JP2013535692A - 標的抗体に対する中和抗体検出用インビトロ二重機能標的結合アッセイ - Google Patents

Abstract

インビトロアッセイ方法が開示される。この非細胞ベース二重機能標的結合アッセイは、ＩｇＧ標的抗体、例えば、生物試料（例えば、血清試料）中の生物学的薬剤、およびＩｇＧ標的抗体に対する中和抗体（ＮＡｂ）の存在の両方の検出に有用である。
【選択図】図１

Description

本出願は、２０１０年８月１０日にＥＦＳ−ＷＥＢを用いて提出されたＡＳＣＩＩ「ｔｘｔ」標準に準拠する配列リストを含み、これは３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．セクション１．８２１（ｃ）および１．８２１（ｅ）により要求されているコンピュータで読み取り可能な形式（ＣＲＦ）および紙コピーの両方の機能を果たす。この配列リストは、本明細書ににおいて参照によってその全体が組み込まれる。２０１０年８月１０日に作成された「ｔｘｔ」ファイルの名称は：Ａ−１５８６−ＵＳ−ＰＳＰ−ＳｅｑＬｉｓｔ０８１０１０＿ＳＴ２５．ｔｘｔであり、サイズは２５ｋｂである。

本出願を通して、種々の出版物が丸括弧または角括弧で囲って参照されている。これらの出版物の開示は、本発明に関連する最先端技術をさらに完全に記述するために、本明細書において参照によりその全体が本出願に組み込まれる。

発明の分野
本発明は、治療抗体の分野に関する。

先行技術の説明
抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）は、液性免疫応答の機序の１つである。ＡＤＣＣ応答では、免疫系のエフェクター細胞、主に、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が、標的細胞の表面の標的タンパク質に結合している特異的抗体により結合されている標的細胞を活発に溶解する。好中球および好酸球もＡＤＣＣを媒介する。例えば、好酸球は、ＡＤＣＣにより蠕虫として知られる特定の寄生虫を死滅させることができる。

種々のＩｇＧアイソタイプ抗体が、一定のＡＤＣＣ活性を有することが報告されているが、通常は、ＩｇＧ１およびＩｇＧ３アイソタイプが、顕著な抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を有するものとして特徴づけられている。ある研究では、ＩｇＧ１およびＩｇＧ３抗体の両方が単球または活性化Ｕ９３７細胞ＡＤＣＣ媒介に関し等しく効果的であったが、ＮＫ細胞媒介ＡＤＣＣでは、ＩｇＧ３よりＩｇＧ１の活性が高かった、と報告された（Ｒｏｚｓｎｙａｙ ｅｔ ａｌ．、ＦｃガンマＲ媒介機能におけるＩｇＧ１とＩｇＧ３アイソタイプの特有の役割（Ｄｉｓｔｉｎｃｔｉｖｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ＩｇＧ１ ａｎｄ ＩｇＧ３ ｉｓｏｔｙｐｅｓ ｉｎ Ｆｃ ｇａｍｍａ Ｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ）、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ６６（４）：４９１‐４９８（１９８９））。ＩｇＧ３感作赤血球は、ＩｇＧ１誘導溶解を抑制したと報告されており、各サブクラスは、同じＦｃガンマＲ受容体と関わるが、溶解には、ＩｇＧ３分子が送出できない追加の「シグナル」が必要であることを示唆している（Ｒｏｚｓｎｙａｙ ｅｔ ａｌ．、同上）。ＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）は、ＡＤＣＣエフェクター機能に関連する受容体として特定されている。

いくつかの研究から、ヒトＩｇＧ１抗体のオリゴ糖からのフコース除去により、ＦｃγＲＩＩＩａへのＩｇＧ１結合の改善を通して、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の顕著な強化がもたらされ、ＮＫ細胞の効率的動員と活性化により、ＡＤＣＣ誘導に必要な抗原密度を低減できることが示された（Ｎｉｗａ ｅｔ ａｌ．、ナチュラルキラー細胞結合および低フコースＩｇＧ１抗体による活性化の強化が、低抗原密度での強力な抗体依存性細胞傷害誘導をもたらす（Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ Ｃｅｌｌ Ｂｉｎｄｉｎｇ ａｎｄ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｂｙ Ｌｏｗ−Ｆｕｃｏｓｅ ＩｇＧ１ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎ Ｐｏｔｅｎｔ Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ａｔ Ｌｏｗｅｒ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｄｅｎｓｉｔｙ）、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １１：２３２７（２００５）；Ｓａｔｏｈ ｅｔ ａｌ．、次世代治療抗体としての非フコシル化治療抗体（Ｎｏｎ−ｆｕｃｏｓｙｌａｔｅｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｓ ｎｅｘｔ−ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）、Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｏｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｔｈｅｒａｐｙ ６（１１）：１１６１−１１７３（２００６））。この現象は、治療抗体において特に有用となりうる。治療モノクローナル抗体、例えば、リツキシマブ（リツキサン（登録商標））およびトラスツズマブ（ハーセプチン（登録商標））は腫瘍および／または自己免疫疾患の治療に広く使われている（Ｓｔａｖｅｎｈａｇｅｎ ｅｔ ａｌ．、治療抗体のＦｃ最適化が、インビトロで腫瘍細胞を死滅させる能力を高め、低親和性活性化Ｆｃγ受容体を介した腫瘍増殖をインビボで制御する（Ｆｃ Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｅｎｈａｎｃｅｓ Ｔｈｅｉｒ Ａｂｉｌｉｔｙ ｔｏ Ｋｉｌｌ Ｔｕｍｏｒ Ｃｅｌｌｓ Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌｓ Ｔｕｍｏｒ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｉｎ ｖｉｖｏ ｖｉａ Ｌｏｗ−Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ Ｆｃγ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６７（１８）：８８８２‐９０（２００７）；Ｃｌｙｎｅｓ、ＲＡ ｅｔ ａｌ．、抑制性Ｆｃ受容体が、腫瘍標的に対する細胞毒性をインビボで調節する（Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ｆｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｍｏｄｕｌａｔｅ ｉｎ ｖｉｖｏ ｃｙｔｏｘｉｃｉｔｙ ａｇａｉｎｓｔ ｔｕｍｏｒ ｔａｒｇｅｔｓ）、Ｎａｔ Ｍｅｄ ６（４）：４４３‐４６（２０００）；Ｈａｕｓｅｒ ｅｔ ａｌ．、再発寛解型多発性硬化症におけるリツキシマブに伴うＢ細胞欠乏（Ｂ−ｃｅｌｌ ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｒｉｔｕｘｉｍａｂ ｉｎ ｒｅｌａｐｓｉｎｇ−ｒｅｍｉｔｔｉｎｇ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、ＮＥＪＭ ３５８：６７６−８８（２００８））。

ＫＷ−０７６１（「モガムリズマブ」または「ＡＭＧ７６１」としても知られる）が、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）または末梢性Ｔ細胞リンパ腫（ＰＴＣＬ）患者の治療用に開発中である。ＫＷ−０７６１は、ＣＣケモカイン受容体４（ＣＣＲ４）発現細胞を標的とする免疫グロブリンＧ、サブクラス１（ＩｇＧ１）カッパアイソタイプのヒト化モノクローナル抗体であり、ＡＤＣＣを介してＣＣＲ４発現Ｔ細胞を枯渇させる能力を示している。ＫＷ−０７６１は、定常（Ｆｃ）部の複合体型オリゴ糖からの脱フコシル化により活性化されたＡＤＣＣ活性を有する（Ｉｓｈｉｉ ｅｔ ａｌ．、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫のための新規免疫療法薬としての脱フコシル化ヒト化抗ＣＣＲ４モノクローナル抗体ＫＷ−０７６１（Ｄｅｆｕｃｏｓｙｌａｔｅｄ Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ Ａｎｔｉ−ＣＣＲ４ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ＫＷ−０７６１ ａｓ ａ Ｎｏｖｅｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｇｅｎｔ ｆｏｒ Ａｄｕｌｔ Ｔ−ｃｅｌｌ Ｌｅｕｋｅｍｉａ／Ｌｙｍｐｈｏｍａ）、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １６：１５２０−３１（２０１０）；Ｓｈｉｔａｒａ ｅｔ ａｌ．、ヒトＣＤＲグラフト化抗体およびその抗体断片（Ｈｕｍａｎ ＣＤＲ−ｇｒａｆｔｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｎｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｔｈｅｒｅｏｆ）、米国特許第７、５０４、１０４号）。

中和抗体、またはＮＡｂは、通常、そのインビボ合成を誘導する特異的抗原および類似の分子と反応する免疫グロブリン分子である。中和抗体は、作用モードに従って、凝集素、溶菌素、溶血素、オプソニン、または沈降素、に分類される。抗体は、細胞表面受容体への抗原の結合により活性化されているＢ細胞により合成され、中和抗体は、例えば、病原体の表面上にある抗原の生物学的作用を除去または「中和する」ことができる。不都合なことに、治療抗体は、一部の患者でＮＡｂの産生を誘導することがあり、臨床的安全性のために、治療抗体薬投与を受けている患者の血清中の治療抗体に対するＮＡｂの出現をモニターできることは重要である。

患者の血清中の、このようなＡＤＣＣを誘導可能な治療ＩｇＧ抗体の検出、さらに、このような治療抗体に対するＮａｂの検出のための信頼性のある非細胞ベースのインビトロアッセイ法が、本発明が提供する利得である。

米国特許第７、５０４、１０４号明細書

Ｒｏｚｓｎｙａｙ ｅｔ ａｌ．、ＦｃガンマＲ媒介機能におけるＩｇＧ１とＩｇＧ３アイソタイプの特有の役割（Ｄｉｓｔｉｎｃｔｉｖｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ＩｇＧ１ ａｎｄ ＩｇＧ３ ｉｓｏｔｙｐｅｓ ｉｎ Ｆｃ ｇａｍｍａ Ｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ）、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ６６（４）：４９１‐４９８（１９８９） Ｎｉｗａ ｅｔ ａｌ．、ナチュラルキラー細胞結合および低フコースＩｇＧ１抗体による活性化の強化が、低抗原密度での強力な抗体依存性細胞傷害誘導をもたらす（Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ Ｃｅｌｌ Ｂｉｎｄｉｎｇ ａｎｄ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｂｙ Ｌｏｗ−Ｆｕｃｏｓｅ ＩｇＧ１ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎ Ｐｏｔｅｎｔ Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ａｔ Ｌｏｗｅｒ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｄｅｎｓｉｔｙ）、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １１：２３２７（２００５） Ｓａｔｏｈ ｅｔ ａｌ．、次世代治療抗体としての非フコシル化治療抗体（Ｎｏｎ−ｆｕｃｏｓｙｌａｔｅｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｓ ｎｅｘｔ−ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）、Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｏｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｔｈｅｒａｐｙ ６（１１）：１１６１−１１７３（２００６） Ｓｔａｖｅｎｈａｇｅｎ ｅｔ ａｌ．、治療抗体のＦｃ最適化が、インビトロで腫瘍細胞を死滅させる能力を高め、低親和性活性化Ｆｃγ受容体を介した腫瘍増殖をインビボで制御する（Ｆｃ Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｅｎｈａｎｃｅｓ Ｔｈｅｉｒ Ａｂｉｌｉｔｙ ｔｏ Ｋｉｌｌ Ｔｕｍｏｒ Ｃｅｌｌｓ Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌｓ Ｔｕｍｏｒ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｉｎ ｖｉｖｏ ｖｉａ Ｌｏｗ−Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ Ｆｃγ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６７（１８）：８８８２‐９０（２００７） Ｃｌｙｎｅｓ、ＲＡ ｅｔ ａｌ．、抑制性Ｆｃ受容体が、腫瘍標的に対する細胞毒性をインビボで調節する（Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ｆｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｍｏｄｕｌａｔｅ ｉｎ ｖｉｖｏ ｃｙｔｏｘｉｃｉｔｙ ａｇａｉｎｓｔ ｔｕｍｏｒ ｔａｒｇｅｔｓ）、Ｎａｔ Ｍｅｄ ６（４）：４４３‐４６（２０００） Ｈａｕｓｅｒ ｅｔ ａｌ．、再発寛解型多発性硬化症におけるリツキシマブに伴うＢ細胞欠乏（Ｂ−ｃｅｌｌ ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｒｉｔｕｘｉｍａｂ ｉｎ ｒｅｌａｐｓｉｎｇ−ｒｅｍｉｔｔｉｎｇ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、ＮＥＪＭ ３５８：６７６−８８（２００８） Ｉｓｈｉｉ ｅｔ ａｌ．、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫のための新規免疫療法薬としての脱フコシル化ヒト化抗ＣＣＲ４モノクローナル抗体ＫＷ−０７６１（Ｄｅｆｕｃｏｓｙｌａｔｅｄ Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ Ａｎｔｉ−ＣＣＲ４ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ＫＷ−０７６１ ａｓ ａ Ｎｏｖｅｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｇｅｎｔ ｆｏｒ Ａｄｕｌｔ Ｔ−ｃｅｌｌ Ｌｅｕｋｅｍｉａ／Ｌｙｍｐｈｏｍａ）、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １６：１５２０−３１（２０１０）

本発明は、インビトロ二重機能標的結合アッセイに関し、このアッセイは、生物試料（例えば、血清試料）中の生物学的製剤、等のＩｇＧ標的抗体、およびＩｇＧ標的抗体に対する中和抗体（ＮＡｂ）の存在の両方を検出するのに有用である。

一実施形態では、本発明のインビトロアッセイ法は、生理学的条件で検出を可能とする新鮮な緩衝液の存在下、アビジンコートウエル中でシグナルを測定することにより、ポリヒスチジンタグ組換え型ヒトＣＤ１６ａポリペプチドに結合しているポリヒスチジンに特異的に結合するいずれかの抗体を検出することを含む。ここで、アビジンコートウエルを予めブロックし、その後、生理学的条件下で、ブロックしたアビジンコートウエル中でプレインキュベート反応混合物をインキュベートした。また、プレインキュベーションの間、プレインキュベート反応混合物を水性の血清含有アッセイ緩衝液中で懸濁させ、プレインキュベート反応混合物中には下記を含めた：

（ｉ）ＣＤ１６ａ結合部位を有するＦｃドメインを含む標的抗原結合タンパク質；および

（ｉｉ）対象の標的タンパク質のビオチン化ポリペプチド部であって、標的抗原結合タンパク質が特異的に結合するポリペプチド部。

ここで、アビジンコートウエル中でのプレインキュベート反応混合物のインキュベーションに続き、新鮮なアッセイ緩衝液中に懸濁したポリヒスチジンタグ組換え型ヒトＣＤ１６ａポリペプチドを、アビジンコートウエルのアビジンに結合したビオチン化ポリペプチド部に結合したいずれかの標的抗原結合タンパク質と一緒に、生理学的条件下でインキュベートし；シグナルの測定による検出の前に、新鮮なアッセイ緩衝液中に懸濁した特異的にポリヒスチジンに結合する抗体を、標的抗原結合タンパク質に結合したいずれかのポリヒスチジンタグ組換え型ヒトＣＤ１６ａポリペプチドと一緒に、生理学的条件下、ウエル中でインキュベートした。

この方法のいくつかの実施形態は、ポリヒスチジンに特異的に結合する抗体を検出する前に、ウエル中で、生理学的条件下、複合体化したシグナル生成標識を含む抗体を、新鮮なアッセイ緩衝液中で懸濁させてインキュベートするステップをさらに含む。ここで、この抗体は、ポリヒスチジンに特異的に結合する抗体に特異的に結合する。

特定の実施形態では、本発明のインビトロでアッセイ方法は下記ステップを含む：

（ａ）ブロックしたアビジンコートウエル中で、生理学的条件下、水性の血清含有アッセイ緩衝液中で懸濁したプレインキュベート反応混合物をインキュベートするステップっであって、前記プレインキュベートした反応混合物が下記を含むステップ：

（ｉ）ＣＤ１６ａ結合部位を有するＦｃドメインを含むＩｇＧ標的抗体；および

（ｉｉ）対象標的タンパク質のビオチン化ポリペプチド部であって、前記ＩｇＧ標的抗体が特異的に結合するポリペプチド部；

（ｂ）ステップ（ａ）のアビジンに結合したビオチン化されたポリペプチド部に結合されたいずれかのＩｇＧ標的抗体と一緒に、ウエル中で、生理学的条件下、新鮮なアッセイ緩衝液中に懸濁したポリヒスチジンタグ組換え型ヒトＣＤ１６ａポリペプチドをインキュベートするステップ；

（ｃ）ステップ（ｂ）のＩｇＧ標的抗体に結合されたいずれかのポリヒスチジンタグ組換え型ヒトＣＤ１６ａポリペプチドと一緒に、ウエル中で、生理学的条件下、新鮮なアッセイ緩衝液に懸濁したポリヒスチジンに特異的に結合する抗体をインキュベートするステップ；および

（ｄ）ウエル中で、生理学的条件下、検出を可能とする新鮮な緩衝液の存在下で、ステップ（ｃ）のポリヒスチジンタグ組換え型ヒトＣＤ１６ａポリペプチドに結合したポリヒスチジンに特異的に結合するいずれかの抗体を、シグナルを測定することにより検出するステップ。

本発明のいくつかの実施形態では、方法は、（ｄ）の前に、ウエル中で、生理学的条件下、新鮮なアッセイ緩衝液中に懸濁した、複合体化したシグナル生成標識を含む抗体をインキュベートするステップをさらに含み、前記抗体は、ステップ（ｃ）のポリヒスチジンに特異的に結合する抗体に特異的に結合する。

別の有用な実施形態では、インビトロアッセイ法は、下記ステップを含む：

（ａ）ブロックしたアビジンコートウエル中で、生理学的条件下、水性の血清含有アッセイ緩衝液中に懸濁したプレインキュベート反応混合物をインキュベートするステップであって、プレインキュベート反応混合物が下記を含むステップ：
（ｉ）ＣＤ１６ａ結合部位を有するＦｃドメインを含むヒトＣＣＲ４に対するＩｇＧ標的抗体；
（ｉｉ）中和抗体の存在を試験する血清試料；および
（ｉｉｉ）ヒトＣＣＲ４のビオチン化ポリペプチド部であって、ＩｇＧ標的抗体が特異的に結合するポリペプチド部；

（ｂ）ステップ（ａ）のアビジンに結合したヒトＣＣＲ４のビオチン化ポリペプチド部に結合したいずれかのＩｇＧ標的抗体と一緒に、ウエル中で、生理学的条件下、新鮮なアッセイ緩衝液中に懸濁したポリヒスチジンタグ組換え型ヒトＣＤ１６ａポリペプチドをインキュベートするステップ；

（ｃ）ステップ（ｂ）のＩｇＧ標的抗体に結合したいずれかのポリヒスチジンタグ組換え型ヒトＣＤ１６ａポリペプチドと一緒に、ウエル中で、生理学的条件下、新鮮なアッセイ緩衝液中に懸濁したポリヒスチジンに特異的に結合する抗体をインキュベートするステップ；

（ｄ）ウエル中で、生理学的条件下、新鮮なアッセイ緩衝液中に懸濁した、複合化されたシグナル生成標識を含む抗体をインキュベートするステップであって、前記抗体がステップ（ｃ）のポリヒスチジンに特異的に結合する抗体に特異的に結合するステップ；および

（ｅ）ウエル中で、生理学的条件下で検出を可能とする新鮮な緩衝液の存在下、生成されたいずれかのシグナルを検出するステップ。

種々の本発明の実施形態では、シグナルは、高感度電気化学発光（ＥＣＬ）標識システムにより生成できるが、蛍光標識（例えば、フルオレセイン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、緑色蛍光タンパク質［ＧＦＰ］、強化型ＧＦＰ［ｅＧＦＰ］、黄色蛍光タンパク質［ＹＦＰ］、シアン蛍光タンパク質［ＣＦＰ］、等）、同位体標識（例えば、^１２５Ｉ、^１４Ｃ、^１３Ｃ、^３５Ｓ、^３Ｈ、^２Ｈ、^１３Ｎ、^１５Ｎ、^１８Ｏ、^１７Ｏ、等）、または酵素結合（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ−、ベータガラクトシダーゼ−、またはルシフェラーゼ−ベース）標識システムもまた有用な実施形態である。シグナルは、適切な装置を用いて検出される。

生物試料がＩｇＧ１標的抗体に対する中和抗体を含む場合は、標的抗体は、アビジンコート固体基質上に捕捉された対象ビオチン化標的ペプチドに結合できない。従って、ＮＡｂの存在下で、低（例えば、ＥＣＬ）シグナルが生成される。ＮＡｂが存在しない場合は、高（例えば、ＥＣＬ）シグナルが生成される。その理由は、ＩｇＧ１標的抗体が、ビオチン化標的ペプチドとポリヒスチジンタグ組換え型ヒトＦＣγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）の間でブリッジを形成することができるためである。

