KR20100044780A

KR20100044780A - 암의 진단 및 치료 방법

Info

Publication number: KR20100044780A
Application number: KR1020107000955A
Authority: KR
Inventors: 제롤드 베플러
Original assignee: 유니버시티 오브 사우스 플로리다
Priority date: 2007-06-15
Filing date: 2008-06-13
Publication date: 2010-04-30
Also published as: ES2401475T3; RU2010101093A; JP2010530746A; US20090017012A1; CN101815793A; JP5479332B2; BRPI0813364A2; EP2171086B1; AU2008266048A1; EP2171086A1; MX2009013646A; CA2690865A1; WO2008157353A1; EP2171086A4

Abstract

본 발명은 리보뉴클레오티드 환원효소 M1(RRM1) 및 티미딜레이트 신타아제(TS) 유전자 발현의 종양내 발현 수준에 기초하여 대상을 위한 적절한 암 치료법을 결정하는 방법, 뿐만 아니라 TS 단백질의 세포질 수준에 기초하여 임상적 결과(예후)를 예측하는 방법에 관한 것이다. 이러한 방법에 유용한 조성물 및 키트가 또한 제공된다.

Description

암의 진단 및 치료 방법{METHODS OF DIAGNOSING AND TREATING CANCER}

[우선권의 청구]

본원은 2007년 6월 15일자로 출원된 미국 가특허 출원 일련 번호 제60/944,157호 및 2008년 3월 26일자로 출원된 제61/039,555호(이들의 전체 내용은 본원에 참고로 인용됨)의 이점을 청구한다.

[연방정부 지원 연구 또는 개발]

본 발명은 미국 국립 보건원(National Institutes of Health)의 국립 암 연구소(National Cancer Institute)에 의해 수여된 승인 번호 제RO1 CA102726호하에 정부 지원에 의해 이루어 졌다. 정부는 본 발명에 특정 권리를 갖는다.

본 발명은 암, 예컨대 비소세포(non-small cell) 폐 암종을 진단하고 치료하는 방법에 관한 것이다.

폐암은 미국에서 암 사망의 가장 흔한 원인이다. 비소세포 폐암(NSCLC: non-small cell lung cancer)은 가장 흔한 유형의 폐암으로, 폐암의 80% 이상을 차지한다. 이는 일반적으로 소세포 폐암(SCLC: small cell lung cancer)에 비해 더 천천히 성장하고 퍼진다. 종종 폐의 외부 영역에서 발견되는 선암(adenocarcinoma); 대개 기관지 옆의 폐 중심에서 발견되는 편평세포(squamous cell) 암종; 및 폐의 임의의 부분에서 발생될 수 있고 다른 2가지 유형의 NSCLC에 비해 빠르게 성장하고 퍼지는 경향이 있는 대세포 암종을 비롯하여 NSCLC의 3가지 주요 형태들이 존재한다. 예를 들면 문헌[Travis et al., Cancer 75(Suppl. 1): 191-202 (1995)]을 참조한다.

최근 연구에 의해 뉴클레오티드 대사 및 DNA 손상에 관여된 유전자가 초기-상태 비소세포 폐암(NSCLC)의 표현형 행동의 중요한 결정자라는 것이 입증되었다. 구체적으로, 리보뉴클레오티드 환원효소 M1(RRM1: Ribonucleotide Reductase M1), 리보뉴클레오티드 환원효소의 조절 서브유닛(subunit), 및 ERCC1, 뉴클레오티드 삭제 손상에 관여된 5' 뉴클레아제(nuclease)의 성분은 환자의 결과에 대한 예후이다(Bepler et al., J Clin Oncol; 22: 1878-1885 (2004); Simon et al., Chest 127(3): 978-83 (2005); Olaussen et al., N Engl J Med 355:983-991 (2006); Zheng et al., N Engl J Med 356:800-808 (2007)). 고농도의 mRNA 및 이들 유전자의 단백질 발현은 환자에서의 장기간의 생존 및 동물 모델에서의 감소된 전이 형성과 연관된다(Gautam et al., Oncogene 22:2135-2142 (2003)). 또한, 유전자이식 동물에서의 높은 RRM1 수준은 발암물질-유도된 폐 종양 형성을 보호하는 것으로 밝혀졌다(Gautam et al., Cancer Res 66:6497-6502 (2006)).

개요

본 발명은 티미딜레이트 신타아제(TS: thymidylate synthase)의 발현 수준이 NSCLC, 예를 들어 초기 단계(단계 I) NSCLC를 앓는 대상에서의 결과에 대한 예후라는 발견에 기초한다. 또한, TS 및 RRM1의 발현 수준은, 수술로 절제가능한 NSCLC를 앓는 환자에서 비-백금 2중 치료제(doublet), 즉 겜시타빈(gemcitabine) 및 페메트렉세드(pemetrexed)에 의한 수술전 치료에 대한 반응(response)과 상관관계가 있다.

따라서, 한 양태에서, 본 발명은 NSCLC, 예를 들어 초기 단계(단계 I) NSCLC를 앓는 대상에서의 결과를 예측하는 방법을 제공한다.

또다른 양태에서, 본 발명은 비-백금 대사길항물질 제제, 예를 들어 겜시타빈 및 페메트렉세드중 하나 또는 이들 둘다에 의한 수술전후기간의 치료(perioperative treatment), 예를 들어 수술전 또는 수술후 치료에 대해 환자를 선택하는 방법을 제공한다. 이 방법은 TS, 또는 TS 및 RRM1의 종양내 발현 수준을 결정하는 단계, 및 발현 수준에 기초하여 환자를 선택하는 단계를 포함한다.

또다른 양태에서, 본 발명은 대상을 위한 적절한 화학치료제를 선택하는 방법을 제공한다. 이 방법은 종양 샘플을 대상으로부터 수득하는 단계; 종양 샘플에서 리보뉴클레오티드 환원효소 M1(RRM1) 및 티미딜레이트 신타아제(TS) 유전자 발현의 수준을 결정하는 단계; 및 RRM1 및 TS 발현 수준에 기초하여 적절한 화학치료제를 선택하는 단계를 포함한다. RRM1 및 TS 발현 수준이 참고 코호트(reference cohort)의 RRM1 발현 수준 중앙값 보다 낮거나 이와 동일하다면, 겜시타빈 및 페메트렉세드를 포함한 화학치료제가 선택된다. 몇몇 실시양태에서, 이 방법은 선택된 적절한 화학치료제를 대상에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 이 방법은 제2 화학치료 제제, 예를 들어 항튜불린(antitubulin) 또는 백금-함유 제제를 대상에게 투여하는 단계를 또한 포함한다.

추가의 양태에서, 본 발명은 암, 예를 들어, NSCLC, 예를 들어, 수술가능한 NSCLC를 앓는 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 이 방법은 TS 및 RRM1의 낮은 발현 수준의 존재에 기초하여 대상을 선택하는 단계, 및 대상에게 겜시타빈 및 페메트렉세드의 조합물을, 예를 들어, 4회의 격주 치료로서 투여하는 단계를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 이 방법은 TS, 또는 TS 및 RRM1의 종양내 발현 수준을 결정함을 추가로 포함한다.

추가의 양태에서, 본 발명은 비-백금 대사길항물질 제제, 예를 들어 겜시타빈 및 페메트렉세드중 하나 또는 이들 둘다에 의한 치료, 예를 들어, 수술전 또는 수술후 치료에 대한 대상의 반응을 예측하는 방법을 제공한다. 추가의 양태에서, 본 발명은 겜시타빈 및 페메트렉세드의 투여를 포함하는 치료에 대한 대상의 반응을 예측하기 위한 방법을 제공한다. 이 방법은 종양 샘플을 대상으로부터 수득하는 단계; 종양 샘플에서 리보뉴클레오티드 환원효소 M1(RRM1) 및 티미딜레이트 신타아제(TS) 유전자 발현의 수준을 결정하는 단계; 및 종양 샘플중의 RRM1 및 TS 발현 수준에 기초하여 치료에 대한 대상의 반응을 예측하는 단계를 포함한다. RRM1 및 TS의 낮은 수준의 발현은 대상이 치료에 양성 반응을 가질 것임을 지시한다.

또다른 양태에서, 본 발명은 비소세포 폐암이 진단된 대상의 예후를 제공하기 위한 방법을 제공한다. 이 방법은 종양 샘플을 대상으로부터 수득하는 단계; 종양 샘플에서 세포질 티미딜레이트 신타아제(TS) 단백질의 수준을 결정하는 단계; 및 샘플에서의 세포질 TS 단백질의 수준을 세포질 TS 단백질의 참고 수준과 비교하는 단계를 포함한다. 참고 수준과 비교하여 샘플에서의 세포질 TS 단백질의 높은 수준은 양호한 예후를 나타내고, 참고 수준과 비교하여 세포질 TS 단백질의 낮은 수준은 불량한 예후를 나타낸다. 몇몇 실시양태에서, 세포질 TS 단백질의 수준은 정량적 제자리(in situ) 분석 방법, 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 AQUA을 사용하여 결정된다.

또다른 양태에서, 본 발명은 비-백금 대사길항물질 제제, 예를 들어 겜시타빈 및 페메트렉세드중 하나 또는 이들 둘다에 의한 치료, 예를 들어, 수술전 또는 수술후 치료의 유효성을 결정하거나 모니터링(monitoring)하는 방법을 제공한다. 이 방법은 기선 수준을 확립하기 위해 치료 이전에 TS 및/또는 RRM1의 수준을 결정하는 단계, 및 치료 개시후의 TS 및/또는 RRM1의 하나 이상의 수준을 결정하는 단계를 포함한다. 측정된 유전자의 수준에서의 변화는 치료의 효능을 나타내고; 예를 들어 TS 및/또는 RRM1의 발현에서의 증가는 치료가 효과적임을 나타낸다. 이 방법은 또한 TS 및/또는 RRM1의 수준에서의 변화에 기초하여 치료를 결정하는 단계를 포함한다.

또다른 양태에서, 본 발명은 환자로부터의 조직 샘플중의 RRM1 및 TS를 어세이하기 위한 시약 및 지침서(instruction sheet)를 포함하는 키트(kit)를 제공한다. 몇몇 실시양태에서, RRM1 및 TS 발현을 어세이하기 위한 시약은 올리고-dT 프라이머(primer), RRM1 또는 TS cDNA로 하이브리드화(hybridize)하는 정방향 프라이머, RRM1 또는 TS cDNA로 하이브리드화하는 역방향 프라이머, 역전사효소(reverse transcriptases), DNA 폴리머라아제(polymerases), 완충제, 및 뉴클레오티드로부터 선택된 그룹으로부터 선택된 미리측정된 일정량의 시약을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, RRM1 및 TS 발현을 어세이하기 위한 시약은 웨스턴 블롯(Western blot) 또는 면역조직화학 어세이(immunohistochemistry assay)를 수행하기 위해 미리측정된 일정량의 항-RRM1 및 항-TS 항체, 및 완충제를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 키트는 또한 환자로부터의 조직 샘플을 처리하기 위한 시약을 포함한다.

"증식성 질환(proliferative disorder)"은 세포 분열에서의 불규칙성을 특징으로 한다. 암(예를 들어, 신경교종, 전립선암, 흑색종, 암종, 자궁경부암, 유방암, 결장암, 또는 육종)은 증식성 질환의 일예이다. 증식성 질환의 특징적 세포(즉, "신생(neoplastic) 세포" 또는 "종양 세포")는 자율적 성장 능력, 즉 세포 개체군의 비적합한 증식적 성장을 특징으로 하는 비정상적 상태 또는 증상을 갖는다. 신생 세포 또는 종양 세포는 비정상적으로 높은 속도로 증식하는 세포이다. 신생 세포를 포함하는 새로운 성장체는 "종양"으로서도 공지된 신생물(neoplasm)이다. 종양은 정상 조직에 비해 더 신속히 세포 증식에 의해 성장하는, 일반적으로 별개의 덩어리를 형성하는 비정상적 조직 성장체이다. 종양은 정상 조직과의 기능적 조화 및 구조적 체계가 부분적으로 또는 전체적으로 결여되어 있다. 본원에서 사용될 경우, 종양은 고형 종양 뿐만 아니라 조혈성(hematopoietic) 종양을 내포하도록 의도된다.

