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Hintergrund
der Erfindung
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Das
Gebiet der Erfindung ist die Bewertung von Therapeutika, die mit
Ribonukleinsäure
(RNA) wechselwirken, z. B. von Antibiotika, die an die 16S RNA binden
und die Proteinsynthese hemmen.
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Ribosomen
sind große
Ribonukleoproteine (RNPs) bestehend aus mehreren Untereinheiten,
die für die
Proteinsynthese verantwortlich sind und über Stämme sowohl strukturell als
auch funktionell hoch konserviert sind. Sie umfassen große (50S)
und kleine (30S) Untereinheiten, die aus ribosomalen RNAs bestehen und
Proteine, die an die rRNA gebunden sind. Die ribosomale Untereinheit
30S enthält
16S rRNA, während die
50S Untereinheit 23S rRNa enthält.
Ribosomen synthetisieren Proteine bei korrekter Bindung an Messenger-RNA
(mRNA) und Transfer-RNA (tRNA).
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Man
nimmt an, dass der korrekte Zusammenbau der verschiedenen Bestandteile,
die an der Proteinsynthese beteiligt sind, durch Bindestellen auf
den tRNAs gesteuert wird. Zwei wichtige Bindestellen auf der rRNA
für die
Proteinsynthese sind die sogenannten A- und P-Stellen, die die hereinkommende Aminoacyl-tRNA
(A-Stelle) bzw. die Peptidyl-tRNA (P-Stelle) aufnehmen. Bei Prokaryoten bestehen
diese Stellen teilweise aus hoch geordneten Strukturen der 16S rRNA,
wahrscheinlich in der Spalte der 30S Untereinheit.
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Ribosomen
sind in allen Spezies (Eukaryoten eingeschlossen) strukturell ähnlich,
obwohl sich die primären
Nukleotidsequenzen der rRNA Moleküle unterscheiden. Für eine Überblick über die
Funktion ribosomaler RNA, siehe Noller, In the RNA world, Gesteland
und Atkins (Hrsg.), 137–84
(CSHL Press, NY, 1993); Noller et al., In The Ribosome: Structure,
Function, and Evolution, Hill et al., (Hrsg), 73–92 (American Soc. for Microbiol.
Washington, DC, 1990).
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Es
ist nun allgemein akzeptiert, dass 16S und 23S rRNAs (die man in
der ribosomalen 50S Untereinheit findet; analoge eukaryotische rRNAs
sind 28S, 5.8S und 5S rRNA in der ribosomalen Untereinheit 60S, und
18S rRNA in der ribosomalen Untereinheit 40S) wichtige, wenn nicht
essentielle Rollen bei der Dekodierung und bei Peptidyl-Transferase-Aktivitäten von
Ribosomen spielen (Noller et al., 1990, supra, Noller, supra).
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Die
meisten Antibiotika, die Proteinsynthese hemmen, wirken direkt auf
die Ribosomen. Einige Mutationen in ribosomalen Proteinen können z.
B. zu Antibiotikaresistenz führen
(Birge und Kurland (1969) Science, 166: 1282; Ozaki et al., (1969)
Nature, 222: 333; Davies et al. (1965) Science, 149: 1096). Arbeiten
auf diesem Gebiet haben auch gezeigt, dass Aminoglykosid-Antibiotika
mit Stellen auf den ribosomalen Untereinheiten wechselwirken, wodurch
RNA geschützt
wird, wobei der Schutz durch RNA-Footprint-Assays sichtbar gemacht
werden kann (z. B. Moazed und Noller (1987) Nature 327: 389; Woodcock
et al. (1991) EMBO J., 10: 3099; Thompson und Cundliffe (1991) Biochimie,
73: 1131–1135).
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Diese
Forschungsarbeiten haben gezeigt, dass spezifische Nukleotide in
der 16S rRNA Ziele für
die Bindung von Aminoglykosiden wie Neomycin, Streptomycin, Hygromycin,
Gentamycin und Tetrazyklin sind. In ähnlicher Weise sind spezifische
Nukleotide in der 23S rRNA die Ziele zahlreicher MLS Verbindungen
(Makrolide, Lincomycine und Streptogramine), einschließlich Erythromycin.
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Einige
Antibiotika (z. B. Edein, Pactamycin, Apramycin und Neamin) hemmen
Proteinsynthese durch Störung
der Bindung zwischen tRNA und den A- oder P-Stellen auf dem Ribosom
während
der Translation (Woodcock et al. (1991) EMBO J. 10: 3099). Wechselwirkungen
von vielen dieser Verbindungen mit 16S rRNA in der ribosomalen Untereinheit
30S wurden auf verschiedenen funktionellen Stellen kartiert, hauptsächlich durch
chemische Footprint-Analyse. Von anderen antibiotischen Verbindungen,
wie vom Peptid-Antibiotikum Thiostrepton wurde gezeigt, dass sie
auf ähnliche
Weise mit der 23S rRNA in 50S Untereinheiten interagieren (Thompson
und Cundliffe (1991) supra).
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Einige
Faktoren, die alle mit der strukturellen Komplexität des Ribosoms
zusammenhängen,
machen Screening-Assays kompliziert, die auf der Bindung eines möglichen
Arzneistoffkandidats an ein ribosomales Ziel beruhen. Zunächst ist
es schwierig, große
Mengen aufgereinigter Ribosomen, auch aus gewöhnlichen Bakterien, zu gewinnen.
Zweitens degradieren Ribosomen häufig
bei typischen Screening-Bedingungen. Drittens ist es unklar, bis
zu welchem Ausmaß die
Fähigkeit
einer Verbindung, an Ribosomen oder RNA Moleküle zu binden, ein Indikator
für ihr
Potential als Antibiotika ist.
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Insbesondere
sind auch kleine, gut definierte RNA-Moleküle komplexe Ziele für solche
Arzneistoffscreening-Assays, da sie multiple Bindestellen für kleine
Moleküle
unterstützen.
So stellt z. B. das polyanionische Phosphodiester-Gerüst einer
Nukleinsäure
für viele
Verbindungen, die eine positive Ladung tragen, ein attraktives Bindeziel
dar, genauso wie das hydrophobe helikale Zentrum für viele
aromatische Verbindungen ein Ziel darstellt. Somit sind Verbindungen,
die an Nukleinsäurereste
binden, die nicht direkt mit der angestrebten Funktion in Verbindung
stehen als Arzneistoff eher unnützlich.
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Zusammenfassung
der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung basiert auf der Entdeckung, dass relativ kleine
RNA-Moleküle, „Oligoribonukleotid
Analoga", die von
Teilen größerer parentaler
RNA-Strukturen abgeleitet sind (z. B. RNPs), überraschenderweise wichtige
parentale Strukturen beibehalten, auch ohne den Rest der parentalen
RNA Sequenzen) und ohne assoziierte Proteine. Oligoribonukleotid-Analoga sind für neue Verfahren
zum Screening von Kandidatenverbindungen für antibiotische Aktivität nützlich.
Purohit und Stern (Nature, 370, 1994, 659–662) beschreiben entworfene
Oligoribonukleotid-Analoga, die in Wechselwirkungsassays verwendet
werden, aber aus verschieden strukturellen Eigenschaften bestehen.
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Die
Erfindung betrifft daher in einem Aspekt ein Oligoribonukleotid-Analog
eines Bereichs einer parentalen Ribonukleinsäure (RNA), umfassend (i) eine
erste Nukleinsäurestruktur
mit einer oder mehreren Nukleotidsequenzen, wobei die erste Struktur
aus dem Bereich der parentalen RNA, z. B. 16S ribosomale RNA (rRNA)
abgeleitet ist, wobei die Region in ihrem nativen Zustand mit einem
Liganden-Bindungsmuster parentaler RNA an einen Liganden bindet,
und (ii) eine zweite Nukleinsäurestruktur,
die eine oder mehrere Nukleinsäuresequenzen
aufweist, kombiniert mit der ersten Nukleinsäurestruktur zur Bildung des
Analogs und zur Bereitstellung des Analogs mit einer Konformation,
die den Liganden mit einem Liganden-Bindemuster bindet, das im wesentlichen
identisch zum parentalen RNA-Liganden-Bindemuster ist.
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Die
hier verwendeten Begriffe „Oligoribonukleotid-Analog" oder „Analog" bezeichnen ein einzelsträngiges Molekül, bestehend
aus Ribonukleinsäuren,
das kleiner als die parentale RNA ist (z. B. mit insgesamt etwa
10 bis 700 Nukleotiden), welches sich zu einer bestimmten dreidimensionalen
Konfiguration faltet, die die Struktur einer Subdomäne eines
größeren parentalen
RNA Moleküls
nachahmt. Modifizierte RNAs, z. B. Phosphorthioate, Desoxynukleotide
oder 2'-O-Methylsubstitutionen
können
ebenfalls dazu verwendet werden, den Analoga Stabilität zu verleihen.
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Die
Oligoribonukleotid-Analoga werden in vitro entweder durch Transkription
von DNA Matrizen mit RNA Polymerase, z. B. T7 RNA Polymerase oder
durch chemische Synthese mit einem käuflichen DNA/RNA Synthesegerät hergestellt.
Im allgemeinen sind in einem Oligoribonukleotid-Analog etwa 10 Nukleotide
bis zu einigen hundert Nukleotiden (und bevorzugt 20–50 Nukleotide)
identisch zu Nukleotiden in einem Bereich der parentalen RNA (die
Zahl der parental abgeleiteten Nukleotide wird durch die Sequenz
bestimmt, die dazu nötig
ist, eine funktionale Subdomäne
nachzuahmen).