発明の図および詳細な説明を考慮すれば、多くの本発明のさらなる態様と利点が明らかとなるであろう。

本発明の二重機能アッセイの実施形態の模式図を示す。この実施形態は、ビオチン化された（「Ｂ」）対象標的タンパク質（例えば、ＣＣＲ４）に特異的に結合するＩｇＧ１標的抗体（例えば、ＫＷ−０７６１、これは「モガムリズマブ」または「ＡＭＧ７６１」としても知られる）を検出し、さらに、血清試料中の中和抗体を検出するように構成されている。この実施形態では、アビジンでコートされたプレートは、ストレプトアビジン（「ＳＡ」）をコートした「ＭＳＤ６０００プレート」（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）で表されており、また、ＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ（登録商標）タンパク質複合体（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）電気化学発光（ＥＣＬ）抗体標識システムを検出用に採用した。ＳＥＣＴＯＲ（登録商標）Ｉｍａｇｅｒ６０００プレートリーダー（「ＭＳＤ６０００」）を検出に使用した。 ＩｇＧ１標的抗体に対する中和抗体を検出するための、本発明のインビトロアッセイのステップを示すフローチャートである。 アッセイ緩衝液（０％ＰＨＳ）またはプールされたヒト血清（「ＰＨＳ」：５％ＰＨＳまたは２０％ＰＨＳ；（ｖ／ｖ））の存在下の本発明のアッセイにおける、ＫＷ−０７６１（「モガムリズマブ」または「ＡＭＧ７６１」としても知られる）の代表的用量反応を示す。 ビオチン化ＣＣＲ４ペプチドに対するＫＷ−０７６１（「モガムリズマブ」または「ＡＭＧ７６１」としても知られる）の結合がポリクローナル抗ＫＷ−０７６１中和抗体の存在により用量依存形式で阻害されることを示す。 実施例３で開示および修正されたように、図１および図２で図示されたのと同じアッセイフォーマットで表現されている、ビオチン化されたＣＤ２０ペプチドへのリツキシマブの用量依存形式での結合を示す。「ＭＢＴ４７３６」は配列番号７を、「ＭＢＴ４７３７」は配列番号８をそれぞれ指す。

実施形態の詳細な説明
本明細書で使われる節の見出しは、構成上の目的のみのためであり、記載されている内容を限定するものと解釈されるべきではない。

定義
本明細書中で別段の定義がなければ、本出願に関連して使用される科学および技術用語は、当業者により通常理解されている意味を有するものとする。さらに、文脈から別義が要求されなければ、単数形の用語は、複数を含み、複数形の用語は、単数を含むものとする。従って、本明細書および添付請求項で使用される単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈から明確に別義が示さなければ、複数形参照対象を含む。例えば、「タンパク質（ａ ｐｒｏｔｅｉｎ）」への参照は、複数のタンパク質を含み、「細胞（ａ ｃｅｌｌ）」への参照は、複数の細胞集団を含む。

「ポリペプチド」および「タンパク質」は、本明細書で同義に使用され、ペプチド結合を介して共有結合した２つ以上のアミノ酸の分子鎖を含む。これらの用語は、特定の長さの生成物を指すものではない。従って、「ペプチド」、および「オリゴペプチド」は、ポリペプチドの定義に含まれる。この用語は、ポリペプチドの翻訳後修飾、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、等を含む。さらに、タンパク質断片、類似体、変種または変異タンパク質、融合タンパク質、等が、ポリペプチドの意義に含まれる。この用語は、また、既知のタンパク質工学技術を使って組換えにより発現しうるような、１つまたは複数のアミノ酸類似体または非標準もしくは非天然アミノ酸が含まれる分子を含む。さらに、よく知られた有機化学技術により、本明細書に記載のように、融合タンパク質が誘導体化されうる。

参照される「単離タンパク質」という用語は、対象タンパク質が（１）通常自然において認められるであろう他のタンパク質の少なくともいくつかを含まず、（２）同じ源由来、例えば、同じ種由来の他のタンパク質を基本的に含まず、（３）異なる種または種類の細胞で組換により発現され、（４）自然において随伴するポリヌクレオチド、脂質、炭水化物、または他の物質の少なくとも約５０パーセントのから分離され、（５）自然においては随伴しないおよび／または（６）本来発生しないポリペプチドを操作可能なように（共有または非共有相互作用により）伴う、ことを意味する。典型的には、「単離タンパク質」は、所与の試料の少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２５％、または少なくとも約５０％を構成する。合成由来のゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡまたは他のＲＮＡ、またはいずれかのこれらの組み合わせは、このような単離タンパク質をコードし得る。単離タンパク質は、実質的に、治療、診断、予防、研究または他の使用を妨害する可能性のある、それの自然環境中で見出されるタンパク質もしくはポリペプチドまたは他の混入物を含まないことが好ましい。

本明細書での、ポリペプチドまたはタンパク質ならびに変異体のいずれかのさらなる記載において、１文字略記法を頻繁に適用し、通常の天然のペプチドおよびタンパク質（表１）に組み込まれている２０の「標準的」アミノ酸残基の特定をする。このような１文字略記は、３文字略記、または非略記アミノ酸名で意味上の完全な置き換えが可能である。
表１．標準アミノ酸の１文字略記。
３文字略記を括弧で示す。
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アラニン（Ａｌａ） Ａ
グルタミン（Ｇｌｎ） Ｑ
ロイシン（Ｌｅｕ） Ｌ
セリン（Ｓｅｒ） Ｓ
アルギニン（Ａｒｇ） Ｒ
グルタミン酸（Ｇｌｕ） Ｅ
リシン（Ｌｙｓ） Ｋ
トレオニン（Ｔｈｒ） Ｔ
アスパラギン（Ａｓｎ） Ｎ
グリシン（Ｇｌｙ） Ｇ
メチオニン（Ｍｅｔ） Ｍ
トリプトファン（Ｔｒｐ） Ｗ
アスパラギン酸（Ａｓｐ） Ｄ
ヒスチジン（Ｈｉｓ） Ｈ
フェニルアラニン（Ｐｈｅ） Ｆ
チロシン（Ｔｙｒ） Ｙ
システイン（Ｃｙｓ） Ｃ
イソロイシン（Ｉｌｅ） Ｉ
プロリン（Ｐｒｏ） Ｐ
バリン （Ｖａｌ） Ｖ
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本明細書では、アミノ酸配列中のアミノ酸置換は、通常、特定の位置のアミノ酸残基の１文字略記、続けて、対象の元の配列に対するアミノ酸位置の数値、次に、置換したアミノ酸残基の１文字記号により表される。例えば、「Ｔ３０Ｄ」は、トレオニン残基のアスパルタート残基による、対象の元の配列に対するアミノ酸位置３０における置換を表す。別の例では、「Ｗ１０１Ｆ」は、トリプトファン残基のフェニルアラニン残基による、対象の元の配列に対するアミノ酸位置１０１の置換を表す。非標準アミノ酸残基も、組換えによる細胞発現を使うタンパク質工学の既知の技術を採用することにより、本発明の範囲内でペプチドに組み込み可能である（例えば、Ｌｉｎｋ ｅｔ ａｌ．、タンパク質工学における非標準アミノ酸（Ｎｏｎ−ｃａｎｏｎｉｃａｌ ａｍｉｎｏａｃｉｄｓ ｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１４（６）：６０３−６０９（２００３）を参照）。「非標準アミノ酸残基」いう用語は、通常、天然タンパク質、例えば、β−アミノ酸、ホモアミノ酸、環状アミノ酸および誘導体化した側鎖を有するアミノ酸中に組み込まれる、２０標準アミノ酸に含まれないＤ−またはＬ−型のアミノ酸残基を指す。例には、（Ｌ−型またはＤ−型の）β−アラニン、β−アミノプロピオン酸、ピペリジン酸、アミノカプリオ酸、アミノヘプタン酸、アミノピメリン酸、デスモシン、ジアミノピメリン酸、Ｎ^α−エチルグリシン、Ｎ^α−エチルアスパルギン、ヒドロキシリシン、アロヒドロキシリシン、イソデスモシン、アロイソロイシン、ω−メチルアルギニン、Ｎ^α−メチルグリシン、Ｎ^α−メチルイソロイシン、Ｎ^α−メチルバリン、g−カルボキシグルタマート、e−Ｎ、Ｎ、Ｎ−トリメチルリジン、e−Ｎ−アセチルリジン、Ｏ−ホスホセリン、Ｎ^α−アセチルセリン、Ｎ^α−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリシン、および他の類似のアミノ酸、ならびに下記表２に挙げたもの、ならびに本明細書記載のようなこれらのいずれかの誘導体化型、が含まれる。表２には、本発明に従って有用である、いくつかの代表的非標準アミノ酸残基、およびそれらに関連する本明細書で通常使用される関連略記が含まれるが、熟練した実践者なら、別の略記および命名法を同じ物質に適用でき、本明細書中に同じ意味で登場する可能性があることを理解するであろう。

生化学命名法に関するＵＰＡＣ−ＩＵＢ合同委員会（ＪＣＢＮ）によるアミノ酸とペプチドの命名法と記号体系は、下記の文書で出版されている：Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、１９８４、２１９、３４５−３７３；Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１９８４、１３８、９−３７；１９８５、１５２、１；１９９３、２１３、２；Ｉｎｔｅｒｎａｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔ．Ｒｅｓ．、１９８４、２４、ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｐ８４；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９８５、２６０、１４−４２；Ｐｕｒｅ Ａｐｐｌ．Ｃｈｅｍ．、１９８４、５６、５９５−６２４；アミノ酸とペプチド（Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ）、１９８５、１６、３８７−４１０；生化学命名法および関連文書（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｄｏｃｕｍｅｎｔｓ）、２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｐｏｒｔｌａｎｄ Ｐｒｅｓｓ、１９９２、ｐａｇｅｓ ３９−６９。

ポリペプチド（例えば、抗原結合タンパク質、または抗体）の「変異体」は、別のポリペプチド配列に比べて、アミノ酸配列へ１つまたは複数のアミノ酸残基が挿入されている、欠失しているおよび／または置換されているアミノ酸配列を含む。変異体には、融合タンパク質が含まれる。

「融合タンパク質」という用語は、タンパク質が、２つ以上の親タンパク質またはポリペプチド由来の、または同じタンパク質であるが同じタンパク質分子中では本来同時には認められない単一融合分子内の異なる順序由来のポリペプチド成分を含むキメラであることを示す。典型的には、融合タンパク質は、融合遺伝子から発現され、この融合遺伝子では、１つのタンパク質由来のポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列が、異なるタンパク質由来のポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列とインフレームで付加され、さらに、任意選択で異なるタンパク質由来のポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列由来のリンカーにより分離されてもよい。融合遺伝子は、その後、組換え宿主細胞により単一のタンパク質として発現されうる。

「分泌」タンパク質は、分泌シグナルペプチド配列の結果として、ＥＲ、分泌ベシクル、または細胞外の空隙に誘導されうるタンパク質、ならびに必ずしもシグナル配列を含まないで細胞外の空隙中に放出されるタンパク質を指す。分泌タンパク質が細胞外の空隙に放出されると、分泌タンパク質は、細胞外処理を受け、「成熟」タンパク質を生成することができる。細胞外の空隙中への放出は、エキソサイトーシスおよびタンパク切断、等の多くの機序により生じうる。本発明の組成のいくつかの他の実施形態では、ポリペプチドは、分泌タンパク質として宿主細胞により合成され、その後、細胞外の空隙および／または媒質からさらに精製されうる。

本発明のインビトロアッセイ法のいくつかのステップでは、分子または分子の混合物は、水性の液体、例えば、血清含有アッセイ緩衝液、または新鮮なアッセイ緩衝液中で「懸濁」される。用語の「懸濁」は、分子または混合物が、その液体に、溶解する、分散する、浮遊する、流動する、または混合されることを意味する。

宿主細胞中の組換えＤＮＡ技術により産生されるタンパク質に関連する場合、本明細書で使用される「可溶性」タンパク質は、水溶液中に存在するタンパク質である；タンパク質が、ツインアルギニンシグナルアミノ酸配列を含む場合は、可溶性タンパク質は、グラム陰性菌宿主中の細胞周辺腔に排出される、または分泌ができる真核生物宿主細胞によって、もしくは適切な遺伝子（例えば、ｋｉｌ遺伝子）を有する細菌性宿主によって培地中に分泌される。したがって、可溶性タンパク質は、宿主細胞内部の封入体中には認められないタンパク質である。あるいは、文脈によっては、他のタンパク質無しに、生理学的条件下、対象の水性緩衝液（緩衝液は、洗剤または尿素、塩酸グアニジウム、または過塩素酸リチウム等のカオトロピック剤を含まない）中で懸濁される場合に、可溶性タンパク質は、細胞膜中に集積されているのが認められない、またはインビトロで溶解されている、または生理学的条件下、顕著な量の不溶性の凝集体を形成しないで水性緩衝液に溶解可能である（すなわち、総タンパク質の１０％未満、さらには、通常は、約５％未満の凝集体を形成する）タンパク質である。対称的に、不溶性タンパク質は、宿主細胞の細胞質顆粒（封入体と呼ばれる）の内側に変性型で存在するタンパク質であるか、または再度文脈によっては、不溶性タンパク質は、限定されないが、細胞膜、ミトコンドリア膜、葉緑体膜、小胞体膜、等の細胞膜中に存在するタンパク質である。あるいは、対象の水性緩衝液（緩衝液は、洗剤または尿素、塩酸グアニジウム、または過塩素酸リチウム等のカオトロピック剤を含まない）中で、生理学的条件下、他のタンパク質の無い状態で（生理学的に適合できる温度で）懸濁される場合、インビトロで水性の緩衝液中で、生理学的条件下、多量の不溶性凝集体を形成する（すなわち、総タンパク質の約１０％以上の凝集体を形成する）タンパク質である。

「組換え」という用語は、物質（例えば、核酸またはポリペプチド）が人工的に、または合成を通して（すなわち、非天然的に）、ヒトの介入により改変されていることを示す。改変は、それの自然環境または状態内の物質、またはそこから取り出した物質に対し行うことができる。例えば、「組換え核酸」は、例えば、クローニング、ＤＮＡシャフリングまたは他のよく知られた分子生物学的手法の間に、核酸を組み換えることにより作成される核酸である。このよう分子生物学的手法の例は、Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．、分子クローニング．実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ（１９８２）に認められる。「組換えＤＮＡ分子」は、このような分子生物学的手法で連結されたＤＮＡセグメントから構成される。本明細書で使われる「組換えタンパク質」または「組換えポリペプチド」という用語は、組換えＤＮＡ分子を使って発現されたタンパク質分子を指す。「組換え宿主細胞」は、組換え核酸を含むおよび／または発現する細胞である。

「ポリヌクレオチド」または「核酸」という用語は、２つ以上のヌクレオチド残基を含む単鎖および二重鎖の両方のヌクレオチドポリマーを包含する。ポリヌクレオチド含有ヌクレオチド残基は、リボヌクレオチドでも、デオキシリボヌクレオチドでも、またはいずれかのタイプのヌクレオチドの改変型であってもよい。前記改変は、ブロモウリジンおよびイノシン誘導体等の塩基改変、２’、３’−ジデオキシリボース等のリボース改変、およびホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、ホスホロセレノアート、ホスホロジセレノアート、ホスホロアニロチオアート、ホスホラニラダートおよびホスホロアミダート等のヌクレオチド間結合改変、を含む。

「オリゴヌクレオチド」という用語は、２００以下のヌクレオチド残基を含むポリヌクレオチドを意味する。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１０〜６０塩基長である。他の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０〜４０ヌクレオチド長である。オリゴヌクレオチドは、例えば、変異体遺伝子の構成に使用するためには、単鎖であっても二重鎖であってもよい。オリゴヌクレオチドは、センスオリゴヌクレオチドでも、アンチセンスオリゴヌクレオチドでもよい。オリゴヌクレオチドは、定量化または検出を容易にするための同位体標識（例えば、^１２５Ｉ、^１４Ｃ、^１３Ｃ、^３５Ｓ、^３Ｈ、^２Ｈ、^１３Ｎ、^１５Ｎ、^１８Ｏ、^１７Ｏ、等）、検出アッセイ用の蛍光標識、ハプテンまたは抗原標識、等の標識を含んでもよい。オリゴヌクレオチドは、例えば、ＰＣＲプライマー、クローニングプライマーまたはハイブリダイゼーションプローブとして使用できる。

本明細書で同義に使用される「ポリヌクレオチド配列」または「ヌクレオチド配列」または「核酸配列」は、ポリヌクレオチド中のヌクレオチド残基の一次配列であり、文脈に応じ、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ、およびＲＮＡ、核酸、またはヌクレオチド残基の一次配列を表す文字列を含む。任意の特定のポリヌクレオチド配列から、所与の核酸または相補的なポリヌクレオチド配列のいずれかが決定できる。単鎖または二重鎖であってもよく、またセンス鎖でもアンチセンス鎖でもよいゲノムまたは合成由来のＤＮＡまたはＲＮＡが含まれる。特段の指定がなければ、本明細書で考察する任意の単鎖ポリヌクレオチド配列の左側末端は、５’末端であり；二重鎖ポリヌクレオチド配列の左側方向が、５’方向と呼ばれる。新生のＲＮＡ転写物の５’→３’付加方向は、転写方向と呼ばれる；ＲＮＡ転写物（ＲＮＡ転写物の５’から５’末端まで）と同じ配列を有するＤＮＡ鎖上の配列領域は、「上流配列」と呼ばれる；ＲＮＡ転写物（ＲＮＡ転写物の３’から３’末端まで）と同じ配列を有するＤＮＡ鎖上の配列領域は、「下流配列」と呼ばれる。

本明細書で使用される「単離核酸分子」または「単離核酸配列」は、（１）通常、核酸の天然源に付随する少なくとも１つの混入核酸分子から特定および分離されるか、または（２）クローン化、増幅、タグ取り付け、または他の方法でバックグラウンド核酸から識別され、それにより、対象核酸配列が決定できるか、のいずれかである核酸分子である。単離核酸分子は、天然で認められる形状または環境以外の状態にある。しかし、単離核酸分子は、通常、ポリペプチド（例えば、オリゴペプチドまたは抗体）を発現する細胞（ここでは、例えば、核酸分子は天然の細胞とは異なる染色体の位置に存在する）中に含まれる核酸分子を包含する。

本明細書で使われる用語の「〜をコードする核酸分子」、「〜をコードするＤＮＡ配列」、および「〜をコードするＤＮＡ」は、デオキシリボヌクレオチドのデオキシリボ核酸鎖に沿った順序または配列を指す。これらのデオキシリボヌクレオチドの順序は、ｍＲＮＡ鎖に沿ったリボヌクレオチドの順序を決定し、また、ポリペプチド（タンパク質）鎖に沿ったアミノ酸の順序も決定する。従って、ＤＮＡ配列は、ＲＮＡ配列をコードし、アミノ酸配列をコードする。

用語の「遺伝子」は、広範囲に使われ、生物学的機能に関連した任意の核酸を指す。遺伝子は、通常、コード配列および／またはこのようなコード配列の発現に必要な調節配列を含む。用語の「遺伝子」は、具体的ゲノムまたは組換え型配列、ならびにその配列によりコードされるｃＤＮＡまたはｍＲＮＡに適用される。「融合遺伝子」は、天然に一緒には見つからない、またはコード化融合タンパク質（すなわち、キメラタンパク質）中に存在するものと同じ配列中に、天然では一緒には見つからない、異なるタンパク質由来の部分を有するポリペプチドをコードするコーディング領域を含む。遺伝子は、また、例えば、他のタンパク質のための認識配列を形成する非発現核酸セグメントを含む。転写因子等の調節タンパク質が結合する転写調節領域を含む非発現調節配列は、隣接または近くの配列の転写を生ずる。

「遺伝子の発現」または「核酸の発現」は、ＤＮＡのＲＮＡへの転写（任意選択で、ＲＮＡの修飾、例えば、スプライシングを含む）、ＲＮＡのポリペプチドへの翻訳（その後のポリペプチドの翻訳後修飾を含む場合もある）、または文脈によっては、転写と翻訳の両方、を意味する。

本明細書で使われる「コーディング領域」または「コード配列」という用語は、構造遺伝子に関連して使用される場合、ｍＲＮＡ分子の翻訳の結果として、発生期のポリペプチドで認められるアミノ酸をコードするヌクレオチド配列を指す。真核生物では、コーディング領域は、５’側のイニシエータのメチオニンをコードするヌクレオチドトリプレット「ＡＴＧ」および３’側の停止コドン（すなわち、ＴＡＡ、ＴＡＧ、ＴＧＡ）を指定する３つのトリプレットの内の１つにより境界が形成されている。

「制御配列」または「制御シグナル」という用語は、特定の宿主細胞中で、それが連結されるコード配列の発現および処理に影響を与えることができるポリヌクレオチド配列を指す。このような制御配列の特性は、宿主生物体に依存しうる。特定の実施形態では、原核生物に対する制御配列は、プロモーター、リボソーム結合部、および転写終止配列を含んでもよい。真核生物に対する制御配列は、１つまたは複数の転写因子のための認識部位、転写エンハンサー配列または要素、ポリアデニル化部位、および転写終止配列を含むプロモーターを含んでもよい。制御配列は、リーダー配列および／または融合パートナー配列を含むことができる。プロモーターおよびエンハンサーは、転写に関与する細胞タンパク質と特異的に相互作用する短い配列のＤＮＡから構成される（Ｍａｎｉａｔｉｓ、ｅｔ ａｌ．、科学２３６：１２３７（１９８７））。プロモーターおよびエンハンサー配列は、酵母、昆虫および哺乳動物細胞中の遺伝子ならびにウイルスを含む種々の真核生物源から単離されている（類似の調節領域、すなわち、プロモーターは、また、原核生物中でも見つかっている）。特定のプロモーターおよびエンハンサーの選択は、どの細胞型を対象タンパク質の発現に使用すべきかということに依存する。一部の真核生物プロモーターおよびエンハンサーは、広範な宿主範囲を有するが、一方、他のものは、限定された細胞型サブセットにおいて機能する（Ｖｏｓｓ、ｅｔ ａｌ．、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．、１１：２８７（１９８６）およびＭａｎｉａｔｉｓ、ｅｔ ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３６：１２３７（１９８７）の概説参照）。

「ベクター」という用語は、情報をコードしたタンパク質宿主細胞中に移入するのに使用される任意の分子または実体（例えば、核酸、プラスミド、バクテリオファージまたはウイルス）を指す。