종양은 양성(양성 종양) 또는 악성(악성 종양 또는 암)일 수 있다. 악성 종양은 넓게 3가지 주요 유형으로 분류될 수 있다. 상피 구조물로부터 발생된 악성 종양은 암종으로 일컬어 지고; 연결 조직, 예컨대 근육, 연골, 지방 또는 골로부터 기원된 악성 종양은 육종으로 일컬어 지고; 면역계의 성분을 비롯한 조혈 구조물(혈액 세포의 형성에 관련된 구조물)에 영향을 주는 악성 종양은 백혈병 및 림프종으로 일컬어 진다. 다른 종양으로는, 제한되지 않지만, 신경섬유종이 포함된다.

증식성 질환으로는, 침입의 조직병리학적 유형 및 단계와 무관하게, 모든 유형의 암적 성장 또는 종양원성 과정, 전이성 조직 또는 악성 변형 세포, 조직 또는 기관이 포함된다. 암으로는 다양한 기관 시스템, 예컨대 폐, 유방, 갑상선, 림프, 위장관 및 요로관의 악성 종양, 뿐만 아니라 대부분의 결장암, 신장-세포 암종, 전립선암 및/또는 고환 종양과 같은 악성 종양을 비롯한 선암, 폐의 비소세포 암종, 소장암 및 식도암이 포함된다. 암종으로는 상피 또는 내분비 조직의 악성 종양, 예컨대 호흡계 암종, 위장관계 암종, 요로계 암종, 고환 암종, 유방 암종, 전립선 암종, 내분비계 암종, 및 흑색종이 포함된다. 다른 암종으로는 자궁경부, 폐, 두경부(head and neck), 결장 및 난소의 조직으로부터 형성된 암종이 포함된다. 중추 신경계의 암으로는 신경교종[성상세포종, 혼합된 희소성아교세포종(oligoastrocytomas), 다형성교모세포종(glioblastoma multiform), 상의세포종(ependymoma), 및 핍지교종(oligodendroglioma)이 포함됨], 뇌수막종, 뇌하수체 종양, 혈관아세포종(hemangioblastomas), 청신경종양(acoustic neuroma), 송과선(pineal gland) 종양, 척수 조양, 조혈세포 종양, 및 중추 신경계 림프종이 포함된다. 연결 조직, 예컨대 지방, 근육, 혈관, 진피(deep skin) 조직, 골, 및 연골에 영향을 주는 암은 육종으로 일컬어 진다. 육종으로는, 예를 들면, 지방육종, 평활근육종, 횡문근육종, 활막육종(synovial sarcoma), 혈관육종(angiosarcoma), 섬유육종(fibrosarcoma), 신경섬유육종(neurofibrosarcoma), 위장관 간질 종양(GIST: Gastroinestinal Stromal Tumor), 유건종(desmoid trumor), 유잉 육종(Ewing's sarcoma), 골육종 및 연골육종이 포함된다.

본원에 기재된 방법은 상피성 악성 종양, 예컨대 폐암(예를 들어, 비소세포 폐암(NSCLC)), 유방암, 직장결장암, 두경부암, 또는 난소암을 앓는 인간의 치료와 특히 관련된다. 상피성 악성 종양은 상피 조직에 영향을 주는 암이다.

본원에 기재된 바와 같은 "대상"은 증식성 질환을 앓는 임의의 대상일 수 있다. 예를 들면, 대상은 임의의 포유동물, 예컨대 인간 암 환자를 비롯한 인간일 수 있다. 예시적인 인간 이외의 포유동물로는 인간 이외의 영장류(예컨대, 원숭이 또는 유인원), 마우스, 래트, 염소, 암소, 황소, 돼지, 말, 양, 야생 수퇘지, 해달, 고양이 및 개가 포함된다. 본원에 기재된 방법은 태아(예를 들어, 자궁내), 영아, 유아, 청소년, 성인 또는 노인을 비롯한 임의의 연령의 임의의 대상에서 수행될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 대상은 상피성 악성 종양; 폐암, 예를 들어, 비소세포 폐암; 유방암; 직장결장암; 두경부암; 또는 난소암을 앓는다.

본원에서 사용되는 "대사길항물질"은 정상적인 생화학적 반응에 필요한 물질(대사물질)과 유사한 구조를 갖지만 세포의 정상적 기능을 간섭하기에 충분히 상이한 화학성분이다. 대사길항물질로는 DNA 합성을 간섭하는 퓨린 및 피리미딘 유사체가 포함된다. 예시적인 대사길항물질로는, 예를 들어, 아미노프테린(aminopterin), 2-클로로데옥시아데노신, 사이토신 아라비노시드(ara C: cytosine arabinoside), 시트라빈(cytarabine), 플루다라빈(fludarabine), 플루오로우라실(5-FU: fluorouracil)[및 카페시타빈(capecitabine) 및 테가퓨어(tegafur)를 비롯한 이의 유도체], 겜시타빈, 메토프테린(methopterin), 메토트렉세이트(methotrexate), 페메트렉세드, 랄티트렉세드(raltitrexed), 트리메트렉세이트(trimetrexate), 6-머캅토퓨린 및 6-티오구아닌이 포함된다.

본원에서 사용되는 "항튜불린(antitubulin)"은 유사분열 방추를 저해함으로써 세포 분열을 차단하는 화학치료 제제를 지칭한다. 항튜불린제로는, 예를 들면, 탁산스 파클리탁셀(taxanes paclitaxel) 및 도데탁셀(docetaxel), 및 빈카 알칼로이드 비노렐빈(vinca alkaloids vinorelbine), 빈크리스틴(vincristine), 빈블라스틴(vinblastine), 빈플루닌(vinflunine), 및 빈데신(vindesine)이 포함된다.

본원에서 사용되는 "백금-함유 제제"로는 백금을 함유하는 화학치료 제제가 포함된다. 백금-함유 제제는 DNA와 가교결합하여 이를 알킬화시킴으로써, DNA 합성 및 전사를 저해한다. 백금-함유 제제는 임의의 세포 주기에서 작용하고, 결과적으로 신생물 뿐만 아니라 건강한 분열중인 세포를 사멸시킬 수 있다. 백금-함유 제제로는, 예를 들면, 시스플라틴(cisplatin), 카보플라틴(carboplatin) 및 옥살리플라틴(oxaliplatin)이 포함된다.

별도로 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 용어 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 당분야의 숙련가중 1명에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 방법 및 재료는 본 발명에 사용하기 위해 본원에 기재되어 있고, 당분야에 공지된 다른 적합한 방법 및 재료가 또한 사용될 수 있다. 재료, 방법 및 실시예는 단지 예시적인 것으로 제한하려는 것이 아니다. 본원에 언급된 모든 공보, 특허 출원, 특허, 서열, 데이타베이스 항목(database entry), 및 기타 참고문헌은 본원에 참고로 이들 전체가 인용되어 있다. 상충되는 경우, 정의를 비롯하여 본 명세서는 조절될 것이다.

본 발명의 다른 특징 및 이점은 하기 상세한 설명 및 도면, 및 특허청구범위로부터 명백할 것이다.

상세한 설명

NSCLC에 대한 현행 연구 노력의 주요 목표는, 임상 치료학적 결정에 분자 파라미터를 혼입함으로써, 완전한 수술 절제 환자에서 수술전후기간의 전신적 치료법의 효능을 증가시키는 것이다. 본원에 기재된 바와 같이, 티미딜레이트 신타아제(TS) 유전자의 종양내 발현 수준은 임상적 결과와 상관관계가 있고, TS 및 리보뉴클레오티드 환원효소 M1(RRM1)의 수준은 비-백금 대사길항물질 약물에 의한 치료에 대한 종양 반응성과 상관관계가 있다.

비소세포 폐암( NSCLC )

NSCLC를 진단하는 방법은 당분야에 공지되어 있다. 진단 절차는 개별 환자에 대해 개인적으로 맞춰져야 하고, 다음을 포함할 수 있다:

- 장기-지속된 양성 병변을 배제하거나 악성 병변의 진행 속도를 결정하기 위한 이전의 흉부 X-선의 검토.

- 객담 세포진검사(sputum cytology)

- 기관지경검사(bronchoscopy), 기관지내 병변의 생검, 브러싱(brushing) 및 세척, 기관지경검사후 객담 세포진검사.

- 종격동(mediastinal) 림프절에서 수술불가 전이를 배제하기 위한 종격동경검사(mediastinoscopy).

- 경피성 세침(fine needle) 생검

- 쉽게 접근가능한 부차적 침전물의 적출 또는 침 생검.

진단의 조직학적 또는 세포학적 검증이 수득되어야 한다.

단계분류(staging)는 또한 당분야에 공지된 방법, 예를 들어, 문헌[Mountain, Chest 111 :1710-17 (1997)]; [Pisters and Gail, J. Thoracic One. 2(7):583-584 (2007)]; [Rami-Porta et al., J. Thoracic One. 2(7):593-602 (2007)]; [Rusch et al., J. Thoracic One. 2(7):603-612 (2007)]; [Postmus et al., J. Thoracic One. 2(8):686-693 (2007)]; [Groome et al., J. Thoracic One. 2(8):694-705 (2007)]; 및 [Goldstraw et al., J. Thoracic One. 2(8):706-714 (2007)]에 기재된 바와 같은, 국제적으로 허용된 국제 암 예방 연합(UICC: International Union Against Cancer) 종양/절/전이(TNM: Tumor/Node/Metastasis) 분류 시스템을 사용하여 수행될 수 있다. 간단히, "T"는 종양의 크기 및 이것이 조직 근처로 침입했느냐의 여부를 표시하고, "N"은 관여된 임의의 림프절을 표시하고, "M"은 전이(하나의 신체 부분으로부터 다른 부분으로의 암의 퍼짐)를 표시한다. TNM 등급에 따르면, 단계 0은 제자리에서의 암종을 지시하고, 이는 이것이 시작된 세포의 층에만 존재하는 초기 암이다. 단계 I, II, III, 및 IV는 계속 악화된 질병 상태를 지시한다. 보다 높은 단계는, 보다 큰 종양 크기 및/또는 림프절 및/또는 1차 종양에 인접한 기관 부근으로의 암의 퍼짐에 의해 입증되는 바와 같은 보다 광범위한 질병을 지시한다. 단계 IV에서, 종양은 하나 이상의 다른 기관으로 퍼져 있다.

예후 방법

본원에 기재된 바와 같이, TS 단백질, 예를 들어, 세포질 TS 단백질의 수준은 예후를 결정하기 위해, 예를 들어, 연장된 기간에 걸친 생존 가능성을 결정하기 위해 사용될 수 있다. 이들 방법에서, 종양 세포를 포함하는 샘플은 대상으로부터 취해지고, TS 단백질의 수준은 당분야에 공지된 방법, 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 방법을 사용하여 결정된다. 예를 들면, TS 단백질 발현 수준은 단백질 발현의 정량적 제자리 분석의 방법을 사용하여, 예를 들어, 자동화된 정량적 분석(AQUA: automated quantitative analysis)에 의해 결정될 수 있고, 예를 들어, 문헌[Camp et al., Nat. Med. 8:1323-1327 (2002)]을 참조한다. 샘플중의 종양 세포중의 TS 수준을 참고 수준과 비교하는 것은 대상의 가능한 결과를 나타낸다. 몇몇 실시양태에서, 이러한 비교는 본원에 기재된 참고 코호트에서의 TS 단백질 발현에 의해 결정된 컷포인트 백분위수(들)로 만들어 진다. 몇몇 실시양태에서, 참고 컷포인트는 약 89번째 백분위수인 발현 수준이고; 이러한 컷포인트를 초과한, 예를 들어, 발현 수준의 최상위 11% 이내의 대상은 개선된 생존 기회를 갖고, 이러한 컷포인트 아래의 대상은 보다 불량한 예후를 갖는다. 몇몇 실시양태에서, 2개의 참고 컷포인트가 하위 25% 그룹, 중간 64% 그룹, 및 상위 11% 그룹에서 사용되고; 최하위 25%에 속하는 대상은 부정적 결과(사망)의 가장 높은 위험을 갖고, 중간 64%에 속하는 대상은 중간 위험 수준을 갖고, 최상위 11%에 속하는 대상은 가장 위험이 낮다. 예를 들면, 실시예 1 및 도 2A-B를 참조한다. 몇몇 실시양태에서, 환자를 어떻게 적극적으로 치료하는지에 관한 결정은 이들 방법에 의해 제공되는 예후적 정보에 기초하여 이루어지고, 예를 들어, 부정적 결과의 보다 높은 위험을 갖는 대상은 보다 적극적으로, 또는 추가의 치료 양식, 예를 들어, 방사선 또는 본원에 기재된 바와 같은 다른 화학치료 제제를 투여하여 치료된다.

