DE69924147T2

DE69924147T2 - Floureszenzintensitäts-test für eine protein- oder peptidbindung an nukleinsäuren

Info

Publication number: DE69924147T2
Application number: DE69924147T
Authority: DE
Inventors: H. Glen ERIKSON; I. Jasmine DAKSIS
Original assignee: Ingeneus Corp
Current assignee: Ingeneus Corp
Priority date: 1998-12-31
Filing date: 1999-12-29
Publication date: 2006-01-05
Anticipated expiration: 2019-12-30
Also published as: EP1141392A1; ATE290607T1; US6294333B1; TWI235766B; CA2358065C; CA2358065A1; JP2002534664A; EP1141392B1; DE69924147D1; JP3959438B2; AU771451B2; WO2000040753A1; AU1791100A

Description

Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung betrifft Biopolymer-Bindungsassays und spezieller Verfahren zum Prüfen der Bindung zwischen Nucleinsäuren und Peptiden oder Proteinen unter Verwendung von Fluoreszenzintensitätsdaten.
Hintergrund der Erfindung
Protein-Nucleinsäure-Komplexe spielen bekanntermaßen eine wichtige Rolle in einer Vielfalt biologischer Prozesse. Siehe z.B. Hill et al. "Fluorescence Approaches to Study of Protein-Nucleic Acid Complexation", 278 Methods in Enzymology 390 (1997). Beispielsweise spielen DNA-bindende Proteine bekanntermaßen eine wichtige Rolle bei der Genregulation. Gene werden typischerweise auf der Ebene der Transkription durch DNA-bindende Proteine reguliert, welche als Transkriptionsfaktoren bezeichnet werden. Transkriptionsfaktoren regulieren die Genexpression durch spezifische Bindung an eine Zielnucleinsäuresequenz in Promotor-DNA.
Aufgrund der biologischen Bedeutung der Protein-Nucleinsäure-Wechselwirkung wurde eine Vielfalt von Verfahren zur Untersuchung der Protein-Nucleinsäure-Bindungscharakteristiken vorgeschlagen. Siehe z.B. Hill et al. und die dort zitierten Referenzen.
Das US-Patent Nr. 5,783,384 von Verdine offenbart Verfahren zur Bestimmung der Affinität eines DNA-bindenden Proteins für eine Zielnucleinsäuresequenz. Verdine lehrt Verfahren, welche die Bereitstellung einer reversiblen Bindung zwischen einem DNA-bindenden Protein und einer Zielnucleinsäuresequenz und die Bestimmung der relativen Stärke der reversiblen Bindung (und somit der Affinität des Proteins für die Nucleinsäure) durch deren Aufbruch unter kontrollierten Bedingungen umfassen. Je stringenter die erforderlichen Bedingungen zum Aufbrechen der Bindung, desto höher die Affinität des Proteins für die Nucleinsäure. Bindungsassays auf Fluoreszenzbasis werden von Verdine weder offenbart noch vorgeschlagen.
Das US-Patent Nr. 5,445,935 von Royer offenbart Fluoreszenz-basierte Verfahren zur Untersuchung der Protein-Oligonucleotid-Bindung; jedoch sind die Lehren des Patents ausschließlich auf Fluoreszenzanisotropie-Techniken beschränkt. Grundsätzlich misst die Anisotropie Rotationsdiffusionsereignisse von freier DNA oder protein-gebundener DNA sowie die lokalen Bewegungen eines Fluorophors, das mit der DNA über einen Linkerarm verknüpft ist. Freie DNA rotiert schnell, depolarisiert das Licht leichter und zeigt einen niedrigen Anisotropiewert. Im Gegensatz dazu rotiert proteingebundene DNA relativ langsam zur Lebenszeit des Fluorophors, depolarisiert das Licht nur leicht und zeigt somit einen relativ hohen Anisotropiewert.
Es gibt jedoch erhebliche Nachteile bei Assays auf Basis von Anisotropie. Das Ausmaß der Anisotropieänderung als Funktion der Bindung ist nicht so vorhersagbar wie die Verfechter von Verfahren auf Anisotropiebasis versichern. Die Interpretation von Anisotropiedaten zur Anpassung von inkonsistenten Daten an theoretische Erwartungen kann mehr Mühe erfordern als in einem analytischen Verfahren wünschenswert ist, insbesondere wenn das Verfahren automatisiert werden soll.
Die radioaktive Markierung bleibt das populärste Verfahren zur Analyse von Protein-Nucleinsäure-Wechselwirkung trotz relativer Langsamkeit, einer Gefahr für die Gesundheit und die Umwelt und relativ hohem Arbeitsaufwand. Herkömmliche Verfahren zur radioaktiven Markierung erfordern typischerweise eine radioaktive Endmarkierung von DNA-Sonden mit ³²P unter Verwendung spezialisierter Enzyme. Die Reinigung von markierter DNA von nicht-inkorporiertem ³²P beinhaltet Polyacrylamidgelelektrophorese, Elution über Nacht, Gelfiltration und Konzentrationsschritte. Nachdem die Halbwertszeit von ³²P nur 14 Tage beträgt, ist eine radioaktive Markierung etwa alle drei Wochen für jede Sonde erforderlich. Darüber hinaus müssen Protein-³²P-DNA-Komplexe von ungebundener ³²P-DNA durch native Polyacrylamidgelelektrophorese abgetrennt werden. Die Gele werden dann getrocknet und mittels Autoradiographie oder Phosphoimaging analysiert.
WO 98/26093 offenbart ein Verfahren zum Nachweis der Bindung zwischen einer Nucleinsäure, die ein fluoreszierendes Nucleotid-Analogon enthält, und Protein. Die Änderung der normalen Konformation der Nucleinsäure durch Hybridisierung oder durch Proteinbindung reduziert und/oder eliminiert das Quenchen des fluoreszierenden Nucleotid-Analogons und verursacht dadurch eine nachweisbare Erhöhung der Fluoreszenz.
Bestimmte Assays, die früher von den Erfindern entwickelt wurden, sind in den US-Patenten Nr. 5,846,729 und 6,060,242 offenbart.
Trotz der vorstehenden Entwicklungen bestand auf diesem Gebiet nach wie vor Bedarf für ein einfaches, effektives und schnelles Verfahren zur Analyse von Peptid-Nucleinsäure- und Protein-Nucleinsäure-Wechselwirkungen.
Zusammenfassung der Erfindung
Die Erfindung stellt ein Verfahren bereit zum Prüfen der Bindung zwischen mindestens einer fluorophormarkierten Verbindung und mindestens einer unmarkierten Verbindung. Das Verfahren umfasst den Nachweis einer Quenchwirkung auf die von der mindestens einen fluorophormarkierten Verbindung emittierten Fluoreszenz, die das Ergebnis dieser Bindung ist, wobei die Bindung spezifisch und eine andere als die von Nucleobase zu Nucleobase ist. Das Verfahren wird vorzugsweise durchgeführt, ohne die Komplexe der mindestens einen fluorophormarkierten Verbindung und der mindestens einen unmarkierten Verbindung von der mindestens einen fluorophormarkierten Verbindung vor dem Nachweis der Quenchwirkung abzutrennen und ohne einen Signalquencher zum Quenchen der emittierten Fluoreszenz bereitzustellen.
Kurzbeschreibung der Zeichnungen
Die Erfindung wird in Verbindung mit den folgenden Zeichnungen beschrieben werden, worin ähnliche Bezugszeichen ähnliche Elemente bezeichnen und worin:
die 1A, 1B, 1C, 1D, 2A, 2B, 3A, 3B, 4A, 4B, 5A, 5B, 6A, 6B, 7A, 7B, 8A und 8B Fluoreszenzspektren sind.
Detaillierte Beschreibung bevorzugter Ausführungsformen
Die Erfindung stellt bereit ein Verfahren zum Prüfen einer speziellen Bindung zwischen mindestens einer Proteinsequenz und mindestens einer Nucleinsäuresequenz, wobei die mindestens eine Proteinsequenz und/oder die mindestens eine Nucleinsäuresequenz mindestens ein Fluorophor enthält. Das Verfahren umfasst den Nachweis einer die Fluoreszenzintensität quenchenden Wirkung auf das mindestens eine Fluorophor, welche die Folge der speziellen Bindung unter Bildung mindestens eines Protein-Nucleinsäure-Komplexes ist. Vorzugsweise ist das Fluorophor mit der mindestens einen Nucleinsequenz vor der Bindung an die mindestens eine Proteinsequenz verknüpft.
Im Gegensatz zu Fluoreszenzanisotropieniveaus, welche zunehmen, wenn ein Protein an ein DNA- oder RNA-Oligonucleotid bindet, nimmt die Fluoreszenzemissionsintensität nach Komplexbildung ab.
Ein bevorzugtes Verfahren zum Nachweis des Quenchens (und somit zur Prüfung der Bindung) umfasst: (a) Bereitstellen eines Testmediums, das die mindestens eine Nucleinsäuresequenz und die mindestens eine Proteinsequenz enthält; (b) Bestrahlen des Testmediums mit einer Strahlung, die bewirkt, dass das mindestens eine Fluorophor ein Fluoreszenzlicht aussendet; und (c) Vergleichen der Fluoreszenzintensität des Fluoreszenzlichts mit einer Bezugsfluoreszenzintensität eines Bezugsmediums, das mit dem Testmedium im wesentlichen identisch ist, mit der Ausnahme, dass dem Bezugsmedium die mindestens eine Proteinsequenz fehlt, wobei die Quenchwirkung und die spezielle Bindung aufgefunden werden, wenn die Fluoreszenzintensität geringer als die Bezugsfluoreszenzintensität ist. Ein Quenchen zeigt die Bildung eines Protein-Nucleinsäure-Komplexes durch spezielle/spezifische Bindung an.
