TWI235766B

TWI235766B - Fluorescent intensity assaying method for protein or peptide binding to nucleic acids

Info

Publication number: TWI235766B
Application number: TW088123389A
Authority: TW
Inventors: Jasmine I Daksis; Glen H Erikson
Original assignee: Lorne Park Res Usa Llc
Priority date: 1998-12-31
Filing date: 2000-01-25
Publication date: 2005-07-11
Also published as: JP2002534664A; ATE290607T1; US6294333B1; EP1141392B1; CA2358065A1; EP1141392A1; CA2358065C; JP3959438B2; WO2000040753A1; AU1791100A; DE69924147D1; AU771451B2; DE69924147T2

Description

A7 1235766 五、發明説明（/ ) 發明領域本發明是有關於生物聚合物結合分析，更特別地，是有關於使用螢光強度數據以分析在核酸及肽類或蛋白質之間的結合之方法。發明背景蛋白質-核酸複合體是已知在許多生物性過程中扮演重要的角色。例如，參見Hill等人“以螢光的方法硏究蛋白質-核酸複合作用”，卷278，酵素學方法，頁390 ( 1997 )。例如，DNA-結合蛋白是已知在基因調控中扮演重要的角色。基因典型地是藉由DNA-結合蛋白而在轉錄的層次上受到調控，這些DNA-結合蛋白則稱爲轉錄因子。轉錄因子藉由在啓動子DNA中專一性地結合至標的核酸序列而調控基因的表現。由於蛋白質-核酸交互作用的生物重要性，所以許多用以硏究蛋白質-核酸結合特性之方法因而被提出。例如，參見Hill等人以及其中所引用的參考文獻。

Verdine之美國專利第5,783,384號，揭露用於測定 DNA結合蛋白對於標的核酸序列之親和力的方法。 Verdine所指示的方法包括··在DNA結合蛋白與標的核酸序列之間，提供一可逆的鍵結；以及在監督的條件下，藉由將此鍵結打斷而測定可逆鍵結的相對強度（並因此測定蛋白質對於核酸的親和力）。用於打斷此鍵結所需之條件愈嚴格的話，則蛋白質對於核酸就有愈高的親和力。但 Verdine並沒有揭露或建議以螢光爲基礎的結合分析法。 ________ 4 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格(210X297公釐) ' ~ -------1 |_-ΙΦ-----:111.------蟀 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1235766 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（））

Royer之美國專利第5,445,935號，揭露以螢光爲基礎 ’用以硏究蛋白質-寡核苷酸結合的方法；然而，本發明的指τκ僅限定於蛋光非等方性（anis〇tr〇py)的技術。基本上，非等方性是測量自由DNA或蛋白質結合的DNA之旋轉的擴散，以及藉由一連接臂而貼附至DNA的螢光原（ fluorophore)之局部移動。自由的DNA快速地旋轉，將光更容易地退極化，並且顯示一低的非等方性數値。相對地 ’蛋白質結合的DNA緩慢地旋轉（相對於螢光原的壽命），僅輕微地將光退極化，並因此顯示一相當高的非等方性數値。然而，以非等方性爲基礎的分析存在有明顯的缺點。非等方性改變的程度，如同結合函數一般，並非如同主張以非等方性爲基礎的方法之擁護者一樣可預測。非等方性數據之解釋，使得不一致的數據能符合理論的期望，是較在分析方法中所需者需要更多的努力，特別是當此方法要自動化時。輻射活性的標記仍是用於分析蛋白質-核酸交互作用之最普遍的方法，儘管它是相當地緩慢、對健康及環境有危險以及相當地勞力密集。習知之輻射活性的標記方法，典型地需要輻射活性末端標記的DNA探針與32磷（32P)，使用特定的酵素。從未倂入的32P中純化標記的DNA，牽涉到聚丙烯醯胺凝膠電泳、隔夜的洗脫（elution)、凝膠過濾以及濃縮等步驟。因爲32P的半衰期僅有14天，因此大約每3個星期就需要對每個探針輻射標記一次。此外， 5 本I張尺度適用中國國家標準( CNS ) A4規格（210X297公釐） — I---------------訂------ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁} A7 1235766 五、發明說明（）耳突變型JD3F/4F之螢光光譜。圖2A顯示在50mM NaCl反應混合物中0奈克，20奈克，100奈克及200奈克野生型c-Jim之DNA結合區域與 0.075微微莫耳野生型JD1F/2F之螢光光譜。圖2B顯示在50mM NaCl反應混合物中0奈克，20奈克，100奈克及200奈克野生型c-Jun之DNA結合區域與 0.075微微莫耳突變型JD3F/4F之螢光光譜。圖3A及3B係0奈克，200奈克及400奈克在c-Jun 之鹼性區域有兩個胺基酸取代之純c-JTim突變14肽與〇·〇75微微莫耳野生型JD1F/2F(圖3A)或突變型JD3F/4F( 圖3B)進行反應所得之螢光光譜。圖4A及4B顯示200奈克之鋅指DNA結合蛋白Spl 結合至野生型JD11F/12F或突變型JHD13F/14F之螢光光譜〇圖5A及汩顯示在含0，750奈克，1微克或5微克 IgG之50mM NaCl反應混合物中1微克或250奈克oJim 結合至JD1F/2F之螢光光譜。圖6A及6B係1〇微克HeLa細胞核抽取物分別與 °·05微微莫耳野生型JD49F/50F(圖3A)或突變型 JD51F/52F(圖3B)進行反應所得之螢光光譜。圖7A顯示0，1〇微克及20微克含Oct-Ι蛋白之HeU 細胞核抽取物，0及〇·1微克VP16，及0·〇25微微莫耳野生型JD41F/42F之混合物之螢光光譜。

圖7Β顯示〇，1〇微克及20微克含〇ct-l蛋白之HeU 本紙張尺度適ϋ國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公H ' 〜 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) Φ 1235766 A7 ____B7____ 五、發明說明（）細胞核抽取物，〇及0.1微克vpl6，及0.025微微莫耳野生型JD43F/44F之混合物之螢光光譜。圖8A顯示0，10微克及20微克含〇ct-i蛋白之HeLa 細胞核抽取物，〇及0.1微克VP16，及0.025微微莫耳野生型JD45F/46F之混合物之螢光光譜。圖8B顯示0，10微克及20微克含Oct-Ι蛋白之HeLa 細胞核抽取物，0及0.1微克VP16，及〇·〇25微微莫耳野生型JD47F/48F之混合物之螢光光譜。較佳具體實施例之詳細說明本發明提供一種用於分析在至少一種蛋白質序列以及至少一種核酸序列之間的特定結合之方法，其中該至少一種蛋白質序列及/或該至少一種核酸序列包含至少一種螢光原。此方法包括：偵測導源於特定結合以形成至少一種蛋白質-核酸複合體之至少一種螢光原上的螢光強度淬滅效應‘ 。較佳地，在結合至該至少一種蛋白質的序列之前，此螢光原是貼附至該至少一種核酸的序列上。不像螢光非等方性的程度，當蛋白質結合至DNA或 RNA寡核苷酸時，此程度會增加'，當複合體形成時，此螢光發散的強度會降低。 •-種用於偵測淬滅（並因此分析結合）的較佳方法包括：（a)提供一測試介質，其包括至少一種核酸序列以及至少一種蛋白質序列；（b)以輻射線照射此測試介質，使有效產生至少一種螢光原，以發散螢光；以及（c)以一實質上相同於此測試介質的參考介質之參考螢光強度，與此 ----- —— - 〇本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公爱） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

