CN102459642A - 采用可检测蛋白质的细胞测定法 - Google Patents
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Abstract
本文中提供了可用于例如测定牵涉细胞过程的蛋白质的活性的测定法。在一些实施方案中,使用核酸标签,且特别地通过检测核酸标签的存在来评估蛋白质的活性。例如,可以使用此类测定法来研究测试化合物作为蛋白质活性的调控剂,例如抑制剂、激动剂和拮抗剂的效果。
Description
1.交叉引用
本申请要求2009年4月24日提交的美国临时申请号61/172,680的权益,通过提及而将其公开内容完整收入本文。
2.发明领域
本文中所提供的主题涉及检测蛋白质修饰领域,包括筛选和鉴定调控牵涉各种细胞过程的蛋白质的活性的化合物的方法。
3.发明概述
本文中提供了可用于例如测定牵涉细胞过程的蛋白质的活性的测定法。在一些实施方案中,使用核酸标签,且特别地通过检测核酸标签的存在来评估蛋白质的活性。例如,可以使用此类测定法来研究测试化合物作为蛋白质活性的调控剂(modulator),例如抑制剂、激动剂和拮抗剂的效果。
如此,在一方面,本文中提供了一种检测通过感兴趣的细胞过程修饰的蛋白质的方法,包括下列步骤:(a)使包含靶蛋白和核酸相互作用基序的可检测蛋白质与以下接触:(i)抗体,其结合已经通过所述感兴趣的细胞过程修饰过的靶蛋白;和(ii)核酸寡聚物,其包含结合所述核酸相互作用基序的核酸序列;并(b)检测与可检测蛋白质结合的所述核酸寡聚物的存在,所述可检测蛋白质也被所述抗体结合;其中步骤(b)的结合的核酸寡聚物的存在指示通过所述感兴趣的细胞过程修饰的蛋白质的存在。在一些实施方案中,在步骤(a)中在使所述可检测蛋白质与所述核酸寡聚物接触前使所述可检测蛋白质与所述抗体接触。在一些实施方案中,在步骤(a)中在使所述可检测蛋白质与所述核酸寡聚物接触后使所述可检测蛋白质与所述抗体接触。在一些实施方案中,在步骤(a)中使所述可检测蛋白质与所述抗体和所述核酸寡聚物同时接触。
在一些实施方案中,所述细胞过程选自酰化、乙酰化、脱乙酰化、甲酰化、烷基化、甲基化、磷酸化、脱磷酸化、硫酸化、氧化、还原、羟基化、脱酰胺化、羧基化、二硫化物形成、异戊烯化、糖化、糖基化、泛素化、SUMO化(sumoylation)、蛋白水解、外消旋化和异构化。在一个具体的实施方案中,细胞过程是磷酸化。
在一些实施方案中,所述靶蛋白是激酶底物。在一些实施方案中,经修饰的靶蛋白是在一个或多个残基处磷酸化的,且所述抗体是抗磷酸抗体。在一些实施方案中,经修饰的靶蛋白是在一个或多个酪氨酸残基处磷酸化的,且所述抗体是抗磷酸酪氨酸抗体。在一些实施方案中,经修饰的靶蛋白是在一个或多个丝氨酸残基处磷酸化的,且所述抗体是抗磷酸丝氨酸抗体。在一些实施方案中,经修饰的靶蛋白是在一个或多个苏氨酸残基处磷酸化的,且所述抗体是抗磷酸苏氨酸抗体。
在一些实施方案中,所述靶蛋白是G偶联蛋白受体、离子通道蛋白、核受体蛋白、转录因子、激酶、细胞因子、生长因子、激素、酶、抗体或小链可变片段(small chain variable fragment,scFv)。
在一些实施方案中,核酸相互作用基序是DNA结合域。在一些实施方案中,DNA结合域是NF-κB DNA结合域、cro阻抑物DNA结合域、lac阻抑物DNA结合域、GAL4 DNA结合域、GCN4 DNA结合域、Lex-A DNA结合域、Opaque-2(Opaque-2)DNA结合域或TGA1a DNA结合域。在具体的实施方案中,核酸相互作用基序包含SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6中所描述的氨基酸序列。
在一些实施方案中,所述寡聚物的长度为约50-500个核苷酸。
在另一方面,本文中提供了一种鉴定调控细胞过程的测试化合物的方法,其中所述细胞过程修饰靶蛋白,所述方法包括下列步骤:(a)使包含可检测蛋白质的细胞或细胞裂解物与测试化合物接触,其中所述可检测蛋白质包含所述靶蛋白和核酸相互作用基序;(b)使所述可检测蛋白质与以下接触:(i)抗体,其特异性结合已经由于所述细胞过程而修饰过的所述靶蛋白;和(ii)核酸寡聚物,其包含结合所述核酸相互作用基序的核酸序列;并(c)检测与所述可检测蛋白质结合的核酸寡聚物的量,所述可检测蛋白质也被所述抗体结合;其中相对于在没有所述测试化合物的情况中检出的结合的核酸寡聚物量,在存在所述测试化合物的情况中检出的步骤(c)的结合的核酸寡聚物量的增加或减少指示所述测试化合物调控所述细胞过程。
在一些实施方案中,相对于在没有所述测试化合物的情况中检出的结合的核酸寡聚物量,在存在所述测试化合物的情况中检出的步骤(c)的结合的核酸寡聚物量的增加指示所述测试化合物使所述细胞过程激动(agonize thecellular process)。在一些实施方案中,相对于在没有所述测试化合物的情况中检出的结合的核酸寡聚物量,在存在所述测试化合物的情况中检出的步骤(c)的结合的核酸寡聚物量的减少指示所述测试化合物抑制所述细胞过程。
在一些实施方案中,步骤(a)包括使包含可检测蛋白质的细胞与测试化合物接触。在一些实施方案中,所述细胞瞬时表达所述可检测蛋白质。在一些实施方案中,所述细胞稳定表达所述可检测蛋白质。
在一些实施方案中,所述细胞过程选自酰化、乙酰化、脱乙酰化、甲酰化、烷基化、甲基化、磷酸化、脱磷酸化、硫酸化、氧化、还原、羟基化、脱酰胺化、羧基化、二硫化物形成、异戊烯化、糖化、糖基化、泛素化、SUMO化、蛋白水解、外消旋化和异构化。在一个具体的实施方案中,细胞过程是磷酸化。
在一些实施方案中,所述靶蛋白是激酶底物。在一些实施方案中,经修饰的靶蛋白是在一个或多个酪氨酸残基处磷酸化的,且所述抗体是抗磷酸酪氨酸抗体。在一些实施方案中,经修饰的靶蛋白是在一个或多个丝氨酸残基处磷酸化的,且所述抗体是抗磷酸丝氨酸抗体。在一些实施方案中,经修饰的靶蛋白是在一个或多个苏氨酸残基处磷酸化的,且所述抗体是抗磷酸苏氨酸抗体。
在一些实施方案中,所述靶蛋白是G偶联蛋白受体、离子通道蛋白、核受体蛋白、转录因子、激酶、细胞因子、生长因子、激素、酶、抗体或小链可变片段(scFv)。
在一些实施方案中,核酸相互作用基序是DNA结合域。在一些实施方案中,DNA结合域是NF-κB DNA结合域、cro阻抑物DNA结合域、lac阻抑物DNA结合域、GAL4 DNA结合域、GCN4 DNA结合域、Lex-A DNA结合域、Opaque-2 DNA结合域或TGA1a DNA结合域。在具体的实施方案中,核酸相互作用基序包含SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6中所描述的氨基酸序列。
在一些实施方案中,所述寡聚物的长度为约50-500个核苷酸。
在一些实施方案中,所述激酶底物是Mek1,其中所述抗体特异性结合磷酸化的Mek1,且步骤(a)进一步包括制备阳性对照样品,由此使所述包含可检测蛋白质的细胞或细胞裂解物与Braf抑制剂而非测试化合物接触。在这些实施方案内,相对于在没有抑制剂的情况中检出的结合的核酸寡聚物量,与Braf抑制剂接触优选地导致步骤(c)中检出的结合的核酸寡聚物量的减少,由此指示Braf抑制剂抑制Braf激酶活性,例如抑制MEK1的磷酸化。在一些实施方案中,所述Braf抑制剂选自BAY-43-9006、PLX-4720、Chir-265。
在一些实施方案中,所述激酶底物是Akt1,且所述抗体结合磷酸化的Akt。在一些实施方案中,所述抗体结合Ser473或Thr308处磷酸化的Akt1。在一些实施方案中,所述抗体结合Thr308处磷酸化的Akt1。在一些实施方案中,所述抗体结合Ser473处磷酸化的Akt1。
在一些实施方案中,所述激酶底物是FRAP1或PDPK1,其中所述抗体分别特异性结合磷酸化的FRAP1或磷酸化的PDPK1,且步骤(a)进一步包括制备阳性对照样品,由此使所述包含可检测蛋白质的细胞或细胞裂解物与PIK3CA抑制剂而非测试化合物接触。在这些实施方案内,相对于在没有抑制剂的情况中检出的结合的核酸寡聚物量,与PIK3CA抑制剂接触优选地导致步骤(c)中检出的结合的核酸寡聚物量的减少,由此指示PIK3CA抑制剂抑制PIK3CA激酶活性,例如分别抑制FRAP1或PDPK1的磷酸化。在一些实施方案中,PIK3CA抑制剂选自PI103、ZSTK-474、渥曼青霉素(wortmannin)和PIK-93。
在一些实施方案中,所述激酶底物是AKT1,其中所述抗体特异性结合磷酸化的AKT1,且步骤(a)进一步包括制备阳性对照样品,由此使所述包含可检测蛋白质的细胞或细胞裂解物与PDPK1、FRAP1或mTOR抑制剂而非测试化合物接触。在这些实施方案内,相对于在没有抑制剂的情况中检出的结合的核酸寡聚物量,与PDPK1、FRAP1或mTOR抑制剂接触优选地导致步骤(c)中检出的结合的核酸寡聚物量的减少,由此指示PDPK1、FRAP1或mTOR抑制剂抑制PDPK1、FRAP1或mTOR激酶活性,例如抑制AKT1的磷酸化。在一些实施方案中,PDPK1抑制剂是BX-795。
在一些实施方案中,所述激酶底物是FOXO1,且所述抗体特异性结合磷酸化的FOXO1。在一些实施方案中,所述抗体结合Thr24处磷酸化的FOXO1。
在一些实施方案中,步骤(a)进一步包括制备阳性对照样品,由此使所述包含可检测蛋白质的细胞或细胞裂解物与AKT1抑制剂而非测试化合物接触。在一些实施方案中,Akt1抑制剂是GSK-690693。
在一些实施方案中,本文中所提供的方法包括使所述包含可检测蛋白质的细胞或细胞裂解物与至少两个浓度的测试化合物接触,并计算所述测试化合物的IC50。
在一些实施方案中,所述核酸寡聚物包含(a)作为PCR扩增序列的第一核酸序列,和(b)结合所述核酸相互作用基序的第二核酸序列,其中所述第一核酸序列对于所述第二核酸序列而言是异源的。
在一些实施方案中,本文中所提供的方法包括qPCR扩增与所述可检测蛋白质结合的所述核酸寡聚物。在一些实施方案中,所述核酸寡聚物是放射性标记的、荧光标记的或生物素化的。
在本文中所提供的方法的一些实施方案中,所述抗体是固定于固体支持物上的。在一些实施方案中,所述抗体是固定于多孔板上的。
在又一方面,本文中提供了一种试剂盒,其包含:包含可检测蛋白质的细胞,其中所述可检测蛋白质包含可以通过细胞过程修饰的靶蛋白、核酸相互作用基序;和包含结合所述核酸相互作用基序的核酸序列的核酸寡聚物。在一些实施方案中,试剂盒进一步包含结合已经通过所述感兴趣的细胞过程修饰过的靶蛋白的抗体。在一些实施方案中,所述细胞过程是磷酸化,且所述经修饰的靶蛋白是磷酸化的靶蛋白。
4.附图简述
图1提供了描绘细胞测定法的示意图,所述细胞测定法利用包含靶蛋白和核酸相互作用基序的可检测蛋白质、结合已经通过细胞过程修饰过的靶蛋白的抗体、和包含结合核酸相互作用基序的核酸序列的核酸寡聚物。
图2提供了PIK3CA信号传导途径的图。
图3至图7提供了多种化合物的剂量响应曲线,其中x-轴表示按nM计的化合物浓度,而y-轴表示通过qPCR产生的信号,其按探针等同单位(PEU)计。
图3提供了自磷酸-Mek1结合测定法获得的BAY-43-9006、PLX-4720、Chir-265和CI-1040的剂量响应曲线。
图4提供了自磷酸-Akt(Ser473)结合测定法和磷酸-Akt(Thr308)结合测定法获得的PI103、ZSTK-474、BX-795、渥曼青霉素和PIK93的剂量响应曲线。
图5提供了在磷酸-Akt1(Ser473)测定法中的BX-795、TG-100-115、根赤壳菌素(radicicol)和曲西立滨(triciribine)的剂量响应曲线。
图6提供了在磷酸-Akt1(Thr308)测定法中的根赤壳菌素和曲西立滨的剂量响应曲线。
图7提供了在AKT1-磷酸-FOXO(T24)测定法中的GSK-690693、PI103和BX-795的剂量响应曲线。
5.发明详述
5.1术语
如本文中所使用的,术语“靶蛋白”指可以由于细胞过程,诸如本文中所描述的那些细胞过程而修饰的任何感兴趣的蛋白质。在一些实施方案中,通过具有酶或催化活性的蛋白质修饰靶蛋白。