Wie hier definiert, schließt eine spezielle/spezifische Bindung zwischen mindestens einer Proteinsequenz und mindestens einer Nucleinsäuresequenz komplementäre Basenpaarungen (d.h. Watson-Crick) zwischen Peptid- Nucleinsäuren und Nucleinsäuren aus, umfasst jedoch alle anderen Typen spezifischer Bindung zwischen Proteinen (für die Zwecke dieser Erfindung ist der Begriff "Protein" in seinem breitesten Sinn definiert als beispielsweise Peptide (z.B. Peptide, Dipeptide, Tripeptide, etc.), Polypeptide, Proteine und Multiprotein-Komplexe einschließend) und Nucleinsäuren (z.B. dsDNA, ssDNA, RNA, ssRNA, dsRNA, mRNA, hnRNA, tRNA, rRNA, ssDNA:RNA-Hybride, dsDNA:RNA-Hybride, Nucleinsäureanaloga und Oligonucleotide).
Eine Vielfalt von Protein-Nucleinsäure-Komplexen kann mit dem Verfahren der Erfindung geprüft werden. Die Erfindung kann zur Analyse von Bindungscharakteristiken (einschließlich der Anwesenheit oder Abwesenheit einer Bindung und der Bindungsaffinität) zwischen einer Nucleinsäure und beispielsweise einem Peptid, einem Protein oder einem Multiprotein-Komplex verwendet werden. Geeignete Proteine zur Analyse umfassen beispielsweise Wildtyp, Mutante, isoliert, in vitro translatiert und/oder synthetisiert. Die Erfindung ist besonders geeignet für die Analyse der Bindung eines DNA-bindenden Proteins an dsDNA. Testproben brauchen nicht zu 100 rein sein, sondern können vielmehr beispielsweise eine gereinigte Präparation, eine synthetisierte Präparation, einen halbgereinigten Proteinextrakt, einen rohen Proteinextrakt oder eine in vitro translatierte Präparation umfassen.
Ausführungsformen der Erfindung analysieren die Bindungscharakteristiken von Multiproteinkomplexen, bei denen die gleichen oder verschiedene Proteine an einzelne oder mehrere Bindungsstellen auf der Nucleinsäuresequenz gebunden sind. Multiprotein:DNA-Komplexe treten in der Natur häufiger auf und sind biologisch bedeutsamer als Einzel-protein:DNA-Komplexe oder Homodimer:DNA-Komplexe. Mit Hilfe der Erfindung der Erfindung ist es möglich nachzuweisen, ob die zwei (oder mehr) wechselwirkenden Proteine an ihre jeweiligen DNA-Stellen unabhängig, kooperativ oder synergistisch binden. Beispielsweise kann die Erfindung die Bindung von zwei Proteinen an zwei DNA-Stellen messen, welche durch intervenierende DNA-Sequenzen getrennt sind, die eine Schleife bilden, wenn die beiden gebundenen Proteine miteinander wechselwirken.
Die Komponenten der bindenden Komplexe müssen nicht nur Wildtypen sein oder perfekte Paare. Beispielsweise kann die Erfindung die Bindung zwischen einem Mutantenprotein und einer Mutanten-DNA-Bindungssequenz oder zwischen einem Mutantenprotein mit veränderter Bindungsaffinität für eine Wildtyp-DNA-Bindungsstelle auffinden.
Die Erfindung ermöglicht den Nachweis der Bindung einer ersten unmarkierten Verbindung an eine zweite unmarkierte Verbindung durch Nachweis einer Änderung in den Bindungscharakteristiken (wie angezeigt durch eine Veränderung in der Fluoreszenzintensität) zwischen der ersten unmarkierten Verbindung und einer markierten Verbindung. Für die Zwecke dieser Erfindung wird ein solcher Nachweis als Nachweis "sekundärer Bindung" oder in seinem breiteren Sinn als Nachweis "indirekter Bindung" bezeichnet. In der Theorie ermöglicht die Erfindung den Nachweis tertiärer Bindung, quaternärer Bindung usw., vorausgesetzt, dass jede zusätzliche Ebene der Bindung eine signifikante Änderung der Bindung zwischen der markierten Verbindung und der ersten unmarkierten Verbindung ergibt.
Gleichermaßen ermöglicht die Erfindung auch den Nachweis der Bindung einer unmarkierten Verbindung an mindestens ein Mitglied eines Komplexes komplexierter Verbindungen, wobei mindestens eine der komplexierten Verbindungen für Fluoreszenzintensitätsmessungen markiert ist. Die markierte Verbindung und die unmarkierte Verbindung brauchen nicht einmal direkt zu wechselwirken, damit der Nachweis stattfinden kann. Der entscheidende Punkt ist, dass die Verbindung den Nachweis eines Zustandes durch seinen direkten oder indirekten Einfluss auf die Bindungscharakteristiken einer markierten Sonde an einem Ziel ermöglicht.
Somit ermöglicht die Erfindung den Nachweis der Bindung eines Antikörpers (d.h. der "zweiten unmarkierten Verbindung") an ein spezifisches Protein (d.h. die "erste unmarkierte Verbindung"), gegen welches der Antikörper gerichtet ist, wobei das spezifische Protein entweder direkt an die markierte DNA-Sequenz gebunden ist oder in einem Multiprotein-DNA-Komplex vorliegt und somit mit einem oder mehreren anderen Protein(en) in dem Komplex wechselwirkt, jedoch nicht notwendigerweise direkt mit der markierten DNA wechselwirkt. Die Zugabe spezifischer Antikörper zu Protein:DNA-Komplexen (insbesondere Multiprotein:DNA-Komplexen) ist eine allgemein eingesetzte Technik zur Identifizierung der Anwesenheit unbekannter Proteine in Protein:DNA-Komplexen. Die Bindung des Antikörpers wird entweder die Bildung des Protein:DNA-Komplexes verhindern (was zu keiner Veränderung der Intensität im Vergleich zu freier DNA führt) oder wird in einem Antikörper:Protein:DNA-Komplex resultieren, welcher die Intensität der Fluoreszenz sogar noch stärker als der Protein:DNA-Komplex verringern sollte.
Die Erfindung ermöglicht ferner den Nachweis direkter und indirekter Bindung einer markierten Nucleinsäure an andere sequenzspezifisch bindende Moleküle, wie z.B. Peptide, Peptidmimetika, komplexe Kohlenhydrate oder andere Oligomere.
Die Erfindung eignet sich für eine große Anzahl von Zwecken, einschließlich Gestaltung und/oder Auswahl von Molekülen, welche in stellenspezifischer Weise an gewünschte DNA oder andere Typen von Sequenzen binden oder welche die Bindung anderer Moleküle verändern. Die Erfindung stellt somit bereit ein Verfahren zur Identifizierung und Evaluierung neuer Substanzen oder Arzneiwirkstoffe, welche eine spezifische Bindungsaktivität aufweisen oder welche voraussagbar die Bindungseigenschaften anderer Bindungspaare/Komplexe verändern. Beispielsweise kann eine Substanz mit DNA-Bindungsspezifität identifiziert werden, welche an Promotor-DNA bindet und somit als transkriptionaler Blocker wirkt. Dieser neu identifizierte Transkriptionsblocker kann sowohl in in vitro- als auch in in vivo-Transkriptionsprozessen eingesetzt werden.
Das Verfahren der Erfindung kann durchgeführt werden ohne Abtrennung des mindestens einen Protein-Nucleinsäure-Komplexes von der mindestens einen Proteinsequenz und der mindestens einen Nucleinsäuresequenz vor dem Nachweis der Fluoreszenzintensität und ohne Bereitstellung eines Signalquenchers auf dem mindestens einen Protein oder der mindestens einen Nucleinsäuresequenz.
Das Verfahren erfordert nicht die Verwendung radioaktiver Sonden, welche gefährlich, mühsam und zeitaufwendig zu verwenden sind und ständig regeneriert werden müssen. Sonden der Erfindung sind vorzugsweise sicher zu verwenden und für Jahre stabil. Dementsprechend können Sonden in großen Mengen produziert oder bestellt und gelagert werden.
Das Verfahren der Erfindung erfordert keinen Gelseparationsschritt und erlaubt dadurch eine Verdoppelung der Menge der in nur einem halben Tag zu testenden und zu analysierenden Proben. Quantitative Analysen sind einfach und genau.
Die Erfindung wird detaillierter unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele erläutert werde+n, es sollte jedoch verstanden werden, dass die vorliegende Erfindung nicht darauf beschränkt sein soll.
Beispiele
Die Beispiele demonstrieren die Bindung von drei verschiedenen Klassen von DNA-bindenden Proteinen an ihre jeweiligen DNA-Erkennungsstellen als Beweis, dass der Laser-basierte Assay der Erfindung auf alle Klassen von DNA-bindenden Proteinen anwendbar ist. Die drei repräsentativen Proteine, welche für die Beispiele ausgewählt wurden, sind c-JUN (Beispiele 1-3 und 5), Sp1 (Beispiel 4) und Oct-1 (Beispiele 6-7).
