemplo, una anti-tubulina o agente que contiene platino. [0013] En un aspecto adicional, la revelaci6n proporciona metodos de tratamiento de un sujeto con cancer, por ejemplo, CPCNP; por ejemplo, CPCNP operable. El metodo incluye la selecci6n de un sujeto en funci6n de la presencia de niveles de expresi6n

15 bajos de TS y de RRM1, y la administraci6n al sujeto de una combinaci6n de gemcitabina y pemetrexed, por ejemplo, en forma de cuatro tratamientos quincenales. En algunos modos de realizaci6n, los metodos tambien incluyen la determinaci6n de los niveles de expresi6n intratumoral de TS o de TS y RRM1. [0014] En otro aspecto, la revelaci6n proporciona metodos para predecir la respuesta

20 de un sujeto a un tratamiento, por ejemplo, un tratamiento pre-o postoperatorio, con un agente antimetabolito sin platino, por ejemplo, gemcitabina y pernetrexed o uno de los dos. En otro aspecto, la revelaci6n proporciona metodos para predecir la respuesta de un sujeto a un tratamiento que comprende la administraci6n de gemcitabina y pemetrexed. Los metodos incluyen la obtenci6n de una muestra de tumor del sujeto, la

25 determinaci6n de un nivel de expresi6n genica de la ribonucle6tido reductasa M1 (RRM1) y la timidilato sintasa (TS) en la muestra de tumor, y la predicci6n de la respuesta del sujeto al tratamiento en funci6n del nivel de expresi6n genica de RRM1 y de TS en la muestra de tumor. Los niveles de expresi6n bajos de TS y de RRM1 indican que es probable que el sujeto tenga una respuesta positiva al tratamiento.

30 [0015] En otro aspecto mas, la revelaci6n proporciona metodos para proporcionar un pron6stico para un sujeto al que se le ha diagnosticado cancer de pulm6n de celulas no pequefas. Los metodos incluyen la obtenci6n de una muestra de tumor del sujeto, la determinaci6n de un nivel de proteina timidilato sintasa (TS) citoplasmatica en la muestra de tumor y la comparaci6n del nivel de proteina TS citoplasmatica de la

35 muestra con un nivel de referencia de proteina TS citoplasmatica. Un nivel alto de proteina TS citoplasmatica de la muestra en comparaci6n con el nivel de referencia es indicativo de un pron6stico bueno y un nivel bajo de proteina TS citoplasmatica en comparaci6n con el nivel de referencia es indicativo de un pron6stico malo. En algunos modos de realizaci6n, el nivel de proteina TS citoplasmatica se determina mediante un metodo de analisis cuantitativo in situ, por ejemplo, el AQUA (analisis cuantitativo

5 automatizado) como se describe en este documento. [0016] En otro aspecto, la revelaci6n proporciona metodos para determinar o controlar la eficacia de un tratamiento, por ejemplo, un tratamiento pre-o postoperatorio, con un agente antimetabolito sin platino, por ejemplo, gemcitabina y pernetrexed o uno de los dos. Los metodos incluyen la determinaci6n de un nivel de TS y/o de RRM1, antes del

10 tratamiento para establecer un nivel de partida, y la determinaci6n de uno o mas niveles de TS y/o de RRM1, despues de que se haya iniciado el tratamiento. Un cambio en los niveles del gen medido es indicativo de la eficacia del tratamiento, por ejemplo, un aumento en la expresi6n de TS y/o de RRM1 indica que el tratamiento es eficaz. El metodo tambien puede incluir la toma de una decisi6n de tratamiento basada

15 en cambios en los niveles de TS y/o de RRM1. [0017] En otro aspecto, la revelaci6n proporciona kits que incluyen un reactivo para examinar la expresi6n de RRM1 y de TS en una muestra de tejido de un paciente y una hoja de instrucciones. En algunos modos de realizaci6n, los reactivos para examinar la expresi6n de RRM1 y de TS comprenden partes previamente medidas de

20 un reactivo seleccionado del grupo seleccionado de cebadores oligo-dT, cebadores directos que hibridan con RRM1 o ADNc de TS, cebadores inversos que hibridan con RRM1 o ADNc de TS, transcriptasas inversas, ADN polimerasas, tampones y nucle6tidos. En algunos modos de realizaci6n, los reactivos para examinar la expresi6n de TS y de RRM1 comprenden partes previamente medidas de anticuerpos

25 anti-RRM1 y anti-TS y tampones para realizar un ensayo de Western blot o de inmunohistoquimica. En algunos modos de realizaci6n, los kits tambien incluyen un reactivo para procesar una muestra de tejido de un paciente. [0018] Un quot;trastorno proliferativoquot;, es un trastorno caracterizado por irregularidades en la divisi6n celular. Un cancer (por ejemplo, un glioma, cancer de pr6stata, melanoma,

30 carcinoma, cancer de cuello de utero, cancer de mama, cancer de colon o sarcoma) es un ejemplo de un trastorno proliferativo. Las celulas caracteristicas de trastornos proliferativos (es decir, quot;celulas neoplasicasquot; o quot;celulas tumoralesquot;) tienen la capacidad de crecimiento aut6nomo, es decir, un estado o condici6n anormal caracterizado por un crecimiento proliferativo inapropiado de poblaciones de celulas. Una celula

35 neoplasica o una celula tumoral es una celula que prolifera a una velocidad anormalmente alta. Un nuevo crecimiento que comprende celulas neoplasicas es un neoplasma, conocido tambien como un quot;tumorquot;. Un tumor es un crecimiento anormal de tejido, formando normalmente una masa distinta, que crece por proliferaci6n celular mas rapidamente que el tejido normal. Un tumor puede mostrar una falta total o parcial de organizaci6n estructural y coordinaci6n funcional con el tejido normal. Tal como se

5 utiliza en este documento, un tumor pretende abarcar tumores hematopoyeticos, asi como tumores s6lidos. [0019] Un tumor puede ser benigno (tumor benigno) o maligno (tumor maligno o cancer). Los tumores malignos se pueden clasificar en lineas generales en tres tipos principales. Los tumores malignos que surgen de las estructuras epiteliales se

10 denominan carcinomas, los tumores malignos que se originan en tejidos conectivos como musculo, cartilago, grasa o hueso se denominan sarcomas y los tumores malignos que afectan a estructuras hematopoyeticas (estructuras relacionadas con la formaci6n de celulas sanguineas) incluyendo componentes del sistema inmunol6gico se denominan leucemias y linfomas. Otros tumores incluyen, sin caracter limitativo,

15 neurofibromatosis. [0020] Los trastornos proliferativos incluyen todos los tipos de crecimientos cancerosos o procesos oncogenicos, tejidos metastasicos o celulas, tejidos u 6rganos con transformaci6n maligna, independientemente del tipo histopatol6gico o estadio de invasi6n. Los canceres incluyen tumores malignos en diversos sistemas organicos,

20 tales como el pulm6n, mama, tiroides, linfoide, gastrointestinal y tracto genitourinario, asi como adenocarcinomas que incluyen tumores malignos tales como la mayoria de los canceres de colon, carcinoma de celulas renales, cancer de pr6stata y/o tumores testiculares, carcinoma de pulm6n de celulas no pequefas, cancer de intestino delgado y cancer de es6fago. Los carcinomas incluyen tumores malignos en tejidos

25 epiteliales o endocrinos, tales como carcinomas del sistema respiratorio, carcinomas del sistema gastrointestinal, carcinomas del sistema genitourinario, carcinomas testiculares, carcinomas del sistema, carcinomas de mama, carcinomas de pr6stata, carcinomas del sistema endocrino y melanomas. Otros carcinomas incluyen los que se forman a partir de tejido del cuello de utero, pulm6n, cabeza y cuello, colon y ovario.

30 Los canceres del sistema nervioso central incluyen gliomas (incluyendo astrocitomas, oligodendrogliomas mixtos, glioblastoma multiforme, ependimoma y oligodendroglioma), meningiomas, tumores pituitarios, hemangioblastomas, neuromas acusticos, tumores de la glandula pineal, tumores de la medula espinal, tumores hematopoyeticos y linfomas del sistema nervioso central. Los canceres que afectan al

35 tejido conectivo, como grasa, musculo, vasos sanguineos, tejidos profundos de la piel, nervios, huesos y cartilago, se denominan sarcomas. Los sarcomas incluyen, por ejemplo, liposarcomas, leiomiosarcomas, rabdomiosarcomas, sarcomas sinoviales, angiosarcomas, fibrosarcomas, neurofibrosarcomas, tumores del estroma gastrointestinal (GIST por sus siglas en ingles), tumores desmoides, sarcomas de Ewing, osteosarcomas y condrosarcomas.

5 [0021] Los metodos descritos en este documento son particularmente relevantes para el tratamiento de seres humanos que tienen un tumor maligno epitelial, tal como un cancer de pulm6n (por ejemplo, cancer de pulm6n de celulas no pequefas (CPCNP)), cancer de mama, cancer colorrectal, cancer de cabeza y cuello o cancer de ovario. Los tumores malignos epiteliales son canceres que afectan a los tejidos epiteliales.

10 [0022] Un quot;sujetoquot; como se describe en este documento puede ser cualquier sujeto que tenga un trastorno proliferativo. Por ejemplo, el sujeto puede ser cualquier mamifero, tal como un ser humano, incluyendo un paciente humano de cancer. Ejemplos de mamiferos no humanos incluyen un primate no humano (por ejemplo, un mono o simio), un rat6n, rata, cabra, vaca, toro, cerdo, caballo, oveja, jabali, nutria

15 marina, gato y perro. Los metodos descritos en este documento se pueden realizar en cualquier sujeto de cualquier edad, incluyendo un feto (por ejemplo, en el utero), bebe, nifo, adolescente, adulto o anciano humano. En algunos modos de realizaci6n, el sujeto tiene un tumor maligno epitelial: un cancer de pulm6n, por ejemplo, cancer de pulm6n de celulas no pequefas; cancer de mama; cancer colorrectal; cancer de

20 cabeza y cuello o cancer de ovario. [0023] Un quot;antimetabolitoquot; como se usa en este documento es una sustancia quimica con una estructura similar a una sustancia (un metabolito) requerida para las reacciones bioquimicas normales, pero lo suficientemente diferente como para interferir en las funciones normales de las celulas. Los antimetabolitos incluyen

25 analogos de la purina y la pirimidina que interfieren en la sintesis del ADN. Ejemplos de antimetabolito incluyen, por ejemplo, aminopterina, 2-clorodeoxiadenosina, arabin6sido de citosina (Ara C), citarabina, fludarabina, fluorouracilo (5-FU) (y sus derivados, que incluyen capecitabina y tegafur), gemcitabina, metopterina, metotrexato, pemetrexed, raltitrexed, trimetrexato, 6-mercaptopurina y 6-tioguanina.

30 [0024] Una quot;antitubulinaquot; como se utiliza en este documento se refiere a un agente quimioterapeutico que bloquea la divisi6n celular por la inhibici6n del huso mit6tico. Los agentes antitubulina incluyen, por ejemplo, los taxanos paclitaxel y docetaxel, y los alcaloides de vinca vinorelbina, vincristina, vinblastina, vinflunina y vindesina. [0025] Un quot;agente que contiene platinoquot; como se usa en este documento incluye

35 agentes quimioterapeuticos que contienen platino. Los agentes que contienen platino se entrecruzan con el ADN alquilado, lo que da lugar a la inhibici6n de la sintesis y transcripci6n del ADN. Los agentes que contienen platino pueden actuar en cualquier ciclo celular y, por consiguiente, matar celulas neoplasicas, asi como celulas que se dividen de forma sana. Los agentes que contienen platino incluyen, por ejemplo, cisplatino, carboplatino y oxaliplatino.