암 치료법을 결정하는 방법

적절한 암 치료법을 결정하거나 선택하는 방법은 환자로부터의 종양 샘플을 수득하거나 제공하는 단계, 및 환자에서의 RRM1 또는 TS의 발현 수준을 결정하는 단계를 포함한다. RRM1 및 TS의 종양내 수준이 낮으면, 겜시타빈 및 페메트렉세드의 조합물을 함유하는 화학치료법이 적절한 것으로 결정될 수 있다. RRM1 및/또는 TS의 종양내 수준이 높으면, 겜시타빈 및 페메트렉세드 부재의 화학치료법이 적절한 것으로 결정될 수 있다.

"낮은" 및 "높은" 발현 수준은 상대적인 값이고, 참고 코호트의 수준과의 비교에 기초한다. 본원에서 사용되는 "참고 코호트"는 RRM1 및/또는 TS 발현 데이터가 수집되는 샘플 암 모집단이다. 참고 코호트에서의 발현 수준은 샘플 모집단에서의 종양내 유전자 발현 수준을 측정함으로써 결정된다(예를 들어, 문헌[Rosell et al., Clin Cancer Res 10:1318-25, 2004]; [Lord et al., Clin Cancer Res 8:2286-2291, 2002]; [Bepler et al., J Clin Oncol 22: 1878-85, 2004]; 및 [Simon et al., Chest 127:978-83, 2005] 참조). 전형적으로, 종양은, 발현 수준이 참고 코호트에서의 RRM1 발현 수준 중앙값과 동일하거나 이보다 적은 경우 "낮은" RRM1 수준을 나타내고, 종양은, 발현 수준이 참고 코호트에서의 RRM1 발현 수준 중앙값 보다 큰 경우 "높은" RRM1 수준을 나타낸다. 유사하게, 종양은, 발현 수준이 참고 코호트에서의 TS 발현 수준 중앙값과 동일하거나 이보다 적은 경우 "낮은" TS 수준을 나타낸다. "낮은" 발현 수준 및 "높은" 발현 수준은 상대적이고, 각각의 신규 참고 그룹에 의해 확립될 수 있다. 한 다른 양태에서, 화학치료법에 대한 대상의 반응을 예측하기 위해 결정된 발현 수준은 참고 코호트의 최저 3분위수 또는 최저 4분위수의 발현 수준과 동일하거나 이보다 적을 수 있거나, 또는 예측 발현 수준이 참고 코호트의 최고 3분위수 또는 최고 4분위수의 발현 수준과 동일하거나 이보다 크다고 결정될 수 있다.

종양 샘플

종양 샘플을 수득하기 위해 임의의 방법, 예컨대 생검(예를 들어, 중앙부 침 생검(core needle biopsy))이 사용될 수 있고, 조직은 처리를 위해 최적 조직 절단 화합물(OCT(등록상표): Optimal Tissue Cutting compound)에 함침될 수 있다. 예를 들면, OCT(등록상표)중의 조직은 동결된 구획으로 처리될 수 있다. 종양 세포는, 예컨대 레이저 포획 현미해부(LCM: laser capture microdissection)에 의해 수집될 수 있고, 유전자 발현은 예를 들면, 폴리머라아제 쇄 반응에 커플링된 역전사(RT-PCR: reverse transcription coupled to polymerase chain reaction) 또는 RNA 수준을 측정하기 위한 노던 블롯(Northern blot) 분석, 또는 단백질 수준을 측정하기 위한 웨스턴 블롯(Western blot)에 의해 어세이될 수 있다. 한 예시적인 접근법에서, RRM1 또는 TS 발현 수준은 실제-시간 정량적 RT-PCR에 의해 어세이될 수 있다. 이들 유전자의 발현 수준은 또한 면역조직화학법에 의해, 예를 들어, 고정된 견본에서(예를 들어, 포르말린으로 고정됨) 결정될 수 있다.

참고 코호트

참고 코호트로부터의 샘플은 동일한 종의 대상(예를 들어, 인간 대상)으로부터 취해지고, 참고 코호트의 종양은 바람직하게는 동일한 유형의 종양(예를 들어, NSCLC의 종양)이다. 예를 들면, 참고 코호트의 종양은 모두, 예를 들면, 암종, 조혈 종양, 뇌종양, 또는 육종일 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 참고 코호트의 종양은 모두, 예를 들면, 폐암, 유방암, 직장결장암, 두경부암 또는 남소암으로부터의 종양일 수 있다. 참고 코호트의 개별 구성원은 또한 다른 유사성, 예컨대 질병의 단계, 이전의 치료 섭생, 생활 양식(예를 들어, 흡연가 또는 비흡연가, 과체중 또는 저체중), 또는 다른 인구통계학(예를 들어, 연령, 유전적 기질)에서의 유사성을 공유할 수 있다. 예를 들면, 동일한 유형의 종양을 앓는다는 점 이외에, 참고 코호트의 환자는 임의의 중요한 전신적 화학치료법을 수여받지 않았을 수 있다. 참고 코호트는 10명 이상의 대상, 예를 들어, 15명, 20명, 25명, 30명, 40명, 50명, 60명, 70명, 80명, 90명, 100명, 120명, 140명, 160명, 180명, 또는 200명 또는 그 이상의 대상으로부터의 종양 샘플로부터 취해진 유전자 발현 분석 데이터를 포함해야 한다.

유전자 발현 및 단백질 수준의 결정

참고 코호트에서 유전자 발현 수준은 임의의 방법, 예컨대 정량적 RT-PCR, 노던 블롯 분석, 웨스턴 블롯 분석, 또는 면역조직화학법에 의해 결정될 수 있다. 시험 대상으로부터의 종양 샘플에서의 발현 수준은 참고 코호트에서의 발현 수준과 동일한 방식으로 결정된다.

본 방법에 유용한 서열로는, 인간에서 실행될 경우, 제한되지 않지만 다음이 포함된다:

-RRM1 서열: 유전자ID: 6240-인간 RRM1-NM_001033.3 및 NP_OO1024.1; 유전자=NC_000011.8 참고 어셈블리(assembly), 범위 4072500-4116682; NT_009237.17, 범위 2903165-2947347

-TS 서열: 유전자ID: 7298-인간 TS NM_001071.2 및 NP_OO1062.1; 유전자=NC_000018.8 참고 어셈블리-범위 647651-663492; NT_010859.14, 범위 647651-663492.

예를 들어 웨스턴 블로팅을 사용하여 단백질 수준을 결정하는 것이 바람직한 경우, 다음의 항체가 사용될 수 있고; 다른 항체 또한 유용할 것이다:

-특히 산타 크루즈 바이오테크놀로지 인코포레이티드(Santa Cruz Biotechnology, Inc.), 노부스 바이올로지칼스(Novus Biologicals), 프로테인테크 그룹 인코포레이티드(Proteintech Group, Inc.), 및 압노바 코포레이션(Abnova Corporation)으로부터 시판되는 항-RRM1.

-특히 아빔(Abeam), 세로텍(Serotec), 아크리스 안티바디스 게엠베하(Acris Antibodies GmbH), 인비트로겐(Invitrogen), 랩 비전(Lab Vision), 밀리포어 코포레이션(Millipore Corporation), 노부스 바이올로지칼스(Novus Biologicals), 프로사이언스 인코포레이티드(ProSci, Inc.), 록랜드 이뮤노케미칼스 인코포레이티드(Rockland Immunochemicals, Inc.) 및 산타 크루즈 바이오테크놀로지 인코포레이티드(Santa Cruz Biotechnology, Inc.)로부터 시판되는 항 TS.

치료학적 섭생의 선택

종양은 RRM1 또는 TS 또는 이들 둘다의 발현 수준을 위해 샘플링될 수 있고, 관찰된 발현 수준에 기초하여 적절한 화학치료법이 결정될 수 있다. 화학치료법은 단일 제제 또는 복합 화학치료 제제(예를 들어, 2종, 3종 또는 그 이상의 화학치료 제제)를 포함할 수 있다.

한 예에서, RRM1 및 TS 둘다의 종양내 발현 수준이 결정되고, 적절한 화학치료 제제가 두 유전자의 발현 수준에 기초하여 결정된다. 예를 들면, RRM1 및 TS 발현 수준이 둘다 낮은 것으로 결정되면, 겜시타빈 및 페메트렉세드의 조합물을 포함하는 적절한 화학치료법이 선택될 수 있다. RRM1 수준이 낮고 TS 수준이 높은 것으로 결정되면, 겜시타빈을 포함하고 페메트렉세드가 배제되며 선택가능한 제2 제제, 예컨대 항튜불린 또는 알킬화제가 포함될 수 있는 적절한 화학치료법이 결정될 수 있다. 이러한 화학치료학적 조성물은 백금-함유 제제를 포함할 수 있다. RRM1 수준이 높고 TS 수준이 낮은 것으로 결정되는 경우, 적절한 화학치료법은 겜시타빈을 포함하여서는 안되지만, 페메트렉세드, 및 선택가능한 제2 제제, 예컨대 항튜불린 또는 알킬화제를 포함할 수 있다. RRM1 및 TS 수준이 둘다 높은 것으로 결정되면, 항튜불린을 포함하는 적절한 화학치료법이 결정될 수 있다. 이 화학치료법은 대사길항물질을 포함하지 않아야 한다.

추가의 치료

일반적으로, NSCLC로 진단된 대상은 수술적 절제; 방사선; 및 보조적 및/또는 신보조적(neoadjuvant) 화학치료법으로 치료되고, 예를 들어, 문헌[Kris et al,. Oncologist 10(Suppl.2):23-29 (2005)]을 참조한다. NSCLC를 치료하기 위한 현행 표준 케어(care)는, 실행가능한 경우, 수술적 절제이고, 이후 단계 II 및 III에서 보조적 화학치료법이 수행되고; 문헌[Allen and Jahanzeb, J. Natl. Compr. Cane. Netw. 6(3):285-293 (2008)]을 참조한다. 또한 방사선치료법의 동시적 또는 연속적 부가를 포함하는 3양식(trimodal) 접근법이 사용된다. 따라서, 본원에 기재된 방법은, 임의의 추가의 치료 양식, 예를 들어, 수술적 절제 및/또는 방사선의 사용을 포함할 수 있다.