Beispiel 1
c-JUN ist ein Mitglied der AP-1-Familie von Transkriptionsfaktoren, welche an AP-1-DNA-Bindungsstellen, die natürlicherweise in Promotor- oder Enhancer-Sequenzen vieler zellulärer und viraler Gene vorliegen, binden und diese regulieren. Siehe beispielsweise Bohmann et al., "Human proto-oncogene c-jun encodes a DNA binding protein with structural and functional properties of transcription factor AP-1", 238 Science 1386-1392 (1987). Ferner gehört das humane c-JUN-Protein zu einer Klasse von Proteinen (welche c-FOS und c-MYC einschließen), bezeichnet als Proto-Onkoproteine, welche, wenn sie dereguliert und aktiviert sind, Tumorgenese und Krebs verursachen. c-JUN, c-FOS und c-MYC stellen eine spezielle Gruppe von DNA-bindenden Proteinen dar, deren DNA-bindende Domäne aus einer Region besteht, die reich an basischen Aminosäuren ist (gewöhnlich als "basische Region" oder "basische Domäne" bezeichnet), welche unmittelbar neben einer strukturellen Domäne liegt, die als "Leucin-Reißverschluss" bezeichnet wird. Der Leucin-Reißverschluss besteht aus 4 bis 5 Leucinresten (c-JUN hat 5), die durch regelmäßige Intervalle von 7 Aminosäuren getrennt sind, welche bimolekulare Coiled-Coiled-Strukturen bilden. Ein spezifischer Kontakt mit ihrer palindromischen DNA-Sequenz geschieht primär über die basische Region. Der Leucin-Reißverschluss erlaubt die Dimerisierung von c-JUN selbst unter Bildung von c-JUN:c-JUN-Homodimeren oder mit c-FOS unter Bildung von c-JUN:c-FOS-Heterodimeren. Homodimere von c-JUN biegen DNA 79° zu der kleineren Vertiefung einer DNA-Helix, während c-JUN:c-FOS-Heterodimere DNA 94° in der entgegengesetzten Orientierung, zur größeren Vertiefung, biegen. Eine vollständig funktionelle DNA-Bindungsdomäne erfordert sowohl die basische Region als den Leucin-Reißverschluss. Nachdem reines humanes c-JUN-Protein in den folgenden Assays verwendet wird, zeigen die Beispiele die Bindung von c-JUN:c-JUN-Homodimeren an eine einzelne AP-1-Stelle (JD1F/2F).
Ein mit Fluorescein markiertes Wildtyp-dsDNA-Oligonucleotid, JD1F/2F, enthaltend eine Consensus-AP-1-DNA-Bindungsstelle von 7 bp, wurde von der Promotorsequenz des humanen Kollagenasegens abgeleitet. Komplementäre 5'-fluoresceinmarkierte ssDNA-17-mere JD1F und JD2F mit fünf Nucleotiden, die beide Enden der Consensus-AP-1-Stelle flankieren, wurden auf einem PerSeptive Biosystems Expedite-Nucleinsäuresynthesizer synthetisiert und mittels HPLC gereinigt. Äquimolare Mengen an JD1F- und JD2F-Oligos wurden in 10 mM Tris, pH 7,5, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA durch Denaturierung bei 95° C für fünf Minuten, gefolgt von Inkubation bei 42° C, 35° C und 21° C für jeweils 40 Minuten, verschmolzen. Die verschmolzenen Oligos wurden zwei Stunden lang bei –20° C ethanolgefällt, durch Zentrifugation bei 14.000 UpM für 20 Minuten bei 0° C pelletiert, mit 100%igem Ethanol gewaschen, erneut mit 14.000 UpM für 20 Minuten bei 0° C pelletiert, getrocknet und in bidestilliertem H₂O in einer Endkonzentration von 100 ng/μl gelöst. Die gebildeten dsDNA-Oligos wiesen ein einzelnes Fluoresceinmolekül an beiden 5'-Enden auf.
Sequenz für Wildtyp JD1F (SEQ-ID-NR. 1):
5'-Flu-GTG TCT GAC TCA TGC TT-3'
Sequenz für Wildtyp JD2F (SEQ-ID-NR. 2):
5'-Flu-AAG CAT GAG TCA GAC AC-3'
Das Mutanten-dsDNA-17-mer JD3F/4F war in seiner Sequenz identisch mit Wildtyp JD1F/2F, mit Ausnahme eines einzigen Basenpaaraustausches (unterstrichen) von GC zu TA innerhalb der Wildtyp-AP-1-Consensus-DNA-Bindungsstelle.
Sequenz für die Mutante JD3F (SEQ-ID-NR. 3):
5'-Flu-GTG TCT TAC TCA TGC TT-3'
Sequenz für die Mutante JD4F (SEQ-ID-NR. 4):
5'-Flu-AAG CAT GAG TAA GAC AC-3'
Die c-JUN:DNA-Bindungsreaktionsmischung (30 μl) enthielt folgendes : 9,25 mM HEPES, pH 7,9, 2,23 mM MgCl₂, 0,03 mM EDTA, 50 mM NaCl, 5,0 mM DTT, 3,75 % (Vol./Vol.) Glycerin, 0,15 μg/μl Rinderserumalbumin (BSA), 0-2,0 μg reines c-JUN-Protein (Promega, Madison, Wisconsin) oder 0-400 ng reines c-JUN-Peptid und 0,075 pmol 5'-fluoresceinmarkiertes dsDNA-Oligonucleotid. Wenn Volllängen-c-JUN verwendet wurde, wurden 3 ng/μl Poly(dI)-Poly(dC) in die Reaktionsmischung eingeschlossen und vor der Zugabe von Protein und fluoresceinmarkierter DNA zugegeben. Die Beispiele in den 1B und 1D enthielten 50 mM KCl anstelle von 50 mM NaCl. Wildtyp- und Mutanten-c-JUN-DNA-Bindungsdomänenpeptide wurden großzügig von Dr. Dirk Bohmann (European Molecular Biology Laboratory, Heidelberg, Deutschland) zur Verfügung gestellt. Die Reaktionsmischungen wurden bei 21° C 30 Minuten lang inkubiert, in eine Quarzküvette eingebracht, mit einem Argonionenlaserstrahl mit einer Wellenlänge von 488 nm bestrahlt und hinsichtlich Fluoreszenzemission überprüft.
Das Wildtyp-c-JUN-DNA-Bindungsdomänenpeptid bestand aus den C-terminalen 132 Aminosäureresten von c-JUN (von Gln 209 bis Phe 340). Das c-JUN-Mutanten-14-DNA-Bindungsdomänenpeptid war in seiner Sequenz identisch mit dem Wildtyp-Peptid mit Ausnahme einer Zwei-Aminosäuren-Substitution (unterstrichen), welche Lysin in Isoleucin an Position 277 und Cystein in Asparaginsäure an Position 278 innerhalb der zentralen basischen Domäne überführte.
Sequenz für Wildtyp-c-JUN-Peptid (SEQ-ID-NR. 5):
Die für die Bindung von 2 μg, 1 μg oder 0,05 μg Volllängen-c-JUN an 0,075 pmol Wildtyp JD1F/2F oder 0,075 pmol der Mutante JD3F/4F erhaltenen Fluoreszenzspektren sind in den 1A–1D gezeigt. Die DNA-Konzentration wurde konstant bei 2,5 fmol/μl für jede getestete Probe gehalten. Alle Proben, ob DNA alleine oder in Gegenwart von c-JUN, wurden unter identischen Reaktionsbedingungen getestet. Die maximale Fluoreszenzintensität trat bei 525 nm auf, da das verwendete Fluorophor Fluorescein war. Die maximale Intensität, welche beobachtet wurde, wenn 1 μg oder 0,05 μg c-JUN an JD1F/2F gebunden wurden, war 54 % bzw. 49 % niedriger als die mit JD1F/2F allein beobachtete (1A). Eine 55%ige Intensitätsabnahme resultierte, wenn 2 μg c-JUN an Wildtyp JD1F/2F gebunden wurden (Daten nicht gezeigt). Die ähnlichen Intensitätsabnahmen, die mit sowohl 1 μg als auch 2 μg c-JUN beobachtet wurden, legen nahe, dass durch die Zugabe von 1 μg Protein Sättigungsniveaus der Bindung erreicht wurden.
Zum Testen der c-JUN-Präferenz für die Bindung an DNA unter unterschiedlichen Salzbedingungen wurde das obige Experiment gleichzeitig in einem Reaktionspuffer durchgeführt, der 50 mM KCl anstelle von 50 mM NaCl (1B) enthielt. Als 2 μg c-JUN an Wildtyp JD1F/2F in dem KCl-Reaktionspuffer gebunden wurden, wurde eine 57%ige Intensitätsabnahme im Vergleich zu dem mit DNA alleine erreichten Niveau beobachtet. 1 μg und 0,5 μg c-JUN, gebunden an den Wildtyp JD1F/2F in dem Puffer mit 50 mM KCl, ergaben eine Abnahme von 40 % bzw. 34 %, welches Bindungsniveaus unterhalb der Sättigung nahe legen. Deshalb bindet c-JUN an seine AP-1-Stelle in einer Reaktionsmischung mit 50 mM NaCl mit einer höheren Bindungsaffinität als in einer Reaktionsmischung mit 50 mM KCl. Somit konnte der erfindungsgemäße Laser-Bindungsassay c-JUN:DNA-Bindung nicht nur zuverlässig nachweisen, sondern auch bevorzugte Bindungsbedingungen identifizieren.
Während des gleichen Experiments wurde, als genau die gleichen Mengen an c-JUN mit 0,075 pmol der Mutante JD3F/4F in der Reaktionsmischung mit 50 mM NaCl (1C) oder der Reaktionsmischung mit 50 mM KCl (1D) umgesetzt wurden, keine Abnahme der Fluoreszenzintensität in jeder Probe beobachtet, was eine fehlende Bindung von Protein an die mutierte DNA-Sequenz anzeigt. Diese Mutanten-DNA-Bindungsstudien bestätigen die Spezifität sowohl der c-JUN:Wildtyp-DNA-Bindungsbedingungen als auch des Laser-Nachweisverfahrens.