本明細書で使われる「発現ベクター」または「発現構築物」という用語は、所望のコード配列、およびコード配列の特定の宿主細胞中での発現のために必要な適切な機能的に連結された核酸制御配列を含む組換えＤＮＡ分子を指す。発現ベクターは、限定されないが、転写、翻訳に影響を与える、または制御する、および、イントロンが存在する場合には、機能的に連結されたコーディング領域のＲＮＡスプライシングに影響を与える配列を含むことができる。原核生物における発現に必要な核酸配列は、プロモーターを含み、任意選択でオペレーター配列、リボソーム結合部位および可能な限り他の配列を含む。真核細胞は、プロモーター、エンハンサー、および終結とポリアデニル化シグナルを利用することが知られている。分泌シグナルペプチド配列は、また、任意選択で、所望に応じ、細胞から対象ポリペプチドのさらに容易な単離のために発現ベクターによりコードされ、対象のコード配列に機能的に連結され、それにより、発現したポリペプチドが組換え型宿主細胞により分泌されてもよい。このような技術は、当技術分野でよく知られている（Ｅ．ｇ．、Ｇｏｏｄｅｙ、Ａｎｄｒｅｗ Ｒ．；ｅｔ ａｌ．、ペプチドおよびＤＮＡ配列（Ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｄ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）、米国特許第５，３０２，６９７号；Ｗｅｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ．、タンパク質分泌組成物と方法（Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ）、米国特許第６，０２２，９５２号および同６，３３５，１７８号；Ｕｅｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，タンパク質発現ベクターとその利用（Ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ａｎｄ ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｔｈｅｒｅｏｆ）、米国特許第７，０２９，９０９号；Ｒｕｂｅｎ ｅｔ ａｌ．、２７ ヒト分泌タンパク質（ｈｕｍａｎ ｓｅｃｒｅｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ）、米国特許公開第２００３／０１０４４００Ａ１号）。

本明細書で使用される「操作可能な組み合わせで」、「操作可能な順に」および「機能的に連結された」という用語は、所与の遺伝子の転写および／または所望のタンパク質分子の合成を指示できる核酸分子が産生されるような方式での核酸配列の連結を指す。この用語は、また、機能的タンパク質が産生されるような方式でのアミノ酸配列の連結を指す。例えば、タンパク質コード配列に「機能的に連結されている」ベクター中の制御配列は、タンパク質コード配列の発現が、制御配列の転写活性と適合する条件下で行われるように、連結される。

「宿主細胞」という用語は、核酸で形質転換されている、または形質転換されることができ、それにより目的遺伝子を発現できる細胞を意味する。この用語は、元の親細胞と形態学的にまたは遺伝的性質が同じであってもなくても、目的遺伝子が存在する限りは、親細胞の子孫を含む。多数の利用可能な、よく知られた宿主細胞の内のいずれかを、本発明の実施に際し使用可能である。特定の宿主の選択は、当技術分野で認識されているいくつかの要因に依存する。これらには、例えば、選択発現ベクターとの的合成、ＤＮＡ分子によりコードされたペプチドの毒性、形質転換速度、ペプチド回収の容易さ、発現特性、バイオセーフティおよびコスト、が含まれる。これらの要因のバランスは、必ずしも全ての宿主が特定のＤＮＡ配列の発現に同等に有効ではないという理解と関係付けなければならない。これらの一般ガイドラインの範囲内で、培養に有用な微生物宿主細胞には、細菌（例えば、大腸菌種種）、酵母（例えば、サッカロミセス種）および他の真菌細胞、昆虫細胞、植物細胞、哺乳類（ヒトを含む）細胞、例えば、ＣＨＯ細胞およびＨＥＫ−２９３細胞が含まれる。修飾は、ＤＮＡレベルでも同様に行うことができる。ＤＮＡ配列をコードするペプチドは、選択宿主細胞にさらに適合性のよいコドンに変更できる。大腸菌に対して、最適化コドンが当技術分野で知られている。コドンは、制限酵素部位を除くために、またはサイレント制限酵素部位を含めるために置換可能であり、これにより、選択宿主細胞中でのＤＮＡの処理を支援することができる。次に、形質転換宿主は培養され、精製される。宿主細胞は、従来の発酵条件下で培養でき、所望の化合物が発現される。このような発酵条件は、当技術分野でよく知られている。

「トランスフェクション」という用語は、外来または外因性ＤＮＡの細胞による取込を意味し、外因性のＤＮＡが、細胞膜の内部に導入されている場合、細胞は「形質移入」されている。いくつかのトランスフェクション技術が当技術分野でよく知られており、本明細書で開示されている。例えば、Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．、１９７３、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２：４５６；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．、２００１、分子クローニング：実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）、前出；Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．、１９８６、分子生物学の基本的方法（Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ；Ｃｈｕ ｅｔ ａｌ．、１９８１、Ｇｅｎｅ １３：１９７、を参照。このような技術は、１つまたは複数の外因性のＤＮＡ成分を適切な宿主細胞中に導入するために使用できる。

「形質転換」という用語は、細胞の遺伝的特性の変化を指し、細胞が新規ＤＮＡまたはＲＮＡを含むように改変されている場合に、細胞は、形質転換されている。例えば、トランスフェクション、形質導入または他の技術を介した新規遺伝的物質の導入により、そのネイティブ状態から遺伝的に改変される場合に、細胞は、形質転換される。トランスフェクションまたは形質導入の後、形質転換ＤＮＡは、細胞の染色体中に物理的に組み込むことにより細胞のＤＮＡと組み換えられてもよく、または複製されることなく、エピソームエレメントとして一時的に維持されてもよく、または、独立にプラスミドとして複製されてもよい。形質転換ＤＮＡが細胞分裂に伴い複製される場合に、細胞は「安定に形質転換」されていると見なされる。

タンパク質の「ドメイン」または「領域」（本明細書では同義に使用される）は、全タンパク質の、完全なタンパク質までの、および完全なタンパク質を含む、任意の部分であるが、通常は、完全なタンパク質より小さい部分を含む。ドメインは、残りのタンパク質鎖とは無関係に折り畳むことができ、および／または特定の生物学的、生化学的、または構造的機能もしくは部位（例えば、リガンド結合ドメイン、またはサイトゾル、膜貫通もしくは細胞外ドメイン）と関連付けできるが、必ずしも必要ではない。

治療の目的のための「哺乳動物」は、哺乳動物に分類される任意の動物を指し、ヒト、飼育動物および家畜、および動物園の動物、スポーツアニマル、またはペット動物、例えば、イヌ、ウマ、ネコ、雌ウシ、ラット、マウス、サル等が含まれる。

生物学的物質、例えば、ポリペプチド、核酸、宿主細胞、等に関連して本明細書全体を通して使用される「天然」という用語は、自然界で見付けられる物質を指す。

「抗体」、または同義の「Ａｂ」という用語は、広い意味で使用され、完全に構築された抗体、モノクローナル抗体（ヒト、ヒト化またはキメラ抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多選択性の抗体（例えば、二重特異性抗体）、および抗原に結合できる抗体断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ、単鎖抗体、ダイアボディ）を含み、所望の生物活性を示す限り、前出のものの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。化学的誘導体化抗体を含む無傷分子および／または断片の多量体または凝集体が、意図されている。ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ならびにＩｇＥ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２、またはいずれかのアロソタイプを含むいずれのアイソタイプクラスまたはサブクラスの抗体も意図されている。異なるアイソタイプは、異なるエフェクター機能を有する。例えば、ＩｇＧ１およびＩｇＧ３アイソタイプは、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を有する。従って、本発明のインビトロでアッセイ法の一部の実施形態では、ＩｇＧ標的抗体は、ＩｇＧ１（例えば、ＫＷ−０７６１（「モガムリズマブ」または「ＡＭＧ７６１」としても知られる）、リツキシマブ、またはトラスツズマブ）またはＩｇＧ３抗体である。

「抗原結合タンパク質」（ＡＢＰ）という用語は、前で定義した抗体または抗体断片、および組換え型ペプチドまたは所望の抗原結合特性を有するＣＤＲ由来の配列を含む他の化合物を含む。

抗体−抗原相互作用は、Ｍ^−１ｓ^−１で表される会合速度定数（ｋ_ａ）、またはｓ^−１で表される解離速度定数（ｋ_ｄ）、または、代わりに、Ｍで表される解離平衡定数（Ｋ_Ｄ）で特徴付けることができる。一般に、抗原結合タンパク質、例えば、抗体または抗体断片は、類似の結合アッセイ条件下の他の無関係のタンパク質に対する親和性と比較して、顕著に高い結合親和性を有し、その結果として、その抗原を区別することができる場合、抗原に「特異的に結合」する。１０^−９Ｍ以下の範囲で、１０^−１２Ｍ以下（低い値が高い結合親和性を示す）までの範囲のＫ_Ｄ（解離平衡定数）で測定した結合親和性、または１０^−４ｓ^−１以下の範囲で、１０^−１０ｓ^−１以下までの範囲のｋ_ｄ（解離速度定数）で測定した結合力、等の特性が望ましい。典型的には、解離平衡定数（Ｋ_Ｄ）が１０^−８Ｍ以下の場合に、抗原結合タンパク質（例えば、抗体または抗体断片）は、その標的抗原に「特異的に結合する」といわれる。抗原結合タンパク質（例えば、抗体または抗体断片）は、Ｋ_Ｄが５ｘ１０^−９Ｍ以下の場合に、特異的に抗原に「高親和性」で結合し、Ｋ_Ｄが５ｘ１０^−１０Ｍ以下の場合に、「非常に高親和性」で結合する。一実施形態では、抗原結合タンパク質（例えば、抗体）は、約１０^−８Ｍ〜１０^−１０ＭのＫ_Ｄで結合し、さらに別の実施形態では、抗体は、５ｘ１０^−９Ｍ以下のＫ_Ｄで結合する。会合速度定数、解離速度定数、または解離平衡定数は、動態解析技術、例えば、表面プラズモン共鳴法（ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）；例えば、Ｆｉｓｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．、ペプチド−免疫グロブリンコンジュゲート（Ａ ｐｅｐｔｉｄｅ−ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）、国際公開第２００７／０４５４６３Ａ１号、実施例１０、この特許は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、またはメーカーにより概略説明されている一般的方法または当技術分野で既知の他の方法を使ったＫｉｎＥｘＡを使って容易に測定できる。ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）またはＫｉｎＥｘＡにより得られた動力学的データは、メーカーにより説明されている方法で解析できる。

「抗原結合領域」または「抗原結合部位」は、特異的に特定抗原に結合する抗原結合タンパク質（例えば、抗体タンパク質または抗体断片）の部分を意味する。例えば、抗原と相互作用するアミノ酸残基を含み、抗原に対する特異性および親和性を抗体に付与する抗体のその部分は、「抗原結合領域」と呼ばれる。抗原結合領域は、通常、１つまたは複数の「相補的結合領域」（「ＣＤＲ」）を含む。特定の抗原結合領域は、また、１つまたは複数の「フレームワーク」領域（「ＦＲ」）を含む。「ＣＤＲ」は、抗原結合特異性および親和性をもたらすアミノ酸配列である。「フレームワーク」領域は、ＣＤＲの正しい高次構造の維持を支援し、抗原結合領域および抗原の間の結合を促進することができる。

「単離」抗体は、産生細胞により抗体が分泌された天然環境のまたは培地中の１つまたは複数の成分から特定および分離されている抗体である。その天然環境または培地の「混入物」成分は、抗体の診断または治療上の使用を妨害するであろう物質であり、酵素、ホルモン、および他のタンパク質様の溶質を含む可能性がある。一部の実施形態では、抗体は、（１）抗体重量で９５％超に、および最も好ましくは、９９重量％超に、または（２）還元または非還元条件下、任意選択で染色し、例えば、クマシー・ブルーまたは銀染色を使って、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより均質になるまで、精製される。抗体の天然環境の少なくとも１つの要素が存在しないので、単離天然抗体には、組換え細胞内のそのままの状態での抗体が含まれる。しかし、通常、単離抗体は、少なくとも１つの精製ステップにより調製される。

本明細書で使われる「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均質な抗体の集団から得た抗体、すなわち、その集団を含む個別抗体が少量存在する可能性がある天然変異を除いて、同一である抗体を指す。モノクローナル抗体は、ポリクローナル抗体製剤とは対照的に、高度に特異的であり、個別の抗原性の部位またはエピトープに向けられる。モノクローナル抗体は、通常、異なるエピトープに対する異なる抗体を含む。モノクローナル抗体の非制限的例には、マウス、ウサギ、ラット、ニワトリ、キメラ、ヒト化、またはヒト抗体、完全集合抗体、多選択性抗体（二重特異性抗体を含む）、抗原に結合できる抗体断片（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ、単鎖抗体、ディアボディを含む）、マキシボディ、ナノボディ、およびそれらが所望の生物活性を示す範囲で前出物質のＣＤＲを含む組換えペプチド、またはそれらの変異体もしくは誘導体が含まれる。

「モノクローナル」という修飾語は、実質的に均質な抗体集団から入手される抗体の特徴を示し、いずれかの特定の方法による抗体の産生が必要であると解釈されるべきではない。例えば、本発明において使用されるモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法（Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５［１９７５］により始めて記載された）により作成でき、または、組換えＤＮＡ方法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号参照）により作成できる。「モノクローナル抗体」は、また、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、３５２：６２４−６２８［１９９１］およびＭａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２２：５８１−５９７（１９９１）に記載の技術を使って、ファージ抗体ライブラリーから単離できる。

「免疫グロブリン」という用語は、それぞれ軽鎖（ＬＣ）に共有結合した２つの二量体化重鎖（ＨＣ）を含む完全抗体；１つの単量体免疫グロブリン重鎖および共有結合で連結された軽鎖（ＨＣ＋ＬＣ）、またはキメラ免疫グロブリン（軽鎖＋重鎖）−Ｆｃヘテロ三量体（いわゆる「ヘミボディ（ｈｅｍｉｂｏｄｙ）」）を包含する。

「抗体」は、四量体の糖タンパク質である。天然抗体では、各四量体は、２つの同一の対のポリペプチド鎖から構成され、各対は、約２２０アミノ酸（約２５ｋＤａ）の１つの「軽」鎖および約４４０アミノ酸（約５０〜７０ｋＤａ）の１つの「重」鎖を有する。各鎖のアミノ末端部分は、主に抗原認識に関与する約１００〜１１０以上のアミノ酸の「可変」（「Ｖ」）部を含む。各鎖のカルボキシ末端部分は、主にエフェクター機能に関与する定常部を規定する。可変部は、異なる抗体間で異なる。定常部は、異なる抗体間で同じである。各重鎖または軽鎖の可変部内で、抗体の抗原に対する特異性を決定するのを支援する３つの高頻度可変性亜領域がある。高頻度可変性領域の間の可変ドメイン残基は、フレームワーク残基と呼ばれ、一般的には、異なる抗体間である程度の相同性がある。免疫グロブリンは、それらの重鎖の定数ドメインのアミノ酸配列に応じて、異なるクラスに割り当てることができる。ヒト軽鎖は、カッパ（κ）およびラムダ（λ）軽鎖に分類される。軽鎖および重鎖内で、可変部および定常部は、約１２以上のアミノ酸の「Ｊ」領域により連結され、重鎖は、また、約１０超のアミノ酸の「Ｄ」領域を含む。一般的説明は、免疫学の基礎（Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）、Ｃｈ．７（Ｐａｕｌ、Ｗ．、ｅｄ．、２ｎｄ ｅｄ．Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｎ．Ｙ．（１９８９））を参照されたい。本発明の範囲内で、「抗体」は、また、組換えで生成された抗体、およびグリコシル化の欠けた抗体を包含する。

「軽鎖」または「免疫グロブリン軽鎖」という用語は、完全長軽鎖および結合特異性を付与するのに充分な可変部配列を有するその断片を含む。完全長軽鎖は、可変部ドメイン、Ｖ_Ｌ、および定常部ドメイン、Ｃ_Ｌを含む。軽鎖の可変部ドメインは、ポリペプチドアミノ末端にある。軽鎖は、カッパ鎖およびラムダ鎖を含む。

「重鎖」または「免疫グロブリン重鎖」という用語は、完全長重鎖および結合特異性を付与するのに充分な可変部配列を有するその断片を含む。完全長重鎖は、可変部ドメイン、Ｖ_Ｈ、および３つの定常部ドメイン、Ｃ_Ｈ１、Ｃ_Ｈ２、およびＣ_Ｈ３を含む。Ｖ_Ｈドメインは、ポリペプチドのアミノ末端にあり、Ｃ_Ｈドメインカルボキシル末端にあり、Ｃ_Ｈ３はポリペプチドのカルボキシ末端に最近接の位置にある。重鎖は、ミュー（μ）、デルタ（Δ）、ガンマ（γ）、アルファ（α）、およびイプシロン（ε）に分類され、それぞれ抗体のアイソタイプＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＥを規定する。別の本発明の実施形態では、重鎖は、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４サブタイプを含む）、ＩｇＡ（ＩｇＡ１おょびＩｇＡ２サブタイプを含む）、ＩｇＭおよびＩｇＥを含むいずれのアイソタイプでもよい。これらの内のいくつかは、サブクラスまたはアイソタイプ、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２にさらに分割できる。異なるＩｇＧアイソタイプは、異なるエフェクター機能（Ｆｃ領域による媒介）、例えば、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）および補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）を持つことができる。ＡＤＣＣでは、抗体のＦｃ領域は、ナチュラルキラーおよびマクロファージ等の免疫エフェクター細胞の表面上のＦｃ受容体（ＦｃγＲ）に結合し、標的細胞の食作用または溶解を引き起こす。ＣＤＣでは、抗体は、細胞表面で補体カスケード開始させることにより標的細胞を死滅させる。

「Ｆｃ領域」、または本明細書で同義に使用される「Ｆｃドメイン」もしくは「免疫グロブリンＦｃドメイン」は、２つの重鎖断片を含み、これらは、完全抗体では、抗体のＣ_Ｈ１およびＣ_Ｈ２ドメインを含む。２つの重鎖断片は、２つ以上のジスルフィド結合およびＣ_Ｈ３ドメインの疎水性の相互作用により保持される。

「サルベージ受容体結合エピトープ」という用語は、ＩｇＧ分子（例えば、ＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３、またはＩｇＧ_４）のＦｃ領域のエピトープを指し、インビボでのＩｇＧ分子の血清中半減期の増加に関与する。

「アロタイプ」は、抗体配列中（定常部中での場合が多い）のバリエーションで、免疫原性であってもよく、ヒトの特定の対立遺伝子によりコードされる。アロタイプは、ヒトＩＧＨＣ遺伝子の５つの、ＩＧＨＧ１、ＩＧＨＧ２、ＩＧＨＧ３、ＩＧＨＡ２およびＩＧＨＥ遺伝子として特定されており、それぞれ、Ｇ１ｍ、Ｇ２ｍ、Ｇ３ｍ、Ａ２ｍ、およびＥｍアロタイプと命名される。以下の、少なくとも１８Ｇｍアロタイプが既知である：ｎＧ１ｍ（１）、ｎＧ１ｍ（２）、Ｇ１ｍ（１、２、３、１７）またはＧ１ｍ（ａ、ｘ、ｆ、ｚ）、Ｇ２ｍ（２３）またはＧ２ｍ（ｎ）、Ｇ３ｍ（５、６、１０、１１、１３、１４、１５、１６、２１、２４、２６、２７、２８）またはＧ３ｍ（ｂ１、ｃ３、ｂ５、ｂ０、ｂ３、ｂ４、ｓ、ｔ、ｇ１、ｃ５、ｕ、ｖ、ｇ５）。２つのＡ２ｍアロタイプ：Ａ２ｍ（１）およびＡ２ｍ（２）が存在する。

抗体の構造と生成の詳細な説明としては、Ｒｏｔｈ、Ｄ．Ｂ．、ａｎｄ Ｃｒａｉｇ、Ｎ．Ｌ．、Ｃｅｌｌ、９４：４１１−４１４（１９９８）を参照されたい。この文献は、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。簡単に説明すると、重鎖と軽鎖免疫グロブリン配列をコードするＤＮＡ生成プロセスは、最初、Ｂ細胞発達段階で起こる。種々の免疫グロブリン遺伝子セグメントの再構成および連結の前に、Ｖ、Ｄ、Ｊおよび定常（Ｃ）遺伝子セグメントは、通常、１つの染色体上で相互に近接近しているのが認められる。Ｂ細胞の分化の間に、Ｖ、Ｄ、Ｊ（または軽鎖遺伝子の場合は、ＶとＪのみ）遺伝子セグメントの適切な各ファミリーメンバーの内の１つが組み換えられて、機能的に再構成された重鎖と軽鎖免疫グロブリン遺伝子の可変部を形成する。この遺伝子セグメント再構成プロセスは、逐次的であるように見える。最初、重鎖Ｄ−ｔｏ−Ｊ連結が作られ、続いて重鎖Ｖ−ｔｏ−ＤＪ連結および軽鎖Ｖ−ｔｏ−Ｊ連結が作られる。Ｖ、ＤおよびＪセグメントの再構成に加えて、軽鎖のＶおよびＪセグメントが連結される部位、および重鎖のＤおよびＪセグメントが連結される部位での可変組換えにより、免疫グロブリン重鎖および軽鎖の初期レパートリー中で、さらなる多様性が形成される。軽鎖中のこのようなバリエーションは、通常、Ｖ遺伝子セグメントの最後のコドンおよびＪセグメントの最初のコドン内で起こる。連結における同様の不正確さは、ＤおよびＪ_Ｈセグメント間の重鎖染色体上で起こり、１０ヌクレオチドもの長さを超えて延長できる。さらに、いくつかのヌクレオチドは、ゲノムＤＮＡにはコードされていないＤおよびＪ_Ｈの間ならびにＶ_ＨおよびＤ遺伝子セグメントの間に挿入可能である。これらのヌクレオチドの追加は、Ｎ領域多様性として知られる。可変部遺伝子セグメントのこのような再構成の正味の効果およびこのような連結の間に起こりうる可変組換えは、一次抗体レパートリーの作成である。