A7 B7 1235766 五、發明說明（）螢光的螢光強度相比較，除了此參考介質是缺乏此至少一種蛋白質序列之外，其中，當螢光強度小於參考螢光強度時，偵測該淬滅效應以及該特定的結合。淬滅是蛋白質-核酸複合體經由特定的結合而形成之象徵。如同此處所定義的，在至少一種蛋白質序列以及至少一種核酸序列之間的特定結合，是排除在肽類核酸以及核酸之間的互補（也就是，華森-克立克）鹼基對，但包括所有在蛋白質（爲了本發明之目的，名詞“蛋白質”是以其最寬廣的觀念而定義，如包括，例如，肽類（例如胜肽、二胜肽、三胜肽等）、多胜肽、蛋白質以及多蛋白質複合體）以及核酸（例如，雙股DNA (dsDNA)、單股DNA (ssDNA)、RNA、單股 RNA、雙股 RNA、信使 RNA (mRNA)、核不均 RNA (hnRNA)、轉移 RNA (tRNA)、核糖體 RNA (rRNA)、單股 DNA : RNA 雜合物(hybdds)、雙股 DNA : RNA雜合物、核酸類似物以及寡核苷酸）之間的其他類型之特定結合。許多蛋白質-核酸複合體可使用本發明之方法而分析。本發明可用於分析在核酸以及，例如，肽類、蛋白質或多蛋白質複合體之間的結合特性（包括結合以及結合親和力的存在或不存在）。適合用於分析的蛋白質包括，例如，野生型、突變的、分離的、體外的（M Wko)轉譯的及/或合成的蛋白質。本發明特別適合用於分析DNA-結合蛋白對雙股DNA之結合。測試用的樣品不需要是1〇〇%的純，但可包括例如，純化的製備、合成的製備、半純化的蛋白 __2__ _ _ 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公爱) ' " (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) I I · I I------I . -n n n n ϋ n ϋ n n n n n n n ϋ n I I ϋ n ϋ < A7 1235766 B7 五、發明說明（） ^〜 ---- 『又物、粗製(crude)蛋白質萃取物或活體外轉譯的製本發明之具體實麵分析多種蛋白質複合體的結合性，此複合體具有結合到在核酸序列上之單一或數個結八位置之相同或不同的蛋白質。多蛋白質：D·複合體在= f界：是更普_，並且較單—蛋白質：DNA複合體或同 =二聚體（h〇m〇dimer) : DNA複合體更具有生物學上的思義。使用本發明，可以偵測兩種（或多種）交互作用的虫白貞，是否獨立地、合作地或協同地結合到它們各自的 DNA位置。例如，本發明可測量兩個蛋白質結合到兩個 DNA位置，其藉由插入的DNA序列而分開，當這兩個結合的蛋白質互相交互作用時，此插入的DNA序列結成環狀〇結合的複合體之成份不需要一定是野生型或完美的配對。例如’本發明可分析在突變的蛋白質及突變的DNA結合序列之間的結合，或者可分析在具有改變的結合親和力之突變蛋白質至野生型DNA結合位置之間的結合。本發明可偵測第一未標記的化合物至第二未標記的化合物之結合，藉由偵測在第一未標記的化合物及標記的化合物之間結合特性的改變（如同藉由螢光強度的改變所指示）。爲了本發明的目的，這樣的偵測稱爲“二級結合的 ”偵測，或以其較寬廣的觀念，稱爲“非直接結合的”偵測。理論上，本發明可進行三級結合的偵測、四級結合的偵測等等，如果結合的每一個額外的程度’可在標記的化 "^紙張尺度適財關家鮮（CNS)A4規格χ 2971(^' (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ------—丨訂---------線— · •ϋ ·ϋ ί - 1235766 五、發明說明（）合物及弟一未標記的化σ物之間的結合，產生一*明顯的改變的話。相似地，本發明也可偵測未標記的化合物到至少一種複雜化合物的複合體成員的結合，其中，至少一種複雜的化合物被標記以用於螢光強度的測量。標記的化合物及未標記的化合物，甚至不需要直接地交互作用就可偵測。必要的關鍵是在於，本發明可經由其在標記探針的結合特性上之非直接或直接對標的物之影響而偵測一狀況。因此，本發明可偵測一對抗特定蛋白質的抗體（也就是，“第二未標記的化合物”）對特定蛋白質（也就是， “第一未檩記的化合物”）的結合，其中，此特定的蛋白質是直接結合到標記的DNA序列，或是存在於多蛋白質·· DNA複合體中，並且因此與一種或多種在複合體中的其他蛋白質交互作用，但並不需要與標記的DNA直接交互作用。加入特定的抗體至蛋白質：DNA複合體（特別是多蛋白質：DNA複合體），是廣泛使用的技術，以鑑別在蛋白質 :DNA複合體中未知蛋白質的存在。抗體的結合將避免蛋白質：DNA複合體的形成（當與自由的DNA比較時，導致強度上沒有改變），或者將導致抗體：蛋白質：DNA的複合體，其甚至可能較蛋白質：DNA複合體更爲降低螢光的強度。本發明更進一步地可偵測標記的核酸至其他序列專一性的結合分子之直接及非直接的結合，此分子例如，肽類、模擬的肽類、複雜的碳水化合物或其他的寡聚物。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1235766 a7 __—_ B7__ 五、發明說明（）本發明是有效用於非常多的目的，包括設計及/或篩選分子，此分子以位置專一性的方式結合至所需要的DNA或其他類型的序列，或是此分子改變其他分子的結合。因此 ’本發明提供一種用於鑑別及評估新物質或藥物的方法，其具有特定的結合活性，或是可預測地改變其他結合配對/ 複合體之結合特性。例如，可鑑別具有DNA結合專一性的物質，其結合至啓動子DNA，因此扮演轉錄阻礙者的角色。這個新鑑別的轉錄阻礙物質，可同時使用於活體外及活體內（MWvo)的轉錄作用。本發明之方法可以不需要在螢光強度偵測之前，從至少一種蛋白質序列及至少一種核酸序列中，分離至少一種蛋白質：核酸複合體，並且不需要在該至少一種蛋白質上或在該至少一種核酸序列上，提供一信息淬滅作用劑。本發明並不需要使用輻射活性的探針，其使用上爲具有危險、令人厭煩和浪費時間的，並且需要不斷地再生。本發明之探針較佳地使用上是安全的，並且可保持數年的穩定。因此，可大量地製造或訂購探針並且儲存。本發明之方法並不需要膠體分離的步驟，藉此允許加倍要測試樣品的量，並且只要半天的時間來分析。定量分析是簡單並準確的。本發明將關於以下的實施例做更詳盡地說明，但應了解的是，本發明並非視爲限制於此。實施例本實施例證明三種不同類型的DNA結合蛋白質，對本紙張尺度中國國家標準（Cns)A4規格（210 X 297公爱) 一 ' (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ·--------訂---------線 *·-- 1235766 A7 _______B7_____ 五、發明說明（）其相對的DNA辨認位置之結合，作爲本發明以雷射爲基礎的分析，可應用在所有類型的DNA結合蛋白質之證據。實施例所選擇之三種代表性的蛋白質是c-JUN(實施例1-3 及5)、Spl(實施例4)以及Oct-l(實施例6-7)。實施例f c-JUN是轉錄因子之AP-1家族的成員，其結合並且調控在許多細胞及病毒基因的啓動子或促進子序列中之天然存在的AP-1 DNA結合位置。例如，參見Bohmann等人“ 人類原生-致癌基因編碼具有結構性及功能性轉錄因子AP-1性質的DNA結合蛋白質”卷238，科學雜誌，頁 1386-1392 ( 1987)。此外，人類c-JUN蛋白質是屬於名爲原生-致癌蛋白質的一類蛋白質（其包括c-FOS及c-MYC )’當其解除管制並活化時，產生腫瘤形成以及癌症。c-JUN、c-FOS及c-MYC構成一特定的DNA結合蛋白質族群’其DNA結合的功能部位（domain)是由一富含驗性氨基酸的區域所組成（一^般稱爲驗性區域”或“驗性功能口 βίΐΔ )’其緊罪在名爲白肢酸拉鍊（leucine zipper ) 的結構性功能部位旁。白胺酸拉鍊是由4到5個白胺酸殘基所組成（c-JUN具有5個），其以7個氨基酸的固定間隔而分開，形成二分子的螺旋-螺旋結構。與其迴文的（ palindromic) DNA序列之特定接觸，經由鹼性區域而初步地發生。白胺酸拉鍊提供c-JUN對本身的二聚作用，形成 dUN : c-JUN同質二聚體，或對C-F〇s形成C-JUN :卜 FOS異質一聚體。c_juN的同質二聚體使得DNA朝向 -— ___ η 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ""— --- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ·訂-丨 1>1 m tn m I n —ϋ A7 B7 1235766 五、發明說明（） DNA螺旋的次要凹槽（minor groove)彎曲79度，然而c-JUN : c-FOS異質二聚體使得DNA以相反的方向，朝向 DNA螺旋的主要凹槽（major groove)彎曲94度。具有完整功能的DNA結合功能部位，同時需要鹼性區域以及白胺酸拉鍊。如同純的人類c-JUN蛋白質使用在以下的分析，本實施例顯示c-JUN : c-JUN同質二聚體結合至單一的AP-1 位置（JD1F/2F)。螢光素標記的野生型雙股DNA寡核苷酸，JD1F/2F，其含有一致性的7個鹼基對之AP-1 DNA結合位置，是衍生自人類膠原蛋白酶（collagenase)基因的啓動子序列。互補的5’-螢光素標記之單股DNA 17-聚體JD1F及JD2F，其具有5個核苷酸包圍在一致性AP-1位置的兩側，在 PerSeptive Biosystems Expedite核酸合成儀上合成，並且藉由高效能液體色層分析（HPLC)而純化。相等莫耳量的 JD1F及JD2F寡核苷酸，在10毫莫耳濃度的三羥甲基氨基甲烷（Tris)、pH 7.5、100毫莫耳濃度的氯化鈉、1毫莫耳濃度的乙二胺四乙酸（EDTA)中，藉由在95°C變性5 分鐘，然後分別在42°C、35°C及21°C中各培養40分鐘而黏合（anneal)。黏合的寡核苷酸在-20°C以酒精沈澱2小時，在〇°C以14,000轉/分鐘（rpm)的轉速離心20分鐘而形成小片，以100%酒精淸洗，在0°C以14,000轉/分鐘的轉速離心20分鐘再形成小片，乾燥，並且以1〇〇奈克（ng )/微升的最終濃度溶解於二次蒸|留水中。所形成的雙股 DNA寡核苷酸，在5’末端的兩側具有單一的螢光素分子。本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