如本文中所使用的,术语“细胞过程”和“感兴趣的细胞过程”可互换使用,指细胞中发生的任何导致对细胞蛋白质的修饰的事件。在一些实施方案中,细胞过程发生在活细胞经历的过程期间,例如在摄取、转运、受体结合、代谢、融合、生物化学应答、细胞脱离(detachment)、细胞迁移、细胞生长、坏死和凋亡期间。在其它实施方案中,细胞过程发生在肿瘤发生、转化和/或转移期间。在一些实施方案中,细胞过程导致具有催化或酶活性的蛋白质对蛋白质,例如靶蛋白的修饰。在其它实施方案中,细胞过程导致酶促或非酶促蛋白质修饰。在某些实施方案中,酶促或非酶促蛋白质修饰是共价修饰。在其它实施方案中,细胞过程导致酶促非共价蛋白质修饰,包括但不限于蛋白水解、外消旋化或异构化。在其它实施方案中,细胞过程导致非共价修饰,诸如蛋白质同或异二聚化或牵涉配体、生长因子、激素、细胞因子、变构调控剂、辅因子、辅酶和第二信使的其它结合事件。例示性细胞过程包括但不限于酰化、乙酰化、脱乙酰化、甲酰化、烷基化、甲基化、磷酸化、脱磷酸化、硫酸化、氧化、还原、羟基化、脱酰胺化、羧基化、二硫化物形成、异戊烯化、糖化、糖基化、泛素化、SUMO化、蛋白水解、外消旋化和异构化。如此,如本文中所使用的,通过细胞过程修饰的蛋白质是经历修饰的蛋白质,所述修饰包括但不限于由于细胞过程所致的酰化、乙酰化、脱乙酰化、甲酰化、烷基化、甲基化、磷酸化、脱磷酸化、硫酸化、氧化、还原、羟基化、脱酰胺化、羧基化、二硫化物形成、异戊烯化、糖化、糖基化、泛素化、SUMO化、蛋白水解、外消旋化和异构化。
如本文中所使用的,术语“抗体”和“免疫球蛋白”或“Ig”可以互换使用。如本文中所使用的,“抗体”可以是任何类型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、任何类别(例如,IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)、或任何亚类(例如,IgG2a和IgG2b)的免疫球蛋白分子,或其任何抗原识别(或抗原结合)片段。抗体可以是单克隆或多克隆的,并且可以是任何起源物种的,包括但不限于小鼠、大鼠、兔、马、或人,或者可以是嵌合抗体。参见例如Walker等,Molec.Immunol.1989;26:403-411;Morrision等,Proc.Nat’l.Acad.Sci.1984;81:6851;Neuberger等,Nature 1984;312:604。抗体可以是依照美国专利No.4,474,893(Reading)或美国专利No.4,816,567(Cabilly等)中所披露的方法来生成的重组单克隆抗体。抗体也可以通过依照美国专利No.4,676,980(Segel等)中所披露的方法生成的特定抗体来化学构建。本发明的抗体包括但不限于合成的抗体、单克隆抗体、重组生成的抗体、多特异性抗体(包括双特异性抗体)、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、细胞内抗体(intrabody)、单链Fv(scFv)(例如,包括单特异性、双特异性,等等)、驼源化(camelized)抗体、Fab片段、F(ab’)2片段、二硫化物连接的Fv(sdFv)、抗独特型(抗-Id)抗体、和任何上述物的表位结合片段。特别地,本发明的抗体包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫学活性部分,即含有免疫特异性结合例如经修饰的感兴趣蛋白质的抗原结合位点的抗原结合域或分子。在某些实施方案中,抗体是IgG抗体,诸如单克隆IgG抗体。
如本文中所使用的,术语“抗磷酸抗体”指特异性结合蛋白质抗原或表位,包括激酶抗原或表位的磷酸化形式(例如,包含磷酸酪氨酸、磷酸苏氨酸或磷酸丝氨酸的表位),而不特异性结合蛋白质抗原或表位的非磷酸化形式的抗体和抗体片段。特异性结合抗原的抗体或片段可以与相关抗原有交叉反应性。在一个实施方案中,抗磷酸抗体是特异性结合激酶抗原,而不与其它抗原起交叉反应的抗体或抗体片段。可以例如通过免疫测定法、BIAcore、或本领域技术人员已知的其它技术来鉴定特异性结合激酶抗原的抗体或抗体片段。如使用实验技术,诸如RIA和ELISA测定,在抗体或抗体片段以比对任何交叉反应性抗原高的亲和力结合抗原时,其特异性结合抗原。典型地,特异性或选择性反应会是背景信号或噪音的至少两倍,且更典型地,是背景的超过10倍。在一个实施方案中,抗磷酸抗体是抗磷酸酪氨酸抗体(又称为“抗-pTyr”或“抗-py”),其特异性结合蛋白质或酶的一个或多个磷酸化的酪氨酸残基,包括激酶的一个或多个磷酸化的酪氨酸残基。在一个实施方案中,抗磷酸抗体是抗磷酸丝氨酸抗体(又称为“抗-pSer”或“抗-pS”),其特异性结合蛋白质或酶的一个或多个磷酸化的丝氨酸残基,包括激酶的一个或多个磷酸化的丝氨酸残基。在一个实施方案中,抗磷酸抗体是抗磷酸苏氨酸抗体(又称为“抗-pThr”或“抗-pT”),其特异性结合蛋白质或酶的一个或多个磷酸化的苏氨酸残基,包括激酶的一个或多个磷酸化的苏氨酸残基。在某些实施方案中,抗磷酸抗体免疫特异性结合激酶的一个或多个特定位置处的一个或多个磷酸化的酪氨酸(Y)、丝氨酸(S)或苏氨酸(T)残基。在另一个具体实施方案中,抗磷酸抗体仅特异性结合蛋白质的一个磷酸化的氨基酸残基。
“化合物”或“测试化合物”指一种或多种有机化学化合物、无机化学化合物、合成的核酸、天然的核酸、合成的多肽、天然的多肽、肽片段和/或蛋白质。如本文中所使用的,术语“化合物”或“测试化合物”还包括实验用小分子、得到FDA批准的小分子治疗剂、为抗体定向疗法开发的抗体和其它治疗剂。
5.2鉴定通过细胞过程调控的蛋白质的方法
本文中所提供的以下实施方案是例示性的,并且不是限制性的。本文中所公开的方法具有应用范围。本文中所提供的组合物和方法可以在体外和/或在体内使用。
在一方面,本文中提供了一种检测通过感兴趣的细胞过程修饰的靶蛋白的方法,包括下列步骤:(a)使包含靶蛋白和核酸相互作用基序的可检测蛋白质与以下接触:(i)抗体,其结合已经通过感兴趣的细胞过程修饰过的靶蛋白;和(ii)核酸寡聚物,其包含结合所述核酸相互作用基序的核酸序列;并(b)检测与所述可检测蛋白质结合的所述核酸寡聚物的存在,所述可检测蛋白质也被所述抗体结合;其中步骤(b)的核酸寡聚物的存在指示通过所述感兴趣的细胞过程修饰的靶蛋白的存在。在一些实施方案中,在步骤(a)中在使所述可检测蛋白质与所述核酸寡聚物接触前使所述可检测蛋白质与所述抗体接触。在一些实施方案中,在步骤(a)中在使所述可检测蛋白质与所述核酸寡聚物接触后使所述可检测蛋白质与所述抗体接触。在一些实施方案中,在步骤(a)中使所述可检测蛋白质与所述抗体和所述核酸寡聚物同时接触。
在一些实施方案中,细胞过程选自酰化、乙酰化、脱乙酰化、甲酰化、烷基化、甲基化、磷酸化、脱磷酸化、硫酸化、氧化、还原、羟基化、脱酰胺化、羧基化、二硫化物形成、异戊烯化、糖化、糖基化、泛素化、SUMO化、蛋白水解、外消旋化和异构化。在一个具体的实施方案中,细胞过程是磷酸化。
在一些实施方案中,所述靶蛋白是激酶底物。在一些实施方案中,经修饰的靶蛋白是在一个或多个残基处磷酸化的,且所述抗体是抗磷酸抗体。在一些实施方案中,经修饰的靶蛋白是在一个或多个酪氨酸残基处磷酸化的,且所述抗体是抗磷酸酪氨酸抗体。在一些实施方案中,经修饰的靶蛋白是在一个或多个丝氨酸残基处磷酸化的,且所述抗体是抗磷酸丝氨酸抗体。在一些实施方案中,经修饰的靶蛋白是在一个或多个苏氨酸残基处磷酸化的,且所述抗体是抗磷酸苏氨酸抗体。
在一些实施方案中,所述靶蛋白是G偶联蛋白受体、离子通道蛋白、核受体蛋白、转录因子、激酶、细胞因子、生长因子、激素、酶、抗体或小链可变片段(scFv)。
在一些实施方案中,核酸相互作用基序是DNA结合域。在一些实施方案中,DNA结合域是NF-κB DNA结合域、cro阻抑物DNA结合域、lac阻抑物DNA结合域、GAL4 DNA结合域、GCN4 DNA结合域、Lex-A DNA结合域、Opaque-2 DNA结合域或TGA1a DNA结合域。在具体的实施方案中,核酸相互作用基序包含SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6中所描述的氨基酸序列。
在一些实施方案中,所述寡聚物的长度为约50-500个核苷酸。
在另一方面,本文中提供了一种鉴定调控细胞过程的测试化合物的方法,其中所述细胞过程修饰靶蛋白,所述方法包括下列步骤:(a)使包含可检测蛋白质的细胞或细胞裂解物与测试化合物接触,其中所述可检测蛋白质包含所述靶蛋白和核酸相互作用基序;(b)使所述可检测蛋白质与以下接触:(i)抗体,其特异性结合已经由于所述细胞过程而修饰过的所述靶蛋白;和(ii)核酸寡聚物,其包含结合所述核酸相互作用基序的核酸序列;并(c)检测与所述可检测蛋白质结合的核酸寡聚物量,所述可检测蛋白质也被所述抗体结合;其中相对于在没有所述测试化合物的情况中检出的结合的核酸寡聚物量,在存在所述测试化合物的情况中检出的步骤(c)的结合的核酸寡聚物量的增加或减少指示所述测试化合物调控所述细胞过程。
在一些实施方案中,相对于在没有所述测试化合物的情况中检出的结合的核酸寡聚物量,在存在所述测试化合物的情况中检出的步骤(c)的结合的核酸寡聚物量的增加指示所述测试化合物使所述细胞过程激动。在一些实施方案中,相对于在没有所述测试化合物的情况中检出的结合的核酸寡聚物量,在存在所述测试化合物的情况中检出的步骤(c)的结合的核酸寡聚物量的减少指示所述测试化合物抑制所述细胞过程。
在一些实施方案中,步骤(a)包括接触包含可检测蛋白质的细胞。在一些实施方案中,所述细胞瞬时表达所述可检测蛋白质。在一些实施方案中,所述细胞稳定表达所述可检测蛋白质。
在一些实施方案中,所述细胞过程选自酰化、乙酰化、脱乙酰化、甲酰化、烷基化、甲基化、磷酸化、脱磷酸化、硫酸化、氧化、还原、羟基化、脱酰胺化、羧基化、二硫化物形成、异戊烯化、糖化、糖基化、泛素化、SUMO化、蛋白水解、外消旋化和异构化。在一个具体的实施方案中,所述细胞过程是磷酸化。
在一些实施方案中,所述靶蛋白是激酶底物。在一些实施方案中,经修饰的靶蛋白是在一个或多个酪氨酸残基处磷酸化的,且所述抗体是抗磷酸酪氨酸抗体。在一些实施方案中,经修饰的靶蛋白是在一个或多个丝氨酸残基处磷酸化的,且所述抗体是抗磷酸丝氨酸抗体。在一些实施方案中,经修饰的靶蛋白是在一个或多个苏氨酸残基处磷酸化的,且所述抗体是抗磷酸苏氨酸抗体。
在一些实施方案中,所述靶蛋白是G偶联蛋白受体、离子通道蛋白、核受体蛋白、转录因子、激酶、细胞因子、生长因子、激素、酶、抗体或小链可变片段(scFv)。
在一些实施方案中,核酸相互作用基序是DNA结合域。在一些实施方案中,DNA结合域是NF-κB DNA结合域、cro阻抑物DNA结合域、lac阻抑物DNA结合域、GAL4 DNA结合域、GCN4 DNA结合域、Lex-A DNA结合域、Opaque-2 DNA结合域或TGA1a DNA结合域。在具体的实施方案中,核酸相互作用基序包含SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6中所描述的氨基酸序列。
在一些实施方案中,所述寡聚物的长度为约50-500个核苷酸。
在一些实施方案中,所述激酶底物是Mek1,其中所述抗体特异性结合磷酸化的Mek1,且步骤(a)进一步包括制备阳性对照样品,由此使所述包含可检测蛋白质的细胞或细胞裂解物与Braf抑制剂而非测试化合物接触。在这些实施方案内,相对于在没有抑制剂的情况中检出的结合的核酸寡聚物量,与Braf抑制剂接触优选地导致步骤(c)中检出的结合的核酸寡聚物量的减少,由此指示Braf抑制剂抑制Braf激酶活性,例如抑制MEK1的磷酸化。在一些实施方案中,所述Braf抑制剂选自BAY-43-9006、PLX-4720、Chir-265。
在一些实施方案中,所述激酶底物是Akt1,且所述抗体结合磷酸化的Akt。在一些实施方案中,所述抗体结合Ser473或Thr308处磷酸化的Akt1。在一些实施方案中,所述抗体结合Thr308处磷酸化的Akt1。在一些实施方案中,所述抗体结合Ser473处磷酸化的Akt1。
在一些实施方案中,所述激酶底物是FRAP1或PDPK1,其中所述抗体分别特异性结合磷酸化的FRAP1或磷酸化的PDPK1,且步骤(a)进一步包括制备阳性对照样品,由此使所述包含可检测蛋白质的细胞或细胞裂解物与PIK3CA抑制剂而非测试化合物接触。在这些实施方案内,相对于在没有抑制剂的情况中检出的结合的核酸寡聚物量,与PIK3CA抑制剂接触优选地导致步骤(c)中检出的结合的核酸寡聚物量的减少,由此指示PIK3CA抑制剂抑制PIK3CA激酶活性,例如分别抑制FRAP1或PDPK1的磷酸化。在一些实施方案中,PIK3CA抑制剂选自PI103、ZSTK-474、渥曼青霉素(wortmannin)和PIK-93。
在一些实施方案中,所述激酶底物是AKT1,其中所述抗体特异性结合磷酸化的AKT1,且步骤(a)进一步包括制备阳性对照样品,由此使所述包含可检测蛋白质的细胞或细胞裂解物与PDPK1、FRAP1或mTOR抑制剂而非测试化合物接触。在这些实施方案内,相对于在没有抑制剂的情况中检出的结合的核酸寡聚物量,与PDPK1、FRAP1或mTOR抑制剂接触优选地导致步骤(c)中检出的结合的核酸寡聚物量的减少,由此指示PDPK1、FRAP1或mTOR抑制剂抑制PDPK1、FRAP1或mTOR激酶活性,例如抑制AKT1的磷酸化。在一些实施方案中,PDPK1抑制剂是BX-795。