다른 화학치료 제제는 대사길항물질 조합물, 예를 들어, 항튜불린 또는 백금-함유 제제와 함께 또한 투여될 수 있다. 다른 화학치료 제제로는, 예를 들면, L-아스파라기나아제(asparaginase), 비칼루타미드(bicalutamide), 벨로마이신(bleomycin), 캄프토테신(camptothecin)(CPT-11), 카미노마이신(carminomycin), 사이클로포스파미드(cyclophosphamide), 사이토신 아라비노시드, 다카바진(dacarbazine), 닥티노마이신(dactinomycin), 독소루비신(doxorubicin), 다우노루비신(daunorubicin), 엑테이나시딘(ecteinascidin) 743, 에스트라무스틴(estramustine), 에토포시드(etoposide), 에토포시드 포스페이트, 에포틸론(epothilone), 플루타미드(flutamide), FK506, 헥사메틸 멜라민, 이다트렉세이트(idatrexate), 레플룬이미드(leflunimide), 류프롤리드(leuprolide), 류로시딘(leurosidine), 류로신(leurosine), 멜팔란(melphalan), 미토마이신(mitomycin) C, 마이코페놀레이트 모페틸(mycophenolate mofetil), 필카마이신(plicamycin), 포도필로톡신(podophyllotoxin), 포르피로마이신(porfiromycin), 란피마아제(ranpimase), 라파마이신(rapamycin), 토포테칸(topotecan), 테니포시드(teniposide), 및 티오테파(thiotepa)가 포함된다.

투약 및 투여

화학치료제, 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 RRM1 및/또는 TS 발현 수준에 기초하여 대상을 위해 선택된 페메트렉세드/겜시타빈 조합 치료제는 통상의 투약 섭생을 사용하여 대상에게 투여될 수 있다.

화학치료제는 경구적으로, 예컨대 환의 형태로, 정맥내로, 신체 강(예컨대 방광)으로의 주사에 의해, 근육내로 또는 경막내로(intrathecally) 투여될 수 있다. 화학치료제 섭생은 연속적인 섭생으로서, 예를 들어, 정맥내, 경구적, 또는 체강내로 전달될 수 있다. 화학치료제 섭생은 약물이 투여되고 휴식 및 회복 기간이 수반되는 날 또는 날들을 포함하는 주기로 전달될 수 있다. 회복 기간은 1주, 2주, 3주 또는 4주 이상 지속될 수 있고, 이어서 주기는 반복된다. 화학치료법의 과정은 2 주기 이상 내지 12 주기(예를 들어, 3, 4, 5, 6, 7, 10 또는 12 주기)를 포함할 수 있다.

본원에 구현된 방법으로부터 수득된 유전자 발현 데이터는, 인구통계학적 데이터; 생존유지(vital) 상태; 교육; 알코올, 담배 및 약물 남용에 대한 이력; 병력; 및 상기 기재된 바와 같이 고안된 화학치료제의 투여후 증식성 질환의 예후와 관련된 결과를 조정하기 위한 문서화된 치료를 비롯한 환자의 의료 기록으로부터의 정보와 조합될 수 있다.

종양내 RRM1 또는 TS 발현 수준에 따른 화학치료제의 투여시, 환자는 치료법에 대한 반응을 위해 모니터링될 수 있다. 예를 들면, 종양 측정은 질병 진행을 모니터링하기 위해 화학치료제의 투여 전후에 이루어질 수 있다. 종양 크기가 감소하면, 질병은 완화, 또는 완화로 복귀된 것으로 결정될 수 있다. 종양 크기의 부분적 감소는 질병이 부분적으로 완화됨을 나타낼 수 있고, 종양이 완전히 사라진다면, 질병은 완전히 완화된 것으로 일컬어 질 수 있다. 종양 크기가 증가하면, 질병은 진행중인 것으로 결정될 수 있다. 화학치료제의 투여후 종양 크기가 변하지 않으면, 질병은 안정한 것으로 구분될 수 있다.

한 대상은 또한 체중 감소, 늑막 삼출, 및 암과 관련된 다른 증후와 같은 인자에 주의하여 그의 신체 조건에 따라 평가될 수 있다. 예를 들면, 소세포 및 비소세포 폐 암종을 비롯한 폐암의 증후로는 지속적인 기침, 혈액이 섞인 객담, 흉부 통증, 및 반복적인 폐렴 및 기관지염이 포함된다. 평가는 당분야에 공지된 방법에 따른 조합 치료제의 투약 및 투여 섭생을 조정하기 위해 사용될 수 있다.

효능을 예측하는 방법 및 스크리닝 방법

본 발명은 또한 화학치료 제제를 함유하는 조성물의 효능을 평가 또는 예측하는 방법을 구현한다. 이 방법은 2종 이상의 세포주, 및 하나 이상의 화학치료 제제를 함유하는 조성물을 사용한다. 세포주는 이들의 RRM1 및/또는 TS의 발현 수준에 있어서 상이하다. 예를 들면, 하나의 세포주는 표준 대조 세포주에 비해 낮은 수준으로 RRM1을 발현하거나, 하나의 세포주는 표준 대조 세포주에 비해 높은 수준으로 RRM1을 발현한다. 보다 높은-발현 세포주는 바람직하게는 보다 낮은-발현 세포주에 비해 약 20%, 40%, 60%, 80%, 100%, 200% 또는 300% 이상으로 RRM1 및/또는 TS를 발현한다.

RRM1 및/또는 TS의 증가되거나 감소된 발현을 유발시키는 임의의 방식이 이용될 수 있다. 예를 들면, 보다 낮은 수준의 RRM1 및/또는 TS를 발현하는 세포주는 siRNA 또는 안티센스(antisense) RNA(이는 보다 낮은 수준의 발현을 유발함)를 발현하도록 조작될 수 있다. 다르게는, RRM1 및/또는 TS 발현은 조절가능한 프로모터, 예컨대 테트라사이클린-, IPTG-, 또는 엑디손(ecdysone)-반응성 프로모터의 제어하에 놓아질 수 있다. RRM1 및/또는 TS 발현은 모 균주에서의 발현에 비해 낮을 수 있거나, 발현은 유도 이전에 완전히 존재하지 않을 수 있다. RRM1 및/또는 TS를 높은 수준으로 발현하는 세포는 RRM1 및/또는 TS 유전자를 내생성 RRM1 및/또는 TS 프로모터에 비해 높은 수준으로 발현하는 구성적 프로모터의 제어하에 RRM1 및/또는 TS 유전자를 함유할 수 있거나, RRM1 및/또는 TS는 유도가능한 프로모터, 예컨대 테트라사이클린- 또는 IPTG-반응성 프로모터로부터 발현되어, 모 균주에서의 수준에 비해 더 큰 수준으로 발현을 이끌어낼 수 있다. 보다 높은 수준의 RRM1 및/또는 TS 발현을 이끌어내거나 보다 낮은 수준의 발현을 유도하는 외생성 서열은 모 균주의 게놈내로 안정하게 조립될 수 있거나, 모 균주내로 일시적으로 형질감염될 수 있다.

RRM1 및/또는 TS를 높고 낮은 수준으로 발현하는 세포들은 유력한 화학치료 제제 또는 제제들의 조합물(예를 들어, 2종, 3종, 또는 4종의 화학치료 제제)과 접촉되고, 세포는 대조 균주와 비교될 경우 화학치료 제제 또는 제제들에 대한 증가된 감수성 또는 내성에 대해 모니터링된다. 대조 세포주에 비해 증가된 감수성을 세포주에 일으키는 제제, 또는 제제들의 조합물은 상응하는 수준의 RRM1 및/또는 TS를 발현하는 종양을 앓는 환자를 위한 유력한 치료 제제로서 확인될 수 있다.

또다른 예에서, 낮은 수준(즉, 대조 모 균주에 비해 낮은 수준)의 TS를 발현하는 세포가 대조 균주의 세포에 비해 화학치료 제제에 더 감수성이면, 이 제제는 낮은 수준의 TS를 발현하는 종양을 앓는 환자의 치료를 위한 유력한 치료 제제이다. 높은 수준(즉 대조 모 균주에 비해 높은 수준)의 TS를 발현하는 세포가 대조 균주의 세포에 비해 화학치료 제제에 더 감수성이면, 이 제제는 높은 수준의 TS를 발현하는 종양을 앓는 환자의 치료를 위한 유력한 치료 제제이다.

본원에 기재된 방법은 높거나 낮은 수준의 RRM1 및/또는 TS를 발현하는 종양의 치료를 위해 유력한 제제를 확인하기 위한 스크리닝 어세이에 사용될 수 있다. 세포주, 예컨대 본원에 기재된 세포주는 제제의 패널(panel)(예를 들어, 소분자 약물, 핵산, 또는 폴리펩티드)과 접촉되어, 낮거나 높은 수준의 RRM1 및/또는 TS를 발현하는 세포의 증가된 감수성을 일으키는 제제를 확인할 수 있다.

상기 스크리닝 방법에서 확인된 제제, 또는 상기 방법에서 유력한 화학치료제로서 확인된 제제 또는 제제의 조합물은 인간에서 시험되기 이전에 동물 모델에서 시험될 수 있다. 예를 들면, 치료법은 인간에서 시험되기 이전에 마우스 또는 영장류 모델에서 종양 크기를 감소시키는 능력에 대해 시험될 수 있다.

키트

본원에 기재된 방법을 수행하기 위한 시약, 도구, 및/또는 지침은 키트에 제공될 수 있다. 예를 들면, 키트는 암 환자를 위한 적절한 치료법을 결정하기 위한 시약, 도구, 및 지침을 포함할 수 있다. 이러한 키트는 환자로부터의 조직 샘플을, 예컨대 생검에 의해 수집하기 위한 시약, 및 조직을 처리하기 위한 시약을 포함할 수 있다. 키트는 또한 유전자 발현 분석을 수행하기 위한 하나 이상의 시약, 예컨대 RT-PCR, 노던 블롯, 웨스턴 블롯 분석, 또는 면역조직화학법을 수행하여 인간의 종양 샘플에서 RRM1 및/또는 TS 발현 수준을 결정하기 위한 시약을 포함할 수 있다. 예를 들면, RT-PCR을 수행하기 위한 프라이머, 노던 블롯 분석을 수행하기 위한 프로브(probe), 및/또는 웨스턴 블롯 및 면역조직화학 분석을 수행하기 위한 항체가 이러한 키트에 포함될 수 있다. 어세이를 위한 적절한 완충제가 또한 포함될 수 있다. 이러한 임의의 어세이에 필요한 검출 시약이 또한 포함될 수 있다.

본원에서 구현된 키트는 또한 유전자 발현을 측정하기 위한 어세이를 어떻게 수행하는지를 설명하는 지침서를 포함할 수 있다. 이러한 지침서는 또한 참고 코호트에서 RRM1 및/또는 TS 발현 수준을 결정하는 방법, 및 시험 대상과의 비교를 위해 참고값을 확립하기 위한 발현 데이터를 모으는 방법을 비롯하여 참고 코호트를 결정하는 방법을 위한 지침을 포함할 수 있다. 지침서는 또한 시험 대상에서 유전자 발현을 어세이하기 위한 지침, 및 발현 수준을 참고 코호트에서의 발현과 비교하여 후속적으로 시험 환자를 위한 적절한 화학치료제를 결정하기 위한 지침을 포함할 수 있다. 적절한 화학치료제를 결정하기 위한 방법은 상기 기재되어 있고, 지침서에 상세하게 기재될 수 있다.

또다른 예에서, 본 발명에서 구현된 키트는 RRM1 또는 TS 발현 수준에 기초하여 유력한 화학치료 제제의 효능을 예측하기 위한 시약, 도구 및 지침을 포함할 수 있다. 이러한 키트는 세포에서 RRM1 또는 TS 발현 수준을 조정하기 위한 벡터, 및 세포 표현형을 모니터링하기 위한 시약, 예컨대 아포토시스(apoptosis)를 검출하기 위한 시약을 포함할 수 있다. 조직 샘플중의 RRM1 및 TS의 발현 수준을 결정하기 위한 시약이 상기 기재된 바와 같이 포함될 수 있다.

키트에 포함된 정보 자료는 본원에 기재된 방법 및/또는 본원에 기재된 방법을 위한 시약의 용도와 관련된 설명적 자료, 교육용 자료, 마케팅 자료 및 기타 자료일 수 있다. 예를 들면, 키트의 정보 자료는 연락 정보, 예를 들어, 물리적 주소, 이메일 주소, 웹사이트, 또는 전화 번호를 포함할 수 있고, 이때 키트의 사용자는, 특별히 이들이 특이적 화학치료법에 대한 양성 반응을 가질 가능성이 있는 인간에게 적용하는 경우, 유전자 발현 분석을 수행하고 결과를 해석하기 위한 실질적 정보를 수득할 수 있다.