-ϋ n ϋ n n n n-^OJ· n n n ϋ n n ϋ I ·.1 ·ϋ ϋ n n n n n n ϋ ϋ n n n ϋ n ϋ ϋ n ϋ -ϋ n I A7 B7 1235766 五、發明說明（）野生型JD1F之序列（序列辨識編號：1): 5，-螢光素-GTG TCT GAC TCA TGC TT-3’ 野生型JD2F之序列（序列辨識編號：2): 5、螢光素-AAG CAT GAG TCA GAC AC-3’ 突變的雙股DNA 17-聚體JD3F/4F，是相同於野生型 JD1F/2F的序列，除了在野生型AP-1 —致性的DNA結合位置內，從GC到TA單一鹼基對（標以底線）的改變之外。突變的JD3F之序列（序列辨識編號：3): 5’-螢光素-GTG TCT IAC TCA TGC TT-3’ 突變的JD4F之序列（序列辨識編號：4): 5，-螢光素_AAG CAT GAG ΤΔΛ GAC AC-3’ c-JUN : DNA的結合反應混合液（30微升）包含下列成份：9.25毫莫耳濃度的N-2-羥乙基派嗪-N’_2’-乙基磺酸 (HEPES)、pH，7.9、2.23毫莫耳濃度的氯化鎂、0.03毫莫耳濃度的乙二胺四乙酸、50毫莫耳濃度的氯化鈉、5.0 毫莫耳濃度的二硫蘚糖醇（DTT)、3.75% (Wv)甘油、 0.15微克/微升的牛血淸白蛋白CBSA)、0-2.0微克純的 c-JUN 蛋白質（Promega，Madison，威其斤康辛）或 0-400 奈克純的c-JUN胜肽，以及0.075微微莫耳（pmole)之 5’-螢光素標記的雙股DNA寡核苷酸。當使用全長的c-JUN時，將3奈克/微升的聚(dl)-聚(dC)納入至反應混合液中，並且在添加蛋白質及螢光素標記的DNA之前添加。在第1B及1D圖中的實施例包含50毫莫耳濃度的氯化鉀替 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) · 訂i •線丨-- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） A7 1235766 ___B7 __ 五、發明說明（）代50毫莫耳濃度的氯化鈉。野生型及突變的c-JUN DNA 結合功能部位胜肽，是由Dirk Bohmann博士慷慨提供（歐洲分子生物實驗室，海德堡，德國）。反應混合液在21°C 培養30分鐘，置於石英小管中，以具有488毫微米波長的氬離子雷射波束照射，並且監測螢光的發散。野生型的c-JUN DNA結合功能部位胜肽，是由c-JUN 的羧基端132個氨基酸殘基所組成（從麩胺酸醯胺209到苯丙胺酸340)。c-JUN突變的14 DNA結合功能部位胜肽，在序列上是相同於野生型的胜肽，除了在中間的鹼性功能部位內之2個氨基酸取代基（標以底線）之外，把在位置277的離胺酸轉換爲異白胺酸，以及把位置278的半胱胺酸轉換爲天門冬胺酸。野生型c-〗UN胜肽之序列（序列辨識編號：5)= 210 220 230 240 QPQQQQQPPfiHLPQQMPVQHPRLQALKEEPQTVPEMPGE 250 260 270 280

TPPLSPIDMESQERIKAERKRMRNRIAASKCRKRKLERIA 290 300 310 320 RLEEKVKTLICAQNSELASTANMLREQVAQLKQKVMNHV 330 340

NSGCQLMLTQQLQTF 突變的14c-JUN月生之序列（序列辨識編號：6): 210 220 230 240

QPQQQQQPPHHLPQQMPVQHPRLQALKEEPQTVPEMPGE L——~—-----16 _ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

--ϋ 11 n n n n n^OJa n ·1 -ϋ I 線丨· A7 1235766 _____B7_____ 五、發明說明（） 250 260 270 280 TPPLSPIDMESQERIKAERKRMRNRIAASJ^RKRKLERIA 290 300 310 320 RLEEKVKTLKAQNSELASTANMLREQVAQLKQKVMNHV 330 340

