JP2002534664A - 核酸へのタンパク質またはペプチドの結合のための蛍光強度測定法 - Google Patents
核酸へのタンパク質またはペプチドの結合のための蛍光強度測定法Info
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Abstract
Description
ンパク質との結合を蛍光強度データを用いて測定する方法に関する。
ることが知られている。例えば、ヒル(Hill)ら、タンパク質−核酸複合体
の研究への蛍光アプローチ(Fluorescence Approaches
to Study of Protein−Nucleic Acid Co
mplexation)278、Methods in Enzymology
390(1997)を参照されたい。例えば、DNA結合タンパク質は遺伝子
調節に重要な役割を果たすことがわかっている。遺伝子は一般に、DNA結合タ
ンパク質により転写レベルで調節され、DNA結合タンパク質は、転写因子と称
される。転写因子は、特にプロモータDNAの標的核酸配列に結合することによ
り、遺伝子発現を調節する。
結合特性を研究するための種々の方法が提案されている。例えば、ヒル(Hil
l)らや本明細書に引用した参考文献を参照されたい。
号は、標的核酸配列に対するDNA結合タンパク質の親和性を測定するための方
法を開示している。ヴァーディンは、DNA結合タンパク質と標的核酸配列との
間に可逆的結合を提供する工程と、その可逆的結合を管理された条件下で破るこ
とにより可逆的結合の相対強度(従ってタンパク質核酸のタンパク質の親和性)
を測定する工程とから成る方法を教示している。結合を破るのに必要な条件が厳
しければきびしいほど、核酸に対するタンパク質の親和性は高い。ヴァーディン
は、蛍光に基づく結合アッセイについては開示も示唆もしていない。
パク質−オリゴヌクレオチド結合を研究するための蛍光に基づく方法を開示して
いる。しかし、同特許の教示は専ら蛍光異方性技術に限定されている。基本的に
、異方性は、自由DNAまたはタンパク質が結合したDNAの回転拡散事象を測
定すると共に、リンカーアームを介してDNAに取り付けられたフルオロフォア
の局所運動を測定する。自由DNAは速く回転し、光を容易に偏光解消し、低い
異方性値を示す。対照的に、タンパク質が結合したDNAはフルオロフォアの寿
命に対してゆっくり回転し、光をほんのわずかに偏光解消し、従って、比較的高
い異方性値を示す。
方性の変化の程度は、異方性に基づく方法の提案者が示すほどには予測可能なも
のではない。相反するデータを理論期待値と適合させる異方性データの解釈には
、解析的方法(特に該方法が自動化される場合)で望まれる努力よりも多くの努
力が必要となる可能性がある。
を要するにも拘わらず、タンパク質−核酸相互作用を分析するための最も普及し
ている方法である。一般に、従来の放射性標識法では、特定の酵素によって32P
で末端が放射性標識されたDNAプローブが必要である。組み込まれなかった32 Pからの標識DNAの精製には、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、一晩の溶出
、ゲル濾過および濃縮工程が含まれる。32Pの半減期はたった14日であるため
、各プローブに対して約3週間ごとに放射性標識が必要である。さらに、タンパ
ク質−32P−DNA複合体は、未変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動により非
結合32P−DNAから分離する必要がある。その後ゲルは、オートラジオグラフ
ィーまたはまたはリンイメージングにより乾燥、分析される。
で効果的で速い方法に対する要求が、当該技術分野には存在している。 本明細書に引用したすべての参考文献は、米国特許第5,846,729号お
よび米国特許出願番号08/807,901および08/870,370(それ
ぞれ1997年2月27日と1997年6月6日に出願された)を含めて、参照
によりその全体が本明細書に組み込まれる。
標識化合物との間の結合を測定する方法を提供する。該方法は、結合の結果前記
少なくとも1つのフルオロフォア標識化合物により発せられた蛍光に対する消光
効果を検出する工程を含む。この場合、前記結合は特異的であり、核酸塩基対核
酸塩基以外の結合である。該方法は、消光効果の検出前に前記少なくとも1つの
フルオロフォア標識化合物と前記少なくとも1つの非標識化合物の複合体を前記
少なくとも1つのフルオロフォア標識化合物から分離せずに、かつ前記発せられ
た蛍光を消光するシグナル消光剤を加えずに、好ましくは行われる。
間の特異的結合を測定する方法であって、前記少なくとも1つのタンパク質配列
および/または前記少なくとも1つの核酸配列が少なくとも1つのフルオロフォ
アを含む方法を提供する。該方法は、該特異的結合により少なくとも1つのタン
パク質−核酸複合体が形成した結果起こる、少なくとも1つのフルオロフォアに
対する蛍光強度の消光効果を検出する工程を含む。好ましくは、フルオロフォア
は、少なくとも1つのタンパク質配列への結合より先に、少なくとも1つの核酸
配列に取り付けられる。
蛍光異方性レベルとは異なり、蛍光発出強度は複合体が形成されると減小する。 消光を検出する(従って結合を測定する)好ましい方法は、(a)少なくとも
1つの核酸配列と少なくとも1つのタンパク質配列を含む試験媒質を提供する工
程と;(b)該少なくとも1つのフルオロフォア標識化合物が蛍光を発するのに
有効な放射線で試験媒質を照射する工程と;(c)該蛍光の蛍光強度を、少なく
とも1つのタンパク質配列を欠いている以外には試験媒質と実質的に同一な参照
媒質の参照蛍光強度と比較する工程とから成り、消光効果および特異的結合は蛍
光強度が参照蛍光強度よりも小さいときに検出される。消光は、特異的結合を介
したタンパク質−核酸複合体の形成の指標である。
つの核酸配列との間の特異的結合からは、ペプチド核酸および核酸との間の相補
的(すなわち、ワトソン−クリックの)塩基対合は除外されるが、すべての他の
種類のタンパク質間の特異的結合は含まれる(本発明のために、「タンパク質」
という用語は、例えばペプチド(例えば、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド
等)、ポリペプチド、タンパク質および複数タンパク質の複合体)および核酸(
例えば、dsDNA、ssDNA、RNA、ssRNA、dsRNA、mRNA
、hnRNA、tRNA、rRNA、ssDNA:RNAハイブリッド、dsD
NA:RNAハイブリッド、核酸類似体およびオリゴヌクレオチド)を含むもの
として最も広い意味に定義される。
である。本発明は、核酸と例えばペプチド、タンパク質、または複数タンパク質
