WO2001079537A2 - Testsystem zum nachweis einer spleissreaktion, sowie dessen verwendung - Google Patents

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WO2001079537A2
WO2001079537A2 PCT/EP2001/002234 EP0102234W WO0179537A2 WO 2001079537 A2 WO2001079537 A2 WO 2001079537A2 EP 0102234 W EP0102234 W EP 0102234W WO 0179537 A2 WO0179537 A2 WO 0179537A2
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nucleic acid
splice
intron
splicing
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Eberhard Schneider
Marion Bartel
Peter Wagner
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Aventis Research & Technologies Gmbh & Co Kg
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Definitions

  • the present invention relates to a homogeneous test system containing
  • genes coding for proteins in eukaryotes are interrupted in their form in the genome by one or more sequences (introns) not coding for the protein.
  • these non-coding areas are transferred to the primary transcript.
  • this precursor mRNA in order to generate a correct form of the mRNA, this precursor mRNA (pre-mRNA) must be processed.
  • the pre-mRNA is processed by removing the introns and fusing the coding regions (exons). Only then can one read continuously
  • Nucleotide strand can be made available for translation in the cytoplasm.
  • the formation of mRNA in eukaryotes therefore requires a so-called splicing process in which the non-coding gene regions (introns) are removed from the primary gene transcript.
  • the splicing takes place in the core before the mRNA is transported out of the core. It is generally carried out in a two-step mechanism, in each of which a transesterification step is involved (Moore, ÜM, et al., (1993) Splicing of precursors to messenger RNAs by the Spliceosome. In The RNA world, Edited by Gesteland RF, Gesteland, JF, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 303-358).
  • the first step generates a free 5 ' exon and a so-called lariat structure of the intron, which is still connected to the 3 ' exon.
  • the lariat structure contains a branched RNA, which is caused by esterification of the 5 ' end of the intron with a 2 ' hydroxyl group of a ribose in an adenosine, which is approximately 20-40
  • Nucleotide is located upstream of the 3 ' end of the intron, the so-called branch site.
  • the second catalytic step leads to ligation of the exons and release of the intron.
  • an energy source for example AT P, is necessary for this catalysis (Guthrie, C. (1991) Science, 253, 157).
  • snRNPs small nuclear ribonucleoprotein particies
  • the second class consists of so far little characterized proteins that are not firmly bound to the snRNPs and are therefore called non-snRNP splice factors (Lamm, G.M. & Lamond, A.J. (1993) Biochm. Biophys. Acta, 1173,
  • the composition of the snRNPs is best investigated in HeLa cells (Will, CL et al., (1995) Nuclear pre-mRNA splicing. In: Eckstein, F. and Lilley, DMJ (eds). Nucleic Acids and Molecular Biology. Springer Verlag, Berlin, pp. 342-372).
  • the snRNPs lie in a 12S U1 snRNP, a 17S U2 snRNP and a 25S [U4 / U6.U5] tri- snRNP complex.
  • salt concentrations approximately 1
  • the tri-snRNP complex dissociates into a 20S U5 and a 12S U4 / U6 particle.
  • the U4 and U6 RNAs are base-paired in the U4 / U6 snRNP via two intermolecular helices
  • the snRNPs consist of two groups of proteins. In all snRNPs this is
  • each snRNP contains specific proteins that are only contained in this.
  • the U1 snRNP contains three additional proteins (70K, A and C) and the U2 snRNP contains eleven additional proteins.
  • U5 snRNP carries nine additional proteins with a molecular weight of 15, 40, 52, 100, 102, 110, 116, 200 and 220 kDa
  • 12S U4 / U6 snRNP carries two additional proteins with a molecular weight of approx. 60 and Contains 90 kDa
  • the 25S tri-snRNP [U4 / U6.U5] contains five additional proteins with a molecular weight of approx. 15.5, 20, 27, 61 and 63 kDa.
  • the individual components pre-mRNA, snRNPs and non-snRNP proteins
  • pre-mRNA, snRNPs and non-snRNP proteins are brought together in a step-by-step process. This is achieved not only through interactions of the pre-mRNA with the protein-containing components, but also through numerous interactions between the protein-containing components themselves (Moore, JM (1993) supra; Madhani, HD & Guthrie, C. (1994) Annu. Rev. Genetics, 28, 1; Nilsen, TW (1994) Cell, 65, 11 5).
  • the pre-mRNA carries in its sequence specific recognition sequences for the different splice components.
  • the U1 snRNP binds to the 5 ' splice via these recognition sequences.
  • the U2 snRNP particle interacts with the so-called branch site in the intron area (Krämer, A. & Utans, U. (1991) EMBO J., 10, 1503; Fu, XD & Maniatis, T. (1992) Proc. Natl. Acad. Sei USA, 89, 1725; Krämer, A. (1992) Mol. Cell Biol., 12, 4545; Zamore, PD et al. (1992) Nature, 355, 609; Eperon, JC et al. ( 1993) EMBO J., 12, 3607; Zuo, P. (1994) Proc. Natl. Acad.
  • alternative splicing By means of alternative splicing, different mature mRNAs can be formed from one and the same protein transcription, which code for different proteins.
  • This alternative splicing is regulated in many cases. For example, this mechanism can be used to switch from a non-functional to a functional protein (e.g. B transposase in Drosophila)
  • a functional protein e.g. B transposase in Drosophila
  • alternative splicing is carried out in a tissue-specific manner.
  • the tyrosine kinase which is encoded by the src proto-oncogene, is synthesized in nerve cells by alternative splicing in a special form
  • CD44 Splicing variants of the membrane-standing molecule CD44 play a decisive role
  • the CD44 gene contains several exons, 10 of which adjacent exons are spliced from the pra-mRNA in a different arrangement in the mRNA generation.
  • metastatic variants are the exons Carrying 4 to 7 or 6 to 7 With the help of antibodies against the part of the protein encoded by exon 6, the metastasis could be effectively suppressed (Sherman, L, et al, (1996) Curr Top Microbiol Immunol 213 249-269) splice mutants of the APC - (Adenomatosis Pohposis Col ⁇ ) oncogene, which comes from patients of familial Adomatoser Poliposis (FAP) isolated produce truncated proteins as a result of faulty alternative splicing, with exons 9, 10A and 14 being excised (Bala, S., et al., (1996) Hum Genet 98 (5): 528
  • Organism It is known that a point mutation in an intron of the ß-globin can lead to a ß + thalemia.
  • the base exchange results in a wrong splice site, which leads to a changed reading frame and to premature termination of the peptide chain (Weatherall, D. & Clegg, JB (1982) Cell, 29, 7; Fukumaki, Y. et al. (1982) Cell , 28, 585).
  • Arabidopsis thaliana mutants z.
  • the NS1 protein which is encoded by the genome of the influenza virus, can also interfere with the splicing by binding to the U6 snRNA.
  • the protein binds to nucleotides 27-46 and 83-101 of human U6 snRNA and thus prevents U6 from interacting with partners U2 and U4 during the splicing process (Fortes, P. et al. (1994) EMBO J. , 13, 704; Qiu, Y. & Krug, RM (1995) J. Virol., 68, 2425.
  • the NS1 protein also appears to prevent export from the nucleus by binding to the poly-A tail of the mRNA formed (Fortes, P. et al. (1994), supra; Qiu, Y. & Krug, RM (1994), supra).
  • Polymerase II were generated, also to be able to intervene in the splice processes (Yurvey, A. et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sei USA, 93, 6975; WO97 / 20031).
  • oligonucleotides which can additionally activate RNase H (Hodges, D. & Crooke ST. (1995) Mol. Pharmacol., 48, 905).
  • RNase H Hodges, D. & Crooke ST. (1995) Mol. Pharmacol., 48, 905.
  • a more detailed analysis of the pre-mRNA sequences required for the splicing showed that 19 nucleotides upstream from the branch point adenosine and 25 nucleotides around the 3 ' and 5 ' splice site are suitable
  • a pre-mRNA is generally first prepared by in vitro transcription. Genetic constructs from viruses, e.g. B. adenoviruses, or cellular structural genes. Such pre-mRNAs contain all the important structural elements that are necessary for the recognition of the pre-mRNA by the spliceosome and the process of splicing. In general, the pre-mRNA is radiolabelled so that, after separation in a denaturing urea-polyacrylamide gel, the characteristic band patterns can be used to assess whether a splicing reaction has occurred or in which reaction step a disturbance has occurred.
  • test systems of this type are very time-consuming and labor-intensive and are therefore not suitable for the systematic detection of substances which can modulate the splicing.
  • Components are mobile in a soluble phase, for the detection of a
  • Screening is suitable, for example, in a robot system.
  • the task is solved by the specific choice of the probes.
  • the present invention therefore relates to a homogeneous test system
  • probes For a homogeneous test system, therefore, suitable probes must be generated that enable the detection of the splicing that has been carried out or that has not been done.
  • the probes according to (b) can preferably bind to the nucleic acid to be investigated by means of hybridization.
  • nucleic acids of such probes which are necessary for this and which are complementary to partial sequences of the splicable nucleic acid are complementary to at least one partial sequence of an intron and one partial sequence of an exon or at least to two partial sequences of two exons.
  • the basic arrangement is shown in Figure 1a) -d).
  • the complementary probes are preferably located at the ends of the intron or exon and, on the basis of corresponding fluorophores in the unspliced splicable nucleic acid or in the splice product, generate a detectable signal by means of which the maturity state of the RNA (pre-mRNA or mRNA) can be characterized and investigated ,
  • Molecules are known to those skilled in the art under the name fluorophore, the physical behavior of which is distinguished by the fact that they are excited by a distinct wavelength, i.e. be raised to a higher energy level and emit this additional energy in the form of light of a longer length of time when they fall back to their original energy level.
  • Corresponding fluorophores in the sense of the invention are understood to mean a pair of fluorescent molecules whose properties consist in the fact that the wavelength of the emitted light (emission) of the fluorophore of lower wavelength (donor) is in the range of the excitation wavelength of the second fluorophore (acceptor).
  • Natural fluorophore pairs are, for example, phenylalanine / tyrosine and tyrosine / tryptophan in proteins.
  • Corresponding fluorophores on the basis are preferred according to the invention Fluorescein / rhodamine, and their derivatives such as carboxyfluorescein
  • the fluorescent molecules can be linked to the nucleotides using methods known to the person skilled in the art during the synthesis of a nucleotide sequence, or can also be specifically covalently linked to the 5 'or 3' terminus of the nucleotide sequence (see examples).
  • the splicing product resulting from the splice reaction, the mature mRNA, can be detected according to the invention by means of the corresponding fluorophores, so that both partial steps (each exoni / intron / exon2 cut on the characteristic consensus sequences) of a splice reaction have been completed.
  • the probes therefore consist of two oligonucleotides which are complementary to the 3 'end of exon 1 or 5' end of exon 2 and in turn have a corresponding one at their 5 'or 3' end Wear fluorophore.
  • the splicing process that has taken place can be detected particularly easily by means of a signal produced by fluorescence resonance energy transfer (cf. FIG. 1a).
  • the probe consists of two oligonucleotides which are complementary to the 3 'end of exon 1 or 5' end of the intron, or complementary to the 3 'end of intron and 5' end of exon 2 and carry a fluorescent molecule at their 5 'or 3' end.
  • the splicing process can be detected particularly simply by the decrease in a signal resulting from fluorescence resonance energy transfer (cf. FIG. 1 b).
  • a probe consists of two oligonucleotides which are complementary to the 3 'end of exon 1 or 5 "end of exon 2 and carry a fluorescent molecule at their 5' or 3 'end
  • the arrangement of the oligonucleotides in FIG. 1a serves for the direct detection of a deleted intron sequence.