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Die
zweite Nukleinsäurestruktur
kann heterologe (künstliche)
Nukleotidsequenzen enthalten, d. h. Sequenzen, die in der parentalen
RNA nicht existieren und die die Struktur des Analogs stabilisieren,
wenn sie mit der ersten Nukleinsäurestruktur
kombiniert werden. Der hier verwendete Begriff „kombiniert" bedeutet, dass die
Nukleotidsequenzen der ersten und zweiten Nukleinsäurestrukturen
derart gekoppelt sind, z. B. durch kovalente und nichtkovalente
Verknüpfungen
(z. B. Wasserstoffbrücken,
ionische (elektrostatische) Wechselwirkungen, und/oder van der Waals
Kräfte),
dass das vollständige
Analog ein Liganden-Bindemuster aufweist, dass im wesentlichen identisch
ist zum Liganden-Bindemuster
der parentalen RNA im nativen Zustand, d. h. im intakten Ribosom.
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Der
hier verwendete Begriff „parentale(s)
RNA" Molekül oder -Struktur
bezieht sich auf das/die natürlicherweise
auftretende (oder „native") intakte RNA-Molekül oder Struktur
(einschließlich
assoziierter Proteine und anderen Bestandteilen der Struktur), von
denen die erste Nukleinsäurestruktur
des Oligoribonukleotids abgeleitet ist. Die parentale RNA kann ribosomale
RNA, virale RNA wie HIV-RNA, messenger RNA oder spezifische zelluläre RNA regulatorische
Elemente sein.
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Bevorzugte
HIV RNA Oligoribonukleotid-Analoga werden von der Tat-Bindestelle
(TAR) oder dem Rev Response Element (RRE), insbesondere von einem
Teil des RRE mit der Sequenz GCACUAUGGGCGCAGCGUCAAUGACGCUGACGGUACAGGCCAGACAAU
UAUUGUCUGGUAUAGUGC (SEQ ID NO: 8) abgeleitet. Weiterhin kann, wenn
der parentale RNA-bindende „Ligand" ein Aminoglykosid
wie Neomycin ist, das rRNA Bindemuster auch als „Aminoglykosid-Schutzprofil" der parentalen RNA
bezeichnet werden.
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In
spezifischen Ausführungsformen
ist der Bereich der parentalen RNA eine dekodierende Region der 16S
rRNA, der z. B. die Nukleotide 1398–1410 und 1490–1505 der
16S rRNA (von E. coli) umfasst. In anderen Ausführungsformen ist der Bereich
die Subdomäne
der A-Stelle der dekodierenden Region der 16S rRNA, die z. B. die
Nukleotide 1404–1410
und 1490–1497
der 16S rRNA (von E. coli) umfasst. Der „dekodierende Bereich" ist der Teil der
16S rRNA, der im intakten Ribosom während der Proteinsynthese die
tRNA mit der mRNA genau in Kontakt für eine richtige Kodon-Antikodon
Basenpaarung bringt. Der dekodierende Bereich besteht aus der „A-Stelle", die im intakten
Ribosom die hereinkommende Aminoacyl-tRNA aufnimmt und der „P-Stelle", die den Peptidyl-tRNA-Komplex
enthält
(wobei die tRNA noch an alle Aminosäuren gekoppelt ist, die bis
dahin an die Kette angehängt
wurden). Andere mögliche
rRNAs, die in der Erfindung verwendet werden können, sind die 23S rRNAs von
Prokaryoten; oder die 28S, 5.8S, 5S und 18S rRNAs von Eukaryoten.
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Die
zweite Nukleinsäurestruktur
des Analogs kann eine stabile Stamm-Schleife, z. B. eine Tetra-Schleife
enthalten, die z. B. die Nukleotidsequenz 5'-CCUUCGGG-3' besitzt, wobei die Nukleotide UUCG die
Schleife bilden und die Nukleotide CC und GG gepaart sind. Die zweite
Nukleinsäurestruktur
kann auch zwei Nukleotidsequenzen enthalten, die eine basengepaarte
stabile Helix bilden, die auch als Nukleotidklemme („nucleotide
clamp") bekannt
ist. Solch eine Klemme kann z. B. die folgende Nukleotidsequenz
aufweisen:
3'-CGUGUC-5' oder 3'-CC-5'
5'-GCACAG-3' 5'-GG-3'
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Spezifische
Analoga der Erfindung umfassen eine erste Nukleinsäurestruktur,
die von einem dekodierenden Bereich einer 16S rRNA abgeleitet sind
und eine zweite Nukleinsäurestruktur,
die eine Tetra-Schleife und eine basengepaarte Nukleotidklemme umfasst.
Der dekodierende Bereich kann z. B. die Nukleotide 1398–1410 und
1490–1505
der 16S rRNA umfassen, die Tetra-Schleife kann die Nukleotidsequenz
5'-CCUUCGGG-3' aufweisen, die basengepaarte
Nukleotidklemme kann die Nukleotidsequenz:
3'-CGUGUC-5'
5'-GCACAG-3'
haben, und
die vollständige
lineare Nukleotidsequenz der kombinierten ersten und zweiten Nukleotidstrukturen des
Analogs wäre
5'-GCACAGACCG CCCGUCACAC
CUUCGGGUCA AGUCGUAACA AGGCUGUGC-3' (SEQ ID NO: 1).
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In
einer anderen Ausführungsform
kann das Analog von einem dekodierenden Bereich abgeleitet sein, der
die Nukleotide 1404–1410
und 1490–1497
der 16S rRNA umfasst, die Tetraschleife kann die Nukleotidsequenz
5'-CCUUCGGG-3' haben, die basengepaarte
Nukleotidklemme kann die Nukleotidsequenz:
3'-CC-5'
5'-GG-3'
haben, und
die vollständige
lineare Nukleotidsequenz der kombinierten ersten und zweiten Nukleotidstrukturen des
Analogs wäre
5'-GGCGUCACACCUUCGGGUGA
AGUCGCC-3' (SEQ
ID NO: 11).
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In
einem anderen Aspekt betrifft die Erfindung einen Affinitäts-Assay
zur Bestimmung der möglichen antibiotischen
oder therapeutischen Aktivität
einer Testverbindung; wobei der Assay die Schritte umfasst des (i)
Vermischen einer Testverbindung mit einem erfindungsgemäßen Oligoribonukleotid-Analog
unter Bedingungen, die die Bildung eines Bindungskomplexes zwischen
dem Analog und der Testverbindung gestatten, und (ii) Nachweis der
Bildung eines Bindungskomplexes, wobei die Anwesenheit eines Bindungskomplexes zeigt,
dass die Testverbindung mögliche
antibiotische Aktivität
hat.
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Die
Testverbindungen zeigen bevorzugt eine spezifische Affinität, d. h.
die bestimmte Wechselwirkung mit dem Oligoribonukleotid-Analog ist
reproduzierbar und betrifft die gleichen Nukleotide im Analog. Je
höher die
Affinität
des Testmoleküls
für das
Oligoribonukleotid, desto höher
sein möglicher
Nutzen als therapeutische/antibiotische Verbindung.
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In
spezifischen Ausführungsformen
ist das Analog markiert, z. B. mit einer fluoreszierenden oder einer radioaktiven
Markierung, und auf einer Oberfläche
immobilisiert, und der Bindungskomplex wird durch das Überwachen
von Änderungen
des Signals der Markierung nachgewiesen, wenn eine Testverbindung
an das Analog gebunden ist, oder das Analog wird auf einer Oberfläche immobilisiert,
die Testverbindung wird markiert und der Bindungskomplex wird durch
Nachweis einer der Markierungen nachgewiesen, die an die Oberfläche über das
Analog gebunden sind.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
wird der Affmitäts-Assay
dazu verwendet, mögliche
nützliche Verbindungen
aus einem Gemisch von Verbindungen zu identifizieren. Dies beinhaltet
die Schritte des In-Kontakt-Bringens des Analogs mit zahlreichen
Testverbindungen, die im Gemisch vorliegen, das Isolieren der Analog-Testverbindung-Komplexe und das
Bestimmen der Identität
der Testverbindungen, die an das Analog binden. Ein Beispiel für ein solches
Verbindungsgemisch ist eine kodierte Bibliothek kleiner Moleküle (vgl.
z. B. Needels et al., 1993, PNAS 90: 10700–04).
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In
einer kodierten Bibliothek wird die molekulare Struktur synthetischer
kleiner Moleküle,
z. B. von Peptiden oder anderen organischen Molekülen z. B.
von einem DNA-Strang kodiert. In einer kodierten Peptidbibliothek
sind z. B. die spezifischen DNA-Sequenzen für jedes Peptid an Kügelchen
angeheftet (wobei eine einzigartige Sequenz, die für die Peptidsequenz
kodiert, an das Kügelchen
angeheftet ist), als auch die kleinen Peptidmoleküle, die
von den DNA-Sequenzen kodiert werden. Wenn eines oder mehrere dieser
Testmoleküle eine
Affinität
für das
markierte erfindungsgemäße Oligoribonukleotid-Analog
zeigt, kann es isoliert werden, z. B. durch Biotinylierungs/Streptavidin-Wechselwirkung
oder durch Fluoreszenzaktiviertes Zellsortieren markierter Moleküle und dann
durch Standardverfahren identifiziert werden, z. B. Polymerasekettenreaktion
(PCR) oder Didesoxy-Sequenzierung.
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Die
Erfindung betrifft auch einen kompetitiven Bindeassay zur Bestimmung
der möglichen
antibiotischen oder therapeutischen Aktivität einer Testverbindung, umfassend
(i) Vermischen eines Analogs mit einem Analog-bindenden Liganden
unter Bedingungen, die die Bildung eines ersten Bindungskomplexes
zwischen dem Analog und dem Liganden gestatten, (ii) Vermischen
einer Testverbindung mit dem ersten Bindungskomplex unter Bedingungen,
die es der Testverbindung ermöglichen,
den ersten Bindungskomplex unter Bildung eines zweiten Bindungskomplexes
zwischen dem Analog und der Testverbindung zu zerstören, und
(iii) Nachweis der Zerstörung
des ersten Bindungskomplexes, wobei die Zerstörung des ersten Bindungskomplexes zeigt,
dass die Testverbindung mögliche
antibiotische Aktivität
besitzt.