の複合体との間の結合特性(結合の存在または不在ならびに結合親和性)を測定
するために使用することが可能である。分析に適したタンパク質には、例えば、
野生型タンパク質、変異タンパク質、単離タンパク質、インビトロ翻訳タンパク
質、および/または合成タンパク質が含まれる。本発明は、DNA結合タンパク
質のdsDNAへの結合を分析するのに特に適している。試験試料は純度100
%である必要はなく、むしろ精製調製物、合成調製物、半精製タンパク質抽出物
、粗タンパク質抽出物、またはインビトロ翻訳調製物であり得る。
か異なる複数のタンパク質を有する複数タンパク質の複合体の結合特性を分析す
る。複数のタンパク質:DNAの複合体は、1つのタンパク質:DNA複合体ま
たはホモ二量体:DNA複合体よりも、自然界では一般的であり、生物学的にも
重要である。本発明を用いて、2つの(またはそれより多くの)相互作用をして
いるタンパク質がその各DNA部位に独立して、協同的に、または共同作用的に
結合するかどうかを検出することが可能である。例えば、本発明は、2つの結合
したタンパク質が互いに相互作用した場合にループから外れる介在DNA配列に
より分離された2つのDNA部位に対する、2つのタンパク質の結合を測定する
ことができる。
ったりする必要はない。例えば、本発明は変異タンパク質と変異DNA結合配列
との結合または結合親和性が変えられた変異タンパク質と野生型DNA結合部位
との結合を測定することができる。
って示されるような)結合特性の変化を検出することにより、第1の非標識化合
物の第2の非標識化合物に対する結合を検出することが可能である。本発明のた
めに、そのような検出は「2次結合」の検出またはより広い意味では「間接的結
合」の検出と称される。さらなる各結合レベルが標識化合物と第1の非標識化合
物との間の結合に有意な変化を生じると仮定すると、理論的には、本発明では、
3次結合の検出、4次結合の検出等が可能である。
れた、複数の複合化合物から成る複合体の少なくとも1つのメンバーへの非標識
化合物の結合を検出することが可能である。標識化合物と非標識化合物は検出が
起こるよう直接相互作用する必要はない。重要な点は、本発明が、標的に対する
標識プローブの結合特性に間接または直接的に影響を及ぼすことにより、ある条
件を検出できることにある。
が指向する特異的タンパク質(すなわち「第1の非標識化合物」)に対する結合
を検出することが可能となる。特異的タンパク質は標識DNA配列に直接結合さ
れるか、または複数タンパク質:DNA複合体に存在して該複合体中の1または
複数の他のタンパク質と相互作用するが必ずしも標識DNAと直接相互作用する
必要はない。タンパク質:DNA複合体(特に複数タンパク質:DNA複合体)
への特異的抗体の添加は、タンパク質:DNA複合体中の未知タンパク質の存在
を確認するための広く使用されている技術である。抗体の結合により、タンパク
質:DNA複合体の生成(その結果、自由DNAと比べた強度の変化はない)が
防止されるか、タンパク質:DNA複合体よりもずっと大きく蛍光強度を減小さ
せる抗体:タンパク質:DNA複合体を生じるであろう。
プチド模倣分子、複合炭水化物または他のオリゴマー)に直接および間接的に結
合することが可能である。
り他の分子の結合を変化させたりする分子を設計および/または選択する等の多
数の目的に有効である。本発明は、特異的結合活性を有するか他の結合対/複合
体の結合特性を予測可能に変化させる新規物質または薬剤を同定および評価する
方法を提供する。例えば、プロモータDNAに結合し転写ブロッカーとして作用
するDNA結合特異性を有する物質を同定することが可能である。この新たに同
定された転写ブロック物質は、インビトロ転写プロセスでもインビボ転写プロセ
スでも使用することが可能である。
少なくとも1つの核酸配列から成る少なくとも1つのタンパク質−核酸複合体を
分離せず、かつ少なくとも1つのタンパク質または少なくとも1つの核酸配列に
対するシグナル消光剤を与えずに、行うことができる。
る放射性プローブを使用する必要がない。本発明のプローブは、好ましくは安全
に使用され、数年にわたって安定である。従って、プローブを大量に製造または
注文することができると共に、貯蔵できる。
び分析すべき試料の量を2倍にすることができる。定量分析は簡単・正確である
。
うな実施例に制限されるものとはみなさないことは当然である。 (実施例) 実施例では、本発明のレーザに基づく測定がすべてのクラスのDNA結合タン
パク質に適用可能であるという証拠として、3つの異なるクラスのDNA結合タ
ンパク質の、その各DNA認識部位に対する結合を証明する。この実施例のため
に選択した3つの各タンパク質は、c−JUN(実施例1−3および5)、Sp
I(実施例4)およびOct−1(6−7)である。
サー配列に天然に存在するAP−1 DNA結合部位に結合して該結合部位を調
節する、AP−1ファミリー転写因子のメンバーである。例えば、ボーマン(B
ohmann)ら、“Human proto−oncogene c−jun
encodes a DNA binding protein with
structural and functional properties
of transcription factor AP−1”238 Sc
ience 1386−1392(1987)を参照されたい。さらに、ヒトc
−JUNタンパク質は、調節が解除され活性化されると、原腫瘍タンパク質と呼
ばれる、腫瘍形成とがんを引き起こすタンパク質(c−FOSおよびc−MYC
を含む)のクラスに属する。c−JUN、e−FOSおよびc−MYCは、DN
A結合ドメインが塩基性アミノ酸に富んだ領域(「塩基性領域」または「塩基性
ドメイン」と一般に呼ぶ)から成り、「ロイシンジッパー」と称される構造ドメ
インにすぐ隣接して存在する、DNA結合タンパク質の特異的グループを構成す
る。ロイシンジッパーは、2分子のコイルとコイルの構造を形成する、7個のア
ミノ酸の規則的間隔に離間された4〜5個のロイシン残基(c−JUNは5個有
する)から成る。そのパリンドロームDNA配列との特異的接触は、主として塩
基性領域を介して起こる。ロイシンジッパーは、c−JUN:c−JUNホモ二
量体を形成するc−JUNのそれ自体に対する二量体形成またはc−JUNc−
FOSヘテロ二量体を形成するc−JUNのc−FOSへの二量体形成を許容す
る。c−JUNのホモ二量体は、DNAらせんの小溝に対してDNAを79゜に
曲げるが、c−JUN:c−FOSヘテロ二量体は小溝に対してDNAを反対方
向に94゜曲げる。DNA結合ドメインが完全に機能するには、塩基性領域とロ
イシンジッパーの両方が必要である。ヒトの純c−JUNタンパク質を以下の測
