JP5415264B2 - 検出可能な核酸タグ - Google Patents
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Description
本件出願で提供する主題は、対象とするタンパク質と連結するか、又は連結することができる核酸タグに関する。詳細には、本件出願で提供する主題は、レポーター機能及びタンパク質タグ付け機能を含むオリゴヌクレオチドに関する。また、本件出願は、それを使用した核酸タグ組成物、キット及び方法も提供する。
タンパク質の存在を定量及び検出するための従来の技術には、ゲル電気泳動、ウェスタンブロット法、ELISAベースの免疫吸収アッセイ及びタンパク質マイクロアレイが含まれる。これらの方法のそれぞれは扱いにくく、ハイスループット使用に適合しない。これらの従来の方法には、検出感度及び特異性の限界もある。本件出願は、核酸タグ、及びその核酸タグを用いる、非常に高感度で選択的な新しいタンパク質検出方法を提供する。
本件出願は、タンパク質と連結するか又は連結することができ、そのタンパク質の高感度検出を可能にする核酸タグを提供する。一実施態様では、核酸タグは、レポーター機能及びタンパク質タグ付け機能を有するオリゴヌクレオチドである。一実施態様では、オリゴヌクレオチド(オリゴマー)は、PCRプローブで判別可能なPCR増幅配列(アンプリコン)である第一の核酸配列、及び対象とするタンパク質と共有結合で連結するか、非共有結合で連結するか、複合体を形成するか、又はその他で結合する(例えば結合するか又は結合することができる)第二の核酸配列を含むオリゴヌクレオチドである。ある実施態様では、アンプリコンは、ランダムに生成される、天然に存在しないPCR増幅配列である。一実施態様では、第一の核酸配列及び/又は第二の核酸配列は、生物に内在しない。他の実施態様では、第一の核酸配列及び/又は第二の核酸配列は、生物に内在する。ある実施態様では、第一の核酸配列及び第二の核酸配列は、異種性である。本明細書で用いるように、2つの核酸配列が「異種性である」場合、第一及び第二の核酸配列は通常一緒に見いだされないことを意味する。例えば、ある実施態様では、第一及び第二の核酸は同じタンパク質をコードせず、及び/又は同じ生物体に由来しない。一部の実施態様では、第一の配列は天然に存在する配列であり、第二の配列は天然に存在する配列であり、該第一及び第二の配列は異なる。具体的な実施形態では、第一の核酸配列は、合成の及び/又はランダムに生成される核酸配列、例えば天然に存在しない配列(例えば、任意の天然に存在する配列から分岐したもの)などの核酸配列である。ある実施態様では、第一の核酸配列は、例えば対象とするタンパク質、融合タンパク質、核酸と相互作用するモチーフ、及び/又は本件出願で提供されるスクリーニングアッセイで用いられるベクターで見いだされない、合成の及び/又はランダムに生成される核酸配列などの核酸配列である。一部の実施態様では、第一の核酸配列は、本件出願で提供されるキナーゼアッセイで核酸タグを用いる予定の場合などの、ヒトキノムに存在しない合成の及び/又はランダムに生成される核酸配列(又は所与のアッセイで用いられる他の任意のヌクレオチド配列)などの核酸配列である。これらの実施態様は、例えば、部分配列PCR増幅のために用いるプライマーが、第二のDNA配列及び/又は他の任意の(例えば、天然に存在する)DNA配列、例えば所与のアッセイで用いられるものと、交差反応及びミスプライムしないことを保証する。ある実施態様では、例えば本件出願で提供される多重アッセイで用いる場合などに、プライマーが鋳型の間で交差反応する機会がないように、各PCR鋳型は他とは異なる。
本件出願で提供される以下の実施態様は、例示であって制限ではない。本件出願で開示される方法はある範囲の適用を有し、その全ては、検出可能な核酸によってタグ付けされる対象とするタンパク質を検出、定量化又は単離する能力に基づく。本件出願で提供される組成物及び方法は、インビトロ及び/又はインビボでタンパク質を標識するために用いることができる。