  • the arrangement of the oligonucleotides in FIG. 1b is preferably used to demonstrate whether the exoni could be separated from the intron sequence during the splicing process.
  • FIG. 1c The arrangement of the oligonucleotides in FIG. 1c is preferably used to demonstrate whether Exon2 could be successfully separated from the intron sequence.
  • a combination of Fig. 1 a and 1 b shows Fig. 1d and is therefore preferably used to detect the individual intermediate and end products during the
  • test system can therefore be used to determine in which reaction step the splicing process is interrupted.
  • the splicable nucleic acid contains at least two exons which are separated by at least one intron.
  • Exoni generally represents an exon 5 'from the intron and Exon2 generally represents a 3' exon.
  • the splicable nucleic acid is any nucleic acid that can be spliced, preferably an RNA, for example in the form of a so-called pre-mRNA or in the form of a DNA that contains RNA sections.
  • Intron means a non-coding sequence which is spliced due to the recognizing consensus sequences.
  • consensus sequences are in yeast: / GUAUGU in the 5 'splice, YAG / G in the 3' splice and UACUAAC in the branch point; in humans: AG / GURAGU in the
  • MINX miniature wild-type substrates
  • Zillmann, M., Zapp, ML, Berget, SM (1988), Mol. Cell. Biol., 8: 814-21.
  • additional probes can be inserted into the intron structure of the pre-mRNA.
  • Such constructs are therefore suitable for detection an inhibition of splicing in the first step, ie opening of the mRNA and
  • the connection between exoni and intron is opened in the first splicing step by the spliceosome at the 5 'splice point of the intron. Only in the second splicing step is there a covalent link between Exoni and Exon2. The exoni is therefore no longer connected to the mRNA during the first step of the splicing reaction and can therefore be removed from the splicing reaction.
  • a statement can therefore be made as to whether, for example, inhibition has taken place in the first splicing step.
  • both the first splicing step can be used how to track the second splicing step in a test system.
  • suitable nucleic acid constructs are disclosed in the form of their coding sequences in German patent application 199 09 156. A basic arrangement for execution is given in FIG. Depending on the signal sequence, the sequence of the splicing process can be concluded when using different wavelengths.
  • the invention therefore also relates to a method for examining the splicing process.
  • RNA, 2: 1079-93 For investigations in the yeast system, one can, for example, start from the pre-mRNA for U3 of the yeast (Mougin, A. et al., (1996), RNA, 2: 1079-93).
  • a composition containing the individual splice components preferably "small nuclear ribonucleoprotein particles (snRNP) components and non-snRNP components, is usually used.
  • the snRNP components contain U1, U2, U4, U5 and / or U6 proteins.
  • Cell extracts especially eukaryotic cell extracts used for the studies.
  • the cell extracts from animal cells, in particular mammalian cells, especially HeLa cells, in particular from
  • Nuclear extracts from HeLa cells or cell extracts from fungi in particular
  • Yeasts can be obtained by methods generally known to the person skilled in the art
  • the cell extracts generally contain all the important factors for performing splicing in vitro.
  • the present invention therefore also relates to a method for producing a test system in which at least one mobile splicable nucleic acid together with the associated probes containing corresponding fluorophores and at least one gel-free detection system and optionally at least one composition containing splice components and, if appropriate, further auxiliaries are put together.
  • Preferred embodiments of the individual components have already been described in more detail.
  • Another object of the present invention is therefore a method for finding an active substance, wherein a) one or more identical or different mobile nucleic acid / s with at least one splicable nucleic acid sequence together with associated probes with corresponding fluorophores in the presence of at least one substance to be investigated and at least a composition containing splice components and optionally in the presence of further auxiliaries under suitable conditions, and b) the splice product that may be formed is detected by means of a gel-free detection system.
  • the active substance can be a pharmaceutically active compound, a natural product in the broadest sense, a fungicide, a herbicide, a pesticide and / or an insecticide, preferably it is an antibiotic.
  • the substance to be examined is generally a naturally occurring, a naturally occurring and chemically modified and / or a synthetic substance.
  • so-called combinatorial substance libraries can be searched particularly easily and quickly with the methods according to the invention.
  • Another object of the present invention is therefore a method for diagnosing a disease, wherein a) one or more identical or different mobile nucleic acid (s), preferably with at least one splicable nucleic acid sequence together with probes with associated corresponding fluorophores in the presence of at least one substance to be examined and at least one a composition containing splice components and, if appropriate, further auxiliaries are incubated under suitable conditions, and b) that any splice product formed is detected by means of a gel-free detection system.
  • s mobile nucleic acid
  • the substance is very preferably a nucleic acid, preferably RNA.
  • the diseases to be diagnosed here are preferably hereditary diseases, cancerous diseases and / or viral diseases, in particular Grave's disease, spinal muscular atrophy, ⁇ '-thalassemia, cancerous diseases relating to the c-genetic oncogene, hepatitis-C infections and / or herpes simplex virus infections ,
  • the present invention can directly identify shortened alternative splice products of the mutated APC oncogene and thus represents an alternative to the previously practiced PTT (protein truncation test) (Bala, S., et al., (1996) Hum Genet 98 (5 ): 528 - 533).
  • composition containing splice components can be, for example, a treated or untreated tissue sample from the patient.
  • the RNA construct The mRNA to be spliced consists of at least two exons, which are separated by an intron. It can be both natural and of molecular biological origin.
  • cell cultures with Heia cells are used.
  • the cells are sedimented from the culture medium by centrifugation (1000 ⁇ g, 10 min.) And washed with phosphate buffer.
  • the cell sediment is then taken up in five times the volume of buffer A (10 mM HEPES, 1.5 mM MgCb, 10 mM KCI, 0.5 mM DTT, pH 7.9, 4 ° C.) Incubated for 10 minutes.
  • the cells are sedimented again and in duplicate
  • the cores are sedimented by centrifugation. Finally, the cores are again taken up in buffer A and centrifuged for 20 minutes at 25,000 xg.
  • the sediment is dissolved in 3 ml buffer B (20 mM HEPES, 25% (v / v) glycerol, 0.42 M NaCl, 1.5 mM MgCl 2 , 0.2 mM EDTA, 0.5 mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF), 0.5 mM DTT, pH 7.9) and digested again with the Dounce homogenizer.
  • the resulting suspension is incubated for 30 minutes on a magnetic stirrer and then centrifuged at 25,000 xg for 30 minutes.
  • Yeast cells from a protease-deficient strain (BJ926, EJ101 or similar strains) are sedimented in the logarithmic growth phase by centrifugation (1500 ⁇ g, 5 min., 4 ° C.). The cells are resuspended in two to four times the volume of ice-cold water and centrifuged again at 1,500 ⁇ g (5 min, 4 ° C.). The cells are then taken up in the simple volume of zymolyase buffer (50 mM Tris HCL, 10 mM MgCb, 1 M sorbitol, 30 mM DTT, pH 7.5) and incubated for 30 minutes at room temperature.
  • zymolyase buffer 50 mM Tris HCL, 10 mM MgCb, 1 M sorbitol, 30 mM DTT, pH 7.5
  • the cells are centrifuged off (1,500 ⁇ g, 5 min., 4 ° C.), taken up in three times the volume of zymolyase buffer with 2 mg (200 U) of zymolyase 100 T and incubated for 40 minutes at 30 ° C. on a shaker (50 RPM).
  • the spheroblasts formed are centrifuged off (1,500 xg, 5 min., 4 ° C.) and washed once in 2 ml of ice-cold zymolyase buffer.
  • the sediment is washed with two volumes of lysis buffer (50 mM Tris HCl, 10 mM MgSO, 1 mM EDTA, 10 mM potassium acetate, 1 mM DTT, protease inhibitors, 1 mM PMSF, pH 7.5) and finally taken up in one volume of lysis buffer , The Spherical blasts are then in a dounce homogenizer by 5- to
  • the assay is evaluated in a suitable evaluation device (fluorescence spectrometer, Perkin Elmer, Ueberlingen, Germany; Fluoreszezreader, Fluostar Galaxy, BMG, Offenburg, Germany; Light Cycler, Röche, Mannheim, Germany).
  • a suitable evaluation device fluorescence spectrometer, Perkin Elmer, Ueberlingen, Germany; Fluoreszezreader, Fluostar Galaxy, BMG, Offenburg, Germany; Light Cycler, Röche, Mannheim, Germany).
  • the construct described in FIG. 2 was provided with a T7 promoter and amplified via a standard PCR reaction. It was then transcribed into the corresponding mRNA using in vitro transcription. The corresponding construct without intron was also used in the experiments as a positive control and for later comparison.
  • NTPs ATP, GTP, CTP and UTP with 5 mM
  • MINX template DNA 1 mg / ml
  • T7 polymerase 10 U / ⁇ l
  • the transcription batch was incubated at 37 ° C. for 2 h and then cleaned using a preparative urea gel using standard methods.
  • the gel was placed on a thin-layer chromatography plate carrying a 0.25 mm thick layer of Kieselgel-60 with fluorescent indicator UV254 (Macherny-Nagel), and from above by a UV lamp with a wavelength of Irradiated 254 nm.
  • the RNA band absorbs the wavelength necessary to excite the fluorescence indicator and thus causes an unexcited area on the thin-layer chromatography plate, which becomes visible as a shadow.
  • the RNA was cut out with a scalpel.
  • the gel fragment was cut and the RNA extracted from the gel overnight at 4 ° C. with elution buffer (500 mM Na acetate pH 5, 1 mM EDTA pH 8, 2.5% phenol / chloroform). Then that was
  • pre-mRNA was used which did not contain the intron.
  • reaction mixture including the probes above, was pipetted and the increase or decrease in the signal was monitored by means of a fluorescence reader over a period of 40 minutes.
  • a large number of small samples can be detected, for example to diagnose the shortened splice products of the APC oncogene, in the Light Cycler System (Röche, Switzerland) or in a fluorescence reader (Fluostar Galaxy, BMG, Offenburg, Germany).
  • the oligonucleotides used can be prepared by standard solid-phase DNA synthesis using a 392 RNA / DNA synthesizer (Applied Biosystems, 1992: Evaluating and Isolating Synthetic Oligonucleotides). The syntheses are carried out on a scale of 0.2 or 1 ⁇ mol according to the standard cycles recommended by Applied Biosystems while maintaining the 5'-terminal dimethoxytrityl group ("trityl-on"). A carrier loaded with a fluorophore (CPG support - controlled pore glass carrier) is used to synthesize a 3'-labeled probe.
  • CPG support - controlled pore glass carrier is used to synthesize a 3'-labeled probe.
  • fluorophore fluorescein-CPG, TAMRA-CPG, Glen Research; Sterling, Virginia
  • fluorescein-CPG fluorescein-CPG
  • TAMRA-CPG Glen Research; Sterling, Virginia
  • oligonucleotides are split off from the solid phase with aqueous
  • the subsequent removal of the protective groups is carried out by further addition of aqueous ammonia solution (33%) and subsequent incubation at 55 ° C. for 6 h.
  • the efficiency of the individual coupling steps is determined by UVA IS spectrometry by measuring the absorption of the trityl groups split off during the synthesis at 495 nm.
  • the deprotected oligonucleotide solutions are frozen with liquid nitrogen and lyophyllized, in order to avoid detritylation at the terminal 5 'position, a pH check is carried out at intervals of 20 minutes and triethlyamine (1 ⁇ l) is added if necessary.
  • the lyophilisate is then taken up in 400 ⁇ l of 100 mM triethylammonium acetate, pH 7.0, and the oligonucleotides are purified by means of reversed pased HPLC on a Hypersil reversed phase C-18 column at a flow rate of 1 ml / min.