Identische Ergebnisse wurden erhalten, als die emittierten Fluoreszenzintensitäten bei drei verschiedenen Integrationszeiten gemessen wurden (Daten nicht gezeigt), was einheitliche Ergebnisse unabhängig von der Integrationszeit demonstriert.
BEISPIEL 2
Volllängen-c-JUN-Protein hat eine Größe von 40 kD oder 340 Aminosäuren. Die DNA-bindende Domäne von c-JUN befindet sich bei den C-terminalen 132 Aminosäureresten von c-JUN (von Glutamin an Rest 209 bis Phenylalanin an Rest 340) und ist in der Lage, an DNA mit ähnlicher Bindungsaffinität wie das Volllängen-Protein zu binden.
2A–2B demonstrieren, dass der Laser-Assay auch eine spezifische Bindung durch ein reines Protein oder Peptid, bestehend aus nur dieser 132 Aminosäuren langen DNA-bindenden Domäne, nachweisen kann. 20 ng, 100 ng und 200 ng von Wildtyp-c-JUN-DNA-Bindungsdomänenpeptid, gebunden an 0,075 pmol Wildtyp JD1F/2F in der Reaktionsmischung mit 50 mM NaCl, resultierte in einer 13%igen, 28%igen bzw. 43%igen Abnahme der Fluoreszenzintensität, verglichen mit der von JD1F/2F alleine emittierten Intensität (2A). Die Tatsache, dass die Bindung von nur 20 ng c-JUN-Peptid an 0,075 pmol DNA zuverlässig nachgewiesen werden konnte, demonstriert die hohe Sensitivität des Laser-Assays. Darüber hinaus ist der Peptid-DNA-Bindungsassay quantitativ, da zunehmende Mengen an c-JUN-Peptid zu einer zunehmend höheren Bindung an Wildtyp-DNA führten.
Im Gegensatz dazu banden 20 ng, 100 ng und 200 ng Wildtyp-c-JUN-Peptid nicht an die Mutante JD3F/4F und führten zu kleineren Zunahmen der Fluoreszenzintensität oberhalb der mit Mutanten-DNA alleine beobachteten (2B), was die Spezifität des Laser-Bindungsassays bestätigt.
Die 43%ige Abnahme der Fluoreszenzintensität, die für 200 ng c-JUN-Peptid, gebunden an JD1F/2 F, beobachtet wurde, ist geringer als die beobachteten Abnahmen von 54 % und 49 % für 1 μg bzw. 0,5 μg Volllängen-c-JUN-Protein, wie vorausgesagt. Man würde erwarten, mit einem Peptid eine geringere statische Quenchung als mit einem Protein voller Länge zu erhalten, da in einem Peptid eine geringere Proteinmasse das ausgesandte Fluoreszenzlicht absorbieren würde.
Beispiel 3
Die Spezifität des Laser-Bindungsassays wurde ferner getestet durch Umsetzung eines Mutanten-c-JUN-DNA-Bindungsdomänenpeptids mit Wildtyp- oder Mutanten-DNA. Spezifische Mutationen in der basischen Domäne von c-JUN eliminieren die DNA-Bindung ohne die Dimerisierung zu beeinflussen, wohingegen spezifische Mutationen in dem Leucin-Reißverschluss sowohl die Dimerisierung als auch die DNA-Bindung verhindern. Die Fluoreszenzspektren, welche bei Umsetzung von 200 ng und 400 ng reinem c-JUN-Mutanten-14-Peptid, das eine Zwei-Aminosäuren-Substitution innerhalb der basischen Domäne von c-JUN aufweist, mit 0,075 pmol Wildtyp JD1F/2F oder Mutante JD3F/4F erhalten wurden, sind in 3A bzw. 3B dargestellt. Keine Abnahme der Fluoreszenzintensität wurde für JD1F/2F oder JD3F/4F beobachtet, selbst wenn ein großer Überschuss an c-JUN-Mutanten-14-Peptid vorlag, was klar die Eliminierung der DNA-Bindung demonstrierte und darüber hinaus die Spezifität des Laser-Bindungsassays belegte.
Beispiel 4
Sp1 gehört zu einer signifikanten Klasse von DNA-bindenden Proteinen, die als Zinkfinger-DNA-Bindungsproteine bezeichnet werden. Siehe beispielsweise Kadonaga et al., "Isolation of cDNA encoding transcription factor Sp1 and functional analysis of the DNA binding domain," 51 Cell 1079-1090 (1987). Sp1 steuert die Transkription einer großen Anzahl viraler und zellulärer Promotoren oder Enhancer, einschließlich des langen terminalen Repeats (LTR) von HIV. Die Anzahl, Beabstandung, Orientierung und Sequenz von Sp1-Bindungsstellen variiert in großem Umfang zwischen Promotoren und führt zu Bindungsstellen mit hoher, mittlerer oder geringer Affinität. Obwohl Sp1 ein relativ großes Protein (95 kD und 105 kD in seiner glycosylierten bzw. phosphorylierten Form) darstellt, ist seine DNA-Bindungsaktivität in der Nähe des C-Terminus des Proteins (von Cystein an Rest 539 bis Histidin an Rest 619) lokalisiert. Diese Region enthält drei zusammenhängende Zn(II)-Finger-Motive, welche Metalloprotein-Strukturen sind, die mit DNA wechselwirken. Die Sequenzspezifität der DNA-Bindung wird vollständig durch die drei Zn(II)-Finger verliehen. Der Finger 3 ist der kritischste Finger (bezüglich der Bindungsaffinität), gefolgt von Finger 2 und schließlich Finger 1. Zwei Cystein- und zwei Histidinreste binden ein Zn(II)-Ion, um jeden Finger zu bilden. Eine Entfernung von Zink bringt die Sekundärstruktur der drei Zinkfinger zum Zusammenbruch. Die Finger in dieser Klasse von DNA-bindenden Proteinen haben eine Consensussequenz von Cys-X_2,4-Cys-X₃-Phe-X₅-Leu-X₂-His-X₃-His, bezeichnet als Cys₂/His₂-Finger. Ein zweiter Typ eines Zn(II)-Finger-Motivs, bezeichnet als Cys₂/Cys₂-Finger in der Form von Cys-X₂-Cys-X₁₃-Cys-X₂-Cys, wird in anderen DNA-bindenden Proteinen, wie z.B. vielen Hormon-Rezeptoren, gefunden.
Ein fluoresceinmarkiertes Wildtyp-dsDNA-Olignucleotid JD11F/112F, enthaltend eine einzelne Consensus-Sp1-DNA-Bindungsstelle von 10 bp, wurde von der Promotorsequenz des humanen Metallothionein-II_A-Gens abgeleitet. Komplementäre 5'-fluoresceinmarkierte ssDNA-20-mere JD11F und JD12F wurden synthetisiert, gereinigt und verschmolzen wie oben.
Sequenz für den Wildtyp JD11F (SEQ-ID-NR. 7):
5'-Flu-CCG GCC GGG GCG GGG CTT TT-3'
Sequenz für den Wildtyp JD12F (SEQ-ID-NR. 8):
5'-Flu-AAA AGC CCC GCC CCG GCC GG-3'
Das Mutanten-dsDNA-20-mer JD13F/14F war in seiner Sequenz identisch mit Wildtyp JD11F/12F, mit Ausnahme einer 6-bp-Änderung (unterstrichen), welche die Consensus-Sp1-Bindungsstelle GGG GCG GGG C in TAA ATA GGG C überführte.
Sequenz für die Mutante JD13F (SEQ-ID-NR. 9):
5'-Flu-CCG GCC TAA ATA GGG CTT TT-3'
Sequenz für die Mutante JD14F (SEQ-ID-NR. 10):
5'-Flu-AAA AGC CCT ATT TAG GCC GG-3'
Die Sp1:DNA-Bindungsreaktionsmischung (30 μl) enthielt folgendes: 25 mM HEPES, pH 7,8, 100 mM KCl, 100 μM ZnSO₄, 1 mM DTT, 20 % (Vol./Vol.) Glycerin, 0,05 μg/μl BSA, 0-200 ng reines Sp1-Protein (Promega) und 0,1 pmol 5'-fluoresceinmarkiertes dsDNA-Oligonucleotid. Die Reaktionsmischungen wurden 15 Minuten lang bei 0° C inkubiert, in eine Quarzküvette eingebracht, mit einem Argonionenlaserstrahl mit einer Wellenlänge von 488 nm bestrahlt und hinsichtlich Fluoreszenzemission überprüft.
4 illustriert die Bindung des Zinkfinger-DNA-Bindungsproteins Sp1 an Wildtyp JD11F/12F oder Mutante JD13F/14F. Wenn 200 ng Sp1 an 0,1 pmol JD11F/12F gebunden wurden, wurde eine 44%ige Abnahme der Fluoreszenzintensität im Vergleich zu dem mit JD11F/12F allein erreichten Intensitätsniveau beobachtet (4A). Ferner konnte die Bindung von 25 ng Volllängen-Sp1-Protein zuverlässig nachgewiesen werden (Daten nicht gezeigt), was die hohe Sensitivität des Laser-Assays demonstriert. Nachdem Sp1 ein relativ großes Protein ist (95 kD), während c-JUN nur eine Größe von 40 kD hat, war bei Sp1-gebundener DNA gegenüber c-JUN-gebundener DNA aufgrund der größeren Absorption und Retention von emittiertem Fluoreszenzlicht durch das größere Protein eine geringere Menge an Protein erforderlich, um eine 44%ige Verringerung der Fluoreszenzintensität zu erzielen.