定に使用するため、実施例は、c−JUN:c−JUNホモ二量体の1つのAP
−1部位(JD1F/2F)への結合を示す。
野生型のdsDNAオリゴヌクレオチドであるJD1F/2Fは、ヒトコラゲナ
ーゼ遺伝子のプロモータ配列から得た。共通AP−1部位の両端に隣接して5個
のヌクレオチドを有する、相補的な5’−フルオレセイン標識したssDNA1
7量体JD1FおよびJD2Fを、Perseptive Biosystem
Expedites核酸合成装置で合成し、HPLCにより生成した。当モル
量のJD1FおよびJD2Fオリゴを、95℃で5分間変性することにより10
mM Tris、pH7.5、100mM NaCl、1mM EDTA中でア
ニーリングし、その後42℃、35℃および21℃で40分間ずつインキュベー
トした。アニーリングしたオリゴを2時間−20℃でエタノ−ル沈殿させ、14
Krpm、20分間、0℃で遠心分離でペレットとし、100%エタノールで洗
浄し、14Krpm、20分間、0℃で再びペレットとし、乾燥させ、最終濃度
が100ng/μlとなるようにddH2Oに溶解させた。生成したdsDNA
オリゴはいずれの5’末端にも1つのフルオレセイン分子を有していた。
位でのGCからTAへの1つの塩基対の変化(下線)以外は、野生型JD1F/
2Fと同じ配列であった。
EPES、pH7.9、2.23mM MgCl2、0.03mM EDTA、
50mM NaCl、5.0mM DTT、3.75%(v/v)グリセロール
、0.15μg/μlウシ血清アルブミン(BSA)、0〜2.0μg 純c−
JUNタンパク質(プロメガ(Promega)社、ウィスコンシン州マジソン
(Madison)または0〜400ng純c−JUNペプチド、および0.0
75pmole 5’−フルオレセイン標識dsDNAオリゴヌクレオチド。完
全長c−JUNを使用した場合、3ng/μlポリ(dI)−ポリ(dC)が反
応混合物に含まれ、タンパク質とフルオレセイン標識DNAの添加前に加えられ
る。図1Bおよび1Dの例は、50mM NaClの代わりに50mM KCl
を含有した。野生型および変異c−JUN DNA結合ドメインペプチドはダー
クボーマン(Dirk Bohmann)博士、(ヨーロッパ分子生物学研究所
(European Molecular Biology Laborato
ry、ドイツ国ハイデルベルグ(Heidelberg)所属)より供与された
。反応混合物は、21℃で30分間インキュベートし、石英キュベットに入れ、
488nm波長を有するアルゴンイオンレーザ光線で照射し、蛍光の発出をモニ
タした。
32個のアミノ酸残基から構成された(Gln209からPhe340まで)。
c−JUN変異14DNA結合ドメインペプチドは、277位置でリジンがイソ
ロイシンに変わり、278位置でシステインがアスパラギン酸に変わる中心塩基
性ドメイン内の2つのアミノ酸の置換(下線)以外は、野生型ペプチドと配列が
同一であった。
JD3F/4Fに対する2μg、1μgまたは0.05μgの完全長cJUNの
結合について得られた蛍光スペクトルを図1A〜1Dに示す。DNA濃度は各試
験試料に関して2.5fmole/μlに一定に保った。試料はすべて、DNA
のみであろうと、c−JUNの存在下であっても、同じ反応条件下で試験した。
使用したフルオロフォアがフルオレセインであったため、最大蛍光強度は525
nmで起こった。1μgまたは0.05μgのc−JUNをJD1F/2Fに結
合させた時に観察されたそれぞれの最大強度は、JD1F/2Fのみ(図1A)
について観察した最大強度よりも54%および49%低かった。2μgのc−J
UNをJD1F/2Fに結合させると、55%の強度の減少が生じた(データ示
さず)。1μgおよび2μg c−JUNの両方に関して得られた同様な強度の
減小は、結合の飽和レベルが1μgのタンパク質の添加により達成されることを
示唆している。
述の実験を、50mK NaClの代わりに50mM KClを含有する反応緩
衝液で同時に行った(図1B)。2μgのc−JUNをKCl反応緩衝液中で野
生型JD1F/2Fと結合させると、DNAのみに関して達成されたレベルと比
べて、57%の強度の減少が観察された。50mM KCl緩衝液中で1μgお
よび0.5μgのc−JUNを野生型JD1F/2Fと結合させると、それぞれ
40%および34%の減小が起こり、結合の飽和レベルより低いことが示唆され
た。従って、c−JUNは、50mM KCl反応混合物よりも50mM Na
Cl反応混合物中で、高い結合親和性でそのAP−1部位に結合する。このよう
に、本発明のレーザ結合測定法は、c−JUN:DNA結合を高い信頼性で検出
できただけでなく、選択的結合条件も同定できた。
図1C)または50mM KCl反応混合物(図1D)中で0.075pmol
e変異JD3F/4Fと反応させると、どの試料でも蛍光強度の減少は観察され
ず、これは変異DNA配列にタンパク質が結合していないことを示した。以上の
変異DNA結合研究は、c−JUN:野生型DNA結合条件とレーザ検出法との
両方の特異性を確認している。
れ(データ示さず)、これは統合時間に拘わらず結果が一致することを示した。
ある。c−JUNのDNA結合ドメインはc−JUNのC末端の132個のアミ
ノ酸残基(209残基のグルタミン酸から340残基のフェニルアラニンまで)
に局在しており、完全長タンパク質と同様な結合親和性でDNAと結合すること
ができる。
のみから成る純タンパク質ペプチドによる特異的結合も検出できることを証明し
ている。20ng,100ng,および200ngの野生型c−JUN DNA
結合ドメインペプチドを、0.075pmole野生型JD1F/2Fと50m
M NaCl反応混合物中で結合させると、JD1F/2Fのみで発生した強度
と比較して、それぞれ13%,28%および43%の蛍光強度の減少が起こった
(図2A)。ちょうど20ngのc−JUNペプチドの0.075pmole
DNAへの結合が高い信頼性で検出できるという事実は、レーザ測定法の感受性
が高いことを証明している。さらに、c−JUNペプチドの量が増大すると野生
型DNAへの結合は漸増的に結合するため、ペプチド:DNA結合測定法は定量
的である。
ドは変異JD3F/4Fには結合せず、変異DNAのみに関して観察される蛍光
強度より大きいわずかな蛍光強度の増加が生じた(図2B)。これは、レーザ結
合測定法の特異性を確認している。
された43%の蛍光強度の減少は、予測通り、1μgおよび0.5μg完全長c
−JUNタンパク質に対してそれぞれ観察された54%および49%よりも小さ
い。少ない質量のタンパク質はペプチドに発出した蛍光を吸収するため、完全長
のタンパク質よりもペプチドでは得られる静的消光が少ないことが予測されるだ
ろう。