  • Elution is carried out using the following gradients: 11-26% 70% acetonitrile / 30% 100 mM triethylammonium acetate, pH 7.0 (0-20 min), 26-44% 70% acetonitrile / 30% 100 mM triethylammonium acetate, pH 7, 0, (20-30 min), 44-100% 70% acetonitrile / 30% 100 mM triethylammonium acetate, pH 7.0 (30-33 min).
  • the product fractions are combined, lyophilized and traces of triethylammonium acetate are removed by repeated absorption in water (1 ml each) and subsequent lyophilization.
  • the 5'-terminal trityl group is split off (“detrilization”) using aqueous acetic acid (80%, 10 ⁇ l / nmol
  • Oligonucleotide for 20 min at RT.
  • the detritylated oligonucleotides are after adding aqueous sodium acetate solution (3M, pH 5.2 1, 5 ul / nmol oligonucleotide) and isoproanol (34 ul / nmol oligonucleotide) at -80 ° C for 10 min like.
  • the oligonucleotides are centrifuged at 4 ° C. (17,000 g), the
  • Oligonucleotides are centrifuged again at 4 ° C. (17,000 ⁇ g), the supernatant is discarded and the precipitate obtained is dried at RT in a high vacuum. The resulting lyophilisate was taken up in water (500 ⁇ l) and the pH was adjusted to pH 7.0 with aqueous sodium hydroxide solution.
  • the purity of the detrinylated oligonucleotides obtained is determined by reversed phase HPLC using an ODS Hypersil reversed phase C-18 column oil. The following gradient is used for elution: 5-25% 70% acetonitrile / 30% 100 mM triethylammonium acetate, pH 7.0 (0-20 min), 25-45% 70% acetonitrile / 30% 100 mM triethylammonium acetate, pH 7.0 (20-25 min), 45-100% 70% acetonitrile / 30% 100 mM triethylammonium acetate, pH 7.0 (25-28 min).
  • the oligonucleotides are applied to a gel filtration column (NAP-5) pre-equilibrated with water and eluted with 1.5 ml of water.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein homogenes Testsystem enthaltend (a) mindestens eine oder mehrere, gleiche oder verschiedene mobile Nukleinsäuren mit mindestens einer spleissfähigen Nukleinsäure, enthaltend mindestens ein Intron, (b) mindestens zwei Sonden, enthaltend korrespondierende Fluorophore, welche vorzugsweise an den 5' und/oder 3' Enden eines Exon/Intron binden, (c) mindestens ein gelfreies Nachweissystem zum Nachweis einer Spleissreaktion, gegebenenfalls (d) mindestens eine Zusammensetzung enthaltend Spleisskomponenten, (e) weitere Hilfsmittel.

Description

Testsystem zum Nachweis einer Spleißreaktion, sowie dessen Verwendung
Beschreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein homogenes Testsystem enthaltend
(a) mindestens eine oder mehrere, gleiche oder verschiedene mobile Nukleinsäuren mit mindestens einer spleißfähigen Nukleinsäure, enthaltend mindestens ein Intron (b) mindestens zwei Sonden, enthaltend korrespondierende Fluorophore, welche vorzugsweise an den 5' und / oder 3' Enden eines Exon / Intron binden
(c) mindestens ein gelfreies Nachweissystem zum Nachweis einer Spleißreaktion, gegebenenfalls
(d) mindestens eine Zusammensetzung enthaltend Spleißkomponenten, (e) weitere Hilfsmittel
Die meisten für Proteine kodierenden Gene in Eukaryonten werden in ihrer Form im Genom durch eine oder mehrere nicht für das Protein kodierende Sequenzen (Introns) unterbrochen. Bei der Transkription der genomischen DNA in die Boten- RNA (messenger RNA = mRNA) werden diese nicht-codierenden Bereiche (Introns) in das primäre Transkript übernommen. Um eine korrekte Form der mRNA zu generieren, muß diese Vorläufer-mRNA (Prä-mRNA) prozessiert werden.
Die Prozessierung der Prä-mRNA geschieht durch Entfernen der Introns und Fusion der kodierenden Bereiche (Exons). Erst dann kann ein ununterbrochen zu lesender
Nukleotidstrang für die Translation im Zytoplasma zur Verfügung gestellt werden. Die Bildung von mRNA in Eukaryonten erfordert daher einen sogenannten Spleißprozess, in dem die nicht kodierenden Genbereiche (Introns) aus dem primären Gentranskript entfernt werden.
Das Spleißen findet im Kern statt, bevor die mRNA aus dem Kern transportiert wird. Es wird im allgemeinen in einem Zwei-Stufen-Mechanismus durchgeführt, in dem jeweils ein Transesterifizierungsschritt beteiligt ist (Moore, Ü.M. et al., (1993) Splicing of precursors to messenger RNAs by the Spliceosome. In The RNA world, Edited by Gesteland R.F., Gesteland, J.F., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 303-358).
Der erste Schritt generiert ein freies 5'-Exon und eine sogenannte Lariat-Struktur des Introns, welches immer noch mit dem 3'-Exon verbunden ist. Die Lariat-Struktur enthält eine verzweigte RNA, die durch eine Veresterung des 5'-Endes des Introns mit einer 2'-Hydroxyl-Gruppe einer Ribose in einem Adenosin, das ca. 20 - 40
Nukleotide stromaufwärts des 3 '-Endes des Introns gelegen ist, der sogenannten Branch-site, entsteht. Der zweite katalytische Schritt führt zu einer Ligation der Exons und der Freisetzung des Introns. Obwohl keine Nukleotide während dieser Reaktionen eingebaut werden, ist eine Energiequelle, beispielsweise AT P, für diese Katalyse notwendig (Guthrie, C. (1991 ) Science, 253, 157).
An dem Vorgang des mRNA-Spleißens sind mehrere Faktoren beteiligt. Zwei Klassen von Spleiß-Faktoren werden zur Zeit unterschieden. Die erste Klasse besteht aus vier in der Evolution stark konservierten Protein-RNA-Partikeln (small nuclear ribonucleoprotein particies = snRNPs): U1 , U2, U4/U6 und U5, die entweder eine (U1 , U2, U5) oder zwei (U4/U6) snRNA Komponenten enthalten (Moore, J.M. et al., (1993) supra; Guthrie, (1991 ) supra; Green, M.R. (1991 ). Annu. Rev. Cell Biol., 7, 559). Die zweite Klasse besteht aus bisher wenig charakterisierten Proteinen, die nicht fest an die snRNPs gebunden sind und daher nicht-snRNP Spleiß-Faktoren genannt werden (Lamm, G.M. & Lamond, A.J. (1993) Biochm. Biophys. Acta, 1173,
247; Beggs, J.D. (1995), Yeast splicing factors and genetic strategies for their analysis, In: Lamond, A.l. (ed) Pre- mRNA Processing Landes, R.G. Company, Texas, pp. 79-95. Krämer, A. (1995), The biochemistry of pre-mRNA splicing. In: Lamond, A.l. (ed), Pre-mRNA Processing. Landes, R.G. Company, Texas, pp. 35- 64).
Die Zusammensetzung der snRNPs ist am besten in HeLa-Zellen untersucht (Will, C.L. et al., (1995) Nuclear pre-mRNA splicing. In: Eckstein, F. and Lilley, D.M.J. (eds). Nucleic Acids and Molecular Biology. Springer Verlag, Berlin, pp. 342-372). Bei relativ geringen Salzkonzentrationen, bei denen Kern -Extrakte aus HeLa-Zellen das Spleißen von Prä-mRNA in vitro bewirken können, liegen die snRNPs in einem 12S U1 snRNP, einem 17S U2 snRNP und einem 25S [U4/U6.U5] tri-snRNP Komplex vor. Bei höheren Salzkonzentrationen (ca. 350-450 mM) dissoziiert der tri- snRNP-Komplex in einen 20S U5- und einen 12S U4/U6-Partikel. Die U4 und U6 RNAs liegen im U4/U6 snRNP über zwei intermolekulare Helices basengepaart vor
(Bringmann, P. et al. (1984) EMBO J., 3, 1357; Hashimoto, C. & Steitz, J.A. (1984)
Nucleic Acids Res., 12, 3283; Rinke, J. et al., (1985) J. Mol. Biol., 185, 721 ; Brow,
D.A. & Guthrie, C. (1988) Nature, 334, 213).
Die snRNPs bestehen aus zwei Gruppen von Proteinen. In allen snRNPs ist die
Gruppe der allgemeinen Proteine (B/B', D1 , D2, D3, E, F und G) enthalten.
Zusätzlich enthält jeder snRNP spezifische Proteine, die nur in diesem enthalten sind. So enthält nach dem bisherigen Stand der Forschung der U1 snRNP drei zusätzliche Proteine (70K, A und C) und der U2 snRNP elf weitere Proteine. Der 20S
U5 snRNP trägt nach bisherigem Kenntnisstand neun weitere Proteine mit einem Molekulargewicht von 15, 40, 52, 100, 102, 110, 116, 200 und 220 kDa, während der 12S U4/U6 snRNP zwei zusätzliche Proteine mit einem Molekulargewicht von ca. 60 und 90 kDa enthält. Der 25S tri-snRNP [U4/U6.U5] enthält fünf zusätzliche Proteine mit einem Molekulargewicht von ca. 15.5, 20, 27, 61 und 63 kDa. (Behrens, S.E. &
Lührmann, R. (1991 ) Genes Dev., 5, 1439; Utans, U. et al., (1992) Genes Dev., 6, 631 ; Lauber, J. et al., (1996) EMBO J., 15, 4001 ; Will, C.L et al. (1995), supra, Will, C.L. & Lührmann, R. (1997) Curr. Opin. Cell Biol., 9, 320-328).
Die Zusammensetzung der Spleiß-Komponenten bei Saccharomyces cerevisiae sind noch nicht im Detail untersucht. Biochemische und genetische Untersuchungen deuten jedoch darauf hin, daß die Sequenzen sowohl der snRNAs als auch der snRNP-Proteine in der Evolution hoch konserviert sind (Fabrizio, P. et al., (1994) Science, 264, 261 ; Lauber, J. et al., (1996), supra, Neubauer, G. et al., (1997) Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 94, 385; Krämer, A. (1995), supra; Beggs, J.D. (1995); supra,
Gottschalk, A. et al. (1998) RNA, 4, 374-393).
Um einen funktioneilen Spleiß-Komplex (Spliceosom) zu bilden, werden die einzelnen Komponenten (prä-mRNA, snRNPs und nicht-snRNP-Proteine) in einem stufenweisen Prozeß zusammengeführt. Dies wird nicht nur durch Interaktionen der prä-mRNA mit den Protein-haitigen Komponenten, sondern auch durch zahlreiche Wechselwirkungen zwischen den Protein -haltigen Komponenten selbst erreicht (Moore, J.M. (1993) supra; Madhani, H.D. & Guthrie, C. (1994) Annu. Rev. Genetics, 28, 1 ; Nilsen, T.W. (1994) Cell, 65, 11 5). Die Prä-mRNA trägt in ihrer Sequenz spezifische Erkennungssequenzen für die unterschiedlichen Spleißkomponenten.
Zunächst bindet das U1 snRNP über diese Erkennungssequenzen an die 5'-Spleiß-
Region des Introns der prä-mRNA. Gleichzeitig lagern sich eine noch nicht genau bestimmte Anzahl verschiedener weiterer Faktoren (z.B. SF2/ASF, U2AF, SC35, SF1 ) an diesen Komplex an und kooperieren mit den snRNAs in der weiteren
Formierung des Prä-Spliceosoms. Das U2 snRNP-Partikel interagiert mit der sogenannten Branch-Site im Intron-Bereich (Krämer, A. & Utans, U. (1991 ) EMBO J., 10, 1503; Fu, X.D. & Maniatis, T. (1992) Proc. Natl. Acad. Sei USA, 89, 1725; Krämer, A. (1992) Mol. Cell Biol., 12, 4545; Zamore, P.D. et al. (1992) Nature, 355, 609; Eperon, J.C. et al. (1993) EMBO J., 12, 3607; Zuo, P. (1994) Proc. Natl. Acad.