NSGCQLMLTQQLQTF 2微克、1微克或0.05微克之全長c-JUN結合至0.075 微微莫耳野生型JD1F/2F或0.075微微莫耳突變的JD3F/4F 所得到的螢光光譜，顯示於第1A-1D圖。對於每個樣品的測試，DNA濃度都固定保持在2.5 fmole ( 10_15莫耳）/微升。所有的樣品不論是只有DNA，或是有存在c-JUN，都在相同的反應條件下測試。最大的螢光強度發生在525 nm ，因爲使用的螢光原是螢光素。當1微克或0.05微克的c-JUN結合至JD1F/2F時，觀察到最大的強度分別是比只有 JD1F/2F時所觀宰到的低54%及49% (第1A圖）。當2 微克的c-JUN結合至野生型JD1F/2F時，產生強度上55% 的降低（數據未顯示）。1微克及2微克的C-JUN兩者所得到強度上相似的降低，顯示添加1微克的c-JUN蛋白質就可達到結合的飽和程度。爲了測試在不同的鹽條件下，c-JUN對於結合DNA的偏好程度，以上的實驗在含有50毫莫耳濃度氯化鉀以取代 50毫莫耳濃度氯化鈉的反應緩衝液中，同步地進行（第 1B圖）。當2微克的c-JUN在氯化鉀反應緩衝液中結合至野生型JD1F/2F時，可觀察到57%的強度降低，相較於只 ----U------ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -------------^丨一 1235766 a7 ___ B7___ 五、發明說明（）有DNA所達到的程度。1微克及〇·5微克的c-JUN，在50 毫莫耳濃度的氯化鉀緩衝液中結合至野生型的JD1F/2F，分別產生40%及34%的強度降低，顯示低於結合的飽和程度。因此，c-JUN結合至其AP-1位置，在50毫莫耳濃度的氯化鈉反應混合液中，是要比在50毫莫耳濃度的氯化鉀反應混合液中有較高的結合親和力。因此，根據本發明的雷射結合分析，不僅可以確實地偵測c-JUN : DNA的結合，並且也可以鑑別優先的結合條件。在相同的實驗期間，當確實相同的c-JUN量，在50 毫莫耳濃度的氯化鈉反應混合液中（第1C圖），或50毫莫耳濃度的氯化鉀反應混合液中（第1D圖），與〇.075微微莫耳突變的JD3F/4F反應時，在每個樣品中都沒有觀察到螢光強度的降低，顯示蛋白質並沒有結合到突變的DNA 序列。這些突變的DNA結合硏究，證實c-JUN :野生型 DNA結合條件以及雷射偵測方法兩者的專一性。當發散的螢光強度，在3種不同的積分時間測量時，得到相同的結果（數據未顯示），顯示一致性的結果與積分時間無關。實施例2 全長的c-JUN蛋白質是40汗道耳吞（kDa)或340個氨基酸的大小。C-JUN之DNA結合的功能部位是位在c-JUN羧基端的132個氨基酸殘基（從第2〇9殘基的麩胺酸酸胺到第340殘基的苯丙胺酸），並且能夠以相同於全長蛋白質的結合親和力而結合DNA。 1丨一丨 _ 1只本纸張尺度適用中®(CNS)A4規格⑽χ撕公髮） ^-- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

訂---------線L 1235766 A7 _________B7___ 五、發明說明（）第1A-2B圖顯示，雷射分析也可藉由只由這132個氨基酸的DNA結合功能部位所組成的純蛋白質胜肽，而偵測特定的結合。20奈克、100奈克以及200奈克的野生型c-JUN DNA結合功能部位胜肽，在50毫莫耳濃度的氯化鈉反應混合液中，與0.075微微莫耳野生型JD1F/2F結合，分別導致13%、28%以及43%螢光強度的降低，相較於只有JD1F/2F所發散的螢光強度（第2A圖）。事實上，只有20奈克的c-JUN胜肽與0.075微微莫耳DNA的結合，是可以被確實地偵測，顯示此雷射分析的高靈敏度。此外，肽類：DNA的結合分析是定量的，因爲c-JUN胜肽的增加量會導致更加地與野生型DNA的結合。相較之下，20奈克、100奈克以及200奈克的野生型 c-JUN胜肽，並沒有結合至突變的JD3F/4F，導致螢光強度小量的增加，在只有突變的DNA所觀察到的結果之上（第2B圖），證實此雷射結合分析的專一性。如同預測的，對於200奈克的c-JUN胜肽結合至 JD1F/2F所觀察到之43%的螢光強度降低，是分別少於1 微克及〇·5微克全長的，c-JUN蛋白質所觀察到之54%及 49%的降低。任何人將可預期以一肽類得到較少的靜態淬滅發生，因爲較少的蛋白質質量將吸收在肽類中所發散的螢光。實施例3 雷射結合分析的專一性更進一步地藉由將突變的c-JUN DNA結合功能部位胜肽，與野生型或突變的DNA反 ___19 _________ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -n m in n n 一· I— n I n -n flu —m I ϋ ·ϋ n 1— n n n n n n n I ϋ i n n f n n n n —1 - -i 1235766 a7 _________B7 ____ 五、發明說明（）應而測試。在c-JUN的鹼性功能部位中，特定的突變徹底破壞DNA結合但卻不影響二聚作用，然而在白胺酸拉鍊中，特定的突變卻同時阻止二聚作用以及DNA結合。當200 奈克及400奈克之純的C-JUN突變14胜肽（其在C-JUN 的鹼性功能部位內，具有2個氨基酸取代基）與0.075微微莫耳的野生型JD1F/2F或突變的JD3F/4F結合時，所得到的螢光光譜，分別顯示在第3A圖以及第3B圖。對於 JD1F/2F或JD3F/4F，並沒有觀察到螢光強度的降低，甚至當非常過量的c-JUN突變14胜肽存在時，明白地顯示 DNA結合的破壞’並且更加g登明雷射結合分析的專一*性。實施例4

Spl是屬於一類明顯的DNA結合蛋白質，名爲鋅指（ zinc finger ) DNA結合蛋白質。例如，參見Kadonaga等人，“編碼轉錄因子Spl的cDNA之分離，以及DNA結合功能部位的功能性分析”卷51，細胞雜誌，頁1079-1090 ( 1987 )。Spl控制大量病毒及細胞的啓動子或促進子之轉錄作用，包括HIV-1長端重複（LTR)。Spl結合位置的數目、間隔、方向以及序列’廣泛地在啓動子之間改變，導致高親和力、中親和力或低親和力的結合位置。雖然 Spl是相當大的蛋白質（95仟道耳吞及105仟道耳吞’分別在其醣化及磷酸化的形式），但DNA結合活性是位於靠近此蛋白質的羧基端（從第539殘基的半胱胺酸到第619 殘基的組織胺酸）。此區域包含3個鄰接的鋅（π)指主體結構（modf)，其爲與DNA交互作用的金屬蛋白（ __ ____2jQ_ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公爱） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