在一些实施方案中,所述激酶底物是FOXO1,且所述抗体特异性结合磷酸化的FOXO1。在一些实施方案中,所述抗体结合Thr24处磷酸化的FOXO1。
在一些实施方案中,步骤(a)进一步包括制备阳性对照样品,由此使所述包含可检测蛋白质的细胞或细胞裂解物与AKT1抑制剂而非测试化合物接触。在一些实施方案中,Akt1抑制剂是GSK-690693。
在一些实施方案中,所述核酸寡聚物包含(a)作为PCR扩增序列的第一核酸序列,和(b)结合所述核酸相互作用基序的第二核酸序列,其中所述第一核酸序列对于所述第二核酸序列而言是异源的。
在一些实施方案中,所述方法进一步包括实施对照实验以测定测试化合物是否与特异性结合靶蛋白的经修饰形式的抗体竞争对靶蛋白的结合。在优选的实施方案中,使用本文中所提供的方法来鉴定不与特异性结合靶蛋白的经修饰形式的抗体竞争对靶蛋白的结合的测试化合物。
在一些实施方案中,检测与可检测蛋白质结合的核酸寡聚物量的步骤包括qPCR扩增与可检测蛋白质结合的核酸寡聚物。在一些实施方案中,所述核酸寡聚物是放射性标记的、荧光标记的或生物素化的。
在一个实施方案中,经由细胞内部发生的细胞过程修饰靶蛋白。在另一个实施方案中,自细胞裂解物获得包含DNA结合域和靶蛋白的可检测蛋白质。在另一个实施方案中,化学合成包含DNA结合域和靶蛋白的可检测蛋白质。在具体的实施方案中,在无细胞系统中修饰包含DNA结合域和靶蛋白的可检测蛋白质。
在另一方面,本文中提供了鉴定调控酶活性的测试化合物的方法,其中所述酶活性修饰靶蛋白,所述方法包括下列步骤:(a)使包含可检测蛋白质的细胞或细胞裂解物与测试化合物接触,其中所述可检测蛋白质包含靶蛋白和核酸相互作用基序;(b)使所述可检测蛋白质与以下接触:(i)抗体,其特异性结合已经由于酶活性而修饰过的靶蛋白;和(ii)核酸寡聚物,其包含结合所述核酸相互作用基序的核酸序列;并(c)检测与所述可检测蛋白质结合的核酸寡聚物量,所述可检测蛋白质也被所述抗体结合;其中相对于在没有所述测试化合物的情况中检出的结合的核酸寡聚物量,在存在所述测试化合物的情况中检出的步骤(c)的结合的核酸寡聚物量的增加或减少指示所述测试化合物调控酶活性。
在另一方面,本文中提供了鉴定抑制酶活性的化合物的方法,所述方法包括下列步骤:(a)使包含可检测蛋白质的细胞或细胞裂解物与测试化合物接触,其中所述可检测蛋白质包含靶蛋白和核酸相互作用基序;(b)使所述可检测蛋白质与以下接触:(i)抗体,其特异性结合已经由于酶活性而修饰过的靶蛋白;和(ii)核酸寡聚物,其包含结合所述核酸相互作用基序的核酸序列;并(c)检测与所述可检测蛋白质结合的核酸寡聚物量,所述可检测蛋白质也被所述抗体结合;其中相对于在没有所述测试化合物的情况中检出的结合的核酸寡聚物量,在存在所述测试化合物的情况中检出的步骤(c)的结合的核酸寡聚物量的减少指示所述测试化合物抑制酶活性。
在一些实施方案中,酶活性选自酰化、乙酰化、脱乙酰化、甲酰化、烷基化、甲基化、磷酸化、脱磷酸化、硫酸化、氧化、还原、羟基化、脱酰胺化、羧基化、二硫化物形成、异戊烯化、糖化、糖基化、泛素化、SUMO化、蛋白水解、外消旋化和异构化。在一个具体的实施方案中,酶活性是激酶活性。在一个具体的实施方案中,酶活性是磷酸化。在另一个实施方案中,酶活性是磷酸酶活性。在另一个实施方案中,酶活性是甲基转移酶活性。在另一个实施方案中,酶活性是乙酰基转移酶活性。
在又一方面,本文中提供了测量化合物针对酶的IC50的方法,所述方法包括下列步骤:(a)在没有化合物的情况中制备至少一个样品,并在存在增加量的化合物的情况中制备多个样品,其中每个样品源自多个包含可检测蛋白质的细胞或细胞裂解物,其中所述可检测蛋白质包含核酸相互作用基序和酶底物;(b)使可检测蛋白质与结合已经通过细胞过程修饰过的酶底物的抗体接触;(c)分开结合抗体的可检测蛋白质与未结合的可检测蛋白质和未结合的抗体;(d)使结合抗体的可检测蛋白质与结合核酸相互作用基序的核酸寡聚物接触;并(e)检测步骤(a)中制备的每个样品的结合的核酸寡聚物量;其中检出的结合的核酸寡聚物量是在没有化合物的情况中制备的样品中检出的结合的核酸寡聚物量的一半的化合物浓度是化合物针对酶的IC50。
本文中所描述的任何方法可以以单重或多重形式运行。在一个例示性的多重形式中,同时对测试化合物筛选并测试其针对来自一组感兴趣的蛋白质的多种蛋白质(每种均牵涉感兴趣的细胞过程)的调控特性。在同时或序贯测定多种蛋白质的情况中,可以使用对于通过每种感兴趣的蛋白质修饰的蛋白质而言独特的核酸寡聚物来区别每种感兴趣的蛋白质的活性。
5.2.1可检测蛋白质
在某些实施方案中,感兴趣的蛋白质是靶蛋白与异源核酸相互作用基序间的嵌合融合物。在此类嵌合融合物中,可以以符合读码框的方式融合代表嵌合物的各一半的至少两种基因序列,将其克隆入合适的载体中,并在选定的宿主细胞中表达。或者,靶蛋白可以以其它方式与核酸相互作用基序合成连接(例如,使用多肽接头进行)。在某些实施方案中,靶蛋白在核酸相互作用基序(例如,DNA结合蛋白)的氨基端。在其它实施方案中,靶蛋白在核酸相互作用基序(例如,DNA结合蛋白)的羧基端。连接可以是直接或间接的。在某些实施方案中,靶蛋白和/或核酸相互作用基序(例如,DNA结合蛋白)保留野生型蛋白质的相应活性。在某些实施方案中,核酸相互作用基序和靶蛋白源自相同生物体,诸如人。
5.2.1.1靶蛋白
如本文中所使用的,术语“靶蛋白”指可由于细胞过程,诸如那些在本文中所描述的细胞过程而修饰的任何感兴趣的蛋白质。在一些实施方案中,通过具有酶或催化活性的蛋白质修饰靶蛋白。在一些实施方案中,靶蛋白是激酶、转移酶、氧化还原酶、水解酶、连接酶、异构酶或裂合酶的底物。在一个实施方案中,靶蛋白是人多肽或蛋白质。在一些实施方案中,可以通过切割,通过添加或除去官能团或者通过经历异构化来修饰靶蛋白。在某些实施方案中,靶蛋白是具有转移酶活性的转移酶,诸如酰基转移酶、糖基转移酶、酰胺转移酶或硫转移酶的底物。在一些实施方案中,靶蛋白是G偶联蛋白受体、离子通道蛋白、核受体蛋白、转录因子、激酶、细胞因子、生长因子、激素、酶、抗体或小链可变片段(scFv)。在另一个实施方案中,靶蛋白是水解酶、肽酶、蛋白酶或磷酸酶的底物。在一些实施方案中,靶蛋白是激酶的底物。在一些实施方案中,靶蛋白是脂质激酶,诸如P13K家族脂质激酶(例如mTOR)的底物。在一些实施方案中,靶蛋白是蛋白质激酶的底物(参见例如Manning(2002)Science 298:1912)。在一些实施方案中,靶蛋白是酪氨酸激酶,或丝氨酸/苏氨酸激酶的底物。在一些实施方案中,靶蛋白是人非受体酪氨酸激酶,例如作为ABL、ACK、CSK、MATK、FAK、PYK2、FES、FRK、JAK、SRC-A、SRC-B、TEC、和/或SYK家族成员的非受体酪氨酸激酶的底物。在其它实施方案中,靶蛋白是人受体酪氨酸激酶,例如作为ALK、AXL、DDR、EGFR、EPH、FGFR、INSR、MET、MUSK、PDGFR、PTK7、RET、ROR、ROS、RYK、TIE、TRK、VEGFR、AATYK、和/或SuRTK106家族成员的受体酪氨酸激酶的底物。在一些实施方案中,靶蛋白是PIK3CA、FRAP1、PDPK1、AKT1、BRaf、或MEK1的底物。在具体的实施方案中,靶蛋白是组蛋白(例如,组蛋白H3)。在具体的实施方案中,靶蛋白是促凋亡蛋白(例如,BAD)。在具体的实施方案中,靶蛋白是转录因子(例如,STAT5a、STAT6)。在具体的实施方案中,靶蛋白是细胞周期蛋白(例如细胞周期蛋白B1)。在具体的实施方案中,靶蛋白是受体(例如,雄激素受体)。
在某些实施方案中,靶蛋白是通过自磷酸化修饰的酶。在某些实施方案中,靶蛋白是通过自磷酸化修饰的激酶。自磷酸化的激酶的例子包括但不限于CSF1R、Kit、Axl、EGFR、Flt3、AuroraA、Brk、Jak2、Jak3、Fak、Src和Tnk2。
在某些实施方案中,靶蛋白是无催化活性的酶,其能够作为底物得到修饰,但不能影响下游激活。在具体的实施方案中,靶蛋白是能够得到磷酸化,但具有使激酶无活性的激酶域催化残基中的突变的激酶。
在某些实施方案中,将编码可检测蛋白质的核酸克隆入质粒表达载体中,并瞬时转染入细胞系中,导致可检测蛋白质的瞬时表达。在某些实施方案中,将编码可检测蛋白质的核酸克隆入质粒表达载体中,并稳定转染入细胞系中,导致可检测蛋白质的稳定表达。在某些实施方案中,将编码可检测蛋白质的核酸克隆入组成型质粒表达载体中,并转染入细胞系中,导致可检测蛋白质的组成型表达。在具体的实施方案中,组成型表达在CMV启动子的控制下。在某些实施方案中,将编码可检测蛋白质的核酸克隆入诱导型质粒表达载体中,并转染入细胞系中,导致可检测蛋白质的诱导型表达。在具体的实施方案中,诱导型表达在含有操纵基因位点的CMV启动子的控制下。在一个更具体的实施方案中,操纵基因位点是四环素操纵基因2位点。在又一个实施方案中,诱导型质粒表达载体是四环素调节性表达载体。
5.2.1.2核酸相互作用基序
核酸相互作用基序,例如DNA结合域是本领域中已知的,并且表1中提供了适合于用于本文中所提供的方法的例示性序列。核酸相互作用基序可以包括转录因子(包括转录激活物和阻抑物)的DNA结合域。合适的DNA结合域的例子包括NF-κB(真核)、cro阻抑物(λ噬菌体)、lac阻抑物(酵母)、GAL4(酵母)、GCN4(酵母)、Lex-A(大肠杆菌)、Opaque-2(玉米)和TGA1a(烟草)。合适的DNA结合域还可以包括通过组合天然存在的和/或经工程化改造的DNA结合基序的不同片段(piece)构建的合成的DNA结合域,诸如合成的锌指、亮氨酸拉链、翼状螺旋(winged helix)、螺旋-环-螺旋、同源域和POU域。在其它实施方案中,核酸相互作用基序可以是DNA-代谢酶,诸如DNA连接酶、DNA修复酶、限制酶或DNA甲基转移酶的全长、部分长度或功能性片段。
DNA结合域的合适性可以取决于特定DNA结合域与其靶序列的结合时间。例如,在解离半衰期超过4小时的情况中认为NF-κB与其靶DNA序列形成强的结合。(参见Speight等(2001)Chem.Biol.8:951-965)。
在某些实施方案中,核酸相互作用基序存在于串联重复中以容许顺式二聚化。在另一个具体的实施方案中,NF-κB基序存在于串联重复中以容许NF-κB顺式二聚化。
5.2.1.3生成可检测蛋白质的方法
如本文中所讨论的,可检测蛋白质包含与核酸相互作用基序连接的靶蛋白,并且如果靶蛋白是膜蛋白,那么任选地可以包含信号肽。可以使用本领域技术人员公知的多种方法例如重组或合成方法之任一种来生成本文中所提供的可检测蛋白质。
在一方面,可以使用标准的重组DNA技术来生成可检测蛋白质。例如,可以在任何合适的细胞,例如细菌或哺乳动物细胞中表达在表达载体,例如质粒载体中的包含以符合读码框的方式与核酸相互作用基序的编码序列连接的可检测蛋白质的编码序列,例如靶蛋白的编码序列的多核苷酸。
在某些实施方案中,使用细胞来表达单一可检测蛋白质。在其它实施方案中,将细胞工程化改造成表达大于一种形式的可检测蛋白质,例如,工程化改造成表达包含第一靶蛋白的可检测蛋白质,而且还表达包含另一靶蛋白的可检测蛋白质。
在某些实施方案中,在靶蛋白和核酸相互作用基序的编码序列外,编码序列进一步包含信号肽的氨基酸序列。信号肽是将新合成的蛋白质指引入内质网(ER)中以变为溶酶体蛋白质、分泌性蛋白质或跨越质膜的膜蛋白的短氨基酸序列。在一个实施方案中,在靶蛋白是溶酶体蛋白质、分泌性蛋白质或膜蛋白的情况中,采用信号肽来将靶蛋白指引到其最终目的地。信号肽的位置可以在不干扰靶蛋白、核酸相互作用基序的表达或活性的任何位置中放置。例如,可以将信号肽的编码序列放置在靶蛋白编码序列的上游(5’)或下游(3’),使得信号肽分别在表达的可检测蛋白质中的靶蛋白的氨基或羧基端。同样地,可以将信号肽的编码序列放置在核酸相互作用基序的编码序列的上游(5’)或下游(3’),使得信号肽分别在表达的可检测蛋白质中的核酸相互作用基序的氨基或羧基端。在某些实施方案中,信号肽是存在于靶蛋白序列内的内部信号序列。在一个实施方案中,融合蛋白从氨基至羧基端包含信号肽、靶蛋白、任选的接头序列和核酸相互作用基序。在具体的实施方案中,信号肽存在于可检测蛋白质的氨基末端。在具体的实施方案中,可检测蛋白质从氨基至羧基端包含信号肽、靶蛋白、和核酸相互作用基序。在具体的实施方案中,可检测蛋白质包含从氨基至羧基端的信号肽、靶蛋白、和核酸相互作用基序,其中靶蛋白是受体。在具体的实施方案中,接头序列存在于靶蛋白与核酸相互作用基序之间。在某些实施方案中,接头序列长10-20个氨基酸。在某些实施方案中,接头序列长16、17或18个氨基酸。在其它实施方案中,接头序列是柔性接头。在又一个实施方案中,接头序列是可以由蛋白酶识别的酶切割位点。在此类实施方案中,蛋白酶可以自核酸基序切割出靶蛋白。此类切割位点的非限制性例子是由烟草蚀刻病毒(TEV)蛋白酶识别并切割的序列。