키트는 시약 및 정보 자료를 위한 별도의 용기, 칸막이 또는 격실을 포함할 수 있다. 용기는 RRM1 및 TS 유전자 발현 수준의 결정 및 후속적인 인간에 대한 적절한 화학치료법의 결정을 위해 사용하도록 표지화될 수 있다.

키트의 정보 물질은 그의 형태로 제한되지 않는다. 많은 경우, 정보 자료, 예를 들어, 지침은 인쇄물, 예를 들어, 인쇄된 문서, 그림, 및/또는 사진, 예를 들어, 라벨 또는 인쇄지로 제공된다. 그러나, 정보 자료는 또한 다른 형식, 예컨대 점자, 컴퓨터 판독가능한 자료, 영상 기록(video recording), 또는 음성 기록(audio recording)으로 제공될 수 있다. 물론, 정보 자료는 임의의 조합된 형식으로 제공될 수도 있다.

도 1은 TS의 발현을 나타내는 세포주의 웨스턴 블롯이다. 사이토졸 및 핵 추출물은 세포주 H23-Ct 및 H23-R1로부터 준비되었다. 이들은 폴리아크릴아미드 겔에서 분리되고, 막으로 전달되고, TS, Oct-1(핵 단백질), 및 GAPDH(사이토졸 단백질)에 대한 항체로 탐침되었다. TS를 나타내는 38 kD의 하나의 밴드가 세포질에서 발견되었다.
도 2A 및 2B는 TS 발현에 의해 추정되는 카플란 마이어(Kaplan Meier) 전체 생존 곡선이다. 2A, 제자리 단백질 발현에 의한 160명 환자의 생존. 연회색 선은 57.02(N=120; 중앙값=81.3 개월, 95% CI 62.9∼99.6) 초과의 마커 발현을 갖는 환자를 표시하고, 진회색 선은 57.02(N=40; 중앙값=51.7 개월, 95% CI 21.5∼81.9) 이하의 발현을 표시한다. 조정되지 않은 p-값은 0.0013이었다. 2B, 제2 최적 컷포인트(cutpoint)를 포함하는 환자의 동일한 그룹의 생존. 연회색 선은 129.33(N=18; 중앙값은 도달되지 않음) 이상의 마커 발현 환자를 표시하고, 중간 회색 선은 57.58∼124.27(N=82; 중앙값=80.8 개월) 마커 발현 환자를 표시하고, 진회색 선은 57.02(N=40; 중앙값=51.7 개월) 이하의 마커 발현 환자를 표시한다. 조정되지 않은 p-값은 0.002였다.
도 3A는 방사선촬영으로 측정된 치료에 대한 반응을 나타내는 막대 그래프이다. 반응은 측정가능한 병변의 크기에서 95% 증가∼100% 감소의 범위였다.
도 3B∼E는 방사선촬영 질병 반응 및 mRNA 유전자 발현을 나타내는 막대 그래프이다. 3B, RRM1; 3C, RRM2; 3D, TS; 3E, 디하이드로폴레이트 환원효소(DHFR: dihydrofolate reductase).
도 4는 카플란-마이어 전체 생존 추정값 및 질병-부재 생존 추정값의 결과를 나타내는 그래프이다. 흑색 곡선(상부선)은 OS를 표시하고, 회색 곡선(하부선)은 DFS를 표시한다. 눈금(tick) 마크는 검열된 경우를 나타낸다.
도 5는 10명 환자에서 유전자 RRM1 및 TS의 치료전 및 치료후의 mRNA 수준을 보여주는 그래프이다.

실시예

본 발명은 하기 실시예에서 추가로 설명되고, 이는 특허청구범위에 기재된 본 발명의 범주를 제한하지 않는다.

실시예 1 - 제자리 티미딜레이트 신타아제 ( TS ) 단백질 발현

티미딜레이트 신타아제(TS)는 데옥시유리딘 모노포스페이트(dUMP: deoxyuridine monophosphate)의 (데옥시)티미딘 모노포스페이트(TMP: thymidine monophosphate)로의 전환(이는 테트라하이드로폴레이트의 디하이드로폴레이트로의 산화를 필요로 함)을 촉매화한다. TMP는 후속적으로 TTP로 포스포릴화되고, 이는 DNA 합성 및 수선에 필요하다. 5-플루오로우라실(5FU: 5-fluorouracil)은 TMP 합성을 저해하고, 이는 효과적인 화학치료 제제이다(Washtien, Mol Pharmacol 1984;25:171-77; Moertel et al., N Engl J Med 1990;322:352-58; Heidelberger et al., Nature 1957;179(4561):663-6). 높은 종양 수준의 TS는, 특별히 직장결장 암종(CRC: colorectal carcinoma) 및 위 암종을 앓는 환자에서, 5FU-기초 화학치료법에 대한 내성과 연관된다(Johnston et al., Cancer Res 1995;55(7): 1407-12; Leichman et al., J Clin Oncol 1997;15(10):3223-9; Shirota et al., J Clin Oncol 2001;19(23):4298-304).

TS는 리보뉴클레오티드 환원효소의 후속물(down-stream)이고, DNA 합성 및 수선에 필요한 데옥시뉴클레오티드중 하나의 형성에 중요하므로, 본 연구는 단백질 및 mRNA 수준에서의 TS 발현이, 단계 I NSCLC가 완전히 절제되었지만 추가의 화학치료법 또는 방사선치료를 수여받지 않은 환자에서의 결과에 대한 예후인지 아닌지를 결정하거나, 제자리 TS 발현이 RRM1 및 ERCC1 발현과 상관관계가 있는지를 결정하도록 유도되었다.

이들 연구에 사용된 2개의 모집단은 1991년에서 2001년까지 모피트 암 센터(Moffitt Cancer Center)에서 NSCLC의 완전 절제술을 받은 환자들로 이루어지고, 이는 다른 곳에 기재되어 있다(Zheng et al., N Engl J Med 2007;356:800-08). 간단히, 환자들은 병리학적 단계 IA 또는 IB 질병; 선암, 편평세포 암종, 또는 대세포 암종을 가져야 하고; 수술전후기간중 화학치료법 또는 방사선치료를 받지 않고; 이전에 폐암을 앓지 않고; 흉부로의 선행 방사선치료가 없어야 했다. 187명이 조직 미세배열(microarray)의 작성을 위한 충분한 종양 조직을 갖는 것으로 확인된 환자였고, 이는 단백질 수준에서 유전자 발현을 평가하기 위한 모집단을 구성하였다(표 1). 신선한 동결된 종양 조직을 갖는 92명의 환자들은 mRNA 수준에서 유전자 발현을 평가하기 위한 모집단을 구성하였다(표 2). 단백질 및 mRNA 수준에서의 유전자 발현 값을 갖는 32명의 환자들은 2개의 모집단 사이에서 중첩된다. 2년 동안 3개월마다의 방문, 3년 동안 6개월마다의 방문, 이어서 매년 1회의 방문으로서의 후속-조치가 권고되었다. 전체 생존을 위해, 진단에서 사망까지의 시간을 기록하고, 생존유지 통계 기록을 사용하여 입증하였다.

연구에 사용된 단일클론 TS 항체를 랩 비전 코포레이션(주문 #MS-471-P, 로트(lot) #471P504B)으로부터 상업적으로 입수하였다. 이는 재조합 인간 TS를 항원으로서 사용하여 마우스로부터 생성되었다. 항체는 대략 38 kD(TS의 예상 분자량)의 주요 밴드를, 폐암 세포주 H23의 용해물의 웨스턴 블롯상에서의 세포질 편재화에 의해 검출하였다(도 1). 웨스턴 블로팅을 다음과 같이 수행하였다. 세포주 NCI-H23의 영구적인 유전적으로 개질된 배양액으로부터의 세포질 및 핵 추출물을 핵/세포질 분별 키트(fractionation kit)[바이오비전(BioVision), 캘리포니아주 마운틴 뷰 소재]에 의해 제조하였다. 단백질 추출물(50 ㎍)을 10% 노벡스(Novex) 트리스-글리신 겔(인비트로겐, 캘리포니아주 칼스바드 소재)을 통해 분리하고, 순수한 니트로셀룰로스 막[바이오-래드 래보레이토리즈(Bio-Rad Laboratories), 캘리포니아주 헤르큘레스 소재] 상으로 블로팅하였다. 블롯을 TS 항체(마우스 클론 TS-106, 1:200, 랩 비전 코포레이션), Oct-1 항혈청(#3342-100, 1:1000, 바이오비전, 캘리포니아주 마운틴 뷰 소재), 및 GAPDH 항혈청(#sc-20357, 1:1000, 산타 크루즈 바이오테크놀로지, 캘리포니아주 산타 크루즈 소재)과 함께 4℃에서 하룻밤 항온처리 하였다. 단백질 밴드를 항-토끼, 항-마우스, 또는 항-염소IgG 양고추냉이 퍼옥시다아제(horseradish peroxidase) 2차 항체(1:1000; 산타 크루즈) 및 수퍼시그날 웨스트 피코(SuperSignal West Pico) 화학발광 기질[피어스(Pierce), 일리노이주 락포드 소재]에 의해 시각화하였다. 하우스-키핑(house-keeping) 유전자 GAPDH를 동일한 적재 대조표준으로서 사용하였다.

공초점 현미경을 사용하여 TS 단백질의 세포이하 편재화를 다음과 같이 결정하였다. 폐 선암 세포주(H23, H125, H292, H322, A549) 및 결장 암종 세포주(H498, H508, H747, SNU-C2A, SNU-C4)를 랩-테크(Lab-Tek) 챔버 슬라이드(chamber slides) 상에서 직접적으로 성장시켰다. 접착 세포를 포스페이트 완충된 염수(PBS: phosphate buffered saline)에서 세척하고, 20분 동안 PBS중 4% 파라포름알데히드에서 항온처리함으로써 고착시켰다. 이들을 1시간 동안 0.25% 트리톤(Triton)-X100/PBS에서 삼투처리하고, PBS에서 세척하였다. TS(1:100) 항체를 결합 완충액(1% BSA/O.1% NP4O/PBS)에 희석하고, 챔버에 첨가하고, 1시간 동안 항온처리하였다. PBS에서 세척한 후, 슬라이드를 45분 동안 알렉사 플루오르(Alexa Fluor) 555 항-마우스 IgG[몰레큘라 프로브스(Molecular Probes), 인비트로겐, 오리건주 유진 소재]의 1:500 희석액과 함께 항온처리하였다. 슬라이드를 PBS로 세척하고, 프롤롱 골드 색바램방지 시약(ProLong Gold antifade reagent)을 사용하여 DAPI(몰레큘라 프로브스, 인비트로겐)에 의해 차폐하였다. 음성 대조표준으로서, 동일한 절차를 1차 항체없이 수행하였다. 샘플을 63x/1.20NA 수침 대물렌즈(water immersion objective)가 구비된 역전된(inverted) 제이스(Zeiss) LSM 510 공초점 현미경으로 관찰하였다. 핵을 DAPI로 시각화하였다. 2중 광전자증배관(photomultiplier) 검출기 및 LSM 5 버전 3.2.0.115 소프트웨어 묶음(software suite)으로 영상을 생산하였다.

그 결과 5개의 폐암 세포주에서 TS의 우세한 세포질 편재화가 확인되었지만(도 2A); 핵 TS 발현은 모든 세포주에서 관찰되었고, 이는 H23에서 가장 낮았고, A549에서 가장 높았다. 대조적으로, 결장 암종으로부터 유도된 5개의 세포주에서는, TS 발현이 핵에서 우세하였다.