5 [0026] A menos que se defina lo contrario, todos los terminos tecnicos y cientificos utilizados en este documento tienen el mismo significado que entiende normalmente un experto normal en la tecnica a la que pertenece esta invenci6n. Los metodos y el material se describen en este documento para su uso en su presente invenci6n; tambien se pueden utilizar otros metodos y materiales adecuados conocidos en la

10 tecnica. Los materiales, metodos y ejemplos son s6lo ilustrativos y no pretenden ser limitativos. En caso de conflicto, la presente especificaci6n, incluyendo las definiciones, prevalecera. [0027] Otras caracteristicas y ventajas de la invenci6n seran evidentes a partir de la siguiente descripci6n y figuras detalladas, y a partir de las reivindicaciones.

15 DESCRIPCION DE LOS DI8UJOS

[0028]

La figura 1 es un Western blot de lineas celulares que muestran la expresi6n de TS. Se prepararon extractos citos6licos y nucleares a partir de las lineas celulares H23 y H23-CT-R1. Estos se separaron en geles de poliacrilamida, se

20 transfirieron a membranas y se sondaron con anticuerpos dirigidos a TS, Oct-1 (una proteina nuclear) y GAPDH (una proteina citos6lica). Se encontr6 una banda de 38 kD representando a TS en el citoplasma. Las figuras 2A y 28 son curvas de supervivencia global de Kaplan-Meier, estimadas por la expresi6n de TS. 2A, la supervivencia de 160 pacientes

25 mediante la expresi6n de la proteina in situ. Las lineas de color gris claro representan los pacientes con expresi6n de marcadores gt;57,02 (N=120; mediana=81,3 meses, IC 95% 62,9-99,6) y las lineas de color gris oscuro representan la expresi6n :57,02 (N=40; mediana=51,7 meses, IC 95% 21.581,9). El valor p no ajustado fue de 0,0013. 28 la supervivencia del mismo

30 grupo de pacientes incluyendo el segundo mejor punto de corte. Las lineas de color gris claro representan los pacientes con expresi6n de marcadores ;129,33 (N=18; mediana no alcanzada), el gris medio representa los pacientes con expresi6n de marcadores desde 57,58 a 124,27 (N=82; mediana de 80,8 meses) y las lineas de color gris oscuro representan la expresi6n ;57,02

35 (N=40; mediana=51,7 meses). El valor p no ajustado fue de 0,002. La figura 3A es un grafico de barras que muestra la respuesta al tratamiento

medida de forma radiografica. La respuesta oscil6 desde un aumento del 95 % hasta una disminuci6n del 100% del tamafo de las lesiones medibles. Las figuras 38-E son graficos de barras que muestran la respuesta radiografica de la enfermedad y la expresi6n genica del ARNm. 38, RRM1; 3C,

5 RRM2; 3D, TS; 3E, dihidrofolato reductasa (DHFR). La figura 4 es un grafico que muestra los resultados de las estimaciones de supervivencia global y supervivencia sin enfermedad de Kaplan-Meier. La curva negra (linea superior) denota la supervivencia global (OS por sus siglas en ingles) y la curva gris (linea inferior) indica la supervivencia sin enfermedad

10 (DFS por sus siglas en ingles). Las marcas de visto indican los casos censurados. La figura 5 es un grafico que ilustra los niveles de ARNm de pre-y postratamiento de los genes RRMI y TS en 10 pacientes.

DESCRIPCION DETALLADA

15 [0029]Un objetivo importante de los esfuerzos actuales en la investigaci6n del CPCNP es aumentar la eficacia de la terapia sistemica perioperatoria en pacientes con una resecci6n quirurgica completa a traves de la incorporaci6n de parametros moleculares en decisiones terapeuticas clinicas. Como se describe en este documento, los niveles de expresi6n intratumorales del gen timidilato sintasa (TS) estan correlacionanados

20 con los resultados clinicos; y los niveles de TS y de ribonucle6tido reductasa M1 (RRMI) estan correlacionanados con la respuesta del tumor al tratamiento con farmacos antimetabolitos sin platino.

Cancerde pulmonde celulasno pequenas(CPCNP) [0030] Los metodos de diagn6stico del CPCNP son conocidos en la tecnica. Los 25 procedimientos de diagn6stico deben ser personalizados para el paciente individual y pueden incluir: − Revisi6n de radiografias antiguas de t6rax para excluir lesiones benignas de larga duraci6n o para determinar la velocidad de una lesi6n maligna. − Citologia de esputo 30 − 8roncoscopia, biopsia de lesiones endobronquiales, cepillados y lavados, citologia de esputo postbroncoscopia. − Mediastinoscopia para excluir metastasis inoperables en los ganglios linfaticos mediastinales. − 8iopsia percutanea con aguja fina 35 − 8iopsia por escisi6n o con aguja de los dep6sitos secundarios de facil

acceso. La verificaci6n histol6gica o citol6gica del diagn6stico debe ser

obtenida. [0031] La estadificaci6n tambien se puede realizar mediante metodos conocidos en la tecnica, por ejemplo, el sistema de clasificaci6n TNM (Tumor/Nodo/Metastasis) de la

5 UICC (Uni6n Internacional Contra el Cancer) aceptado internacionalmente, tal como se describe en Mountain, Chest 111:1710-17 (1997); Pisters and Gail, J. Thoracic One 2(7):583-584 (2007), Rami-Porta et al, J.Thoracic One. 2 (7):593-602 (2007); Rusch et al, J.Thoracic One. 2(7) :603-612 (2007); Postumus et al, J.Thoracic One. 2(8):686-693 (2007); Groome et al, J.Thoracic One. 2(8):694-705 (2007); Goldstraw et al, J.Thoracic

10 One. 2(8); 706-714 (2007). En resumen, quot;Tquot;, describe el tamafo del tumor y si ha invadido el tejido cercano, quot;Nquot;, describe cualquier ganglio linfatico que este involucrado y quot;Mquot; describe la metastasis (propagaci6n del cancer de una parte del cuerpo a otra). De acuerdo con la escala TNM, el estadio 0 indica el carcinoma in situ, que es la presencia de un cancer s6lo en la capa de celulas en la cual empez6. Los estadios I,

15 II, III, y IV indican el empeoramiento progresivo de los estadios de la enfermedad. Los estadios superiores indican una enfermedad mas extendida como se evidencia por el tamafo mas grande del tumor y/o la propagaci6n del cancer a los ganglios linfaticos cercanos y/u 6rganos adyacentes al tumor primario. En el estadio IV, el tumor se ha diseminado a por lo menos un otro 6rgano.

20 Metodos de pronostico [0032] Como se describe en este documento, los niveles de proteina TS, por ejemplo, proteina citoplasmatica TS, se pueden utilizar para determinar un pron6stico, por ejemplo, para determinar la probabilidad de supervivencia durante un periodo prolongado. En estos metodos, se toma del sujeto una muestra que comprende

25 celulas tumorales y se determinan los niveles de proteina TS mediante metodos conocidos en la tecnica, por ejemplo, como se describe en este documento. Por ejemplo, se pueden determinar sus niveles de expresi6n de proteina mediante un metodo de analisis cuantitativo in situ de expresi6n de proteinas, por ejemplo, mediante un analisis cuantitativo automatizado (AQUA), vease, por ejemplo, Camp et

30 al., Nat. Med. 8:1323.-1327 (2002). La comparaci6n de los niveles de TS en las celulas tumorales de la muestra con un nivel de referencia indica la evoluci6n probable del sujeto. En algunos modos de realizaci6n, la comparaci6n se realiza con un percentil(es) de punto de corte determinado por la expresi6n de la proteina TS en una cohorte de referencia como se describe en este documento. En algunos modos de

35 realizaci6n, el punto de corte de referencia es un nivel de expresi6n que esta alrededor del 89O percentil. Los sujetos por encima de ese punto de corte, por ejemplo, en el 11% mas alto de los niveles de expresi6n, tienen una mayor probabilidad de supervivencia y los sujetos por debajo de ese punto de corte tienen un peor pron6stico. En algunos modos de realizaci6n, se utilizan dos puntos de corte de referencia, en un grupo inferior del 25%, grupo intermedio del 64% y grupo superior del 11%. Los sujetos que estan dentro del 25% mas bajo tienen el riesgo mayor de resultados adversos (muerte), los sujetos en el 64% medio tienen un nivel de riesgo medio y los sujetos en el 11% mas alto tienen un riesgo mas bajo. Vease, por ejemplo, el ejemplo y las figuras 2A-8. En algunos modos de realizaci6n, se toma una decisi6n en cuanto a la agresividad con la que tratar a un sujeto a partir de la informaci6n de pron6stico proporcionada por estos metodos. Por ejemplo, un sujeto con un riesgo mas alto de resultados adversos se trata de manera mas agresiva o con administraci6n de modalidades de tratamiento adicionales, por ejemplo, radiaci6n u otros agentes quimioterapeuticos como se describe en este documento.

Metodos para determinar la terapia de cancer [0033] Los metodos de determinaci6n o selecci6n de una terapia de cancer adecuada incluyen la obtenci6n o proporci6n de una muestra del tumor de un paciente y la determinaci6n del nivel de expresi6n de RRM1 o de TS del paciente. Si los niveles intratumorales de RRM1 y de TS son bajos, se puede determinar que es apropiada una quimioterapia que contenga una combinaci6n de gemcitabina y pemetrexed. Si los niveles intratumorales de RRM1 y/o de TS son altos, se puede determinar que es apropiada una quimioterapia que carezca de gemcitabina y pemetrexed. [0034] Los niveles de expresi6n quot;bajosquot; y quot;altosquot; son valores relativos y estan basados en una comparaci6n con los de una cohorte de referencia. Una quot;cohorte de referenciaquot;, como se usa en este documento, es una muestra de poblaci6n con cancer de la cual se recogen los datos de la expresi6n de RRM1 y/o de TS. El nivel de expresi6n de una cohorte de referencia se determina midiendo los niveles de expresi6n del gen intratumoral en la muestra de poblaci6n (vease, por ejemplo, Rosell et al, Clin Cancer Res 10:1318-25, 2004; Lord et al, Clin Cancer Res. 8:2286-2291, 2002; 8epler et al, J Clin Oncol 22:1878-85, 2004; y Simon et al, Chest 127:978-83, 2005). Normalmente, un tumor muestra niveles quot;bajosquot; de RRM1 si el nivel de expresi6n es igual o menor que el nivel medio de expresi6n de RRM1 de la cohorte de referencia y el tumor muestra niveles quot;altosquot; de RRM1 si el nivel de expresi6n es mayor que el nivel medio de expresi6n de RRM1 de la cohorte de referencia. Del mismo modo, un tumor muestra niveles quot;bajosquot; de TS si el nivel de expresi6n es igual o menor que el nivel medio de expresi6n de TS de la cohorte de referencia. Los niveles de expresi6n quot;bajosquot; y quot;altosquot; son relativos y se pueden establecer con cada grupo nuevo de referencia. En una alternativa, el nivel de expresi6n determinado para predecir la respuesta de un sujeto a una quimioterapia puede ser igual o menor que el nivel de expresi6n del tercio mas bajo, o cuartil mas bajo de una cohorte de referencia, o se puede determinar el nivel de expresi6n de predicci6n para que sea un nivel igual o

5 mayor que el nivel de expresi6n del tercio mas alto, o cuartil mas alto, de una cohorte de referencia.