Sei. USA, 91 , 3363; Hodges, P.E. & Beggs, J.D. (1994) Curr. Biol. 4, 264; Reed, R. (1996) Curr. Op. Gen. Dev., 6, 215). In einem letzten Schritt der Bildung des Spliceosoms interagiert der [U4/U6.U5] tπ-snRNP und eine Anzahl bisher nicht genauer charakterisierter Proteine mit dem Prä-Spliceosom, um das reife Spliceosom zu bilden (Moore, J.M. et al., (1993) supra).
Für den Vorgang des Spleißens werden verschiedene Wechselwirkungen zwischen Prä-mRNA, snRNAs und sn-RNP gelöst und neue gebildet. So ist bekannt, daß vor oder während des ersten katalytischen Schritts der Spleißreaktion in den interagierenden Strukturen von U4 und U6 zwei Helices voneinander getrennt und durch neue Interaktionen Basenpaarungen zwischen U2- und U6-RNAs gebildet werden (Datta, B. & Weiner, A.M. (1991 ) Nature, 352, 821 ; Wu, J.A. & Manley, J.L. (1991 ) Nature, 352, 818; Madhani, H.D. & Guthrie, C. (1992) Cell, 71 , 803; Sun, J.S. & Manley, J.L. (1995) Genes Dev., 9, 843; . Gleichzeitig wird die Bindung von U1 an die 5'Spleißstelle gelöst und die prä mRNA bindet sich an die Erkennungssequenz
ACAGAG der U6 snRNA (Fabrizio, P. & Abelson, J. (1990) Science, 250, 404; Sawa, H. & Abelson, J. (1992) Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 89, 11269; Kandels- Lewis, S. & Seraphin, B. (1993) Science, 262, 2035; Lesser, C.F. & Guthrie, C. (1993) Science, 262, 1982; Sontheimer, E.J. & Steitz, J.A. (1993) Science, 262, 1989; . Das U5 snRNP interagiert über seinen konservierten Loop 1 mit Exon-
Sequenzen, die nahe an den 5'- und 3'-Spleißstellen gelegen sind. Dieser Vorgang scheint sequenziell abzulaufen, während der gesamte Spleiß-Prozess von Stufe 1 zu Stufe 2 fortschreitet (M. McKeown, (1992) Annu. Rev. Cell Dev. Biol., 8: 133- 155Newman, A. & Norman, C. (1991 ) Cell, 65, 115; Wyatt, J.R. et al., (1992) Genes Dev., 6, 2542, Codes, J J et al (1993) EMBO J , 12, 5181 , Sontheimer, E J &
Steits, (1993) supra) Nach der Beendigung der Spleiß-Reaktion wird die reife mRNA freigesetzt und das Spliceosom dissoziiert (Moore, J M et al , (1993) supra)
Durch alternatives Spleißen können aus ein und demselben Pπmartranskπpt verschiedene reife mRNAs gebildet werden, die für verschiedene Proteine kodieren Dieses alternative Spleißen ist in vielen Fallen regulie rt So kann dieser Mechanismus z B dazu genutzt werden, von einem nicht funktionellen zu einem funktionellen Protein umzuschalten (z B Transposase bei Drosophila) Weiterhin ist bekannt, daß alternatives Spleißen gewebespezifisch durchgeführt wird So wird z B die Tyrosin-Kinase, die vom src-Proto-Oncogen codiert wird, in Nervenzellen durch alternatives Spleißen in einer speziellen Form synthetisiert
Fehlerhaft reguliertes oder ausgeführtes alternatives Spleißen kann zu verschiedenen Krankheitsbildern fuhren Bei Patienten, die an der Grave's Krankheit leiden, ist gezeigt worden, daß durch fehlerhaftes Spleißen ein entscheidendes Enzym (Thyroperoxidase) in einer inaktiven Form entsteht (Zanelli, E (1990) Biochem Biophys Res Comm , 170, 725) Untersuchungen für die Krankheit Spinale Muskelatrophy weisen darauf hin, daß ein defektes Genprodukt des Gens SMN (Survival of motor neurons) zu einer erheblichen Störung der Bildung der snRNPs fuhrt Durch die Inhibierung des Spleißapparates der Muskelneuronen, kommt es zu einer Paralyse der Nervenzellen und zu einem Abbau des Muskelgewebes (Fischer, U et al , (1997), Cell, 90 1023-9, Liu, Q et al (1997), Cell, 90 1013-21 , Lefebvre, S et al, (1997) Nat Genet , 16, 265) Bei der Metastasierung von Krebszellen scheinen unter anderem bestimmte alternative
Spleißvarianten von dem membranstandigen Molekül CD44 eine entscheidende Rolle zu spielen Das CD44-Gen enthalt mehrere Exons, von denen 10 nebeneinanderhegende Exons in unterschiedlicher Anordnung bei der mRNA- Geneπerung aus der pra-mRNA gespleißt werden Bei Ratten Karzinomazellen wurde nachgewiesen, daß metastasierende Varianten die Exons 4 bis 7 oder 6 bis 7 tragen Mit Hilfe von Antikörpern gegen den von Exon 6 kodierten Teil des Proteins konnte die Metastasierung wirksam unterdruckt werden (Sherman, L , et al , (1996) Curr Top Microbiol Immunol 213 249-269) Spleißmutanten des APC- (Adenomatose Pohposis Colι)-Onkogen, die aus Patienten Familiärer Adomatoser Poliposis (FAP) isoliert wurden, bringen verkürzte Proteine als Folge von fehlerhaftem alternativem Spleißen, wobei Exon 9, 10A und 14 herausgeschnitten werden, hervor (Bala, S., et al., (1996) Hum Genet 98(5): 528 - 533).
Fehlerhaftes Spleißen kann zu stark ausgeprägten Phänotypen des betroffenen
Organismus führen. So ist bekannt, daß eine Punktmutation in einem Intron des ß- Globin zu einer ß+-Thalassaemie führen kann. Durch den Basenaustausch entsteht ein falscher Spleißort, der zu einem veränderten Leseraster und zu einer vorzeitigen Termination der Peptidkette führt (Weatherall, D . & Clegg, J.B. (1982) Cell, 29, 7; Fukumaki, Y. et al. (1982) Cell, 28, 585). Bei Arabidopsis thaliana Mutanten führt z.
B. eine Punktmutation an der 5' Spleißstelle des Phytochrom B Gens zu einer fehlerhaften Expression des Gens. Durch diese Veränderung kann ein Intron nicht entfernt werden, welches ein Stopcodon in seiner Sequenz enthält. Die Entwicklung der Pflanzen ist gestört, da das Gen an der Phytomorphogenese beteiligt ist (Bradley, J.M. et al. (1995) Plant Mol. Biol, 27, 1133).
Bisher sind nur wenige Arbeiten bekannt geworden, in denen eine Beeinflussung von Spleißvorgängen in der Zelle beschrieben worden sind. So kann mit Hilfe von Antiseren oder monoklonalen Antikörpern gegen Komponenten des Spleißapparates die Generierung von reifer mRNA verhindert werden (Padgett, R.A. et al. (1983) Cell,
35, 10; Gattoni, R. et al. (1996) Nucleic Acid Res., 24, 2535).
Das NS1 -Protein, das durch das Genom des Influenza Virus codiert wird, kann ebenfalls durch Bindung an die U6 snRNA in das Spleißen eingreifen. Das Protein bindet an die Nukleotide 27-46 und 83-101 der humanen U6 snRNA und verhindert so, daß U6 während des Ablaufs des Spleißvorganges mit den Partnern U2 und U4 interagieren kann (Fortes, P. et al. (1994) EMBO J., 13, 704; Qiu, Y. & Krug, R.M. (1995) J. Virol., 68, 2425. Darüberhinaus scheint das NS1 Protein auch über Bindung an den poly-A-Schwanz der gebildeten mRNA einen Export aus dem Kern zu verhindern (Fortes, P. et al. (1994), supra; Qiu, Y. & Krug, R. M. (1994), supra).
Ähnliche Wirkungen werden von einem Genprodukt des Herpes Simplex Virus Typ 1 Genoms beschrieben. Das Protein ICP27 konnte in in vitro Experimenten das Spleißen von einer Modell-RNA (ß-Globin-Prä-mRNA) wirkungsvoll verhindern
(Hardy, W.R. & Sandri-Goldin, R.M. (1994) J. Virol., 68, 7790). Außerdem scheinen
Peptide, die aus der C-terminalen Domäne der großen Untereinheit der RNA
Polymerase II generiert wurden, ebenfalls in die Spleiß -Vorgänge eingreifen zu können (Yurvey, A. et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sei USA, 93, 6975; WO97/20031 ).
Der Einbau von künstlichen Nukleotidanaloga (5 -Fluor-, 5-Chlor- oder 5-Bromuridin) in die zu spleißende mRNA kann ebenfalls zu einer Inhibierung des Spleißvorganges in vitro führen (Sierakowska, H. et al. (1989) J. Biol. Chem., 264, 19185; Wu, X.P. &
Dolnick, B. (1993) Mol. Pharmaco!., 44, 22).
Eine Anzahl von weiteren Untersuchungen betrifft die Wrkung von Anti -Sense- Oligonukleotiden auf das Spleißen. So scheint das Verhältnis von zwei unterschiedlichen Spleißprodukten der c-erb-Onkogen-mRNA (c-erbA-alpha 1 und 2) der Ratte durch eine weitere mRNA, rev-ErbA-alpha, reguliert zu werden. Rev-ErbA- alpha ist eine natürlich vorkommende anti-Sense-RNA, die mit der c-erbA-alpha 2 mRNA aber nicht mit der c-erbA-alpha 1 mRNA paart. Das Spleißen der c-erbA- alpha prä-mRNA zur c-erbA-alpha 2 mRNA konnte durch einen Überschuß an rev- ErbA-alpha mRNA-Konstrukten, die komplementär zur 3'-Spleißstelle waren, wirkungsvoll inhibiert werden (Munroe, S.H. & Lazar, M.A., (1991 ) J. Biol. Chem., 266(33), 22083). Weiterhin konnte gezeigt werden, daß durch Generierung von anti- sense-RNA, die an die Intron-Sequenzen der zu spleißenden mRNA binden, ebenfalls Spleißen inhibiert werden kann (Volloch, V.et al. (1991 ) Biochem. Biophys. Res. Comm., 179, 1600). Hodges und Crooke konnten zeigen, daß bei schwach erkannten Spleißstellen die Bindung von Oligonukleotiden ausreicht, um erfolgreich das Spleißen zu unterbinden. Werden dagegen bevorzugt erkannte Spleißstellen in die Konstrukte eingebaut, werden Oligonukleotide benötigt, die zusätzliche eine Aktivierung der RNase H bedingen können (Hodges, D. & Crooke ST. (1995) Mol. Pharmacol., 48, 905). Eine genauere Analyse der für das Spleißen benötigten Sequenzen der prä-mRNA zeigte, daß 19 Nukleotide stromaufwärts vom Branch- Point Adenosin und 25 Nukleotide um die 3'- und 5'-Spleiß-Stelle geeignete
Sequenzen zur Generierung von Antisense RNAs sind (Dominski, Z. & Kole, R. (1994) Mol. Cell Biol., 14, 7445). Insbesondere für die Hemmung von Viren wurden Untersuchungen mit Antisense Molekülen gemacht. Viren, die höhere Organismen befallen, tragen oft Intron-enthaltende Gene in ihrem Genom. So konnte gezeigt werden, das Antisense Oligonukleotide gegen die 3' -Spleißstelle des immediate early Prä-mRNA 4/5 Gens des Herpes Simplex Virus in Vero-Zellen die Replikation des Virus hemmen konnte (Iwatani, W. et al. (1996) Drug Delivery Syst., 11 , 427).