A7 B7 1235766 五、發明說明（） metalloprotein)結構。DNA結合的序歹[]專一性是藉由3個鋅（II)指而完整地提供。第3指是最關鍵的指（相關於結合親和力），然後是第2指，最後是第1指。2個半胱胺酸以及2個組織胺酸殘基結合一鋅（II)離子，以形成每一指。鋅的移除瓦解3個鋅指的二級結構。在此類DNA 結合蛋白質中，這些指具有（半胱胺酸-X2,4-半胱胺酸-X3-苯丙胺酸-X5-白胺酸-X2-組織胺酸-X3-組織胺酸）之一致性的序列，稱爲半胱胺酸2/組織胺酸2指。第二類型的鋅（II )指主體結構稱爲半胱胺酸2/半胱胺酸2指，具有（半胱胺酸-X2-半胱胺酸-x13-半胱胺酸-X2-半胱胺酸），發現於其他的DNA結合蛋白質中，例如，許多的荷爾蒙受體。一種含有單一一致性10個驗基對的Spl DNA結合位置之野生型螢光素標記的雙股DNA寡核苷酸，JD11F/12F ，是衍生自人類金屬硫肽（MT-IIA)基因的啓動子序列。互補的5’-螢光素標記之單股DNA 20-聚體JD11F及JD12F ，以上述之方法合成、純化以及黏合。野生型JD11F之序列（序列辨識編號：7): 5，-螢光素-CCG GCC GGG GCG GGG CTT TT-3’ 野生型JD12F之序列（序列辨識編號：8): 5，-螢光素-AAA AGC CCC GCC CCG GCC GG-3’ 突變的雙股DNA 20-聚體JD13F/14F，是相同於野生型JD11F/12F的序列，除了 6個鹼基對的改變（標以底線 )之外，其將一致性的Spl結合位置GGG GCG GGG C轉變成爲 TAA ATA GGG C。 ____2J________ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ·--------訂---------線 *·--- 1235766 B7 五、發明說明（）突變的JD13F之序列（序列辨識編號：9): 5，-螢光素-CCG GCC TAA ΑΤΑ GGG CTT ΤΤ-3’ 突變的JD14F之序列（序列辨識編號：1〇): 5，-螢光素-AAA AGC CC工 A1XIAG GCC GG-3， Spl : DNA的結合反應混合液（30微升）包含下列成份：25毫莫耳濃度的N-2-羥乙基呢嗪-N’-2’-乙基磺酸（ HEPES)、pH 7.8、2.23毫莫耳濃度的氯化鉀、100微莫耳濃度的硫酸鋅、1毫莫耳濃度的二硫蘚糖醇（DTT)、20 % ( v/v)甘油、0.05微克/微升的牛血淸白蛋白（BSA)、 0-200奈克純的Spl蛋白質（Promega)以及0.1微微莫耳 (pmole)之5’-螢光素標記的雙股DNA寡核苷酸。反應混合液在〇°C.培養15分鐘，置於石英小管中，以具有488 nm 波長的氬離子雷射波束照射，並且監測螢光的發散。第4圖顯示鋅指DNA結合蛋白質Spl與野生型 JD11F/12F或突變的JD13F/14F之結合。當200奈克的 Spl結合至0.1微微莫耳的JD11F/12F時，觀察到44%的螢光強度降低，相較於只有JD11F/12F時所達到的螢光強度（第4A圖）。此外，可確實地偵測到25奈克之全長 Spl蛋白質的結合（數據未顯示），顯示此雷射分析的高靈敏度。因爲Spl是相當大的蛋白質（95仟道耳吞），然而c-JUN只有40仟道耳吞的大小，因此，對於Spl結合的DNA要比c-JUN結合的DNA需要較少量的蛋白質，以達到44%的螢光強度降低，這是由於較大的蛋白質對於發散的螢光有較高的吸收及保留。 _____ΊΎ _ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂---------線丨-- A235766 A7 _____B7 _ 五、發明說明（）當200奈克的Spl與0·1微微莫耳的JD13F/14F時，並沒有觀察到螢光強度的降低（第4Β圖），顯示沒有蛋白質結合到突變的DNA序列上。這些硏究證實，雷射偵測分析對於完全不同類型的DNA結合蛋白質之專一性。實施例5 本實施例說明本發明硏究抗體直接對特定蛋白質結合的能力，此特定蛋白質是直接地結合到標記的DNA序列上。將特定的抗體加到蛋白質：DNA複合體（特別是多蛋白質：DNA複合體）中，是一種用以鑑別在蛋白質：DNA 複合體中，是否存在有未知蛋白質的技術。抗體的結合將抑制或完全地避免蛋白質：DNA複合體的形成（當與自由的DNA比較時，導致螢光強度之最小的降低或沒有改變），或者將導致抗體：蛋白質：DNA複合體的形成，其降低螢光強度甚至超過蛋白質：DNA複合體。如前所述，1微克、500奈克及250奈克的c-JUN與 0.075微微莫耳的野生型JD1F/2F，在50毫莫耳濃度的氯化鈉或50毫莫耳濃度的氯化鉀反應混合液中反應。在21 °C培養15分鐘之後，變量的單株免疫球蛋白IgGi抗體， c-JUN ( KM-1 )(購自 Santa Cruz 生物科技，Santa Cruz，加州），其得自對抗一段相當於人類c-JUN氨基酸56到 69的胜肽，將其加到一些c-RJN : DNA混合液中。反應混合液在21°C再培養40分鐘，置於石英小管中，以具有488 nm波長的氬離子雷射波束照射，並且監測螢光的發散。第5A圖及第5B圖顯示，在50毫莫耳濃度的氯化鈉 -_____7^ —------ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ——^-------------------------------- 1235766 A7 B7 五、發明說明（）反應混合液中，1微克或250奈克的c-JUN分別與 JD1F/2F的結合。當1微克或250奈克的c-JUN與 JD1F/2F結合時，分別觀察到25%及11%螢光強度的降低，相較於只有DNA所達到的螢光強度。將5微克或1微克的c-JUN抗體加到1微克的c-JUN中，分別導致42%及 37%螢光強度的降低（也就是，更降低17%及12%) ’顯示IgG : 〇JUN : DNA複合體的形成（第5A圖）。當c， JUN抗體在50毫莫耳濃度的氯化鉀反應混合液中’結合到 1微克之與JD1F/2F結合的c-JUN時，觀察到相同的螢光強度降低（數據未顯示）。相似地，將750奈克的c-JUN 抗體加到250奈克之與JD1F/2F結合的c-JUN時，產生27 %的螢光強度降低，比只有蛋白質：DNA複合體所達到的程度更降低丨6% (第5B圖）。IgG : c-JUN複合體並沒有與突變的DNA JD3F/4F結合（數據未顯示），證實此雷射分析的專一性。· 此實施例顯示，此雷射偵測方法可區別（抗體：蛋白質：DNA複合體）以及（蛋白質·· DNA複合體）。此外，其建立了本發明可確實地偵測異源性多蛋白質複合體與 DNA結合的能力，而非只是區別蛋白質的單體或同質二聚體結合至DNA。在多蛋白質：DNA複合體中，只有一種蛋白質需要與DNA結合。多蛋白質：DNA複合體，其中多於一種蛋白質與DNA交互作用，也可使用本發明之方法來偵測。實施例6 ----24 _ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） Γ 请先閱讀背面之注意事項再填寫本頁} ·· 11 •線丨— 1235766 A7 ___B7 五、發明說明（）普遍存在的細胞八聚體結合蛋白質（〇ct_l)，藉由其獨特的DNA結合功能部位，而直接與DNA結合，其完全地不同於c-JUN或Spl之DNA結合功能部位。〇ct-；[是 POU功能部位DNA結合蛋白質的一員，其調控細胞專一性的轉錄及發育。例如，參見Sturm等人“普遍存在的八聚體結合蛋白質Oct-Ι ’包含具有同源異形盒（homeobox )次功能部位（subdomain)的p〇u功能部位” 2，基因及發育，1582-1599 ( 1988 )。POU功能部位的結構，在 DNA結合功能部位中是獨特的，因爲它包含2個結構上獨立的功能部位，其功能上地配合如同單一的DNA結合單位。Oct-Ι藉由此POU功能部位而結合至DNA，係由75個氨基酸的POU專一性（POUs)功能部位所組成：24個氨基酸的短連接區域以及60個氨基酸的POU類型同源異形 (P0UH)功能部位。P〇Us功能部位以及POUH功能部位都包含有螺旋轉螺旋（HTH)的結構。不像實施例1-5使用純化的蛋白質，本實施例使用海拉（HeLa)細胞核萃取物（購自Promega，Madison，威斯康辛），作爲〇ct-l的來源。HeLa細胞核萃取物的使用，其含有大量的各種DNA結合蛋白質以及轉錄因子，顯不藉由本發明的雷射分析，使用天然的蛋白萃取物以偵測序列專一性蛋白質：DNA的結合是可行的。一種含有單——致性8個鹼基對的Oct-1 DNA結合位置之野生型螢光素標記的雙股DNA寡核苷酸，JD49F/50F ，是衍生自人類免疫球蛋白重鏈的啓動子。互補的5’-螢光 _____25 一----- 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) I n ϋ n n n i-_i n^OJ爾―— I ϋ ϋ ϋ 1 n n ϋ n n A7 B7 1235766 五、發明說明（）素標記之單股DNA 18-聚體JD49F及JD50F，以上述之方法合成、純化以及黏合。野生型JD49F之序列（序列辨識編號：11): 5，-螢光素-GAG TAT GCA AAT CAT GTG-3’ 野生型JD50F之序列（序列辨識編號：12): 5，-螢光素-CAC ATG ATT TGC ATA CTC-3’ 突變的雙股DNA 18-聚體JD51F/52F，是相同於野生型JD49F/50F的序列，除了雙重的點突變（AJ2—CG)( 標以底線），其使得P〇Us結合位置不活化；以及第二@ 重的點突變（A6A7—CC)(標以底線），其使得POUh# 合位置不活化之外，藉此將一致性的〇ct-l結合位# ATGCAAAT 轉變成爲 GGGCACCT。突變的JD51F之序列（序列辨識編號：13): 5’-螢光素-GAG TCG GCA Q£J CAT GTG-3’ 突變的JD52F之序列（序列辨識編號：14): 5’-螢光素-CAC ATG AGG TGC CGA CTC-3’