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In
spezifischen Ausführungsformen
ist der Ligand z. B. fluoreszierend oder radioaktiv markiert, das Analog
ist auf einer Oberfläche
immobilisiert und die Zerstörung
des ersten Bindungskomplexes wird durch Überwachung einer Reduzierung
des Signals von der Markierung nachgewiesen, wenn eine Testverbindung den
Liganden aus dem ersten Bindungskomplex verdrängt.
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Alternativ
dazu kann das Analog markiert und der Ligand auf einer Oberfläche immobilisiert
sein, und die Zerstörung
des ersten Bindungskomplexes wird durch Überwachung einer Reduzierung
des Signals von der Markierung nachgewiesen, wenn eine Testverbindung
das Analog aus dem ersten Bindungskomplex verdrängt.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
ist der Ligand ein Aminoglykosid und z. B. kovalent oder quervernetzt
auf einem festen Träger
immobilisiert, z. B. auf einer Nylon- oder von Cellulose abgeleiteter
Membran, einer Mikrotiterplatte oder einem anderen Plastikträger, und
wird dann mit einem markierten (fluoreszierend oder radioaktiv)
Oligoribonukleotid-Analog inkubiert. Die Aminoglykosid-Analog-Komplexe
werden dann kompetitiv mit Testverbindungen, oder Verbindungsgemischen,
Zellextrakten, etc. inkubiert. Die Verbindungen, die wirksam an
das Analog binden können,
werden das Analog aus dem Aminoglykosid-Analog-Komplex verdrängen. Andere
Ausführungsformen
umfassen das Quervernetzen des Analogs mit einem festen Träger und
die Behandlung mit einem Gemisch aus Aminoglykosid und Testverbindungen.
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In
einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung einen in situ Footprinting-Assay
zur Bestimmung der möglichen
antibiotischen oder therapeutischen Aktivität einer Testverbindung, umfassend
(i) Vermischen eines Oligoribonukleotid-Analogs mit einer Testverbindung
unter Bedingungen, die die Bildung eines Bindungskomplexes zwischen
dem Analog und der Testverbindung ermöglichen, (ii) Inkubieren des
Bindungskomplexes mit einem chemischen Sonden-Reagenz und Überwachen
hinsichtlich einer Wirkung des Analogs im Komplex, (iii) in einer
getrennten Kontrollreaktion, Inkubieren des nicht an eine Testverbindung
gebundenen Analogs mit dem chemischen Sondenreagenz und Überwachung
hinsichtlich einer Wirkung des Reagenz auf das ungebundene Analog,
und (iv) Vergleichen der Effekte des Sondenreagenz auf das Analog
im Bindungskomplex und auf das ungebundene Analog, wobei die Prävention
eines Effektes des Reagenz auf das Analog im Bindungskomplex, der
vom Reagenz auf das ungebundene Analog ausgeübt wurde zeigt, das die Testverbindung mögliche antibiotische
Aktivität
besitzt.
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In
spezifischen Ausführungsformen
ist das chemische Sondenreagenz Dimethylsulfat (DMS), Kethoxal (KE)
oder Carbodiimid, z. B. 1-Cyclohexyl-3-(2-morpholinoethyl) carbodiimid
metho-p-toluen-sulfonat (CMCT). Diese und andere Sondenreagenzien
modifizieren ein Nukleotid im Analog kovalent, wenn es nicht an
eine Testverbindung gebunden ist, z. B. durch Methylierung im Falle
von DMA. Die Auswirkungen des Sondenreagenz können durch Verwendung eines
markierten Oligonukleotids überwacht
werden, das z. B. die Sequenz CAGUGU hat, das zu einem Teil des
Analogs komplementär
ist und somit an das Analog hybridisiert, sobald das Analog durch
die Testverbindung vor Modifikation geschützt ist, und hybridisiert nicht
an das Analog, wenn es modifiziert ist, z. B. durch Methylierung
durch das Reagenz, wobei die Anwesenheit der Markierung nach Abschluss
des Assays zeigt, dass die Testverbindung mögliche antibiotische Aktivität hat. Alternativ wird
die Wirkung des Sondenreagenz durch Verwendung eines Oligonukleotidprimers überwacht,
der z. B. die Sequenz TTCACCCGGAAGGTG (SEQ ID NO: 12) aufweist,
der zu einem Teil des Analogs komplementär ist, einem markierten Nukleotid,
und reverser Transkriptase, wobei die Verlängerung des Primers auf dem
Analog mit dem markierten Nukleotid nicht erfolgt, wenn das Analog
durch das Reagenz methyliert ist, wobei die Anwesenheit der Markierung
nach Abschluss des Assays zeigt, dass die Testverbindung mögliche antibiotische oder
therapeutische Aktivität
hat.
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Andere
mögliche
Therapeutika oder Antibiotika, die identifiziert werden können, umfassen
Therapeutika gegen humanes Immundefizienzvirus (HIV) (z. B. Moleküle, die
virale Replikation oder Proteinsynthese hemmen). Interessierende
Bereiche umfassen jene Bereiche, die an der viralen Replikation
beteiligt sind (z. B. Tat Bindestelle (TAR) und das Rev Response
Element (RRE) der RNA).
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„Schutz", z. B. vor einem
Aminoglykosid oder Thiostrepton, bezieht sich auf den charakteristischen Footprint
oder das Profil, d. h. ein Muster von Banden auf einem Polyacrylamidgel,
das nach verschiedenen chemischen Behandlungen (z. B. Dimethylsulfat,
Kethoxal, 1-Cyclohexyl-3-(3-Morpholinoethyl)-Carbodiimid metho-p-toluensulfonat)
von RNA entsteht, die zuvor dem schützenden Molekül ausgesetzt
wurde. Diese Footprint-Assays sind Routine und verwenden bekannte
Verfahren (vgl. z. B. Moazed et al., 1986, Cell 47: 985–94; Stern
et al., 1988, Meth. Enzymol. 164: 481–489; Peattie und Gilbert 1980,
PNAS 77: 4679–82).
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Ein
großer
Vorteil der hier beschriebenen Verfahren besteht darin, dass diese
Verfahren die Entdeckung neuer antibiotischer Verbindungen oder
Moleküle
ohne den Arbeitsaufwand und die Kosten bekannter antimikrobieller
Aktivitäts-Assays
gestatten. Durch Verwendung der Oligoribonukleotid-Analoga, die
die Aminoglykosidwechselwirkungsstelle (Liganden-Bindestelle) einer parentalen DNA nachahmen,
können
Verbindungen, die wahrscheinlich antibiotische, Protein-synthese-hemmende
oder virushemmende Eigenschaften haben, schnell und günstig identifiziert
werden, auch wenn Screening-Protokolle in sehr großem Maßstab mit Hunderten
von Testmolekülen
verwendet werden. Die Assays sind der Automatisierung zugänglich,
wodurch Screening-Verfahren in großem Maßstab erleichtert werden.
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Solange
nicht anders definiert, haben alle hier verwendeten technischen
und wissenschaftlichen Begriffe die übliche, für den jeweiligen Fachmann bekannte
Bedeutung. Obwohl zu den hier beschriebenen Verfahren und Materialien ähnliche
oder äquivalente
Verfahren und Materialien verwendet werden können, sind die bevorzugten
Verfahren und Materialien nachstehend beschrieben. Alle hier genannten
Veröffentlichungen, Patentanmeldungen,
Patente und andere Referenzen sind durch Bezugnahme Teil der Offenbarung.
Zusätzlich
sind die Materialien, Verfahren und Beispiele lediglich veranschaulichend
und nicht beschränkend
aufzufassen.
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Andere
Eigenschaften und Vorteile der Erfindung sind aus der ausführlichen
Beschreibung ersichtlich oder aus den Ansprüchen.
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Beschreibung
der Zeichnungen
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1A–1E sind
schematische Abbildungen der 16S rRNA, der dekodierenden Region,
zweier Oligoribonukleotid-Analoga, und von Testergebnissen. 1A ist
ein schematisches Diagramm der 16S rRNA, das die Nukleotide ausserhalb
der dekodierenden Region (eingerahmt) zeigt, die an Wechselwirkungen der
tRNA und der 30S-Untereinheit an den A- und P-Stellen beteiligt sind (Noller
et al., In The Ribosome: Structure, Function, and Evolution (Hrsg.
Hill, Dahlberg, et al.) American Soc. For Microbiol., Washington,
DC, 1990, Seiten 73–92;
Moazed et al., 1986, Cell, 47: 985–94, Moazed et al., 1990, J.
Mol. Biol., 211: 135–45).