Zur Untersuchung des Spleiß-Mechanismus wird im allgemeinen zunächst eine prä- mRNA durch in vitro Transkription hergestellt. Hierzu werden genetische Konstrukte aus Viren, z. B. Adenoviren, oder zellulärer Strukturgene verwendet. Derartige prä- mRNAs enthalten alle wichtigen Strukturelemente, die für die Erkennung der prä- mRNA durch das Spliceosom und den Ablauf des Spleißens notwendig sind. Im allgemeinen wird die Prä-mRNA radioaktiv markiert, damit man nach der Auftrennung in einem denaturierenden Hamstoff-Polyacrylamidgel aufgrund der charakteristischen Bandenmuster beurteilen kann, ob eine Spleißreaktion stattgefunden hat, bzw. bei welchem Reaktionsschritt eine Störung stattgefunden hat. Derartige Testsysteme sind jedoch sehr zeit- und arbeitsaufwendig und daher nicht für das systematische Auffinden von Substanzen, die das Spleißen modulieren können, geeignet.
In der älteren deutschen Patenanmeldung der Anmelderin 199 09 156 wird ein in- vitro Spleißassay offenbart, welches auf einfache und effektive Art und Weise eine große Anzahl von Verbindungen aus chemischen oder natürlichen Substanzbibliotheken auf ihre Wi rkung beim Spleißen von Nukleinsäuren untersuchen kann (sog. High Throughput Screening). Hierbei müssen jedoch die spleißfähigen Nukleinsäuren immobilisiert werden. Es liegt daher ein heterogenes System vor, welches diverse Waschschritte erfordert.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es daher, ein homogenes Testsystem zu finden, mit dem auf einfache und effektive Art und Weise eine große Anzahl von Verbindungen aus chemischen oder natürlichen Substanzbibliotheken auf ihre Wrkung beim Spleißen von Nukle insäuren untersucht werden können (sog. High
Throughput Screening). Es wurde nun überraschenderweise gefunden, daß ein homogenes Testsystem mit einem gelfreien Nachweissystem mit spezifischen Sonden, in dem alle
Komponenten sich mobil in einer löslichen Phase befinden, zum Nachweis einer
Spleißreaktion geeignet ist, die oben beschriebenen Nachteile der gängigen
Testsysteme zu überwinden und somit für das homogene High Throughput
Screening beispielsweise in einer Roboteranlage geeignet ist.
Die Aufgabe wird durch die spezifsche Wahl der Sonden gelöst.
Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein homogenes Testsystem enthaltend
(a) mindestens eine oder mehrere, gleiche oder verschiedene mobile Nukleinsäuren mit mindestens einer spleißfähigen Nukleinsäure, enthaltend mindestens ein Intron (b) mindestens zwei Sonden, enthaltend korrespondierende Fluorophore, welche vorzugsweise an den 5' und / oder 3' Enden eines Exon / Intron binden
(c) mindestens ein gelfreies Nachweissystem zum Nachweis einer Spleißreaktion, gegebenenfalls
(d) mindestens eine Zusammensetzung enthaltend Spleißkomponenten, (e) weitere Hilfsmittel
Für ein homogenes Testsystem sind daher geeignete Sonden zu generieren, die den Nachweis des erfolgten Spleißens bzw. des nicht erfolgten Spleißens ermöglichen. Die Sonden gemäß (b) können vorzugsweise mittels Hybridisierung an die zu untersuchende Nukleinsäure binden.
Die hierzu notwendigen, zu Teilsequenzen der spleißfähigen Nukleinsäure komplementären Nukleinsäuren solcher Sonden sind zu mindestens einer Teilsequenz eines Introns und einer Teilsequenz eines Exons oder mindestens zu zwei Teilsequenzen zweier Exons komplementär. Die prinzipielle Anordnung ist in Figur 1a)-d) gezeigt.
Vorzugsweise befinden sich die komplementären Sonden an den Enden des Introns oder Exons und erzeugen aufgrund korrespondierender Flurophore in der ungespleißten spleißfähigen Nukleinsäure oder im Spleißprodukt ein detektierbares Signal, durch welche der Reife-Zustand der RNA (pre-mRNA oder mRNA) charakterisiert und untersucht werden kann.
Unter der Bezeichnung Fluorophor sind dem Fachmann Moleküle bekannt, deren physikalisches Verhalten sich dadurch auszeichnet, daß sie durch eine distinkte Wellenlänge angeregt, d.h. auf ein höheres Energieniveau gehoben werden und diese zusätzliche Energie in Form von Licht einer längeren Weilenlänge abgeben, wenn sie auf ihr ursprüngliches Energieniveau zurückfallen.
Unter korrespondierenden Fluorophoren im Sinne der Erfindung wird ein Paar fluoreszierender Moleküle verstanden, deren Eigenschaften darin bestehen, daß die Wellenlänge des abgestrahlten Lichts (Emission) des Fluorophors niedrigerer Wellenlänge (Donor) im Bereich der Anregungswellenlänge des zweiten Fluorophors (Akzeptor) liegt. Natürliche Fluorophorenpaare sind zum Beispiel Phenylalanin/Tyrosin und Tyrosin/Tryptophan in Proteinen. Erfindungsgemäß bevorzugt werden korrespondierende Fluorophore auf der Basis Fluoreszein/Rhodamin, und deren Derivate wie Carboxyfluoreszein-
Succinimidylester/Texas-Red-Sulfonylchlorid, FITC/TMR (Fluoreszein-5-
IsothiocyanateETetramethylrhodamin, sowie Naphtalene/Dansyl, Dansyl/DDPM (N-
[4-(dimethylamino)-3,5-dinitrophenyl]maleimide), IAΕDANS/DiO-C14 (5-(2- ((iodoacethyl)amino)ethyl)amino)-naphthalen-1-sulfoniacid/3,3- ditetradodecyloxacarbocyanin), ANAI/IPM (2-anthracen-N-acethlyimidazole/3(4- isothiocyanatophenyl)7-diethyl-4-amino-4-methylcoumarin, BPE/CY5 (B-
Phycoerythrin/Carboxymethyl indocyanin-N-Hydoxysuccimidylester) und andere, die alle kommerziell erhältlich sind. Ganz besonders bevorzugt sind jedoch korrespondierende Fluorophore auf der Basis von Lanthanid-Chelaten, ebenfalls korrespondierend zu Fluorescein, die in den Patentanmeldungen WO 97/29373 und 98/15380 offenbart sind und käuflich erhältlich sind (Wallac, Turku, Finland).
Die fluoreszierenden Moleküle können mit dem Fachmann bekannten Methoden während der Synthese einer Nukleotidsequenz mit den Nukleotiden verknüpft, oder auch spezifisch mit dem 5' oder 3'-Terminus der Nukleotidsequenz kovalent verbunden werden (siehe Beispiele).
Zudem sind solche korrespondierende Fluorophore bevorzugt, die dem vorteilhaften zeitaufgelösten Fluoresenz-Resonanz-Energie Transfer zugänglich sind.
Das durch die Spleißreaktion entstehende Spleißprodukt, die reife mRNA, kann erfindungsgemäß mittels der korrespondierenden Fluorophore nachgewiesen werden, demzufolge sind beide Teilschritte (jeweils Exoni / Intron / Exon2 Schnitt an den charakteristischen Consensus-Sequenzen) einer Spleißreaktion vollständig abgelaufen.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform bestehen daher die Sonden aus zwei Oligonukleotiden, die komplementär zum 3'-Ende des Exons 1 bzw. 5' Ende des Exons 2 sind und wiederum an ihrem 5'- bzw. 3' Ende ein korrespondierendes Fluorophor tragen. Derart kann der erfolgte Spleißvorgang besonders einfach über ein durch Fluoreszenz Resonanzenergietransfer entstehendes Signal nachgewiesen werden (vgl. Fig. 1a).
In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform besteht die Sonde aus zwei Oligonukleotiden, die komplememtär zum 3'-Ende des Exons 1 bzw. 5' Ende des Introns sind, bzw. komplementär zum 3' Ende des Introns und 5' -Ende des Exons 2 sind und an ihrem 5'- bzw. 3' Ende ein fluoreszierendes Molekül tragen. So kann der Spleißvorgang besonders einfach über die Abnahme eines durch Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer entstehenden Signals nachgewiesen werden (Vgl. Fig. 1 b).
In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform besteht eine Sonde aus zwei Oligonukleotiden, die komplementär zum 3'-Ende des Exons 1 bzw. 5" Ende des Exons 2 sind und an ihrem 5'- bzw. 3' Ende ein fluoreszierendes Molekül tragen. Anhand der entstehenden Fluoreszenz kann hierdurch der erfolgte Spleißvorgang nachgewiesen werden. Ein drittes Oligonukleotid, komplementär zum 3'-Ende des Introns zeigt durch ein entsprechendes Signal die Inhibition der Spleißreaktion an. (Vgl. Fig. 1c)
Die Anordnung der Oligonukleotide in Fig. 1a dient zum direkten Nachweis einer deletierten Intronsequenz.
Die Anordnung der Oligonukleotide in Fig. 1b dient vorzugsweise zum Nachweis, ob das Exoni von der Intronsequenz während des Spleißvorganges abgetrennt werden konnte.
Die Anordnung der Oligonukleotide in Fig. 1c dient vorzugsweise zum Nachweis, ob das Exon2 erfolgreich von der Intronsequenz abgetrennt werden konnte. Eine Kombination aus Fig. 1 a und 1 b zeigt Fig. 1d und dient daher vorzugsweise zum Nachweis der einzelnen Zwischen- und Endprodukte während des
Spleißvorganges.
Daher kann das erfindungsgemäße Testsystem herangezogen werden, um zu bestimmen, in welchem Reaktionsschritt der Spleißvorgang unterbrochen wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform enthält die spleißfähige Nukleinsäure mindestens zwei Exons, die durch mindestens ein Intron getrennt sind.
Exoni steht im allgemeinen für ein 5' vom Intron gelegenes Exon und Exon2 steht im allgemeinen für ein 3' vom Intron gelegenes Exon.
Gemäß der vorliegenden Erfindung ist die spleißfähige Nukleinsäure jede beliebige Nukleinsäure, die gespleißt werden kann, vorzugsweise eine RNA, beispielsweise in Form einer sogenannten prä-mRNA oder in Form einer DNA, die RNA-Abschnitte enthält.
Intron bedeutet eine nicht kodierende Sequenz, welche gespleißt wird, aufgrund der erkennenden Consensus- Sequenzen. Solche Consensus Sequenzen sind in der Hefe: /GUAUGU in der 5'-Spleißstelle, YAG/G in der 3'-Spleißstelle und UACUAAC im Verzweigungspunkt (branchpoint); im Menschen: AG/GURAGU in der
5'Spleißstelle, YAG/ in der 3'-Spleißstelle und YNYURAC im Verzweigungspunkt (branchpoint). Die unterstrichenen Nukleotide sind streng konserviert . Ganz besonders bevorzugt ist ein Intron, welches endständig über Consensus-Sequenzen mit zwei Exons ligiert ist.
Eine für das Spleißen im Humansystem geeignete spleißfähige Nukleinsäure ist beispielsweise die MINX-Modell-prä-mRNA (MINX = miniature wildtype Substrate; Zillmann, M., Zapp, M.L, Berget, S.M., (1988), Mol. Cell. Biol., 8:814-21.