f/f0 = Kcomp/(Kcomp + [comp])
によって記載することができ、上式で、fは、溶液中の競合試験分子の存在下で固定化参照リガンドに結合した対象とするタンパク質の分画であり;f0は、溶解した試験分子の不在下で結合した分画であり;Kcompは、溶液中の対象とするタンパク質と競合試験分子との間の相互作用の平衡解離定数(Kd)であり;[comp]は、溶液中の競合試験分子の濃度である。試験分子濃度の関数としての参照リガンドに結合した対象とするタンパク質の数は、グラフ上にプロットすることができ、Kdは、その曲線を結合方程式f/f0 = (L + (H-L))×(Kcomp/(Kcomp + [comp]))にあてはめることによって計算することができ、上式で、Lは下のベースラインであり、Hは上のベースラインであり、Kcompは試験分子と対象とするタンパク質との間の相互作用の結合定数であり、[comp]は試験分子の濃度である。50%競合では、試験分子の存在下での結合したタンパク質の分画は、試験分子の不在下でのそれの半分であり、すなわち、f/f0 = 1/2であり、Kcompは[comp]と同等である。
標準の分子生物学技術を用いて、下記の遺伝要素を、遺伝子合成とそれに続く制限消化及びその後のライゲーションによって、一般的な細菌性プラスミドpGEMの主鎖にクローニングした。5'末端から3'末端にかけて記載すると、それらは以下の通りである:
ヒトp38α(GenBank番号NP_620581.1)及びBRAF(GenBank番号NP_004324.1)キナーゼ配列を、DNA結合ドメイン(GAL4又はNF-κB;表1を参照)とインフレーム融合させ、標準の分子クローニングプロトコルを用いて制限消化及びその後のライゲーションによってクローニングした。クローンの配列は、ABI配列決定によって検証した。
ヒト胚腎臓(human embryonic kidney)(HEK)293細胞での一時的なインビトロ発現を、Lipofectamine(登録商標)(Invitrogen社製)を用いて実施し、配列検証したプラスミドDNAを、標準のQiagenプラスミド精製キットを用いて得た。トランスフェクションは、10cmの丸型ペトリプレート内の80%コンフルエント細胞を用いて、37℃で24時間実施した。
ランダムな配列を生成し、ソフトウェアPrimer Express(登録商標)(ABI社製)を用いてアンプリコン配列を設計するために用いた。アンプリコン配列を、ヒトキノム、T7ファージゲノム、及び他のアンプリコン配列に対してBLASTで検索し、BLAST検索における配列との最小の類似性に基づいて選択した。選択されたアンプリコン配列をABIに送り、適切なプライマー及びqPCR蛍光プローブをABIによって調製した。GAL4又はNF-κB認識部位を加えることによってアンプリコン配列をさらに修飾し、完全な核酸タグを作製した。オリゴヌクレオチドを細菌性プラスミドにクローニングし、PCRを用いてタグを複製した。
競合結合アッセイのための親和性樹脂は、以下の通りに調製した。Dynabeads(商標)M280(ストレプトアビジン(Dynal社製#602.10))を振盪及び撹拌によって再懸濁し、ビーズは10mg/mLで懸濁し、アッセイウェルにつき0.4mgを用いた。ビーズを3回洗浄し、1×PBS/0.05%ツイーン20(PBST)で10mg/mLに再懸濁し、2mL試験管に分配した。ビオチン化参照リガンドを調製する技術は公知であり、例えば、米国特許出願公開第20050153371号を参照のこと。ビオチン化参照部分を、0.025〜0.25:1のモル比(参照リガンド:ビオチン結合能力)で試験管に加え、混合し、室温において30分間ローテータ上でインキュベートした。次にビーズを過剰のビオチン(ビオチン対ビオチン結合能力のモル比2:1)でブロックし、ブロック緩衝液(SeaBlock(Pierce社製)、1% BSA、0.05%ツイーン20、1mM DTT)で洗浄して未結合のリガンドを除去し、非特異的タンパク質結合を低減させた。