「高頻度可変性」領域という用語は、抗原結合に関与する抗体のアミノ酸残基を指す。高頻度可変性領域は、相補性決定領域またはＣＤＲ［すなわち、軽鎖可変ドメインの残基２４〜３４（Ｌ１）、５０〜５６（Ｌ２）および８９〜９７（Ｌ３）ならびに重鎖可変ドメインの３１〜３５（Ｈ１）、５０〜６５（Ｈ２）および９５〜１０２（Ｈ３）＜Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．、免疫学的な対象のタンパク質配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ）、５^ｔｈ Ｅｄ．米国国立衛生研究所、公衆衛生局（Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．（１９９１）に記載のように＞］由来のアミノ酸残基を含む。単一のＣＤＲでも抗原を認識し、結合できるが、全てのＣＤＲを含む全抗原結合部位よりも低い親和性となる。典型的な抗体では、ＣＤＲは、抗原結合および認識に関与する領域を構成する重鎖と軽鎖可変部中のフレームワーク内に埋め込まれている。可変部は、フレームワーク領域（フレームワーク領域１〜４：ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４と命名されている、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．、１９９１、前出；また、Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ、１９８７、前出、参照）内に、少なくとも３つの重鎖または軽鎖ＣＤＲを含む：上記を参照（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．、１９９１、免疫学的な対象のタンパク質配列、公衆衛生局、Ｎ．Ｉ．Ｈ．、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ；また、Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ、１９８７、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７；Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．、１９８９、Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７７−８８３も参照）。

高頻度可変性「ループ」由来の残基の代わりの定義が、Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７）により、軽鎖可変ドメインの残基２６〜３２（Ｌ１）、５０〜５２（Ｌ２）および９１〜９６（Ｌ３）ならびに重鎖可変ドメインの残基２６〜３２（Ｈ１）、５３〜５５（Ｈ２）および９６〜１０１（Ｈ３）として記載されている。

「フレームワーク」または「ＦＲ」残基は、高頻度可変性領域残基以外の可変部残基である。

「抗体断片」は、無傷完全長抗体の一部、好ましくは無傷抗体の抗原結合部または可変部の一部を含む。抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、およびＦｖ断片；ディアボディ；直鎖抗体（Ｚａｐａｔａ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．、８（１０）：１０５７−１０６２（１９９５））；単鎖抗体分子；ならびに抗体断片から形成された多選択性抗体が含まれる。

抗体のパパイン消化により、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる、それぞれ単一の抗原結合部位を有する２つの同じ抗原結合断片、および定常部を含む残りの「Ｆｃ」断片、が生成される。Ｆａｂ断片は、全可変ドメイン、ならびに軽鎖定常ドメインおよび重鎖第１定常ドメイン（ＣＨ１）を含む。Ｆｃ断片は、炭水化物を提示し、抗体のクラスを区別する多くの抗体エフェクター機能（例えば、補体および細胞受容体結合）に関与する。

ペプシン処理により、Ｆ（ａｂ’）_２断片が得られ、これは、抗体のＶＨおよびＶＬドメインを含む２つの「単鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」抗体断片を有し、これらのドメインは、単一ポリペプチド鎖として存在する。Ｆａｂ断片は、重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端への抗体ヒンジ部由来の１つまたは複数のシステイン等の少数の追加残基の包含によりＦａｂ’断片とは異なる。好ましくは、Ｆｖポリペプチドは、Ｆｖが抗原結合のための所望の構造を形成するのを可能とする、ＶＨおよびＶＬドメインの間のポリペプチドリンカーをさらに含む。ｓｃＦｖの概説は、モノクローナル抗体の薬理学（Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）、ｖｏｌ．ｌ１３、Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅｅｄｓ．、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ｐｐ．２６９−３１５（１９９４）中のＰｌｕｃｋｔｈｕｎを参照されたい。

「Ｆａｂ断片」は、１つの軽鎖ならびに１つの重鎖のＣ_Ｈ１および可変部から構成される。Ｆａｂ分子の重鎖は、別の重鎖分子とジスルフィド結合を形成できない。

「Ｆａｂ’断片」は、１つの軽鎖ならびにＶ_ＨドメインおよびＣ_Ｈ１ドメインを含む１つの重鎖の一部ならびにＣ_Ｈ１およびＣ_Ｈ２ドメインの間の領域も含み、それにより、鎖間ジスルフィド結合が２つのＦａｂ’断片の２つの重鎖の間で形成され、Ｆ（ａｂ’）_２分子が作られる。

「Ｆ（ａｂ’）_２断片」は、Ｃ_Ｈ１およびＣ_Ｈ２ドメインの間の定常部の一部を含む２つの軽鎖および２つの重鎖を含み、それにより、２つの重鎖の間に鎖間ジスルフィド結合が形成される。Ｆ（ａｂ’）_２断片は、従って、２つの重鎖間のジスルフィド結合により一緒に保持されている２つのＦａｂ’断片から構成される。

「Ｆｖ」は、完全な抗原認識部位および結合部位を含む最小抗体断片である。この領域は、堅固な非共有結合性会合による、１つの重鎖可変ドメインと１つの軽鎖可変ドメインダイマーから構成される。各可変ドメインの３つのＣＤＲが相互作用して、ＶＨ ＶＬダイマーの表面上の抗原結合部位を特定するのはこの立体配置によるものである。単一可変ドメイン（または抗原に特異的な３つのＣＤＲのみを含む半分のＦｖ）は、抗原を認識し結合する能力を有するが、全体結合部位よりも低い親和性となる。

「単鎖抗体」は、重鎖と軽鎖可変部がフレキシブルリンカーにより連結されて、抗原結合領域を形成する単一ポリペプチド鎖を形成しているＦｖ分子である。単鎖抗体は、国際公開第８８／０１６４９号ならびに米国特許第４，９４６，７７８号および同５，２６０，２０３号で詳細に考察されている。これらの開示は参照によってその全体が組み込まれる。

「単鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」抗体断片は、抗体のＶ_ＨおよびＶ_Ｌドメインを含み、これらのドメインは、単一ポリペプチド鎖中に存在し、さらに、任意選択で、Ｆｖが抗原結合のための所望の構造を形成するのを可能とするＶ_ＨとＶ_Ｌドメインの間のポリペプチドリンカーを含む（Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４２６、１９８８、およびＨｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９−５８８３、１９８８）。「Ｆｄ」断片は、Ｖ_ＨおよびＣ_Ｈ１ドメインから構成される。

「ディアボディ」という用語は、２つの抗原結合部位を有する小抗体断片を指し、この断片は、同じポリペプチド鎖（ＶＨ ＶＬ）中の軽鎖鎖可変ドメイン（ＶＬ）に連結した重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。同じ鎖上の２つのドメイン間の対形成をさせるには短すぎるリンカーを使うことにより、ドメインは、別の鎖の相補的なドメインとの対形成をせざるを得ず、２つの抗原結合部位を作る。ディアボディは、例えば、欧州特許第ＥＰ４０４、０９７号；国際公開第９３／１１１６１号；およびＨｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０：６４４４−６４４８（１９９３）で、さらに詳しく記載されている。

「ドメイン抗体」は、重鎖の可変部または軽鎖の可変部のみを含む免疫学的機能性免疫グロブリン断片である。いくつかの例では、２つ以上のＶ_Ｈ領域が、共有結合でペプチドリンカーと連結され、二価のドメイン抗体を作る。二価のドメイン抗体の２つのＶ_Ｈ領域は、同じまたは別の抗原を標的にできる。

「抗原」という用語は、選択的結合物質、例えば、抗原結合タンパク質（例えば、抗体またはその免疫学的機能性断片、を含む）により結合されうる分子または分子の一部、およびさらに、動物中で使用して、その抗原に結合できる抗体を産生できる分子または分子の一部を指す。抗原は、別の抗原結合タンパク質、例えば、抗体と相互作用可能な１つまたは複数のエピトープを持つことができる。

「エピトープ」という用語は、抗原結合タンパク質（例えば、抗体）により結合される分子の一部である。この用語は、抗原結合タンパク質、例えば、抗体に特異的に結合できるいずれかの決定因子を含む。エピトープは、近接していても、または非近接（例えば、単鎖ポリペプチドにおいて、ポリペプチド配列中で相互に近接していないが、分子としては、抗体により結合されるアミノ酸残基）であってもよい。特定の実施形態では、エピトープは、抗原結合タンパク質（例えば、抗体）の生成に使用されるエピトープに類似の３次元構造を含むにも関わらず、抗原結合タンパク質生成に使用されるエピトープ中で見出されるアミノ酸残基を含まないか、またはほんの少しのだけのアミノ酸残基を含むという意味での擬態性であってもよい。ほとんどの場合、エピトープは、タンパク質上に存在するが、ある場合には、他の種類の分子、例えば、核酸上に存在できる。エピトープ決定因子は、化学的に活性な表面分子群、例えば、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリルまたはスルホニル基を含んでもよく、また、特異的３次元特性、および／または特異的電荷特性を有していてもよい。一般に、特定の標的抗原に特異的な抗体は、タンパク質および／または高分子の複合混合物中の標的抗原上のエピトープを認識するのが好ましい。

「同一性」という用語は、配列を整列させ、比較することによって決定される、２つ以上のポリペプチド分子または２つ以上の核酸分子の配列間の関連性を指す。「同一性パーセント」は、比較される分子中のアミノ酸またはヌクレオチド間の同じ残基のパーセントを意味し、比較される分子の内の最小の大きさのものに基いてに計算される。これらの計算に対し、整列のギャップ（もしあれば）は、特定の数学的モデルまたはコンピュータプログラム（すなわち、「アルゴリズム」）によって対処されなければならない。整列核酸またはポリペプチドの同一性の計算に使用できる方法には、下記で記載のものが含まれる：コンピュータ利用分子生物学（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、（Ｌｅｓｋ、Ａ．Ｍ．、ｅｄ．）、１９８８、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ；バイオコンピューティングインフォマティクスとゲノムプロジェクト（Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ）、（Ｓｍｉｔｈ、Ｄ．Ｗ．、ｅｄ．）、１９９３、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；配列データのコンピュータ分析（Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ）、Ｐａｒｔ Ｉ、（Ｇｒｉｆｆｉｎ、Ａ．Ｍ．、ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｎ、Ｈ．Ｇ．、ｅｄｓ．）、１９９４、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ：Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ；ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ、Ｇ．、１９８７、分子生物学における配列解析（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；配列解析プライマー（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ）、（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ、Ｍ．ａｎｄ Ｄｅｖｅｒｅｕｘ、Ｊ．、ｅｄｓ．）、１９９１、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｍ．Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ；ａｎｄ Ｃａｒｉｌｌｏ ｅｔ ａｌ．、１９８８、ＳＩＡＭ Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ．４８：１０７３。例えば、配列同一性は、２つのポリペプチドのアミノ酸の位置の類似性を比較するために通常使用される標準的方法により決定できる。ＢＬＡＳＴまたはＦＡＳＴＡ等のコンピュータプログラムを使って、２つのポリペプチドまたは２つのポリヌクレオチド配列をそれらの各残基が最適に整合するよう整列させる（片方もしくは両方の配列の全長に沿って、または片方もしくは両方の配列の所定の部分に沿って）。プログラムは、開始ペナルティーおよびデフォルトギャップペナルティを提供し、スコアリング行列、例えば、ＰＡＭ２５０［標準的スコアリング行列；Ｄａｙｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ．、タンパク質配列と構造の図説（Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）、ｖｏｌ．５、ｓｕｐｐ．３（１９７８）を参照］をコンピュータプログラムと組み合わせて使用可能である。例えば、同一性パーセントは、次のように計算できる：同一マッチの合計数に１００を乗じ、次に、マッチ全長内の長い方の配列の長さと２つの配列を整列させるために長い方の配列に導入したギャップの数の合計で除算する。同一性パーセントの計算では、比較される配列は、配列間で最長マッチが得られるように整列される。

ＧＣＧプログラムパッケージは、同一性パーセントを決定するために使用できるコンピュータプログラムであり、このパッケージは、ＧＡＰ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ．、１９８４、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１２：３８７；Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を含む。コンピュータアルゴリズムＧＡＰは、配列同一性パーセントを決定すべき２つのポリペプチドまたは２つのポリヌクレオチドを整列させるために使用される。配列は、それらの各アミノ酸またはヌクレオチドが最適マッチングとなるよう整列される（アルゴリズムにより決定される「マッチスパン（ｍａｔｃｈｅｄ ｓｐａｎ）」）。ギャップオープニングペナルティ（これは、３回の平均対角として計算される。ここで「平均対角」は、使用されている比較行列の対角要素の平均である；「対角」は、特定の比較行列により各完全アミノ酸マッチに割り当てられるスコアまたは数値である）およびギャップ延長ペナルティ（これは通常、ギャップオープニングペナルティの１／１０倍である）、ならびにＰＡＭ２５０またはＢＬＯＳＵＭ６２等の比較行列が、アルゴリズムと組み合わせて使用される。特定の実施形態では、標準的比較行列（ＰＡＭ２５０比較行列に関しては、Ｄａｙｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ．、１９７８、タンパク質配列と構造の図説（Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）５：３４５−３５２；ＢＬＯＳＵＭ６２比較行列に関しては、Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ｅｔ ａｌ．、１９９２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９：１０９１５−１０９１９、を参照）も、アルゴリズムにより使用される。

ＧＡＰプログラムを使ってポリペプチドまたはヌクレオチド配列の同一性パーセントを決定するための推奨パラメータは、以下の通りである：

アルゴリズム：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．、１９７０、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３；

比較行列：ＢＬＯＳＵＭ６２；Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ｅｔ ａｌ．、１９９２、同上、による；

ギャップペナルティ：１２（しかし、エンドギャップに対してはペナルティ無し）

ギャップ長さペナルティ：４

類似性閾値: 0

２つのアミノ酸配列整列用の特定の整列スキームは、２つの配列の短い領域のみのマッチングを生ずる場合があり、この小さい整列領域は、たとえ、２つの完全長配列の間に顕著な関連性がなくても、非常に高い配列同一性を有する可能性がある。従って、選択整列方法（ＧＡＰプログラム）は、所望に応じ、標的ポリペプチドの少なくとも５０近接アミノ酸にわたる整列を生ずるように調節可能である。

「修飾」という用語は、ポリペプチドに関連して使われる場合、限定されないが、１つまたは複数のアミノ酸変化（置換、挿入または欠失を含む）；化学的修飾；治療または診断薬へのコンジュゲーションによる共有結合の改変；標識（例えば、蛍光標識、電気化学発光標識、放射性核種もしくは他の同位体標識、または種々の酵素を使った）；共有結合ポリマー連結、例えば、ペグ化（ポリエチレングリコールで誘導体化）および非天然アミノ酸の化学合成による挿入または置換、が含まれる。改変ポリペプチドは、本発明の方法で使われる非改変分子の結合特性を保持しなければならない。

「複合体化された」は、少なくとも２つの化学の成分が、直接的に、または任意選択で、それ自体両方の部分に共有結合しているペプチジルもしくは非ペプチジルリンカー部を介して、共有結合で相互に連結されるか、または結合されることを意味する。例えば、共有結合は、ペプチドもしくはタンパク質のアルファアミノ基を含むアミノ酸残基を介しても、または側鎖を介してもよい。

本発明のアッセイ方法の緩衝剤または試薬のインキュベーションに関連した「生理学的条件下」は、非共有結合反応等の生化学的反応が起こることを可能とする温度、ｐＨ、およびイオン強度の条件下のインキュベーションを意味する。典型的には、６．５〜７．５のｐＨで、温度は室温または約３７℃までの雰囲気温度である。

「ブロックされた」は、例えば、ウエル表面への非特異的結合を最小限にする目的で、反応混合物が後で添加される場合は、反応混合物成分を、アッセイ緩衝液と共にインキュベートすることを意味する。

「反応混合物」は、インキュベーションの生理学的条件下、対象の非共有結合反応等のインビトロ生化学的反応を起こさせるのに必要な全試薬と因子を含む水性混合物である。

「アビジン」は、四量体ビオチン結合タンパク質であって、鳥類、爬虫類および両生類の卵管中で天然に産生され、さらに典型的には、それらの卵の卵白中に析出しており、またはそれらの合成もしくは組換え産生型、および／または、それらからの単量体もしくは多量体（例えば、二量体、三量体、等）型である。その四量体のグリコシル化型では、アビジンは、６６〜６９ｋＤａの大きさであると推定され、４分子までのビオチンに、同時に、高度の親和性と特異性で結合できる（Ｋｏｒｐｅｌａ、Ｊ．、アビジン、生物学的研究のツールおよび対象としての高親和性ビオチン結合タンパク質（Ａｖｉｄｉｎ、ａ ｈｉｇｈ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｂｉｏｔｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓ ａ ｔｏｏｌ ａｎｄ ｓｕｂｊｅｃｔ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｒｅｓｅａｒｃｈ）．Ｍｅｄ．Ｂｉｏ．６２：５−２６（１９８４））。本発明の目的に対しては、アビジンがビオチンに対し高親和性を維持している限り（解離平衡定数Ｋ_Ｄ：１０^−１４Ｍ〜１０^−１６Ｍのオーダー）、「アビジン」は、グリコシル化、脱グリコシル化もしくは非グリコシル化、誘導体化、または修飾できる。ニュートラアビジン（ｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎ）（またはニュートラアビジン（ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ））およびストレプトアビジンは、「アビジン」の意味合いの中に含まれる。「ストレプトアビジン」は、５２，８００Ｄａの四量体ビオチン結合タンパク質として細菌Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｉｄｉｎｉｉから天然に産出され、その精製または合成もしくは組換えによる産生バージョン、および／またはその単量体もしくは多量体（例えば、二量体、三量体等）型を含む。組換え操作された一価または多価型のアビジン（またはストレプトアビジン）は、また、「アビジン」に含まれる（例えば、Ｌａｉｔｉｎｅｎ ｅｔ ａｌ．．遺伝子改変アビジンおよびストレプトアビジン（Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ａｖｉｄｉｎｓ ａｎｄ ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎｓ）、Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．６３（２４）：２９９２‐３０１７７（２００６）；Ｈｏｗａｒｔｈ ｅｔ ａｌ．、単一フェムトモルビオチン結合部位を有する一価ストレプトアビジン（Ａ ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ ｗｉｔｈ ａ ｓｉｎｇｌｅ ｆｅｍｔｏｍｏｌａｒ ｂｉｏｔｉｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ）、Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ３（４）：２６７−７３（２００６））。「アビジンコート」は、固体表面、例えば、ポリスチレンプレートのウエル表面が、アビジン部と複合体化され、それでも、アビジン部が、生理学的条件下、高親和性、例えば、１０^−１４Ｍ〜１０^−１６Ｍのオーダーの解離平衡定数Ｋ_Ｄでビオチンと非共有結合できることを意味する。本発明のインビトロでアッセイでのアビジンコートウエルの一部の実施形態では、採用されるアビジンは、ストレプトアビジンまたはニュートラアビジンである。

「ウエル」は、蓋ができる開口部を通して注入可能な容器で、水性液体を含む。例えば、マイクロタイタープレート（例えば、９６−または３８４−ウエルマイクロタイタープレート）のそれぞれの区画は、「ウエル」である；単一区画容器、例えば、培養プレート、ペトリ皿、試験管、コニカルチューブ、またはくぼみスライドのくぼみも「ウエル」である。ウエルの開口部は、蓋がなくても、別々に個別の蓋でカバーしても、または、まとめて１つの取り外し可能な蓋でカバーしてもよい。

「ビオチン」は、水に可溶なＢ−複合体ビタミン、すなわち、ビタミンＢ７であり、テトラヒドロチオフェン環と縮合したウレイド（テトラヒドロイミジザロン）環から構成される（式Ｉ参照）。

吉草酸置換基がテトラヒドロチオフェン環の炭素原子の１つに結合している。自然においていは、ビオチンは、脂肪酸とロイシンの代謝におけるコエンザイムであり、インビボで糖新生の役割を果たしている。ビオチンは、四量体タンパク質アビジン（例えば、ニワトリアビジン、細菌性ストレプトアビジン、およびニュートラアビジン）と、１０^−１４Ｍ〜１０^−１６Ｍ台の解離平衡定数Ｋ_Ｄで非常に堅固に結合する。これは、知られている中で最強のタンパク質リガンド相互作用の１つであり、共有結合の強度に近い（Ｌａｉｔｉｎｅｎ ｅｔ ａｌ．遺伝子改変アビジンおよびストレプトアビジン（Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ａｖｉｄｉｎｓ ａｎｄ ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎｓ）、Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．６３（２４）：２９９２‐３０１７７（２００６））。ビオチン−アビジン非共有結合相互作用は、種々の生物工学的用途に使用されることが多い（Ｌａｉｔｉｎｅｎ ｅｔ ａｌ．、遺伝子改変アビジンおよびストレプトアビジン（Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ａｖｉｄｉｎｓ ａｎｄ ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎｓ）、Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．６３（２４）：２９９２‐３０１７７（２００６））。