在某些实施方案中,可检测蛋白质包含与核酸相互作用基序的氨基端连接的靶蛋白。在此类实施方案中,相应地安排可检测蛋白质的编码序列。如此,在一个实施方案中,将靶蛋白的编码序列放置得与核酸相互作用基序的编码序列符合读码框,从而靶蛋白的羧基端(carboxy-most)氨基酸残基在表达的可检测蛋白质中与核酸相互作用基序的氨基端(amino-most)氨基端残基相邻。在一个备选的实施方案中,将靶蛋白的编码序列放置得与氨基酸接头序列的编码序列符合读码框,其继而放置得与核酸相互作用基序的编码序列符合读码框。在此类实施方案中,靶蛋白的氨基酸序列还与核酸相互作用基序的氨基端连接,但是经由接头序列连接。
同样地,在某些实施方案中,可检测蛋白质包含与核酸相互作用基序的羧基端连接的靶蛋白。在此类实施方案中,相应地安排可检测蛋白质的编码序列。如此,在一个实施方案中,将核酸相互作用基序的编码序列放置得与靶蛋白的编码序列符合读码框,从而核酸相互作用基序的羧基端氨基酸残基在表达的可检测蛋白质中与靶蛋白的氨基端氨基酸残基相邻。在一个备选的实施方案中,将核酸相互作用基序的编码序列放置得与氨基酸接头序列的编码序列符合读码框,其继而放置得与靶蛋白的编码序列符合读码框。在此类实施方案中,靶蛋白的氨基酸序列还与核酸相互作用基序的羧基端连接,但是经由接头序列连接。
用于构建表达载体及在包含表达载体的细胞中表达基因的技术是本领域中公知的。参见例如Sambrook等,2001,Molecular Cloning--A LaboratoryManual,第3版,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY,及Ausubel等编,目前版本,Current Protocols in Molecular Biology,GreenePublishing Associates and Wiley Interscience,NY。
可用于在表达载体中使用的启动子包括但不限于阿拉伯糖启动子、金属硫蛋白启动子、组成型腺病毒主要晚期启动子、地塞米松诱导型MMTV启动子、SV40启动子、MRP pol III启动子、组成型MPSV启动子、四环素诱导型CMV启动子(诸如人立即早期CMV启动子)、和组成型CMV启动子。诱导型启动子在实施本文中所描述的方法中也得到应用,诸如含有tet-开启或tet-关闭系统,例如T-RExTM系统(Invitrogen产品目录编号K1020-02)中的tet响应元件(TRE)的启动子,可以通过添加某些金属盐上调的金属硫蛋白启动子和雷帕霉素诱导型启动子(Rivera等,1996,Nature Med,2(9):1028-1032;Ye等,2000,Science 283:88-91;Sawyer T K等,2002,Mini Rev Med Chem.2(5):475-88)。大量适合于在实施本发明中使用的可调节载体和启动子是本领域技术人员已知的,并且许多是商品化的。
表达载体应当含有与表达可检测蛋白质的细胞相容的表达和复制信号。可用于编码可检测蛋白质的构建体的表达载体包括病毒载体诸如逆转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒、质粒载体、粘粒,等等。对于将表达载体转染入哺乳动物细胞中,病毒和质粒载体是优选的。例如,表达载体pcDNAl(Invitrogen,San Diego,CA)(其中表达控制序列包含CMV启动子)提供良好的对此类细胞的转染和表达率。
还可以例如使用化学合成法,或合成和重组法的组合来生成可检测蛋白质。例如,可以使用本领域技术人员公知的标准多肽合成技术来合成生成可检测蛋白质。或者,可以纯化或者使用例如诸如那些本文中所描述的技术来重组表达可检测蛋白质的部分,并可以使用合成技术来连接各部分以生成完整的可检测蛋白质。
在将可检测蛋白质的各部分表达或纯化,然后连接的实施方案中,连接可以是经由共价连接,例如肽键,或非共价连接,并且可以是直接的或者经由接头模块,例如,连接靶蛋白与核酸相互作用基序的接头模块。
可以利用多种连接之任一种,包括但不限于醚、酯、硫醚、硫酯、酰胺、酰亚胺、二硫化物、肽、或其它连接。连接也可以是经由多种官能团之任一种,例如硫氢基(-S)、羧酸(COOH)或游离氨(-NH2)基。熟练技术人员可以常规地选择合适的连接、任选的接头、及基于例如可检测蛋白质的元件,例如核酸相互作用基序和/或靶蛋白的物理和化学特性来连接可检测蛋白质的各部分的方法。
在利用接头的实施方案中,接头可以直接连接可检测蛋白质的各部分,例如核酸相互作用基序和/或靶蛋白多肽。在其它实施方案中,接头自身可以包含两种或更多种结合以连接可检测蛋白质的各部分,例如核酸相互作用基序和靶蛋白的分子。例如,连接可以是经由附接于例如核酸相互作用基序的生物素分子和附接于靶蛋白多肽的链霉亲合素。例示性的接头包括但不限于直链或支链碳接头、杂环碳接头、取代的碳接头、不饱和的碳接头、芳香族碳接头、肽接头,等等。
在使用接头来连接核酸相互作用基序与靶蛋白多肽的实施方案中,可以通过本领域技术人员已知的不受限制的任何手段或方法来将接头附接于核酸相互作用基序和/或靶蛋白多肽。
此外,可以在适当时将要连接的可检测蛋白质的各部分,例如核酸相互作用基序和靶蛋白衍生化以便于与可检测蛋白质的另一部分,或与接头的连接。可以例如通过附接一种或多种合适的衍生物,诸如那些可获自PierceChemical Company,Rockford,Illinois的衍生物来实现此类衍生化。或者,衍生化可以牵涉化学处理要连接的可检测蛋白质的一个或多个部分,例如核酸相互作用基序和/或靶蛋白。例如,熟练技术人员可以在蛋白质上常规地生成游离的硫氢基基团以提供用于生成二硫化物、硫醚、硫酯等连接的反应性模块。参见例如美国专利No.4,659,839。
可以使用本文中所描述的任何连接方法以便以各种构型连接可检测蛋白质的各部分,例如核酸相互作用基序和靶蛋白。例如,可以将核酸相互作用基序的羧基端与靶蛋白多肽的氨基端直接或间接连接。在一些实施方案中,可以将靶蛋白的羧基端与核酸相互作用基序的氨基端直接或间接连接。在其它实施方案中,可以将核酸相互作用基序的氨基端与靶蛋白的氨基端直接或间接连接。在其它实施方案中,可以将核酸相互作用基序的羧基端与靶蛋白的羧基端直接或间接连接。如上文所讨论的,如本文中所使用的,与氨基端或羧基端“连接”并不必然意味着与多肽的氨基端或羧基端氨基酸的直接连接,而是也可以经由接头,例如一个或多个残基,例如2、3、4、5、10、15、20、25、或更多个氨基酸残基的氨基酸序列。注意可以利用经由上文所描述的方法生成的任何可检测蛋白质作为本文中所描述的方法的一部分。
5.2.2抗体
用于本文中所提供的方法和试剂盒的抗体包括但不限于多克隆抗体、合成抗体、单克隆抗体、重组生成的抗体、多特异性抗体(包括双特异性抗体)、人抗体、人源化抗体、小鼠抗体、山羊抗体、兔抗体、嵌合抗体、细胞内抗体、单链Fv(scFv)(例如,包括单特异性、双特异性,等等)、驼源化抗体、Fab片段、F(ab’)2片段、二硫化物连接的Fv(sdFv)、抗独特型(抗-Id)抗体、和任何上述物的表位结合片段。
在具体的实施方案中,用于本文中所提供的方法和试剂盒的抗体包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫学活性部分。本文中所提供的免疫球蛋白分子可以是任何类型(例如,IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类别(例如,IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类的免疫球蛋白分子。
可以使用的抗体包括免疫球蛋白的变体和衍生物,包括但不限于保留特异性结合表位的能力的片段。优选的片段包括Fab片段(含有抗原结合域,并且包含通过二硫键桥接的轻链和部分重链的抗体片段);Fab’(含有单一抗原结合域的抗体片段,其包含Fab和重链中到铰链区的额外部分);F(ab’)2(两个通过重链铰链区中的链间二硫键连接的Fab’分子;Fab’分子可以针对相同或不同表位);双特异性Fab(具有两个抗原结合域的Fab分子,每个所述抗原结合域可以针对不同表位);包含可变区的单链Fab链,又称为sFv(通过10-25个氨基酸的链连接在一起的抗体的单一轻链和重链的可变、抗原结合决定区);二硫化物连接的Fv、或dsFv(通过二硫键连接在一起的抗体的单一轻链和重链的可变、抗原结合决定区);驼源化的VH(抗体的单一重链的可变、抗原结合决定区,其中VH界面的一些氨基酸是那些存在于天然存在的骆驼抗体的重链中的);双特异性sFv(具有两个抗原结合域的sFv或dsFv分子,每个所述抗原结合域可以针对不同表位);双抗体(在第一sFv的VH域与第二sFv的VL域装配及第一sFv的VL域与第二sFv的VH域装配时形成的二聚化sFv;双抗体的两个抗原结合区可以针对相同或不同表位);和三抗体(三聚化sFv,其以与双抗体相似的方式形成,但是其中在单一复合物中创建三个抗原结合域;三个抗原结合域可以针对相同或不同表位)。作为免疫球蛋白衍生物的抗体还包括抗体结合位点的一个或多个CDR序列。在存在两个或更多个CDR序列时可以在支架上将CDR序列连接在一起。在某些实施方案中,要在本发明中使用的抗体包含单链Fv(“scFv”)。scFv是包含抗体的VH和VL域的抗体片段,其中这些域存在于单一多肽链中。一般地,scFv多肽进一步包含VH和VL域间的多肽接头,其使scFv能够形成抗原结合期望的结构。关于scFv的综述,参见Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,第113卷,Rosenburg和Moore编Springer-Verlag,New York,第269页-第315页(1994)。
用于本文中所提供的方法和试剂盒的抗体可以来自任何动物起源,包括鸟和哺乳动物(例如,人、鼠、猴、绵羊、兔、山羊、豚鼠、骆驼、马、或鸡)。在本文中所提供的方法和试剂盒的某些实施方案中,本发明的抗体是人或人源化的单克隆抗体。如本文中所使用的,“人”抗体包括具有人免疫球蛋白的氨基酸序列的抗体,而且包括自人免疫球蛋白文库或者自表达来自人基因的抗体的小鼠分离的抗体。
在某些实施方案中,特异性结合已经通过细胞过程修饰过的靶蛋白的抗体不结合未修饰形式的靶蛋白或者不与未修饰形式的靶蛋白起交叉反应。对特定的蛋白质修饰,例如对特定的经修饰的残基具有特异性的抗体是本领域中公知的。如此,可以在本文中所提供的方法中使用对蛋白质修饰具有特异性的本领域中已知的任何抗体,所述蛋白质修饰包括但不限于酰化、乙酰化、脱乙酰化、甲酰化、烷基化、甲基化、磷酸化、脱磷酸化、硫酸化、氧化、还原、羟基化、脱酰胺化、羧基化、二硫化物形成、异戊烯化、糖化、糖基化、泛素化、SUMO化、蛋白水解、外消旋化和异构化。在一些实施方案中,用于本文中的方法的抗体是抗磷酸抗体。在另一个实施方案中,用于本文中的方法的抗体是抗甲基抗体。在另一个实施方案中,用于本文中的方法的抗体是抗乙酰基抗体。