Oct-1 : DNA的結合反應混合液（3〇微升）包含下列成份·· 9.25毫莫耳濃度的N-2-羥乙基呢嗪-N，-2，-乙基磺酸 (HEPES)、pH 7·9、2.23毫莫耳濃度的氯化鎂、0.03毫莫耳濃度的EDTA、63毫莫耳濃度的氯化鈉、1.0毫莫其濃度的二硫蘚糖醇（DTT)、3.75% (ν/ν)甘油、0.10毫克/毫升的牛血淸白蛋白（BSA) 、0.01毫莫耳濃度的 PMSF、67微克/毫升的聚（dl)-聚（dC)、67微克/毫升的聚 (dG-dC)-聚（dG-dC)、0-15微克的HeLa細胞核萃取物（ ______26 一本纸張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） A7 I235766 __B7___ 五、發明說明（）

Promega)以及0·05微微莫耳（pmole)之5’-螢光素標記的雙股DNA寡核苷酸。當使用天然的細胞核蛋白質萃取物時，相當高濃度的聚（dl)-聚（dC)以及聚（dG-dC)-聚（dG-dC) 是需要的，以確保序列專一性的蛋白質：DNA結合。反應混合液在21°C培養30分鐘，置於石英小管中，以具有488 nm波長的氬離子雷射波束照射，並且監測螢光的發散。當10微克的HeLa細胞核萃取物與0.05微微莫耳的野生型JD49F/50F或0.05微微莫耳突變的JD51F/52F反應時，所得到的螢光光譜分別顯示於第6A及6B圖。存在於 HeLa細胞核萃取物中的Oct-Ι蛋白質，專一性地結合至野生型高度親和力的Oct-Ι結合位置，導致22%的螢光強度降低，相較於只有JD49F/50F時所觀察到的程度（第6A 圖）。相較之下’ Oct-Ι並沒有結合至突變的JD51F/52F ’ 如同螢光強度在只有突變的DNA所觀察到的結果之上所指示（第6B圖）·，證實此雷射結合分析的序列專一性。這些實驗顯示對於其他完全不同類型的DNA結合蛋白質之雷射偵測分析的專一性。此外，本實施例也證實，可藉由本發明確實地測量專一性的蛋白質：DNA結合，甚至當使用天然的HeLa細胞核萃取物時（其包含數以百計的其他DNA結合蛋白質）° 專一性是藉由適當標記的DNA序列之篩選而提供’其辨認要硏究的特定DNA結合蛋白質。竇施例7 本實施例淸楚地顯示本發明之方法，可測量多蛋白質 ____ ^7 —---- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ·--------訂 i •線丨----- 1235766 A7 __________B7______ 五、發明說明（） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 線丨# 複合體（其由兩種或多種不同的蛋白質所組成）’與一種 (或多種）在DNA序列上之結合位置的結合。此硏究是以人類細胞蛋白質八聚體結合蛋白質（Oct-Ι)和宿主細胞因子（HCF ;例如，參見Wilson等人，“VP16輔助蛋白質 HCF是加工自大的前驅蛋白質之一多胜肽家族”卷76，細胞雜誌，頁115-125，（ 1993 ))，與單純疱疹病毒第1 型（HSV-1)蛋白質VP16 (或Vmw65)結合至DNA序列 TAATGARAT (其中R是嘌呤）而進行。此多蛋白質： DNA複合體稱爲特早期複合體（IEC)或VP16誘導的複合體。雖然VP16是曾鑑別過的轉活化子中，最有效的基因轉活化子，但它本身卻不能有效地結合DNA。除此之外，它專一性地與Oct-Ι和HCF交互作用以誘導基因。VP16 藉由其胺基端的411個氨基酸而與Oct-Ι和HCF結合。 VP16羧基端之高度酸性的功能部位，藉由氨基酸411到 490而定義，作爲有效的轉錄活化區域。例如，參見 Dalrymple等人，“單純疱疹病毒第1型基因之DNA序列 ’其產物負責特早期啓動子之轉錄活化”卷13，核酸硏究，頁 7865-7879 ( 1985 )。

Oct-Ι藉由其兩部份的POU功會g部位而結合至DNA，其可以顯現異常的DNA序列辨識適應性。Oct-1的POU功能部位，以P0Us功能部位接觸此位置5’端的一半（ATGC )，以及POUH功能部位與在此DNA另一端上，此位置3’ 端的一半（AAAT)交互作用，而如同單體般結合至八聚體序歹[J ATGCAAAT。當Oct-Ι結合至高親和力的 ______28 ____ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1235766 A7 __B7 五、發明說明（） ATGCAAAT結合位置時’其不能與νρι6交互作用。

Oct-Ι也結合至與八聚體一致性序列幾乎不相像的 DNA位置。例如，Oct-Ι藉由其本身或聯合hCF及VP16 ，可結合DNA序列TAATGARAT，其具有如同符合八聚體一致性位置的8個鹼基，4個鹼基般少的序列。兩種形式的TAATGARAT位置，在單純瘦瘆病毒特早期（HSV ιΕ )基因的啓動子序列中被發現。第一個，命名爲 (OCTA+)TAATGARAT主體結構，包含一重疊的八聚體 /ΤΛΑ丁GARAT序歹[]，其以高度的親和力結合〇第二個，稱爲（〇CTA>TAATGARAT，缺少一重疊的八聚體序歹[1，並且以相當低的親和力結合Oct-Ι。Oct-Ι的P〇UH功能部位結合5’TAAT序列，然而P0Us功能部位卻結合在 (OCTA )TAATGARAT 位置上的 GARAT 序歹[J。在 (OCTA+)TAATGARAT結合位置上，p〇uH功能部位保持固定在’TAAT序列，，然而P〇Us功能部位卻可結合5，ATGC 序列或3’GARAT元素。Oct-1的P〇UH功能部位是足以與 VP16交互作用的。 HCF是需要的，用以穩定Ocw與VP16在 TAATGARAT位置上的結合，藉由先與VP16 (與無關）或TAATGARAT元素形成一穩定的複合體。HCF穩定 VP16結合Oct-Ι的確實機轉仍是不淸楚的。HCF可誘導在 VP16內之構形上的改變，其啓動VP16與Oct-Ι以及 TAATGARAT位置上的GARAT元素交互作用。另外，在 UEC複合體之內，HCF可接觸Oct-Ι或DNA，並因此提供 —_____29__ 一本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ---III— · I I I I I I--I 一 1235766 a7 ___B7_ 五、發明說明（）此複合體較大的穩定度。一種含有（〇CTA-)TAA丁GARAT位置之野生型螢光素標記的雙股DNA寡核苷酸，JD41F/42F，是衍生自HSV-1 IE基因4/5啓動子的20個鹼基對的區域（-343到-324)。互補的5’-螢光素標記之單股DNA 20-聚體JD41F及JD42F ，以上述之方法合成、純化以及黏合。野生型JD41F之序列（序列辨識編號：15): 5’-螢光素-GGC GGT AAT GAG ATA CGA GC-3’ 野生型JD42F之序列（序列辨識編號：16): 5，-螢光素-GCT CGT ATC TCA TTA CCG CC-3，突變的雙股DNA 20-聚體JD43F/44F，是相同於野生型JD41F/42F的序列，除了雙重的點突變（A2A3—CC)( 標以底線），其使得P〇UH結合位置不活化；以及第二雙重的點突變（A8T9—CG)(標以底線），其使得POUs結合位置不活化之外，藉此將OcM結合位置TAATGAGAT 轉變成爲TCCTGAGCG。突變的JD43F之序列（序列辨識編號：17): 5’-螢光素-GGC GGT Q£J GAG CGA CGA GC-3’ 突變的JD44F之序列（序列辨識編號：18): 5，-螢光素-GCT CGT CGC TCA GGA CCG CC-3’