Die Position einer Quervernetzung zwischen den tRNA Antikodon-Schleifen
und C1400 (Cytosin an Position 1400) mit Länge Null im dekodierenden Bereich
(AC XL) ist angezeigt (Prince et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci
USA, 79: 5450–54). 1B zeigt
den dekodierenden Bereich (SEQ ID Nos: 9 und 10) und die durch Neomycin-artige
Aminoglykosidantibiotika (Moazed et al., 1987, Nature 327: 389–94; Woodcock
et al., 1991, EMBO J., 10: 3099–103)
(Neos) vor Modifikation durch DMS geschützten Nukleotide (bei N1 aus
A, N3 aus C und N7 aus G) und A- und P-Stellen tRNA (Moazed et al.,
1986, Cell, supra, Moazed et al., 1990, J. Mol. Biol., supra). Die Positionen
der A- und P-Stellen dekodierenden Region Subdomänen und die Identitäten der
posttranskriptionell methylierten Nukleotide sind markiert. Der
dekodierende Bereich ist mit den tertiären Basenpaaren von Gutell
und Mitarbeitern gezeichnet (Gutell et al., 1985, Prog. Nucl. Acids
Res. Mol. Biol., 32: 153–216,
Gutell, In The Translational Apparatus (Hrsg. Nierhaus, Subramanian
et al.) Plenum Publishing, NY, 1993, Seiten 477–88): C1399-G1504, G1401-C1501,
C1402-A1500, C1404-G1497
und G1405-C1496. 1C zeigt das Oligoribonukleotid-Analog
der dekodierenden Region (SEQ ID NO: 1), wobei durch Neomycin und
Paromyomycin (Neos) vor DMS-Modifikation
geschützte
Bereiche markiert sind. Das Analog enthält 16S rRNA Sequenzen aus der
dekodierenden Region von A1398 bis A1410 auf der proximalen Seite
und U1490-G1505
auf der distalen Seite. Das distale Ende des Analogs endet in der
gleichen Stamm-Tetra-Schleife,
die man am Ende des vorletzten Stammes der 16S rRNA (Nukleotide
1448–1455)
findet. Eine heterologe Klemme-Helix ist oben gezeigt. Schwacher
und starker Schutz ist durch kleine bzw. große Symbole markiert. 1D zeigt
das Oligoribonukleotid-Analog der dekodierenden Region (SEQ ID NO:
1) mit vor DMS-Modifikation geschützten Nukleotiden, oder Nukleotiden,
die in der Reaktivität
gegenüber
DMS verstärkt
sind, in Reaktion auf poly U mRNA- und tRNA Antikodon-Stamm-Schleifen
T7-Transkripte. 1E zeigt ein Oligoribonukleotid-Analog
(SEQ ID NO: 11) der A-Stelle der dekodierenden Region, wobei durch
Neomycine vor DMS-Modifikation geschützte Nukleotide markiert sind.
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2A–2B zeigen
Fotos von Elektrophorese-Gelen, die Wechselwirkungen zwischen Analoga für den dekodierenden
Bereich und Antibiotika zeigen. 2A zeigt
Ergebnisse mit DMS-Hybridisierungsreaktionen mit dem Oligoribonukleotid-Analog
alleine (Spur 6) und in Anwesenheit von 0.1, 1, 10 und 100 μM Neomycin
(Spuren 7–10),
Paromomycin (Spuren 11–14),
Hygromycin (Spuren 15–18),
Streptomycin (Spuren 19–22),
Tetrazyklin (Spuren 23–26)
und Erythromycin (Spuren 27–30).
Auf der linken Seite sind Didesoxysequenzierungsreaktionen (Spuren
1–4) und
eine Kontroll-Verlängerungsreaktion
mit unmodifizierter RNA (K, Spur 5) und auf der rechten Seite Banden
markiert, die den nachstehend diskutierten Nukleotiden entsprechen. 2B zeigt
DMS/N7 Hybridisierungsreaktionen mit dem Oligoribonukleotid-Analog
alleine (Spur 1) und in Anwesenheit von 0.1, 1, 10 und 100 μM Neomycin
(Spuren 2–5),
Paromomycin (Spuren 6–9).
-
3 zeigt
ein Elektrophoresegel, das Wechselwirkungen von tRNA Antikodon Stammschleifen-Transkripten
und poly U mit dem Oligoribonukleotid-Analog für den dekodierenden Bereich
zeigt. DMS und DMS/N7 Hybridisierungsreaktionen mit nacktem Analog
(Spuren 6 und 16) und 3, 6, 12, und 24 μM Antikodon Stamm-Schleifen
Transkript (Spuren 7–10
und 12–15).
Die gleichen Reaktionen wurden in Anwesenheit von 4 μg poly U
wiederholt (Spuren 11–15
und 21–25).
-
4A–4B zeigen
Elektrophoresegele, die die Selektivität der Wechselwirkungen des
Analogs für
den dekodierenden Bereich zeigen. In 4A wird
die Selektivität
der mRNA Wechselwirkungen durch DMS-Hybridisierungsreaktionen gezeigt.
Reaktionen mit nacktem Analog (Spur 6), 3 μM (Spur 7) und 6 μM (Spur 8)
Antikodon Stamm-Schleifen Transkript wurden in Gegenwart von 2 μg Poly U
(Spuren 9–11),
Polydesoxy U (Spuren 12–14)
und Poly C (Spuren 15–17)
wiederholt. Nukleotide, die durch tRNA Antikodon Stamm-Schleife
oder mRNA geschützt
sind, sind rechts angegeben. 4B zeigt
Selektivität
der P-Stellen Subdomäne
für Stamm-Schleifenstrukturen.
DMS-Hybridisierungsreaktionen mit nacktem Analog (Spur 6) und 1.5,
3, 6 und 12 μM
E. coli tRNAphe Antikodon-Stamm-Schleifen-Transkript (Spuren
7–10),
tRNApro Antikodon-Stamm-Schleifen-Transkript
(Spuren 11–14),
scrambled tRNAphe (sctRNAphe,
Spuren 15–18),
Tetra-Schleifen-Element (Spuren 19–22) und triUloop Element (Spuren
23–26).
Durch die Antikodon Stamm-Schleifen geschützte Nukleotide sind rechts
gezeigt.
-
5A und 5B sind
schematische Diagramme zweier unterschiedlicher Screening-Verfahren
unter Verwendung der Oligoribonukleotid-Analoga der Erfindung.
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6 ist
ein schematisches Diagramm eines Analogs der A-Stelle der dekodierenden
Region und zeigt die möglichen
Nukleotidstellen (Kästchen)
für die
Derivatisierung, z. B. zur Hinzufügung einer Fluoreszenzmarkierung.
-
7A und 7B sind
schematische Diagramme eines Footprint-Assays mit hohem Durchsatz
unter Verwendung der erfindungsgemäßen Analoga und einem auf Oligonukleotid
basierenden Reportersystem.
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8A und 8B sind
schematische Diagramme eines Footprint-Assays mit hohem Durchsatz
unter Verwendung der erfindungsgemäßen Analoga und einem auf reverse
Transkriptase basierenden Reportersystem.
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Ausführliche
Beschreibung
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Trotz
der komplexen Strukturen und der zahlreichen assoziierten Proteine
vollständiger
Ribosomen haben wir kleine Oligoribonukleotid-Analoga entdeckt,
die kleine Domänen
parentaler RNAs nachahmen und die sich für die hier beschriebenen Screeningassays
autonom falten und funktionieren können. Die Erfindung umfasst
alle solchen autonom funktionierenden Oligoribonukleotid-Analoga,
die dazu verwendet werden können,
neue therapeutische Agenzien zur antibiotischen, antiviralen, anti-Krebs,
antiproliferativen und anti-inflammatorischen Verwendung, insbesondere
für die
nachstehend spezifisch beschriebenen Verwendungen zu identifizieren.
Andere Oligoribonukleotid-Analoga, die als Screeningsonden nützlich sind,
können
in zellulärer RNA,
einschließlich
mRNA und viraler RNA identifiziert werden.
-
Eine
Domäne,
die verwendet werden kann, um die erste Nukleinsäurestruktur der Analoga abzuleiten, ist
die dekodierende Region der 16s rRNA, die nahe dem 3'-Ende der 16S rRNA
von E. coli liegt (1A und 1B). Die
nachstehend beschriebenen Experimente zeigen, dass ein Oligoribonukleotid-Analog
der dekodierenden Region sowohl mit antibiotischen als auch mit
RNA Liganden der 30S Untereinheit in einer Weise wechselwirkt, die
mit der normalen Funktion der Untereinheit korreliert. Die Aktivitäten des
Analogs der dekodierenden Region legen nahe, dass die einschüchternde
strukturelle Komplexität
des Ribosoms in gewissem Ausmaß umgangen
werden kann.
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Experimentelle
Verfahren
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Herstellung eines Analogs
-
Eine
erste Oligoribonukleotid-Analog-RNA, die von der dekodierenden Region
der 16S rRNA abgeleitet ist, wurde durch Transkription eines linearisierten
pGEM3 Plasmids (Promega) mit T7 Polymerase (Milligan et al., 1989,
Meth. Enzymol., 180: 51–62)
wie in Zapp et al., 1993, Cell, 74: 969–978 beschrieben hergestellt, das
die in 1D gezeigte Analogsequenz (SEQ
ID NO: 1) enthält,
flankiert durch EcoRI und BamHI Restriktionsstellen, und eine 15mer
Anlagerungsstelle für
reverse Primer unmittelbar 3' von
der BamHI-Stelle. Diese Sequenz umfasst sowohl die ersten und zweiten
Nukleinsäurestrukturen
zur Bildung des vollständigen
Analogs.
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Spezifisch
umfasst im ersten Analog (gezeigt in 1D) die
erste Nukleinsäurestruktur
die Nukleotidsequenzen 5'-ACCGCCCGUCACA-3' (SEQ ID NO: 12)
und 5'-UGAAGUCGUAACAAGG-3' (SEQ ID NO: 13), die
von der vollständigen
dekodierenden Region abgeleitet sind. Die zweite Nukleinsäurestruktur
umfasst eine Tetra-Schleife 5'-CCUUCGGG-3', die minimale Größe für eine stabile
Tetra-Schleife, und eine Nukleotidklemme bestehend aus den Sequenzen
5'-GCACAG-3' und 3'-CGUGUC-5'. Anstelle dieser
bestimmten Nukleotidklemme kann jede andere stabile Helix verwendet
werden. Ähnlich
kann anstelle der bestimmten Tetra-Schleife jede andere stabile
Stammschleife verwendet werden.