応させることにより、レーザ結合測定法の特異性をさらに試験した。c−JUN
の塩基性ドメインの特異的変異が二量化に影響を及ぼさずにDNAへの結合を破
壊する一方で、ロイシンジッパーの特異的変異は、二量化およびDNAへの結合
の両方を妨げる。c−JUNの塩基性ドメイン内に2つのアミノ酸置換を有する
200ngおよび400ngの純c−JUN変異14ペプチドを0.075pm
ole野生型JD1F/2Fまたは変異JD3F/4Fと反応させた場合に得ら
れる蛍光スペクトルをそれぞれ図3Aおよび図3Bに示す。過剰のc−JUN変
異14ペプチドが存在する場合であってもJD1F/2FまたはJD3F/4F
に対して蛍光強度の減少は全く観察されなかった。このことは、DNAへの結合
が完全に破壊されていることを示すと共に、レーザ結合測定法の特異性をさらに
証明している。
質の重要なクラスに属する。例えば、カドナガ(Kadonaga)ら”、Is
olation of cDNA encoding transcripti
on factor Spl and functional analysi
s of the DNA binding domain.”、51 Cel
l 1079−1090(1987)を参照されたい。Splは、HIV−I長
末端反復(LTR)を含む、多数のウイルスおよび細胞プロモータまたはエンハ
ンサーの転写を制御する。Spl結合部位の数、距離、方向および配列は、プロ
モータ間で大きく変わるので、結合部位の親和性は高いか、中程度か、または低
くなる。Splは比較的大きなタンパク質(グリコシル化およびリン酸化型で9
5KDaおよび105KDa)ではあるが、DNA結合活性は該タンパク質のC
末端付近(539残基のシステインから619残基のヒスチジンまで)に局在し
ている。この領域は、DNAと相互作用する金属タンパク質構造である3つの連
続するZn(II)フィンガーモチーフを含む。DNA結合の配列特異性は、そ
の3つのZn(II)フィンガーにより専ら与えられる。フィンガー3は(結合
親和性に関して言うと)最も重要なフィンガーであり、次にフィンガー2、最後
にフィンガー1が来る。2つのシステインと2つのヒスチジン残基は、Zn(I
I)イオンに結合して、各フィンガーを形成する。亜鉛を除去すると、3つの亜
鉛フィンガーの2次構造が折り畳まれる。このクラスのDNA結合タンパク質の
フィンガーは、Cys−X2,4−Cys−X3−Phe−X5−Leu−X2−Hi
s−X3−Hisの共通配列を有し、Cys2His2フィンガーと称される。C
ys2/Cys2フィンガーと称されCys−X2−Cys−X13−Cys−X2−
Cysの形をした第2のタイプのZn(II)フィンガーモチーフは、多くのホ
ルモンレセプター等の他のDNA結合タンパク質に見出される。
識dsDNAオリゴヌクレオチドであるJD11F/12Fは、ヒトメタロチオ
ネイン−IIA遺伝子のプロモーター配列から得た。相補的5’−フルオレセイ
ン標識ssDNA20量体のJD11FおよびJD12Fは上述のように合成、
精製、アニーリングした。
’ 野生型JD12Fに対する配列(配列番号8): 5’−Flu−AAA AGC CCC GCC CCG GCC GG−3
’
GCG GGG CをTAA ATA GGG Cに変えた6塩基対の変化(
下線)以外は、野生型JD11F/12Fと同じ配列であった。
’ 野生型JD14Fに対する配列(配列番号10): 5’−Flu−AAA AGC CCT ATT TAG GCC GG−3
’
HEPES、pH7.8、100μM KCl、100μM ZnSO4、1
mM DTT、20%(v/v)グリセロール、0.05μg/μl BSA、
0〜200ng 純Splタンパク質(プロメガ社)および0.1pmole
5−フルオレセイン標識dsDNAオリゴヌクレオチド。反応混合物を、0℃で
15分間インキュベートし、石英キュベットに入れ、488nm波長を有するア
ルゴンイオンレーザ光線で照射し、蛍光の発出をモニタした。
ィンガーDNA結合タンパク質Splの結合を示す。200ngのSplを0.
1pmole JD11F/12Fと結合させると、JD11F/12Fのみで
達成された強度レベルと比較して、44%の蛍光強度の減小が観察された(図4
A)。その上、25ngの完全長Splタンパク質の結合を高い信頼性で検出す
ることができた(データ示さず)。これは、レーザ測定法の感受性が高いことを
証明している。Splは比較的大きなタンパク質(95KDa)であるが、c−
JUNのサイズは40KDaにすぎず、大きなタンパク質では発せられた蛍光の
吸収と保持が大きいため、44%の蛍光強度の減小を達成するのに必要なタンパ
ク質の量は、Spl結合DNAではc−JUN結合DNAに対するよりも少なか
った。
たところ、蛍光強度の減少は全く観察されなかった(図4B)。このことは、変
異DNA配列に対してタンパク質が結合していないことを示す。この研究により
、DNA結合タンパク質の完全に異なるクラスに対するレーザ検出測定法の特異
性が確認された。
結合を研究するための本発明の能力を示す。タンパク質:DNA複合体(特に複
数のタンパク質:DNA複合体)に対する特異的な抗体の添加が、タンパク質:
DNA複合体中の未知タンパク質の存在を同定するために使用される。抗体の結
合により、タンパク質:DNA複合体の生成(その結果、自由DNAと比較して
蛍光強度は最小限に減小するか全く変化しない)が阻害または完全に防止される
か、タンパク質:DNA複合体よりもずっと大きく蛍光強度を減小させる抗体:
タンパク質:DNA複合体を生じるであろう。
M NaClまたは50mM KCl反応混合物中で0.075pmole変異
JD3F/4Fと反応させた。21℃での15分のインキュベーション後、ヒト
c−JUNの56〜69のアミノ酸に対応するペプチドに対して作製したモノク
ローナルIgG1抗体であるc−JUN(KM−1)(Santa Cruz
Biotechnology、カリフォルニア州サンタクルス所在)の可変量を
c−JUN:DNA混合物の一部に加えた。反応混合物を21℃でさらに40分
間インキュベートし、石英キュベットに入れ、488nm波長を有するアルゴン
イオンレーザ光線で照射し、蛍光の発出をモニタした。
の1μgまたは250ng c−JUNの結合をそれぞれ示す。1μgまたは2
50ng c−JUNをJD1F/2Fと結合させると、DNAのみで達成され
た強度レベルと比較して、25%および11%の強度の減少が観察された(図4
A)。5μgまたは1μgのc−JUN抗体の1μg c−JUNへの添加によ
りそれぞれ42%および37%減小し(すなわち17%および12%のさらなる
減小)、これはIgG:cJUN:DNA複合体が形成されていることを示した
(図5A)。c−JUN抗体を50mM KCl反応混合物中でJD1F/2F