We bereits erwähnt, können zusätzliche Sonden in die Intron -Struktur der prä- mRNA eingefügt werden. Derartige Konstrukte eignen sich daher zum Nachweis einer Inhibierung des Spleißens im ersten Schritt, d. h. Öffnen der mRNA und
Lariatbildung, oder im zweiten Schritt, d. h. Entfernung des Lariats. Im Falle einer
Inhibierung des Spleißprozesses würden die Fluorophore nicht voneinander entfernt werden und daher weiterhin ein Signal abgeben.
Wie bereits näher beschrieben, wird die Verbindung zwischen Exoni und Intron im ersten Spleißschritt durch das Spliceosom an der 5' -Spleißstelle des Introns geöffnet. Erst im zweiten Spleißschritt erfolgt eine kovalente Verknüpfung von Exoni und Exon2. Das Exoni ist folglich während des ersten Schrittes der Spleißreaktion nicht mehr mit der mRNA verbunden und somit aus der Spleißreaktion entfernbar. In Verbindung mit Konstrukten, an die beispielsweise korrespondierende Fluorophorenpaare an Oligonukleotiden im Intron und im Exon 1 binden, kann daher eine Aussage darüber gemacht werden, ob im ersten Spleißschritt beispielsweise eine Inhibierung stattgefunden hat. Werden beispielsweise zwei verschiedene Fluorophorenpaare, die in verschiedenen Wellenlängen emittieren, am 5' -Ende des Exoni und im Intron sowie am 3'-Ende des Introns und dem 5'-Ende des Exons2 der prä-mRNA eingebaut, so kann sowohl der erste Spleißschritt, wie auch der zweite Spleißschritt in einem Testsystem verfolgt werden. Beispiele geeigneter Nukleinsäurekonstrukte sind in Form ihrer kodierenden Sequenzen in der deutschen Patentanmeldung 199 09 156 offenbart. In Figur 2 ist eine prinzipielle Anordnung zur Ausführung gegeben. Je nach Signalfolge kann bei Benutzung verschiedener Wellenlängen auf den Ablauf des Spleißvorganges geschlossen werden.
Daher betrifft die Erfindung ebenfalls ein Verfahren zur Untersuchung des Spleißvorganges.
Für Untersuchungen im Hefesystem kann man beispielsweise von der prä-mRNA für U3 der Hefe ausgehen (Mougin, A. et al., (1996), RNA, 2: 1079-93).
Zur Durchführung der Untersuchungen der einzelnen Spleißreaktionen mit Hilfe eines erfindungsgemäßen Testsystems wird üblicherweise eine Zusammensetzung enthaltend die einzelnen Spleißkomponenten, vorzugsweise "Small Nuclear Ribonucleoprotein Particies (snRNP) -Komponenten und nicht-snRNP-Komponenten verwendet. Insbesondere enthalten die snRNP-Komponenten U1-, U2-, U4-, U5- und/oder U6-Proteine. Insbesondere ist es bevorzugt, wenn man entsprechende
Zellextrakte, insbesondere eukaryotische Zellextrakte für die Untersuchungen verwendet. Beispielsweise können die Zellextrakte aus tierischen Zellen, insbesondere Säugetierzellen, vor allem HeLa-Zellen, insbesondere aus
Zellkernextrakten von HeLa-Zellen oder Zellextrakte von Pilzen, insbesondere
Hefen, nach dem Fachmann allgemein bekannten Verfahren gewonnen werden
(siehe Beispiele). Die Zellextrakte enthalten im allgemeinen alle wichtigen Faktoren, um ein Spleißen in vitro durchführen zu können.
Zur Durchführung der Untersuchungen ist es essentiell, weitere Hilfsmittel, wie z. B. Pufferlösungen, Stabilisatoren und/oder Energieäquivalente, insbesondere ATP, einzusetzen.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich daher auch auf ein Verfahren zur Herstellung eines Testsystems, bei dem mindestens eine mobile spleißfähige Nukleinsäure samt zugehörigen Sonden enthaltend korrespondierende Fluorophore und mindestens ein gelfreies Nachweissystem sowie gegebenenfalls mindestens eine Zusammensetzung enthaltend Spleißkomponenten und gegebenenfalls weitere Hilfsmittel zusammengestellt werden. Bevorzugte Ausführungsformen der einzelnen Komponenten sind bereits näher beschrieben worden.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein Verfahren zum Auffinden einer wirksamen Substanz, wobei a) eine oder mehrere gleiche oder verschiedene mobile Nukleinsäure/n mit mindestens einer spleißfähigen Nukleinsäuresequenz samt zugehörigen Sonden mit korrespondierenden Fluorophoren in Anwesenheit von mindestens einer zu untersuchenden Substanz und mindestens einer Zusammensetzung enthaltend Spleißkomponenten und gegebenenfalls in Anwesenheit von weiteren Hilfsmitteln unter geeigneten Bedingungen inkubiert werden, und b) das sich gegebenenfalls gebildete Spleißprodukt mittels eines gelfreien Nachweissystems nachgewiesen wird.
Bevorzugte einzelne Komponenten des erfindungsgemäßen Verfahrens sind oben bereits näher beschrieben.
Die wirksame Substanz kann hierbei eine pharmazeutisch wirksame Verbindung, ein Naturstoff im weitesten Sinne, ein Fungizid, ein Herbizid, ein Pestizid und/oder ein Insektizid sein, vorzugsweise ist es ein Antibiotikum. Die zu untersuchende Substanz ist im allgemeinen eine natürlich vorkommende, eine natürlich vorkommende und chemisch modifizierte und/oder eine synthetische Substanz. Insbesondere können mit den erfindungsgemäßen Verfahren besonders einfach und schnell sogenannte kombinatorische Substanzbibliotheken durchsucht werden.
In der Beschreibungseinleitung wurde bereits darauf hingewiesen, daß verschiedene Erkrankungen auf eine Störung des Spleißmechanismus zurückzuführen sind. Daher eignet sich die vorliegende Erfindung auch zur Diagnose einer Erkrankung.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein Verfahren zur Diagnose einer Erkrankung, wobei a) eine oder mehrere gleiche oder verschiedene mobile Nukleinsäure/n vorzugsweise mit mindestens einer spleißfähigen Nukleinsäuresequenz samt Sonden mit zugehörigen korrespondierenden Fluorophoren in Anwesenheit von mindestens einer zu untersuchenden Substanz und mindestens einer Zusammensetzung enthaltend Spleißkomponenten und gegebenenfalls weiteren Hilfsmitteln unter geeigneten Bedingungen inkubiert werden, und b) daß sich gegebenenfalls gebildete Spleißprodukt mittels eines gelfreien Nachweissystems nachgewiesen wird.
Ganz bevorzugt handelt es sich bei der Substanz um eine Nukleinsäure, vorzugsweise um RNA. Die zu diagnostizierenden Erkrankungen sind hierbei vorzugsweise Erbkrankheiten, Krebserkrankungen und/oder virale Erkrankungen, insbesondere Grave's Krankheit, spinale Muskelatrophie, ß'-Thalassaemie, Krebserkrankungen in bezug auf das c- Erb-Onkogen, Hepatitis-C Infektionen und/oder Herpes Simplex Virus Infektionen. Insbesondere kann die vorliegende Erfindung verkürzte alternative Spleißprodukte des mutierten APC-Onkogens auf direktem Wege identifizieren und stellt so eine Alternative zu dem bisher praktizierten PTT (proteine truncation test) (Bala, S., et al., (1996) Hum Genet 98(5): 528 - 533) dar.
Die Zusammensetzung enthaltend Spleißkomponenten kann in diesem Fall beispielsweise eine behandelte oder unbehandelte Gewebeprobe des Patienten sein.
Die folgenden Figuren und Beispiele sollen die Erfindung näher beschreiben, ohne sie zu beschränken.
Beispiele
1. Das RNA-Konstrukt: Die zu spleißende mRNA besteht aus mindestens zwei Exons, die durch ein Intron getrennt sind. Es kann sowohl natürlichen als aus molekularbioiogischen Ursprungs sein.
2. Präparation der Kernextrakte: 2.1 Kernextrakte aus Säugetierzellen
Für das Herstellen von Kernextrakte aus Säugetierzellen werden Zellkulturen mit Heia-Zellen herangezogen. Hierzu werden die Zellen durch Zentrifugation (1000 x g, 10 Min.) aus dem Kulturmedium sedimentiert und mit Phosphatpuffer gewaschen. Anschließend wird das Zellsediment in fünffachem Volumen Puffer A (10 mM HEPES, 1 ,5 mM MgCb, 10 mM KCI, 0,5 mM DTT, pH 7,9, 4°C) aufgenommen und 10 Minuten inkubiert. Die Zellen werden erneut sedimentiert und in zweifachem
Volumen Puffer A aufgenommen. Diese Suspension wird mit einem Dounce
Homogenisator (Pistill B) aufgeschlossen (10-faches Auf- und Abbewegen des
Pistills). Die Kerne werden durch Zentrifugation sedimentiert. Abschließend werden die Kerne erneut in Puffer A aufgenommen und für 20 Minuten bei 25.000 x g zentrifuguiert. Das Sediment wird in 3 ml Puffer B (20 mM HEPES, 25% (v/v) Glycerin, 0,42 M NaCI, 1 ,5 mM MgCI2, 0,2 mM EDTA, 0,5 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), 0,5 mM DTT, pH 7,9) aufgenommen und erneut mit dem Dounce Homogenisator aufgeschlossen. Die entstehende Suspension wird 30 Minuten auf einem Magnetrührer inkubiert und anschließend bei 25.000 x g für 30 Minuten zentrifugiert. Erneut schließt sich eine Zentrifugation bei 25.000 x g (30 Min.) an. Der klare Überstand wird gegen das 50-fache Volumen Puffer C (20 mM HEPES, 20% (v/v) Glycerin, 0,1 M KCI, 0,2 mM EDTA, 0,5 mM PMSF, 0,5 mM DTT, pH 7,9) dialysiert. Das Dialysat wird zentrifugiert (25.000 x g, 20 Min.) und der resultierende Überstand kann als Kernextrakt in flüssigem Stickstoff gelagert werden (Dignam; J.D. et al. (1983) Nucleic Acid Res., 11 , 1475).