Muestras tumora/es

[0035] Se puede utilizar cualquier metodo para obtener una muestra de tumor, como una biopsia (por ejemplo, biopsia con aguja gruesa) y se puede incrustar el tejido en 10 OCT® (compuesto de corte 6ptimo de tejido) para procesamiento. Por ejemplo, el tejido en OCT® puede ser procesado como secciones congeladas. Las celulas tumorales se pueden recoger, por ejemplo mediante microdisecci6n por captura laser (LCM por sus siglas en ingles), y se puede examinar la expresi6n genica mediante, por ejemplo, la transcripci6n inversa junto con la reacci6n en cadena de la polimerasa (RT15 PCR por sus siglas en ingles) o el analisis de Northern blot para medir los niveles de ARN, o mediante Western blot, para medir los niveles de proteina. En un enfoque ilustrativo, se examina el nivel de expresi6n de RRM1 o de TS mediante RT-PCR cuantitativa en tiempo real. El nivel de expresi6n de estos genes tambien se puede determinar mediante tecnicas de inmunohistoquimica, por ejemplo, en muestras

20 fijadas, por ejemplo, fijadas con formalina.

Cohorte de referencia

[0036] Las muestras de una cohorte de referencia se toman de sujetos de la misma especie (por ejemplo, seres humanos) y los tumores de una cohorte de referencia son preferiblemente del mismo tipo (por ejemplo, tumores de un CPCNP). Por ejemplo, 25 todos los tumores de una cohorte de referencia pueden ser, por ejemplo, carcinomas, tumores hematopoyeticos, tumores cerebrales o sarcomas. En algunos modos de realizaci6n, todos los tumores de una cohorte de referencia pueden ser, por ejemplo, de un cancer de pulm6n, un cancer de mama, un cancer colorrectal, un cancer de cabeza y cuello o un cancer de ovario. Los miembros individuales de una cohorte de 30 referencia tambien pueden compartir otras similitudes, como similitudes del estadio de la enfermedad, regimenes de tratamiento previos, estilo de vida (por ejemplo, fumadores o no fumadores, sobrepeso o bajo peso), u otros datos demograficos (por ejemplo, edad, predisposici6n genetica). Por ejemplo, ademas de tener el mismo tipo de tumor, los pacientes de una cohorte de referencia no pueden haber recibido 35 cualquier quimioterapia sistemica anterior. Una cohorte de referencia debe incluir datos de analisis de expresi6n genica de muestras de tumores de al menos 10 sujetos,

por ejemplo, de 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80,90, 100, 120, 140, 160, 180, o 200 o mas sujetos.

Determinaci6n de nive/es de expresi6n genica y de protefnas

[0037] Los niveles de expresi6n genica de una cohorte de referencia pueden ser

5 determinados por cualquier metodo, como por RT-PCR cuantitativa, analisis Northern blot, analisis Western blot o inmunohistoquimica. Los niveles de expresi6n de una muestra de tumor de un sujeto de prueba se determinan de la misma manera que los niveles de expresi6n de la cohorte de referencia. [0038] Las secuencias utiles de los presentes metodos, cuando se practican en seres

10 humanos, incluyen, sin caracter limitativo, las siguientes:

-

Secuencias RRM1: GeneID: 6240 -human RRM1 -NM 001033.3 and NP 001024.1; gene = NC 000011.8 Reference assembly, Range 4072500-41 16682: NT 009237.17, Range 2903165-2947347

-

Secuencias TS: GenelD: 7298 -human TS NM 001071.2 and NP 001062.1;

15 gene=NC 00018.8 Reference assembly -Range 647651-663492; NT 010859.14, Range 647651-663492 [0039] Cuando es conveniente determinar los niveles de proteina, por ejemplo, mediante Western 8lot, se pueden utilizar los siguientes anticuerpos. Otros tambien pueden ser utiles.

20 -anti�RRM1 disponible en el mercado a traves de Santa Cruz 8iotechnology, Inc., Novas 8iologicals, Proteintech Group, Inc., y Abnova Corporation, entre otros.

-

anti TS disponible en el mercado a traves de Abeam, Serotec, Acris Antibodies GmbH, Invitrogen, Lab Vision, Millipore Corporation, Novus 8iologicals, ProSci, Inc., Rockland Immunochemicals, Inc. y Santa Cruz 8iotechnology, Inc., entre otros.

25 Se/ecci6n de un regimen terapeutico

[0040] Se pueden tomar muestras del tumor para analizar los niveles de expresi6n de TS o de RRM1 o de ambos y se puede determinar una quimioterapia apropiada a partir de los niveles de expresi6n observados. La quimioterapia puede incluir un agente unico o multiples agentes quimioterapeuticos (por ejemplo, dos, tres o mas

30 agentes quimioterapeuticos). [0041] En un ejemplo, se determinan los niveles de expresi6n intratumoral de tanto RRM1 como de TS y se determina un agente quimioterapeutico apropiado a partir del nivel de expresi6n de ambos genes. Por ejemplo, si se determina que ambos niveles de expresi6n de RRM1 y de TS son bajos, se puede seleccionar una quimioterapia

35 apropiada que incluye una combinaci6n de gemcitabina y pemetrexed. Si se determina que los niveles de RRM1 son bajos y se determina que los niveles de TS son altos, se puede determinar una quimioterapia apropiada que incluya gemcitabina y excluya pemetrexed y se puede incluir un segundo agente opcional, como una antitubulina o un agente alquilante. Dicha composici6n quimioterapeutica podria incluir un agente que contenga platino. Si se determina que los niveles de RRM1 son altos y se determina que los niveles de TS son bajos, una quimioterapia adecuada no deberia incluir gemcitabina, pero puede incluir pemetrexed y un segundo agente opcional, como una antitubulina o un agente alquilante. Si se determina que los niveles de RRM1 y de TS son altos, se puede determinar una quimioterapia adecuada que incluya una antitubulina. La quimioterapia no deberia incluir un antimetabolito.

Tratamientos adiciona/es

[0042] En general, los sujetos diagnosticados con CPCNP son tratados con resecci6n quirurgica, radiaci6n y quimioterapias adyuvantes y/o neoadyuvantes, vease, por ejemplo, Kris et al, Oncologist 10 (Suppl.2):23-29 (2005). El estandar actual de cuidado para el tratamiento de CPCNP es la resecci6n quirurgica, cuando es viable, seguida de quimioterapia adyuvante en estadios II y III, vease Allen and Jahanzeb, J. Natl. Compr.Cane.Netw. 6(3):285-293. Tambien se utilizan enfoques trimodales que implican la adici6n concurrente o secuencial de radioterapia. Por lo tanto, los metodos descritos en este documento pueden incluir el uso de cualquier modalidad de tratamiento adicional, por ejemplo, resecci6n quirurgica y/o radiaci6n. [0043] Otros agentes quimioterapeuticos tambien se pueden administrar con la combinaci6n de antimetabolito, por ejemplo, antitubulina o agentes que contienen platino. Otros agentes quimioterapeuticos incluyen, por ejemplo, L-asparaginasa, bicalatamide, bleomicina, camptotecina (CPT-11), carminomicina, ciclofosfamida, arabin6sido de citosina, dacarbazina, dactinomicina, doxorrubicina, daunorrubicina, ecteinascidina 743, estramustina, etop6sido, fosfato de etop6sido, epotilona, flutamida, FK506, hexametil melamina, idatrexato, leflunomida, leuprolida, leurosidina, leurosina, melfalan, mitomicina C, micofenolato de mofetilo, plicamicina, podofilotoxina, porfiromicina, ranpimasa, rapamicina, topotecan, tenip6sido y tiotepa.

Poso/ogfa y Administraci6n

[0044] Una quimioterapia, por ejemplo, la terapia de combinaci6n de pemetrexed/gemcitabina seleccionada para el sujeto en funci6n de los niveles de expresi6n de RRM1 y/o de TS como se describe en este documento, se puede administrar a un sujeto mediante regimenes de dosificaci6n convencionales. [0045] La quimioterapia puede administrarse mediante metodos estandar, incluyendo por via oral, tales como en forma de pastilla, por via intravenosa, con inyecci6n en una cavidad del cuerpo (por ejemplo, la vejiga), por via intramuscular o por via intratecal. Un regimen de quimioterapia se puede administrar como un regimen continuo, por ejemplo, por via intravenosa, por via oral o en una cavidad corporal. Un regimen de quimioterapia puede administrarse en un ciclo que incluye el dia o dias en que se

5 administra el farmaco seguido de un periodo de descanso y recuperaci6n. El periodo de recuperaci6n puede durar una, dos, tres o cuatro semanas o mas, y entonces el ciclo se puede repetir. Un tratamiento de quimioterapia puede incluir al menos dos a doce ciclos (por ejemplo, tres, cuatro, cinco, seis, siete, diez o doce ciclos). [0046] Los datos de expresi6n genica obtenidos a partir de los metodos presentados

10 en este documento pueden ser combinados con informaci6n del historial clinico de un paciente, incluyendo datos demograficos, estado vital, educaci6n, historial de abuso de alcohol, tabaco y drogas, historial medico y tratamiento documentado para ajustar las conclusiones relativas al pron6stico de una enfermedad proliferativa despues de la administraci6n de una quimioterapia disefada como se describe anteriormente.

15 [0047] Despues de la administraci6n de una quimioterapia de acuerdo con los niveles de expresi6n intratumoral de RRM1 o de TS, se puede controlar al paciente para analizar una respuesta a la terapia. Por ejemplo, las medidas del tumor se pueden tomar antes y despues de la administraci6n de la quimioterapia para controlar la progresi6n de la enfermedad. Si el tamafo del tumor disminuye, se puede determinar

20 que la enfermedad esta en remisi6n o revirtiendo hacia la remisi6n. Una disminuci6n parcial del tamafo del tumor puede indicar una enfermedad en remisi6n parcial, y si el tumor desaparece por completo, se puede decir que la enfermedad esta en remisi6n completa. Si el tamafo del tumor aumenta, se puede determinar que la enfermedad esta progresando. Si el tamafo del tumor no cambia despues de la administraci6n de

25 la quimioterapia, la enfermedad puede clasificarse como estable. [0048] Un sujeto tambien puede ser evaluado de acuerdo a su condici6n fisica, con especial atenci6n a factores tales como perdida de peso, derrame pleural y otros sintomas relacionados con el cancer. Por ejemplo, los sintomas del cancer de pulm6n, incluyendo el carcinoma pulmonar de celulas pequefas y no pequefas, incluyen tos

30 persistente, esputo manchado de sangre, dolor en el pecho y neumonia o bronquitis recurrente. La evaluaci6n se puede utilizar para adaptar la dosis y el regimen de administraci6n de la terapia de combinaci6n de acuerdo con metodos conocidos en la tecnica. Metodos de prediccion de eficacia y metodos de cribado

35 [0049] Tambien se describen metodos para evaluar o predecir la eficacia de una composici6n que contiene un agente quimioterapeutico. Los metodos emplean por lo

menos dos lineas de celulas y una composici6n que contiene uno o mas agentes quimioterapeuticos. Las lineas de celulas difieren en su nivel de expresi6n de RRM1 y/o de TS. Por ejemplo, una linea de celulas expresa un nivel menor de RRM1 que una linea de celulas de control estandar, o una linea de celulas expresa un nivel mayor

5 de RRM1 que una linea de celulas de un control estandar. La linea de celulas de expresi6n mayor expresa preferiblemente al menos alrededor de un 20%, 40%, 60%, 80%, 100%, 200% o 300% mas de RRM1 y/o de TS que una linea de celulas de expresi6n menor. [0050] Cualquier manera de provocar una expresi6n aumentada o disminuida de