競合結合アッセイは、HEK293細胞で発現するp38タンパク質、及びp38のATP結合部位に結合する固定化リガンドを特徴とする。p38タンパク質を生成するために、先に述べたように標準のクローニングプロトコルを用いて、p38αのコード領域をGAL4又はNF-κBのDNA結合ドメインとインフレームで融合し、発現ベクターにクローニングした。高い親和性でp38のATP結合部位に結合することが知られている化合物であるSB202190を、固定化参照リガンドとして用いた。ビオチン化した柔軟なリンカーを、p38結合部位を妨害しない位置で、SB202190に結合させた。次に、そのビオチン化リンカーを介して、SB202190をストレプトアビジンでコーティングした磁性ビーズ上に固定化した。
BRAFキナーゼタンパク質を生成するために、BRAFのコード領域をGAL4又はNF-κBのDNA結合ドメイン(表1を参照)とインフレームで融合し、前記発現ベクターにクローニングし、次にHEK293細胞で発現させた。高い親和性でBRAFのATP結合部位に結合することが知られている化合物であるPD-173955を、固定化参照リガンドとして用いた。この連結した化合物は、SB202190ベイトを作製するために用いたものと同じ戦略を用いて生成した。
下の表2は、キナーゼのパネルに対して実施した競合結合アッセイのシグナル対バックグラウンド比を示し、各キナーゼは、NFκBのDNA結合ドメインとの融合タンパク質として調製した。上記のプロトコルを用い、いくつかの既知のATP競合キナーゼ阻害剤を含む溶液中で、潜在的競合試験化合物の混合物の存在下又は不在下で、各キナーゼを、そのコグネイトベイト(参照リガンド)を用いて試験した。30:1のシグナル対バックグラウンド比が許容可能とみなされ、100:1の比が好ましい。
競合結合アッセイは、以下の方法で多重化した:そのコグネイトDNAに対するNF-κBのDNA結合ドメインの高親和性、及び4〜40時間のその長いタンパク質DNA複合体半減期に基づいて、NF-κBのDNA結合領域をキナーゼの融合パートナーとして選択した。競合結合アッセイには、ビオチン化参照リガンドベイトを0.0025〜0.25:1のモル比でビーズに加え、上記方法で処理することによって、リガンドされたビーズを調製することが含まれた。タンパク質抽出物の調製には、二段階希釈が含まれた。第一の希釈ステップでは、各タンパク質抽出物ストックを、10μMの特異なキメラ核酸タグ及び200μg/mLのサケ精子DNAの存在下で、室温において1×PBS/0.05%ツイーン20/0.1% BSA/10mM DTTで100倍に希釈した。第二の希釈ステップは、1μMの「qPCRサイレント」デコイDNAの存在下で異なる希釈抽出物を混合し、1×PBS/0.05%ツイーン20/0.1%BSA/10mM DTTでさらに100倍希釈し、これにより最終希釈物は、各キナーゼ融合タンパク質のキメラ核酸タグの各々の0.1〜1nMを含有する10,000倍希釈のストックを生じる、多重化ステップであった。強いアッセイシグナルを発生する特定のキナーゼをより弱いアッセイシグナルを発生する他のキナーゼで多重化した状況では、異なるキナーゼ抽出物を混合するステップで、弱いシグナルを発生するキナーゼと関連するタグが強いシグナルを発生するキナーゼへ交換される可能性を減少させるために、強いシグナルを発生するキナーゼの第一の希釈ステップは、10nMよりも100nMの核酸タグを含有した。その後の競合結合アッセイステップは、前記の方法で実施した。結合量をqPCRによって決定する読取ステップでは、結合アッセイからの溶出液を異なる試料に等分し、各試料は二重フォーマットで読み取った。或いは、試料は、三色読取りを用いる三重フォーマットでもよい。