Wenn 200 ng Sp1 mit 90,1 pmol der Mutante JD13F/14F umgesetzt wurden, wurde keine Abnahme der Fluoreszenzintensität beobachtet (4B), was eine fehlende Bindung von Protein an die mutierte DNA-Sequenz anzeigt. Diese Studien bestätigten die Spezifität des Laser-Nachweisassays für eine vollständig unterschiedliche Klasse von DNA-bindenden Proteinen.
BEISPIEL 5
Dieses Beispiel illustriert das Vermögen der Erfindung zur Untersuchung der Bindung eines Antikörpers, der gegen ein spezifisches Protein gerichtet ist, welches direkt an die markierte DNA-Sequenz gebunden ist. Die Zugabe spezifischer Antikörper zu Protein:DNA-Komplexen (insbesondere Multiprotein:DNA-Komplexen) ist eine Technik, welche zur Identifizierung der Anwesenheit unbekannter Proteine in Protein:DNA-Komplexen verwendet wird. Die Bindung des Antikörpers wird die Bildung des Protein:DNA-Komplexes entweder hemmen oder vollständig verhindern (was zu einer minimalen Abnahme oder keiner Veränderung der Fluoreszenzintensität im Vergleich zu freier DNA führt) oder zu einem Antikörper:Protein:DNA-Komplex führen, welcher die Intensität der Fluoreszenz sogar noch stärker verringert als der Protein:DNA-Komplex.
1 μg, 500 ng und 250 ng c-JUN wurden mit 0, 075 pmol Wildtyp JD1F/2F in der Reaktionsmischung mit 50 mM NaCl oder 50 mM KCl, wie zuvor beschrieben, umgesetzt. Nach einer 15-minütigen Inkubation bei 21° C wurden variable Mengen des monoklonalen IgG₁-Antikörpers c-JUN (KM-1) (von Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, Kalifornien), gerichtet gegen ein Peptid, das den Aminosäuren 56 bis 69 von humanem c-JUN entspricht, zu einigen der c-JUN:DNA-Mischungen zugegeben. Die Reaktionsmischungen wurden weitere 40 Minuten lang bei 21° C inkubiert, in eine Quarzküvette eingebracht, mit einem Argonionenlaserstrahl mit einer Wellenlänge von 488 nm bestrahlt und auf Fluoreszenzemission überprüft.
Die 5A und 5B zeigen die Bindung von 1 μg bzw. 250 ng c-JUN an JD1F/2F in der Reaktionsmischung mit 50 mM NaCl. Wenn 1 μg oder 250 ng c-JUN an JD1F/2F gebunden wurden, wurde eine 25%ige bzw. 11%ige Abnahme der Intensität im Vergleich zu dem mit DNA alleine erzielten Niveau beobachtet. Die Zugabe von 5 μg oder 1 μg c-JUN-Antikörper zu 1 μg c-JUN führte zu einer 42%igen bzw. 37%igen Abnahme (d.h. einer weiteren Abnahme von 17 % und 12 %), welche eine IgG:c-JUN:DNA-Komplexbildung anzeigt (5A). Identische Abnahmen der Intensität wurden beobachtet, wenn c-JUN-Antikörper an 1 μg c-JUN, gebunden an JD1F/2F in der Reaktionsmischung mit 50 mM KCl, gebunden wurde (Daten nicht gezeigt). Gleichermaßen ergab die Zugabe von 750 ng c-JUN-Antikörper zu 250 ng c-JUN, gebunden an JD1F/2F, eine 27%ige Intensitätsabnahme, eine weitere Abnahme von 16 % gegenüber dem Niveau, das mit dem Protein:DNA-Komplex alleine erreicht wurde (5B). IgG:c-JUN-Komplexe banden nicht an Mutanten-DNA-JD3F/4F (Daten nicht gezeigt), was die Spezifität des Laser-Assays bestätigt.
Dieses Beispiel demonstriert, dass das Laser-Nachweisverfahren zwischen einem Antikörper:Protein:DNA-Komplex und einem Protein:DNA-Komplex differenzieren kann. Darüber hinaus bestätigt es das Vermögen der Erfindung zum verlässlichen Nachweis von heterologen Multiprotein-Komplexen, die an DNA gebunden sind, und nicht nur von Monomeren oder Homodimeren von Protein, das an DNA gebunden ist. Nur eines der Proteine in dem Multiprotein:DNA-Komplex muss an DNA gebunden sein. Multiprotein:DNA-Komplexe, in denen mehr als ein Protein mit DNA wechselwirkt, können ebenfalls mit der Erfindung nachgewiesen werden.
Beispiel 6
Das überall vorkommende zelluläre Octamer-Bindungsprotein (Oct-1) bindet DNA direkt über seine charakteristische DNA-Bindungsdomäne, welche sich von den DNA-Bindungsdomänen von c-JUN oder Sp1 vollständig unterscheidet. Oct-1 ist ein Mitglied der POU-Domänen-DNA-Bindungsproteine, welche zellspezifische Transkription und Entwicklung regulieren. Siehe z.B. Sturm et al., "The ubiquitous octamer-binding protein Oct-1 contains a POU domain with a homeo box subdomain", 2 Genes and Development 1582-1599 (1988). Die Struktur der POU-Domäne ist einzigartig unter den DNA-bindenden Domänen, da sie zwei strukturell unabhängige Domänen enthält, welche funktionell als eine einzige DNA-bindende Einheit kooperieren. Oct-1 bindet an DNA über diese POU-Domäne, aufgebaut aus einer POU-spezifischen (POU_S) Domäne von 75 Aminosäuren, einer kurzen Linkerregion von 24 Aminosäuren und einer POU-Typ-Homeo (POU_H)-Domäne von 60 Aminosäuren. Sowohl die POU_S-Domäne als auch die POU_H-Domäne enthalten Helix-Kehre-Helix („helix-turn-helix"; HTH)-Strukturen.
Im Gegensatz zu den Beispielen 1-5, bei denen gereinigtes Protein verwendet wird, werden bei diesem Beispiel HeLa-Zellkernextrakte (von Promega, Madison, Wisconsin) als Quelle für Oct-1 verwendet. Die Verwendung von HeLa-Zellkernextrakten, welche eine große Vielfalt verschiedener DNA-bindender Proteine und Transkriptionsfaktoren enthalten, zeigt die Möglichkeit der Verwendung von rohen Proteinextrakten zum Nachweis von sequenzspezifischer Protein:DNA-Bindung mit dem Laser-Assay der Erfindung.
Ein fluoresceinmarkiertes Wildtyp-dsDNA-Oligonucleotid, JD49F/50F, enthaltend eine einzelne Consensus-Oct-1-DNA-Bindungsstelle von 8 bp, wurde von dem Promotor der schweren Kette von humanem Immunglobulin abgeleitet. Komplementäre 5'-fluoresceinmarkierte ssDNA-18-mere, JD49F und JD50F, wurden synthetisiert, gereinigt und verschmolzen wie oben.
Sequenz für den Wildtyp JD49F (SEQ-ID-NR. 11):
5'-Flu-GAG TAT GCA AAT CAT GTG-3'
Sequenz für den Wildtyp JD50F (SEQ-ID-NR. 12):
5'-Flu-CAC ATG ATT TGC ATA CTC-3'
Das Mutanten-dsDNA-18-mer JD51F/52F war in seiner Sequenz identisch mit dem Wildtyp JD49F/50F, mit Ausnahme einer doppelten Punktmutation (A₁T₂-CG) (unterstrichen), welche die POU_S-Bindungsstelle inaktivierte, und einer zweiten doppelten Punktmutation (A₆A₇-CC) (unterstrichen), welche die POU_H-Bindungsstelle inaktivierte, und die damit die Consensus-Oct-1-Bindungsstelle ATGCAAAT in CGGCACCT überführten.
Sequenz für die Mutante JD51F (SEQ-ID-NR. 13):
5'-Flu-GAG TCG GCA CCT CAT GTG-3'
Sequenz für die Mutante JD52F (SEQ-ID-NR. 14):
5'-Flu-CAC ATG AGG TGC CGA CTC-3'
Die Oct-1:DNA-Bindungsreaktionsmischung (30 μl) enthielt folgendes: 9,25 mM HEPES, pH 7,9, 2,23 mM MgCl₂, 0,03 mM EDTA, 63 mM NaCl, 1,0 mM DTT, 3,75 % (Vol./Vol.) Glycerin, 0,10 mg/ml BSA, 0,01 mM PMSF, 67 μg/ml Poly(dl)-Poly(dC), 67 μg/ml Poly(dG-dC)-Poly(dG-dC), 0-15 μg HeLa-Zellkernextrakt (Promega) und 0,05 pmol 5'-fluoresceinmarkiertes dsDNA-Oligonucleotid. Die relativ hohen Konzentrationen an Poly(dl)-Poly(dC) und Poly(dG-dC)-Poly(dG-dC) sind erforderlich, um eine sequenzspezifische Protein-DNA-Bindung sicher zu stellen, wenn rohe nukleäre Proteinextrakte verwendet werden. Die Reaktionsmischungen wurden 30 Minuten lang bei 21° C inkubiert, in eine Quarzküvette eingebracht, mit einem Argonionenlaserstrahl mit einer Wellenlänge von 488 nm bestrahlt und hinsichtlich Fluoreszenzemission überprüft.