조직 미세배열을 생성하기 위해, 종양 견본을 전향적으로(prospectively) 수집하고, 중성-완충된 포르말린(10% v/v)에서 고착시키고, 파라핀납에 완전히 함침시켰다. 전체 조직 구획을 H & E 염색하고, 대표적 종양 영역을 표시하였다. 0.6 ㎜ 직경을 갖는 조직 중심부를 천공하고, 조직 배열기[비처 인스트루먼트(Beecher Instrument), 매릴랜드주 실버 스프링 소재]를 사용하여 수용 블럭(recipient block)내로 배열하였다. 5 ㎛ 두께의 구획을 절단하고, 접착제 코팅된 슬라이드[인스트루메딕스(Instrumedics), 뉴저지주 소재](4x)로 옮기고, UV 광에 30초 동안 노출시켜 접착력을 증진시켰다.

제자리 TS 단백질 발현을 NSCLC가 완전히 절제되었지만 수술전후기간 동안 화학치료, 또는 방사선치료를 받지 않은 총 187명의 환자를 포함하는 2개의 중복 조직 미세배열에서 종양 세포질에서의 AQUA에 의해 결정하였다.

자동화된 정량적 분석(AQUA)과 조합된 면역형광법에 기초한 면역조직화학법(IHC)을 사용하여 타겟 분자의 제자리 발현을 평가하였다. 13종의 항원을 0.01 몰/ℓ의 Na-시트레이트(pH 6.0)중에서 15분 동안 극초단파 오븐 처리하여 회수하였다. 슬라이드를 30분 동안 0.3% BSA로 차단시킨 다음, 실온에서 1차 항체(마우스 클론 TS-106, 1:30, #MS-471-P, 랩 비전 코포레이션, 캘리포니아주 프레몬트 소재)와 함께 하룻밤 항온처리하였다. 암종 세포를 확인하기 위해, 사이토케라틴(cytokeratin)에 대한 항혈청을 사용하였다[토끼 항-인간 팬사이토케라틴(pancytokeratin) AE1/AE3, 1:200, #Z0622, 다코 사이토메이션(Dako Cytomation)]. 슬라이드를 세척하고 2종의 상이한 2차 항체와 함께 1시간 동안 항온처리하였다[엔비전(Envision)(등록상표) 표지된 중합체-HRP 항-마우스, #K4007, 및 알렉사(Alexa) 555 염소 항-토끼, #A21429, 1:200, 다코 사이토메이션]. 형광 증폭을 위해, 슬라이드를 Cy5-티라미드(Tyramide)(1:50)에 10분 동안 실온에서 노출시켰다. 여기에 DAPI(4'-6-디아미디노-2-페닐인돌) 마운드 용액(mound solution)과 함께 프롤롱 골드 색바램방지 시약을 올려놓았다. 최종 조직 미세배열 슬라이드를 스팟그래버(SpotGrabber)로 스캔하고, 영상 데이터를 AQUA[PM-2000, 히스토알엑스(HistoRx), 코넥티컷주 뉴 해븐 소재]로 분석하였다. 가장 낮은 가능한 AQUA 점수는 0이고 가장 높은 점수는 255이다.

결과는 도 2B에 제시되어 있다. TS 발현 데이터를 160명/187명(86%) 환자에서 수득하였다. 2중 발현 데이터는 27개의 견본에서 이용할 수 없었는데, 이는 스팟이 그 구획에 없었거나 처리 동안 씻겨 내려갔기 때문이었다. 평균값은 5.8∼238.6(0∼255의 등급상에서)이고, 중앙값은 98.4이며, 평균은 98.3(53.0의 표준 편차)이었다. 데이터는 거의 정상적으로 분포되었고, 정규화를 위한 데이터 변형은 수행하지 않았다. 중복 배열간의 TS 발현에 유의적인 상관관계가 있었다(r=0.599, p≤0.001).

TS 단백질과 종양 단계, 조직구조, 전신수행 상태(PS: performance status), 체중 손실의 부재 또는 존재, 흡연 상태, 또는 성별 사이에는 통계적으로 유의적인 연관성이 없었다(표 1). 상기 환자 코호트에서의 단방향 종양 직경은 0.5∼10.8 ㎝ 범위였고, TS 발현과 유의적으로 상관되지 않았다(r=0.051, p=0.52). 이전에 보고된 RRM1 및 ERCC1 단백질 수준과 유의적인 상관관계가 없었다(각각 r=0.13 및 ∼0.07, p>0.1)(Zheng et al., N Engl J Med 2007;356:800-08).

최적 컷포인트 결정을 위하여 최대 로그-랭크(log-rank) 방법을 사용하여, 57.02 이하의 수준을 갖는 환자를 57.02 초과 수준을 갖는 환자와 분리한 경우(이는 TS 발현의 25번째 백분위수(40명/160명 환자)임), 가장 유의적인 전체 생존 차이를 나타내었다(도 3A). 낮은 TS 그룹에서의 생존 중앙값은 51.7 개월이고, 이는 높은 TS 그룹에서의 경우 81.3 개월이었다(p=0.0013). 이러한 생존 차이는 다중 관찰을 위해 p-값을 조정한 이후 유의적으로 남아있었다(p=0.034).

TS 단백질 발현 및 종양 단계를 포함하는 최종 다변수 모델에서(표 2), TS는 전체 생존과 유의적으로 연관된 것으로 남아있었다(p=0.0013, 조정된 p=0.032). 사망에 대한 상대위험도(hazard ratio)는 높은 TS 단백질 발현 대 낮은 TS 단백질 발현의 경우 0.45였다.

계획된 생존 분석에 더하여, TS 발현 및 생존의 연관성의 예비적 검사를 실행하였다. TS 발현을 연속 변수로서 콕스 회귀 분석에 포함시키고, 낮은 비조정된 p-값(p=0.006) 및 종양 단계에 대해 조정된 p-값(p=0.002) 둘다를 산출하였다. 또한 TS 단백질 발현에 대한 제2 컷포인트가 129.33의 AQUA 점수(89번째 백분위수)인 것으로 밝혀졌다. 생존 분석에 상기 컷포인트를 포함시켜 환자를 3개의 생존 그룹으로 분류하였다(도 3B). 가장 높은 TS 그룹에서의 생존 중앙값은 120 개월을 초과하였고, 이는 중간 TS 그룹에서는 80.9 개월이고, 가장 낮은 TS 그룹에서는 51.7 개월이었다(p=0.002).

98.4의 샘플 중앙값을 컷포인트로 사용하여 TS 발현 데이터를 이분화(dichotomization)시킨 결과, 높은 TS 발현 환자의 경우 81.3 개월의 OS 중앙값을 갖고 낮은 TS 발현 환자의 경우 62.2 개월의 OS 중앙값을 갖는 것으로 밝혀졌다(p=0.071).

상기 실시예에서의 통계적 분석을 다음과 같이 수행하였다. 2개의 중복 판독값으로부터의 AQUA 점수에 대한 평균 값을 계산하고, 독립적 연속 변수로서 취급하였다. TS mRNA 발현의 평균은 3중 판독값으로부터 계산하고, 독립적 연속 변수로서 취급하였다. 1차 목적은 제자리 TS 단백질과 전체 생존 사이의 연관성에 대해 평가하는 것이었다. 이를 위해, TS 발현은 높고 낮은 카테고리로 선험적으로 분류되지 않았다. 대신, 최대 로그-랭크 방법을 최적 컷포인트 결정을 위해 사용하고, 다중 관찰을 위해 p-값을 조정하였다(Miller and Siegmund, Biometrics 1982;38:1011-16; Hilsenbeck and Clark, Stat Med 1996;15(1):103-12). 정렬된 TS 단백질 발현의 중심 80% 이내의 컷포인트를 고려하였다. 이어서 TS 단백질 발현에 의해 결정된 컷포인트 백분위수(들)를 사용하여, 생존과 낮고 높은 TS 발현 사이의 연관성을 카플란-마이어 생존 곡선에 요약하였다. 0.15의 유의성 수준-대-체류(level-to-stay)를 갖는 후향 제거를 사용하여 다변수 콕스 회귀 분석을 수행함으로써 생존에 대한 TS 단백질 발현의 영향을 평가하는 한편, 잠재적 공변수인 종양 단계, 전신수행 상태, 성별, RRM1 단백질 발현, 및 ERCC1 단백질 발현을 조정하였다. RRM1 및 ERCC1 단백질 발현은 연속 변수로서 포함되었다. TS 단백질 발현에 대한 이분화된 분할이 최적 선택에 의해 수득되었으므로, 이의 콕스 회귀 p-값을 조정하였다. 최적 컷포인트 결정을 위한 최대 로그-랭크 방법을 또한 사용하여 TS mRNA 발현 및 전체 생존의 연관성을 검사하였다.

연속 변수들 사이의 연관성을 스피어만 상관관계 계수(Spearman's correlation coefficient)에 의해 분석하였다. 연속 변수와 개별 변수 사이의 연관성을 개별 그룹의 수에 의존하여 윌콕손 랭크 합산 시험(Wilcoxon rank sum test) 또는 크루스칼-월리스 시험(Kruskal-Wallis test)에 의해 분석하였다. 로그-랭크 시험을 사용하여 인구통계학적 그룹과 임상학적 그룹 사이의 생존 차이를 평가하였다.

다중 시험을 설명하기 위한 정밀한 통계학적 접근법을 사용한 결과, 증가된 세포질 TS 발현이 연장된 생존과 연관됨이 입증되었다. 2가지 예비적 분석은 이러한 발견을 뒷받침하였다. 우선, 선험적으로 콕스 회귀 분석에 의해 TS 수준이 증가함에 따라 사망 위험이 감소함을 관찰하였고, 통계적으로 유의적인 결과(p=0.006)를 수득하였다. 두번째로, 사망 위험은 TS 발현의 2개의 별개의 수준, 57.02 및 129.33에서 극적으로 바뀐다. 이러한 생존 모델은 환자를 하위 25% 그룹, 중간 64% 그룹, 및 상위 11% 그룹으로 나눈다.

실시예 2 - TS mRNA 발현

TS mRNA 발현을 단계 I NSCLC가 완전히 절제된 92명의 환자로부터의 신선한-동결된 종양 견본에서 다음과 같이 결정하였다. 신선한-동결된 종양 견본은 실시예 1에 기재된 바와 같은 동일한 선택 기준을 충족시키는 92명의 환자에서 전향적으로 수집되었다(표 3).

종양으로 구성된 세포가 60%를 초과하는 종양 견본으로부터 RNA를 단리하고, 올리고-DT 및 랜덤한 프라이머를 사용하여 역전사효소[퀀티텍 역전사 키트(QuantiTect Reverse Transcription Kit), 캘리포니아주 발렌시아 퀴아겐 소재]에 의해 cDNA를 생성하였다. 대략 5 ng의 샘플 cDNA를 실제-시간 기술(ABI 7900HT, 캘리포니아주 포스터 시티 소재)에 의한 TS 발현 분석을 위하여 3중으로 사용하였다. 역치 주기(threshold cycle)를 표준 곡선과 비교함으로써 샘플중의 TS mRNA의 상대량을 결정하고, TS 양(ABI, HS00426591-m1, 앰플리콘(amplicon) 크기 87 bp)을 18SrRNA 양(ABI, #4319413E)으로 나눔으로써 표준화된 양을 결정하였다.

데이터를 85명(92%)의 환자로부터 수득하였고, 발현은 0.2∼104.3의 범위이며, 중앙값은 3.5이고, 평균은 6.7이었다(표준 편차: 12.9). mRNA 수준은 종양 단계, 전신수행 상태, 체중 손실의 존재 또는 부재, 흡연 상태 또는 성별과 유의적으로 연관되지 않았다(표 3). 그러나, 이들은 조직학적 아형이 크게 상이하였고; 수준은 편평세포 및 대세포 암종에 비해 선암에서 낮았다(표 3). 상기 환자 코호트에서의 단방향 종양 직경은 1.4∼10.8 ㎝의 범위였고, 이들은 TS 발현과 상관관계가 없었다(r=0.135, p=0.218).

최대 로그-랭크 방법은 최적 컷포인트 결정을 위해 사용되었고, 다중 관찰을 위한 조정 이후에 TS mRNA 발현에 대한 통계적으로 유의적인 컷포인트는 발견되지 않았다(조정된 p=1.0).