不活性形態のAbl1キナーゼは、Abl1融合タンパク質を発現するHEK293細胞を、150mM NaCl、25×無EDTA COMPLETE(Roche社製#11873 580 001)及び10mM DTTを有する1×M-PER緩衝液(Pierce社製#78501)中で溶解することによって調製した。タンパク質抽出物をPCR試験管へ移して、30℃で45分間サーモサイクラー内でインキュベートし、細胞抽出物中の内因性ホスファターゼにAbl1タンパク質を脱リン酸化させ、それによって不活性(非リン酸化)状態のタンパク質分画を増加させた。
本明細書で記載される競合結合アッセイでベイトとして用いる参照リガンドは、一般にATP分子自体よりも大きい。したがって、これらの参照リガンドはATP結合部位よりも多く結合し、それらは、基質結合部位及びドメイン間間隙などの正規のATP結合部位及び隣接部位を含む活性部位に結合するとより正確に記載される。したがって、これらの参照リガンドは、ATP結合部位の結合剤だけでなく、基質結合部位に結合するものを含む、ATP部位に隣接して結合する結合剤も置換する能力を有する。
ヒトO6-アルキルグアニンDNAアルキルトランスフェラーゼ(hAGT)をコードする哺乳動物の発現ベクターを、標準の分子クローニング手順を用いて構築した。クローニングベクター中の遺伝的エレメントには、5'末端から3'末端にかけて、CMVエンハンサー/プロモーター、TEVプロテアーゼ認識配列、続いて完全長p38αキナーゼ、続いてHA11エピトープタグをコードする配列とインフレームで融合した、ヒトO6-アルキルグアニンDNAアルキルトランスフェラーゼをコードする配列が含まれた。
Claims (29)
- 融合タンパク質に結合した核酸オリゴマーを含む組成物であって、
該融合タンパク質が、
(a)対象とするタンパク質を含む第一のドメイン、及び、
(b)該第一のドメインとは異なる核酸相互作用モチーフを含む第二のドメインを含み;
該核酸オリゴマーが、
(c)PCR増幅配列である第一の核酸配列、及び、
(d)該核酸相互作用モチーフに結合する第二の核酸配列を含み;
該第一の核酸配列が該第二の核酸配列に対して異種性である、前記組成物。 - 前記核酸が一本鎖又は二本鎖DNAである、請求項1記載の組成物。
- 前記核酸相互作用モチーフがDNA結合ドメインである、請求項1又は2記載の組成物。
- 前記DNA結合ドメインがNF-κBのDNA結合ドメイン、croリプレッサーのDNA結合ドメイン、lacリプレッサーのDNA結合ドメイン、GAL4のDNA結合ドメイン、GCN4のDNA結合ドメイン、Lex-AのDNA結合ドメイン、Opaque-2のDNA結合ドメイン又は、TGAIaのDNA結合ドメインである、請求項3記載の組成物。
- 前記第二の核酸配列が配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号11、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20又は配列番号21に示す配列を含む、請求項3記載の組成物。
- 前記第二の核酸配列が配列番号10、配列番号12又は配列番号13に示す配列を含む、請求項3記載の組成物。
- 前記オリゴマーが、約50〜約500ヌクレオチドの長さである、請求項1〜6のいずれか一項記載の組成物。
- 前記対象とするタンパク質が膜貫通タンパク質、膜貫通イオンチャネルタンパク質、リガンド作動性イオンチャネルタンパク質、核ホルモン受容体タンパク質、細胞外シグナル伝達分子若しくは因子、サイトカイン、成長因子、ホルモン、酵素、抗体又は短鎖可変断片(scFv)である、請求項1〜7のいずれか一項記載の組成物。
- 前記対象とするタンパク質が活性状態又は不活性状態のキナーゼである、請求項1〜7のいずれか一項記載の組成物。
- 前記キナーゼがヒトキナーゼである、請求項9記載の組成物。
- 前記キナーゼが非受容体チロシンキナーゼである、請求項9記載の組成物。
- 前記非受容体チロシンキナーゼが、ABL、ACK、CSK、MATK、FAK、PYK2、FES、FRK、JAK、SRC-A、SRC-B、TEC又はSYKチロシンキナーゼファミリーのメンバーである、請求項11記載の組成物。