Die erhaltenen Fluoreszenzspektren, wenn 10 μg HeLa-Zellkernextrakt mit 0,05 pmol Wildtyp JD49F/50F oder 0,05 pmol der Mutante JD51F/52F umgesetzt wurden, sind in den 6A bzw. 6B gezeigt. Das in dem HeLa-Zellkernextrakt vorhandene Oct-1-Protein band spezifisch an die hoch affine Wildtyp-Oct-1-Bindungsstelle und führte zu einer 22%igen Abnahme der Fluoreszenzintensität im Vergleich zu dem mit JD49F/50F allein beobachteten Niveau (6A). Im Gegensatz dazu band Oct-1 nicht an die Mutante JD51F/52F, wie angezeigt durch die Zunahme der Fluoreszenzintensität oberhalb derjenigen, welche mit Mutanten-DNA alleine beobachtet wurde (6B), was die Sequenzspezifität des Laser-Bindungsassays bestätigt. Diese Experimente demonstrierten die Spezifität des Laser-Nachweisassays für eine weitere vollständig unterschiedliche Klasse von DNA-bindenden Proteinen.
Darüber hinaus bestätigte dieses Beispiel, dass eine spezifische Protein:DNA-Bindung zuverlässig mit der Erfindung gemessen werden kann, sogar wenn rohe HeLa-Zellkernextrakte verwendet werden, welche hunderte von anderen DNA-bindenden Proteinen enthalten. Die Spezifität wird durch die Wahl der geeignet markierten DNA-Sequenz verliehen, welche das speziell zu untersuchende DNA-bindende Protein erkennt.
BEISPIEL 7
Dieses Beispiel demonstriert klar, dass das Verfahren der Erfindung die Bindung eines Multiprotein-Komplexes (bestehend aus zwei oder mehr verschiedenen Proteinen) an eine (oder mehrere) Bindungsstelle(n) auf einer DNA-Sequenz messen kann. Studien wurden durchgeführt hinsichtlich der Bindung der humanen zellulären Proteine Octamer-Bindungsprotein (Oct-1) und Wirtszellfaktor (HCF, siehe beispielsweise Wilson et al., "The VP16 accessory protein HCF is a family of polypeptides processed from a large precursor protein", 74 Cell 115-125 (1993)) mit dem Herpes-Simplex-Virus Typ 1(HSV-1)-Protein VP16 (oder Vmw65) an die DNA-Sequenz TAATGARAT (wobei R ein Purin ist). Dieser Multiprotein:DNA-Komplex wird als der "immediate early complex" (IEC) oder VP16-induzierte Komplex bezeichnet. Obwohl VP16 der wirksamste jemals identifizierte Transaktivator von Genen ist, kann er alleine DNA nicht effizient binden. Statt dessen wechselwirkt er spezifisch mit Oct-1 und HCF, um Gene zu induzieren. VP16 bindet an Oct-1 und HCF über seine aminoterminalen 411 Aminosäuren. Die C-terminale hochsaure Domäne von VP16, definiert durch die Aminosäuren 411 bis 490, wirkt als die wirksame transkriptionale Aktivierungsregion. Siehe beispielsweise Dalrymple et al., "DNA sequence of the herpes simplex virus type 1 gene whose product is responsible for transcriptional activation of immediate early promoters", 13 Nucleic Acids Research 7865-7879 (1985).
Oct-1 bindet an DNA über seine zweiteilige POU-Domäne, welche in der Lage ist, eine außerordentliche Flexibilität der DNA-Sequenzerkennung zu zeigen. Die Oct-1-POU-Domäne bindet an die Octamer-Sequenz ATGCAAAT als Monomer, wobei die POU_S-Domäne die 5'-Hälfte dieser Stelle (ATGC) kontaktiert und die POU_H-Domäne mit der 3'-Hälfte dieser Stelle (AAAT) auf entgegengesetzten Seiten der DNA wechselwirkt. Wenn Oct-1 an die hochaffine Bindungsstelle ATGCAAAT gebunden ist, ist es nicht in der Lage, mit VP16 zu wechselwirken.
Oct-1 bindet auch an DNA-Stellen, welche wenig Ähnlichkeit mit dem Octamer-Consensus haben. Beispielsweise kann Oct-1 allein oder in Assoziation mit HCF und VP16 die DNA-Sequenz TAATGARAT binden, welche so wenig wie 4 von 8 Basenpaaren Übereinstimmung mit der Octamer-Consensusstelle aufweist. Zwei Formen der TAATGARAT-Stelle werden in den Promotorsequenzen der "immediate early"-Gene des Herpes Simplex-Virus (HSV-IE-Gene) gefunden. Die erste, bezeichnet als das (OCTA⁺)TAATGARAT-Motiv, enthält eine überlappende Octamer/TAATGARAT-Sequenz, welche Oct-1 mit hoher Affinität bindet. Der zweiten, bezeichnet als (OCTA^–)TAATGARAT, fehlt eine überlappende Octamer-Sequenz und diese bindet Oct-1 mit relativ geringer Affinität. Die POU_H-Domäne von Oct-1 bindet die 5'-TAAT-Sequenz, während die POU_S-Domäne die GARAT-Sequenz auf der (OCTA^–)TAATGARAT-Stelle bindet. Auf der (OCTA⁺)TAATGARAT-Bindungsstelle bleibt die POU_H-Domäne an der TAAT-Sequenz fixiert, während die POU_S-Domäne entweder die 5'-ATGC-Sequenz oder das 3'-GARAT-Element binden kann. Die Oct-1-POU_H-Domäne ist ausreichend für die Wechselwirkung mit VP16.
Das HCF ist erforderlich zur Stabilisierung der Assoziation von Oct-1 mit VP16 auf einer TAATGARAT-Stelle, indem zuerst ein stabiler Komplex mit VP16 unabhängig von Oct-1 oder dem TAATGARAT-Element gebildet wird. Der genaue Mechanismus, über den HCF die VP16-Assoziation mit Oct-1 stabilisiert, ist unbekannt. Das HCF könnte eine Konformationsänderung innerhalb von VP16 induzieren, welche VP16 zur Wechselwirkung mit Oct-1 und dem GARAT-Element der TAATGARAT-Stelle veranlasst. Alternativ könnte das HCF innerhalb des IEC-Komplexes Oct-1 oder DNA kontaktieren und somit dem Komplex eine größere Stabilität verleihen.
Ein fluoresceinmarkiertes Wildtyp-dsDNA-Oligonucleotid, JD41F/42F, enthaltend eine (OCTA^–)TAATGARAT-Stelle, wurde von einer 20-bp-Region (–343 bis –324) von dem HSV-1-IE-Gen-4/5-Promotor abgeleitet. Komplementäre 5'-fluoresceinmarkierte ssDNA-20-mere JD41F und JD42F wurden synthetisiert, gereinigt und verschmolzen wie oben.
Sequenz für den Wildtyp JD41F (SEQ-ID-NR. 15):
5'-Flu-GGC GGT AAT GAG ATA CGA GC-3'
Sequenz für den Wildtyp JD42F (SEQ-ID-NR. 16):
5'-Flu-GCT CGT ATC TCA TTA CCG CC-3'
Das Mutanten-dsDNA-20-mer JD43F/44F war in der Sequenz identisch mit dem Wildtyp JD41F/42F, mit Ausnahme einer doppelten Punktmutation (A₂A₃ → CC) (unterstrichen), welche die POU_H-Bindungsstelle inaktivierte, und einer zweiten doppelten Punktmutation (A₈T₉ → CG) (unterstrichen), welche die POU_S-Bindungsstelle inaktivierte, und die dadurch die Oct-1-Bindungsstelle TRATGAGAT in TCCTGAGCG überführten.
Sequenz für die Mutante JD43F (SEQ-ID-NR. 17):
5'-Flu-GGC GGT CCT GAG CGA CGA GC-3'
Sequenz für die Mutante JD44F (SEQ-ID-NR. 18):
5'-Flu-GCT CGT CGC TCA GGA CCG CC-3'
Ein fluoresceinmarkiertes Wildtyp-dsDNA-Oligonucleotid, JD45F/46F, enthaltend eine (OCTA⁺)TAATGARAT-Stelle, wurde von einer 23-bp-Region (–170 bis –148) aus dem HSV-1-IE-Gen-I-Promotor abgeleitet. Komplementäre 5'-fluoresceinmarkierte ssDNA-23-mere, JD45F und JD46F, wurden synthetisiert, gereinigt und verschmolzen wie oben.
Sequenz für den Wildtyp JD45F (SEQ-ID-NR. 19):
5'-Flu-GTG CAT GCT AAT GAT ATT CTT TG-3'
Sequenz für den Wildtyp JD46F (SEQ-ID-NR. 20):
5'-Flu-CAA AGA ATA TCA TTA GCA TGC AC-3'
Mutanten-dsDNA-23-mer JD47F/48F war in der Sequenz identisch mit dem Wildtyp JD45F/46F, mit Ausnahme einer doppelten Punktmutation (A₆A₇ → CC) (unterstrichen), welche die POU_H-Bindungsstelle inaktivierte, und zweier zusätzlicher doppelter Punktmutationen (A₁T₂ → CG) und (A₁₂T₁₃ → CG) (unterstrichen), welche die beiden POU_S-Bindungsstellen inaktivierten, wodurch die Oct-1-Bindungsstelle ATGCTAATGATAT in CGGCTCCTGATCG überführt wurde.