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Das
zweite Analog, das in 1E gezeigt wird, wurde auf die
gleiche Weise hergestellt, ist jedoch von der A-Stellen Subdomäne der dekodierenden
Region abgeleitet und weist die Nukleotidsequenzen 5'-CGUCACA-3' und 5'-UGAAGGUCG-3' auf. Bezogen auf
die zweite Nukleinsäurestruktur
hat das zweite Analog die gleiche Tetra-Schleife wie im ersten Analog,
umfasst jedoch eine kürzere
Nukleotidklemme, bestehend aus zwei Nukleotidsequenzen 5'-GG-3' und 3'-CC-5'. Die vollständige Nukleotidsequenz
des zweiten Analogs ist 5'-GGCGUCACACCUUCGGGUGAAGUCGCC-3' (SEQ ID NO: 11).
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Gel-aufgereinigte
RNA wurde durch Ethanolpräzipitation
konzentriert, für
1 Minute auf 80°C
erhitzt und unmittelbar für
5 Minuten bei 37°C
gehalten.
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Aminoglykosid-Schutzexperimente
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Wechselwirkungs-(oder „Bindungs-")Reaktionen (12,5 μl) die 125
ng Oligoribonukleotid-Analog-RNA und
Antibiotika in 80 mM HEPES (pH 7,9), 50 mM NH4Cl
und 5% PEG Puffer enthalten, wurden bei 37°C für 15 Minuten angelagert und
für 1 Stunde
auf Eis inkubiert. DMS (1 μl
einer 1 : 5-Verdünnung
in Ethanol) wurde zugegeben, und die Modifikationsreaktionen wurden
40 Minuten lang auf Eis inkubiert. Die Reaktionen wurden mit DMS
Stop (Peattie et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci USA, 77: 4679–82) gestoppt
und die RNA wurde durch Ethanolpräzipitation aufgereinigt.
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DMS/N7-Reaktionen
wurden gemäß Standardprotokollen
durchgeführt
(Peattie et al., supra), mit der Ausnahme, dass die Lyophilisierungsschritte
durch Säure-Phenol
Extraktion und Ethanol-Präzipitation
ersetzt wurden. Für
die Primerverlängerung
wurden 10 ng Analog RNA an 0,75 ng endmarkierten Primer angelagert und
mit 10–15
U MoMuLV reverser Transkriptase für 1 Stunde verlängert. Die
Reaktionen wurden durch Ethanolpräzipitation gestoppt, die Pellets
in 10 μl
8 M Harnstoff, 0,05 × TBE
Ladepuffer resuspendiert und 2 μl
wurden auf ein 8%, 19 : 1 Acrylamid : Bisacrylamid, 0,5 × TBE Sequenziergel
geladen.
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tRNA Schutzexperimente
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Bindereaktionen
wurden wie vorstehend für
die Aminoglycosid-Schutzexperimente beschrieben durchgeführt, mit
der Ausnahme, dass der Bindepuffer 200 mM NH4Cl
und 80 mM MgCl2 enthielt. E. coli tRNAphe Antikodon Stammschleife (GGGGAUUGAAAAUCCCC;
SEQ ID NO: 3) wurde mit T7 RNA Polymerase transkribiert, über ein
Gel aufgereinigt, durch Ethanolpräzipitation konzentriert und
mit einem kurzem Hitzeschritt angelagert (80°C/1 Minute gefolgt von 10 Minuten
auf Eis).
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Selektivitätsexperimente
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Die
Reaktionen entsprachen den bei den tRNA-Schutzexperimenten beschriebenen
Experimenten. TRNApro Antikodon Stammschleife
(GGUCAUCUUGGGGUGAUGACC; SEQ ID NO: 4), scrambled tRNAphe (GGGAGCGUCAUCACAUA;
SEQ ID NO: 5), Tetra-Schleife-Element
(GGGACUUCGGUCCC; SEQ ID NO: 6) und Tri-U-Schleife-Element (GGCGCUUUGCGCC;
SEQ ID NO: 7) wurden wie für
die E. coli tRNAphe Antikodon Stammschleife
transkribiert und behandelt. Der Assay und die Ergebnisse werden
nachstehend und in 4B beschrieben.
-
Experimenteller
Aufbau und Erlebnisse
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Die
Analyse von RNA-Struktur mit chemischen Sonden ist eine gut etablierte
und leistungsfähige Technik,
die die Überwachung
einzelner Atome von Nukleotidbasen oder des Phosphodiester-Gerüstes hinsichtlich
inter- oder intramolekularer Wechselwirkungen ermöglicht.
So methyliert z. B. Dimethylsulfat (DMS) N1 von A, N7 von G und
N3 von C-Resten,
Kethoxal (KE) bildet einen Zusammenschluss mit N1 und N2 von G und
ein lösliches
Carbodiimid (1-cyclohexyl-3-(2-morpholinoethyl) Carbodiimid metho-p-toluol
sulfonat (CMCT) modifiziert N3 von U-Resten. Nukleotidbasen-Modifikationen,
die mit der Bildung von Watson-Crick-Paaren interferieren, werden
typischerweise durch reverse Transkription überwacht, da der Fortschritt
der reversen Transkriptase stark behindert wird, wenn sie auf solche
Modifikationen trifft. Dies führt
zur Entstehung eines trunkierten reversen Transkriptionsproduktes,
dessen Länge
effektiv die Position der modifizierten Base widerspiegelt, wenn
die Produkte auf standardmäßigen Sequenziergelen
aufgetrennt werden.
-
Andere
Modifikationen, die nicht selbst mit der Bildung von Watson-Crick-Basenpaaren
interferieren, können
auf ähnliche
Weise überwacht
werden, indem zuerst das Aufschneiden des RNA-Strangs induziert wird.
So kann z. B. die Methylierung von N7 von G durch DMS durch Behandlung
der methylierten RNA mit Natriumborhydrid und Anilin zur Induktion
des Aufschneiden des Stranges an den Stellen der N7-Methylierung überwacht
werden. Die reverse Transkriptase fällt an dieser Stelle einfach
von der Matrize ab, was wiederum zu einem trunkierten Produkt führt, welches
die Position der N7 Methylierung anzeigt.
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Wir
haben diese Prinzipien und Techniken dazu verwendet, die erfindungsgemäßen Oligoribonukleotid-Analoga
zu analysieren und Screening-Assays unter Verwendung dieser Analoga
zu entwickeln.
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Wir
haben zuerst ein Oligoribonukleotid-Analog der in den 1C und 1D (SEQ
ID NO: 1) gezeigten dekodierenden Region entworfen, wie vorstehend
beschrieben, und stellten die Frage, ob es mit Aminoglykosidantibiotika
wie Neomycin wechselwirken könnte,
von dem zuvor gezeigt wurde, dass es N1 von A1408 (dies bezeichnet
das Adenin an Position 1408) und N7 von G1491 und G1494 innerhalb
der A-Stellen Subdomäne
der dekodierenden Region (Moazed et al, 1987, Nature, supra; Woodcock
et al., supra) schützen kann; ähnliche
Wechselwirkungen mit dem Analog wären ein starker Indikator für seine
richtige Faltung und das funktionale Potential. Umgekehrt interagieren
andere Antibiotika wie Streptomycin, Tetracyclin und Erythromycin
mit anderen Segmenten von 16S rRNA oder 23S rRNA (Moazed et al.,
1987, Nature, supra; Woodcock et al., supra, Moazed et al., 1987,
Biochimie, 69: 879–84)
und man würde
daher nicht erwarten, dass sie mit dem Analog interagieren. Ein
zweites Analog, das von der A-Stellen Subdomäne der dekodierenden Region
abgeleitet ist (und in 1E gezeigt wird) wurde auf die
gleiche Weise getestet.
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Wie
in den 1C, 1D und 1E zusammengefasst,
zeigen die Wechselwirkungen der Aminoglykoside wie Neomycin und
Paromomycin mit Oligoribonukleotid-Analoga der dekodierenden Region
eine auffallende Ähnlichkeit
zu ihren Gegenstück-Wechselwirkungen
mit dem dekodierenden Bereich in Untereinheiten von vollständiger 16S
rRNA in Ribosomen. Insbesondere zeigen der dekodierende Bereich
von Ribosomen (1A) und ein kleines Analog,
das nur die A-Stellen Subdomäne
enthält
(1E) quasi identische Aminoglykosid-Wechselwirkungen,
die durch eine einzelne Transversion von G zu U an Position 1491
zerstört werden.
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Die
Analoga wurden mit Dimethylsulfat (DMS; Stern et al., 1988, Meth.
Enzymol., 164: 481–89)
alleine als nackte RNA getestet, oder in Anwesenheit steigender
Konzentrationen von Neomycin, Paromomycin, Hygromycin, Streptomycin,
Tetrazyklin und Erythromycin. 2A zeigt,
dass Neomycin (Spuren 7–10)
und das eng verwandte Aminoglykosid Paromomycin (Spuren 11–14) N1
an A 1408 bei Konzentrationen von 10 und 0,1 μM stark schützten. Zusätzlich verstärkte Hygromycin
(Spuren 15–18),
ein strukturell unterschiedliches Aminoglykosid, die Reaktivität von N1
von A1408 schwach. Im Gegensatz dazu interagierten Streptomycin (Spuren
19–22),
Tetrazyklin (Spuren 23–26)
und Erythromycin (Spuren 27–30),
d. h., Antibiotika, die nicht mit der dekodierenden Region in 16S
rRNA interagieren, nicht in nachweisbarer Weise mit den Analoga.
-
2B zeigt,
dass zusätzlich
zu N1 von A1408, N7 von G1405 und G1494 stark durch Neomycin und Paromomycin
geschützt
wurden, während
N7 von G1491 und G1497 schwach geschützt wurden. Diese Ergebnisse
sind in 1C zusammengefasst. Da diese
Ergebnisse eng mit denen übereinstimmen,
die zuvor mit Antibiotika und intakten, vollständigen Ribosomen erhalten wurden
(Moazed et al., 1987, Nature, supra, Woodcock et al., supra, Moazed
et al., 1987, Biochimie, supra), zogen wir die Schlussfolgerung,
dass die A-Stelle Subdomäne
unseres Oligoribonukleotid-Analogs sich in eine biologisch relevante
Konformation faltet.