10 RRM1 y/o de TS se puede utilizar. Por ejemplo, una linea celular que expresa un nivel mas bajo de RRM1 y/o de TS puede ser disefada para expresar un ARNsi o ARN antisentido que provoca el nivel de expresi6n mas bajo. De forma alternativa, la expresi6n de RRM1 y/o de TS se puede colocar bajo control de un promotor regulable, como un promotor de respuesta a tetraciclina, IPTG o ecdisona. La expresi6n de

15 RRM1 y/o de TS puede ser menor que la expresi6n en una cepa madre, o la expresi6n puede estar completamente ausente antes de la inducci6n. Las celulas que expresan niveles altos de RRM1 y/o de TS pueden contener un gen RRM1 y/o TS bajo control de un promotor constitutivo que expresa RRM1 y/o TS a un nivel mas alto que el promotor de RRM1 y/o de TS end6geno, o RRM1 y/o TS puede estar expresado a

20 partir de un promotor inducible, como un promotor de respuesta a tetraciclina o IPTG, de tal manera que la inducci6n conduce la expresi6n a un nivel mayor que el de la cepa madre. Una secuencia ex6gena que conduce un nivel mas alto de expresi6n de RRM1 y/o de TS o dirige un nivel de expresi6n mas bajo puede ser integrada de forma estable en el genoma de la cepa madre o puede ser transfectada temporalmente a la

25 cepa madre. [0051] Las celulas que expresan niveles altos y bajos de RRM1 y/o de TS se ponen en contacto con un agente quimioterapeutico o una combinaci6n de agentes quimioterapeuticos candidatos (por ejemplo, 2, 3 o 4 agentes quimioterapeuticos) y las celulas se controlan para detectar un aumento de la sensibilidad o de la resistencia al

30 agente o agentes quimioterapeuticos en comparaci6n con una cepa de control. Un agente, o combinaci6n de agentes, que causa un aumento de la sensibilidad en comparaci6n con una linea celular se puede identificar como un agente terapeutico candidato para un paciente que tiene un tumor que expresa el nivel correspondiente de RRM1 y/o de TS.

35 [0052] En otro ejemplo, si las celulas que expresan niveles bajos de TS (es decir, niveles mas bajos que una cepa madre de control) son mas sensibles a un agente quimioterapeutico que las celulas de la cepa de control, el agente es un agente terapeutico candidato para el tratamiento de un paciente con un tumor que expresa niveles bajos de TS. Si las celulas que expresan niveles altos de TS (es decir, niveles mas altos que una cepa madre de control) son mas sensibles a un agente

5 quimioterapeutico que las celulas de la cepa de control, el agente es un agente terapeutico candidato para el tratamiento de un paciente con un tumor que expresa niveles altos de TS. [0053] Los metodos descritos en este documento se pueden utilizar en ensayos de cribado para identificar agentes que son candidatos al tratamiento de tumores que

10 expresan niveles altos o bajos de RRM1 y/o de TS. Las lineas celulares como las descritas anteriormente pueden ponerse en contacto con un panel de agentes (por ejemplo, farmacos de moleculas pequefas, acidos nucleicos o polipeptidos) para identificar los agentes que causan un aumento de la sensibilidad de celulas que expresan niveles bajos o altos de RRM1 y/o de TS.

15 [0054] Los agentes identificados en los metodos de cribado anteriores, o agentes o combinaciones de agentes identificados por los metodos anteriores como quimioterapias candidatas pueden ser probados en modelos animales antes de ser probados en seres humanos. Por ejemplo, las terapias pueden ser probadas para analizar la capacidad de reducir el tamafo del tumor en modelos de ratones o

20 primates, antes de ser probadas en seres humanos. Kits [0055] Los reactivos, herramientas y/o instrucciones para realizar los metodos descritos en este documento se pueden proporcionar en un kit. Por ejemplo, el kit puede contener reactivos, herramientas e instrucciones para determinar un tratamiento

25 adecuado para un paciente de cancer. Dicho kit puede incluir reactivos para la recogida de una muestra de tejido de un paciente, como por medio de biopsia, y reactivos para el procesamiento del tejido. El kit tambien puede incluir uno o mas reactivos para realizar un analisis de la expresi6n genica, tales como reactivos para la realizaci6n de la RT-PCR, analisis de Northern blot, de Western blot o

30 inmunohistoquimica para determinar los niveles de expresi6n de RRM1 y/o de TS en una muestra de tumor de un humano. Por ejemplo, los cebadores para la realizaci6n de la RT-PCR, las sondas para la realizaci6n de analisis de Northern blot, y/o anticuerpos para la realizaci6n de analisis de Western blot y de inmunohistoquimica pueden ser incluidos en dichos kits. Los tampones adecuados para los ensayos

35 tambien se pueden incluir. Los reactivos de detecci6n requeridos para cualquiera de esos ensayos tambien se pueden incluir.

[0056] Los kits presentados en este documento tambien pueden incluir una hoja de instrucciones que describe c6mo llevar a cabo los ensayos para medir la expresi6n genica. La hoja de instrucciones tambien pueden incluir instrucciones para determinar una cohorte de referencia, incluyendo c6mo determinar los niveles de expresi6n de 5 RRM1 y/o de TS en la cohorte de referencia y c6mo reunir los datos de expresi6n para establecer una referencia para su comparaci6n con un sujeto de prueba. La hoja de instrucciones tambien puede incluir instrucciones para analizar la expresi6n genica en un sujeto de prueba y para comparar el nivel de expresi6n con la expresi6n de la cohorte de referencia para determinar posteriormente la quimioterapia apropiada para

10 el paciente de prueba. Los metodos para determinar la quimioterapia apropiada se han descrito anteriormente y pueden estar descritos en detalle en la hoja de instrucciones. [0057] En otro ejemplo, un kit presentado en la invenci6n puede contener reactivos, herramientas e instrucciones para predecir la eficacia de un agente quimioterapeutico candidato en funci6n de los niveles de expresi6n de RRM1 o de TS. Dicho kit puede

15 incluir vectores para la modulaci6n de los niveles de expresi6n de RRM1 o de TS en una celula y reactivos para el control del fenotipo celular, tales como reactivos para detectar la apoptosis. Los reactivos para determinar los niveles de expresi6n de RRM1 y de TS en las muestras de tejido tambien se pueden incluir como se ha descrito anteriormente.

20 [0058] El material informativo incluido en los kits puede ser descriptivo, educativo, de marketing u otro material que se refiera a los metodos descritos en este documento y/o al uso de los reactivos para los metodos descritos en este documento. Por ejemplo, el material informativo del kit puede contener informaci6n de contacto, por ejemplo, direcci6n fisica, direcci6n de correo electr6nico, pagina web o numero de telefono,

25 donde un usuario del kit puede obtener informaci6n sustancial sobre la realizaci6n de un analisis de expresi6n genica y la interpretaci6n de los resultados, especialmente ya que se refieren a la probabilidad de que un ser humano tenga una respuesta positiva a una quimioterapia especifica. [0059] Un kit puede contener recipientes separados, separadores o compartimentos

30 para los reactivos y material informativo. Un recipiente puede ser marcado para su uso para la determinaci6n de los niveles de expresi6n genica de RRM1 y de TS y la determinaci6n subsiguiente de una quimioterapia apropiada para el ser humano. [0060] El material informativo de los kits no esta limitado en su forma. En muchos casos, el material informativo, por ejemplo, instrucciones, se proporciona en material

35 impreso, por ejemplo, un texto impreso, dibujo y/o fotografia, por ejemplo, una etiqueta u hoja impresa. Sin embargo, el material informativo tambien se puede proporcionar en otros formatos, como 8raille, material en soporte informatico, grabaci6n de video o grabaci6n de audio. Naturalmente, el material informativo tambien se puede proporcionar en cualquier combinaci6n de formatos. EJEMPLOS

5 [0061] La invenci6n se describe mas extensamente en los siguientes ejemplos, que no limitan el alcance de la invenci6n descrita en las reivindicaciones. Ejemplo 1 -Expresi6n de la proteina timidilato sintasa (TS) in situ [0062] La timidilato sintasa (TS) cataliza la conversi6n de desoxiuridina monofosfato (dUMP) en (desoxi)timidina monofosfato (TMP), que requiere la oxidaci6n de

10 tetrahidrofolato a dihidrofolato. TMP es posteriormente fosforilado a TTP, que se requiere para la sintesis y reparaci6n del ADN. 5-fluorouracilo (5FU) inhibe la sintesis de TMP y es un agente quimioterapeutico eficaz (Washtien, Mol Pharmacol 1934; 25:171-77; Moertel et al, N Engl J Med 1990; 322:352-58; Heidelberger et al, Nature 1957; 179(4561):663-6). Los altos niveles tumorales de TS se han asociado a la

15 resistencia a la quimioterapia basada en 5-FU, particularmente en pacientes con carcinoma colorrectal (CRC) y carcinoma gastrico (Johnston et al, Cancer Res 1995; 55 (7):1407-12; Leichman et al, J Clin Oncol 1997; 15(10):3223-9: Shirota et al, J Clin Oncol 2001; 19 (23):4298-304). [0063] Ya que TS esta aguas abajo de la ribonucle6tido reductasa y es crucial para la

20 formaci6n de uno de los desoxinucle6tidos necesarios para la sintesis y reparaci6n del ADN, el presente estudio se realiz6 para determinar si la expresi6n de TS a nivel de proteinas y de ARNm es pron6stico de la evoluci6n de los pacientes con CPCNP de estadio I completamente resecado que no recibieron quimioterapia o radiaci6n adicional y si la expresi6n de TS in situ esta correlacionada con la expresi6n de

25 ERCC1 y RRM1. [0064] Las dos poblaciones utilizadas en estos estudios consistieron en pacientes que se sometieron a una resecci6n completa de CPCNP en el Moffitt Cancer Center entre 1991 y 2001 y se ha descrito en otra parte (Zheng et al, N Engl J Med 2007; 356:80008). En resumen, los pacientes tenian que tener enfermedad de estadio patol6gico IA

30 o I8; adenocarcinoma, carcinoma de celulas escamosas o carcinoma de celulas grandes; sin quimioterapia o radiaci6n perioperatoria, sin cancer de pulm6n previo y sin radiaci6n previa en el pecho. Se identificaron 187 pacientes con tejido tumoral suficiente para la construcci6n de micromatrices de tejidos que componian la poblaci6n para la evaluaci6n de la expresi6n genica a nivel de proteina (tabla 1), 92

35 pacientes con tejido tumoral fresco congelado componian la poblaci6n para la evaluaci6n de la expresi6n genica a niveles de ARNm (tabla 2). Treinta y dos pacientes con valores de expresi6n genica a niveles de proteina y de ARNm se superponian entre las dos poblaciones. El seguimiento recomendado fue de tres visitas mensuales durante dos afos, seis visitas mensuales durante tres afos y, despues, visitas anuales. Para la supervivencia global, el tiempo desde el diagn6stico

5 hasta la muerte fue registrado y verificado mediante registros de estadisticas vitales. [0065] El anticuerpo monoclonal TS utilizado para el estudio estaba disponible en el mercado a traves de Lab Vision Corporation (orden # MS-471-P, lote # 471P5048). Se gener6 en ratones por medio de TS humano recombinante como antigeno. El anticuerpo elimin6 una banda dominante de aproximadamente 38 kD, la masa

10 molecular esperada de TS, con localizaci6n citoplasmatica en Western blots de lisados de linea celular de cancer de pulm6n H23 (Fig. 1). El Western blot se realiz6 de la manera siguiente. Extractos citoplasmaticos y nucleares de cultivos permanentes modificados geneticamente de la linea celular NCI-H23 se prepararon por medio de una kit de fraccionamiento nuclear/de citosol (8ioVision, Mountain View, CA). Los

15 extractos de proteinas (50 �g) se separaron por medio de geles de tris-glicina Novex 10% (Invitrogen, Carlsbad, CA) y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa pura (8io-Rad Laboratories, Hercules, CA). Las membranas se incubaron con anticuerpo TS (clon de rat6n TS-106, 1:200, Lab Vision Corp.), antisuero Oct-I (# 3342-100, 1:1000, 8ioVision, Mountain View, CA) y antisuero CAPDH (# sc-20357, 1:1000, Santa

20 Cruz 8iotechnology, Santa Cruz, CA) a 4°C durante la noche. Las bandas de proteina se visualizaron con anticuerpo secundario de peroxidasa de rabano picante de IgG anti-conejo y anti-rat6n o anti-cabra (1:1000; Santa Cruz) y sustrato de quimioluminiscencia SuperSignal West Pico (Pierce, Rockford, IL). El gen domestico GAPDH se utiliz6 como control de carga igual.