在靶蛋白是组蛋白H3的具体实施方案中,特异性结合经修饰形式的组蛋白H3的有用的抗体包括但不限于抗乙酰基组蛋白H3(Lys5)(Epitomics,Novus Biologicals);抗乙酰基组蛋白H3(Lys12)(Novus Biologicals);抗乙酰基组蛋白H3(BioVision,EMD Biosciences);抗乙酰基组蛋白H3(Lys9)(ActiveMotif,USBIO,Novus Biological);抗乙酰基组蛋白H3(Lys14),抗乙酰基组蛋白H3(Lys18)(Active Motif,USBIO,Epitmoics);抗乙酰基组蛋白H3(Lys24)(Santa Cruz Biotechnology);抗乙酰基组蛋白H3(Lys23),抗乙酰基组蛋白H3(Lys27),抗乙酰基组蛋白H3(Lys56)(Active Motif),Epitomics);抗乙酰基组蛋白H3(Lys9/Lys14)(Cell Signaling Technology,Santa Cruz Biotechnology);抗乙酰基组蛋白H3(Lys9/Lys18)(USBIO);抗-泛甲基组蛋白H3(Lys9)(CellSignaling Technology,Active Motif,USBIO);抗-单甲基组蛋白H3(Lys9)、抗-单甲基组蛋白H3(Lys56)、抗-单甲基组蛋白H3(Lys79)(Active Motif);抗-磷酸单甲基组蛋白H3(Lys4)(Cell Signaling Technology);抗-二甲基组蛋白H3(Lys4)、抗-二甲基组蛋白H3(Lys9)、组蛋白H3(Lys27)、抗-二甲基组蛋白H3(Lys79)(Cell Signaling Technology,Active Motif,USBIO);抗-二甲基组蛋白H3(Lys80)(Santa Cruz Biotechnology);抗-二甲基组蛋白H3(Lys56),(CellSignaling Technology,Active Motif);(Cell Signaling Technology);抗-二甲基组蛋白H3(Lys36),(Active Motif);抗-三甲基组蛋白H3(Lys9)、抗-三甲基组蛋白H3(Lys27)(Active Motif);抗-三甲基组蛋白H3(Lys4)(Epitomics);抗-磷酸(Thr80)抗-三甲基(Thr79)组蛋白H3(USBIO);抗-磷酸(Thr3)抗-甲基(Lys4)组蛋白H3(Lifespan Biosciences);抗-乙酰基(Lys9)抗-磷酸(Ser10)组蛋白H3(USBIO);抗-乙酰基(Lys15)抗-磷酸(Ser11)组蛋白H3(Santa CruzBiotechnology);和抗-磷酸组蛋白H3(Ser28)(Santa Cruz Biotechnology)。
在靶蛋白是细胞周期蛋白B1的具体实施方案中,特异性结合经修饰形式的细胞周期蛋白B1的有用的抗体包括但不限于抗-磷酸细胞周期蛋白B1(Ser126)(Rockland,Meridian Life Science);和抗-磷酸细胞周期蛋白B1(Ser 133)(Cell Signaling Technology)。
在靶蛋白是BAD的具体实施方案中,特异性结合经修饰形式的BAD的有用的抗体包括但不限于抗-磷酸BAD(Ser 112)(Immuno-BiologicalLaboratories,Assay Designs,Cell Signaling Technology,IMGENEX,MBLInternational);抗-磷酸BAD(Ser 136)(Immuno-Biological Laboratories,Assay Designs);和抗-磷酸BAD(Ser 155)(Immuno-Biological Laboratories,IMGENEX)。
在靶蛋白是STAT5A的具体实施方案中,特异性结合经修饰形式的STAT5A的有用的抗体包括但不限于抗-磷酸STAT5(Tyr694)(Rockland,ECMBiosciences,Cell Signaling Technology,Abgent,Immuno-BiologicalLaboratories,USBIO,LifeSpan Biosciences,MBL International,;RayBiotech,Biotrend,IMGENEX,AnaSpec,Abcam,EMD Biosciences);抗-磷酸STAT5(Tyr695/Tyr699)(RayBiotech);抗-磷酸STAT5A(Ser 127/Ser 128);抗-磷酸STAT5A(Ser 780)(Abgent);抗-磷酸STAT5A(Ser 780)(IMGENEX);和抗-磷酸STAT5A/B。
在靶蛋白是STAT6的具体实施方案中,特异性结合经修饰形式的STAT6的有用的抗体包括但不限于抗-磷酸STAT6(Thr641)(Cell SignalingTechnology,R&D Systems,Biotrend,MBL International,RayBiotech,IMGENEX,Biovision,Millipore,EMD Biosciences);和抗-磷酸STAT6(Thr645)(IMGENEX,Abcam)。
用于检测蛋白质修饰的其它抗体包括抗-法呢基抗体(Sigma)和抗-O-糖化抗体(Millipore,Acris Antibodies GmbH,GeneTex,Fitgerald IndustriesInternationl)。可以制备识别并结合特定蛋白质修饰的定制单克隆或多克隆抗体。
在一些实施方案中,使用固相测定法形式来实施测定法。在本文中所提供的方法和试剂盒的具体实施方案中,将抗体固定于固体支持物上。如本文中所使用的,“固体支持物”是(不限于)抗体可以直接或间接结合(例如,经由其它结合配偶中间体,诸如其它抗体,蛋白A或蛋白G),或者抗体可以包埋在其中(例如,经由受体或通道)的任何柱(或柱材料)、珠、试管、微量滴定皿、颗粒(例如,磁、琼脂糖或Sepharose珠)、微芯片(例如,玻璃、纤维玻璃、胶乳、硅、硅-玻璃、或金芯片)、或膜(例如,脂质体或囊泡的膜)、塑料材料(例如,聚苯乙烯或聚氯乙烯),或传感器芯片(例如,那些与BIAcore系统一起使用的)。在具体的实施方案中,经由将蛋白G固定于固体支持物上来间接固定抗体。
可以使用任何标准规程,例如通过抗体的生物素化,接着使用固定化的链霉亲合素(例如,固定于磁珠或柱上的链霉亲合素)来捕捉生物素化的抗体,从而“捕获”测定法中使用的抗体。结合抗体(和核酸寡聚物,其结合可检测蛋白质)的靶蛋白仍会结合固体支持物,而可以将未结合的结合试剂(例如,靶蛋白和核酸寡聚物)洗掉。在捕获结合的靶蛋白后,可以例如使用与核酸寡聚物杂交的引物通过实施PCR反应来常规地检测已经经由结合可检测蛋白质的核酸相互作用基序而结合靶物的核酸寡聚物。在某些实施方案中,使用标准的定量方法(例如,使用Perkin-Elmer的Taq Man)来实施PCR反应。在一些实施方案中,固体支持物保留多种感兴趣的蛋白质-核酸寡聚物复合物,在该情况中,可以鉴定分离集合的个别成员,诸如经由扩增例如一组中对于特定的感兴趣的蛋白质特异性的每种独特的核酸寡聚物来进行。
在某些实施方案中,抗体结合的固体支持物是磁珠。在某些实施方案中,抗体是固定到经链霉亲合素包被的珠(例如,Invitrogen的DynabeadsTM M280)上的生物素化的抗体。在某些实施方案中,生物素化的抗体是用于捕捉一抗的二抗,所述一抗继而用于识别并结合经修饰的靶蛋白。在某些实施方案中,将抗体固定到蛋白G珠(Invitrogen的DynabeadsTM蛋白G)上。在某些实施方案中,将抗体固定到蛋白A柱(Invitrogen的DynabeadsTM蛋白A)上。在一些实施方案中,通过被固定于固体表面(例如,M-280绵羊抗-小鼠IgG(Invitrogen);M-280绵羊抗-兔IgG(Invitrogen))上的二抗结合来固定抗体。
在某些实施方案中,在期望抗体-靶蛋白复合物的洗脱的情况中,例如对于核酸寡聚物的PCR检测,可以使用商品化洗脱缓冲液来实施蛋白质复合物的洗脱。在某些实施方案中,在使用蛋白G珠来固定抗体-靶蛋白复合物的情况中,可以使用苯基磷酸酯或者使用商品化的低pH缓冲液来实施洗脱。在某些实施方案中,固定的抗体,例如一抗或二抗含有能够化学或酶促切割的可切割接头。在一个实施方案中,可切割接头能够通过膦或双硫醇介导的还原来切割。在一个具体的实施方案中,膦是三-(2-羧乙基)膦(TCEP)。
在某些实施方案中,在具有多个孔的板,诸如多孔板或多域多孔板的孔中固定抗体。多孔测定板的使用容许平行加工并分析分布于平板的多个孔中的多个样品。多孔测定板(又称为微量板或微量滴定板)可以采用多种形式、大小和形状(例如,96-、384-、1536-、或9600-孔板;圆-或平-底多孔板)。本文中所提供的方法在以标准化的板形式实施时可以利用用于贮存和移动这些板的可容易获得的设备及用于将液体快速分配至板中或从板中移出的可容易获得的设备(例如,多孔移液器,洗板仪,等)。可以在本文中所提供的方法中使用的例示性多孔板形式包括那些存在于96孔板(12x8阵列的孔)、384孔板(24x16阵列的孔)和1536孔板(48x32阵列的孔)上的。可以在本文中所提供的方法中使用的其它形式包括但不限于单孔或多孔板,其包含多个域。
5.2.3核酸寡聚物
如本文中所使用的,核酸寡聚物结合靶蛋白的核酸相互作用基序。在某些实施方案中,核酸寡聚物包含(a)第一核酸序列,其是具有报告物功能的PCR扩增序列(“或扩增子”),和(b)第二核酸序列,其结合具有蛋白质捕捉或“加标签”功能的核酸相互作用基序。在具体的实施方案中,第一核酸序列对于第二核酸序列而言是异源的,即正常情况下不会发现与第二核酸序列连续。可以经由例如DNA-蛋白质复合物形成通过核酸寡聚物将包含靶蛋白和核酸相互作用基序,诸如DNA-结合蛋白的可检测蛋白质捕获或“加标签”。
在一个实施方案中,核酸寡聚物包含与DNA结合蛋白(例如,NFκB、cro阻抑物、GAL4、GCN4、LexA、Opaque-2和TGA1a)可特异性识别的靶DNA序列连接的扩增子。在另一个实施方案中,核酸寡聚物包含与转录因子的DNA结合域的关联(cognate)DNA序列连接的扩增子。在一个实施方案中,第二核酸序列包含天然存在的或合成的DNA结合蛋白的识别序列。在具体的实施方案中,包含PCR扩增序列的第一核酸序列与包含核酸相互作用基序的第二核酸分开且不同。在此类实施方案中,核酸寡聚物能够结合或以其它方式连接具有特异性识别核酸寡聚物的DNA结合构件的感兴趣的蛋白质。然后,可以使用例如定量PCR(qPCR)来检测和/或量化核酸寡聚物,或者可以将核酸寡聚物进行PCR扩增,并通过质谱术来检测。在一些实施方案中,在PCR扩增步骤期间采用第二报告物功能。在一个具体的实施方案中,在PCR扩增步骤期间,核酸寡聚物经历引物延伸步骤,此时第二报告物功能诸如荧光标签被附接于核酸寡聚物。
在一个实施方案中,通过qPCR来检测和/或量化核酸寡聚物。通过qPCR进行的核酸寡聚物检测具有的优点不仅在于是可靠的定量检测法,还在于是高度灵敏的且具有高度选择性的检测法。由于qPCR检测法的高度灵敏性质,此方法实现对非常少量的靶蛋白的检出,而且降低对稀缺且昂贵的测定成分,诸如重组蛋白的需要。由于qPCR检测法的高特异性性质,qPCR还实现对复杂的异质混合物中特定DNA序列的检测,而且消除对通常对蛋白质样品进行以改善或增强蛋白质检测的任何种类的纯化步骤的需要。
可扩增序列以序列特异性方式与或能够与PCR引物杂交。在某些实施方案中,核酸寡聚物包含多个扩增子,例如2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个扩增子。在一些实施方案中,多个扩增子是单一扩增子的串联重复。在某些实施方案中,扩增子可通过定量PCR扩增,所述定量PCR容许量化通过此类核酸寡聚物加标签的蛋白质。在一个具体的扩增方法中,PCR序列的扩增包括在标准的PCR反应混合物(一般地,具有终浓度10mM Tris-HCl(pH8.3于25℃)、1-4mM MgCl2、0.1-1mM dNTP的混合物)中组合含有PCR扩增模板的核酸、PCR引物和qPCR探针,并首先在热启动(Hot Start)条件(例如,加热至95℃达5分钟)下处理样品以使非特异性退火或错配最小化,接着是变性步骤(例如,95℃持续45秒),接着是退火步骤(55℃持续1分钟),并且接着是延伸步骤(72℃持续1分钟),变性、退火和延伸的连续步骤有多达40轮,以完成qPCR信号的扩增。
在一个实施方案中,核酸寡聚物的长度是约50-约100、约50-约200、约50-约300、约50-约400、约50-约500、约100-约200、约100-约300、约100-约400、约100-约500、约200-约300、约200-约400、约200-约500、约300-约400、约300-约500、或约400-约500个核苷酸的长度。
如本文中所使用的,报告物功能指容许核酸寡聚物显现或者以其它方式检出或量化,并且因此容许捕获的或“加标签的”蛋白质间接显现或以其它方式检出或量化的核酸寡聚物的特征。在某些实施方案中,通过基于核酸的读出,包括但不限于PCR、qPCR(Applied Biosystems Inc./ABI,BioTrove)、DNA微阵列(Affymetrix的)、珠测定法(Illumina的BeadArrayTechnology,Luminex的xMAP technology)、DNA毛细管阵列或毛细管电泳(Applied Biosystems Inc./ABI,Beckman Coulter的GenomeLabTM GeXPGenetic Analysis System)、纳米技术(nCounterTM AnalysisSystem)、DNA测序(454,Illumina的Solexa,Life Technology的SOLiDTMSystem Sequencing,Applied Biosciences Inc./ABI)及通过质谱术(BioTrove)来检测核酸寡聚物的报告物功能。