-
Wir
stellten uns danach die Frage, ob das Analog ähnlich wie die dekodierte Region
der 16S rRNA im Ribosom durch Interaktion mit tRNA und/oder mRNA
agieren könnte.
In dem in 3 gezeigten Experiment wurden
ansteigende Konzentrationen einer minimalen tRNA für diese
Zwecke (Rose et al., 1983, J. Mol. Biol., 167: 103–17), einem
T7 Transkript der Antikodon Stammschleife von E. coli tRNAPhe entweder
alleine (Spuren 7–10
und 17–20),
oder in Anwesenheit bekannter Poly U Message (Spuren 11–15 und
21–25)
inkubiert. 3 zeigt, dass das Antikodon
Stammschleifen-Transkript N3 von C1402 und C1403 (vgl. Spuren 6
mit Spuren 7–10)
und N7 von G1401 (vgl. Spur 16 mit den Spuren 17–20) schützte, während poly U N1 von A1408, A1492,
A1493, A1499 und A1502 stark, N1 von A1500, A1503 schwach und N7
von G1494 schwach (vgl. Spur 6 mit Spuren 11–15 und Spur 16 mit Spuren
21–25)
schützte,
wobei diese Effekte in Anwesenheit von poly U abgeschwächt wurden
(vgl. Spuren 7–10
mit Spuren 12–15).
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Ein
Vergleich der gegenwärtigen
Ergebnisse mit Ergebnissen aus früheren Studien mit Ribosomen (Moazed
et al., 1986, Cell, supra; Moazed et al., 1990, J. Mol. Biol., supra)
zeigt, das die durch das tRNA Antikodon Stammschleifen-Transkript
im Analog (G1401, C1402 und C1403) geschützten Nukleotide eng mit jenen
Nukleotiden assoziiert sind und nahezu überlappen, die in An- oder
Abwesenheit von Message durch an die P-Stelle gebundene tRNA geschützt werden
(C1399, C1400 und G1401). Weiterhin sind innerhalb der A-Stellen
Subdomäne
des Analogs durch mRNA geschützte
Nukleotide (A1408, A1492-G1494) identisch zu jenen, die mit der
mRNA-abhängigen
Interaktion von tRNA mit der A-Stelle von Ribosomen assoziiert sind (Moazed
et al., 1986, Cell, supra; Moazed et al., 1990, J. Mol. Biol. Supra).
Die anderen Nukleotide, die durch mRNA geschützt werden (A1499, A1500, A1502
und A1503) wurden früher
weder mit A- noch in P-Stellen Funktion in chemischen Testversuchen
identifiziert.
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Zur
Hilfe bei der Bestimmung, ob poly U mRNA Wechselwirkungen durch
Watson-Crick-Basenpaarungen
mit A-Resten im Analog vermittelt wurden, untersuchten wir als nächstes poly
C, eine mRNA ohne Potential zur Bildung von Watson-Crick-Basenpaaren
mit A-Resten und mit polydesoxy U, einer 2'-desoxy-Form von poly U, mit ähnlichem
Potential zur Watson-Crick Basenpaarung. Das Experiment von 4A zeigte,
dass während
Poly U A1408, A1492 und A1493 so stark wie erwartet schützte (vgl.
Spuren 6–8
mit den Spuren 12–14),
Polydesoxy U nicht nachweisbar mit irgendwelchen Nukleotiden im
Analog interagieren konnte (vergleiche Spuren 6–8. mit den Spuren 9–11). Die
Wechselwirkungen von polyC waren komplexer, da die Reaktivitäten von
N1 von A1410 und N3 von C1402 und C1403 erhöht waren (vgl. Spuren 6–8 mit Spuren
15–17). Mit
der Ausnahme von A1492 jedoch schützte Poly C die gleichen Nukleotide
wie Poly U, einschließlich
A1408, A1493, A1499, A1500, A1502 und A1503. Somit war trotz der
durch Poly C induzierten offensichtlichen Zerstörung der Analogstruktur sein
Schutzmuster quasi identisch zu dem von Poly U. Zusammen betrachtet
legen diese Ergebnisse nahe, dass die Wechselwirkungen von mRNA
mit der dekodierenden Region nicht einfach durch Watson-Crick-Basenpaarung
vermittelt werden.
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C1402
und C1403 sind in 16S rRNA unreaktiv (Moazed et al., 1986, J. Mol.
Biol., 187: 399–416);
ihre Reaktivität
im Analog und ihr Schutz durch das tRNA Antikodon Stammschleifen-Transkript legen
nahe, dass sich die Struktur der P-Stelle Subdomäne des Oligoribonukleotid-Analogs sich von
der von Ribosomen unterscheidet.
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Zum
besseren Verständnis
der diskriminatorischen Fähigkeit,
oder Selektivität
der P-Stellen Subdomäne
des Oligoribonukleotid-Analogs stellten wir als nächstes die
Frage, ob sie zwischen eng verwandten RNA-Strukturen unterscheidet.
In dem in 4B gezeigten Experiment wurden
eine zweite (mit unterschiedlicher Sequenz) Prolin-spezifische tRNA
Antikodon Stammschleife (tRNApro) (GGUCAUCUUGGGGUGAUGACC;
SEQ ID NO: 4), eine scrambled-Sequence E. coli tRNAphe mit
wenig Potential zur Bildung von Sekundärstrukturen (sctRNAphe) (GGGAGCGUCAUCACAUA; SEQ ID NO: 5), ein
hoch stabiles Tetra-Schleife-Stamm Schleifenelement (Tetra-Schleife)
(GGGACUUCGGUCCC; SEQ ID NO: 6) und ein anderes, kleineres Stamm-Schleifen-Element
mit einer Schleife, die nur aus drei U-Resten besteht (triUloop)
(GGCGCUUUGCGCC; SEQ ID NO: 7) jeweils in eine Bindereaktion mit
dem Analog titriert.
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4B zeigt,
dass nur die tRNAphe und tRNApro Antikodon
Stamm-Schleifen Transkripte interagierten und jeweils C1402 und
C1403 stark schützten.
Das Fehlen von Interaktion des scrambled tRNAphe und der anderen
Stamm-Schleifen Elemente unterstützt
nachweisbar die Hypothese, dass trotz ihrer veränderten Konformation die P-Stellen
Subdomäne
selektiv mit RNA Liganden interagiert. Diese Ergebnisse legen nahe,
dass die P-Stelle Subdomäne
des Oligoribonukleotid-Analogs eine signifikante diskriminatorische
Kapazität
aufweist, die mit ribosomaler P-Stellen Funktion verwandt sein kann.
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Angesichts
des Weglassens von 1500 Nukleotiden aus der vollständigen 16S
rRNA, aller Nukleotidmodifikationen, und der 21 kleinen Untereinheit-Proteine,
die man normalerweise in der 30S ribosomalen Untereinheit findet,
war das Aufzeigen der Wechselwirkungen zwischen den kleinen dekodierende
Region Oligoribonukleotid-Analoga und den 30S Untereinheitsliganden,
die mit den normalen 30S Untereinheit-Aktivitäten korrelieren, überraschend
und unerwartet. Positive Korrelationen werden wahrscheinlich am
besten beispielhaft dargestellt durch die Interaktionen der Antibiotika
mit der A-Stellen Subdomäne,
wo eine fast perfekte Übereinstimmung
zwischen den Eigenschaften der dekodierenden Region in Ribosomen
und dem Oligoribonukleotid-Analog mit einer großen Vielzahl von Verbindungen
beobachtet wurde.
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Verwendungen/Vorteile
der Erfindung
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Die
erfindungsgemäßen Oligoribonukleotide
sind insoweit unterschiedlich, als dass sie von jeder ribosomalen
RNA (z. B., 16S, 23S), RNA von menschlichem Immundefizienzvirus
(HIV) (vgl. Green (1993) AIDS Res. Rev. 3: 41–55 für Beispiele gewünschter
Bereiche wie Tat oder Rev Interaktionsstellen) oder von jeder anderen
RNA, die manipuliert werden kann, um eine funktionell relevante
Struktur beizubehalten, abgeleitet werden können. Obwohl der dekodierende
Bereich der 16s rRNA und Aminoglykosidantibiotika in den hier beschriebenen
Experimenten umfasst sind, sind sie nicht der einzige Bereich oder
die einzige chemische Klasse, die in dieser Erfindung verwendet
werden kann.
-
So
können
z. B. auch regulatorische Elemente von messenger RNA, Telomerase
RNA (vgl., z. B. Bahattacharyya und Blackburn, EMBO J., 13: 5721–31, 1994),
Onkogen-mRNAs, mRNAs von Cytokinen und Lymphokinen, Thymidylatsynthase
mRNAs und verschiedene virale Elemente wie der dreiteilige Leader
für späte RNA von
Adenovirus, RNA von Hepatitis Delta Virus und „ribosomal landing pads" von Picornavirus
oder „internal
ribosomal entry sites",
die im 5' untranslatierten
Bereich liegen, dazu verwendet werden, die erfindungsgemäßen Oligoribonukleotid-Analoga
zu entwerfen.
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Weiterhin
werden selbst-spleissende Gruppe I Introns, einschließlich des
HDV Gruppe I Intron durch die Bindung von Aminoglykosiden gehemmt
und können
somit dazu verwendet werden, RNA Oligoribonukleotid-Analoga zu entwerfen.