「ビオチン化」は、物質が１つまたは複数のビオチン部に複合体化されることを意味する。本発明の実施に有用なビオチン化されたペプチドは、市販品として購入可能（例えば、Ｍｉｄｗｅｓｔ Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈ Ｉｎｃ．）であるか、または、容易に合成、ビオチン化できる。化合物、例えば、ペプチド、のビオチン化は、いずれかの既知の化学技術により行うことができる。これらには、一級アミンビオチン化、スルフヒドリルビオチン化、およびカルボキシルビオチン化が含まれる。例えば、ペプチド上のリシン側鎖εアミンおよびＮ末端αアミンとして存在するアミン基は、一級アミンビオチン化のための一般的な標的である。アミン反応性ビオチン化試薬は、水溶性に基づき２つのグループに分けることができる。
１）ビオチンのＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステルは、水溶液中の溶解度が低い。水溶液中での反応のためには、有機溶媒に溶解する必要があり、その後、希釈して水性の反応混合物とする。この目的で最もよく使われる有機溶剤は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）およびジメチルフォルムアミド（ＤＭＦ）であり、これらは、大抵のタンパク質と低濃度で適合性がある。
２）ビオチンのスルフォＮＨＳエステルは、水に対しより大きな可溶性があるが、容易に加水分解するので、使用の直前に水に溶解される。スルフォＮＨＳエステルの水への溶解度は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド環上のスルホン酸基に由来し、この試薬を有機溶媒に溶解する必要性を取り除く。
ＮＨＳおよびスルフォＮＨＳエステルの化学反応は、基本的には同じである：アミド結合が形成され、ＮＨＳまたはスルフォＮＨＳが脱離基となる。エステルの標的は脱プロトン化一級アミンであるため、反応は、ｐＨ７超で行われるのが普通である。ＮＨＳエステルの加水分解が主要競合反応であり、ｐＨの上昇につれ、加水分解速度が大きくなる。ＮＨＳおよびスルフォＮＨＳエステルは、ｐＨ７で数時間の半減期があるが、ｐＨ９では数分に過ぎない。ＮＨＳエステルをペプチドの一級アミンに複合体化する条件には、４〜３７℃のインキュベーション温度、７〜９の反応ｐＨ値、および数分〜約１２時間のインキュベーション時間が含まれる。アミン（例えば、トリスまたはグリシン）含有緩衝液は、避けなければならない。理由は、それらが反応で競合するからである。ＨＡＢＡ染料（２−（４−ヒドロキシアゾベンゼン）安息香酸）法を使って、ビオチン化度を測定することができる。簡単に説明すると、ＨＡＢＡ染料がアビジンに結合され、特徴的吸光度が得られる。ビオチン化されたタンパク質または他の分子の形で、ビオチンが導入されると、それが染料を置換し、５００ｎｍの吸光度の変化を生じる。吸光度の変化は、直接的に試料中のビオチンの量に比例する。

「ＦＣγＲＩＩＩａ」（「ＣＤ１６ａ」または「ＦＣＧＲ３」または「ＩＧＦＲ３」としても知られる。本明細書では、これらの名称は同義に使用される）は、免疫グロブリンＧ Ｆｃ受容体ＩＩＩを意味する。ヒトＣＤ１６ａ（ジェンバンク受入番号ＡＡＨ１７８６５）は、下記のアミノ酸配列を含む：
1 mwqlllptal lllvsagmrt edlpkavvfl epqwyrvlek dsvtlkcqga yspednstqw
61 fhneslissq assyfidaat vddsgeyrcq tnlstlsdpv qlevhigwll lqaprwvfke
121 edpihlrchs wkntalhkvt ylqngkgrky fhhnsdfyip katlkdsgsy fcrglvgskn
181 vssetvniti tqglavstis sffppgyqvs fclvmvllfa vdtglyfsvk tnirsstrdw
241 kdhkfkwrkd pqdk// 配列番号11.
しかし、ＣＤ１６ａの多型配列も、「ＣＤ１６ａ」という用語に含まれる。このような多型には、１７６Ｖ（高結合型）および１７６Ｆ（低結合型）が含まれる。ＣＤ１６ａの２５４アミノ酸残基配列（配列番号１１）には、１６残基シグナル配列；１９１残基細胞外のドメイン（ＥＣＤ）；ならびに２２残基膜貫通ドメインおよび２５残基Ｃ末端細胞質ドメインが含まれる。「組換え型ヒトＣＤ１６ａポリペプチド」は、組換ＤＮＡ技術により産生された可溶性の配列番号１１の断片（またはその多形性変異体）である。このような可溶性断片の例は、配列番号１１の推定上のＥＣＤを含むＧ１７−Ｑ２０８断片である：
17 gmrt edlpkavvfl epqwyrvlek dsvtlkcqga yspednstqw
61 fhneslissq assyfidaat vddsgeyrcq tnlstlsdpv qlevhigwll lqaprwvfke
121 edpihlrchs wkntalhkvt ylqngkgrky fhhnsdfyip katlkdsgsy fcrglvgskn
181 vssetvniti tqglavstis sffppgyq//配列番号12。
「組換え型ヒトＣＤ１６ａポリペプチド」の他の実施形態には、５０ｎＭ未満の推定Ｋ_ＤでヒトＩｇＧに結合する能力を維持している配列番号１２のさらに短い断片が含まれる。

「ポリヒスチジンタグ付き」は、組換え型ヒトＣＤ１６ａポリペプチドが、合成技術（例えば、Ｐｅｔｅｒｓｏｎ、米国特許第５，８４０，８３４号、アミノ酸配列およびイムノアッセイに有用な新規組成物を連結する技術（Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｆｏｒ ｊｏｉｎｉｎｇ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ａｎｄ ｎｏｖｅｌ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｕｓｅｆｕｌ ｉｎ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ））、または組換ＤＮＡ技術によって、少なくとも５つ、通常は、６（「ヘキサヒスチジンタグ」または「６ｘＨｉｓタグ」）〜１８の近接ヒスチジン残基を含む組換え型ヒトＣＤ１６ａポリペプチドのＮ末端またはＣ末端延長部として複合体化されていることを意味する。ポリヒスチジンタグ組換え型ヒトＣＤ１６ａポリペプチドは、市販もされている（例えば、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ カタログ＃４３２５−ＦＣ）。特異的にポリヒスチジンに結合する抗体およびそれらの作成方法は当技術分野でよく知られており、このような抗体は市販されている（例えば、Ｚｅｎｔｇｒａｆ ｅｔ ａｌ．、ヒスチジン部を含む融合ポリペプチドに対し活性な抗体（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｃｔｉｖｅ ａｇａｉｎｓｔ ａ ｆｕｓｉｏｎ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ ａ ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ ｐｏｒｔｉｏｎ）、米国特許第６，７９０，９４０号および同７，７１３，７１２号；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ 製品＃Ｈ１０２９；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ カタログ＃ＭＡＢ０５０）。本発明のインビトロアッセイ方法の一部の実施形態では、特異的にポリヒスチジンに結合する抗体、または他の実施形態では、特異的にポリヒスチジンに結合する抗体に特異的に結合する抗体は、抗体に複合体化されたシグナル生成標識、例えば、限定されないが、蛍光標識、同位体標識、電気化学発光標識、または分光光度、比色、蛍光定量、発行定量または他の装置（例えば、西洋わさびペルオキシダーゼ、ベータガラクトシダーゼ、またはルシフェラーゼベース検出システム）により基質を容易に検出される反応物に変化させる反応を触媒できる酵素をさらに含む。

「電気化学発光」（ＥＣＬ）、または同義の「電気化学発光（ｅｌｅｃｔｒｏｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）」は、溶液中の電気化学反応の間に生成される発光の一種である。ＥＣＬでは、電気化学的に生成される中間体が、高エネルギー発生反応を起こし、電子的に励起された状態を作り出し、次にこれが発光する（Ｆｏｒｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｅｌｅｃｔｒｏｇｅｎｅｒａｔｅｄ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ、分析化学年次概況（Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）２：３５９−３８５（２００９））。ＥＣＬ励起は、電気発生種のエネルギー電子遷移（レドックス）反応により生ずる。これらの電子遷移反応は、充分にエネルギー発生性であり、光励起無しで、多環式芳香族炭化水素および金属錯体を含む発光団の励起状態の生成を可能にする。例えば、トリプロピルアミンの存在下の［Ｒｕ（ｂｐｙ）_３］^２＋の酸化は、光励起により生成される発光と類似の発光を生ずる。このようなルテニウム錯体は、本発明の目的のための化学発光標識として有効に採用できる。例えば、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ；Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）のＳｕｌｆｏ−Ｔａｇ（登録商標）ＥＣＬ検出システムは、ルテニウム錯体を含む電気化学発光標識に依拠している。Ｓｕｌｆｏ−Ｔａｇ（登録商標）システムでは、下記の化学構造（ＩＩ）を有する活性化Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルが使われて標識を形成する：

メーカーの指示（ＭＳＤ Ｓｕｌｆｏ−Ｔａｇ（登録商標）ＮＨＳエステル、１７７９４−ｖ２−２００８Ｍａｙ、（２００８））に従って、活性化Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルが標識するために抗体等のポリペプチドと反応される。前に記載のように、ＮＨＳおよびスルフォＮＨＳエステルの化学反応は、基本的には同じであり：アミド結合が形成され、ＮＨＳまたはスルフォＮＨＳは脱離基になる。エステルの標的は脱プロトン一級アミンであるため、反応はｐＨ７超で行われるのが普通である。ＮＨＳエステルをペプチドの一級アミンに複合体化する条件には、４〜３７℃のインキュベーション温度、７〜９の反応ｐＨ値、および数分〜約１２時間のインキュベーション時間が含まれる。アミン含有緩衝液（例えば、トリスまたはグリシン）は避けなければならない。理由は、それ等が、反応と競合するからである。標識反応の標識ポリペプチド産物は、下記式（ＩＩＩ）を有するルテニウム錯体を含む電気化学発光標識を含み、カルボニル基から引かれた線は残りの分子への結合を示す：

本発明のインビトロでアッセイ法の一部の実施形態では、プレインキュベート反応混合物は、中和抗体の存在に関し試験をされる血清試料をさらに含む。「中和抗体」（ＮＡｂ）は、インビボでまたは試料によりインビトロで、対象抗原、例えば、ＩｇＧ標的抗体、の血清力価を、特異的にそれに結合することにより低減できる抗体である。インビボで、ＮＡｂは、治療分子の活性部位内にあるエピトープに直接結合するか、または活性部位に最近接しているエピトープに結合することに起因する立体障害によりその活性部位を遮断することにより、治療分子の生物活性を遮断する。ある場合には、ＮＡｂの存在が、臨床的効果に繋がらないことがある一方で、他の場合では、充分な量のＮＡｂで、効力の減少が観察され、類似の効力を得るためには、より高い用量の製剤投与が必要なことがありうる（例えば、Ｇｕｐｔａ ｅｔ ａｌ．、生物学的治療薬に対する誘発された中和抗体応答の検出に使用される細胞ベースアッセイの設計、最適化、および適格性のための勧告（Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｓｉｇｎ、ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ、ａｎｄ ｑｕａｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｅｌｌ−ｂａｓｅｄ ａｓｓａｙｓ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｅｌｉｃｉｔｅｄ ｔｏ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ３２１（１−２）：１‐１８（２００７）参照）。

他の場合では、効力の減少が観察され得、類似の効力を得るためには、より高い用量の製剤投与が必要なことがありうる。

対象の「標的タンパク質」は、任意のタンパク質、例えば、限定されないが、抗体の特異的標的として、科学、医学、臨床、または治療の対象であるヒトタンパク質である。対象標的タンパク質の一例は、ケモカイン受容体タイプ４（ＣＣＲ４）である。ヒトＣＣＲ４のアミノ酸配列は、以下の通りである（ジェンバンク受入番号Ｐ５１６７９）：
1 mnptdiadtt ldesiysnyy lyesipkpct kegikafgel flpplyslvf vfgllgnsvv
61 vlvlfkykrl rsmtdvylln laisdllfvf slpfwgyyaa dqwvfglglc kmiswmylvg
121 fysgiffvml msidrylaiv havfslrart ltygvitsla twsvavfasl pgflfstcyt
181 ernhtycktk yslnsttwkv lssleinilg lviplgimlf cysmiirtlq hcknekknka
241 vkmifavvvl flgfwtpyni vlfletlvel evlqdctfer yldyaiqate tlafvhccln
301 piiyfflgek frkyilqlfk tcrglfvlcq ycgllqiysa dtpsssytqs tmdhdlhdal // 配列番号１。
対象標的タンパク質の別の例は、Ｂリンパ球抗原ＣＤ２０である。ヒトＣＤ２０のアミノ酸配列配下の通りである（ジェンバンク受入番号ＮＰ＿６９０６０５）：
1 mttprnsvng tfpaepmkgp iamqsgpkpl frrmsslvgp tqsffmresk tlgavqimng
61 lfhialggll mipagiyapi cvtvwyplwg gimyiisgsl laateknsrk clvkgkmimn
121 slslfaaisg milsimdiln ikishflkme slnfirahtp yiniyncepa npseknspst
181 qycysiqslf lgilsvmlif affqelviag ivenewkrtc srpksnivll saeekkeqti
241 keevvglt etssqpknee dieiipiqee eeeetetnfp eppqdqessp iendssp// 配列番号２。

対象標的タンパク質の別の例は、ＨＥＲ２である。ヒトＨＥＲ２（癌遺伝子ＥＲＢＢ２、チロシンプロテインキナーゼｅｒｂＢ−２、癌遺伝子ＮＧＬ、ＮＥＵ、またはＴＫＲ１とてしても知られる）のアミノ酸配列は以下の通りである（ジェンバンク受入番号Ｐ０４６２６）：
1 melaalcrwg lllallppga astqvctgtd mklrlpaspe thldmlrhly qgcqvvqgnl
61 eltylptnas lsflqdiqev qgyvliahnq vrqvplqrlr ivrgtqlfed nyalavldng
121 dplnnttpvt gaspgglrel qlrslteilk ggvliqrnpq lcyqdtilwk difhknnqla
181 ltlidtnrsr achpcspmck gsrcwgesse dcqsltrtvc aggcarckgp lptdccheqc
241 aagctgpkhs dclaclhfnh sgicelhcpa lvtyntdtfe smpnpegryt fgascvtacp
301 ynylstdvgs ctlvcplhnq evtaedgtqr cekcskpcar vcyglgmehl revravtsan
361 iqefagckki fgslaflpes fdgdpasnta plqpeqlqvf etleeitgyl yisawpdslp
421 dlsvfqnlqv irgrilhnga ysltlqglgi swlglrslre lgsglalihh nthlcfvhtv
481 pwdqlfrnph qallhtanrp edecvgegla chqlcarghc wgpgptqcvn csqflrgqec
541 veecrvlqgl preyvnarhc lpchpecqpq ngsvtcfgpe adqcvacahy kdppfcvarc
601 psgvkpdlsy mpiwkfpdee gacqpcpinc thscvdlddk gcpaeqrasp ltsiisavvg
661 illvvvlgvv fgilikrrqq kirkytmrrl lqetelvepl tpsgampnqa qmrilketel
721 rkvkvlgsga fgtvykgiwi pdgenvkipv aikvlrents pkankeilde ayvmagvgsp
781 yvsrllgicl tstvqlvtql mpygclldhv renrgrlgsq dllnwcmqia kgmsyledvr
841 lvhrdlaarn vlvkspnhvk itdfglarll dideteyhad ggkvpikwma lesilrrrft
901 hqsdvwsygv tvwelmtfga kpydgipare ipdllekger lpqppictid vymimvkcwm
961 idsecrprfr elvsefsrma rdpqrfvviq nedlgpaspl dstfyrslle dddmgdlvda
1021 eeylvpqqgf fcpdpapgag gmvhhrhrss strsgggdlt lglepseeea prsplapseg
1081 agsdvfdgdl gmgaakglqs lpthdpsplq rysedptvpl psetdgyvap ltcspqpeyv
1141 nqpdvrpqpp spregplpaa rpagatlerp ktlspgkngv vkdvfafgga venpeyltpq
1201 ggaapqphpp pafspafdnl yywdqdpper gappstfkgt ptaenpeylg ldvpv// 配列番号１３。

「ポリペプチド部」は、標的タンパク質の抗原性のペプチジル部を含む対象標的タンパク質のサブセットである。一般的には、このような「ポリペプチド部」は、少なくとも５〜６近接アミノ酸残基を含み、全体対象タンパク質の大きさであってもよい。さらに一般的には、「ポリペプチド部」は、１０〜４０アミノ酸残基長さである。「ポリペプチド部」は、標的抗原結合タンパク質またはＩｇＧ標的抗体の少なくとも１つのＣＤＲ、または別の実施形態では、少なくとも２つのＣＤＲ、またはさらに別の実施形態では、少なくとも３つのＣＤＲ、が特異的に結合する標的タンパク質のアミノ酸残基を含む。

「標的抗原結合タンパク質」は、対象標的タンパク質のポリペプチド部に特異的に結合する抗原結合タンパク質であり、また、ＣＤ１６ａ結合部位を有するＦｃドメインを含む。ＩｇＧ標的抗体は、「標的抗原結合タンパク質」の一例である。

「ＩｇＧ標的抗体」は、対象標的タンパク質のポリペプチド部に特異的に結合する抗体であり、また、ＣＤ１６ａ結合部位を有するＦｃドメインを含む。

抗体の産生
ポリクローナル抗体。ポリクローナル抗体は、当該抗原およびアジュバントの複数の皮下（ｓｃ）または腹腔内（ｉｐ）注射により動物中で産生させるのが好ましい。あるいは、抗原を動物のリンパ節に直接注射してもよい（Ｋｉｌｐａｔｒｉｃｋ ｅｔ ａｌ．、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ、１６：３８１−３８９、１９９７、参照）。改善された抗体応答は、当該抗原を、免疫される種中で免疫原性であるタンパク質、例えば、スカシ貝ヘモシアニン、血清アルブミン、ウシチログロブリン、または大豆トリプシン阻害剤に、二官能性または誘導体化薬剤、例えば、マレイミドベンゾイル・スルホスクシンイミドエステル（システイン残基を介したコンジュゲーション）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（リジン残基を介したコンジュゲーション）、グルタルアルデヒド、コハク酸無水物または当技術分野で既知の他の薬剤を使って、複合体化することにより得ることができる。

動物は、抗原、免疫原性複合体、または誘導体に対し、例えば、１００μｇのタンパク質または複合体（マウス用）を３倍量のフロイント完全アジュバントと混ぜ合わせ、その溶液を皮内の複数の部位に注射することにより免疫される。１ヶ月後、動物に、フロイント完全アジュバント中の最初の量の１／５〜１／１０のペプチドまたは複合体を複数の部位で皮下注射することにより、追加免疫する。追加免疫注射後７〜１４日目に、動物から採血し、血清の抗体力価のアッセイを行う。力価がプラトーになるまで動物に追加免疫を行う。動物に、同じ抗原であるが、異なるタンパク質との複合体で、および／または異なる架橋結合試薬による複合体で、追加免疫をするのが好ましい。複合体は、また、タンパク質融合体として組換え型細胞培養で作成することもできる。また、免疫応答を強化するために、ミョウバン等の凝集剤も適切に使用される。

モノクローナル抗体。モノクローナル抗体は、当技術分野で既知の任意の技術を使って、例えば、免疫化スケジュールの完了後、遺伝子導入動物から採取した不死化脾臓細胞により、産生可能である。脾臓細胞は、当技術分野で既知の任意の技術を使って、例えば、骨髄腫細胞と融合させ、ハイブリドーマを産生することにより不死化できる。例えば、モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５（１９７５）で最初にＫｏｈｌｅｒ等により記載されたハイブリドーマ法を使って、または、通常、軽鎖と重鎖の等モル産生を促進する「ｓｐｌｉｔ ＤＨＦＲ」法、等の方法を含む、組換えＤＮＡ法（例えば、Ｃａｂｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ．、免疫グロブリン、ベクターおよび形質転換宿主細胞を産生する方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ、ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｈｏｓｔ ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ ｕｓｅ ｔｈｅｒｅｉｎ）、米国特許第６，３３１，４１５号、参照）により、任意選択で、抗体をグリコシル化できる哺乳動物細胞株（例えば、ＣＨＯ細胞）を使って（例えば、Ｐａｇｅ、抗体産生（Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）、欧州特許第ＥＰ０４８１７９０Ａ２号および米国特許第５，５４５，４０３号、参照）、作ることができる。

ハイブリドーマ法では、マウスまたは他の適切な宿主哺乳動物、例えば、ラット、ハムスターまたはマカクザルが、本明細書に記載のように、免疫され、免疫化に使われたタンパク質に特異的に結合する抗体を産生する、または産生できるリンパ球を誘発する。あるいは、リンパ球が、インビトロで免疫されうる。リンパ球は、次いで、適切な融合剤、例えば、ポリエチレングリコールを使って骨髄腫細胞と融合して、ハイブリドーマ細胞を形成する（Ｇｏｄｉｎｇ、モノクローナル抗体：原理と実際（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ）、ｐｐ．５９−１０３（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９８６））。

一旦調製されると、ハイブリドーマ細胞は、適切な培地中で播種、成長させることができる。培地は、非融合、親骨髄腫細胞の増殖または生存を抑制する１つまたは複数の物質を含むことが好ましい。例えば、親骨髄腫細胞が、酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠いている場合は、ハイブリドーマ用の培地は、通常、ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジンを含み（ＨＡＴ培地）、この物質がＨＧＰＲＴ欠乏細胞の増殖を防ぐ。