在某些实施方案中,核酸寡聚物的报告物功能来自核酸寡聚物的放射性标记、荧光标记或生物素化。核酸寡聚物可以是单链或双链DNA、单链或双链RNA、DNA-RNA杂合物、RNA-RNA杂合物,或其天然的或合成的衍生物、类似物及片段。在一些实施方案中,核酸寡聚物是DNA,且可以例如通过任何标准的酶反应,诸如切口转译,或者通过用经32P、125I或生物素标记的三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)的末端标记来将报告物功能标记物导入DNA,或者标记物可以作为插入剂导入。存在着许多商品化的并且可以用于标记核酸寡聚物的荧光或发光基团。可以用于标记核酸寡聚物的荧光标记物的一些例子是荧光素、罗丹明和香豆素及其商业衍生物诸如德克萨斯红和Alexa发光基团的例子是镧系元素复合物和发光纳米颗粒。在一个实施方案中,核酸寡聚物最初没有报告物功能,但是在核酸检测步骤前添加报告物功能。
表1中显示了例示性的核酸寡聚物和核酸相互作用基序对。DNA结合蛋白可以包括例如转录因子的DNA结合域,包括转录激活物和阻抑物。合适的DNA结合域的例子包括NF-κB(真核)、cro阻抑物(λ噬菌体)、lac阻抑物(大肠杆菌)、GAL4(酵母)、GCN4(酵母)、Lex-A(大肠杆菌)、Opaque-2(玉米)和TGA1a(烟草)。DNA结合域的合适性还可以取决于特定DNA结合域与其靶序列的结合时间。例如,在解离半衰期超过4小时的情况中认为NF-κB与其靶DNA序列形成强结合。(参见Speight等(2001)Chem.Biol.8:951-965)。合适的DNA结合域还包括通过组合天然存在的和/或经工程化改造的DNA结合基序的不同片段构建的合成的DNA结合域,诸如合成的锌指、亮氨酸拉链、翼状螺旋、螺旋-环-螺旋、同源域和POU域。可以经由DNA结合域对核酸寡聚物的某些结合识别序列的识别来将可检测蛋白质捕获或“加标签”。在本发明的另一个实施方案中,核酸相互作用基序可以是本文中所描述的DNA-代谢酶,诸如DNA连接酶、DNA修复酶、限制酶或DNA甲基转移酶的全长、部分长度或功能性片段。
表1:例示性的核酸寡聚物、核酸相互作用基序和核酸相互作用基序识别序列
5.2.4细胞
要用于本文中所提供的方法的细胞可以是任何细胞类型和起源的原代细胞、次代细胞或永生化细胞。在一些实施方案中,细胞是哺乳动物来源,包括人的。在一些实施方案中,细胞是不同细胞类型的。在其它实施方案中,细胞来自基本上同质的细胞群体。本发明的方法容许分析例如42-、96-、384-、或1536孔测定板中含有的大量细胞样品。
可以使用可在标准组织培养塑料器皿中培养的任何细胞类型来实施本文中所提供的方法。此类细胞类型包括源自任何认可的来源,例如哺乳动物、植物、细菌、病毒或真菌的所有正常的和经转化的细胞。在具体的实施方案中,细胞是哺乳动物(人或动物,诸如啮齿动物或猿)来源的。在一些实施方案中,细胞是人来源的。在一些实施方案中,细胞是啮齿动物来源的。在一些实施方案中,细胞是鼠来源的。在一些实施方案中,哺乳动物细胞可以是任何器官或组织来源(例如,脑、肝、肺、心脏、肾、皮肤、肌肉、骨、骨髓或血液)的及任何细胞类型的。适合于用于本文中所提供的方法的细胞类型包括但不限于成纤维细胞、基细胞、上皮细胞、内皮细胞、血小板、淋巴细胞、T细胞、B细胞、天然杀伤细胞、网织红细胞、粒细胞、单核细胞、肥大细胞、神经细胞、成神经细胞、巨细胞性细胞、树突细胞、巨噬细胞、卵裂球、内皮细胞、肿瘤细胞、间质细胞、肝巨噬细胞(Kupffer cell)、朗格汉斯细胞、衬细胞(littoral cell)、组织细胞诸如肌肉细胞和脂肪细胞、去核细胞,等等。
本领域普通技术人员可以容易地实施特定细胞类型和/或细胞系的选择以开发依照本文中所描述的方法的特定测定法,并且其会由数项因素诸如要研究的细胞过程的性质和测定法意图的目的决定。例如,细胞系的选择会部分取决于对底物起作用的所研究的蛋白质(经转染的可检测靶蛋白)是否内源存在于细胞中。在一些实施方案中,可以使用建立的稳定细胞系(其是商品化的,并且通常相对容易生长)来实施为初次筛选(即,第一轮筛选)调控细胞过程的测试化合物开发的测定法。在后来要在药物开发过程中使用测定法的其它实施方案中,可以使用原代或次代细胞(其经常比永生化细胞更难以获得、维持和/或生长,但是代表更好的体内情况实验模型)来实施测定法。
在一些实施方案中,本文中所描述的方法包括在使细胞与测试化合物接触前使细胞饥饿的步骤。在要测定的细胞过程是通过一种或多种蛋白质激酶的磷酸化时,细胞饥饿可以是特别有用的,并且感兴趣的蛋白质激酶不是组成型活性的。饥饿中断细胞生长和分裂的正常循环,将细胞置于静息(失活)状态,并使细胞磷酸化水平回到基线。可以通过任何合适的方法,例如通过在没有血清或生长补充物的培养基中培养细胞来实施使细胞饥饿。
在本文中所描述的方法的一些实施方案中,可以将细胞遗传工程化改造成表达包含靶蛋白和核酸相互作用基序的可检测蛋白质。可以通过本领域技术人员已知的不受限制的任何方法来将表达载体导入宿主细胞中以进行表达。此类方法包括但不限于例如,细胞自溶液直接摄取分子;或者使用例如脂质体或免疫脂质体经由脂转染促进的摄取;颗粒介导的转染;等等。参见例如,美国专利No.5,272,065;Goeddel等编,1990,Methods in Enzymology,第185卷,Academic Press,Inc.,CA;Krieger,1990,Gene Transfer and Expression--A Laboratory Manual,Stockton Press,NY;Sambrook等,1989,MolecularCloning--A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,NY;及Ausubel等编,目前版本,Current Protocols in Molecular Biology,GreenePublishing Associates and Wiley Interscience,NY。用于表达载体的有用启动子包括但不限于金属硫蛋白启动子、组成型腺病毒主要晚期启动子、地塞米松诱导型MMTV启动子、SV40启动子、MRP pol III启动子、组成型MPSV启动子、RSV启动子、四环素诱导型CMV启动子(诸如人立即早期CMV启动子)、和组成型CMV启动子。表达载体应当含有与其中要表达可检测蛋白质的细胞相容的表达和复制信号。可用于表达本文中所描述的可检测蛋白质的表达载体包括病毒载体诸如逆转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒、质粒载体、粘粒,等等。
可以使用本领域技术人员已知可用于表达重组多肽的任何哺乳动物细胞,例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、海拉(HeLa)细胞、A375细胞、HEK293或LnCap细胞来表达包含靶蛋白和核酸相互作用基序的可检测蛋白质。在合适的宿主细胞中表达靶蛋白时,它可以展现出天然蛋白质中存在的翻译后修饰,并且因此预期具有天然蛋白质的结构和功能。
5.3试剂盒
本文中还提供了一种用于筛选调控细胞过程的候选分子或测试化合物的试剂盒,其中所述细胞过程修饰靶蛋白。这样的试剂盒可以包含用充当细胞测定法中的可检测底物的可检测靶蛋白转染的细胞系。这样的试剂盒可以进一步包含特异性结合已经由于细胞过程而修饰过的靶蛋白的抗体。任选地,将抗体固定于固体支持物或容器上,诸如多孔板中的孔。在一些实施方案中,试剂盒进一步包含可检测核酸寡聚物;和能够通过核酸寡聚物“加标签”的靶蛋白。在核酸寡聚物可通过qPCR检测的情况中,试剂盒可以另外包含能够识别核酸寡聚物中的PCR启动序列的PCR引物。可以使用这样的试剂盒来实施鉴定调控细胞过程的测试化合物的方法,如上文所描述的。
在另一个实施方案中,可以使用试剂盒来检测已经由于细胞过程而修饰过的靶蛋白的存在。可以使用这样的试剂盒作为诊断试剂盒以对生物学样品测试调控细胞过程或诱导导致靶蛋白修饰的细胞过程的某些分子(不管是化学化合物、肽,还是蛋白质)的存在。在一个例子中,试剂盒包含固定于固体表面的抗体,其特异性结合已经由于细胞过程而修饰过的靶蛋白;可检测蛋白质,其包含靶蛋白和能够通过核酸寡聚物加标签的核酸相互作用基序;及可检测核酸寡聚物。任选地,试剂盒可以进一步包含能够识别核酸寡聚物中的PCR启动序列以容许qPCR扩增的PCR引物。
6.实施例
6.1实施例1:NF-kB和激酶融合蛋白的构建
供组成型表达用的表达载体:
使用标准的分子生物学技术通过基因合成,接着通过限制性消化及随后的连接来将下列遗传元件克隆入通用细菌质粒pGEM的骨架中。自5’端至3’端列出,它们是:
CMV(巨细胞病毒)增强子/启动子区以容许在许多细胞类型中的强的、组成型表达;
嵌合内含子,其由人β-珠蛋白基因的第一内含子和在免疫球蛋白基因重链可变区的前导与主体间的内含子组成(转染研究已经证明了,cDNA插入物侧翼的内含子的存在经常提高基因表达水平);
酵母GAL4或人NF-κB转录激活物的DNA结合域(参见表1),其与TEV(烟草蚀刻病毒)蛋白酶识别序列,接着是具有多个独特限制性位点的多克隆区以符合读码框方式融合;
SV40(猿病毒40)后期多腺苷酸化信号,用于增强的mRNA稳定性和翻译;
pMB1复制起点,用于在大肠杆菌中增殖;和
氨苄青霉素抗性(AmpR)基因,用于在大肠杆菌中选择/增殖。
供诱导型表达用的表达载体:
还使用pcDNATM5/TO(Invitrogen产品目录编号K1020-01)来克隆5.1.1中所列出的蛋白质以能够控制可检测蛋白质在细胞中的表达水平,从而不干扰细胞系统,所述pcDNATM5/TO设计为与T-RExTM系统(Invitrogen产品目录编号K1020-02)一起使用。此载体含有容许四环素调节性表达的CMV启动子内的两个四环素操纵基因2(TetO2)位点。TetO2位点充当pcDNATM6/TR中表达的四个Tet阻抑物分子的结合位点。Tet阻抑物的结合在没有四环素的情况中抑制可检测蛋白质的表达。四环素的添加导致可检测蛋白质的去阻抑和表达。可检测蛋白质的表达可以通过调节细胞中存在的四环素量或者通过调节共转染入细胞中的pcDNATM5/TO和pcDNATM6/TR的比率来控制。
6.1.1蛋白质的克隆
编码全长人激酶Mek1(GenBank登录号NP 002746.1)(SEQ ID NO.:22)、全长人Erk1(Ref Seq.P27361)(SEQ ID NO.:23)、全长人激酶Akt1(GenBank登录号NP_005154.2)(SEQ ID NO.:24)、全长人转录因子FKHR/FOXO1(GenBank登录号NP_002006)(SEQ ID NO.:25)、人Ack1/Tnk2的氨基酸1-787(Ref Seq Q07912)(SEQ ID NO.:26)、全长Aurora激酶A(Ref Seq O14965)(SEQ ID NO.:27)、全长人Src(Ref Seq P12931)(SEQ ID NO.:28)、全长人促凋亡蛋白BAD(Ref Seq CAG46757)(SEQ ID NO.:29)、全长人组蛋白H3(RefSeqs P68431和Q71DJ3)(SEQ ID NO.:30)、人雄激素受体(AR)的氨基酸142-540(Ref Seq P10275)(SEQ ID NO.:31)、全长人转录因子STAT5A(P42229)(SEQ ID NO.:32)、全长转录因子STAT6(P42226)(SEQ ID NO.:33)和全长细胞周期蛋白B1(Ref Seq 14635)(SEQ ID NO.:34)的序列自逆翻译获得,并且与编码人DNA结合域NF-κB的氨基酸35-36(MetAla)和氨基酸41-359(SEQ ID NO:5)的序列以符合读码框的方式融合的每种也自逆翻译获得。还通过将激酶域催化残基的突变引入上述野生型序列来克隆相应的无催化活性的激酶。如此,编码下列错义突变(在圆括号中描述特定的氨基取代)的序列自逆翻译获得,所述序列编码全长人Mek1(K97A)、全长Erk1(K71R)、全长Akt1(K179A)、全长Ack1/Tnk2(K158R)、全长Aurora激酶A/AurKA(K162R)、全长Src(K298R)和雄激素受体/AR的氨基酸142-540(Y534F),并且与编码SEQ ID NO:5的序列以符合读码框方式融合的每种也自逆翻译获得。将无催化活性的激酶构建为磷酸根基团的被动受体,其不会施加下游效应,而且因此仅会最小程度干扰宿主的细胞系统。