Weiterhin wird das HIV Rev Response Element (RRE) durch einige der
gleichen Antibiotika gebunden, die an den dekodierenden Bereich
der 16S rRNA binden. Die Bindung von Neomycin an das RRE hemmt die
Funktion von Rev und von viraler Replikation in Zellkulturmodellen.
Somit ist das RRE ein geeignetes Ziel zum Entwerfen von Oligoribonukleotid-Analoga,
die nützlich
sind, um gegen das RRE wirksame Antibiotika zu testen.
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Jedes
bekannte RNA-Strukturmotiv kann als parentale RNA verwendet werden,
um ein Oligonukleotid-Analog zu entwerfen, das als Screening-Ziel
verwendet werden kann, und da der Transport, das Prozessieren und
die Translation von mRNA von solchen Strukturen und deren Wechselwirkungen
mit verschiedenen Bindepartnern abhängen, existiert eine Vielzahl
von möglichen
Zielen in viraler und zellulärer
mRNA. Wenn man diese Ideen noch weiter denkt, angenommen, dass mutierte
zelluläre
mRNA Sequenzen veränderte mRNA
Strukturen produzieren, kann es sogar möglich sein, spezifische mutierte
mRNA Sequenzen mit kleinen Molekülen
zu erreichen.
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Zusätzlich zu
den ersten Nukleotidsequenzen, die von der parentalen RNA abgeleitet
sind, enthalten die erfindungsgemäßen Oligoribonukleotid-Analoga
auch zweite, heterologe Sequenzen (z. B. künstliche Stammschleifen und
Nukleotidklemmen) die die geeignete dreidimensionale Konformation
der ersten Nukleotidsequenzen hinsichtlich normaler Wechselwirkung
mit Kandidatenarzneistoffen, Nukleinsäuremolekülen etc. unterstützen. Durch
die geringe Größe dieser
Kandidatenarzneistoffe und Moleküle
sind diese für
zahlreiche kostengünstige
in vitro Assays zugänglich,
die eine Vielzahl von Oligoribonukleotid-Analoga verwenden.
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Proteinsyntheseinhibitoren
haben in erster Linie zwei ribosomale Ziele: der dekodierende Bereich
von 16S rRNA und der Peptidyltransferase-Bereich (Domäne V) der
23S rRNA. Aminoglykoside interagieren mit der dekodierenden Region,
während
MLS Antibiotika (Macrolide, Lincosamine und Streptogramine) mit
dem Peptidyltransferase-Bereich interagieren. Peptide, Nukleinsäuremoleküle und eine
Vielzahl anderer chemischer Verbindungen und Moleküle können als
Therapeutika nützlich
sein und können
unter Verwendung der erfindungsgemäßen Oligoribonukleotid-Analoga
und Verfahren leicht gescreent werden.
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Die
Oligoribonukleotid-Analoga ermöglichen
die Verwendung verbesserter Verfahren zum Screening neuartiger therapeutischer
Verbindungen, insbesondere von antibiotischen Verbindungen, die
die Proteinsynthese hemmen. Standardverfahren zum Screenen von Antibiotika
beinhalten den Nachweis von antimikrobieller oder bakterizider Aktivität in kultivierten
Zellen über
lange Zeiträume
(bis zu einigen Tagen). Das Screening vieler potentieller antibiotischer
Verbindungen unter diesen Bedingungen kann teuer und zeitaufwändig sein. Andererseits
besitzen Screening-Assays, in denen die erfindungsgemäßen Oligoribonukleotid-Analoga
verwendet werden, mehrere deutliche Vorteile gegenüber diesen
bekannten Screeningverfahren.
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Die
neuen Screeningassays sind viel schneller (ein erfindungsgemäßer Assay
kann in einer Stunde durchgeführt
werden), die einzelnen Assays benötigen nur geringe Stoffmengen
(Volumina von etwa 100 μl) und
zahlreiche Reaktionen können
parallel durchgeführt
werden (z. B. in einer 96-Loch Mikrotiterplatte). Mit den erfindungsgemäßen Verfahren
können
wahrscheinliche Kandidatenverbindungen schnell identifiziert werden
und dann könnten
nur die wahrscheinlichen Kandidaten mit Zellkulturassays weitergetestet
werden.
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Einige
der Vorteile leiten sich, verglichen mit Ribosomen vollständiger Größe, von
den Analoga selbst ab. Die Oligoribonukleotid-Analoga sind klein
genug, um einfach produziert zu werden, entweder enzymatisch als
T7 Polymerase-Transkripte oder chemisch durch automatisierte RNA
Synthese.
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Die
Analoga sind viel stabiler als Ribosomen, da sie radikal einfacher
sind. Weiterhin kann, anders als bei Ribosomen, deren labiles Ribophosphodiestergerüst durch
Einbau von 2'-O-methyl Ribonukleotiden,
Desoxyribonukleotiden oder Phosphorthioaten entweder gleichmäßig oder
an ausgewählten
Positionen stabilisiert werden.
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Zusätzlich können Analoga
während
automatisierter chemischer Synthese leicht derivatisiert werden. So
können
z. B. fluoreszierende Reste an jedem Ende (5' oder 3') oder intern, und Kopplungsreste, wie
primäre Amine
oder Biotin an jedem Ende eingebaut werden (siehe nachstehende Diskussion).
Weiterhin ist der Nachweis von Wechselwirkungen zwischen neuen Testverbindungen
und Analoga eher für
potentielle antibiotische Aktivität relevant, da im Gegensatz
zu Ribosomen die neuen Analoga ein kleines, gut definiertes Ziel
darstellen.
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Screening-Assays
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Durch
die folgenden Screeningverfahren wird keine besondere Klasse molekularer
Struktur selektiert. Die Verfahren sind eher nur für die Existenz
hoch spezifischer Wechselwirkungen selektiv, an denen bestimmte Nukleotidatome
im analogen RNA-Ziel beteiligt sind. Daher können spezifische Verbindungen
getestet werden, um zu bestimmen, ob sie wahrscheinlich antibiotische
Aktivität
haben.
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Allgemeine
Betrachtungen
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Aminoglykoside
sind Polykationen, und Ladung-Ladung Wechselwirkungen mit dem negativ
geladenen Phosphodiestergerüst
der Oligoribonukleotid-Analoga sind wahrscheinliche wichtige Determinanten
ihrer Bindespezifität
und Affinität.
Somit umfassen wichtige Faktoren, die die Bildung und Stabilität von Aminoglykosid-RNA-Wechselwirkungen
steuern, ein- und zweiwertige Kation(Salz)-Konzentrationen, und
die An- oder Abwesenheit nichtspezifischer Nukleinsäuren. Demgemäss begünstigen
niedrige Salzkonzentrationen (< 100 mM
K+, NH4+, Na+, < 5
mM Mg++) die Komplexbildung, während
die Anwesenheit von unspezifischen Nukleinsäuren ungünstig ist. Zu testende Kandidatenverbindungen
sollten daher in Niedrigsalz-Puffern hergestellt werden, die größtenteils
frei von kontaminierenden Nukleinsäuren sind.
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Um
das Screening mit hohem Durchsatz zu erleichtern, wird ein standardmäßiges Mikrotiterplattenformat
mit einem standardmäßigem Fluoreszenz-
oder Strahlungsdetektor verwendet. Ein Robotersystem wird dazu verwendet,
in jeder Vertiefung zu beladen, zu waschen und um ein Signal nachzuweisen.
Kationenkonzentrationen, unspezifische Nukleinsäuren und andere Variable, einschließlich Temperatur
und Zeit können während der
Binde- und Waschschritte angepasst werden, um die Hintergrund-Bindekonzentrationen
anzupassen.
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Drei Screening-Verfahren
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5A und 5B veranschaulichen
zwei spezifische Screening Assays basierend auf 1) Bindung von Testverbindungen
an immobilisierte (nackte) Oligoribonukleotid-Analoga, die als Reporter
wirken („Affinitätsassay"), bzw. 2) Verdrängung eines
vorgebundenen Reportermoleküls
aus einem immobilisierten Analog durch Testverbindungen („kompetitiver
Bindeassay"). Diese
beiden Verfahren sind sich, obwohl sie unterschiedlich sind, in
der Gesamtstrategie und Organisation ähnlich. Ein drittes Verfahren
(7A, 7B, 8A und 8B), das
auf Oligomerbindung an ein in situ „footprinted" Analog basiert,
unterscheidet sich in Organisation und Strategie von den ersten
beiden Verfahren und wird getrennt diskutiert.
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Verfahren 1: Affinitätsassay
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Dieses
Screeningverfahren kann, wie in 5A gezeigt,
mit einem immobilisierten, fluoreszenzmarkierten Oligoribonukleotid-Analog
implementiert werden. Das Verfahren besteht aus (1) Inkubation des
immobilisierten Analogs mit Testverbindungen, (2) Waschschritt(en),
und nachfolgendem Nachweis von Komplexbildung beruhend auf Veränderungen
der Fluoreszenzeigenschaften des immobilisierten RNA-Analogs. Das RNA-Analog kann derivatisiert
werden, z. B. während
automatisierter chemischer Synthese, sowohl für die Immobilisierung als auch
für die
Markierung. Mögliche
Positionen für
die Derivatisierung in einem Oligoribonukleotid-Analog werden durch
Kästchen
um die Nukleotide in 6 gezeigt.
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Für die Immobilisierung
kann das Analog z. B. entweder mit terminalem Biotin (mit Biotin
Phosphoramidit (5'-Biotin)
oder CPG (3'-Biotin))
oder einer freien primären
Aminogruppe (mit Amino Modifikator Phosphoramidit (5'-NH2)
oder CPG (3'-NH2)) derivatisiert werden. Die Immobilisierung
in Vertiefungen von Mikrotiterplatten kann dann durch Polystyrolplatten
durchgeführt
werden, die mit Streptavidin bzw. Maleinanhydrid aktiviert wurden.