に結合した1μg c−JUNに結合させると、同じ強度の減小が観察された(
データ示さず)。同様に、JD1F/2Fに結合した250ng c−JUNへ
750ngのc−JUN抗体を添加すると、27%の強度の減小が生じるが、タ
ンパク質:DNA複合体のみにより達成されるレベルからのさらに16%の減少
である(図5B)。IgG:c−JUN複合体は変異DNA JD3F/4Fに
は結合しなかった(データ示さず)が、これによりレーザ検出測定法の特異性が
確認された。
:DNA複合体とを区別できることを証明している。さらにこの実施例は、DN
Aと結合するタンパク質のたんなる単量体やホモ二量体ではなく、DNAと結合
する異種から成る複数タンパク質の複合体を高い信頼性で検出する本発明の能力
を確認した。複数のタンパク質:DNA複合体のタンパク質のうちの1つだけが
DNAと結合する必要がある。2つ以上のタンパク質がDNAと相互作用する場
合の複数タンパク質:DNA複合体も、本発明により測定することが可能である
。
lのDNA結合ドメインとは完全に異なるその特徴的なDNA結合ドメインによ
り直接DNAに結合する。Oct−1は細胞特異的転写と発生を調節するPOU
ドメインDNA結合タンパク質のメンバーである。例えば、スターム(Stur
m)ら、“The ubiquitous octamer−binding
protein Oct−1 contains a POU domain
with a homeo box subdomain.”2 Genes
and Development 15 82−1599(1988)を参照さ
れたい。単一のDNA結合ユニットとして機能的に協同する2つの構造的に独立
したドメインを有するが故に、POUドメインの構造はDNA結合ドメインの中
でも特有である。Oct−1は、75個のアミノ酸POU特異的(POUs)ド
メインと、短い24個のアミノ酸のリンカー領域と、60個のアミノ酸のPOU
型homeo(POUH)ドメインとから構成されたPOUドメインを介して、
DNAに結合する。POUsドメインとPOUHドメインはへリックス−ターン−
へリックス(HTH)構造を有する。
胞核抽出物(プロメガ社、ウィスコンシン州マジソン)をOct−1の供給源と
して使用している。多数の様々なDNA結合タンパク質と転写因子を含むHeL
a細胞核抽出物の使用により、本発明のレーザ測定により配列特異的タンパク質
:DNA結合を検出するために粗タンパク質抽出物を用いることの可能性が示さ
れる。野生型フルオレセイン標識dsDNAオリゴヌクレオチドであるJD49
F/50Fは、1つの8塩基対の共通Oct−1 DNA結合部位を有し、ヒト
免疫グロブリン重鎖のプロモータから得た。相補的5−フルオレセイン標識ss
DNA18量体のJD49FおよびJD50Fは上述のように合成、精製、アニ
ーリングした。
する塩基対の2点の突然変異(A1T2→CG)(下線)と、POUH結合部位を
不活性化する第2の2点突然変異(A6T7→CC)(下線)とを有し、それゆえ
共通Oct−1結合部位ATGCAAATをCGCACCTへと変換させる以外
は、野生型49F/50Fと配列が同一であった。
25mM HEPES、pH7.9、2.23mM MgCl2、0.03mM
EDTA、63mM NaCl、1.0mM DTT、3.75%(v/v)
グリセロール、0.10mg/ml BSA、0.01mM PMSF、67μ
g/ml ポリ(dI)−ポリ(dC)、67μg/mlポリ(dG−dC)−
ポリ(dG−dC)、0〜15μg HeLa細胞核抽出物(プロメガ社)およ
び0.05pmole 5’−フルオレセイン標識dsDNAオリゴヌクレオチ
ド。粗各タンパク質抽出物を用いた場合、配列特異的なタンパク質のDNA結合
を確実にするには、比較的高濃度のポリ(dI)−ポリ(dC)とポリ(dG−
dC)−ポリ(dG−dC)が必要である。反応混合物を、21℃で30分間イ
ンキュベートし、石英キュベットに入れ、488nm波長を有するアルゴンイオ
ンレーザ光線で照射し、蛍光の発出をモニタした。
50Fまたは0.05pmoleの変異JD51F/52Fと反応させたときに
得られた蛍光スペクトルを図6Aおよび6Bにそれぞれ示す。HeLa細胞核抽
出物に存在するOct−1タンパク質は、野生型の高い親和性のOct−1結合
部位と特異的に結合し、JD49F/50Fのみ(図6A)で観察されたレベル
と比較して22%の蛍光強度の減小が生じた。対照的に、Oct−1は、変異D
NAのみ(図6B)について観察したのを超える蛍光強度の増大によって示され
るように、変異JD51F/52Fとは結合せず、これによりレーザ結合測定法
の配列特異性が確認された。以上の実験は、他の完全に異なるクラスのDNA結
合タンパク質に対するレーザ検出測定法の特異性を証明した。
細胞核抽出物を用いたときでさえも、特異的タンパク質:DNA結合が本発明に
より高い信頼性で測定可能であることが確認された。特異性は、研究すべき特定
のDNA結合タンパク質を認識する適切に標識されたDNA配列の選択により与
えられる。
の異なるタンパク質から成る)の1つの(または複数の)DNA配列上の結合部
位への結合を測定できることをはっきり証明する。ヒト細胞タンパク質8量体結
合タンパク質(Oct−1)および宿主細胞因子(HCF――例えば、ヴィルソ
ン(Wilson)ら、“The VP16 accessory prote
in HCF is a family of polypeptides p
rocesed from a large precursor prote
in.” 74 Cell 115−125(1993)を参照。)の、単純疱
疹ウイルスI型(HSV−1)タンパク質VP16(またはVmw65)による
DNA配列TAATGARAT(Rはプリンである)への結合についての研究を
行った。この複数タンパク質:DNA複合体は、即時型複合体(IEC)または
VP16誘導複合体と呼ばれている。VP16はこれまでに同定された遺伝子の
うち最も強力なトランスアクチベータではあるが、それ自体DNAと効率的に結
合することができない。代わりに、VP16は特にOct−1およびHCFと相
互作用して、遺伝子を誘導する。VP16はOct−1およびHCFと、アミノ
末端の411個のアミノ酸を介して結合する。VP16のC末端の強酸性ドメイ
ンは、アミノ酸411〜490によって形成され、転写活性化領域として機能す
る。例えば、ダルリンプル(Dalrymple)ら、“DNA sequen
ce of the herpes simplex virus type
1 gene whose product is responsible
for transcriptional activating of im