一種含有（〇CTA+)TAATGARAT位置之野生型螢光素標記的雙股DNA寡核苷酸，JD45F/46F，是衍生自HSV-1 ΪΕ基因1啓動子的23個鹼基對的區域（-170到-148)。互補的5，-螢光素標記之單股DNA 23-聚體JD45F及JD46F ______ 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 一-οτ I 11 1_ amMme Bn l n tmmMm I n ϋ aB_l ϋ— n «ϋ· n -ϋ ϋ_ι m ·_ϋ n m I— n If n i i Hi n in 1235766 A7 __B7__ 五、發明說明（），以上述之方法合成、純化以及黏合。野生型JD45F之序列（序列辨識編號：19): 5，-螢光素-GTG CAT GCT AAT GAT ATT CTT TG-3’ 野生型JD46F之序列（序列辨識編號：20): 5,-螢光素-CAA AGA ATA TCA TTA GCA TGC AC-3’ 突變的雙股DNA 23-聚體JD47F/48F，是相同於野生型JD45F/46F的序列，除了雙重的點突變（A6A7—CC)( 標以底線），其使得P〇UH結合位置不活化；以及另外兩個雙重的點突變（AJ2—CG)以及（A12T13—CG)(標以底線），其使得兩個P〇Us結合位置不活化之外，藉此將 Oct-Ι 結合位置 ATGCTAATGATAT 轉變成爲 CGGCTCCTGATCG。突變的JD47F之序列（序列辨識編號：21): 5’-螢光素-GTG CCG GCT CCT GAT QQJ CTT TG-35 突變的JD48.F之序列（序列辨識編號：22): 5’-螢光素_CAA AGA CGA TCA ΟϋΑ GCC_ QGC AC-3， Oct-1 ·· HCF : VP16 : DNA的結合反應混合液（30微升）包含下列成份：9.25毫莫耳濃度的N-2-羥乙基顿嗪-N’-2’-乙基磺酸（HEPES)、pH 7.9、2.23毫莫耳濃度的氯化鎂、0.03毫莫耳濃度的EDTA、63毫莫耳濃度的氯化鈉、1.0毫莫耳濃度的二硫蘚糖醇（DTT)、3.75% ( v/v)甘油、0.10毫克/毫升的牛血淸白蛋白（BSA)、0.01毫莫耳濃度的PMSF、133微克/毫升的聚(dl)-聚(dC)、67微克/毫升的聚(dG-dC)-聚(dG-dC)、0-25微克的HeLa細胞核萃取 _31,____ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 一 ff n flu ammmMm i n n s I n ·1 n HI in n n n I— HI ϋ— n n m i n ϋ ·ϋ I— ^^1 n n 1235766 B7 五、發明說明（）物（Promega)、0-0.1微克的HSV-1病毒粒子萃取物以及 0.025微微莫耳（pmole)之5’-螢光素標記的雙股DNA寡核苷酸。包含80%純的VP16之HSV-1病毒粒子萃取物是由Chds Preston博士所慷慨提供（MRC病毒學硏究所， Glasgow，蘇格蘭）。HeLa細胞核萃取物提供作爲Oct-1 及HCF的來源。除了 DNA及病毒粒子萃取物之外的所有成份在21°C培養1〇分鐘。然後加入DNA，接著加入 HSV-1病毒粒子萃取物（適量）。反應混合液在21°C再培養30分鐘，置於石英小管中，以具有488 nm波長的氬離子雷射波束照射，並且監測螢光的發散。

Oct-Ι蛋白質，以10微克及20微克HdU細胞核萃取物的量存在，專一性地與0.025微微莫耳的野生型 JD41F/42F結合，分別導致10%及43%的螢光強度降低，相較於只有JD41F/42F所達到的程度（第7A圖）。0.025 微微莫耳的低DNA量，以莫耳數而言是超過存在於HeLa 細胞核萃取物中的Oct-1量。當Oct-1結合至0.05微微莫耳之其高度親和力的JD49F/50F結合位置時（在實施例6 中），觀察到10微克的HeLa細胞核萃取物產生22%的螢光強度降低，然而，當Oct-Ι結合至0.025微微莫耳之其低度親和力的JD41F/42F結合位置時（以莫耳數而言，其超過Oct-Ι存在的量），相同量的HeLa細胞核萃取物卻僅導致10%的螢光強度降低，證實對於相同的蛋白質，雷射結合分析可區分高度親和力以及低度親和力的DNA結合位置。 ______飞 9 ____ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂------ 線丨· 1235766 A7 _B7 ____ 五、發明說明（）當〇·1微克的VP16加到Oct-1 : JD41F/42F反應混合液中時，觀察到20%螢光強度的降低，相當於只有Oct-1 :JD41F/42F複合體所達到的程度更降低10% (第7A圖 )。此額外的降低是由多蛋白質：〇ct-l : HCF : VP16 : JD41F/42F複合體的形成所引起，比起單一的蛋白質Oct-1 :JD41F/42F複合體，其可以吸收以及保留更多發散的螢光。當10微克或20微克的HeLa細胞核萃取物（存在或不存在VP16)與0.025微微莫耳突變的JD43F/44F反應時，並沒有觀察到螢光強度的降低，顯示Oct-Ι或Oct-Ι : HCF : VP16複合體並沒有與突變的DNA序列結合（第7B 圖）。這些突變的DNA結合硏究，證實對於使用天然的細胞核萃取物以測量專一性的多蛋白質：DNA複合體的形成上，此雷射偵測方法的專一性。當10微克的HeLa細胞核萃取物與0.025微微莫耳的野生型JD45F/46F反應時，發生32%螢光強度的降低，相較於只有JD45F/46F所觀察到的螢光強度（第8A圖）。此相當大的強度降低，是Oct-Ι以高度親和力結合至 (〇CTA>TAATGARAT位置的能力之作用。將0.1微克的VP16加到10微克的HeLa細胞核萃取物以及0.025微微莫耳的野生型JD45F/46F，導致69%螢光強度的降低，相當於只有Oct-1 : JD45F/46F複合體所得到的強度更降低37% (第8A圖）。因爲Oct-1、HCF以及VP16分別是11〇仟道耳吞、〜300仟道耳吞以及65仟道 ____— _23____ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂---------線1·丨 1235766 A7 __ _____ 五、發明說明（）耳呑的大小，所以此巨大的69%的降低’是局度有效的多蛋白質：〇ct-l : HCF : VP16，與存在於JD45F/46F中的 (〇CTA+)TAATGARAT位置結合之直接的結果。相較之下，當微克的HeLa細胞核萃取物（存在或不存在0.1微克的VP16)與0.025微微莫耳突變的 JD47F/48F反應時，並沒有觀察到螢光強度的降低（第8Β 圖），淸楚地顯示DNA與突變的DNA序列之結合的破壞，並且更證明此雷射結合分析的專一性。此實施例淸楚地顯示，當使用天然的細胞核萃取物時，本發明之方法可再現地測量多蛋白質複合體（其由兩種或多種不同的蛋白質所組成）之專一性的結合至一種（或多種）在DNA序列上之結合位置。此外，此雷射結合分析可評估特定的蛋白質或多蛋白質複合體，結合至任何給定的DNA序列之親和力。如同實施例所顯示，本發明可應用至所有類型的DNA 結合蛋白質。例如，當致癌蛋白質c-JUN結合至其專一性的DNA辨識位置時，觀察到55%可測量單位的降低，相較於未結合的DNA所達到的程度（第1A及1B圖）。當 c-JUN與突變的DNA序列反應時，並沒有觀察到強度的降低（第1C及1D圖），顯示沒有結合，並且證實此偵測方法的專一性此外，只含有蛋白質的DNA結合功能部位之肽類的專一性結合，可用定量的方式偵測。例如，20奈克、1〇〇奈克及200奈克結合至野生型DNA的c-JUN胜狀，分別 — ________24___— 一本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) .--------訂---------線 ---- 1235766 B7 五、發明說明（）導致13%、28%及43%的降低，相較於自由的DNA所觀察到程度（第2A圖）。事實上可確實地測量只有20奈克的oJUN胜肽之結合，顯示此偵測分析之高靈敏度。相較之下，20奈克、100奈克及200奈克的c-JUN胜肽，並沒有結合突變的DNA，在只有突變的DNA所觀察到的程度之上，導致較小的降低（第2B圖）。以肽類替代全長蛋白質的結合，對於設計及篩選藥物可以是特別引起興趣的〇此偵測分析的專一性，可藉由將突變的c-JUN DNA結合功能部位胜肽，與野生型（第3A圖）或突變的DNA ( 第3B圖）反應而進一步地測試。甚至當過量的c-JUN突變的14胜肽出現時，也沒有觀察到降低，淸楚地顯示 DNA結合的破壞，並且進一步地證明此分析的專一性。第4A及4 B圖顯示鋅指DNA結合蛋白質Spl，分別與野生型或突變的DNA結合位置之結合。當200奈克的 Spl結合至野生型的DNA時，觀察到44%的降低，相較於只有DNA所測得的程度。對於突變的DNA序列，並沒有觀察到200奈克Spl的結合。此雷射偵測分析可區分抗體：蛋白質：DNA複合體以及蛋白質：DNA複合體。例如，當5微克或1微克的c-JUN抗體結合至1微克的c-JUN時（其複合於野生型的 DNA)，分別觀察到42%以及37%螢光強度的降低，相較於c-JUN : DNA複合體所得到的25%降低（第5A圖）。 IgG : c-JUN複合體並沒有結合至突變的DNA序列。 _35 ________ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