25 [0066] Se utiliz6 un microscopio confocal para determinar la localizaci6n subcelular de la proteina TS, de la siguiente manera. Se cultivaron lineas celulares de adenocarcinoma de pulm6n (H23, H125, H292, H322, A549) y lineas celulares de carcinoma de colon (H498, H508, H747, SNU-C2A, SNUC4) directamente en portaobjetos para camara Lab-Tek. Las celulas adherentes se lavaron en tamp6n

30 fosfato salino (P8S por sus siglas en ingles), se fijaron por incubaci6n durante 20 min, en paraformaldehido 4% en P8S, y se lavaron en P8S. Se permeabilizaron durante 1 hora en Triton-X100/P8S 0,25% y se lavaron en P8S. Los anticuerpos TS (1:100) se diluyeron en tamp6n de uni6n (1% 8SA/0.1NP40/P8S%), se afadieron a las camaras y se incubaron durante 1 hora. Despues de lavarlos en P8S, los portaobjetos se

35 incubaron durante 45 min. con diluciones 1:500 de IgG anti-rat6n Alexa Fluor 555 (Molecular Probes, Invitrogen, Eugene, OR). Los portaobjetos se lavaron con P8S y se cubrieron con reactivo antifade ProLong Gold con DAPI (Molecular Probes, Invitrogen). Como controles negativos, se realiz6 el mismo procedimiento sin anticuerpo primario. Las muestras fueron vistas con un microscopio confocal invertido Zeiss LSM 510 con un objetivo de inmersi6n en agua de 63x / L20NA. Los nucleos fueron visualizados con

5 DAPL. Las imagenes fueron producidas con detector fotomultiplicador dual y la suite de software 3.2.0.115 versi6n LSM 5. [0067] Los resultados indicaron que se confirm6 la localizaci6n citoplasmatica predominante de TS en 5 lineas celulares de cancer de pulm6n (Fig. 2A); sin embargo, la expresi6n nuclear de TS se observ6 en todos, y la menor fue en H23 y la mayor, en

10 A549. En contraste, en 5 lineas celulares derivadas de carcinoma de colon, la expresi6n de TS fue predominantemente nuclear. [0068] Para crear micromatrices de tejidos, se recogieron muestras de tumor de forma prospectiva, se fijaron en formalina tamponada neutra (10% v/v) y se incrustaron por completo en parafina. Se realiz6 una tinci6n hematoxilina-eosina en secciones de

15 tejido completas y se marcaron areas tumorales representativas. Se perforaron nucleos de tejido de un diametro de 0,6 mm y se dispusieron en un bloque receptor utilizando un arrayer tisular (8eecher Instrument, Silver Spring, MD). Se cortaron secciones de 5 m de espesor, se transfirieron a portaobjetos recubiertos adhesivos de 4x (Instrumedies, NJ) y se expusieron a luz UV durante 30 segundos para mejorar

20 la adherencia. [0069] La expresi6n de la proteina TS in situ se determin6 mediante AQUA en el citoplasma del tumor en dos replicas de micromatrices de tejidos que abarcaban un total de 187 pacientes con CPCNP completamente resecado que no habian recibido quimioterapia o radiaci6n perioperatoria.

25 [0070] La inmunohistoquimica (IHC por sus siglas en ingles) basada en la inmunofluorescencia combinada con analisis cuantitativo automatizado (AQUA) se utiliz6 para evaluar la expresi6n in situ de las moleculas diana. 13 antigenos fueron recuperados por medio del tratamiento por horno microondas durante 15 minutos en 0,01 mol/L de citrato de sodio a pH 6,0. Los portaobjetos fueron bloqueados durante

30 30 minutos con 0,3% de albumina de suero bovino (8SA por sus siglas en ingles) y despues fueron incubados durante la noche a temperatura ambiente con el anticuerpo primario (clon de rat6n TS-106, 1:30, # MS-471-P, Lab Vision Corp., Fremont, CA). Para la identificaci6n de celulas de carcinoma, se utiliz6 un antisuero para citoqueratina (pancitoqueratina antihumana de conejo AE1/AE3, 1:200, # Z0622,

35 Cytomation Dako). Los portaobjetos se lavaron y se incubaron con dos anticuerpos secundarios diferentes durante 1 hora (Envision® calificado de anti-rat6n de polimero HRP, # K4007, y anticonejo de cabra Alexa 555, # A21429, 1:200, Dako Cytomation). Para la amplificaci6n de fluorescencia, los portaobjetos fueron expuestos a Cy5-tiramida (1:50) durante 10 minutos a temperatura ambiente. Se montaron con reactivo Prolong Gold antifade con soluci6n DAPI (4'6'diamidino-2-fenilindole). Los

5 portaobjetos finales de micromatriz de tejido se escanearon con SpotGrabber y los datos de imagen se analizaron con AQUA (PM-2000, HistoRx, New Haven, Connecticut). La puntuaci6n AQUA mas baja posible es 0 y la mas alta es 255. [0071] Los resultados se muestran en la figura 28. Los datos de expresi6n de TS se obtuvieron en 160/187 (86%) pacientes. Los datos de expresi6n duplicados no estaban

10 disponibles para 27 muestras porque los puntos estaban ausentes en la secci6n o se habian lavado durante el procesamiento. Los valores medios oscilaron desde 5,8 hasta 238,6 (en una escala de 0 -255) con una mediana de 98,4 y una media de 98,3 (desviaci6n estandar de 53,0). Los datos estaban cerca de una distribuci6n normal, y no se realiz6 una transformaci6n de datos para su normalizaci6n. Hubo una

15 correlaci6n significativa en la expresi6n de TS entre las matrices de replica (r=0,599,

p: 0,001). [0072] No se encontr6 asociaci6n estadisticamente significativa entre la expresi6n de la proteina TS y el estadio tumoral, la histologia, el estado funcional, la ausencia o presencia de perdida de peso, el habito de fumar o el sexo (tabla 1). Los diametros

20 unidimensionales del tumor en esta cohorte de pacientes oscilaron de 0,5 a 10,8 cm y no se correlacionaron significativamente con la expresi6n de TS (r=0,051, p=0,52). No hubo correlaci6n significativa con los niveles de proteina RRM1 y ERCC1 presentados anteriormente (r=0,13 y -0,07 respectivamente, pgt;0,1) (Zheng et al, N Engl J Med 2007; 356:800-08).

Tabla 1: Caracteristicas del paciente, expresion de la proteina TS y supervivencia

Caracteristicas del paciente T5 mediante AQUA

N (187) Mediana de supervivencia global [meses] valorp de log rank Mediana N (160) valorp de Kruskal Wallis

Estadio

IA

85 100,5 ,019 99,6 71 ,818

IB

102 62,2 97,3 89

Histologla

Adeno

78 72,0 ,061 98,4 67 ,427

BAC

18 87,4 84,6 17

Escamosa

68 101,8 101,5 55

Celula grande

23 41,8 93,3 21

Estado funcional

0

128 79,0 ,034 99,8 109 ,191

1

48 52,7 90,4 41

Perdida de peso gt;5% en 3 meses

ausente

159 74,9 ,823 94,3 133 ,278

presente

14 81,3 102,9 14

Habito de fumar

Nunca

11 NA* ,077 101,2 8 ,326

Ex fumador

113 77,9 94,4 98

Activo

49 61,4 105,0 41

5exo

Mujeres

86 81,3 ,143 103,6 73 ,284

Hombres

101 69,4 91,6 87

*NA, no alcanzado

[0073] Con el metodo log-rank maximo para la determinaci6n del punto de corte 6ptimo, la diferencia de supervivencia global mas significativa se observ6 si los pacientes con niveles de :57,02 se separaron de aquellos con niveles de gt;57,02, que

5 eran el 25O percentil (40/160 pacientes) de la expresi6n de TS (Fig. 3A). La mediana de supervivencia del grupo con TS baja fue de 51,7 meses y fue de 81,3 meses para aquellos del grupo con TS alta (p=0,0013). Esta diferencia en la supervivencia continu6 siendo significativa despues de ajustar el valor p a multiples aspectos (p=0,034).

10 [0074] En el modelo multivariado final, que incluye la expresi6n de la proteina TS y el estadio del tumor (tabla 2), TS continu6 estando significativamente asociada con la supervivencia global (p 0,0013, p ajustada=0,032). El indice de riesgo de muerte fue de 0,45 para la expresi6n de la proteina TS alta frente a la baja.

Tabla 2: Modelo de regresion de Cox

Variable

N fndice de riesgo univariado (IC* 95%) valor p univariado fndice de riesgo multivariado ** (IC 95%) valor p multivariado

Grupo TS (baja = referencia)

160 0,46 (0,28 - 0,75) 0,040** 0,45 (0,28 - 0,73) 0,032***

Estadio (IA = referencia)

160 1,72 (1,06 - 2,76) 0,029 1,76 (1,08 - 2,87) 0,022

Sexo (mujeres = referencia)

160 1,23 (0,77 - 1,96) 0,393

Expresion de ERCC1

160 0,994 (0,986 - 1,002) 0,130

Expresion de RRM1

160 0,988 (0,975 - 1,002) 0,095

Estado funcional (0 = referencia)

150 1,46 (0,87 - 2,44) 0,156

*IC. intervalo de confianza **, basado en 160 pacientes, ya que se eliminaron los estados funcionales del analisis multivariado final ***, valor p ajustado para representar la seleccion de punto de corte optimo

[0075] Ademas del analisis de supervivencia previsto, se realizaron examenes exploratorios de la asociaci6n de la expresi6n de TS y la supervivencia. La expresi6n 5 de TS se incluy6 en un analisis de regresi6n de Cox como una variable continua y dio lugar a un valor p bajo tanto no ajustado (p=0,0061) como ajustado al estadio tumoral (p=0,002). Tambien se encontr6 un segundo punto de corte para la expresi6n de la proteina TS, con una puntuaci6n AQUA de 129,33 (89O percentil). La inclusi6n de este punto de corte en el analisis de la supervivencia dio lugar a una clasificaci6n de los

10 pacientes en tres grupos de supervivencia (Fig. 38). La mediana de supervivencia en el grupo con TS mas alta fue gt;120 meses, fue de 80,9 meses en el grupo con TS media y de 51,7 meses en el grupo con TS mas baja (p=0,002). [0076] Un dicotomizaci6n de los datos de expresi6n de TS utilizando la mediana de la muestra de 98,4 como un punto de corte revel6 una mediana de supervivencia global