32명의 환자들은 양쪽 데이터세트(dataset)에 공통되고, 따라서 단백질 및 mRNA 수준 둘다에서 TS 발현 값을 가졌다. 수준들 사이에의 상관관계는 거의 0이었다(r=0.028, p=0.877).

통계적 분석을 실시예 1에 기재된 바와 같이 수행하였다.

이들 결과(이는 정량적 분석을 위해 특별히 개발된 방법을 사용하여 TS 단백질 및 mRNA 발현 사이의 연관성을 검출하는데 실패함)는, 대다수의 유전자의 경우 폐암에서의 단백질 및 mRNA 수준 사이에 상관관계가 없음을 입증하는 보다 최근의 보고와 일치한다(Chen et al., Mol Cell Proteomics 2002;1(4):304-13).

실시예 3-절제가능한 비소세포 폐암에서 신보조적 겜시타빈 및 페메트렉세드의 임상적 효능 및 예측되는 분자 마커

절제가능한 비소세포 폐암(MSCLC)의 치료에 백금-함유 화학치료법을 혼입함은 N1 또는 N2 림프절에 전이성 질병을 갖는 환자를 위한 표준 케어가 되어왔다(The International Adjuvant Lung Cancer Trial Collaborative Group. N Engl J Med 2004; 350:351-360; Winton et al., N Engl J Med 2005; 352:2589-2597; Douillard et al., Lancet Oncol 2006; 7:719-727). 신보조적 치료에 의한 반응률은 대략 33∼64%이고(Depierre et al., J Clin Oncol 2002; 20:247-253; Scagliotti, Proc Am Soc Clin Oncol 2005; 23:626s; Gilligan et al., Lancet 2007; 369: 1929-1937; Pisters et al., Proc Am Soc Clin Oncol 2007; 25:389s), 신보조적 치료법은 절대적인 전체 생존율을 대략 5∼15% 증가시킨다(The International Adjuvant Lung Cancer Trial Collaborative Group. N Engl J Med 2004; 350:351-360; Winton et al., N Engl J Med 2005; 352:2589-2597; Douillard et al., Lancet Oncol 2006; 7:719-727). 그러나, 모든 환자를 백금-함유 섭생으로 치료하는 접근법은 효능 면에서 정점에 달했다. 또한, 대략 1∼2%의 치료-관련된 사망률을 비롯하여 이러한 접근법과 연관된 중대한 독성이 존재한다(The International Adjuvant Lung Cancer Trial Collaborative Group. N Engl J Med 2004; 350:351-360; Pisters et al., Proc Am Soc Clin Oncol 2007; 25:389s). 분자 종양 특징을 치료학적 결정에 혼입함은 효능을 개선시키고 독성을 감소시킬 것이다.

본 실시예는, 절제가능한 NSCLC를 앓는 환자에서 신보조적 겜시타빈 및 페메트렉세드의 단일-설정 시도(single-institution trial)를, 선택된 섭생의 임상적 효능 및 내인성을 설명하고 치료학적 효능에 있어서 이들 약물의 대사에 관여하는 유전자의 mRNA 발현의 예측가능한 이용성을 조사하기 위해 기술한다.

유도 화학치료법 및 독성: 41세∼83세(중앙값 67세) 사이의 26명의 남성 및 26명의 여성으로 이루어진 총 52명의 적격의 환자는 화학치료제의 1회 이상의 투약량을 수여받았다. 이들은 2004년 4월∼2006년 4월에 등록되었고, 이들의 특징은 표 4에 기재되어 있다.

임상 단계는 신체적 검사, 흉부 및 상부 복부의 전산화단층촬영(CT: computed tomography), 전체 신체 FDG 양전자방출단층촬영(PET: positron emission tomography), 뇌의 자기공명영상(MRI: magnetic resonance imaging), 기관지경검사, 및 종격동경검사에 의해 결정하였다. NSCLC의 조직학적 확증; 단계 IB-IIIA 및 선택된 IIIB(1개의 엽에서 2개의 병변, T4); 연령>18세; 0∼1의 전신수행 상태(PS); RECIST에 의한 측정가능한 질병; 및 폐암에 대한 선행 치료법의 부재가 자격을 위해 요구되었다. 이들 기준은 52명의 환자에 의해 충족되었다.

겜시타빈 1,500 ㎎/m², 이어서 페메트렉세드 500 ㎎/m²의 화학치료제를 수술전 1일, 15일, 29일 및 43일에 투여하였다. 화학치료제의 후속적 투약은 적절한 경우 독성 때문에 지연되거나 감소되었다. 환자는 경구 폴레이트를 매일 350∼1,000 ug의 투약량으로 수여받고, 화학치료법 1주 전에 시작하여 매 9주마다 피하로 비타민 B12를 1,000 ug의 투약량으로 수여받았다. 모든 독성을 통상의 독성 기준(CTC: common toxicity criteria, 버전 3.0)에 따라 등급화하였다.

화학치료법 이후, CT 및 PET 스캔을 50일∼63일에 반복하였다. 모든 가장 큰 종양 직경의 합에서의 변화율을 계산하여 치료후 및 치료전 CT 스캔을 비교함으로써(1-[치료후 병변의 합/치료전 병변의 합] xlOO), 또한 최적의 전체 반응으로서의 RECIST에 의해 방사선촬영 반응을 연속 변수로서 나타내었다.

절제가능한 질병을 갖는 환자들은 64일∼77일 사이에 개흉술(thoracotomy)을 받았다. 권고된 수술은 종격동 림프절 절제에 의한 엽절제술(lobectomy) 또는 폐절제술(pneumonectomy)이었다. 구역절제술(Segmentectomy) 또는 웨지(wedge) 절제는 권고되지 않았다. 절제불가능한 질병을 갖는 환자 및 불완전하게 절제된 환자는 이들의 담당의사의 자유재량으로 치료되었다. 모든 환자에게 2년 동안 3개월의 간격으로 CT를 수행하였다.

42명의 환자는 모든 계획된 화학치료제를 제시간에 투약량의 감소없이 수여받았다. 3명의 환자는 투약량의 감소없이 투약이 지연되었다. 그 이유는 3급 이하의 수족 연조직염(extremity cellulitis), 2급 혈소판감소증, 및 3급 간 효소 상승 때문이었다. 7명의 환자는 의도된 4회의 격주간의 치료에 비해 적게 치료받았다. 3명의 환자는 단지 제1 주기만을 받았는데, 신부전에 의한 3급 호중구감소성 열(neutropenic fever), 3급 열성(febrile) 약물 반응때문이었고, 1명의 환자는 치료-관련 부작용 없이 즉각적인 수술을 요청하였다. 3명의 환자는 단지 1회 및 2회 주기를 받았다. 그 이유는 1명의 환자의 경우 3급 이하의 수족 정맥염 때문이고, 2명의 환자의 경우 3급 피로 때문이었다. 1명의 환자는 3주기 이후에 아마도 바이러스성 병인의 폐렴으로 사망하였지만; 가능하게는 치료-관련된 병인이 배제될 수 없었다.

화학치료법에 대한 방사선촬영 반응: 방사선촬영 반응 평가는 49명의 환자에서 가능하였다. 최적 전체 반응은 1명(2%; 95% CI: 0.1∼10.9%)의 환자에서 완전한 완화(CR: complete remission)였고; 16명(33%; 95% CI: 20.0∼47.5%)의 환자에서는 부분적 완화(PR: partial remission)였고, 29명(59%; 95% CI: 44.2∼73.0%)의 환자에서는 안정한 질병(SD: stable disease)이었고, 3명(6%; 95% CI: 1.3∼16.9%)의 환자에서는 진행중인 질병(PD: progressive disease)이었다. 반응은 측정가능한 병변의 크기에서 95% 증가∼100% 감소의 범위였다(도 3A). 방사선촬영 질병 반응과 임상적 매개변수인 연령(p=0.62), 성별(p=0.96), 전신수행 상태(p=0.94), 체중 손실(p=0.88), 흡연 상태(p=0.85), 종양 조직구조(p=0.95), 및 단계(p=0.31) 사이에 통계적으로 유의적인 연관성이 없었다(표 4).

화학치료법에 대한 병리학적 반응: H & E로 염색된 수술 절제 견본의 광 현미경 평가에 의한 괴사 및/또는 섬유증 물질의 비율을 결정함으로써 병리학적 반응 평가를 수행하였다. 이는 43명의 환자에서 가능하였고, 이는 0∼90% 범위였다. 어떤 환자도 병리학적 CR(>95% 괴사/섬유증)을 갖지 않았고, 13명(30%)의 환자는 병리학적 PR(50∼94% 괴사/섬유증)을 갖고, 30명(70%)의 환자는 병리학적 반응을 갖지 않았다(pNR). 병리학적 질병 반응과 임상적 파라미터인 연령(p=0.39), 성별(p =0.65), 전신수행 상태(p=0.18), 체중 손실(p=0.69), 흡연 상태(p=0.96), 종양 조직구조(p=0.43) 및 단계(p=0.66) 사이에 통계학적으로 유의적인 연관성이 없었다. 방사선촬영과 병리학적 반응 사이에 상관관계가 존재할지라도(스피어만의 rho=0.23); 즉, 임상적 반응이 보다 높은 비율의 괴사 및 섬유증과 연관되었더라도, 이는 통계학적으로 유의적이지 않았다(p=0.14).

수술 치료: 46명의 환자에서 개흉술을 수행하였고, 그 결과 40명의 환자에서 완전히 절제되었다. 32명의 환자는 엽절제술을 받고, 2명은 양엽절제술(bilobectomy)을 받고, 8명은 폐절제술을 받고, 2명은 웨지 절제를 받고, 2명은 종양 절제를 받지 않았다. 수술 절제시, 초기 단계에 비교하여 17명의 환자는 단계가 하향되었고, 17명은 변화가 없었고, 12명은 단계가 상향되었다. 1명의 환자는 기관지흉막루(bronchopleural fistula)의 T2N1 편평세포 암종으로 인해 완전한 우측 상부 및 중간 엽절제술을 받은 이후 2.7 개월만에 사망하였다.

생존: 2008년 2월 8일부로 20건의 사례(event)가 발생하였고, 32명의 환자가 생존하였다(5명은 재발되고, 5명은 불완전하게 절제됨). OS 중앙값은 >28.0 개월이고, 완전히 수술 절제된 환자에 대한 DFS 중앙값은 >21.1 개월이었다(도 4). 12-개월 및 24-개월 OS 비율은 84.6%(95% CI: 71.6∼92.0%) 및 71.0%(95% CI: 56.5∼81.4%)였고, 상응하는 DFS 비율은 각각 67.5%(95% CI: 50.7∼79.7%) 및 53.0%(95% CI: 36.0∼67.4%)였다. 화학치료법에 대한 방사선촬영 또는 병리학적 반응은 OS 또는 DFS와 유의적으로 연관되지 않았다(표 4).

질병 반응을 예측하는 약물유전체적 ( pharmacogenomic ) 변수: 실제-시간 RTPCR에 의한 유전자 발현 분석을 위한 충분한 양 및 품질의 예비치료 종양 견본은 10명에서 이용가능하였고, 치료후 견본은 35명의 환자에서 이용가능하였다. 겜시타빈 및 페메트렉세드 치료법이 RRM1 및 TS의 mRNA 수준을 변경할 수 있는지를 평가하였다.

종양 샘플을 치료전 및 치료후에 동결된 견본으로서 수집하였다. 수집을 위한 표준 수술 절차는 생검 또는 절제로부터 동결까지의 시간 기록을 포함하였고, 경과된 시간은 모든 경우 30분 이하였다. 동결된 견본을 OCT에 함침시키고, 5∼7 ㎛ 구획으로 절단하였다.