好ましい骨髄腫細胞は、効率的に融合し、選択抗体産生細胞による安定な高レベル抗体産生を支援し、培地に敏感である細胞である。ヒト骨髄腫およびマウスヒトヘテロミエローマ細胞株は、また、ヒトモノクローナル抗体産生用として記載されている（Ｋｏｚｂｏｒ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３３：３００１（１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒ ｅｔ ａｌ．、モノクローナル抗体産生技術と応用（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）、ｐｐ．５１−６３（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ、Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８７））。ハイブリドーマ産生融合方法で使用のための骨髄腫細胞は、非抗体産生であり、高融合効率を有し、所望の融合細胞（ハイブリドーマ）のみの増殖を支援する特定の選択培地中での増殖を不可能にする酵素欠損を有しているのが好ましい。マウス融合体での使用に適切な細胞株の例には、Ｓｐ−２０、Ｐ３−Ｘ６３／Ａｇ８、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８．６５３、ＮＳ１／１．Ａｇ４１、Ｓｐ２１０−Ａｇ１４、ＦＯ、ＮＳＯ／Ｕ、ＭＰＣ−１１、ＭＰＣ１１−Ｘ４５−ＧＴＧ１．７およびＳ１９４／５ＸＸＯ Ｂｕｌが含まれる；ラット融合体に使われる細胞株の例には、Ｒ２１０．ＲＣＹ３、Ｙ３−Ａｇ１．２．３、ＩＲ９８３Ｆおよび４Ｂ２１０が含まれる。細胞融合体用に有用な他の細胞株は、Ｕ−２６６、ＧＭ１５００−ＧＲＧ２、ＬＩＣＲ−ＬＯＮ−ＨＭｙ２およびＵＣ７２９−６である。

抗原に対するモノクローナル抗体の産生に関し、ハイブリドーマ細胞が増殖中の培地がアッセイされる。ハイブリドーマ細胞により産生されたモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降またはインビトロ結合アッセイ、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）または酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）によって測定されるのが好ましい。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）またはスキャチャード解析により測定できる（Ｍｕｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１０７：２２０（１９８０）；Ｆｉｓｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．、ペプチド−免疫グロブリンコンジュゲート（Ａ ｐｅｐｔｉｄｅ−ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）、国際公開第２００７／０４５４６３Ａ１号の実施例１０（この特許は、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる））。

所望の特異性、親和性、および／または活性、の抗体を産生するハイブリドーマ細胞が特定された後で、クローンは、限界希釈方法によりサブクローニングおよび標準的方法により増殖できる（Ｇｏｄｉｎｇ、モノクローナル抗体：原理と実際（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ）、ｐｐ．５９−１０３（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９８６））。この目的に適する培地には、例えば、Ｄ−ＭＥＭまたはＲＰＭＩ−１６４０培地が含まれる。さらに、ハイブリドーマ細胞は、動物中で腹水腫瘍として、インビボ増殖可能である。

ハイブリドーマまたはｍＡｂは、特定の特性、例えば、特定の抗原または標的との結合親和性を有するｍＡｂを特定するために、さらなる選別が可能である。サブクローンにより分泌されたモノクローナル抗体は、従来の免疫グロブリン精製手法、例えば、タンパク質Ａセファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動法、透析、親和性クロマトグラフィー、またはいずれかの他の適切な当技術分野で既知の精製技術により、培地、腹水、または血清から適宜分離される。

抗体および他のポリペプチドの組換え産生。本発明は、ポリペプチド、融合ペプチド、または抗原結合タンパク質、例えば、本明細書記載の発明の抗体断片を含む抗体（ポリクローナルおよびモノクローナル）のいずれかをコードする単離核酸を提供し、任意選択で、この核酸は、宿主細胞、ベクターおよび核酸を含む宿主細胞により認識される制御配列に機能的に連結されている。さらに本発明は、宿主細胞を培養し、それにより、核酸が発現すること、および、任意選択で、宿主細胞培養または培地から抗体を回収することを含んでもよい抗体産生用組換え技術を提供する。類似の物質および方法は、他のポリペプチドの産生にも適用できる。

対象の免疫グロブリンまたはポリペプチド由来の関連アミノ酸配列は、直接タンパク質シーケンシングにより決定でき、適切なコーディングヌクレオチド配列は、ユニバーサルコドン表に従って設計できる。あるいは、モノクローナル抗体をコードするゲノムまたはｃＤＮＡを単離し、このような抗体を産生する細胞から、従来の方法を使って（例えば、モノクローナル抗体の重鎖と軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを使って）配列決定できる。

ＤＮＡクローニングは、標準的な方法を使って行われる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９）分子クローニング：実験ガイド（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｇｕｉｄｅ）、Ｖｏｌｓ１−３、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、を参照。本文献は、参照により本明細書に組み込まれる）。例えば、ｃＤＮＡライブラリーを、ｐｏｌｙＡ＋ ｍＲＮＡ、好ましくは膜結合性ｍＲＮＡの逆転写により構築でき、ライブラリーをヒト免疫グロブリンポリペプチド遺伝子配列に特異的プローブを使って選別できる。一実施形態では、しかし、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使って、対象の免疫グロブリン遺伝子セグメント（例えば、軽鎖または重鎖可変セグメント）をコードするｃＤＮＡ（または完全長ｃＤＮＡの一部）を増幅する。増幅された配列は、任意の適切なベクター、例えば、発現ベクター、ミニ遺伝子ベクター、またはファージディスプレイベクターに容易に挿入できる。対象免疫グロブリンポリペプチドの一部の配列を決定することが可能である限り、使用した特定のクローニング方法は、重要ではないことは理解されよう。

抗体核酸の源の１つは、対象抗原で免疫した動物由来のＢ細胞を得て、不死細胞に融合することにより産生されるハイブリドーマである。あるいは、核酸は、免疫動物のＢ細胞（または全脾臓）から単離できる。さらに抗体をコードする核酸の別の源は、例えば、ファージディスプレイ技術により生成される核酸のライブラリーである。対象ペプチド、例えば、所望の結合特性を有する可変部ペプチドをコードするポリヌクレオチドは、パニング等の標準的な方法により特定できる。

免疫グロブリンポリペプチドの全可変部をコードする配列を決定可能であるが、しかし、可変部の一部のみ、例えば、ＣＤＲをコードする部分を配列決定することで十分な場合もある。配列決定は、標準的な方法を使って行われる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９）分子クローニング：実験ガイド（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｇｕｉｄｅ）、Ｖｏｌｓ１−３、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、およびＳａｎｇｅｒ、Ｆ．ｅｔ ａｌ．（１９７７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７４：５４６３−５４６７を参照（これらの文献は参照により本明細書に組み込まれる））。クローン化核酸の配列をヒト免疫グロブリン遺伝子およびｃＤＮＡの掲載された配列と比較することにより、当業者なら、配列決定される領域に応じて、（ｉ）ハイブリドーマ免疫グロブリンポリペプチド（重鎖アイソタイプを含む）の生殖系列セグメントの使用頻度、および（ｉｉ）Ｎ領域付加および体細胞変異プロセス由来の配列を含む、重鎖と軽鎖可変部の配列、を容易に決定できるであろう。免疫グロブリン遺伝子配列情報ソースの１つは、米国国立衛生研究所、国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ, Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄである。

単離ＤＮＡは、制御配列に機能的に連結、または発現ベクター中に挿入でき、次いで、他の方法は免疫グロブリンタンパク質を産生しない宿主細胞に形質移入され、組換え型宿主細胞中でモノクローナル抗体の合成を指令する。抗体の組換え産生は、当技術分野でよく知られている。

別の核酸配列と機能的関連性がある場合、核酸は、機能的に連結されている。例えば、プレ配列または分泌リーダーのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌物中に析出するタンパク質前駆体として発現される場合、ポリペプチドに対するＤＮＡに機能的に連結されている；プロモーターまたはエンハンサーは、配列の転写に影響する場合、コード配列に機能的に連結されている。または、リボソーム結合部位は、翻訳を促進するような位置に置かれている場合、コード配列に機能的に連結されている。通常、機能的に連結されることは、連結されるＤＮＡ配列が近接しており、分泌リーダーの場合には、近接かつ読み枠にあることを意味する。しかし、エンハンサーは、近接している必要はない。連結は、都合のよい制限酵素部位での連結反応により行われる。このような部位が存在しない場合は、従来の手法に従い、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーが使用される。

多くのベクターが当技術分野で知られている。ベクター成分には、１つまたは複数の以下のものを含んでもよい：シグナル配列（例えば、抗体の分泌を指示することができる；例えば、ＡＴＧＧＡＣＡＴＧＡＧＧＧＴＧＣＣＣＧＣＴＣＡＧＣＴＣＣＴＧＧＧＧＣＴＣＣＴＧＣＴＧＣＴＧＴＧＧＣＴＧＡＧＡＧＧＴＧＣＧＣＧＣＴＧＴ／／配列番号９、これはＶＫ−１シグナルペプチド配列ＭＤＭＲＶＰＡＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＲＧＡＲＣ／／配列番号１０、をコードする）、複製起点、１つまたは複数の選択マーカー遺伝子（例えば、抗生物質または他の薬剤耐性、補体栄養要求欠損を付与、または培地中に存在しない重要な栄養素を供給できる）、エンハンサー配列、プロモーター、および転写終止配列（これら全ては、当技術分野でよく知られている）。

細胞、細胞株、および細胞培養は、同義に使用されることが多く、本明細書のこれらの全ての名称は、子孫を含む。形質転換体および形質転換細胞は、初代対象細胞および継代の数にかかわらずそれら由来の培養物を含む。また、全ての子孫は、故意の、または故意でない変異に起因して、ＤＮＡ内容が正確に同じではない可能性があることも理解されよう。元の形質転換細胞で選別されたものと同じ機能または生物活性を有する変異体子孫が含まれる。

代表的宿主細胞には、原核生物、酵母、または高等真核生物細胞が含まれる。原核生物宿主細胞には、グラム陰性またはグラム陽性菌等の真正細菌、例えば、大腸菌類等の腸内細菌科、例えば、大腸菌、エンテロバクター属、エルウィニア属、クレブシエラ属、プロテウス属、サルモネラ属、例えば、ネズミチフス菌、セラチア属、例えば、セラチア菌、および赤痢菌属、ならびに枯草菌およびバチルスリケニホルミス、シュードモナス、およびストレプトマイセス等のバチルス属、が含まれる。真核生物微生物、例えば、糸状菌または酵母菌は、クローニングまたは組換え型ポリペプチドまたは抗体用の適切な発現宿主である。出芽酵母、すなわち通常のパン酵母は、低級真核生物宿主微生物の中で最もよく使われる。しかし、下に示すいくつかの他の属、種、および菌株が一般的に入手可能であり、本明細書で有用である：ピキア属、例えば、Ｐ．パストリス、分裂酵母；クリベロマイセス属、ヤロウイア属；カンジダ属；トリコデルマ・リージア；アカパンカビ；シュワニオミセス属、例えば、シュワニオミセスオキシデンタリス；および糸状菌類、例えば、パンカビ、アオカビ類、トリポクラジウム、ならびにアスペルギルス属宿主、例えば、偽巣性コウジ菌およびクロコウジカビ。

グリコシル化抗体の発現用宿主細胞は、多細胞生物から得てもよい。無脊椎動物細胞の例には、植物および昆虫細胞が含まれる。ヨトウガ（イモムシ）、ネッタイシマカ（蚊）、ヒトスジシマカ（蚊）、キイロショウジョウバエ（ショウジョウバエ）、およびカイコ、等の宿主由来の多くのバキュロウイルス株および変異体ならびに対応する許容できる昆虫宿主細胞が特定されている。このような細胞のトランスフェクション用の種々のウイルス株、例えば、オートグラファ・カリフォルニカＮＰＶのＬ−１変異体およびカイコＮＰＶのＢｍ−５株が公的に入手可能である。

脊椎動物宿主細胞は、また、適切な宿主であり、このような細胞からのポリペプチド（抗原結合タンパク質、例えば、抗体および抗体断片を含む）の組換え産生は、日常的な手法になっている。有用な哺乳類宿主細胞株の例は、以下の通りである：ＣＨＯＫ１細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ６１）、ＤＸＢ−１１、ＤＧ−４４、およびチャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲを含むチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ、Ｕｒｌａｕｂ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：４２１６（１９８０））；ＳＶ４０により形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５１）；ヒト胚性腎臓株（浮遊培養による増殖用にサブクローンされた２９３または２９３細胞、［Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．３６：５９（１９７７）］；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ１０）；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３−２５１（１９８０））；サル腎臓細胞（ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５８７）；ヒト子宮頚癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ３４）；ＢＵＦラット肝臓細胞（ＢＲＬ３Ａ、ＡＴＣＣＣＲＬ１４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ ＣＣＬ７５）；ヒト肝細胞腫細胞（ＨｅｐＧ２、ＨＢ８０６５）；マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ ０６０５６２、ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４−６８（１９８２））；ＭＲＣ ５細胞もしくはＦＳ４細胞；または哺乳類骨髄腫細胞。

宿主細胞は、ポリペプチド（抗原結合タンパク質、例えば、抗体を含む）の産生のために、上述の核酸またはベクターで形質転換または形質移入され、プロモーターの誘導、形質転換体の選択、または所望の配列をコードする遺伝子の増幅のために、適宜改良された通常の栄養素培地中で培養される。さらに、選択マーカーで区切られた転写ユニットの複数コピーを有する新規ベクターおよび形質移入された細胞株は、抗体等のポリペプチドの発現に特に有用である。

本発明で有用なポリペプチドを産生するために使用する宿主細胞は、種々の培地中で培養できる。ハムＦ１０（Ｓｉｇｍａ）、最小必須培地（（ＭＥＭ）、（Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ）、およびダルベッコ変法イーグル培地（（ＤＭＥＭ）、Ｓｉｇｍａ）等の市販の培地が、宿主細胞の培養に好適である。さらに、Ｈａｍ ｅｔ ａｌ．、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．５８：４４（１９７９）、Ｂａｒｎｅｓ ｅｔ ａｌ．、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０２：２５５（１９８０）、米国特許第４，７６７，７０４号；同４，６５７，８６６号；同４，９２７，７６２号；同４，５６０，６５５号；または同５，１２２，４６９号；国際公開第９０１０３４３０号；同８７／００１９５号；または米国再発行特許第３０，９８５号、に記載のいずれの培地も、宿主細胞用培地として使用できる。必要に応じ、これらの培地のいずれをも、ホルモンおよび／または他の増殖因子（例えば、インスリン、トランスフェリン、または上皮増殖因子）、塩（例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、およびリン酸塩）、緩衝剤（例えば、ＨＥＰＥＳ）、ヌクレオチド（例えば、アデノシンおよびチミジン）、抗生物質（例えば、ゲンタマイシン（登録商標）薬剤）、痕跡の元素（通常、ミクロモルの最終濃度範囲で存在する無機化合物として規定される）、およびブドウ糖または等価なエネルギーソース、で補充してもよい。他の必要ないずれの補充剤も、当業者には既知の適切な濃度で含んでもよい。培養条件、例えば、温度、ｐＨ、等は、発現用に宿主細胞で以前に使用された条件であり、当業者には明らかであろう。

宿主細胞の培養に際しては、組換えポリペプチドは、細胞内で、細胞周辺腔中で、または培地中に直接分泌により産生出来る。抗原結合タンパク質（例えば、抗体）等のポリペプチドが細胞内で産生される場合は、第１ステップとして、宿主細胞または溶解断片の粒子状破片が、例えば、遠心分離または限外濾過により除去される。

抗体または抗体断片は、例えば、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、陽イオンもしくは陰イオン交換クロマトグラフィー、または好ましくは、対象の抗原またはタンパク質Ａまたはタンパク質Ｇを親和性リガンドとして使った親和性クロマトグラフィー、を使用して精製できる。タンパク質Ａは、含有ポリペプチドがヒトγ１、γ２、またはγ４重鎖に基づいているタンパク質を精製するのに使用できる（Ｌｉｎｄｍａｒｋ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．６２：１−１３（１９８３））。タンパク質Ｇは、全てのマウスアイソタイプおよびヒトγ３に対し推奨される（Ｇｕｓｓ ｅｔ ａｌ．、ＥＭＢＯＪ．５：１５６７１５７５（１９８６））。親和性リガンドが接着するマトリックスは、多くの場合、アガロースであるが、他のマトリックスも利用可能である。機械的に安定なマトリックス、例えば、気孔制御ガラスまたはポリ（スチレンジビニル）ベンゼンは、アガロースの場合より高速な流量と、より短い処理時間を可能とする。タンパク質がＣ_Ｈ３ドメインを含む場合には、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ ＡＢＸ（登録商標）樹脂（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ、Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ、Ｎ．Ｊ．）が、精製に有用である。他のタンパク質精製技術、例えば、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、等電点電気泳動、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、および硫酸アンモニウム沈殿法もまた、回収される抗体に応じて、利用可能である。

キメラ、ヒト化、Ｈｕｍａｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ（登録商標）、Ｘｅｎｏｍｏｕｓｅ（登録商標）モノクローナル抗体。げっ歯類モノクローナル抗体の可変Ｉｇドメインが、ヒト定常Ｉｇドメインに融合されているキメラモノクローナル抗体は、当技術分野で既知の標準的方法を使って生成できる（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、Ｓ．Ｌ．、ｅｔ ａｌ．（１９８４）キメラヒト抗体分子（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）；ヒト定常部ドメインを有するマウス抗原結合ドメイン（Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｄｏｍａｉｎｓ ｗｉｔｈ Ｈｕｍａｎ Ｃｏｎｓｔａｎｔ Ｒｅｇｉｏｎ Ｄｏｍａｉｎｓ）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１、６８４１−６８５５；および、Ｂｏｕｌｉａｎｎｅ、Ｇ．Ｌ．、ｅｔ ａｌ、Ｎａｔｕｒｅ ３１２、６４３−６４６．（１９８４）を参照）。抗体配列をさらにヒト様にヒト化する、または改変することに関し、例えば、（１）非ヒト相補性決定領域（ＣＤＲ）の、ヒトフレームワークおよび定常部への移植（当技術分野で「ＣＤＲ移植」によるヒト化と呼ばれるプロセス）または（２）全非ヒト可変ドメインを移植するが、それらの表面残基の置換によるヒト様表面での「被覆」（当技術分野で「ベニアリング（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）」と呼ばれるプロセス）、または（３）選択非ヒトアミノ酸残基を、各残基の抗原結合または抗体構造での寄与の見込みおよびその免疫原性の見込みに基づいて、よりヒト型への改変、によるいくつかの技術が記載されている。例えば、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２５２５（１９８６）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、Ｕ．Ｓ．Ａ．、８１：６８５１６８５５（１９８４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ａｎｄ Ｏｉ、Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、４４：６５９２（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４１５３６（１９８８）；Ｐａｄｌａｎ、Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎ．２８：４８９４９８（１９９１）；Ｐａｄｌａｎ、Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１（３）：１６９２１７（１９９４）；および Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ、Ｃ．Ａ．ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．４（７）：７７３８３（１９９１）；Ｃｏ、Ｍ．Ｓ．、ｅｔ ａｌ．（１９９４）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２、２９６８−２９７６）；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ７：８０５−８１４（１９９４）、を参照されたい。これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

抗体配列をさらにヒト様にヒト化する、または改変することに関し、例えば、（１）非ヒト相補性決定領域（ＣＤＲ）の、ヒトフレームワークおよび定常部への移植（当技術分野で「ＣＤＲ移植」によるヒト化と呼ばれるプロセス）または（２）全非ヒト可変ドメインを移植するが、それらの表面残基の置換によるヒト様表面の「被覆」（当技術分野で「ベニアリング（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）」と呼ばれるプロセス）、または（３）選択非ヒトアミノ酸残基を、各残基の抗原結合または抗体構造での寄与の見込みおよびその免疫原性の見込みに基づいて、よりヒト型への改変、によるいくつかの技術が記載されている。例えば、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２５２５（１９８６）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、Ｕ．Ｓ．Ａ．、８１：６８５１６８５５（１９８４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ａｎｄ Ｏｉ、Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、４４：６５９２（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４１５３６（１９８８）；Ｐａｄｌａｎ、Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎ．２８：４８９４９８（１９９１）；Ｐａｄｌａｎ、Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１（３）：１６９２１７（１９９４）；および Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ、Ｃ．Ａ．ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．４（７）：７７３８３（１９９１）；Ｃｏ、Ｍ．Ｓ．、ｅｔ ａｌ．（１９９４）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２、２９６８−２９７６）；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ７：８０５−８１４（１９９４）、を参照されたい。これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

抗体は、また、内在性免疫グロブリン産生の無い遺伝子導入動物を使って、ヒト免疫グロブリン座位を含むように操作して、産生出来る（例えば、Ｍｅｎｄｅｚ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔ．ジェネット．１５：１４６−１５６（１９９７）参照）。例えば、国際公開第９８／２４８９３号は、ヒトＩｇ座位を有する遺伝子導入動物を開示している。この座位では、動物は、内在性重鎖および軽鎖座位の不活性化に起因して、機能できる内在性免疫グロブリンを産生しない。国際公開第９１／１０７４１号は、また、免疫原に対し免疫応答開始できる遺伝子導入非霊長類哺乳類宿主を開示し、ここでは、抗体は、霊長類定常および／または可変部を有し、内在性免疫グロブリンコード座位は、置換または不活化されている。国際公開第９６／３０４９８号は、Ｃｒｅ／Ｌｏｘ ｓｙｓｔｅｍを使用して、全てまたは一部の定常または可変部を置換して改変抗体分子を形成するように、哺乳動物の免疫グロブリン座位を変更することが開示されている。国際公開第９４／０２６０２号は、不活化内在性Ｉｇ座位および機能できるヒトＩｇ座位を有する非ヒト哺乳類宿主を開示している。米国特許第５，９３９，５９８号は、遺伝子導入マウスを作る方法を開示し、この方法では、マウスは、内在性重鎖を欠き、１つまたは複数の異種定常部を含む外因性の免疫グロブリン座位を発現する。