15 de 81,3 meses para los pacientes con expresi6n de TS alta y 62,2 meses para aquellos con la expresi6n de TS baja (p=0,071). [0077] El analisis estadistico de este ejemplo se realiz6 como sigue. Los valores medios de las puntuaciones de AQUA de dos lecturas repetidas se calcularon y se

trataron como variables continuas independientes. El promedio de expresi6n de ARNm de TS se calcul6 a partir de las lecturas por triplicado y se trat6 como una variable continua independiente. El principal objetivo fue evaluar la asociaci6n entre la expresi6n de la proteina TS in situ y la supervivencia global. Para ello, la expresi6n de 5 TS no se clasific6 en categorias alta y baja a priori. En cambio, el metodo logrank maximo se utiliz6 para la determinaci6n de un punto de corte 6ptimo y ajust6 los valores p a multiples aspectos (Miller y Siegmund, 8iometries 1982, 38, 1011-1016; Hilsenbeck and Clark, Stat Med 1996; 15(1):103-12). Se consideraron los puntos de corte dentro del 80% central de la expresi6n de la proteina TS ordenada. La 10 asociaci6n entre supervivencia y expresi6n de TS baja y alta se resumi6 en una curva de supervivencia de Kaplan-Meier utilizando el percentil(es) de punto de corte determinado por la expresi6n de la proteina TS. Se realiz6 un analisis de regresi6n de Cox multivariado mediante la eliminaci6n hacia atras con una importancia nivel-estadio de 0,15 para evaluar el impacto de la expresi6n de la proteina TS en la supervivencia 15 a la vez que se ajust6 a las posibles covariables de estadio del tumor, estado funcional, sexo, expresi6n de la proteina RRM1 y expresi6n de la proteina ERCCI. La expresi6n de las proteinas RRM1 y ERCC1 se incluyeron como variables continuas. Ya que la divisi6n dicot6mica de la expresi6n de la proteina TS se obtuvo mediante selecci6n 6ptima, se ajust6 su valor p de regresi6n de Cox. El metodo logrank maximo

20 para la determinaci6n de punto de corte 6ptimo tambien se utiliz6 para examinar la asociaci6n de la expresi6n de ARNm de TS y la supervivencia global. [0078] Las asociaciones entre variables continuas se analizaron mediante el coeficiente de correlaci6n de Spearman. Las asociaciones entre variables continuas y discretas se analizaron mediante el test de Wilcoxon o el test de Kruskal-Wallis en

25 funci6n del numero de grupos discretos. El test logrank se utiliz6 para evaluar las diferencias de supervivencia entre grupos demograficos y clinicos. [0079] Mediante un enfoque estadistico riguroso para explicar las multiples pruebas, los resultados demuestran que el aumento de la expresi6n citoplasmica de TS se asoci6 con una supervivencia prolongada. Dos analisis exploratorios apoyaron este

30 hallazgo. En primer lugar, si hubieramos elegido a priori buscar una disminuci6n del riesgo de muerte con el aumento de los niveles de TS del analisis de regresi6n de Cox, se habria obtenido un resultado estadisticamente significativo (p=0,006). En segundo lugar, el riesgo de muerte cambia dramaticamente en dos niveles distintos de expresi6n de TS, 57,02 y 129,33. Este modelo de supervivencia dividi6 a los pacientes

35 en un grupo inferior 25%, un grupo medio 64% y un grupo superior 11%.

Ejemplo 2 -Expresi6n de mRNA de TS [0080] La expresi6n de ARNm de TS se determin6 en muestras de tumor fresco congelado de 92 pacientes con CPCNP de estadio 1 completamente resecado de la manera siguiente. Las muestras de tumor fresco congelado se habian recogido de forma prospectiva en 92 pacientes que cumplian los mismos criterios de selecci6n como se describe en el ejemplo 1 (tabla 3).

Tabla 3: Caracteristicas del paciente, expresion de ARNm de TS y supervivencia

Caracteristicas del paciente T5 mediante RTPeR

N (92) Mediana de supervivencia global [meses] valor p de log rank Mediana N (85) valor p de Kruskal Wallis

Estadio

IA

39 NA* ,671 3,42 37 ,642

IB

53 74,9 3,65 48

Histologla

Adeno

41 62,2 ,642 2,25 39 ,002

BAC

7 87,4 0,50 6

Escamosa

33 NR 4,73 30

Celula grande

11 69,4 5,08 10

Estado funcional

0

52 80,4 ,771 3,47 52 ,853

1-2

33 62 1 3,87 26

Perdida de peso gt;5% en 3 meses

ausente

75 80,4 ,020 3,52 69 ,703

presente

6 34,1 5,60 6

Habito de fumar

Nunca

6 31,2 ,898 4,53 4 ,057

Ex fumador

55 74,9 2,26 51

Activo

27 88,2 5,16 26

5exo

Mujeres

39 88,2 ,605 4,04 35 ,652

Hombres

53 74,9 2,33 50

* NA, no alcanzado

[0081] Se aisl6 ARN de las muestras de tumor con gt;60% de celulas que formaban el tumor y se gener6 ADNc mediante oligo-DT y cebadores aleatorios con transcriptasa inversa (QuantiTect Reverse Transcription Kit, Qiagen, Valencia. CA). Aproximadamente el 5 ng de muestra de ADNc se utiliz6 por triplicado para el analisis de la expresi6n de TS con tecnologia en tiempo real (A8I 7900HT. Foster City, CA). La cantidad relativa de ARNm de TS en una muestra se determin6 comparando el ciclo umbral con la curva estandar, y la cantidad estandarizada se determin6 despues dividiendo la cantidad de TS (A8I, HS00426591-ml, tamafo de amplic6n de 87 pb) entre la cantidad de 18SrRNA (A8I, # 4319413E). [0082] Los datos se obtuvieron de 85 pacientes (92%) y la expresi6n oscil6 desde 0,2 hasta 104,3 con una mediana de 3,5 y una media de 6,7 (desviaci6n estandar de 12,9). Los niveles de ARNm no se asociaron significativamente con el estadio tumoral, el estado funcional, el estado, ausencia o presencia de perdida de peso, el habito de fumar o el sexo (tabla 3). Sin embargo, fueron significativamente diferentes entre los subtipos histol6gicos; los niveles fueron mas bajos en adenocarcinomas en comparaci6n con los carcinomas de celulas escamosas y grandes (tabla 3). Los diametros tumorales unidimensionales de esta cohorte de pacientes oscilaron entre 1,4 y 10,8 cm y no se correlacionaron con la expresi6n de TS (r=0,165, p ::::: 0,218). [0083] El metodo log-rank maximo se utiliz6 para la determinaci6n del punto de corte 6ptimo y no se encontr6 punto de corte estadisticamente significativo para la expresi6n de ARNm de TS despues de ajustarlo a multiples aspectos (p ajustada :::: 1,0). [0084] Treinta y dos pacientes fueron comunes a ambos conjuntos de datos y, por lo tanto, tenian valores de expresi6n de TS a niveles tanto de proteina como de ARNm. Hubo una correlaci6n casi de cero entre los niveles (r=0,028. p=0,877). [0085] El analisis estadistico se realiz6 como se describe en el ejemplo 1. [0086] Estos resultados, que no lograron detectar una asociaci6n entre la expresi6n de la proteina TS y de ARNm por medio de metodos especificamente desarrollados para analisis cuantitativo, concuerdan con un informe mas reciente que demuestra una falta de correlaci6n entre los niveles de proteina y de ARNm en canceres de pulm6n para la mayoria de los genes (Chen et al, Mol Cell Prote6mica 2002; 1(4):304-13). Ejemplo 3 - Eficacia clinica y marcadores moleculares predictivos de Gerncitabina y Pemetrexed neoadyuvantes en cancer de pulm6n resecable de celulas no pequefas [0087] La incorporaci6n de quimioterapia con platino en el tratamiento del cancer de pulm6n resecable de celulas no pequefas (CPCNP) se ha convertido en el estandar de cuidado para los pacientes con enfermedad metastasica en los ganglios linfaticos Ni o N2 (The International Adjuvant Lung Cancer Trial Collaborative Group. N Engl J

Med 2004; 350:351-360; Winton et al, N Engl. J Med 2005; 352:2589-2597: Douillard et al, Lancet Oncol 2006; 7:719-727). El tratamiento neoadyuvante da lugar a tasas de respuesta de aproximadamente 33-64% (Depierre et al., J Clin Oncol 2002; 20:247253; Scagliotti, Proc Am Soc Clin Oncol 2005; 23:626s; Gilligan et al., Lancet 2007; 5 369:1929-1937; Pisters et al, Proc Am Soc Clin Oncol 2007; 25:389s) y la terapia adyuvante aumenta la supervivencia global absoluta en aproximadamente un 5-15% (The International Adjuvant Lung Cancer Trial Collaborative Group. N Engl J Med 2004; ,350:351-360: Winton et al., N Engl J Med 2005; 352:2589-2597; Douillard et al., Lancet Oncol 2006; 7:719-727). Sin embargo, el enfoque de tratamiento de todos los 10 pacientes con un regimen que contiene platino puede haber llegado a un nivel estable en cuanto a su eficacia. Ademas, hay una toxicidad significativa asociada a este enfoque que incluye una mortalidad relacionada con el tratamiento de aproximadamente un 1-2% (The International Adjuvant Lung Cancer Trial Collaborative Group. N Engl J Med 2004; 350:351-360; Pisters et al., Proc Am Soc Clin Oncol 2007;

15 25:389s). La incorporaci6n de las caracteristicas moleculares del tumor en las decisiones terapeuticas puede mejorar la eficacia y reducir la toxicidad. [0088] Este ejemplo describe un ensayo de una sola instituci6n de gemcitabina y pemetrexed neoadyuvante en pacientes con CPCNP resecable con el objetivo de describir la eficacia clinica y la tolerancia del regimen elegido y de investigar la utilidad

20 predictiva de la expresi6n de ARNm de los genes implicados en el metabolismo de estos farmacos en la eficacia terapeutica. [0089] Quimioterapia de inducci6n y toxicidad: Un total de 52 pacientes que reunian las condiciones necesarias, 26 hombres y 26 mujeres, entre las edades de 41 a 83 afos (media de 67 afos), recibieron al menos una dosis de quimioterapia. Participaron

25 entre abril de 2004 y abril de 2006 y sus caracteristicas se describen en la tabla 4. [0090] La estadificaci6n clinica se determin6 mediante examen fisico, tomografia computarizada de t6rax y abdomen superior (TC), tomografia por emisi6n de positrones FDG (PET, por sus siglas en ingles) de todo el cuerpo, imagen por resonancia magnetica del cerebro (IRM), broncoscopia y mediastinoscopia. Para reunir

30 las condiciones, fueron necesarios la confirmaci6n histol6gica del CPCNP; un estadio 18-IIIA y III8 seleccionado (2 lesiones en un l6bulo, T4), una edad gt;18 afos, un estado funcional (PS) de 0-1, enfermedad medible por Criterios de Evaluaci6n de Respuesta en Tumores S6lidos (RECIST por sus siglas en ingles) y ningun tratamiento previo para el cancer de pulm6n. Estos criterios fueron cumplidos por 52 pacientes.