mediate early promoters.”13 Nucleic
Acid Research 7865−7879(1985)を参照されたい
。
し、POUドメインは、例外DNA配列認識融通性を示すことができる。Oct
−1 POUドメインは、8量体の配列ATGCAAATに単量体として結合し
、DNAの両側で、POUsドメインはこの部位の5’半分(ATGC)と接触
し、POUHドメインはこの部位の3’半分(AAAT)と接触している。Oc
t−1が高親和性のATGCAAAT結合部位と結合すると、Oct−1はVP
16と相互作用することができない。
例えば、Oct−1は単独でまたはHCFおよびVP16と会合して、8塩基対
のうち4つしか8量体の共通部位に適合しないDNA配列TAATGARATに
結合することができる。TAATGARAT部位の2つの形式が、プロモータ配
列単純疱疹ウイルス即時型(HSV IE)遺伝子に見出されている。その第1
は、(OCTA+)TAATGARATモチーフと称され、Oct−1と高い親
和性で結合する重複する8量体/TAATGARAT配列を有する。第2は、(
OCTA-)TAATGARATと称され、重複する8量体配列がなく、Oct
−1と比較的低い親和性で結合する。Oct−1のPOUHドメインは、5’T
AAT配列と結合し、POUsドメインは(OCTA-)TAATGARAT部位
上のGARAT配列に結合する。(OCTA+)TAATGARAT結合部位上
で、POUHドメインはTAAT配列と固定されたまま残り、POUSドメインは
5’TAAT配列か3’GARATエレメントに結合し得る。Oct−1 PO
UHドメインは、VP16と相互作用するのに十分である。
化させるのに必要である。安定化は、Oct−1またはTAATGARATエレ
メントと独立してVP16との安定な複合体を形成することにより行われる。H
CFがOct−1とのVP16の会合を安定化する正確なメカニズムはまだ知ら
れていない。HCFはVP16内でコンホメーションの変化を誘導し、VP16
をOct−1およびTAATGARAT部位のGARATエレメントと相互作用
させる。代わりに、IEC複合体内で、HCFはOct−1またはDNAと接触
し、従って複合体の大きな安定性を与える。
sDNAオリゴヌクレオチドのJD41F/42Fは、HSV−1 IE遺伝子
4/5プロモータ由来の20塩基対の領域(−343〜−324)から得た。5
’−フルオレセイン標識ssDNA20量体のJD41FおよびJD42Fは上
述のように合成、精製、アニーリングした。
’ 野生型JD42Fに対する配列(配列番号16): 5’−Flu−GGC CGT ATC TCA TTA CCG CC−3
’ 変異dsDNA20量体JD43F/44Fは、POUH結合部位を不活性化
する2点の突然変異(A2A3→CC)(下線)と、POUs結合部位を不活性化
する第2の2点突然変異(A8T9→CG)(下線)とを有し、それゆえOct−
1結合部位TAATGAGATをTCCTGAGCGへと変換させる以外は、野
生型41F/42Fと配列が同一であった。
’ 変異JD44Fに対する配列(配列番号18): 5’−Flu−GCT CGT CGC TCA GGA CCG CC−3
’
sDNAオリゴヌクレオチドであるJD45F/46Fは、HSV−1遺伝子1
プロモータの23塩基対領域(−170から−148まで)から得た。相補的5
’−フルオレセイン標識ssDNA23量体のJD45FおよびJD46Fは上
述のように合成、精製、アニーリングした。
TG−3’ 野生型JD46Fに対する配列(配列番号20): 5’−Flu−CAA AGA ATA TCA TTA GCA TGC
AC−3’
する2点の突然変異(A6T7→CC)(下線)とPOUs結合部位を不活性化す
るさらなる2つの2点の突然変異(A1T2→CG)および(A12T13→CG)(
下線)とを有し、それゆえOct−1結合部位ATGCTAATGATATをC
GGCTCCTGATCGへと変換させる以外は、野生型JD45F/46Fと
配列が同一であった。
TG−3’ 変異JD48に対する配列(配列番号22): 5’−Flu−CAA AGA CGA TCA GGA GCC GGC
AC−3’
含有していた:9.25mM HEPES、pH7.9、2.23mM MgC
l2、0.03mM EDTA、63mM NaCl、1.0mM DTT、3
.75%(v/v)グリセロール、0.10mg/ml BSA、0.01mM
PMSF、133μg/ml ポリ(dI)−ポリ(dC)、67μg/ml
ポリ(dG−dC)−ポリ(dG−dC)、0〜25μg HeLa細胞核抽出
物(プロメガ社)、0〜0.1μg HSV−1ビリオン抽出物および0.02
5pmole 5’−フルオレセイン標識dsDNAオリゴヌクレオチド。80
%純VP16を含有するHSV−1ビリオン抽出物はクリス プレストン(Ch
ris Preston)博士(MRC Institute of Viro
logy, Glasgow,Scotland)より供与された。HeLa細
胞核抽出物はOct−およびHCFの供給源として機能した。DNAおよびビリ
オン抽出物を除くすべての成分を、21℃で10分間インキュベートした。次に
DNAを加えてから、HSV−1ビリオン抽出物(適切な場合)を加えた。反応
混合物を、さらに21℃で30分間インキュベートし、石英キュベットに入れ、
488nm波長を有するアルゴンイオンレーザ光線で照射し、蛍光の発出をモニ
タした。
ク質は、0.025pmole野生型JD41F/42Fと特異的に結合し、そ
の結果、HD41F/42Fのみ(図7A)で達成されたレベルと比較してそれ
ぞれ10%および43%の蛍光強度の減小が生じた。0.025pmoleとい
う低いDNA量は、HeLa細胞核抽出物中に存在するOct−1の量に対して
過剰のモル量であった。Oct−1が0.05pmoleのその高い親和性JD
49F/50F結合部位(実施例6)と結合すると、10pgのBeLa細胞核
抽出物で蛍光強度が22%減少するが、他方、Oct−1が0.025pmol
eのその低い親和性JD41F/42F結合部位(存在するOct−1の量より
過剰のモル量である)と結合しても同量のHeLa細胞核抽出物では蛍光強度が
10%しか減少しないという観察により、同じタンパク質に対する高親和性DN
A結合部位と低親和性DNA結合部位とを区別するレーザ結合測定法の能力が確
認された。
れると、20%の蛍光強度の減少が観察された。これは、Oct−1:JD41
F/42F複合体のみ(図7A)で達成されたレベルからさらに10%減小した
ことを示している。このさらなる減小は、単一のタンパク質Oct−1:JD4
1F/42F複合体よりも発せられた蛍光をより多く吸収および保持する複数タ