레이저 포획 미세절제(LCM: laser capture microdissection)에 의해 아크투루스 시스템(Arcturus system)을 사용하여 종양 세포를 수집하였다. 총 RNA를 상업적 방법(아크투루스, 캘리포니아주 마운틴 뷰 소재)에 의해 추출하고, cDNA를 올리고-dT 및 랜덤한 프라이머에 의해 생성하였다. 실제-시간 정량적 PCR 분석을 샘플당 3중으로 수행하였다(7900HT, ABI, 캘리포니아주 포스터 시티 소재). RRM1에 대한 프로브 및 프라이머는 이전에 기재된 것들이다(Bepler et al., J Clin Oncol 2004; 22: 1878-1885). 상업적으로 입수가능한 프라이머 및 프로브를 모든 다른 타겟 유전자의 발현 분석을 위해 사용하였다(표 5). 기재된 바와 같은 표준 곡선과 역치 주기를 비교함으로써 샘플중 RRM1 및 TS mRNA의 상대량을 결정하였다(Bepler et al., J Clin Oncol 2004; 22: 1878-1885). 남은 유전자를 위해, 유동성 카드 어세이(fluidic card assay)에서 시험 샘플을 단일 교정용 샘플과 비교함으로써 상대 정량화를 수행하였다. cDNA 주형이 없는 음성 대조표준을 모든 실험에 포함시켰다.

모든 유전자의 경우 치료전 및 치료후 수준 사이에 유의적인 상관관계가 존재하였고(스피어만의 rho=0.786, p=0.025), 이는 화학치료법후 유전자 발현 수준이 치료전 수준을 대표함을 제안한다. 그러나, 유전자 발현 수준은 치료에 의해 증가한 것으로 보인다(도 5). 모든 후속적 분석을 35개의 치료후 견본 상에서 수행하였다. 모든 14종의 유전자에 대한 발현 및 기타 마커 특징의 범위를 표 5에 요약하였다. RRM1의 mRNA 수준은 질병 반응과 유의적인 상관관계를 가졌고(rho=0.649, p=0.001); 즉, 낮은 수준은 종양 크기 감소를 예측하고, 높은 수준은 종양 성장을 예측하였다(도 3B). 1.68의 중앙값 이하로 RRM1을 발현하는 18명의 환자중, 10명은 PR 또는 CR을 가진 한편, RRM1 발현이 높은 17명의 환자중 2명만이 반응하였다. TS의 mRNA 수준은 질병 반응과 상관관계가 있는 것 같았지만(rho=0.454, p=0.006)(도 3C); 데이터 분석의 다중성을 위한 본페로니 조정(Bonferroni adjustment)을 사용한 후, p-값은 0.0036 수준 보다 높았다. 3.40의 중앙값 이하로 TS를 발현하는 18명의 환자중, 7명은 PR 또는 CR을 가진 한편, TS 발현이 높은 17명의 환자중 5명만이 반응하였다.

놀랍게도, 모든 다른 유전자의 발현 수준은, 이들이 또한 투여된 치료제의 타겟으로 고려될지라도, 질병 반응과 유의적으로 상관되지 않았고(도 3D & E); 표 5에 열거된 상위 7종의 유전자는 겜시타빈 대사 경로에 속하는 반면, 표 5에 열거된 하위 7종의 유전자는 페메트렉세드 대사에 관여되고, 단지 RRM1 및 TS만이 유의적인 상관관계를 나타내었다(표 5의 최우측 칼럼 참조).

결과

비-백금 2중 치료제, 즉 겜시타빈 및 페메트렉세드의 수술전 효능을 수술적으로 절제가능한 NSCLC를 앓는 환자에서 조사하였다. 이러한 조합의 근본적 이유는 두 제제가 비교적 잘 알려진 작용 기작을 가진 대사길항물질이고, 둘다 내인성이며, 둘다 효과적이고, 이미 환자 케어에 통합되어 있기 때문이다. 백금-기제 화학치료제를 이용하는 선행의 랜덤화된 상 III 신보조적 연구에 따르면, 반응률은 33%(5명), 41%(7명), 49%(6명) 및 64%(4명)였다. 대략 75%의 환자가 모든 계획된 화학치료법을 받았고, 화학치료법-관련된 사망률은 대략 2%였다. 이들 반응률은 35%의 반응률에 비해 더 높은 것으로 보이지만; 상기 연구에서 18명/52명의 환자가 단계 III 질병을 앓는 반면, 참고된 시도중 2개는 단계 III 환자를 포함하지 않았고(5명, 7명), 다른 2개의 시도에서 단계 III 환자의 비율은 각각 7%(6명) 및 47%(4명)였다. 단계 III 질환을 앓는 환자에서 백금-기제 치료제에 의한 초기 2개의 랜덤화된 신보조적 시도에서, 보고된 반응률은 53%(16명/30명) 및 35%(9명/26명)였다(Roth et al., J Natl Cancer Inst 1994; 86:673-680). 예상된 반응률은 선험적으로 50%로 설정되고; 이 목표는 도달되지 않았다. 따라서, 겜시타빈 및 페메트렉세드의 조합은, 절제가능한 NSCLC를 앓는 환자의 비선택된 그룹에 제공된다면, 백금-함유 2중 치료제에 비해 탁월한 것으로 보이지 않는다.

이 시도에서 87%(45명/52명)의 환자가 계획된 4 주기 치료법을 수여받았다. 5명의 환자는 치료-관련된 3급 독성으로 인해 4 주기 미만의 치료를 받고, 이들중 4명은 완전 절제 수술을 받았다. 1명의 환자는 추정적으로 바이러스성 폐렴에 의해 수술전에 사망하였다. 따라서, 겜시타빈 및 페메트렉세드의 조합은 잘 용인되고, 백금-함유 2중 치료제를 수용할 수 있는 환자 비율 이상의 비율의 환자에게 4회 격주간의 치료로서 전달가능하다.

이러한 약물유전체적 연구에 따르면, 겜시타빈 및 페메트렉세드에 대한 종양 반응의 크기는 유전자 RRM1 및 TS의 종양에서의 발현과 연관된다. 종양이 이들 유전자를 낮은 수준으로 발현시키는 환자는 높은 수준으로 유전자 발현을 하는 환자에 비해 종양 크기가 감소될 경향이 더 높다. 이러한 연관성은 유전자 RRM1에 대해 유의적이지만, TS의 경우 0.0036의 유의성 수준에 도달하지 못했다. 총 14종의 유전자가 이들 환자에서 평가되었으므로, 유의성 수준은 본페로니에 따라 조정되었다. 이는 데이터 분석의 다중성을 위한 조정에 대한 보수적 접근법이고, 대부분의 상관관계 조사는 덜 엄격한 조건하에 수행된다. 따라서, TS 발현과 치료에 대한 반응 사이의 연관성을 위해 관찰된 (∼)0.454의 상관관계 계수는 주목할만 하고 추가의 외삽을 필요로 한다.

요약하면, 기재된 임상적 상관관계 조사는 RRM1 발현과 겜시타빈 효능 사이의 이전에 공지된 상관관계를 겜시타빈 및 페메트렉세드의 조합물로 확장시킨다. 이들은 또한 TS 발현과 이러한 조합물의 효능 사이의 연관성에 대한 합리적인 증거를 제공한다. 절제가능한 NSCLC를 앓는 환자의 비선택된 그룹에서, 겜시타빈 및 페메트렉세드는 양호한 내인성을 갖고 35%의 객관적 방사선촬영 반응률을 제공한다.

추가의 참고문헌

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다른 실시양태

본 발명이 이의 상세한 설명에 의해 기재되어 있지만, 전술된 기재내용은 본 발명의 범주를 예시하는 것이지 제한하는 것이 아니며, 이는 첨부된 특허청구범위의 범주에 의해 한정된다. 다른 양태, 이점 및 변형은 하기 특허청구범위의 범주내에 속한다.

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Claims

a. 종양 샘플을 대상으로부터 수득하는 단계;
b. 종양 샘플에서 리보뉴클레오티드 환원효소 M1(RRM1: Ribonucleotide Reductase M1) 및 티미딜레이트 신타아제(TS: thymidylate synthase) 유전자 발현의 수준을 결정하는 단계; 및
c. RRM1 및 TS 발현 수준에 기초하여 적절한 화학치료제를 선택하는 단계를 포함하고, 여기서 RRM1 및 TS 발현 수준이 참고 코호트(reference cohort)의 RRM1 발현 수준 중앙값 보다 낮거나 이와 동일하다면, 겜시타빈(gemcitabine) 및 페메트렉세드(pemetrexed)를 포함한 화학치료제를 선택하는,
대상을 위한 적절한 화학치료제를 선택하는 방법.
제1항에 있어서, 적절한 화학치료제를 대상에게 투여함을 추가로 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 제2 화학치료 제제를 대상에게 투여함을 추가로 포함하는 방법.
제3항에 있어서, 제2 화학치료 제제가 항튜불린(antitubulin) 또는 백금-함유 제제인 방법.
제1항에 있어서, 대상이 상피성 악성종양을 앓는 방법.
제1항에 있어서, 대상이 폐암, 유방암, 직장결장암, 두경부암(head and neck cancer), 또는 난소암을 앓는 방법.
제6항에 있어서, 폐암이 비소세포 폐암(non-small cell lung cancer)인 방법.
a. 종양 샘플을 대상으로부터 수득하는 단계;
b. 종양 샘플에서 리보뉴클레오티드 환원효소 M1(RRM1) 및 티미딜레이트 신타아제(TS) 유전자 발현의 수준을 결정하는 단계; 및
c. 종양 샘플에서의 RRM1 및 TS 유전자 발현 수준에 기초하여 치료에 대한 대상의 반응을 예측하는 단계를 포함하고, 여기서 RRM1 및 TS의 낮은 수준의 발현은 대상이 치료에 양성 반응을 가질 것임을 지시하는
겜시타빈 및 페메트렉세드의 투여를 포함하는 치료에 대한 대상의 반응을 예측하는 방법.
제8항에 있어서, 대상이 상피성 악성종양을 앓는 방법.
제8항에 있어서, 대상이 폐암, 유방암, 직장결장암, 두경부암, 또는 난소암을 앓는 방법.
제10항에 있어서, 폐암이 비소세포 폐암인 방법.
a. 종양 샘플을 대상으로부터 수득하는 단계;
b. 종양 샘플에서 세포질 티미딜레이트 신타아제(TS) 단백질의 수준을 결정하는 단계; 및
c. 샘플에서의 세포질 TS 단백질의 수준을 세포질 TS 단백질의 참고 수준과 비교하는 단계를 포함하고, 여기서 참고 수준과 비교하여 샘플에서의 세포질 TS 단백질의 높은 수준은 양호한 예후를 나타내고, 참고 수준과 비교하여 세포질 TS 단백질의 낮은 수준은 불량한 예후를 나타내는,
비소세포 폐암으로 진단된 대상에게 예후를 제공하는 방법.
제12항에 있어서, 세포질 TS 단백질의 수준이 정량적 제자리(in situ) 분석 방법에 의해 결정되는 방법.
a. 환자로부터의 조직 샘플에서 RRM1 및 TS 발현을 어세이(assay)하기 위한 시약, 및
b. 지침서를 포함하는
키트(kit).
제14항에 있어서, RRM1 및 TS 발현을 어세이하기 위한 시약이 올리고-dT 프라이머(primer), RRM1 또는 TS cDNA로 하이브리드화(hybridize)하는 정방향 프라이머, RRM 1 또는 TS cDNA로 하이브리드화하는 역방향 프라이머, 역전사효소(reverse transcriptase), DNA 폴리머라아제(polymerase), 완충제, 및 뉴클레오티드로부터 선택된 그룹으로부터 선택된 미리측정된 일정량의 시약을 포함하는 키트.
제14항에 있어서, RRM1 및 TS 발현을 어세이하기 위한 시약이, 미리측정된 일정량의 항-RRM1 및 항-TS 항체, 및 완충제를 웨스턴 블롯(Western blot) 또는 면역조직화학 어세이(immunohistochemistry assay)의 수행을 위해 포함하는 키트.
제14항에 있어서, 환자로부터의 조직 샘플을 처리하기 위한 시약을 추가로 포함하는 키트.