35 [0091] La quimioterapia preoperatoria con gemcitabina 1500 mg/m2 seguida de pemetrexed 500 mg/m2 se administr6 en los dias 1, 15, 29 y 43. Las dosis posteriores de quimioterapia fueron retrasadas o reducidas a cause de su toxicidad si fue apropiado. Los pacientes recibieron folato oral en una dosis diaria de 350-1.000ug y vitamina 812 subcutanea en una dosis de 1.000ug cada 9 semanas comenzando una semana antes de la quimioterapia. Todas las toxicidades fueron clasificadas de

5 acuerdo con los criterios de toxicidad comunes (CTC, versi6n 3.0). [0092] Despues de la quimioterapia, se repitieron las TC y PET entre los dias 50 y 63. La respuesta radiografica se expres6 como una variable continua al calcular el porcentaje de cambio en la suma de todos los diametros de tumor mas grandes comparando las TC post-tratamiento y pre-tratamiento (1-[suma post lesiones/suma

10 pre lesiones] x 100) y tambien mediante RECIST como mejor respuesta global. [0093] Los pacientes con enfermedad resecable recibieron toracotomia entre los dias 64 y 77. La cirugia recomendada fue lobectomia o neumonectomia con disecci6n de ganglios linfaticos mediastinales. Se desaconsej6 la segmentectomia o resecci6n en cufa. Los pacientes con enfermedad no resecable y aquellos con resecciones

15 incompletas fueron tratados a discreci6n de su medico. Todos los pacientes fueron seguidos en intervalos de 3 meses y durante 2 afos con una TC. [0094] Cuarenta y dos pacientes recibieron toda la quimioterapia prevista a tiempo y sin reducci6n de dosis. Tres pacientes tuvieron retrasos de dosis sin reducciones de dosis. Las razones fueron una celulitis de las extremidades inferiores de grado 3, una

20 trombocitopenia de grado 2 y una elevaci6n de las enzimas hepaticas de grado 3. Siete pacientes recibieron menos de las 4 terapias quincenales previstas. Tres pacientes recibieron s6lo el primer ciclo debido a fiebre neutropenica de grado 3 con insuficiencia renal, una reacci6n febril a los farmacos de grado 3 y un paciente solicit6 una intervenci6n quirurgica inmediata sin haber experimentado efectos secundarios

25 relacionados con el tratamiento. Tres pacientes s6lo recibieron los ciclos I y 2. Las razones fueron flebitis en extremidad inferior de grado 3 en un paciente y fatiga de grado 3 en dos. Un paciente muri6 despues del ciclo 3 a causa de una neumonia de etiologia probablemente viral; sin embargo, no se podria excluir una etiologia posiblemente relacionada con el tratamiento.

Tabla 4: Caracteristicas del paciente, respuesta a la enfermedad y supervivencia

Tasa de respuesta a la radiografla1 Tasa de respuesta a la patologla2 Mediana de supervivencia general Mediana de supervivencia sin enfermedad3

Todos los pacientes N=52

35% (17849) 30% (13/43) gt;28,0 m gt;21,1 m

Edad mediana (rango) 67 y (41-83)

lt; 67 y N-26

38% (9/24) 25% (6/24) gt;28,0 m gt;21,1 m

? 67 y N=26

32% (8/25) 33% (7/21) gt;28,0 m p=0 86 21,0 m p=0 40

5exo

mujeres N=26

32% (8/25) 27% (6/22) gt;28,0 m 21,1 m

hombres N=26

38% (9/25) 33% (7/21) gt;28,0 m p=0,78 gt;21,1 m p=0,90

Estado funcional

cero N=31

36% (10/28) 36% (10/28) gt;28,0 m gt;21.1 m

uno N=21

33% (7/21) 20% (3/15) 16,8 m p=0,005 gt;21.1 m p=0,70

Perdida de peso4

ausente N=47

34% (15/44) 31% (12/39) gt;28,0 m gt;21,1 m

presente N=5

40% (2/5) 25% (1/4) 16,1m p=0,04 9,1 m p=0,30

Habito de fumar5

Activo N=23

30% (6/20) 21% (4/19) gt;28,0 21,1 m

Ex fumador (gt;1y) N=27

41% (11/27) 36% (8/22) gt;28,0 m p=0,35 gt;21,1 m p=0,70

Nunca N=2

NA6 (0/2) NA (1/2)

Histopatologla7

escamosa N=19

39% (7/18) 22% (4/18) gt;28,0 m gt;21,1 m

no escamosa N=33

32% (10/31) 36% (9/25) gt;28,0 m p=0,99 gt;21,1 m p=0,91

Estadio

I N=16

31% (5/16) 27% (4/15) gt;28,0 m 20,7 m

II N=18

38% (6/16) 29% (4/14) gt;28,0 m p 0,77 gt;21,1 m p=0,58

III8 N=18

35% (6/17) 36% (5/14) gt;28,0 m gt;21,1 m

Reseccion de tumor

completa N=40

37% (14/38) 33% (13/39) gt;28,0 m gt;21,1 m

incomp./no realizada N=12

27% (3/11) 0% (0/4) 12,9 m p=0,22 NA p=NA

Respuesta a la quimioterapia9

CR/PR N=17

NA (17/17) 38% (6/16) 27,4 m 18,2 m

SO N=29

NA (0/29) 24% (6/25) gt;28,0 m p=0,67 gt;21,1 m p=0,24

PO N=3

NA (0/3) 0% (0/1) gt;28,0 m

Leyenda de la tabla 4: 1no evaluado en tres pacientes; 2no evaluado en nueve pacientes; 3en los 40 pacientes con reseccion de tumor completa; 4igual o mayor que 5% durante los tres meses anteriores al diagnostico; 5se definio a un fumador que nunca ha fumado como una persona que habfa fumado menos de un total de 100 cigarrillos; 6NA, no aplicable; 721 pacientes tuvieron adenocarcinoma incluyendo 5 con caracterfsticas bronquioloalveolares, 12 tenfan otros subtipos de CPCNP incluyendo 2 carcinomas adenoescamosos, 2 carcinomas adeno y escamosos mixtos, y 1 carcinoma de celulas grandes con caracterfsticas neuroendocrinas sugestivas; 8dos T4N0, T4 debido a dos nodulos tumorales separados en un lobulo unico del pulmon; 9las categorfas de respuesta de enfermedad patologica pPR y pNR no fueron significantemente asociadas con supervivencia global aS (fndice de riesgo de pPR vs. pNR = 1,1,p = 0,90) o supervivencia sin enfermedad OFS (fndice de riesgo de pPR vs. pNR = 0,87, p = 0,78)

[0095] Respuesta radiografica a la quimioterapia: Fue posible una evaluaci6n de la respuesta radiol6gica en 49 pacientes. La mejor respuesta general fue una remisi6n completa (CR) en 1 (2% 95% IC: 01-10,9% paciente, fue una remisi6n parcial (PR) en 5 16 (33%; 95% IC: 20.0-47.5%), enfermedad estable (SD) en 29 (59%; 95% CI: 44,273,0%) y enfermedad progresiva (PD) en 3 (6%; 95% CI: 1,3-16,9%) pacientes. La respuesta oscil6 entre un aumento del 95% y una disminuci6n del 100% del tamafo de las lesiones medibles (figura 3A). No se encontraron asociaciones estadisticamente significativas entre la respuesta radiografica de la enfermedad y los parametros

10 clinicos de edad (p=0,62), sexo (p=0,96), estado funcional (p=0,94), perdida de peso (p=0,88), habito de fumar (p=0,85), histologia del tumor (p=0,95) y estadio (p 0,31) (tabla 4). [0096] Respuesta patol6gica a la quimioterapia: una evaluaci6n de la respuesta patol6gica se realiz6 mediante la determinaci6n de la proporci6n de material necr6tico

15 y/o fibr6tico en la evaluaci6n microsc6pica de luz de muestras de resecci6n quirurgica tintadas con hematoxilina-eosina. Esto fue posible en 43 pacientes, y oscil6 entre 090%. Ninguno de los pacientes tuvo una CR patol6gica (; 95% de necrosis/fibrosis), 13 (30%) tuvieron una PR patol6gica (50-94% de necrosis/fibrosis y 30 (70%) no tuvieron respuesta patol6gica (pNR). No se encontraron asociaciones estadisticamente significativas entre la respuesta patol6gica de la enfermedad y los parametros clinicos de edad (p=0,39), sexo (p=0,65), estado funcional (p=0,18),

5 perdida de peso (p=0,69), habito de fumar (p=0,96), histologia del tumor (p=0,43) y estadio (p=0,66). Aunque se encontr6 correlaci6n entre respuesta radiografica y patol6gica (rho de Spearman=0,23, es decir, una mejor respuesta clinica fue asociada a una mayor proporci6n de necrosis y fibrosis), no fue estadisticamente significativa (p=0,14).

10 [0097] Tratamiento quirurgico: Se realiz6 una toracotomia a 46 pacientes y dio lugar a una resecci6n completa en 40 pacientes. A treinta y dos pacientes se les practic6 una lobectomia, a 2 se les practic6 una bilobectomia, a 8 se les practic6 una neumonectomia, a 2 se les practic6 una resecci6n en cufa y a 2 no se les practic6 resecci6n de tumor. En la resecci6n quirurgica, 17 pacientes bajaron de estadio, 17 no

15 sufrieron cambios y 12 subieron de estadio en comparaci6n con la estadificaci6n inicial. Un paciente muri6 2,7 meses despues de una lobectomia completa central y superior derecha por un carcinoma de celulas escamosas T2N1 de una fistula broncopleural. [0098] Supervivencia: A 8 de febrero de 2008, habian ocurrido 20 sucesos y 32

20 pacientes estaban vivos (5 con una recurrencia y 5 con una resecci6n incompleta). La mediana de supervivencia global fue de gt;28,0 meses y la mediana de supervivencia sin enfermedad de los pacientes con una resecci6n quirurgica completa fue de gt;21,1 meses (figura 4). Las tasas de supervivencia global a 12 meses y 24 meses fueron de 84,6% (95% IC: 71,6-92,0%) y de 71,0% (95% IC: 56,5-81,4%) y las tasas de

25 supervivencia sin enfermedad correspondientes fueron de 67,5% (95% IC: 50,779,7%) y 53,0% (95% IC: 36,0-67,4%), respectivamente. La respuesta radiografica o patol6gica a la quimioterapia no se asoci6 significativamente con la supervivencia global o a la supervivencia sin enfermedad (tabla 4). [0099] Variables farmacogen6micas predictoras de la respuesta de la enfermedad:

30 Muestras de pre-tratamiento de tumores de cantidad y calidad suficientes para el analisis de la expresi6n genica mediante RTPCR en tiempo real estuvieron disponibles en 10 y muestras de post-tratamiento en 35 pacientes. Se evalu6 si la terapia con gemcitabina y pemetrexed alteraria los niveles de ARNm de RRMI y de TS. [0100] Las muestras tumorales fueron recogidas antes y despues de la terapia como

35 muestras congeladas. El procedimiento operativo estandar para la recolecci6n incluy6 un registro del tiempo desde la biopsia o resecci6n hasta la congelaci6n y el tiempo transcurrido fue de 30 min o menos en todos los casos. Las muestras congeladas fueron incrustadas en OCT y cortadas en secciones de 5-7 m. [0101] Las celulas tumorales se recogieron mediante microdisecci6n por captura laser (LCM por sus siglas en ingles), utilizando el sistema Arcturus. El ARN total fue extraido

5 por medio de un metodo comercial (Arcturus, Mountain View, CA) y se gener6 ADNc con oligo-dT y cebadores aleatorios. El analisis de PCR cuantitativo en tiempo real se realiz6 por triplicado por muestra (7900HT, A8I, Foster City, CA). La sonda y los cebadores de RRMI fueron los descritos previamente (8epler et al, J Clin Oncol 2004;.