Nach der Kopplung sollten die Platten zur Entfernung von löslicher
Analog-RNA gründlich
gewaschen werden.
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Zur
Markierung werden die Analoga derivatisiert, um die Addition eines
Fluorophors an einem der RNA Termini mit Fluorescein Phosphoramidit
(3' Markierung)
oder CPG (5' Markierung)
oder den Einbau von fluoreszierendem Adenosin oder von Cytosinnukleotiden
(mit EthenoA bzw. EthenoC Phosphoramiditen) an spezifischen internen
Positionen in der RNA zu ermöglichen.
Der letztere Ansatz kann aufgrund der Nähe des Fluorophors und der
Antibiotika-Bindestelle viel sensitiver sein. Alternativ dazu kann
ein Fluoreszenzfarbstoff wie Ethidiumbromid oder möglicherweise
Hoechst 33258 mit underivatisierter RNA verwendet werden. Diese
Markierung ermöglicht
den Nachweis jeder Veränderung
entweder bei der Bindung oder den Fluoreszenzeigenschaften des Farbstoffs
oder von beiden, nach der Komplexbildung zwischen Testverbindung
und Analog.
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Typische
(Lösung-)
Bindereaktionen enthalten 25 mM neutralen pH Puffer (Tris oder Hepes)
und 50 mM einwertiges Salz (KCl, NH4Cl,
etc). Es ist vorteilhaft, Bindungsreaktionen bei 30–37°C für ca. 30
Minuten durchzuführen
und die gleichzeitige Anlagerung der RNA zu erleichtern. Bei den
Waschschritten kann derselbe Puffer verwendet werden.
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Testverbindungen
und Salzkonzentrationen sollten empirisch angepasst werden, um den
Assay zu optimieren. So sollte die Konzentration der Testverbindung
im mikromolaren Bereich liegen, und die Salzkonzentrationen sollten
im Bereich von 10 bis 500 mM sein, aber diese Zahlen müssen in
Abhängigkeit
der spezifischen Assaybedingungen angepasst werden. Zusätzlich können beim
Bindungsschritt nichtspezifische Nukleinsäuren zugegeben werden, um die
Auswirkungen irgendwelcher kontaminierender Verbindungen mit unspezifischer Affinität für Nukleinsäuren zu
reduzieren. Die unspezifische Nukleinsäure kann Gesamt-tRNA von Hefe, Poly
1-C, etc. sein. Eine weitere, möglicherweise
nützliche
unspezifische Nukleinsäure
wäre ein
(lösliches) A-Stelle
Analog, das die G1491U Punktmutation aufweist.
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Verfahren 2: Kompetitiver
Bindeassay
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Wie
in 5B gezeigt, basiert dieses Screeningverfahren
auf der Hypothese, dass nützliche
Testverbindungen vorgebundene Reporterliganden aus ihren immobilisierten
Analog-Bindestellen
verdrängen.
So kann z. B. immobilisiertes Neomycin (ein antibiotischer Ligand,
von dem man weiß,
dass er an Analoga bindet, die von der dekodierenden Region von
16S rRNA abgeleitet sind) (1) mit einem markierten Analog vorbeladen und
(2) Testverbindungen zugegeben werden und die Kompetition mit immobilisiertem
Neomycin um das markierte Analog, das als Reporter dient, wird zugelassen.
Nach einem Waschschritt zur Entfernung von verdrängtem Analog, das noch mit
der Testverbindung komplexiert ist, würde der Nachweis des Fehlens
der Markierung in spezifischen Vertiefungen anzeigen, dass spezifische
Testverbindungen die Analog RNA wirksam gebunden haben, d. h. ein
positives Ergebnis. Die umgekehrte Konfiguration, mit immobilisierter
Analog-RNA und markiertem Neomycin kann ebenfalls verwendet werden.
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Neomycin
und andere Aminoglykoside enthalten zahlreiche primäre Aminogruppen,
die ideale Ziele für
die Kopplung entweder an Amin-reaktive Fluoreszenzsonden oder aktiviertes
Polystyrol sind. So kann z. B. ein lösliches Neomycin-Reportermolekül durch
Kopplung von Neomycin an NHS-Fluorescein hergestellt werden. Andererseits
kann Neomycin auf Malein-Anhydrid-aktivierten
Polystyrol-Mikrotiterplatten immobilisiert werden. Wie vorstehend
diskutiert, kann das Oligoribonukleotid-Analog ähnlich markiert oder immobilisiert werden.
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Verfahren 3: Screening
durch in situ Footprinting
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7A und 7B und 8A und 8B veranschaulichen
ein drittes Screeningverfahren, das direkt auf unseren Erfahrungen
mit chemischer Austestung beruht, die gezeigt haben, dass das N1
Atom von A1408 in Abwesenheit von Neomycin durch DMS stark methyliert
ist und umgekehrt in Anwesenheit von Neomycin stark vor DMS Methylierung
geschützt
ist. In herkömmlichen
Footprinting-Experimenten stellt diese differentielle Modifizierung
ein Verfahren zum Nachweis der Komplexbildung (überwacht durch Hemmung der Primerverlängerung)
bereit. Verfahren 3 nützt
in ähnlicher
Weise die differentielle Methylierung aus, aber überwacht diese Methylierung
z. B. über
die differentielle Anlagerung eines markierten komplementären Oligomers (z.
B. CAGUGU) mit einer Bindestelle, die mit der Methylierungsstelle überlappt,
A1408 (7A und 7B).
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In
diesem Verfahren wird das N1 Atom vom A1408 durch Dimethylsulfat
(DMS) in Abwesenheit von Neomycin (7A) stark
methyliert und umgekehrt in Anwesenheit von Neomycin („gebundenes
kleines Molekül") (7B)
stark vor DMS Methylierung geschützt.
Somit gibt nach der Komplexbildung (Schritt 1) und DMS
Modifikation (Schritt 2) der Methylierungszustand von A1408
seine (vorherige) Beteiligung an Komplexbildung mit Neomycin an.
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Die
Schritte des Assays sind ähnlich
zu Verfahren 1, insofern als das der erste Schritt die Bildung von Komplexen
zwischen den immobilisierten (aber hier unmarkierten) Analoga- und Testverbindungen
(Schritt 1) beinhaltet. Nach der Komplexbildung und den
Waschschritten wird die Platte mit DMS behandelt, um die RNA differentiell
zu methylieren (Schritt 2). DMS-Reaktionen werden dann
mit einem 1 M βME
Waschschritt gestoppt und markiertes Reporteroligo zugegeben und
angelagert (Schritt 3).
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Die
Technik zur Überwachung
der differentiellen Methylierung, die in 7A und 7B veranschaulicht
wird, beruht auf der Unfähigkeit
von N1-methyliertem A zur Bildung von Watson-Crick-Basenpaaren mit einem
kurzem markierten Oligomer. In 7A, mit
unkomplexiertem Analog und methyliertem N1 kann das kurze Oligo
nicht an das Analog anlagern und wird weggewaschen, wobei keine
Markierung in der Vertiefung zurückbleibt.
In 7B, mit komplexiertem Analog und unmethyliertem
N1, lagert sich das Oligo an das Analog an und wird effektiv davon
immobilisiert, wobei eine Markierung in der Vertiefung zurückbleibt.
Vertiefungen, die das Reporter-Oligo zurückhalten, zeigen, dass A1408
nicht methyliert war, was wiederum zeigt, das A1408 durch einen
gebundenen antibiotischen Liganden geschützt war. Somit stellt die Anwesenheit
einer Markierung in einer Vertiefung ein positives Ergebnis dar.
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Ein
alternatives Verfahren zur Überwachung
der differentiellen Methylierung, die in 8A und 8B gezeigt
wird, beruht auf der reversen Transkription der modifizierten Matrize.
Schritte 1 und 2 sind identisch zu den in 7A und 7B gezeigten,
mit der Ausnahme, dass das Zielanalogon (RNA) nicht länger immobilisiert
ist. Stattdessen wird ein biotinylierter Primer (z. B. mit der Nukleotidsequenz
TTCACCCGGAAGGTG; SEQ ID NO: 12) zu jeder Reaktion zugegeben (8A und 8B),
und die Primerverlängerung wird
in Anwesenheit von markiertem TTP (z. B., α-32P-TTP)
und reverser Transkriptase initiiert.
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In 8A wird
die Primerverlängerung
durch Methylierung von N1 von A1408 gehemmt und keine Markierung
wird eingebaut. In 8B ist die Primerverlängerung
erfolgreich, woraus der Einbau von Markierung in den Primer resultiert.
In beiden Fällen
wird der biotinylierte Primer durch Interaktion mit Streptavidin-beschichteten
Vertiefungen immobilisiert. Nach einem Waschschritt zur Entfernung
von nicht-eingebautem markiertem TTP wird nur das Szenario aus 8B das
Zurückhalten
der Markierung in der Vertiefung ermöglichen, wodurch die Anwesenheit
von gebundenem Liganden in Schritt 1 angezeigt wird.
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Die
auf reverser Transkriptase basierende Reportermethodologie ähnelt oberflächlich gesehen
standardmäßigen chemischen
Hybridisierungsverfahren. Der Hauptunterschied, abgesehen vom immobilisierten Primern
besteht darin, dass die Primer-Verlängerungsbedingungen, z. B.
Mg Konzentration, Reaktionszeit, Temperatur und Menge an Enzym durch
Standardverfahren angepasst werden, so dass die Methylierung von A1408
die Verlängerung
eines hohen Prozentsatzes (ca. 90%) der Transkripte vollständig stoppen
wird. Dies ist das Gegenteil der gewünschten Situation in Standardexperimenten,
wobei die Bedingungen so angepasst werden, dass mehr als 90% der
Transkripte vollständig
lang sind.
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