- 前記キナーゼが受容体チロシンキナーゼである、請求項9記載の組成物。
- 前記受容体チロシンキナーゼが、ALK、AXL、DDR、EGFR、EPH、FGFR、INSR、MET、MUSK、PDGFR、PTK7、RET、ROR、ROS、RYK、TIE、TRK、VEGFR、AATYK又はSuRTK106チロシンキナーゼファミリーのメンバーである、請求項13記載の組成物。
- 対象とするタンパク質を検出する方法であって、
融合タンパク質を検出可能な核酸オリゴマーと接触させることを含み、
該融合タンパク質が、対象とするタンパク質を含む第一のドメイン、及び該第一のドメインとは異なる核酸相互作用モチーフを含む第二のドメインを含み、該対象とするタンパク質と該核酸相互作用モチーフとが互いに異なり、該核酸オリゴマーが、(a)PCR増幅配列である第一の核酸配列、及び(b)該核酸相互作用モチーフに結合する第二の核酸配列を含み、該第一の核酸配列が該第二の核酸配列に対して異種性である、前記方法。 - リガンドに結合する対象とするタンパク質を同定する方法であって、
固体支持体上に固定化されたリガンドを、(a)該対象とするタンパク質を含む第一のドメイン、及び(b)該第一のドメインとは異なる核酸相互作用モチーフを含む第二のドメインを含み、該対象とするタンパク質と該核酸相互作用モチーフとが互いに異なる融合タンパク質と接触させること;
(c)PCR増幅配列である第一の核酸配列、及び(d)該核酸相互作用モチーフに結合する第二の核酸配列を含み、該第一の核酸配列が該第二の核酸配列に対して異種性である核酸オリゴマーを加えること;
未結合の核酸オリゴマー及び/又は未結合の融合タンパク質を除去すること;及び、
該核酸オリゴマーが該融合タンパク質に結合するかどうかを検出すること;を含み、
それにより、結合した核酸オリゴマーの検出は、該対象とするタンパク質が該リガンドに結合することを示す、前記方法。 - 対象とするタンパク質に結合する試験化合物を同定する方法であって、
試験化合物の存在下及び不在下で、該対象とするタンパク質に結合する固定化参照リガンドを、(a)該対象とするタンパク質を含む第一のドメイン、及び(b)該第一のドメインとは異なる核酸相互作用モチーフを含む第二のドメインを含み、該対象とするタンパク質と該核酸相互作用モチーフとが互いに異なる融合タンパク質と接触させること;
(c)PCR増幅配列である第一の核酸配列、及び(d)該核酸相互作用モチーフに結合する第二の核酸配列を含み、該第一の核酸配列が該第二の核酸配列に対して異種性である核酸オリゴマーを加えること;
未結合の核酸オリゴマー及び/又は未結合の融合タンパク質を除去すること;及び、
該核酸オリゴマーが該融合タンパク質に結合するかどうかを検出すること;を含み、
試験化合物の不在と比較した、試験化合物の存在下での該固定化参照リガンドに結合した融合タンパク質の量の減少は、該試験化合物が該対象とするタンパク質に結合することを示す、前記方法。 - 対象とするタンパク質に対する試験化合物のKd値を決定する方法であって、
様々な濃度の試験化合物の存在下及び不在下で、該対象とするタンパク質に結合する固定化参照リガンドを、(a)該対象とするタンパク質を含む第一のドメイン、及び(b)該第一のドメインとは異なる核酸相互作用モチーフを含む第二のドメインを含み、該対象とするタンパク質と該核酸相互作用モチーフとが互いに異なる融合タンパク質と接触させること;
(c)PCR増幅配列である第一の核酸配列、及び(d)該核酸相互作用モチーフに結合する第二の核酸配列を含み、該第一の核酸配列が該第二の核酸配列に対して異種性である核酸オリゴマーを加えること;
未結合の核酸オリゴマー及び/又は未結合の融合タンパク質を除去すること;及び、
該試験化合物の様々な濃度のそれぞれ及びその不在下において、該固体支持体上に保持された該融合タンパク質に結合する該核酸オリゴマーを検出し、又は定量することによって、競合結合曲線を得ること;を含み、