H ϋ n n ϋ n n^OJe n I n I

線L 1235766 A7 _ _Β7___ __ 五、發明說明（）第6、7及8圖顯示兩部份的POU功能部位DNA結合蛋白質Oct-Ι，以不同的結合親和力結合至3種不同的 DNA序列辨識位置。此外，實施例6-7證明使用天然的細胞核萃取物作爲DNA結合蛋白質來源的可行性，但仍保留高度專一性的蛋白質-DNA結合。根據每個DNA位置的結合親和力，1〇微克的HeLa細胞核萃取物，結合至野生型〇ct-l DNA結合位置，具有10%、22%以及32%的降低，相較於未結合的DNA所達到的程度。顯然地，本發明之方法可確實地測量多蛋白質複合體 (其由兩種或多種不同的蛋白質所組成）結合至一種（或多種）DNA結合位置，不論是使用純的蛋白質或是天然的細胞核萃取物。例如，當結合至高親和力的 (OCTA+)TAATGARAT位置，或低親和力的（OCTA_ )TAATGARAT 位置時，Oct-1 : HCF : VP16 : DNA 複合體分別產生69%及，20%螢光強度的降低（第8及7圖）。對於所有突變的DNA序列，沒有觀察到Oct-Ι蛋白質或〇(^-1 : HCF : VP16蛋白質複合體的結合。多蛋白質：DNA複合體比單一蛋白質：DNA複合體，在本質上是更普遍的並且更具生物意義。本發明之方法可使用天然的細胞核蛋白質萃取物’以分析單一或多蛋白質以高度專一性的方式結合至DNA的能力’是最重要的客觀關連。雖然本發明已以其附隨的實施例詳細地說明’但顯而易見的是，在不脫離本發明的範疇之外，熟悉於此技藝者 ______^6 -------- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公t ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

1235766 A7 B7 五、發明說明（）可做各種的更動以及潤飾 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) I n ϋ n I— n n 一-OJI n I ϋ n n n ϋ I ϋ n n I— n n n n 37 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐）

Claims

1235766 哉 C8 D8 六、申請專利範圍 (mRNA)、核不均 RNA (hnRNA)、轉移 RNA (tRNA)、核糖體 RNA (rRNA)、單股 DNA : RNA 雜合物(hybrids)、雙股 DNA : RNA雜合物、核酸類似物以及寡核苷酸所組成的族群中；及其中該未標記的化合物是一肽類、多胜肽、蛋白質或多蛋白質複合體。 2.如申請專利範圍第1項之方法，其中該核酸結合性蛋白質是以純化的製備、合成的製備、半純化的蛋白質萃取物、粗製的蛋白質萃取物或活體外轉譯的製備的形式而提供。 3·如申請專利範圍第1項之方法，其中該螢光原標記的化合物是一核酸結合性蛋白質，以及該未標記的化合物是一核酸。 4·如申請專利範圍第1項之方法，其中該螢光原標記的化合物是一核酸，以及該未標記的化合物是一核酸結合性蛋白質。 5·如申請專利範圍第1項之方法，更包括對於多數不同未標記的化合物，測定該標記的化合物之結合親和力。 6.如申請專利範圍第5項之方法，其中該標記的化合物是一核酸，以及該多數不同未標記的化合物是核酸結合性蛋白質。 7·如申請專利範圍第6項之方法，更包括根據該結合親和力的測定，從該多數不同未標記的蛋白質中篩選一藥物候選物。 8·如申請專利範圍第6項之方法，更包括根據該結合 2 (請先閲讀背面之注意事項再塡寫本頁) -έ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格(210 X 297父釐) 1235766 韶 C8 D8 六、申請專利範圍親和力的測定，從該多數不同未標記的蛋白質中篩選一基因抑制劑或活化劑。 9·如申請專利範圍第6項之方法，更包括比較該多數不同未標記的蛋白質之結合親和力，以測定該蛋白質是否寺價地結合。 W·如申請專利範圍第4項之方法，其中該方法更包括偵測一蛋白質結合的化合物與該蛋白質之結合。 11·如申請專利範圍第10項之方法，其中該蛋白質結合的化合物是專一性對抗該蛋白質的抗體。 12·如申請專利範圍第11項之方法，其中當螢光強度是藉由該抗體與該蛋白質以及該蛋白質與該核酸之結合而淬滅時，偵測該蛋白質-抗體的結合。 13·如申請專利範圍第11項之方法，其中當螢光強度沒有淬滅時，偵測該蛋白質-抗體的結合，該沒有淬滅顯示一蛋白質-抗體複合體已形成，並且阻礙該核酸與該蛋白質的結合。 14·如申請專利範圍第1項之方法，更包括在該核酸以及至少一種沒有螢光原的核酸之間，藉由將該沒有螢光原的核酸加到該測試介質，而進行一競爭性的分析。 15. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該未標記的化合物是一突變體。 16. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該標記的化合物是一突變體。 17. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該未標記的 3 本紙張尺度適用0國家標準（CNS)A4規格(210 x 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項 φ^ϋ 再填寫本頁) .1235766 098 8 99 ABCD 六、申請專利範圍化合物，是在一多蛋白質複合體內的一突變蛋白質，該未標記的化合物阻礙其他蛋白質與該螢光原標記的化合物之結合。 18. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該未標記的化合物，是藉由磷酸化、醣化或與金屬離子交互作用而改質。 19. 如申請專利範圍第5項之方法，更包括在一蛋白質萃取物內鑑別一功能性蛋白質或多蛋白質複合體的存在，其可在蛋白質萃取物製備的不同代謝狀態期間結合 DNA。 20·如申請專利範圍第6項之方法，其中該核酸是改質的。 21·如申請專利範圍第20項之方法，其中該核酸是甲基化的。 4 (請先閲讀背面之注意事項再塡寫本頁) -•5U 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格(210 X 297公釐)