22:01 878-1885). Se utilizaron cebadores y sondas disponibles en el mercado para el

10 analisis de la expresi6n de todos los otros genes diana (tabla 5). La cantidad relativa de ARNm de RRMI y de TS en una muestra se determin6 comparando el ciclo umbral con una curva estandar como se ha descrito (8epler et al, J (Clin Oncol 2004; 22:18781885) Para los genes restantes, la cuantificaci6n relativa se realiz6 mediante la comparaci6n de las muestras de ensayo con una muestra de calibrador unico en un

15 ensayo de tarjeta fluidica. Se incluyeron controles negativos sin una plantilla de ADNc en todos los experimentos. [0102] Hubo una correlaci6n significativa entre los niveles pre-y post-tratamiento de ambos genes (rho de Spearman=0,786, p=0,025) que sugiere que los niveles de expresi6n genica de quimioterapia son representativos de los niveles de

20 pretratamiento. Sin embargo, los niveles de expresi6n genica parecen aumentar con el tratamiento (figura 5). Todos los analisis posteriores se realizaron en las 35 muestras de post-tratamiento. Los rangos de expresi6n y otras caracteristicas de marcadores para todos los 14 genes estan resumidos en la tabla 5. Los niveles de ARNm de RRMI estaban significativamente correlacionados con la respuesta de la enfermedad

25 (rho=0,649, p=�0,001); es decir, los niveles bajos fueron predictivos de la reducci6n del tamafo del tumor y los niveles altos, del crecimiento del tumor (figura 38). De los 18 pacientes con expresi6n de RRMI igual o por debajo de la mediana de 1,68, a 10 se les practic6 una PR o CR, mientras que s6lo 2 de los 17 con expresi6n de RRMI alta respondieron. Los niveles de ARNm de TS se correlacionaron asimismo con la

30 respuesta de la enfermedad (rho=0,454, p=0,006) (figura 3C); sin embargo, despues de usar un ajuste de 8onferroni para multiplicidad de analisis de datos, el valor p fue superior al nivel de 0,0036. De los 18 pacientes con expresi6n de TS igual o por debajo de la mediana de 3,40, 7 recibieron una PR o CR, mientras que s6lo 5 de los 17 con expresi6n de TS alta respondieron.

35 [0103] Sorprendentemente, los niveles de expresi6n de todos los otros genes no estuvieron significativamente correlacionados con la respuesta de la enfermedad (figuras 3D y E), aunque tambien se consideran dianas de la terapeutica administrada. Los primeros siete genes enumerados en la tabla 5 estan en la via metab6lica de la gemcitabina, mientras los siete ultimos de la tabla 5 estan involucrados en el metabolismo de pemetrexed, y s6lo RRMI y TS mostraron una correlaci6n significativa (vease la columna mas a la derecha de la tabla 5).

Tabla 5: ARNm� Caracteristicas de expresion genica y asociacion con la respuesta radiografica de la enfermedad

Nombre del gen IO del conjunto de sonda N Min Max Mediana Media rho de Spearman Valor p

Respuesta clfnica

49 95% (aumento) -100% (disminuci on) -19% -19%

RRM1

subunidad reguladora de ribonucleotido reductasa * 35 0,37 7,93 1,68 2,72 0,649 �0,001

RRM2a

subunidad catalftica de ribonucleotido reductasa Hs00367247-ml 32 0,00 5,42 0,90 1,38 -0,017 0,924

RRM2b

subunidad catalftica de ribonucleotido reductasa inducible de P53 Hs00153082-ml 32 0,00 12,24 1,34 1,99 0,276 0,125

OCK

deoxicitina quinasa Hs00176127-ml 32 0,46 40,39 3,82 5,52 0,130 0,476

COA

citidina deaminasa Hs00156401-ml 32 0,00 118,66 2,42 10,27 0,028 0,878

ENT1 (SLC29A1)

transportador equilibrativo de nucleosidos 1 Hs00191940-ml 32 0,00 21,42 1,30 2,18 0,162 0,374

5�-NT (NT5CIA)

5�-nucleotidasa citosolica Hs00261369-ml 32 0,00 170843,81 0,00 10,89 -0,081 0,657

TS

timidilato sintasa Hs00426591-ml 35 0,32 18.31 3,40 4,46 0,454 0,006

OHFR

Oihidrofolato reductasa Hs00758822-sl 32 0,00 9,83 0,85 1,29 0,166 0,362

GARFT

fosforribosil glicinamida formil Hs00531926-ml 32 0,17 21,93 1,19 2,28 0,002 0,988

FPGS

folilpoliglutama to sintasa Hs00191956-ml 32 0,36 32,75 2,23 3,50 0,222 0,220

EN12 (SLC29A2)

transportador equilibrativo de nucleosidos 2 Hs00155426-ml 32 0,11 41,30 5,16 7,76 0,125 0,494

RFC1 (SLC19A1)

portador de folato reducido Hs00161870-ml 32 0,01 33,47 0,12 2,23 0,096 0,600

�-GH

gammaglutamil hidrolasa Hs00608257-ml 32 0,07 33,52 2,47 5,75 -0,015 0,934

Nombre del gen IO del conjunto de sonda N Min Max Mediana Media rho de Spearman Valor p

Respuesta clfnica

49 95% (aumento) -100% (disminuci on) -19% -19%

* 5�-FAM-TTTGC TCTTT GGATT CCGGA TCTCT TCA-TAMRA-3�

Resultados [0104] La eficacia pre-operatoria de una combinaci6n sin platino, es decir, gemcitabina y pemetrexed, se investig6 en pacientes con CPCNP resecable quirurgicamente. La

5 raz6n de esta combinaci6n fue que ambos agentes son antimetabolitos con mecanismos de acci6n relativamente bien conocidos, ambos se toleran bien y son eficaces y ya se han integrado en el cuidado del paciente. Los estudios neondjuvantes de estadio III aleatorios anteriores que utilizaron quimioterapia basada en platino habian presentado tasas de respuesta del 33%,5 41%,7 49%,6 y 64%,4.

10 Aproximadamente el 75% de los pacientes recibieron toda la quimioterapia prevista y la mortalidad relacionada con la quimioterapia fue de aproximadamente un 2%. Estas tasas de respuesta parecen mas altas que la tasa de respuesta del 35%; sin embargo, 18/52 pacientes de este estudio tenian enfermedad de estadio III, mientras que dos de los ensayos a los que se hace referencia no incluian pacientes en estadio III, 5,7 y la

15 proporci6n de pacientes en estadio III de los otros dos ensayos fue de 7%6 y 47%4, respectivamente. En dos ensayos neoadyuvantes aleatorios anteriores con terapia basada en platino en pacientes con enfermedad en estadio III, las tasas de respuesta presentadas fueron del 53% (16/30) 16 y 35% (9/26) (Roth et al,, J Natl Cancer Inst 1994;. 86:673-680). La tasa de respuesta esperada se estableci6 a priori en un 50%;

20 una meta que no se logr6. Por lo tanto, la combinaci6n de gemcitabina y pemetrexed es poco probable que sea superior a las combinaciones que contienen platino si se administra a un grupo no seleccionado de pacientes con CPCNP resecable. [0105] El ochenta y siete por ciento (45/52) de los pacientes del ensayo recibieron los 4 ciclos de tratamiento previstos. Cinco pacientes recibieron menos de 4 ciclos debido

25 a toxicidades de grado 3 relacionadas con el tratamiento y, de esos, cuatro recibieron cirugia con una resecci6n completa. Un paciente falleci6 antes de la cirugia a causa de una neumonitis presuntamente viral. Asi, la combinaci6n de pemetrexed y gemcitabina se tolera bien y se administra en cuatro tratamientos quincenales a una proporci6n de pacientes que es al menos igual a la proporci6n de pacientes que pueden recibir una

30 combinaci6n que contiene platino. [0106] Estos estudios farmacogen6micos indican que la magnitud de la respuesta del tumor a la gemcitabina y pemetrexed se asocia con la expresi6n tumoral de los genes

RRM1 y TS. Los pacientes cuyos tumores expresan estos genes en niveles bajos son mas propensos a experimentar una reducci6n del tamafo del tumor en comparaci6n con aquellos con niveles altos de expresi6n genica. Esta asociaci6n fue significativa para el gen RRM1, pero no logr6 llegar a un nivel de importancia de 0,0036 para TS. 5 Ya que un total de 14 genes fueron evaluados en estos pacientes, el nivel de importancia se ajust6 de acuerdo con 8onferroni. Este enfoque es conservador para el ajuste de la multiplicidad de analisis de datos y la mayoria de las investigaciones correlativas se llevan a cabo bajo condiciones menos rigurosas. De ese modo, el coeficiente de correlaci6n de (-)0,454 visto para la asociaci6n entre la expresi6n de TS

10 y la respuesta al tratamiento es notable y requiere una mayor exploraci6n. [0107] En resumen, las investigaciones clinicas correlativas descritas amplian la relaci6n conocida anteriormente entre la expresi6n de RRM1 y la eficacia de la gemcitabina para la combinaci6n de gemcitabina y pemetrexed. Tambien proporcionan pruebas razonables para una asociaci6n entre la expresi6n de TS y la eficacia de esa

15 combinaci6n. En un grupo no seleccionado de pacientes con CPCNP resecable, gemcitabina y pemetrexed proporcionan una tasa de respuesta radiografica objetiva del 35% con buena tolerabilidad.

Referencias adicionales [0108]

20 8epler et al ., J Clin Oncol 2004;22:1878-85. 8epler et al., J Clin Oncol 2006; 24:4731-4737 Camp et al, Nat Med 2002;8:1323-27. Ceppi et al., Cancer 2006; 107:1589-96. Chen et al., N Engl J Med 2007; 356:11-20

25 Coombes et al., Nat Med 2007; 13:1276-1278 Edler D et al., Clin Cancer Res 2000;6(2):488-92. Gautam and 8epler, Cancer Res 2006;66:6497-502. Gautam et al., Oncogene 2003;22:2135-42. Kato et al., N Engl J Med 2004;350(17):1713-21.

30 Olaussen et al., N Engl J Med 2006;355:983-91. Potti et al., N Engl J Med 2006; 355:570-580 Potti et al., Nat Med 2006; 12:1294-1300 Rimm, Nat 8iotechnol 2006;24(8):914-6. Rosell et al., N Engl J Med 1994; 330:153-158

35 Simon et al., Chest 2005;127(3):978-83, Zhou et al., Cancer Research 1995:55(6):1328-33. OTROS MODOS DE REALIZACION [0109] Se debe entender que aunque la invenci6n se ha descrito junto con la descripci6n detallada de la misma, la descripci6n anterior pretende ilustrar y no limitar el alcance de la invenci6n.

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES

   1� Un metodo para predecir la respuesta de un sujeto a un tratamiento que comprende la administraci6n de gemcitabina y pemetrexed, el metodo comprendiendo;

   a. la determinaci6n de un nivel de expresi6n genica de ribonucle6tido reductasa 5 M1 (RRM1) y timidilato sintasa (TS) en una muestra del tumor del sujeto; y

   b. la predicci6n de la respuesta del sujeto al tratamiento en funci6n del nivel de expresi6n genica de RRM1 y de TS en la muestra de tumor; en la cual si el nivel de la expresi6n genica de RRM1 es menor o igual a un nivel de referencia de expresi6n genica de RRM1; y

   10 si el nivel de expresi6n genica de TS es menor que o igual a un nivel de referencia de expresi6n genica de TS; es probable que el sujeto tenga una respuesta positiva al tratamiento.

   2� El metodo de la reivindicaci6n 1, en el cual el sujeto tiene un tumor maligno epitelial. 3� El metodo de la reivindicaci6n 1, en el cual el sujeto tiene un cancer de pulm6n, un

   15 cancer de mama, un cancer colorrectal, un cancer de cabeza y cuello o un cancer de ovario. 4� El metodo de la reivindicaci6n 3, en el cual el cancer de pulm6n es cancer de pulm6n de celulas no pequefas. 5� El metodo de la reivindicaci6n 1, en el cual el nivel de referencia de expresi6n

   20 genica de RRM1 es un nivel de la mediana de la expresi6n genica de RRM1. 6� El metodo de la reivindicaci6n 1, en el cual el nivel de referencia de expresi6n genica de TS es un nivel de la mediana de la expresi6n genica de TS.

   Valores de expresion normalizados