ンパク質Oct−1:HCF:VP16:JD41F/42F複合体の形成に起
因する。
を0.025pmole変異JD43F/44Fと反応させた場合には、蛍光強
度の減少が観察されなかった。このことは、Oct−1またはOct−1:HC
F:VP16複合体が変異DNA配列(図7B)に結合しないことを示している
。以上の変異DNA結合の研究により、粗核抽出物を用いて特異的複数タンパク
質:DNA複合体形成を測定するための、レーザ結合測定法の特異性が確認され
た。
6Fと反応させた場合、JD45F/46Fのみ(図8A)で観察された蛍光強
度と比較して32%の蛍光強度の減少が生じた。この比較的大きな強度の減少は
、高い親和性で(OCTA+)TAATGARAT部位と結合するOct−1の
能力のはたらきである。
e野生型JD45F/46Fに加えることにより、蛍光強度は69%減少したが
、これはOct−1:JD45F/46F複合体のみで得られる強度レベルから
さらに37%減小したことを示している(図8A)。Oct−1、HCFおよび
VP16のサイズはそれぞれ110KDa、約300KDaおよび65KDaな
ので、69%という大きな減小は、JD45F/46Fに存在する(OCTA+
)TAATGARAT部位に高い効率で複数タンパク質Oct−1:HCF:V
P16が結合した直接的結果である。
細胞核抽出物を0.025pmoleの変異JD47F/48Fと反応させた場
合には、蛍光強度の減小は観察されず(図8B)、変異DNA配列への結合が妨
げられることが明らかに示されると共に、レーザ結合測定法の特異性がさらに証
明された。
複合体(2またはそれより多くの種々のタンパク質から成る)の、DNA配列上
の1つ(または複数)の結合部位への特異的結合を、再現可能に測定できること
を明らかに示している。その上、レ−ザ結合測定法は、特定のタンパク質または
複数タンパク質の複合体の任意のDNA配列への親和性を評価することができる
。
ク質に適用可能である。例えば、腫瘍タンパク質c−JUNがその特異的DNA
認識部位に結合する場合、非結合DNAにより達成されるレベルと比較して55
%の測定可能なユニットの減小が観察される(図1Aおよび1B)。c−JUN
を変異DNA配列と反応させる場合、減小は観察されず(図1Cおよび1D)、
結合が起こっていないことが示され、検出方法の特異性が確認される。
合を、定量的な方法で検出することができる。例えば、野生型DNAと結合した
20ng,100ngおよび200ngのc−JUNペプチドは、自由DNAに
ついて観察されたレベルと比較して、それぞれ13%,28%および43%減小
した(図2A)。結合ちょうど20ngのc−JUNペプチドの結合を高い信頼
性で測定さできるという事実は検出測定法の感度が高いことを証明している。対
照的に、20ng、100ngおよび200ngのc−JUNペプチドは変異D
NAには結合せず、変異DNAのみに関して観察されたレベルを上回る小さな増
加が生じた(図2B)。全長タンパク質の代わりにペプチドを結合させることは
、医薬の設計および/またはスクリーニングに特に重要である。
型(図3A)または変異DNA(図3B)と反応させることによりさらに試験し
た。大量のc−JUN変異14ペプチドが存在した場合であっても減小は観察さ
れず、DNA結合が妨げられることが明らかに示され、検出法の特異性がさらに
証明された。
たは変異DNA結合部位への結合をそれぞれ示す。200ngのSplを野生型
DNAと結合させる場合、DNAのみについて測定されたレベルと比較して44
%の減小が観察される。変異DNA配列に対しては、200ngSplの結合は
全く観察されなかった。
複合体を区別することができる。例えば、5μgまたは1μgのc−JUN抗体
を、野生型DNAと複合した1μg c−JUNに結合させると、c−JUN:
DNA複合体(図5A)について得られた25%の減小と比較して、42%およ
び37%の蛍光強度の減小がそれぞれ観察された。IgG:c−JUN複合体は
変異DNA配列に結合しなかった。
質Oct−1の、3つの異なるDNA配列認識部位への種々の結合親和性による
結合を示している。さらに、実施例6−7は、DNA結合タンパク質の供給源と
して粗核タンパク質抽出物を使用しつつ、非常に特異的なタンパク質−DNA結
合を維持することの実現可能性を証明している。各DNA部位への結合親和性に
依存して、非結合DNAに対して達成されるレベルと比較して10%、22%ま
たは32%の減小で、10μgのHeLa細胞核抽出物は野生型Oct−1DN
A結合部位に結合した。
出物であろうと、複数タンパク質複合体(2またはそれより多くの異なるタンパ
ク質から成る)の1つ(または複数)のDNA結合部位への結合を高い信頼性で
測定することができる。例えば、Oct−1:HCF:VP16:DNA複合体
は、高親和性(OCTA+)TAATGARAT部位または低親和性(OCTA- )TAATGARAT部位と結合すると、それぞれ69%および20%の蛍光強
度の減小を生じた(図8および7)。Oct−1タンパク質またはOct−1:
HCF:VP16タンパク質複合体の非結合が、すべての変異DNA配列に対し
て観察される。
界では一般的であり、生物学的にも重要である。粗核タンパク質抽出物を用いて
非常に特異的な様式で単一または複数タンパク質のDNAへの結合を測定する本
発明の方法の能力は、臨床への重要関連事項である。 本発明を詳細にかつ本発明の特定の実施例を参照しながら説明してきたが、当
業者には、本発明の精神および範囲から逸脱することなく種々の変更および改変
を行い得ることは明らかである。
を要するにも拘わらず、タンパク質−核酸相互作用を分析するための最も普及し
ている方法である。一般に、従来の放射性標識法では、特定の酵素によって32 Pで末端が放射性標識されたDNAプローブが必要である。組み込まれなかった 32 Pからの標識DNAの精製には、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、一晩の
溶出、ゲル濾過および濃縮工程が含まれる。32Pの半減期はたった14日であ
るため、各プローブに対して約3週間ごとに放射性標識が必要である。さらに、
タンパク質−32P−DNA複合体は、未変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動
により非結合32P−DNAから分離する必要がある。その後ゲルは、オートラ
ジオグラフィーまたはまたはリンイメージングにより乾燥、分析される。
分析のための簡単で効果的で速い方法に対する要求が、当該技術分野には存在し 続けて いる。
界では一般的であり、生物学的にも重要である。粗核タンパク質抽出物を用いて
非常に特異的な様式で単一または複数タンパク質のDNAへの結合を測定する本