2.2 Zellextrakte aus Hefezellen
Zellextrakte aus Hefezellen werden auf sehr ähnliche Weise hergestellt. Hefezellen eines Protease-defizienten Stammes (BJ926, EJ101 oder ähnliche Stämme) werden in der logarithmischen Wachstumsphase durch Zentrifugation (1500 x g, 5 Min., 4°C) sedimentiert. Die Zellen werden in dem zwei- bis vierfachen Volumen eiskaltem Wasser resuspendiert und erneut bei 1.500 x g (5 Min, 4°C) zentrifugiert. Anschließend werden die Zellen in dem einfachen Volumen Zymolyasepuffer (50 mM Tris HCL, 10 mM MgCb, 1 M Sorbitol, 30 mM DTT, pH 7,5) aufgenommen und 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Zellen werden abzentrifugiert (1.500 x g, 5 Min., 4°C), in dem dreifachen Volumen Zymolyasepuffer mit 2 mg (200 U) Zymolyase 100 T aufgenommen und 40 Minuten bei 30°C auf einem Schüttler (50 RPM) inkubiert. Die enstandenen Sphäroblasten werden abzentrifugiert (1.500 x g, 5 Min., 4°C) und einmal in 2 ml eiskaltem Zymolyasepuffer gewaschen. Das Sediment wird mit zwei Volumen Lysepuffer (50 mM Tris HCI, 10 mM MgSO , 1 mM EDTA, 10 mM Kalium Acetat, 1 mM DTT, Protease Inhibitoren, 1 mM PMSF, pH 7,5) gewaschen und schließlich in einem Volumen Lysepuffer aufgenommen. Die Sphäroblasten werden anschließend in einem Dounce Homogenisator durch 5- bis
20-maliges Auf- und Abbewegen des Pistills (Abstand 1 -2 μm) lysiert. Das Lysat wird mit dem gleichen Volumen Extraktionspuffer (Lysepuffer + 0,8 M Ammoniumsulfat,
20 % (v/v) Glycerin) versetzt und 15 - 30 Minuten auf einem Überkopf Schüttler inkubiert (4°C). Anschließend wird 90 Minuten bei 100.000 x g zentrifugiert (4°C). Der Überstand wird gegen das hundertfache Volumen Lagerungspuffer (20 mM Tris HCI, 0,1 mM EDTA, 10% (v/v) Glycerin, 100 mM KCI, 1 mM DTT, Proteae Inhibitoren, 1 mM PMSF, pH 7,5) dialysiert. Das Dialysat wird bei 10.000 x g abzentrifugiert (4°C) und der Überstand in flüssigem Stickstoff gelagert (Dünn, B. & Wobbe, C.R. (1994) Preparation of protein extracts from yeast, In: Ausubel, F.M., et al. (eds.) Current Protocols in Molecular Biology, 2nd Volume, John Wiley and Sons, Inc., USA pp. 13.13.1 - 13.13.9).
3. In vitro Spleißen von Konstrukten in einem Testsystem Durch das Ausschneiden des Introns aus der RNA-Sequenz entsteht an der Grenze der beiden nun verbundenen Exons eine Nukleotidsequenz, die in der ungespleißten prä-mRNA nicht vorhanden ist, komplementäre Nukleotidsequenzen, die an den 3'Terminuns des Exons 1 und den δ'-Terminus des Exons 2 hybridisieren bilden nun eine durchgehende Sequenz. Die infolgedessen entstehende Nähe zweier korrespondierender Fluorophore ermöglicht einen Fluoreszenz- Resonanzenergietransfer (FRET). Das nach Anregung einer spezifischen Extinktionswellenlänge gemessene Signal weist den erfolgreich durchgeführten Spleißvorgang nach. Die Auswertung des Assays erfolgt in einem geeigneten Auswertegerät (Fluoreszensspektrometer, Perkin Eimer, Überlingen, Deutschland; Fluoreszezreader, Fluostar Galaxy, BMG, Offenburg, Deutschland; Light Cycler, Röche, Mannheim, Deutschland).
Alle beschriebenen Versuche wurden nach Standardmethoden, wie sie in (Eperon, I.C., and Krainer, A.R. (1994) Splicing of mRNA precursors in mammalian cells. In RNA Processing, vol. I - A Practical Approach (B.D. Harnes and S.J. Higgins, eds.) Oxford: IRL Press, pp. 57-101 ) beschrieben sind, durchgeführt. 3.1. Durchführung der in vitro Transkription
Das in Figur 2 beschriebene Konstrukt wurde über eine PCR-Standardreaktion mit einem T7-Promotor versehen und amplifiziert. Anschließend wurde es mittels in vitro Transkription in die korrespondierende mRNA umgeschrieben. Als Positivkontrolle und zum späteren Vergleich wurde ebenfalls das entsprechende Konstrukt ohne Intron in den Experimenten eingesetzt.
Die Reaktion wurde unter folgenden Bedingungen durchgeführt:
1 ,5 μl 5 x Transkriptionspuffer (200 mM Tris-HCI pH 7.9, 30 mM MgCI2, 10 mM Spermidin, 50 mM NaCI) 0,5 μl RNAsin (40 U/μl) 1 μl DTT (100 mM)
1 μl NTPs (ATP, GTP, CTP und UTP mit 5 mM) 1 μl MINX template DNA (1 mg/ml) 1 μl T7 Polymerase (10 U/μl) ad 10 μl mit H2O
Der Transkriptionsansatz wurde für 2 h bei 37°C inkubiert und anschließend über ein präparatives Harnstoffgel nach Standardmethoden gereingt. Zum Auffinden der markierten RNA wurde das Gel auf eine Dünnschicht-Chromatographie-Platte, die eine 0,25 mm dicke Schicht Kieselgel-60 mit Fluoreszenzindikator UV254 trägt (Macherny-Nagel), aufgelegt und von oben durch eine UV-Lampe mit einer Wellenlänge von 254 nm bestrahlt. Die RNA-Bande absorbiert die zur Anregung des Fluoreszenzindikators notwendige Wellenlänge und ve rursacht somit einen nicht angeregten Bereich auf der Dünnschicht-Chromatographie-Platte, der als Schatten sichtbar wird. Anhand dieses Schattens wurde die RNA mit einem Skalpell ausgeschnitten. Das Gelfragment wurde zerschnitten und über Nacht bei 4°C mit Elutionspuffer (500 mM Na-Acetat pH 5, 1 mM EDTA pH 8, 2,5% Phenol/Chloroform) die RNA aus dem Gel extrahiert. Anschließend wurde das
Acrylamid durch 10-minütige Zentrifugation bei 13 000 x g sedimentiert und die RNA mit Ethanol/Natriumacetat aus dem Überstand gefällt, gewaschen, getrocknet und in 10 mM Tris-HCI, pH 7,5 aufgenommen. 3.2 Durchführung der Spleißreaktion
7 μl Kernextrakt von HeLa-Zellen (=35 % v/v) wurden mit 3,25 mM MgCb, 35 mM
KCI, 2 mM ATP, 20 mM Phosphocreatine, 1 U/μl RNAsin, und 1 μg MINX-prä-mRNA (Zillmann et al., 1988, Molecular and Cellular Biology, 8: 814) in einem
Reaktionsvolumen von 20 μl für 0, 10, 20, 30 und 40 Minuten bei 30°C inkubiert.
Zum Vergleich wurde prä-mRNA eingesetzt, die das Intron nicht enthielt.
Anschließend wurden die Reaktionen durch Zugabe von 400 μl Proteinase K-Puffer
(100 mM Tris-HCI, pH 7,5, 12,5, mM EDTA, 150 mM NaCI, 1% SDS, 0,1 mg Proteinase K) beendet, danach je 50 pmol Sonde hinzugegeben und der
Fluoreszenz-Resonanzenergietransfer im Fluoreszensspektrometer (Perkin Eimer) gemessen.
Zur zeitlichen Verfolgung des Spleißvorgangs (Online Detektion in Echtzeit) wurde der Reaktionsansatz wie oben einschließlich der Sonden pipettiert und die Zu - bzw. Abnahme des Signals mittels Fluoreszensreader über eine Zeitspanne von 40 Minuten verfolgt.
Die Detektion einer großen Anzahl kleiner Proben, beispielsweise zur Diagnose der verkürzten Spleißprodukte des APC-Onkogens, können im Light-Cycler System (Röche, Schweiz) oder in einem Fluoreszensreader (Fluostar Galaxy, BMG, Offenburg, Deutschland) erfolgen.
4. Herstellung der Sonden Die verwendeteten Oligonukleotide können durch Standard-Festphasen-DNA- Synthese mit einem 392 RNA/DNA-Synthesizer (Applied Biosystems, 1992: Evaluating and Isolating Synthetic Oligonucleot ides) hergestellt werden. Die Synthesen werden in einem Maßstab von 0,2 oder 1 μmol nach den von Applied Biosystems empfohlenen Standardzyklen unter Beibehaltung der 5' -endständigen Dimethoxytritylgruppe ("trityl-on") durchgeführt. Zur Synthese einer 3'- markierten Sonde wird dabei ein mit einem Fluorophor beladener Träger (CPG-Support - controlled pore glass Träger) eingesetzt. Dadurch erfolgt der Einbau des Fluorophors (Fluorescein-CPG, TAMRA-CPG, Glen Research; Sterling, Virginia) am 3'-Terminus bereits während der Synthese. Zur Herstellung einer 5' -markierten Sonde wird die Oligosynthese standardmäßig durchgeführt und die 5' -Modifikation durch Umsetzung mit einem Fluorescein-Phosphoramidit (Glen Research) am 5'-
Ende erhalten.
Die Abspaltung der Oligonukleotide von der Festphase erfolgt mit wäßriger
Ammoniak-Lösung (33%) bei RT über einen Zeitraum von 1 h. Die darauffolgende Abspaltung der Schutzgruppen wird durch eine weitere Zugabe von wäßriger Ammoniak-Lösung (33%) und anschließender Inkubation bei 55 °C für 6 h durchgeführt. Die Effizienz der einzelnen Kupplungsschritte wird UVA IS- spektrometrisch durch Messung der Absorption der während der Synthese abgespaltenen Tritylgruppen bei 495 nm bestimmt. Die entschützten Oligonukleotidlösungen werden mit flüssigem Stickstoff eingefroren und lyophyllisiert, wobei zur Vermeidung der Detritylierung an der endständigen 5' - Position eine pH-Wert Kontrolle in 20-minütigem Abstand erfolgt und gegebenenfalls Triethlyamin (1 Oμl) hinzugefügt wird.
Das Lyophilisat wird anschließend in 400 μl 100 mM Triethylammoniumacetat, pH 7,0 aufgenommen und die Oligonukleotide mittels reversed pased HPLC über eine Hypersil reversed phase C-18-Säule mit einer Flußrate von 1 ml/min aufgereinigt. Die Elution erfolgt über den folgenden Gradienten: 11 - 26% 70% Acetonitril / 30% 100 mM Triethylammoniumacetat, pH 7,0 (0-20 min), 26 - 44 % 70% Acetonitril / 30% 100 mM Triethylammoniumacetat, pH 7,0, (20-30 min), 44 - 100 % 70% Acetonitril / 30% 100 mM Triethylammoniumacetat, pH 7,0 (30-33 min). Die Chromatographie wird UV-spektroskopisch bei den Wellenlängen λ = 260 und 290 nm verfolgt. Die Produktfraktionen werden vereinigt, lyophilisiert und Spuren von Triethylammoniumacetat durch mehrmaliges Aufnehmen in Wasser (jeweils 1 ml) und anschließender Lyophilisation entfernt. Das Lyophilisat wird in Wasser (500 μl ) aufgenommen und die Konzentration der Oligonukleotide durch UV-Absorption bei einer Wellenlänge von λ = 260 bestimmt. Die Abspaltung der 5'-endständigen Tritylgruppe ("Detrilierung") wird mit wässriger Essigsäure (80%ig, 10μl/nmol
Oligonukleotid) für 20 min bei RT vorgenommen. Die detritylierten Oligonukleotide werden nach Zugabe von wäßriger Natriumacetat-Lösung (3M, pH 5,2 1 ,5 μl/nmol Oligonukleotid) und Isoproanol (34 μl/nmol Oligonukleotid) bei -80 °C für 10 min gefällt. Die Oligonukleotide werden bei 4 °C abzentrifugiert (17 000 g) , der
Überstand verworfen und der erhaltene weiß-milchige Niederschlag mit auf -20 °C gekühlter wäßriger Ethanol-Lösung (2 x 200 μl, 70%ig) gewaschen. Die
Oligonukleotide werden erneut bei 4 °C zentrifugiert (17 000 x g), der Überstand verworfen und der erhaltene Niederschlag bei RT im Hochvakuum getrocknet. Das resultierende Lyophylisat wurde in Wasser (500 μl) aufgenommen, und der pH -Wert mit wäßriger Natronlauge auf pH 7,0 eingestellt.