Sequenz für die Mutante JD47F (SEQ-ID-NR. 21):
5'-Flu-GTG CCG GCT CCT GAT CGT CTT TG-3'
Sequenz für die Mutante JD48F (SEQ-ID-NR. 22):
5'-Flu-CAA AGA CGA TCA GGA GCC GGC AC-3'
Die Oct-1-HCF:VP16-DNA-Bindungsreaktionsmischung (30 μl) enthielt folgendes: 9,25 mM HEPES, pH 7,9, 2,23 mM MgCl₂, 0,03 mM EDTA, 63 mM NaCl, 1,0 mM DTT, 3,75 % (Vol./Vol.) Glycerin, 0,10 mg/ml BSA, 0,01 mM PMSF, 133 μg/ml Poly(dI)-Poly(dC), 67 μg/ml Poly(dG-dC)-Poly(dG-dC), 0-25 μg HeLa- Zellkernextrakt (Promega), 0-0,1 μg HSV-1-Virionenextrakt und 0,025 pmol 5'-fluoresceinmarkiertes dsDNA-Oligonucleotid. Der HSV-1-Virionenextrakt, enthaltend 80 % reines VP16, wurde freundlicherweise von Dr. Chris Preston (MAC Institute of Virology, Glasgow, Schottland) zur Verfügung gestellt. HeLa-Zellkernextrakte dienten als Quelle für Oct-1 und HCF. Alle Komponenten mit Ausnahme der DNA und des Virionenextrakts wurden 10 Minuten lang bei 21° C inkubiert. Dann wurde DNA zugegeben, gefolgt von der Zugabe des HSV-1-Virionenextrakts (wo angebracht). Die Reaktionsmischungen wurden weitere 30 Minuten lang bei 21° C inkubiert, in eine Quarzküvette eingebracht, mit einem Argonionenlaserstrahl mit einer Wellenlänge von 488 nm bestrahlt und hinsichtlich Fluoreszenzemission überprüft.
Das Oct-1-Protein, das in 10 μg und 20 μg HeLa-Zellkernextrakt vorhanden war, band spezifisch an 0,025 pmol Wildtyp 3D41F/42F, was zu einer 10%igen bzw. 43%igen Abnahme der Fluoreszenzintensität im Vergleich zu dem mit JD41F/42F alleine erreichten Niveau führte (7A). Die niedrige DNA-Menge von 0, 025 pmol war in einem molaren Überschuss zu der Menge an Oct-1 vorhanden, die in dem HeLa-Zellkernextrakt vorlag. Die Beobachtung, dass 10 μg HeLa-Zellkernextrakt eine 22%ige Abnahme der Fluoreszenzintensität ergaben, wenn Oct-1 an 0,05 pmol seiner hoch affinen JD49F/50F-Bindungsstelle gebunden wurde (in Beispiel 6), wohingegen die selbe Menge an HeLa-Zellkernextrakt nur zu einer 10%igen Abnahme der Fluoreszenzintensität führte, wenn Oct-1 an 0,025 pmol seiner wenig affinen JD41F/42F-Bindungsstelle gebunden wurde (welche im molaren Überschuss zu der anwesenden Menge an Oct-1 vorlag), verifizierte das Vermögen des Laser-Bindungsassays zur Unterscheidung zwischen hoch affinen und wenig affinen DNA-Bindungsstellen für das selbe Protein.
Wenn 0,1 μg VP16 der Oct-1:JD41F/42F-Reaktions-Mischung zugegeben wurde, wurde eine 20%ige Abnahme der Fluoreszenzintensität beobachtet, was eine weitere 10%ige Verringerung von dem Niveau darstellt, das mit dem Oct-1:JD41F/42F-Komplex alleine erzielt wurde (7A). Diese zusätzliche Abnahme ergab sich aus der Multiprotein-Oct-1:HCF:VP16:JD41F/42F-Komplexbildung, welche in der Lage war, mehr ausgesandtes Fluoreszenzlicht zu absorbieren und zurückzuhalten als der Einzelprotein-Oct-1:JD41F/42F-Komplex.
Keine Abnahme der Fluoreszenzintensität wurde beobachtet, wenn 10 μg oder 20 μg HeLa-Zellkernextrakt in Abwesenheit oder Anwesenheit von VP16 mit 0,025 pmol der Mutante JD43F/44F umgesetzt wurden, was eine fehlende Bindung von Oct-1 oder Oct-1:HCF:VP16-Komplex an die mutierte DNA-Sequenz anzeigt (7B). Diese Mutanten-DNA-Bindungsstudien bestätigten die Spezifität des Laser-Nachweisverfahrens für die Messung spezifischer Multiprotein:DNA-Komplexbildung unter Verwendung roher Kernextrakte.
Wenn 10 μg HeLa-Zellkernextrakt mit 0,025 pmol Wildtyp JD45F/46F umgesetzt wurden, trat eine 32%ige Abnahme der Fluoreszenzintensität im Vergleich zu der mit JD45F/46F alleine beobachteten Fluoreszenzintensität auf (8A). Diese relativ große Abnahme der Intensität ist eine Funktion des Vermögens von Oct-1 zur Bindung mit hoher Affinität an die (OCTA⁺)TAATGARAT-Stelle.
Die Zugabe von 0,1 μg VP16 zu 10 μg HeLa-Zellkernextrakt und 0,025 pmol Wildtyp JD45F/46F führte zu einer 69%igen Abnahme der Fluoreszenzintensität, was eine weitere Abnahme von 37 % gegenüber dem mit dem Oct-1:JD45F/46F-Komplex allein erhaltenen Intensitätsniveau darstellte (8A). Nachdem Oct-1, HCF und VP16 eine Größe von 110 kD, 300 kD bzw. 65 kD aufweisen, ist die riesige Abnahme von 69 % eine direkte Folge einer hocheffizienten Multiprotein-Oct-1:HCF:VP16-Bindung an die (OCTA⁺)TAATGARAT-Stelle, die in JD45F/46F vorliegt.
Im Gegensatz dazu wurde keine Abnahme der Fluoreszenzintensität beobachtet, wenn 10 μg HeLa-Zellkernextrakt in Abwesenheit oder Anwesenheit von 0,1 μg VP16 mit 0,025 pmol der Mutante JD47F/48F umgesetzt wurden (8B), was klar eine Eliminierung der DNA-Bindung an die mutierte DNA-Sequenz anzeigt und ferner die Spezifität des Laser-Bindungsassays belegt.
Dieses Beispiel demonstriert klar, dass das Verfahren der Erfindung reproduzierbar die spezifische Bindung eines Multiprotein-Komplexes (bestehend aus zwei oder mehr verschiedenen Proteinen) an eine (oder mehrere) Bindungsstelle(n) auf einer DNA-Sequenz messen kann, wenn rohe Zellkernextrakte verwendet werden. Ferner kann der Laser-Bindungsassay die Affinität eines spezifischen Proteins oder eines Multiprotein-Komplexes zu irgend einer gegebenen DNA-Sequenz evaluieren.
Wie durch die Beispiele demonstriert, ist die Erfindung auf alle Klassen von DNA-bindenden Proteinen anwendbar. Beispielsweise wird, wenn das Onkoprotein c-JUN an seine spezifische DNA-Erkennungsstelle bindet, eine 55%ige Abnahme an Messeinheiten im Vergleich zu dem durch ungebundene DNA erreichten Niveau beobachtet (1A und 1B). Keine Abnahme wird beobachtet, wenn c-JUN mit einer Mutanten-DNA-Sequenz umgesetzt wird (1C und 1D), was eine fehlende Bindung anzeigt und die Spezifität des Nachweisverfahrens bestätigt.
Ferner kann die spezifische Bindung von Peptiden, welche nur die DNA-bindende Domäne des Proteins enthalten, in quantitativer Weise nachgewiesen werden. Beispielsweise führen 20 ng, 100 ng und 200 ng c-JUN-Peptid, gebunden an Wildtyp-DNA, zu 13%igen, 28%igen bzw. 43%igen Abnahmen im Vergleich zu dem für freie DNA beobachteten Niveau (2A). Die Tatsache, dass die Bindung von nur 20 ng c-JUN-Peptid zuverlässig gemessen werden kann, demonstriert die hohe Sensitivität des Nachweisassays. Im Gegensatz dazu binden 20 ng, 100 ng und 200 ng c-JUN-Peptid Mutanten-DNA nicht und führen zu kleineren Erhöhungen oberhalb des mit Mutanten-DNA alleine beobachteten Niveaus (2B). Die Bindung von Peptiden anstelle von Volllängen-Proteinen kann von speziellem Interesse für die Entwicklung und/oder das Screenen von Pharmazeutika sein.
Die Spezifität des Nachweisassays wurde weiter getestet durch Umsetzung eines Mutanten-c-JUN-DNA-Bindungsdomänenpeptids mit Wildtyp- (3A) oder Mutanten-DNA (3B). Keine Abnahme wurde beobachtet, selbst wenn ein riesiger Überschuss an c-JUN-Mutanten-l4-Peptid vorlag, was klar eine Eliminierung der DNA-Bindung demonstriert und weiter die Spezifität des Assays belegt.
4A bzw. 4B illustrieren die Bindung des Zinkfinger-DNA-Bindungsproteins Sp1 an Wildtyp- bzw. Mutanten-DNA-Bindungsstellen. Wenn 200 ng Sp1 an Wildtyp-DNA gebunden sind, wird eine 44%ige Abnahme im Vergleich zu dem mit DNA alleine gemessenen Niveau beobachtet. Keine Bindung von 200 ng Sp1 wird für die mutierte DNA-Sequenz beobachtet.