それにより、該対象とするタンパク質に対する該試験化合物のKd値は、試験化合物の存在下で該固定化参照リガンドに保持された該対象とするタンパク質が、試験化合物の不在下で保持された該対象とするタンパク質の50%である濃度である、前記方法。 - 2つ以上の対象とするタンパク質に結合する試験化合物をウェル内で同定する方法であって、
試験化合物の存在下及び不在下で、該2つ以上の対象とするタンパク質のそれぞれに結合する固定化参照リガンドを、各融合タンパク質が独立して(a)該2つ以上の対象とするタンパク質の1つだけを含む第一のドメイン、及び(b)該第一のドメインとは異なる核酸相互作用モチーフを含む第二のドメインを含み、該対象とするタンパク質と該核酸相互作用モチーフとが互いに異なる、2つ以上の融合タンパク質と接触させること;
2つ以上の核酸オリゴマーのそれぞれが、該2つ以上の融合タンパク質の1つだけの核酸相互作用モチーフに独立して結合する第一の核酸配列、及びPCR増幅配列である第二の異種性核酸配列を含む、該2つ以上の核酸オリゴマーを加えること;
未結合の核酸オリゴマー及び/又は未結合の融合タンパク質を除去すること;及び、
該2つ以上の核酸オリゴマーのそれぞれを検出し、又は定量すること;を含み、
試験化合物の不在と比較した、試験化合物の存在下での固定化参照リガンドに結合した該2つ以上の融合タンパク質のそれぞれの量の減少は、該試験化合物が該2つ以上の対象とするタンパク質のそれぞれに結合することを示す、前記方法。 - 2つ以上の対象とするタンパク質に対する試験化合物のKd値をウェル内で決定する方法であって、
様々な濃度の試験化合物の存在下及び不在下で、該2つ以上の対象とするタンパク質のそれぞれに結合する固定化参照リガンドを、各融合タンパク質が独立して(a)該2つ以上の対象とするタンパク質の1つだけを含む第一のドメイン、及び(b)該第一のドメインとは異なる核酸相互作用モチーフを含む第二のドメインを含み、該対象とするタンパク質と該核酸相互作用モチーフとが互いに異なる、2つ以上の融合タンパク質と、ウェル内で接触させること;
2つ以上の核酸オリゴマーのそれぞれが、該2つ以上の融合タンパク質の1つだけの核酸相互作用モチーフに独立して結合する第一の核酸配列、及びPCR増幅配列である第二の異種性核酸配列を含む、該2つ以上の核酸オリゴマーを加えること;
未結合の核酸オリゴマー及び/又は未結合の融合タンパク質を除去すること;及び、
該試験化合物の様々な濃度のそれぞれ及びその不在下において、該固体支持体上に保持された該2つ以上の融合タンパク質に結合する該2つ以上の核酸オリゴマーのそれぞれを検出し、又は定量することによって、競合結合曲線を得ること;を含み、
該2つ以上の対象とするタンパク質のそれぞれに対する該試験化合物のKd値は、試験化合物の存在下で該固定化参照リガンドに保持された該2つ以上の対象とするタンパク質のそれぞれが、試験化合物の不在下で保持された該2つ以上の対象とするタンパク質のそれぞれの50%である濃度である、前記方法。 - 前記核酸オリゴマーが放射標識、蛍光標識又はビオチン化されている、請求項19又は20記載の方法。
- 前記参照リガンドがSB202190、スタウロスポリン、プルバラノールB、SU5402、イマチニブメシレート、SU6668、イレッサ又はPD-173955である、請求項17〜21のいずれか一項記載の方法。
- 対象とするタンパク質に結合する試験化合物を同定するためのキットであって、
(a)核酸オリゴマーに結合する融合タンパク質であって、(i)該対象とするタンパク質を含む第一のドメイン、及び(ii)該第一のドメインとは異なる核酸相互作用モチーフを含む第二のドメインを含み、該対象とするタンパク質と該核酸相互作用モチーフとが互いに異なり、該核酸オリゴマーが該融合タンパク質の核酸相互作用モチーフに結合する第一の核酸配列、及びPCR増幅配列である第二の異種性核酸配列を含む、前記融合タンパク質;及び、
(b)該対象とするタンパク質に結合する参照リガンド;
を含む、前記キット。 - 対象とするタンパク質に結合する試験化合物を同定するためのキットを製造する方法であって、