Die Reinheitsbestimmung der erhaltenen detrinylierten Oligonukleotide erfolgt durch revered phase HPLCunter Verwendung einer ODS Hypersil reversed phase C-18- Säulöe. Zur Elution wird folgender Gradient verwendet: 5-25% 70% Acetonitril / 30% 100 mM Triethylammoniumacetat, pH 7,0 (0-20 min), 25-45% 70% Acetonitril / 30% 100 mM Triethylammoniumacetat, pH 7,0 (20-25 min), 45-100% 70% Acetonitril / 30% 100 mM Triethylammoniumacetat, pH 7,0 (25-28 min).
Zum Entsalzen werden die Oligonukleotide auf eine mit Wasser präequilibrierte Gelfiltrationssäule (NAP-5) aufgetragen und mit Wasser 1 ,5 ml eluiert. Die gesammelten Fraktionen (100 μl) werden durch UV-Absorption bei einer Wellenlänge von λ = 260 bestimmt, die Hauptfraktionen vereinigt, das Volumen durch Lyophilisation eingeengt und die Konzentration der Oligonukleotide UV - spektroskopisch bestimmt.

Claims

Patentansprüche
1. Homogenes Testsystem enthaltend
(a) mindestens eine oder mehrere, gleiche oder verschiedene mobile Nukleinsäuren mit mindestens einer spleißfähigen Nukleinsäure, enthaltend mindestens ein Intron
(b) mindestens zwei Sonden, enthaltend korrespondierende Fluorophore, welche vorzugsweise an den 5' und / oder 3' Enden eines Exon / Intron binden
(c) mindestens ein gelfreies Nachweissystem zum Nachweis einer Spleißreaktion, gegebenenfalls
(d) mindestens eine Zusammensetzung enthaltend Spleißkomponenten,
(e) weitere Hilfsmittel
2. Testsystem nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß die spleißfähige
Nukleinsäure mindestens zwei Exons enthält, die durch mindestens ein Intron getrennt sind.
3. Testsystem nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die mindestens zwei Sonden Nukleinsäuren umfassen, die zu Teilsequenzen von mindestens zwei Exons und/oder zu Teilsequenzen von mindestes einem Exon und einem Intron der spleißfähigen Nukleinsäure gemäß Merkmal (a) komplementär sind, wobei die Teilsequenzen durch die Spleißreaktion zusammengefügt und/oder voneinander entfernt werden.
4. Testsystem nach einem der Ansprüche 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß die spleißfähige Nukleinsäure und die Sonden -bindende Nukleinsäuresequenz miteinander verbunden sind.
Testsystem nach einem der Ansprüche 1-4, dadurch gekennzeichnet, daß die Sonden gemäß Merkmal (b) an die spleißfähige Nukleinsäure gemäß (a) hybridisieren.
. Testsystem nach einem der Ansprüche 1-5, dadurch gekennzeichnet, daß die korrespondierenden Fluorophore ausgewählt sind aus Fluoreszein/Rhodamin, und deren Derivate wie Carboxyfluoreszein-Succinimidylester/Texas-Red- Sulfonylchlorid, FITC/TMR (Fluoreszein-5-lsothiocyanate/Tetramethylrhodamin, sowie Naphtalene/Dansyl, Dansyl/DDPM (N-[4-(dimethylamino)-3,5- dinitrophenyljmaleimide), IAEDANS/DiO-C14 (5-(2- ((iodoacethyl)amino)ethyl)amino)-naphthalen-1 -suϊfoniacid/3,3- ditetradodecyloxacarbocyanin), ANAI/IPM (2-anthracen-N- acethlyimidazole/3(4-isothiocyanatophenyl)7-diethyl-4-amino-4- methylcoumarin, BPE/CY5 (B-Phycoerythrin/Carboxymethyl indocyanin-N- Hydoxysuccimidyiester) sowie Lanthanid-Chelate.
7. Testsystem nach einem der Ansprüche 1-6, dadurch gekennzeichnet, daß dieses korrespondierende Fluorophore enthält, die dem zeitaufgelösten
Fluoresenz-Resonanz-Energie Transfer zugänglich sind.
8. Testsystem nach einem der Ansprüche 1-7, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eine Nukleinsäure eine RNA ist.
9. Testsystem nach einem der Ansprüche 1-8, dadurch gekennzeichnet, daß die
Zusammensetzung gemäß Merkmal (c) "small nuclear ribonucleoprotein particies" (snRNP)-Komponenten und nicht-snRNP-Komponenten enthalten.
10. Testsystem nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die snRNP- Komponenten U1-, U2-, U4-, U5- und/oder U6-Proteine enthalten.
11. Testsystem nach einem der Ansprüche 1-10, dadurch gekennzeichnet, daß die
Zusammensetzung gemäß Merkmal (c) ein Zellextrakt, insbesondere ein eukaryotischer Zeil- oder Zellkernextrakt ist.
12. Testsystem nach Anspruch 11 , dadurch gekennzeichnet, daß der Zellkernextrakt aus tierischen Zellen, insbesondere Säugetierzellen, oder von Pilzen, insbesondere Hefen gewonnen ist.
13. Testsystem nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß die weiteren Hilfsmittel ausgewählt sind aus Pufferlösungen, Stabilisatoren und/oder Energieäquivalente, insbesondere ATP.
14. Verfahren zur Herstellung eines Testsystems gemäß einem der Ansprüche 1 bis
13, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eine mobile spleißfähige Nukleinsäure samt zugehörigen Sonden enthaltend korrespondierende Fluorophore und mindestens ein gelfreies Nachweissystem sowie gegebenenfalls mindestens eine Zusammensetzung enthaltend
Spleißkomponenten und gegebenenfalls weitere Hilfsmittel zusammengestellt werden.
15. Verfahren zum Auffinden einer wirksamen Substanz, dadurch gekennzeichnet, daß a) eine oder mehrere gleiche oder verschiedene mobile Nukleinsäure/n mit mindestens einer spleißfähigen Nukleinsäuresequenz samt zugehörigen Sonden mit korrespondierenden Fluorophoren in Anwesenheit von mindestens einer zu untersuchenden Substanz und mindestens einer Zusammensetzung enthaltend Spleißkomponenten und gegebenenfalls in
Anwesenheit von weiteren Hilfsmitteln unter geeigneten Bedingungen inkubiert werden, und b) das sich gegebenenfalls gebildete Spleißprodukt mittels eines gelfreien Nachweissystems nachgewiesen wird.
16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß die wirksame
Substanz ausgewählt ist aus Naturstoffen im weitesten Sinne, Herbiziden, Insektiziden, Pestiziden, Antibiotika, Pharmaka, kombinatorischen Substanzbibliotheken.
17. Verfahren nach den Ansprüchen 15 oder 16, dadurch gekennzeichnet, daß die zu untersuchende Substanz ausgewählt ist aus einer natürlich vorkommenden, natürlich vorkommenden und chemisch modifizierten und/oder synthetischen Substanz.
18. Verfahren zur Diagnose einer Erkrankung, dadurch gekennzeichnet, daß
(a) eine oder mehrere gleiche oder verschiedene mobile Nukleinsäure/n mit mindestens einer spleißfähigen Nukleinsäuresequenz samt zugehörigen
Sonden mit korrespondierenden Fluorophoren in Anwesenheit von mindestens einer zu untersuchenden Substanz und vorzugsweise mindestens einer Zusammensetzung enthaltend Spleißkomponenten und gegebenenfalls in Anwesenheit von weiteren Hilfsmitteln unter geeigneten Bedingungen inkubiert werden, und
(b) das sich gegebenenfalls gebildete Spleißprodukt mittels eines gelfreien Nachweissystems nachgewiesen wird.
19. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß die Substanz eine Nukleinsäure, vorzugsweise RNA, ist.
20. Verfahren nach den Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß die Erkrankung eine Erbkrankheit, eine Krebserkrankung und/oder eine virale Erkrankung ist.
21. Verfahren nach einem der Ansprüche 18-20, dadurch gekennzeichnet, daß die Erkrankung ausgewählt ist aus Grave's Krankheit, spinale Muskelatrophy, ß'- Thaiassaemie, Krebserkrankungen in bezug auf das c-erb-Onkogen, das APC- Onkogen, Hepatitis C Infektion und/oder Herpes Simplex Virus Infektion.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102007031574A1 (de) 2007-07-06 2009-01-08 Forschungszentrum Karlsruhe Gmbh Minor-Spleißosom Testsystem zur Modulierung der Zellteilung

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1992014841A1 (en) * 1991-02-14 1992-09-03 Baxter Diagnostics Inc. Novel lanthanide chelate-conjugated oligonucleotides
WO1997046714A1 (en) * 1996-06-04 1997-12-11 University Of Utah Research Foundation Monitoring hybridization during pcr
DE19909156A1 (de) * 1999-03-02 2000-09-07 Aventis Res & Tech Gmbh & Co Testsystem zum Nachweis einer Spleißreaktion, sowie dessen Verwendung

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1992014841A1 (en) * 1991-02-14 1992-09-03 Baxter Diagnostics Inc. Novel lanthanide chelate-conjugated oligonucleotides
WO1997046714A1 (en) * 1996-06-04 1997-12-11 University Of Utah Research Foundation Monitoring hybridization during pcr
DE19909156A1 (de) * 1999-03-02 2000-09-07 Aventis Res & Tech Gmbh & Co Testsystem zum Nachweis einer Spleißreaktion, sowie dessen Verwendung

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AUSUBEL F M: "Preparation of protein extracts from yeast. In: Current protocols in molecular biology" 1994 , JOHN WILEY & SONS , CANADA XP002207202 in der Anmeldung erw{hnt Seite 13.13.1 -Seite 13.13.9 *
ERSTER S H ET A.: "Use of RNase H and primer extension to analyze RNA splicing" NUCLEIC ACIDS RESEARCH, Bd. 16, Nr. 13, 1988, Seiten 5999-6014, XP002207201 *
GUTHRIE C: "Messenger RNA splicing in yeast: Clues to why the spliceosome is a ribonucleoprotein " SCIENCE, Bd. 253, 1991, Seite 157 XP002207199 in der Anmeldung erw{hnt *
MORGAN W R ET AL: "THREE SPLICING PATTERNS ARE USED TO EXCISE THE SMALL INTRON COMMON TO ALL MINUTE VIRUS OF MICE RNAS" JOURNAL OF VIROLOGY, NEW YORK, US, US, Bd. 60, Nr. 3, Oktober 1986 (1986-10), Seiten 1170-1174, XP000961665 ISSN: 0022-538X *
VOLLOCH V ET AL: "INHIBITION OF PRE-MRNA SPLICING BY ANTISENSE RNA IN VITRO: EFFECT OF RNA CONTAINING SEQUENCES COMPLEMENTARY TO EXONS" BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS, ACADEMIC PRESS INC. ORLANDO, FL, US, Bd. 179, Nr. 3, 30. September 1991 (1991-09-30), Seiten 1593-1599, XP001053533 ISSN: 0006-291X in der Anmeldung erw{hnt *
ZANELLI E ET AL.: "Evidence for an alternate splicing in the thyroperoxidase messenger from patients with Grave's disease" BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS, Bd. 170, Nr. 2, 1990, Seiten 735-741, XP002207200 in der Anmeldung erw{hnt *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102007031574A1 (de) 2007-07-06 2009-01-08 Forschungszentrum Karlsruhe Gmbh Minor-Spleißosom Testsystem zur Modulierung der Zellteilung
WO2009006990A2 (de) * 2007-07-06 2009-01-15 Forschungszentrum Karlsruhe Gmbh Minor-spleissosom testsystem zur modulierung der zellteilung
WO2009006990A3 (de) * 2007-07-06 2009-04-02 Karlsruhe Forschzent Minor-spleissosom testsystem zur modulierung der zellteilung

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