上述の遺伝子導入動物を使って、選択抗原性分子に対し免疫応答を生成でき、抗体産生細胞は、動物から取り出され、ヒト由来モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマの産生に使用できる。免疫化プロトコル、アジュバント、等は、当技術分野で既知であり、例えば、国際公開第９６／３３７３５号に記載のように、遺伝子導入マウスの免疫化に使用される。モノクローナル抗体は、対応するタンパク質の生物活性または生理的な効果を抑制する、または中和する能力により試験できる。また、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０：２５５１（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、３６２：２５５−２５８（１９９３）；Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．、Ｙｅａｒ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏ．、７：３３（１９９３）；Ｍｅｎｄｅｚ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１５：１４６−１５６（１９９７）；ならびに米国特許第５，５９１，６６９号、同５，５８９，３６９号、同５，５４５，８０７号；および米国特許公開第２００２０１９９２１３号、を参照されたい。米国特許公開第２００３００９２１２５号は、動物の免疫応答を所望のエピトープに偏らせる方法を記載している。ヒト抗体は、また、インビトロ活性化Ｂ細胞によっても生成できる（米国特許第５，５６７，６１０号および同５，２２９，２７５号を参照）。

ファージディスプレイ技術による抗体産生
組換えヒト抗体遺伝子のレパートリー作成技術の開発、および繊維状バクテリオファージの表面上のコード化抗体断片のディスプレイは、ヒト由来抗体生成のための別の手段を提供している。ファージディスプレイに関しては、例えば、Ｄｏｗｅｒ ｅｔ ａｌ．、国際公開第９１／１７２７１号、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．、国際公開第９２／０１０４７号、およびＣａｔｏｎ ａｎｄ Ｋｏｐｒｏｗｓｋｉ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８７：６４５０−６４５４（１９９０）、に記載されている。これらは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ファージ技術により産生された抗体は、通常、細菌中で、抗原結合断片、例えば、ＦｖまたはＦａｂ断片として産生され、従って、エフェクター機能が欠如している。エフェクター機能は、次の２つの戦略の内の１つにより導入できる：断片を操作して、哺乳動物細胞中で完全抗体として発現させる、またはエフェクター機能をもたらすことができる第２の結合部位を有する二重特異性抗体断片とすることができる。

通常、抗体のＦｄ断片（Ｖ_Ｈ〜Ｃ_Ｈ１）および軽鎖（Ｖ_Ｌ〜Ｃ_Ｌ）は、ＰＣＲにより別々にクローニングされ、コンビナトリアルファージディスプレイライブラリーを使って無作為に組み換えられ、その後、特定の抗原に対する結合により選択できる。抗体断片は、ファージ表面上で発現し、ＦｖまたはＦａｂ（および従って、抗体断片をコードするＤＮＡを含むファージ）の抗原結合による選択が、数ラウンドの抗原結合と再増幅（パニングと呼ばれるプロセス）により成し遂げられる。抗原に特異的な抗体断片が濃縮され、最終的に単離される。

ファージディスプレイ技術は、げっ歯類モノクローナル抗体のヒト化のための手法にも使用できる、この手法は、「誘導選択（ｇｕｉｄｅｄ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）」と呼ばれる（Ｊｅｓｐｅｒｓ、Ｌ．Ｓ．、ｅｔａｌ．、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１２、８９９−９０３（１９９４）、を参照）。このために、マウスモノクローナル抗体のＦｄ断片は、ヒト軽鎖ライブラリーと組み合わせて提示でき、得られたハイブリッドＦａｂライブラリーは、次に、抗原を使って選択できる。マウスＦｄ断片は、これによって選択をガイドするテンプレートを提供する。その後、選択ヒト軽鎖は、ヒトＦｄ断片ライブラリーと合わせられる。得られたライブラリーの選択により、完全ヒトＦａｂが得られる。

ファージディスプレイライブラリーからヒト抗体を得るための種々の方法が記載されている（例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２７：３８１（１９９１）；Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ、２２２：５８１−５９７（１９９１）；米国特許第５，５６５，３３２号および同５，５７３，９０５号；Ｃｌａｃｋｓｏｎ、Ｔ．、ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ、Ｊ．Ａ．、ＴＩＢＴＥＣＨ １２、１７３−１８４（１９９４）を参照）。特に、ファージディスプレイライブラリー由来抗体のインビトロ選択と進展は、協力はツールになっている（Ｂｕｒｔｏｎ、Ｄ．Ｒ．、ａｎｄ ＢａｒｂａｓＩＩＩ、Ｃ．Ｆ．、Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５７、１９１−２８０（１９９４）；およびＷｉｎｔｅｒ、Ｇ．、ｅｔ ａｌ．、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２、４３３−４５５（１９９４）；米国特許公開第２００２０００４２１５号および国際公開第９２／０１０４７号；２００３年１０月９日広告の米国特許公開第２００３０１９０３１７号、ならびに米国特許第６、０５４、２８７号；同５、８７７、２９３号、参照。Ｗａｔｋｉｎｓ、「キャプチャーリフトによるファージ発現抗体ライブラリーの選別（Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｏｆ Ｐｈａｇｅ−Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ ｂｙ Ｃａｐｔｕｒｅ Ｌｉｆｔ）」、分子生物学における方法、抗体ファージディスプレイ：方法とプロトコル（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）１７８：１８７−１９３、および２００３年３月６日広告の米国特許公開第２００３００４４７７２号は、ファージ発現抗体ライブラリーまたは他の結合分子のキャプチャーリフトによる選別方法を記載している。キャプチャーリフト法は、候補結合分子の固体支持体への固定化を含む方法である。

抗原結合タンパク質の他の実施形態
上述のように、抗体断片は、無傷完全長抗体の一部、好ましくは、無傷抗体の抗原結合部または可変部を含み、抗体断片から形成された直鎖抗体および多選択性の抗体を含む。抗体断片の非限定的例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、Ｆｄ、ドメイン抗体（ｄＡｂ）、相補性決定領域（ＣＤＲ）断片、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体断片、マクシボディ、ディアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニボディ、直鎖抗体、キレート化組換え抗体（ｃｈｅｌａｔｉｎｇ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｎｔｉｂｏｄｙ）、トリボディまたはバイボディ、イントラボディ、ナノボディ、小モジュール免疫薬剤（ＳＭＩＰ）、抗原結合ドメイン免疫グロブリン融合タンパク質、ラクダ化抗体、ＶＨＨ含有抗体、またはムテインもしくはその誘導体、およびポリペプチド、例えば、抗体が所望の生物活性を維持している限り、ＣＤＲ配列に特異的抗原結合を付与するのに充分な少なくとも一部の免疫グロブリンを含むポリペプチド、が含まれる。このような抗体断片は、全抗体の改変により産生、または組換えＤＮＡ技術もしくはペプチド合成を使って新規に合成できる。

さらなる抗体断片には、ドメイン抗体（ｄＡｂ）断片（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４−５４６、１９８９）が含まれ、これは、ＶＨドメインから構成される。

「直鎖抗体」は、１対のタンデムＦｄセグメント（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）を含み、これは、１対の抗原結合領域を形成する。直鎖抗体は、二重特異性でも、または単一特異性であってもよい（Ｚａｐａｔａ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．８：１０５７−６２（１９９５））。

ペプチドリンカー（ヒンジ無し）経由またはＩｇＧヒンジ経由でＣＨ３に融合したｓｃＦｖから構成される「ミニボディ」は、Ｏｌａｆｓｅｎ、ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ．２００４Ａｐｒ；１７（４）：３１５−２３、に記載されている。

「マクシボディ」という用語は、免疫グロブリンのＦｃ領域に共有結合した二価のｓｃＦｖを指す。例えば、Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋｓ ｅｔ ａｌ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｄｅｓｉｇｎ ＆ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ、１７：９５−１０６（２００４）およびＰｏｗｅｒｓ ｅｔ ａｌ．、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ、２５１：１２３−１３５（２００１）、を参照されたい。

軽鎖を欠いている機能性重鎖抗体は、特定の動物種、例えば、テンジクザメ、オオセサメおよびラクダ等のラクダ科、ヒトコブラクダ、アルパカおよびラマで天然に存在する。これらの動物では、抗原結合部位は、単一ドメイン、ＶＨＨドメインに縮小されている。これらの抗体は、重鎖可変部のみを使って抗原結合領域を形成し、すなわち、これらの機能性抗体は、構造Ｈ２Ｌ２を有するだけの重鎖のホモダイマーである（「重鎖抗体」または「ＨＣＡｂ」と呼ばれる）。ラクダ化ＶＨＨは、ヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３ドメインを含み、ＣＨ１ドメインを欠いているＩｇＧ２およびＩｇＧ３定常部と組み変わると報告されている。古典的なＶＨのみの断片は、可溶型として産生するのが困難であるが、さらにＶＨＨ様に変えられる場合、溶解度と特異的結合の改善を行うことができる（例えば、Ｒｅｉｃｈｍａｎ、ｅｔ ａｌ．、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ １９９９、２３１：２５−３８、を参照）。ラクダ化ＶＨＨドメインは、高親和性で抗原に結合し（Ｄｅｓｍｙｔｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：２６２８５−９０、２００１）、溶液中で高安定性を有することが見出されている（Ｅｗｅｒｔ ｅｔ ａｌ．、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４１：３６２８−３６、２００２）。ラクダ化重鎖を有する抗体の産生方法は、例えば、米国特許公開第２００５／０１３６０４９号および同２００５／００３７４２１号に記載されている。あるいは、足場は、サメＶ−ＮＡＲ足場に、さらに密接にマッチするヒト可変様ドメインから生成でき、長いループ構造のためのフレームワークを提供できる。

重鎖抗体の可変ドメインは、１５ｋＤａにすぎない分子量の最少の完全機能性抗原結合断片であるため、この実体は、ナノボディと呼ばれる（Ｃｏｒｔｅｚ−Ｒｅｔａｍｏｚｏ ｅｔ ａｌ．、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６４：２８５３−５７、２００４）。ナノボディライブラリーは、免疫ヒトコブラクダから、Ｃｏｎｒａｔｈ ｅｔ ａｌ．、（Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ ４５：２８０７−１２、２００１）に記載のように、作成できる。

適切な組換え方法、および、本発明の薬理学的に活性毒素ペプチド類似体にコンジュゲートした二量体Ｆｃ融合タンパク質（「ぺプチボディ」）またはキメラ免疫グロブリン（軽鎖＋重鎖）−Ｆｃヘテロトリマー（「ヘミボディ」）を含む、哺乳動物細胞による抗原結合タンパク質の実施形態の組み換え体発現のために有用な代表的ＤＮＡ構築物のさらなる例は、例えば、Ｓｕｌｌｉｖａｎ ｅｔ ａｌ．、毒素ペプチド治療薬（Ｔｏｘｉｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｇｅｎｔｓ）、米国特許公開第２００７／００７１７６４号およびＳｕｌｌｉｖａｎ ｅｔ ａｌ．、毒素ペプチド治療薬（Ｔｏｘｉｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｇｅｎｔｓ）、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０２２８３１（国際公開第２００８／０８８４２２号として公開）に認められる。これらは、両方とも参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

ペプチド
本発明で使用されるペプチドまたはポリペプチド組成物は、前に本明細書で記載のように、組換えＤＮＡ技術を使って、または化学ペプチド合成により作ることができる。固相合成は、好ましい個別ペプチドの作成技術である。理由は、これが最も対費用効果の高い低分子ペプチド作成方法であるからである。例えば、よく知られた固相合成技術には、保護基、リンカー、および固相支持体の使用、ならびに特異的保護および脱保護反応条件、リンカー切断条件、スカベンジャーの使用、ならびに固相ペプチド合成の他の態様が含まれる。適切な技術は、当技術分野でよく知られている（Ｅ．ｇ．、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（１９７３）、Ｃｈｅｍ．ポリペプチド、ｐｐ．３３５−６１（Ｋａｔｓｏｙａｎｎｉｓ ａｎｄ Ｐａｎａｙｏｔｉｓ ｅｄｓ．）；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（１９６３）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９；Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．（１９８５）、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｉｎｔｌ．１０：３９４−４１４；Ｓｔｅｗａｒｔ ａｎｄ Ｙｏｕｎｇ（１９６９）、固相ペプチド合成（Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）；米国特許第３、９４１、７６３号；Ｆｉｎｎ ｅｔ ａｌ．（１９７６）、タンパク質（Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）（３ｒｄ ｅｄ．）２：１０５−２５３；およびＥｒｉｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９７６）、タンパク質（Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）（３ｒｄ ｅｄ．）２：２５７−５２７；「有機合成における保護基（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」、３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ ａｎｄ Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ、Ｅｄｓ．、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．、１９９９；Ｎｏｖａ Ｂｉｏｃｈｅｍ カタログ、２０００；「合成ペプチド、ユーザーズガイド（Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ、Ａ Ｕｓｅｒ’ｓ Ｇｕｉｄｅ）」、Ｇ．Ａ．Ｇｒａｎｔ、Ｅｄ．、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．、１９９２；「コンビナトリアル＆固相有機化学の最新化学技術ハンドブック（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｈｅｍｔｅｃｈ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ＆ Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、Ｗ．Ｄ．Ｂｅｎｎｅｔ、Ｊ．Ｗ．Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ、Ｌ．Ｋ．Ｈａｍａｋｅｒ、Ｍ．Ｌ．Ｐｅｔｅｒｓｏｎ、Ｍ．Ｒ．Ｒｈｏｄｅｓ、ａｎｄ Ｈ．Ｈ．Ｓａｎｅｉｉ、Ｅｄｓ．、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｈｅｍｔｅｃｈ、１９９８；「ペプチド合成の原理（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）、２ｎｄ ｅｄ．」、Ｍ．Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ、Ｅｄ．、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、１９９３；「ペプチド合成の実際（Ｔｈｅ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）、２ｎｄ ｅｄ．」、Ｍ．Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ ａｎｄ Ａ．Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ、Ｅｄｓ．、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、１９９４；「保護基（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐｓ）」、Ｐ．Ｊ．Ｋｏｃｉｅｎｓｋｉ、Ｅｄ．、Ｇｅｏｒｇ Ｔｈｉｅｍｅ Ｖｅｒｌａｇ、Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ、１９９４；「Ｆｍｏｃ固相ペプチド合成、実践的アプローチ（Ｆｍｏｃ Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ）」、Ｗ．Ｃ．Ｃｈａｎ ａｎｄ Ｐ．Ｄ．Ｗｈｉｔｅ、Ｅｄｓ．、Ｏｘｆｏｒｄ Ｐｒｅｓｓ、２０００、Ｇ．Ｂ．Ｆｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．、合成ペプチド、ユーザーズガイド、１９９０、７７−１８３）。本発明の物質の組成物の作成に適用可能な当技術分野で既知の合成と精製方法のさらなる例に関しては、例えば、Ｓｕｌｌｉｖａｎ ｅｔ ａｌ．、毒素ペプチド治療薬（Ｔｏｘｉｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｇｅｎｔｓ）、米国特許公開第２００７／００７１７６４号およびＳｕｌｌｉｖａｎ ｅｔ ａｌ．、毒素ペプチド治療薬（Ｔｏｘｉｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｇｅｎｔｓ）、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０２２８３１（国際公開第２００８／０８８４２２号として公開）を参照されたい。これら両方の特許は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

リンカー
本明細書で同義に使用される「リンカー」または「リンカー成分」は、本発明の組成物中に含まれるポリペプチド鎖（例えば、免疫グロブリンＨＣまたは免疫グロブリンＬＣまたは免疫グロブリンＦｃドメイン）のアミノ酸残基に共有結合している生物学的に受容可能なペプチジルまたは非ペプチジル有機基を指す。このリンカー成分は、共有結合でポリペプチド鎖を別の分子または化学成分に連結または複合体化する。多くの有用なペプチジルおよび非ペプチジルリンカーが当技術分野で知られており、多くが、Ｓｕｌｌｉｖａｎ ｅｔ ａｌ．、毒素ペプチド治療薬（Ｔｏｘｉｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｇｅｎｔｓ）、米国特許公開第２００７／００７１７６４Ａ１号に詳細に記載されている。本発明に採用される成分または試薬中のいずれかのリンカー成分の存在は、任意選択である。存在する場合には、リンカーの化学構造は重要ではない。理由は、それは、主にスペーサーとして働き、１つまたは複数の他の機能的成分と関連して、配置、連結、接続し、または１つの機能的成分の提示または位置を最適化するためである。

本発明は、以下の実施例により説明されるが、この実施例には、何ら限定の意図はない。

実施例１：ＫＷ−０７６１に対する中和抗体の選別アッセイ
開発中のＫＷ−０７６１（「モガムリズマブ」または「ＡＭＧ７６１」としても知られる）治療薬は、ヒト化ＩｇＧ１抗ＣＣＲ４抗体であり、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の機序によりインビボで機能する（Ｉｓｈｉｉ ｅｔ ａｌ．、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫用新規免疫治療薬としての脱フコシル化ヒト化抗ＣＣＲ４モノクローナル抗体ＫＷ−０７６１（Ｄｅｆｕｃｏｓｙｌａｔｅｄ Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ Ａｎｔｉ−ＣＣＲ４ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ＫＷ−０７６１ ａｓ ａ Ｎｏｖｅｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｇｅｎｔ ｆｏｒ Ａｄｕｌｔ Ｔ−ｃｅｌｌ Ｌｅｕｋｅｍｉａ／Ｌｙｍｐｈｏｍａ）、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １６：１５２０−３１（２０１０）；Ｓｈｉｔａｒａ ｅｔ ａｌ．、ヒトＣＤＲグラフト化抗体およびその抗体断片（Ｈｕｍａｎ ＣＤＲ−ｇｒａｆｔｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｎｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｔｈｅｒｅｏｆ）、米国特許第７、５０４、１０４号）。この薬剤は、標的細胞上のヒトＣＣＲ４ケモカイン受容体およびエフェクター細胞上のヒトＦＣγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）に結合する。その結果、エフェクター細胞は標的細胞を死滅させることができる。我々は、ＭＳＤ電気化学発光（ＥＣＬ）検出法を利用することによる、ＫＷ−０７６１に対する中和抗体（ＮＡｂ）の検出のための二重機能標的結合アッセイの実施形態を開発した。図１は、ビオチン化対象標的タンパク質（例えば、ＣＣＲ４）に特異的に結合するＩｇＧ１標的抗体（例えば、ＫＷ−０７６１）、および血清試料中の中和抗体を検出するように構成された本発明のアッセイの実施形態の模式図である。

簡単に説明すると、この本発明の実施形態では、ＩｇＧ標的抗体（治療の薬剤、例えば、ＫＷ−０７６１； Ｉｓｈｉｉ ｅｔ ａｌ．、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫用新規免疫治療薬としての脱フコシル化ヒト化抗ＣＣＲ４モノクローナル抗体ＫＷ−０７６１（Ｄｅｆｕｃｏｓｙｌａｔｅｄ Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ Ａｎｔｉ−ＣＣＲ４ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ＫＷ−０７６１ ａｓ ａ Ｎｏｖｅｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｇｅｎｔ ｆｏｒ Ａｄｕｌｔ Ｔ−ｃｅｌｌ Ｌｅｕｋｅｍｉａ／Ｌｙｍｐｈｏｍａ）、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １６：１５２０−３１（２０１０）；Ｓｈｉｔａｒａ ｅｔ ａｌ．、ヒトＣＤＲグラフト化抗体およびその抗体断片（Ｈｕｍａｎ ＣＤＲ−ｇｒａｆｔｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｎｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｔｈｅｒｅｏｆ）、米国特許第７，５０４，１０４号）、試験血清試料、標的タンパク質のおよびポリペプチド成分（例えば、ビオチンＣＣＲ４ペプチドコンジュゲート）を含む反応混合物が、プレート（例えば、９６−ウエルストレプトアビジンコートプレート、ＭＳＤ カタログ＃Ｌ１１ＳＡ−１、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ［ＭＳＤ］、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）中のストレプトアビジンコートウエルに添加される。反応混合物をプレートでインキュベート後、プレートを洗浄し、ポリヒスチジンタグ組換えヒトＦＣγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）を添加し、続いて、抗ポリヒスチジンマウスモノクローナル抗体とともにインキュベートする；異なる動物種由来の抗ポリヒスチジンモノクローナル抗体も、適宜使用可能である。Ｓｕｌｆｏ−ＴＡＧ（登録商標）標識ヤギ抗マウス抗体（ＭＳＤ カタログ＃Ｒ３２ＡＣ−１；抗体が使用される抗ポリヒスチジン抗体と特異的に反応する限り、異なる動物種由来の標識抗体も、適宜使用可能である。）およびＭＳＤから入手のＲｅａｄ Ｂｕｆｆｅｒ Ｔ（ＭＳＤ カタログ＃Ｒ９２ＴＣ−１）の添加に伴い、最終的に、電気化学発光（ＥＣＬ）シグナルが生成される。図２は、本発明の実施形態のアッセイ法のステップのフローチャートを示す。血清試料がＩｇＧ標的抗体に対する中和抗体を含む場合は、ＩｇＧ標的抗体は、ストレプトアビジンコートウエル表面に捕捉されているビオチンＣＣＲ４ペプチドに結合できない。その結果、ＮＡｂの存在化で、低ＥＣＬシグナルが生成される。ＮＡｂが無い場合は、薬剤がビオチンＣＣＲ４ペプチドおよびヒスチジンタグ組換えヒトＦＣγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）の間で架橋を形成できるために、高ＥＣＬシグナルが生成される。選別アッセイがＮＡｂの存在を示す場合は、例えば、本明細書の実施例２に記載のような確認用アッセイ、が推奨される。