Der Laser-Nachweisassay kann zwischen einem Antikörper:Protein:DNA-Komplex und einem Protein:DNA-Komplex differenzieren. Beispielsweise wurde eine 42%ige und 37%ige Abnahme der Fluoreszenzintensität beobachtet, wenn 5 μg bzw. 1 μg c-JUN-Antikörper an 1 μg c-JUN, komplexiert mit Wildtyp-DNA, gebunden wurden, im Vergleich zu der 25%igen Abnahme, die für c-JUN:DNA-Komplexe erhalten wurde (5A). IgG:c-JUN-Komplexe banden nicht an Mutanten-DNA-Sequenzen.
Die 6, 7 und 8 illustrieren die Bindung des DNA-Bindungsproteins Oct-1 mit der zweiteiligen POU-Domäne an drei verschiedene DNA-Sequenzerkennungsstellen mit unterschiedlichen Bindungsaffinitäten. Darüber hinaus belegen die Beispiele 6-7 die Möglichkeit der Verwendung von rohen nukleären Proteinextrakten als Quelle von DNA-bindenden Proteinen, während immer noch eine hochspezifische Protein-DNA-Bindung erhalten wird. In Abhängigkeit von der Bindungsaffinität einer jeden DNA-Stelle banden 10 μg von HeLa-Zellkernextrakten Wildtyp-Oct-1-DNA-Bindungsstellen mit einer 10%igen, 22%igen oder 32%igen Abnahme im Vergleich zu den mit ungebundener DNA erzielten Niveaus.
Signifikanterweise kann das Verfahren der Erfindung die Bindung von Multiprotein-Komplexen (bestehend aus zwei oder mehr verschiedenen Proteinen) an eine (oder mehrere) DNA-Bindungsstelle(n) zuverlässig messen, wenn reine Proteine oder rohe Zellkernextrakte verwendet werden. Beispielsweise ergaben Oct-1:HCF:VP16:DNA-Komplexe eine 69%ige bzw. 20%ige Abnahme der Fluoreszenzintensität, wenn sie an eine hoch affine (OCTA⁺)TAATGARAT-Stelle oder eine wenig affine (OCTA^–)TAATGARAT-Stelle banden (8 und 7). Keine Bindung von Oct-1-Protein oder Oct-1:HCF:VP16-Protein-Komplex wird für alle mutierten DNA-Sequenzen beobachtet.
Multiprotein:DNA-Komplexe sind in der Natur wesentlich häufiger und biologisch bedeutsamer als Einzelprotein:DNA-Komplexe. Das Vermögen des erfindungs gemäßen Verfahrens zur Verwendung roher nukleärer Proteinextrakte für die Prüfung einer Einzelprotein- oder Multiprotein-Bindung an DNA auf hochspezifische Weise ist von großer klinischer Bedeutung.
Sequenzprotokoll

Claims

Verfahren zum Prüfen einer speziellen Bindung zwischen mindestens einer fluorophormarkierten Verbindung und mindestens einer unmarkierten Verbindung, wobei mindestens eine fluorophormarkierte Verbindung i) eine markierte Nucleinsäure ist, an die ein Fluorophor kovalent gebunden ist und diese mindestens eine unmarkierte Verbindung ein unmarkiertes Protein darstellt, oder ii) ein markiertes Protein ist und die genannte mindestens eine unmarkierte Verbindung eine unmarkierte Nucleinsäure ist, wobei das Verfahren folgende Stufen umfaßt: • Bereitstellen eines Testmediums, das die mindestens eine fluorophormarkierte Verbindung und die mindestens eine unmarkierte Verbindung enthält, wobei das Testmedium keinen zugesetzten Signalquencher enthält; • Bestrahlen des Testmediums mit einer Strahlung, die bewirkt, daß die mindestens eine fluorophormarkierte Verbindung ein Fluoreszenzlicht aussendet; • Erfassen der Intensität des von dem Testmedium ausgesandten Fluoreszenzlichts; • Vergleichen der Fluoreszenzintensität des genannten Fluoreszenzlichts mit einer Bezugsfluoreszenzintensität eines Bezugsmediums, wobei die genannte Quenchwirkung und die genannte spezielle Bindung aufgefunden werden, wenn die erwähnte Fluoreszenzintensität geringer ist als die Bezugsfluoreszenzintensität.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die markierte Nucleinsäure oder die unmarkierte Nucleinsäure aus dsDNA, ssDNA, RNA, ssRNA, dsRNA, mRNA, hnRNA, tRNA, rRNA, ssDNA:RNA-Hybriden, dsDNA:RNA-Hybriden, Nucleinsäureanalogen und Oligonucleotiden ausgewählt sind.
Verfahren nach Anspruch 2, worin das Protein in Form eines gereinigten Präparats, eines synthetisierten Präparats, eines halbgereinigten Proteinextrakts, eines Rohproteinextrakts oder eines in-vitro-Translationspräparat bereitgestellt wird.
Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, worin die mindestens eine unmarkierte Verbindung ein Peptid, Polypeptid, Protein oder Multiprotein-Komplex ist.
Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, welches ferner das Bestimmen der Bindungsaffinität der mindestens einen markierten Verbindung gegenüber einer Mehrzahl von verschiedenen unmarkierten Verbindungen umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 5, worin die mindestens eine markierte Verbindung die erwähnte markierte Nucleinsäure und die Mehrzahl von verschiedenen unmarkierten Verbindungen Proteine sind.
Verfahren nach Anspruch 6, welches ferner das Auswählen eines Arzneimittelkandidaten aus der genannten Mehrzahl von verschiedenen unmarkierten Proteinen auf der Basis der erwähnten Bindungsaffinitätsbestimmung umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 6, welches ferner das Auswählen eines Gensuppressions- oder -aktivierungsmittels aus der Mehrzahl von verschiedenen unmarkierten Proteinen auf der Basis der erwähnten Bindungsaffinitätsbestimmung umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 6, welches das Vergleichen der Bindungsaffinitäten der Mehrzahl der verschiedenen unmarkierten Proteine zum Bestimmen, ob die genannten Proteine äquivalent binden, umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die mindestens eine fluorophormarkierte Verbindung die genannte markierte Nucleinsäure ist und die mindestens eine unmarkierte Verbindung aus mindestens zwei Proteinen besteht, die mit der erwähnten markierten Nucleinsäure einen Multiproteinkomplex bilden.
Verfahren nach Anspruch 10, worin der Multiproteinkomplex mindestens zwei Proteine enthält, die jeweils an mindestens zwei benachbarte Stellen an der genannten markierten Nucleinsäure gebunden sind, und das Verfahren ferner die Bestimmung umfaßt, ob die mindestens zwei Proteine an die mindestens zwei benachbarten Stellen unabhängig, kooperativ oder synergistisch gebunden sind.
Verfahren nach Anspruch 10, worin der Multiproteinkomplex die genannten mindestens zwei Proteine enthält, die jeweils an mindestens zwei Stellen an der markierten Nucleinsäure gebunden sind, wobei die genannten zwei Stellen durch intervenierende Nucleinsäuresequenzen getrennt sind, die eine Schleife bilden, wenn die zwei gebundenen Proteine miteinander in Wechselwirkung treten.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die mindestens eine fluorophormarkierte Verbindung eine Nucleinsäure ist und das Verfahren ferner das Auffinden einer Bindung einer proteinbindenden Verbindung an das genannte unmarkierte Protein umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 13, worin die proteinbindende Verbindung ein Antikörper ist, der speziell gegen das genannte unmarkierte Protein gerichtet ist.
Verfahren nach Anspruch 14, worin die Protein-Antikörper-Bindung aufgefunden wird, wenn die Fluoreszenzintensität durch die erwähnte Bindung des Antikörpers an das unmarkierte Protein und des unmarkierten Proteins an die markierte Nucleinsäure gequencht wird.
Verfahren nach Anspruch 14, worin die Protein-Antikörper-Bindung aufgefunden wird, wenn die Fluoreszenzintensität nicht gequencht wird, wobei das Fehlen des Quenchens anzeigt, daß ein Protein-Antikörper-Komplex gebildet und eine Bindung der markierten Nucleinsäure an das unmarkierte Protein verhindert worden ist.
Verfahren nach Anspruch 1, welches ferner das Durchführen einer kompetitiven Prüfung zwischen der markierten Nucleinsäure und der mindestens einen fluorophorfreien Nucleinsäure durch Zugabe der fluorophorfreien Nucleinsäure zu dem genannten Testmedium durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die mindestens eine unmarkierte Verbindung eine Mutante ist.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die mindestens eine markierte Verbindung eine Mutante ist.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die mindestens eine unmarkierte Verbindung ein Mutantenprotein innerhalb eines Multiproteinkomplexes ist, wobei die mindestens eine unmarkierte Verbindung eine Bindung eines anderen Proteins an die mindestens eine fluorophormarkierte Verbindung verhindert.
Verfahren nach Anspruch 4, worin die mindestens eine unmarkierte Verbindung durch eine Phosphorylierung, eine Glycosylierung oder eine Wechselwirkung mit Metallionen modifiziert ist.
Verfahren nach Anspruch 5, welches ferner das mit einem Proteinextrakt erfolgende Identifizieren der Anwesenheit eines funktionellen Proteins oder Multiproteinkomplexes umfaßt, das bzw. der während verschiedener metabolischer Zustände der Proteinextraktherstellung DNA binden kann.
Verfahren nach Anspruch 6, worin die markierte Nucleinsäure modifiziert ist.
Verfahren nach Anspruch 23, worin die markierte Nucleinsäure methyliert ist.