(a)該対象とするタンパク質を含む第一のドメイン、及び(b)該第一のドメインとは異なる核酸相互作用モチーフを含む第二のドメインを含み、該対象とするタンパク質と該核酸相互作用モチーフとが互いに異なる融合タンパク質をクローニングし発現させること;及び、
該融合タンパク質の該核酸相互作用モチーフに結合する第一の核酸配列、及びPCR増幅配列である第二の異種性核酸配列を含む核酸オリゴマーを合成すること;
を含む、前記製造方法。 - 前記対象とするタンパク質に結合する参照リガンドを固体支持体に固定化することをさらに含む、請求項24記載の製造方法。
- 試験化合物が、2つ以上の対象とするタンパク質に結合するか否かをウェル内で決定する方法であって、
(i)核酸オリゴマーを該2つ以上の対象とするタンパク質に接触させるステップであって、該対象とするタンパク質のそれぞれが核酸相互作用モチーフに融合されており、かつ該核酸オリゴマーが(a)PCR増幅配列である第一の核酸配列、及び(b)該核酸相互作用モチーフに結合する第二の核酸配列を含み、該第一の核酸配列が該第二の核酸配列に対して異種性であり、該PCR増幅配列が該2つ以上の対象とするタンパク質のそれぞれに特異である、前記ステップ;
(ii)試験化合物の存在下及び不在下で、該2つ以上の対象とするタンパク質のそれぞれに結合する固定化参照リガンドを、該2つ以上の対象とするタンパク質とウェル内で接触させるステップであって、該2つ以上の対象とするタンパク質のそれぞれが該核酸オリゴマーに結合する、前記ステップ;
(iii)未結合の融合タンパク質を除去するステップ;及び、
(iv)該2つ以上の核酸オリゴマーのそれぞれを検出し、又は定量するステップ;を含み、
試験化合物の不在と比較した、試験化合物の存在下での固定化参照リガンドに結合した2つ以上の対象とするタンパク質のそれぞれの量の減少は、該試験化合物が2つ以上の対象とするタンパク質のそれぞれに結合することを示す、前記方法。 - 2つ以上の対象とするタンパク質に対する試験化合物のKd値をウェル内で決定する方法であって、
(i)核酸オリゴマーを該2つ以上の対象とするタンパク質のそれぞれに接触させるステップであって、該対象とするタンパク質のそれぞれが核酸相互作用モチーフにさらに融合されており、かつ該核酸オリゴマーが(a)PCR増幅配列である第一の核酸配列、及び(b)該第一のドメインとは異なる該核酸相互作用モチーフに結合する第二の核酸配列を含み、該PCR増幅配列が該2つ以上の対象とするタンパク質のそれぞれに特異である、前記ステップ;
(ii)様々な濃度の試験化合物の存在下及び不在下で、該2つ以上の対象とするタンパク質のそれぞれに結合する固定化参照リガンドを、該2つ以上の対象とするタンパク質とウェル内で接触させるステップであって、該2つ以上の対象とするタンパク質のそれぞれが該核酸オリゴマーに結合する、前記ステップ;
(iii)未結合の融合タンパク質を除去するステップ;及び、
(iv)該試験化合物の様々な濃度のそれぞれ及びその不在下において、該固体支持体上に保持された該2つ以上の融合タンパク質に結合する該2つ以上の核酸オリゴマーのそれぞれを検出し、又は定量することによって、競合結合曲線を得るステップ;を含み、
それにより、該2つ以上の対象とするタンパク質のそれぞれに対する該試験化合物のKd値は、試験化合物の存在下で該固定化参照リガンドに保持された該2つ以上の対象とするタンパク質のそれぞれが、試験化合物の不在下で保持された該それぞれの2つ以上の対象とするタンパク質の50%である濃度である、前記方法。 - 前記ステップ(ii)におけるウェルが、前記核酸相互作用モチーフに結合する核酸配列を含み、かつPCR増幅配列を欠失しているPCRサイレント核酸オリゴマーをさらに含む、請求項26又は27記載の方法。
- 前記核酸相互作用モチーフがNFkBである、請求項26〜28のいずれか1項記載の方法。
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