使用标准的分子克隆方案通过限制性消化,接着通过连接来克隆序列。通过ABI测序来确认克隆的序列。
使用针对GAL4和NF-κB生成的抗体(Santa Cruz Biotechnology)通过SDS-PAGE/Western印迹来分析每种DNA构建体的表达水平和质量。
6.1.2核酸寡聚物的构建
生成随机序列,并使用它来设计扩增子序列,其使用软件Primer(ABI)来进行。针对人激酶组(kinome)及针对其它扩增子序列BLAST搜索扩增子序列,并基于与BLAST搜索中的序列的最小相似性来选择。将选定的扩增子序列送到ABI,并且合适的引物和qPCR荧光探针由ABI制备。通过添加GAL4或NF-κB识别位点来进一步修饰扩增子序列,以创建完整的核酸寡聚物。将寡核苷酸克隆入细菌质粒中,并使用PCR来复制寡聚物。
6.2实施例2:磷酸-Mek1细胞测定法
在此细胞测定法中,通过测量Mek1(即Braf的一种直接的激酶底物)的磷酸化来对化合物测试其抑制Braf的能力。将表达组成型活性的Braf V600E突变的A375细胞以3e5个细胞/mL的密度在10cm板中铺板,并用1mL具有40μLLipofectamine 2000(Invitrogen)的OPTI-MEM缓冲液(GIBCO/Invitrogen)中的编码可检测蛋白质的表达质粒(16μg)转染,并于37℃温育18-22小时。次日,除去培养基,并将细胞用PBS清洗,胰蛋白酶化,然后用M3培养基(含有10%FBS的DMEM)淬灭。将细胞计数,并在M3完全培养基中以5e6个细胞/mL的密度重悬,然后以50,000个细胞/孔/100μL分配入96孔板中,并于37℃温育3小时。然后,除去培养基,并将饥饿培养基(0.5%FBS/DMEM)添加至各孔,并容许温育过夜。次日,将细胞与M3饥饿培养基中的化合物一起温育,并于37℃温育2小时。
对于蛋白质提取步骤,自各孔除去培养基,添加50μL含有M-PER(Pierce)/150mM NaCl/10mM DTT/1xCompleteTM无EDTA(Roche)抗蛋白酶混合物/250nM冈田酸)的提取缓冲液,并在冷室中以最大速度摇动平板30分钟。将细胞以3000rpm离心20分钟。将30μL上清液收集,并移液入含有10μL 4X蛋白质稳定化混合物(Pierce产品目录编号89806)的冷却聚丙烯板中,混合,并取出2份10μL等分试样,并将平板于-80℃冷冻,并贮存,用于结合测定法。在两步中实施裂解物稀释。将含有10μL提取物等分试样的96孔板于室温融化,并添加40微升具有2nM充当NF-κB探针的核酸标签的0.1%BSA/1xPBS 0.05%Tween溶液,并通过以450rpm于室温轨道摇动10分钟来混合。然后,添加270微升具有20微克/mL在0.1%BSA/1xPBS 0.05%中的剪切鲑精DNA的溶液,并通过用移液管吹吸来温和混合。
作为磷酸-Mek1检测测定法中的第一步,对于PBST(1XPBS/0.05%Tween 20)中的每100μL蛋白G珠(Invitrogen Dynabeads-蛋白G(产品目录编号100-04D)),固定2.5μg抗磷酸-MEK 1/2(Ser217/221)抗体,并于室温旋转约45分钟,之后将1%BSA/0.02%叠氮化钠添加至抗体/珠混合物,并于4℃旋转过夜。次日,将珠沉淀,然后清洗/封闭,并在1-2x2%BSA/PBST中重悬,并以初始原液浓度的一半分配到96孔聚丙烯板上。在含有25μL珠和100μL2%BSA/PBST的不同平板上实施磷酸-Mek1结合测定法,摇动所述平板,直至添加细胞裂解物。对于结合测定法,首先将珠沉淀,并吸出缓冲液,然后将100μL稀释的裂解物添加至每孔,并于室温摇动平板达1小时。结合步骤后,将珠沉淀4分钟,吸出缓冲液,并添加150μL PBST。将平板短暂摇动,然后在磁体上沉淀,然后用清洗缓冲液(1XPBS/0.05%Tween 20)清洗2-4次以除去未结合的蛋白质。最终清洗后,将珠在150μL以0.05%补充Tween 20的IgG洗脱缓冲液(Pierce产品目录编号21004)中重悬,并于室温在摇动的情况中温育60分钟。将珠沉淀后,将50uL洗脱的混合物取出,并添加至30μL 200mMTris碱,充分混合,然后转移至DNA检测测定法。对于qPCR,将2.5μL转移至7.5μL具有合适的引物和探针的MasterMix(Applied Biosystems)。
或者,可以在没有核酸寡聚物的情况中实施结合测定法,所述核酸寡聚物可以后来在除去未结合的蛋白质的清洗步骤后添加。对于抗体固定的备选方法:将生物素-蛋白G(Pierce)固定于链霉亲合素支持物上,用脱硫生物素标记抗体,经由可切割的二硫化物接头将抗体附接于生物素,并将生物素化的抗体固定于链霉亲合素M-280磁珠(Invitrogen)上,获得相当的结果。
还使用抗总Mek1抗体运行结合测定法以标准化孔间测量的磷酸-Mek1量。使用文献中已知的Braf抑制剂:BAY-43-9006、PLX-4720、Chir-265来确认抗磷酸Mek测定法。
图3显示了使用上述方案对针对Braf的BAY-43-9006、PLX-4720、Chir-265获得的IC50,其中CI-1040也作为阴性对照测试。
6.3实施例3:磷酸-Akt1细胞测定法
如图2的图中所显示的,PIK3CA激酶经由两种不同途径来介导信号传导,例如通过直接激活激酶底物FRAP1(mTOR的激酶域),或文献中称为“PDK2”的其它较少研究的激酶和PDPK1,继而,两者都磷酸化Akt。因为FRAP1和PDPK1各经由独特的磷酸化位点(其中FRAP1磷酸化Akt1激酶的氨基酸473处的丝氨酸,而PDPK1磷酸化Akt1激酶的氨基酸308处的苏氨酸)来激活Akt1,所以可以使用对每个磷酸化位点特异性的抗磷酸抗体来分离并测试每种途径的激活。因此,使用此细胞测定法,通过测量Akt的位点特异性磷酸化来对化合物询问其不仅针对PIK3CA,而且针对FRAP1或PDPK1的抑制性机制。遵循实施例1中所描述的方案,只是使用细胞系Hek 293,并以5e5/mL的密度分配。对于磷酸-Akt1检测步骤,使用抗磷酸Akt(Ser473)抗体(一种针对含有Akt1激酶的氨基酸473处的磷酸化丝氨酸的肽的抗体)来测量经由FRAP途径的抑制,并使用抗磷酸Akt1(Thr308)抗体(一种针对含有Akt1激酶的氨基酸308处的磷酸化苏氨酸的肽的抗体)来测量经由PDPK1途径的抑制。还平行运行使用抗总Akt1抗体的结合测定法以标准化孔间测量的磷酸-Akt1的量。
使用文献中的已知的选择性PIK3CA抑制剂诸如PI103、ZSTK-474、渥曼青霉素、和PIK-93及文献中的已知的PDPK1抑制剂BX-795来确认抗磷酸Akt1细胞测定法。
图4显示了自PI103、ZSTK-474和BX-795的抗磷酸Akt1(Ser473)和抗磷酸Akt(Thr308)测定法获得的IC50。细胞测定法将PI103显示为经由FRAP1和PDPK1途径具有几乎等力的IC50,这指示PI103作为选择性PIK3CA抑制剂起作用,如文献中建立的。相似地,细胞测定法将ZSTK-474和渥曼青霉素两者都显示为在询问FRAP1或PDPK1途径的每种测定法中具有几乎等力的IC50,这与将ZSTK-474和渥曼青霉素建立为选择性PIK3CA抑制剂的文献一致。与之相对,作为文献中已知特异性抑制PDPK1的化合物的BX-795在细胞测定法中显示为选择性抑制PDPK1,超过FRAP1(其中BX-795针对FRAP1的IC50比此化合物针对PDPK1获得的IC50大得多)。
还在抗磷酸-Akt1(Ser473)细胞测定法中测试下列化合物:TG-100-115,即一种在文献中已知抑制PIK3CG(PI3KC的γ亚型)的化合物;根赤壳菌素(即一种已知的HSP90抑制剂)和曲西立滨(triciribine)(即Akt1磷酸化的一种已知的抑制剂),并在图5中显示了对每种获得的剂量响应曲线。BX-795和TG-100-115的结果显示了,磷酸-Akt1(Ser473)测定法对PDPK1和PIK3CG抑制剂是不灵敏的。根赤壳菌素的结果显示了,测定法对HSP90抑制是部分灵敏的,而且pAkt抑制剂曲西立滨展现出与根赤壳菌素相似的剂量响应曲线。
还在抗磷酸-Akt(Thr308)细胞测定法(图6)中测试曲西立滨和根赤壳菌素,并且剂量响应曲线显示了这两种化合物仅可以部分抑制Thr308磷酸化。
6.4实施例4:PIK3CA磷酸-FOXO1细胞测定法
在此细胞测定法中,通过测量转录因子FOXO1(又称为FKHR),即Akt1的一种直接的激酶底物的磷酸化来对化合物测试其抑制Akt1的能力。遵循实施例1中所描述的方案,只是使用细胞系Hek 293,并以5e5/mL的密度分配。对于磷酸-FOXO1检测步骤,使用抗磷酸-FOXO(Thr24)抗体(一种针对FOXO1转录因子的氨基酸24处的磷酸化苏氨酸的抗体),而对总体捕获使用针对NF-κB的抗体以标准化孔间测量的磷酸-FOXO1量。
图7显示了对GSK-690693(即一种已知的Akt1抑制剂),及对PI103和BX-795(其是文献中已知分别抑制PIK3CA和PDPK1的化合物)获得的剂量响应曲线。图7显示了与PIK3CA抑制剂诸如PI103(展现出762nM的IC50)相比,抗磷酸-FOXO1(Thr24)测定法对Akt1抑制剂诸如GSK-6900693(展现出165nM的IC50)更灵敏,并且因此容许区别直接的Akt1抑制与对PIK3C的上游抑制。
因此,实施例3和实施例4中所描述的测定法代表容许询问图2中所描绘的PIK3CA途径中起作用的化合物的作用机制的本发明测定法的集合。
6.5实施例5:磷酸-AurkA细胞测定法
在此测定法中,对化合物测试其抑制Aurora A的自磷酸化的能力。将海拉细胞以5e6/mL的密度在10cm板中铺板,并用2mL具有40μL Lipofectamine2000(Invitrogen)的OPTI-MEM缓冲液(GIBCO/Invitrogen)中的编码可检测蛋白质的表达质粒(8μg)转染,并于37℃温育18-22小时。次日,除去培养基,并将细胞用PBS清洗,胰蛋白酶化,然后用M3培养基(含有10%FBS的DMEM)淬灭。将细胞计数,并在M3完全培养基中以5e6mL的密度重悬,然后以50,000个细胞/孔/50μL分配入96孔板中,并于37℃温育4小时。
对于珠制备(其在结合实验前一晚实施),将蛋白G珠(Invitrogen,Dynabeads-蛋白G(产品目录编号100-04D))在15mL管中清洗,在磁体上沉淀,然后在1XPBS/0.05%Tween 20中再清洗。然后,将珠重悬,并以每100μL蛋白G珠2.5μg抗体的比率向其添加抗磷酸Aurora A(Thr288)抗体,并于室温旋转约45分钟,之后将1%BSA/0.02%叠氮化钠添加至抗体/珠混合物,并于4℃旋转过夜。对于本文中公开的所有测定法,通过测试数种抗体浓度,并选择产生自未处理的细胞(磷酸化的)对经处理的细胞(用抑制靶蛋白磷酸化的特定抑制剂处理的)获得的最高信号比的浓度凭经验确定最佳的抗体与珠比率。
过夜温育后次日,将细胞与M3中的测试化合物一起温育,并于37℃温育2小时。对于蛋白质提取,自各孔除去培养基,添加50μL含有M-PER(Pierce)/150mM NaCl/10mM DTT/1xCompleteTM无EDTA(Roche)抗蛋白酶混合物/250nM冈田酸)的提取缓冲液,并在冷室中以3000rpm摇动平板30分钟。将细胞以3000rpm离心20分钟。将30μL上清液收集,并移液入含有10μL 4X蛋白质稳定化混合物(Pierce产品目录编号89806)的冷却聚丙烯板中。
在两步中实施裂解物稀释。首先,将细胞提取物用1XPBS/0/05%Tween/0.1%BSA在存在0.5nM充当NF-κB探针的核酸寡聚物和80μg/mL鲑鱼精DNA的情况中稀释两倍,并容许于室温温育约30分钟。在第二个稀释步骤,将稀释的提取物在1XPBS/0.05%Tween/0.1%BSA和40μg/mL鲑精DNA中再稀释7.5X,从而最终的稀释产生15倍稀释的原液,其含有0.03nM核酸寡聚物和40μg/mL鲑精DNA。
还是在珠制备后次日,将珠沉淀,然后清洗/封闭,并在1XPBS/0.05%Tween 20/2%BSA的初始体积中重悬两次,然后以每含有1XPBS/0.05%Tween 20/2%BSA的孔50μL的体积以初始原液浓度的一半分配到96孔板上。然后,将50μL细胞裂解物添加至每孔,并于室温将平板摇动1小时。