発明の方法の能力は、臨床への重要関連事項である。
Claims (28)
- 【請求項1】少なくとも1つのフルオロフォア標識化合物と少なくとも1つ
の非標識化合物との間の結合を測定する方法であって、前記方法は前記結合の結
果前記少なくとも1つのフルオロフォア標識化合物により発せられた蛍光に対す
る消光効果を検出する工程を含み、前記結合は特異的であると共に、核酸塩基対
核酸塩基以外の結合であり、前記方法は、前記消光効果の検出前に前記少なくと
も1つのフルオロフォア標識化合物と前記少なくとも1つの非標識化合物の複合
体を前記少なくとも1つのフルオロフォア標識化合物から分離せず、かつ前記発
せられた蛍光を消光するためのシグナル消光剤を加えずに行われる、方法。 - 【請求項2】前記消光効果を検出する工程が、 前記少なくとも1つのフルオロフォア標識化合物と前記少なくとも1つの非標
識化合物とを含む試験媒質を提供する工程と、 前記少なくとも1つのフルオロフォア標識化合物が蛍光を発するのに有効な放
射線で、試験媒質を照射する工程と、 前記蛍光の蛍光強度を、前記少なくとも1つ非標識化合物を実質的に欠いてい
る以外には試験媒質と実質的に同一な参照媒質の参照蛍光強度と比較する工程と
を含み、 前記消光効果および前記特異的結合は蛍光強度が参照蛍光強度よりも小さいとき
に検出される、請求項1に記載の方法。 - 【請求項3】前記少なくとも1つのフルオロフォア標識化合物が核酸であり
前記少なくとも1つの非標識化合物がタンパク質であるか、または前記少なくと
も1つのフルオロフォア標識化合物がタンパク質であり前記少なくとも1つの非
標識化合物が核酸である請求項2に記載の方法。 - 【請求項4】前記核酸は、dsDNA、ssDNA、RNA、ssRNA、
dsRNA、mRNA、hnRNA、tRNA、rRNA、ssDNA:RNA
ハイブリッド、dsDNA:RNAハイブリッド、核酸類似体およびオリゴヌク
レオチドから成る群より選択される請求項3に記載の方法。 - 【請求項5】前記タンパク質が、精製調製物、合成調製物、半精製タンパク
質抽出物、粗タンパク質抽出物、またはインビトロ翻訳調製物の形で与えられる
請求項3に記載の方法。 - 【請求項6】前記非標識化合物が、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質ま
たは複数タンパク質の複合体である請求項3に記載の方法。 - 【請求項7】前記少なくとも1つのフルオロフォア標識化合物がタンパク質
であり、前記少なくとも1つの非標識化合物が核酸である請求項2に記載の方法
。 - 【請求項8】前記少なくとも1つのフルオロフォア標識化合物が核酸であり
、前記少なくとも1つの非標識化合物がタンパク質である請求項2に記載の方法
。 - 【請求項9】複数の異なる非標識化合物に対する前記少なくとも1つの標識
化合物の結合親和性を測定する工程をさらに含む請求項2に記載の方法。 - 【請求項10】前記少なくとも1つの標識化合物が核酸であり、前記複数の
異なる非標識化合物がタンパク質である請求項9に記載の方法。 - 【請求項11】前記結合親和性の測定に基づいて前記複数の異なる非標識タ
ンパク質の中から薬剤候補を選択する工程をさらに含む請求項10に記載の方法
。 - 【請求項12】前記結合親和性の測定に基づいて前記複数の異なる非標識タ
ンパク質の中から遺伝子抑制または活性化剤を選択する工程をさらに含む請求項
10に記載の方法。 - 【請求項13】前記タンパク質が同等に結合するかどうかを決定するために
前記複数の異なる非標識タンパク質の結合親和性を比較する工程をさらに含む請
求項10に記載の方法。 - 【請求項14】前記少なくとも1つのフルオロフォア標識化合物は核酸であ
り、前記少なくとも1つの非標識化合物は、前記核酸と複数タンパク質の複合体
を形成する、少なくとも2つのタンパク質である請求項1に記載の方法。 - 【請求項15】前記複数タンパク質の複合体は前記核酸の少なくとも2つの
隣接部位にそれぞれ結合される前記少なくとも2つのタンパク質であり、前記方
法は、前記少なくとも2つのタンパク質が前記少なくとも2つの隣接部位に独立
して、協同的に、または共同作用的に結合するかどうかを決定する工程をさらに
含む請求項14に記載の方法。 - 【請求項16】前記複数タンパク質の複合体は前記核酸の少なくとも2つの
部位にそれぞれ結合される前記少なくとも2つのタンパク質であり、前記2つの
部位は2つの結合したタンパク質が互いに相互作用した場合にループから外れる
介在DNA配列により分離される請求項14に記載の方法。 - 【請求項17】前記タンパク質へのタンパク質結合化合物の結合を検出する
工程をさらに含む請求項8に記載の方法。 - 【請求項18】前記タンパク質結合化合物が、前記タンパク質に対して特異
的に向けられた抗体である請求項17に記載の方法。 - 【請求項19】前記タンパク質と抗体の結合が、蛍光強度が前記抗体の前記
タンパク質への前記結合と前記タンパク質の前記核酸への前記結合とにより消光
されたときに検出される請求項18に記載の方法。 - 【請求項20】前記タンパク質と抗体の結合は蛍光強度が消光しないときに
検出され、前記消光がないのは、タンパク質と抗体の複合体が形成され、前記核
酸の前記タンパク質への結合を妨げられていることを示す請求項18に記載の方
法。 - 【請求項21】前記フルオロフォアの付いていない核酸を前記試験媒質に添
加することにより前記核酸と少なくとも1つのフルオロフォアの付いていない核
酸との間の競合測定を行う工程をさらに含む請求項3に記載の方法。 - 【請求項22】前記少なくとも1つの非標識化合物は変異体である請求項3
に記載の方法。 - 【請求項23】前記少なくとも1つの標識化合物は変異体である請求項3に
記載の方法。 - 【請求項24】前記少なくとも1つの非標識化合物は複数タンパク質の複合
体の中の突然変異タンパク質であり、前記少なくとも1つの非標識化合物は別の
タンパク質が前記少なくとも1つのフルオロフォア標識化合物に結合するのを妨
げる請求項3に記載の方法。 - 【請求項25】前記少なくとも1つの非標識化合物はリン酸化、グリコシル
化または金属イオンとの相互作用により修飾される請求項6に記載の方法。 - 【請求項26】タンパク質抽出物調製の異なる代謝状態の間にDNAと結合
することができる機能タンパク質または複数タンパク質の複合体の存在をタンパ
ク質抽出物内で同定する工程をさらに含む請求項9に記載の方法。 - 【請求項27】前記核酸が修飾されている請求項10に記載の方法。
- 【請求項28】前記核酸がメチル化されている請求項27に記載の方法。
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