结合反应后,将珠沉淀4分钟,吸出缓冲液,并将150μL PBST添加至每孔。将平板摇动,然后在磁体上沉淀,然后用PBST清洗2-4次以除去未结合的蛋白质。在最终的清洗,在磁体上将珠转移到新的平板。用吸出器除去最终的缓冲液,并添加150μL IgG洗脱缓冲液(Pierce产品目录编号21004)(其含有0.05%Tween 20),并于室温在摇动的情况中温育30分钟。
或者,可以在没有核酸寡聚物的情况中实施结合测定法,所述核酸寡聚物可以后来在除去未结合的蛋白质的清洗步骤后添加。还使用抗Aurora A抗体来运行结合测定法以标准化孔间测量的磷酸-AurkA量。
对于qPCR检测步骤,将50μL洗脱物转移至新的384孔聚丙烯板。向其添加30μL中和缓冲液(200mM Tris pH9.4/0.05%叠氮化钠)以中和pH。将2.5μL中和的洗脱物转移至含有7.5μL qPCR反应混合物(定制的MasterMix(Applied Biosystems)的PCR板,并使用7900实时PCR仪(AppliedBiosystems)来读出。对MLN-8054(文献中的一种已知的AurkA抑制剂)、AZD-1152HQPA(文献中的一种已知的AurkB抑制剂)和VX-680(一种泛Aurora抑制剂)获得IC50曲线。
6.6实施例6:磷酸-Erk1细胞测定法
在此测定法中,遵循实施例4中所描述的方案通过测量Erk1的磷酸化来对化合物测试其抑制Mek1的能力。将编码无催化活性的Erk1-NFkB可检测蛋白质的载体在A375细胞中转染,并且对于结合测定法,使用抗磷酸Erk1(Thr202/Tyr204)抗体。还使用抗总Erk1抗体来运行结合测定法以标准化孔间测量的磷酸-Erk1的量。对文献中已知的Erk1抑制剂,包括CI-1040(PD0325901)获得IC50曲线。
6.7实施例7:磷酸-Tnk2细胞测定法
在此测定法中,遵循实施例4中所描述的方案对化合物测试其抑制Tnk2(又称为Ack1)自磷酸化的能力。将编码Tnk2-NFkB可检测蛋白质的载体转染入Hek 293细胞中,并且对于结合反应,使用抗磷酸酪氨酸抗体来检测Tyr284处的Tnk2磷酸化。还使用抗总NFkB抗体来运行结合反应以标准化孔间测量的磷酸-Tnk2的量。
6.8实施例8:磷酸-Src细胞测定法
在此测定法中,遵循实施例4中所描述的方案对化合物测试其抑制Src自磷酸化的能力。将编码Src-NFkB可检测蛋白质的载体转染入Hek 293细胞中,并且对于结合反应,使用抗磷酸酪氨酸抗体来检测Tyr416处的Src磷酸化。还使用抗总Src抗体来运行结合反应以标准化孔间测量的磷酸-Src1的量。对已知的Src抑制剂,包括SKI606(伯舒替尼(bosutinib))、CGP-52421、PD-180970和BMS-354825(达沙替尼(dasatinib))获得IC50曲线。
通过提及而将本说明书中所引用的所有出版物、专利和专利申请收入本文,就像明确且个别指明通过提及而收录每篇单独的出版物或专利申请一样。虽然为了理解清楚,前述发明已经作为例示和例子相当详细地进行了描述,但是本领域普通技术人员根据本发明的教导会容易显而易见的是,可以在不背离所附权利要求书的精神或范围的前提下对其做出某些变化和修饰。
Claims (60)
1.一种检测通过感兴趣的细胞过程修饰的蛋白质的方法,包括下列步骤:
a)使包含靶蛋白和核酸相互作用基序的可检测蛋白质与以下接触:
i)抗体,其结合已经通过所述感兴趣的细胞过程修饰过的靶蛋白;和
ii)核酸寡聚物,其包含结合所述核酸相互作用基序的核酸序列;并
b)检测与所述可检测蛋白质结合的所述核酸寡聚物的存在,所述可检测蛋白质也被所述抗体结合;
其中步骤(b)的所述核酸寡聚物的存在指示通过所述感兴趣的细胞过程修饰的蛋白质的存在。
2.权利要求1的方法,其中在步骤(a)中在使所述可检测蛋白质与所述核酸寡聚物接触前使所述可检测蛋白质与所述抗体接触。
3.权利要求1的方法,其中在步骤(a)中在使所述可检测蛋白质与所述核酸寡聚物接触后使所述可检测蛋白质与所述抗体接触。
4.权利要求1的方法,其中在步骤(a)中使所述可检测蛋白质与所述抗体和所述核酸寡聚物同时接触。
5.权利要求1的方法,其中所述细胞过程选自酰化、乙酰化、脱乙酰化、甲酰化、烷基化、甲基化、磷酸化、脱磷酸化、硫酸化、氧化、还原、羟基化、脱酰胺化、羧基化、二硫化物形成、异戊烯化、糖化、糖基化、泛素化、SUMO化(sumoylation)、蛋白水解、外消旋化和异构化。
6.权利要求1的方法,其中所述细胞过程是磷酸化。
7.权利要求1的方法,其中所述靶蛋白是激酶底物。
8.权利要求7的方法,其中经修饰的靶蛋白是在一个或多个残基处磷酸化的,且所述抗体是抗磷酸抗体。
9.权利要求7的方法,其中经修饰的靶蛋白是在一个或多个酪氨酸残基处磷酸化的,且所述抗体是抗磷酸酪氨酸抗体。
10.权利要求7的方法,其中经修饰的靶蛋白是在一个或多个丝氨酸残基处磷酸化的,且所述抗体是抗磷酸丝氨酸抗体。
11.权利要求7的方法,其中经修饰的靶蛋白是在一个或多个苏氨酸残基处磷酸化的,且所述抗体是抗磷酸苏氨酸抗体。
12.权利要求1的方法,其中所述靶蛋白是G偶联蛋白受体、离子通道蛋白、核受体蛋白、转录因子、激酶、细胞因子、生长因子、激素、酶、抗体或小链可变片段(scFv)。
13.权利要求1的方法,其中所述核酸相互作用基序是DNA结合域。
14.权利要求1的方法,其中所述DNA结合域是NF-κB DNA结合域、cro阻抑物DNA结合域、lac阻抑物DNA结合域、GAL4 DNA结合域、GCN4 DNA结合域、Lex-A DNA结合域、Opaque-2 DNA结合域或TGA1a DNA结合域。
15.权利要求1的方法,其中所述核酸相互作用基序包含SEQ ID NO:5或SEQID NO:6中所描述的氨基酸序列。
16.权利要求1的方法,其中所述寡聚物的长度为约50-500个核苷酸。
17.一种鉴定调控细胞过程的测试化合物的方法,其中所述细胞过程修饰靶蛋白,所述方法包括下列步骤:
a)使包含可检测蛋白质的细胞或细胞裂解物与测试化合物接触,其中所述可检测蛋白质包含所述靶蛋白和核酸相互作用基序;
b)使所述可检测蛋白质与以下接触:
i)抗体,其特异性结合已经由于所述细胞过程而修饰过的所述靶蛋白;和
ii)核酸寡聚物,其包含结合所述核酸相互作用基序的核酸序列;并
c)检测与所述可检测蛋白质结合的核酸寡聚物的量,所述可检测蛋白质也被所述抗体结合;
其中相对于在没有所述测试化合物的情况中检出的结合的核酸寡聚物量,在存在所述测试化合物的情况中检出的步骤(c)的结合的核酸寡聚物量的增加或减少指示所述测试化合物调控所述细胞过程。
18.权利要求17的方法,其中在步骤(b)中在使所述可检测蛋白质与所述核酸寡聚物接触前使所述可检测蛋白质与所述抗体接触。
19.权利要求17的方法,其中在步骤(b)中在使所述可检测蛋白质与所述核酸寡聚物接触后使所述可检测蛋白质与所述抗体接触。
20.权利要求17的方法,其中在步骤(b)中使所述可检测蛋白质与所述抗体和所述核酸寡聚物同时接触。
21.权利要求17的方法,其中步骤(a)包括接触包含所述可检测蛋白质的细胞。
22.权利要求21的方法,其中所述细胞瞬时表达所述可检测蛋白质。
23.权利要求21的方法,其中所述细胞稳定表达所述可检测蛋白质。
24.权利要求21的方法,其中所述细胞组成型表达所述可检测蛋白质。
25.权利要求21的方法,其中所述细胞诱导性表达所述可检测蛋白质。
26.权利要求17的方法,所述细胞过程选自酰化、乙酰化、脱乙酰化、甲酰化、烷基化、甲基化、磷酸化、脱磷酸化、硫酸化、氧化、还原、羟基化、脱酰胺化、羧基化、二硫化物形成、异戊烯化、糖化、糖基化、泛素化、SUMO化、蛋白水解、外消旋化和异构化。
27.权利要求17的方法,其中所述细胞过程是磷酸化。
28.权利要求27的方法,其中所述靶蛋白是激酶底物。
29.权利要求28的方法,其中经修饰的靶蛋白是在一个或多个酪氨酸残基处磷酸化的,且所述抗体是抗磷酸酪氨酸抗体。
30.权利要求28的方法,其中经修饰的靶蛋白是在一个或多个丝氨酸残基处磷酸化的,且所述抗体是抗磷酸丝氨酸抗体。
31.权利要求28的方法,其中经修饰的靶蛋白是在一个或多个苏氨酸残基处磷酸化的,且所述抗体是抗磷酸苏氨酸抗体。
32.权利要求17的方法,其中所述靶蛋白是G偶联蛋白受体、离子通道蛋白、核受体蛋白、转录因子、激酶、细胞因子、生长因子、激素、酶、抗体或小链可变片段(scFv)。
33.权利要求17的方法,其中所述核酸相互作用基序是DNA结合域。
34.权利要求17的方法,其中所述DNA结合域是NF-κB DNA结合域、cro阻抑物DNA结合域、lac阻抑物DNA结合域、GAL4 DNA结合域、GCN4DNA结合域、Lex-A DNA结合域、Opaque-2 DNA结合域或TGA1a DNA结合域。
35.权利要求17的方法,其中所述核酸相互作用基序包含SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6中所描述的氨基酸序列。
36.权利要求17的方法,其中所述寡聚物的长度为约50-500个核苷酸。
37.权利要求28的方法,其中所述激酶底物是Mek1,且步骤(a)进一步包括制备阳性对照样品,由此使所述包含可检测蛋白质的细胞或细胞裂解物与Braf抑制剂而不是测试化合物接触。
38.权利要求37的方法,其中所述Braf抑制剂选自BAY-43-9006、PLX-4720、Chir-265。
39.权利要求28的方法,其中所述激酶底物是Akt1,且所述抗体结合磷酸化的Akt。
40.权利要求39的方法,其中所述抗体结合Ser473或Thr308处磷酸化的Akt1。
41.权利要求40的方法,其中所述抗体结合Thr308处磷酸化的Akt1。
42.权利要求40的方法,其中所述抗体结合Ser473处磷酸化的Akt1。
43.权利要求28的方法,其中所述激酶底物是FRAP1或PDPK1,且步骤(a)进一步包括制备阳性对照样品,由此使所述包含可检测蛋白质的细胞或细胞裂解物与PIK3CA抑制剂而不是测试化合物接触。
44.权利要求43的方法,其中所述PIK3CA抑制剂选自PI103、ZSTK-474、渥曼青霉素和PIK-93。
45.权利要求28的方法,其中所述激酶底物是AKT1,且步骤(a)进一步包括制备阳性对照样品,由此使所述包含可检测蛋白质的细胞或细胞裂解物与PDPK1、FRAP1或mTOR抑制剂而不是测试化合物接触。
46.权利要求45的方法,其中所述PDPK1抑制剂是BX-795。
47.权利要求28的方法,其中所述激酶底物是FOXO1,且所述抗体结合磷酸化的FOXO1。
48.权利要求47的方法,其中所述抗体结合Thr24处磷酸化的FOXO1。
49.权利要求28的方法,其中步骤(a)进一步包括制备阳性对照样品,由此使所述包含可检测蛋白质的细胞或细胞裂解物与AKT1抑制剂而不是测试化合物接触。
50.权利要求49的方法,其中所述Akt1抑制剂是GSK-690693。
51.权利要求17的方法,其进一步包括使所述包含可检测蛋白质的细胞或细胞裂解物与至少两个浓度的测试化合物接触,并计算所述测试化合物的IC50。
52.权利要求17的方法,其中相对于在没有所述测试化合物的情况中检出的结合的核酸寡聚物量,在存在所述测试化合物的情况中检出的步骤(c)的结合的核酸寡聚物量的增加指示所述测试化合物使所述细胞过程激动。
53.权利要求17的方法,其中相对于在没有所述测试化合物的情况中检出的结合的核酸寡聚物量,在存在所述测试化合物的情况中检出的步骤(c)的结合的核酸寡聚物量的减少指示所述测试化合物抑制所述细胞过程。
54.权利要求1-53中任一项的方法,其中所述核酸寡聚物包含(a)作为PCR扩增序列的第一核酸序列,和(b)结合所述核酸相互作用基序的第二核酸序列,其中所述第一核酸序列对于所述第二核酸序列而言是异源的。
55.权利要求1-54中任一项的方法,其进一步包括qPCR扩增与所述可检测蛋白质结合的所述核酸寡聚物。
56.权利要求1-55中任一项的方法,其中所述核酸寡聚物是放射性标记的、荧光标记的或生物素化的。
57.权利要求1-56中任一项的方法,其中所述抗体是固定于多孔板上的。
58.一种试剂盒,其包含:
a)包含可检测蛋白质的细胞,其中所述可检测蛋白质包含通过细胞过程修饰的蛋白质和核酸相互作用基序;和
b)包含结合所述核酸相互作用基序的核酸序列的核酸寡聚物。
59.权利要求58的试剂盒,其进一步包含:
c)结合已经通过所述感兴趣的细胞过程修饰过的靶蛋白的抗体。
60.权利要求58的试剂盒,其中所述细胞过程是磷酸化。
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