選別アッセイプロトコル。次の綿密なアッセイプロトコルを行った：
１．９６ウエルプレート（ＭＳＤカタログ＃Ｌ１１ＳＡ−１、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）中のストレプトアビジンコートウエルを、各ウエルに対しそれぞれ１５０μＬのアッセイ緩衝液（ダルベッコ燐酸塩緩衝食塩水［ｐＨ７．１±０．１；「ＤＰＢＳ」；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手］＋１％（ｖ／ｖ）ウシ血清アルブミン［「ＢＳＡ」］）を用いて、室温で少なくとも１時間ブロックし、ウエルの適切なブロッキングを確実なものとした。ブロックされたウエルが同じ日に本発明のアッセイに使用される限りは、ブロッキングを、１時間を適宜越えて行ってもよい。ブロッキング後、ウエルを２００μＬ／ウエルＤＰＢＳで１回洗浄した。選択したアッセイ緩衝液は、カルシウムまたはマグネシウムジカチオンを除いたが、これらのジカチオンが本アッセイを妨害するとは考えられない。
２．アッセイ緩衝液中にＩｇＧ標的抗体ＫＷ−０７６１（２０ｎｇ／ｍＬ最終濃度）、血清試料（１０％（ｖ／ｖ）最終濃度）、およびビオチンＣＣＲ４ペプチドコンジュゲート（８０ｎｇ／ｍＬ最終濃度）を含む反応混合物（５０μＬ／ウエル）を調製した。体積は、下記ステップ３で反応混合物を移す必要がある所望の数のウエルに対し充分であるように調節した。
（ａ） Ｔｈｅ血清試料：１０μＬの５０％（ｖ／ｖ）血清試料＋アッセイ緩衝液中で希釈した３０μＬの３４ｎｇ／ｍＬ−ＫＷ−０７６１。
（ｂ） 以下の対照試料も作成した：
「Ｎ」対照：１０μＬの５０％（ｖ／ｖ）プールヒト血清［正常なドナー由来］（「ＰＨＳ」；Ｂｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎ、Ｉｎｃ．、Ｌｏｎｇ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹから入手）＋３０μＬアッセイ緩衝液；または
「Ｄ」対照：１０μＬの５０％（ｖ／ｖ）ＰＨＳ＋アッセイ緩衝液中で希釈した３０μＬの３４ｎｇ／ｍＬＫＷ−０７６１；または
「Ｐ」対照：抗ＫＷ−０７６１抗体（−７０℃貯蔵した１．０２ｍｇ／ｍＬ濃度のウサギ抗ＫＷ−０７６１ポリクローナルストック）添加１０μＬの５０％（ｖ／ｖ）ＰＨＳ＋アッセイ緩衝液中で希釈した３０μＬの３４ｎｇ／ｍＬＫＷ−０７６１。
これらの対照または血清試料のＰＨＳの５０％（ｖ／ｖ）への希釈は、等体積のアッセイ緩衝液を混合して行った。上記＃２（ａ）または＃２（ｂ）の試料を、Ｕ−またはＶ−底ポリプロピレンプレート中で、中等度の振盪で、室温で１時間（±１５分）インキュベートし、その後：
（ｃ） ビオチン−ＣＣＲ４ペプチドコンジュゲート（−７０℃で貯蔵した１ｍｇ／ｍＬ−ストック溶液から調製したアッセイ緩衝液で希釈した１０μＬの４００ｎｇ／ｍＬビオチン−ＣＣＲ４ペプチド；一旦解凍して、ストックを４℃に１ヶ月超保持した）を上記＃２（ａ）または＃２（ｂ）の試料に分注し、反応混合物を形成した。ＣＣＲ４のビオチン化ポリペプチド部は、以下のアミノ酸配列であった：
ＭＮＰＴＤＩＡＤＴＴＬＤＥＳＩＹＳＮＹＹＬＹＥＳＩＰＫＰＫ（ビオチン）−ＯＨ／／配列番号３（Ｍｉｄｗｅｓｔ Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈ Ｉｎｃ．から購入、カタログ＃ＭＢＴ３８９８）；あるいは、ＭＮＰＴＤＩＡＤＴＴＬＤＥＳＩＹＳＮＹＹＬＹＥＳＩＰＫＰＣＴＫ（ビオチン）−ＯＨ／／配列番号４、これは、通常の化学技術により合成・ビオチン化した。
３．上記ステップ＃２由来反応混合物（血清試料または対照試料を含む）を、上記ステップ＃１由来のストレプトアビジンコートプレート（ＭＳＤカタログ＃Ｌ１１ＳＡ−１、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）上の各指定ウエルに移した。各ウエルには、５０μＬの反応混合物を入れた。次に、ストレプトアビジンコートプレートを、中等度の振盪で、室温で１時間（±１５分）インキュベートし、その後、ウエルを２００μＬ／ウエル／回のＤＰＢＳで３回洗浄した。
４．アッセイ緩衝液で希釈した５０μＬの８０ｎｇ／ｍＬポリヒスチジンタグ組換えＦＣγＲＩＩＩ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから入手、カタログ＃４３２５−ＦＣ）を、ストレプトアビジンコートプレート上の各指定ウエルに加えて、中等度の振盪で室温で１時間（±１５分）インキュベートし、その後、ウエルを２００μＬ／ウエル／回のＤＰＢＳで３回洗浄した。
５．アッセイ緩衝液で希釈した１００μＬの１μｇ／ｍＬのマウス抗ポリヒスチジンＭａｂ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから入手、カタログ＃ＭＡＢ０５０）を、ストレプトアビジンコートプレート上の各指定ウエルに加えて、中等度の振盪で、室温で４５〜６０分間インキュベートし、その後、ウエルを２００μＬ／ウエル／回のＤＰＢＳで３回洗浄した。
６．アッセイ緩衝液で希釈した１００μＬの１μｇ／ｍＬのヤギ抗マウスＳｕｌｆｏ−ＴＡＧ（登録商標）（ＭＳＤカタログ＃Ｒ３２ＡＣ−１）を、ストレプトアビジンコートプレート上の各指定ウエルに加えて、中等度の振盪で、室温で３０〜４５分間インキュベートし（インキュベーション中、プレートを箔で覆った）、その後、ウエルを２００μＬ／ウエル／回のＤＰＢＳで３回洗浄した。
７．１５０μＬの１ｘ Ｒｅａｄ Ｂｕｆｆｅｒ Ｔ（ＭＳＤカタログ＃Ｒ９２ＴＣ−１；４ｘストックから水を使って１ｘに希釈した）を各ウエルに加え、ＳＥＣＴＯＲ（登録商標）Ｉｍａｇｅｒ６０００リーダー（「ＭＳＤ６０００」；Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）で読み取った。

アッセイ緩衝液（０％ＰＨＳ）またはプールヒト血清（ＰＨＳ：５％ＰＨＳまたは２０％ＰＨＳ；（ｖ／ｖ））の存在下の本発明のアッセイのＫＷ−０７６１の代表的用量反応を、図３に示す。

図４は、ＫＷ−０７６１のビオチン化ＣＣＲ４ペプチドへの結合が、ポリクローナル抗ＫＷ−０７６１中和抗体の存在により用量依存的に抑制されることを示す。

実施例２：確認用アッセイのための一般タンパク質Ｇ／Ｌ枯渇プロトコル
本発明の選別アッセイが、例えば、本明細書の実施例１に記載のように、血清試料中の中和抗体の存在を示す場合は、高感度確認用アッセイが推奨される。以下の確認用アッセイプロトコルは、本明細書の実施例１に記載の選別アッセイプロトコル中のタンパク質Ｇ／Ｌインキュベーション由来の血清試料濾液を使用する：
１．タンパク質Ｇアガロース樹脂（Ｐｉｅｒｃｅカタログ＃２０５２０）およびタンパク質Ｌアガロース樹脂（Ｐｉｅｒｃｅカタログ＃２２８５１）を等分ずつ混合し、次に、樹脂混合物をダルベッコ燐酸塩緩衝食塩水（ｐＨ７．１±０．１；「ＤＰＢＳ」；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手）で希釈して、５０％ビーズスラリー（「タンパク質Ｇ／Ｌ」）を作成した（大量の５０％ビーズスラリーが、前もって試薬として調製でき、３ヶ月の使用期限日付を付与し、２〜８℃で貯蔵できる）。
２．セファロース６Ｂ樹脂（Ｓｉｇｍａカタログ＃６Ｂ１００）をＤＰＢＳで希釈し５０％ビーズスラリー（「セファロース６Ｂ」）を生成した（大量の５０％ビーズスラリーが、前もって試薬として調製でき、３ヶ月の使用期限日付を付与し、２〜８℃で貯蔵できる）。タンパク質Ｇ／Ｌ樹脂で処理される各試料用の対照としてセファロース６Ｂ処理が行われる。血清試料中に存在するＮＡｂは、タンパク質Ｇ／Ｌ樹脂処理では除去できるが、セファロース６Ｂ樹脂処理では、除去できない。
３．樹脂ビーズを続けて懸濁中で維持し、１２０μＬのタンパク質Ｇ／Ｌ（上記＃１で調製）またはセファロース６Ｂ（上記＃２で調製）を適切なマルチスクリーンフィルタープレート（例えば、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅカタログ＃ＭＳＨＶＳ４５１０）のウエル中に入れた。
４．レシピエント９６ウエルプレートをフィルタープレート（上記＃３で調製）の下に置き、フィルタープレートを遠心分離（１０００〜２０００ＲＰＭ）を使ってＤＰＢＳで２回洗浄した（２００μＬ／ウエル／洗浄回）。フィルタープレートからの全通過画分を集め、廃棄した。最終遠心分離により、比較的水分の少ない樹脂ペレットがウエル中に残るはずである。
５．試験すべき血清試料を、各容量の血清試料に等用量のアッセイ緩衝液（ダルベッコ燐酸塩緩衝食塩水［ｐＨ７．１±０．１；「ＤＰＢＳ」；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手］＋１％（ｖ／ｖ）ウシ血清アルブミン［「ＢＳＡ」］）を混合することにより、５０％（ｖ／ｖ）に希釈した。
６．それぞれ希釈した血清試料を対応するタンパク質Ｇ／Ｌペレットおよびセファロース６Ｂペレットに加えた。フィルタープレートウエルを蓋またはトップシールで覆った。
７．新しいレシピエント９６ウエルプレートを、フィルタープレートの下にレシピエントプレートとして置き、レシピエントプレート／フィルタープレートの組み合わせを、プレートシェーカーまたは類似の装置を使って、少なくとも３０分間激しく混合した。３０分の混合後、レシピエントプレート／フィルタープレートの組み合わせを１０００〜２０００ＲＰＭで遠心分離し、濾液をレシピエントプレートに集めた。
８．上記＃７で集めた濾液を直接、確認用アッセイで使用した。このアッセイのステップは、本明細書の実施例１に記載の選別アッセイ法のステップと同じであった。各反応混合物に対し、タンパク質Ｇ／Ｌ処理（またはセファロース６Ｂ濾液対照）由来の１０μＬの濾液を、アッセイ緩衝液で希釈した３０μＬの３４ｎｇ／ｍＬのＫＷ−０７６１（「モガムリズマブ」または「ＡＭＧ７６１」としても知られる）に添加する必要がある。濾過血清試料と薬剤混合物をインキュベート（上記実施例１、ステップ＃２（ａ）のように）後、１０μＬの４００ｎｇ／ｍＬのビオチンＣＣＲ４を加え、完全反応混合物を作成する（上記実施例１、ステップ＃２（ｃ）のように）。実施例１の残りのステップ＃３〜７を行った。

実施例３：リツキシマブ標的結合アッセイ
リツキシマブ（ＲｏｃｈｅＧｒｏｕｐのメンバーのＧｅｎｅｎｔｅｃｈから、リツキサン（登録商標）として入手可能）は、モノクローナルＩｇＧ１治療抗体で、ＣＤ２０^＋Ｂ細胞を選択的に標的とする（Ｈａｕｓｅｒ ｅｔ ａｌ．、再発寛解型多発性硬化症におけるリツキシマブによるＢ細胞枯渇（Ｂ−ｃｅｌｌ ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｒｉｔｕｘｉｍａｂ ｉｎ ｒｅｌａｐｓｉｎｇ−ｒｅｍｉｔｔｉｎｇ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、ＮＥＪＭ ３５８：６７６−８８（２００８））。提案されたリツキシマブの作用機序の１つは、ＡＤＣＣである。本明細書実施例１に記載される、ＫＷ−０７６１用に開発された標的結合アッセイ形式を、：（ｉ）上記実施例１、ステップ＃２（ａ）〜（ｂ）のＫＷ−０７６１を同等量のリツキシマブで置き換え；（ｉｉ）実施例１、ステップ＃２（ｂ）のウサギ抗ＫＷ−０７６１抗体を同等量のウサギ抗リツキシマブ抗体で置き換え；さらに（ｉｉｉ） 上記実施例１、ステップ＃２（ｃ）のビオチン化ＣＣＲ４ペプチドコンジュゲートを同等量のビオチン化ＣＤ２０ペプチドコンジュゲート（例えば、ＭＢＴ４７３６：（ビオチン）−［Ａｈｘ］ＫＧＧＹＮＣＥＰＡＮＰＳＥＫＮＳＰＳＴＱＹＣＹＳＩＱＳＬ／／配列番号７；またはＭＢＴ４７３７：ＹＮＣＥＰＡＮＰＳＥＫＮＳＰＳＴＱＹＣＹＳＩＱＳＬＫ［Ａｈｘ］Ｋ（ビオチン）ＮＨ_２／／配列番号８；両方とも、ＭｉｄｗｅｓｔＢｉｏ−ＴｅｃｈＩｎｃ．から購入；他の実施形態では、（ビオチン）ＫＧＧＹＮＣＥＰＡＮＰＳＥＫＮＳＰＳＴＱＹＣＹＳＩＱＳＬ／／配列番号５またはＹＮＣＥＰＡＮＰＳＥＫＮＳＰＳＴＱＹＣＹＳＩＱＳＬＫＫ（ビオチン）／／配列番号６が代わりに使用された。これらは、従来の化学技術により合成、ビオチン化された）で置き換えることにより、ＦｃドメインにＣＤ１６ａ結合部位を持つリツキシマブに適用できる。実施例１（＃３〜７）の全ての他のステップは、実質的な変更なしに直接適用できる。
実験は、実施例１で記載のものと同じアッセイ形式で行ったが、以下の点で変更した：ヒト血清試料を添加せず、要求された全てのＰＨＳをアッセイ緩衝液（ＤＰＢＳ［ｐＨ７．１±０．１］＋１％［ｖ／ｖ］ウシ血清アルブミン）で置換し、アッセイ緩衝液で希釈したＰＨＳ含有「Ｎ」対照を加えず、抗リツキシマブ抗体を含む「Ｐ」対照を加えず、さらに「Ｄ」対照を、アッセイ法でのリツキシマブの滴定を可能とするように複数の濃度のリツキシマブで試験した（図５参照）。ポリヒスチジンタグ組換え型ヒトＦＣγＲＩＩＩａ／ＣＤ１６ａを添加し、ストレプトアビジンコートプレートに捕捉されたビオチン−ＣＤ２０ペプチド（配列番号７または配列番号８）／リツキシマブ複合体に結合させた（実施例１、ステップ＃１を参照）。本発明の選別アッセイを、本明細書実施例１のように、全ての他の観点でさらに実施した。簡単に説明すると、実施例１で記載のように、抗ポリヒスチジンモノクローナル抗体の添加によりＥＣＬシグナルが生成され、続けて、Ｓｕｌｆｏ−ＴＡＧ（登録商標）−標識ヤギ抗マウス抗体およびＲｅａｄ Ｂｕｆｆｅｒ Ｔを添加し、シグナルをＳＥＣＴＯＲ（登録商標）Ｉｍａｇｅｒ６０００リーダー（「ＭＳＤ６０００」；Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）で検出した。図５は代表的実験データであり、リツキシマブが、ビオチン化ＣＤ２０ペプチド複合体に結合し、実施例１での記載と同じであるが、この実施例３で記載のように修正したアッセイ形式を使って、用量依存的に検出可能であったことを示す。

Claims (38)

1. インビトロアッセイ方法であって、
   ポリヒスチジンタグ組換え型ヒトＣＤ１６ａポリペプチドに結合したポリヒスチジンに特異的に結合するいずれかの抗体を、生理学的条件下の検出を可能にする新鮮な緩衝液の存在下、シグナルの測定によって、アビジンコートウエルの中で検出することを含み、ここで、前記アビジンコートウエルは前もってブロックされており、その後プレインキュベート反応混合物が、生理学的条件下、ブロックされたアビジンコートウエルにおいてインキュベートされ、ここで、前記プレインキュベート反応混合物はプレインキュベーション中に血清含有水性アッセイ緩衝液の中に懸濁されており、およびプレインキュベート反応混合物は：
   （ｉ） ＣＤ１６ａ結合部位を有するＦｃドメインを含む標的抗原結合タンパク質；および
   （ｉｉ） 標的抗原結合タンパク質が特異的に結合する、対象標的タンパク質のビオチン化ポリペプチド部を含み；および
   プレインキュベート反応混合物のアビジンコートウエル中でのインキュベーション後、新鮮なアッセイ緩衝液中に懸濁されたポリヒスチジンタグ組換え型ヒトＣＤ１６ａポリペプチドが、生理学的条件下、アビジンコートウエルのアビジンに結合したビオチン化ポリペプチド部に結合したいずれかの標的抗原結合タンパク質と一緒にインキュベートされ；および
   シグナルの測定による検出の前に、新鮮なアッセイ緩衝液中で懸濁されたポリヒスチジンに特異的に結合する抗体が、標的抗原結合タンパク質に結合したいずれかのポリヒスチジンタグ組換え型ヒトＣＤ１６ａポリペプチドと一緒に、生理学的条件下、ウエル中でインキュベートされる、方法。
2. 請求項１に記載の方法であって、ポリヒスチジンに特異的に結合する抗体を検出する前に、生理学的条件下、新鮮なアッセイ緩衝液中に懸濁した、複合体化されたシグナル生成標識を含む抗体を、ウエル中でインキュベートするステップをさらに含み、ここで、前記抗体はポリヒスチジンに特異的に結合する抗体に特異的に結合する、方法。
3. プレインキュベート反応混合物が、中和抗体の存在について試験する血清試料をさらに含む、請求項１に記載の方法。
4. 標的抗原結合タンパク質が、ＩｇＧ１またはＩｇＧ３抗体である、請求項１に記載の方法。
5. 対象標的タンパク質が、ＣＣＲ４である、請求項１に記載の方法。
6. 対象標的タンパク質が、ＣＤ２０である、請求項１に記載の方法。
7. 対象標的タンパク質が、ＨＥＲ２である、請求項１に記載の方法。
8. アビジンがス、トレプトアビジンである、請求項１に記載の方法。
9. ポリヒスチジンに特異的に結合する抗体が、複合体化されたシグナル生成標識をさらに含む、請求項１に記載の方法。
10. シグナル生成標識が、蛍光標識、同位体標識、電気化学発光標識、または酵素を含む、請求項８に記載の方法。
11. インビトロアッセイ方法であって、
    （ａ）ブロックされたアビジンコートウエル中で、生理学的条件下、血清含有水性アッセイ緩衝液中に懸濁したプレインキュベート反応混合物をインキュベートすること；
    ここで、プレインキュベート反応混合物は、
    （ｉｉｉ） ＣＤ１６ａ結合部位を有するＦｃドメインを含むＩｇＧ標的抗体；および
    （ｉｖ） ＩｇＧ標的抗体が特異的に結合する、対象標的タンパク質のビオチン化ポリペプチド部を含み；
    （ｂ） 生理学的条件下、ウエル中で、新鮮なアッセイ緩衝液中に懸濁されたポリヒスチジンタグ組換え型ヒトＣＤ１６ａポリペプチドを、（ａ）のアビジンに結合したビオチン化ポリペプチド部に結合したいずれかのＩｇＧ標的抗体と一緒に、インキュベートすること；
    （ｃ） 生理学的条件下、ウエル中で、新鮮なアッセイ緩衝液中で懸濁されたポリヒスチジンに特異的に結合する抗体を、（ｂ）のＩｇＧ標的抗体に結合したいずれかのポリヒスチジンタグ組換え型ヒトＣＤ１６ａポリペプチドと一緒に、インキュベートすること；および
    （ｄ） 生理学的条件下、検出を可能とする新鮮な緩衝液の存在下のウエル中で、シグナルを測定することにより、（ｃ）のポリヒスチジンタグ組換え型ヒトＣＤ１６ａポリペプチドに結合したポリヒスチジンに特異的に結合するいずれかの抗体を検出すること；
    を含む、方法。
12. プレインキュベート反応混合物が、中和抗体の存在について試験する血清試料をさらに含む、請求項１１に記載の方法。
13. ＩｇＧ標的抗体が、ＩｇＧ１またはＩｇＧ３抗体である、請求項１１に記載の方法。
14. 対象標的タンパク質が、ＣＣＲ４である、請求項１１に記載の方法。
15. 対象標的タンパク質が、ＣＤ２０である、請求項１１に記載の方法。
16. 対象標的タンパク質が、ＨＥＲ２である、請求項１１に記載の方法。
17. アビジンが、ストレプトアビジンである、請求項１１に記載の方法。
18. ポリヒスチジンに特異的に結合する抗体が、複合体化されたシグナル生成標識をさらに含む、請求項１１に記載の方法。
19. シグナル生成標識が、蛍光標識、同位体標識、電気化学発光標識、または酵素を含む、請求項１８に記載の方法。
20. 請求項１１に記載の方法であって、ステップ（ｄ）の前に、ウエル中で、生理学的条件下、複合体化されたシグナル生成標識を含む抗体を、新鮮なアッセイ緩衝液中で懸濁して、インキュベートすることをさらに含み、ここで、前記抗体は（ｃ）のポリヒスチジンに特異的に結合する抗体に特異的に結合する、方法。
21. シグナル生成標識が、電気化学発光標識を含む、請求項２０に記載の方法。
22. 電気化学発光標識が、ルテニウム錯体を含む、請求項２１に記載の方法。
23. 電気化学発光標識が、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルから形成される、請求項２２に記載の方法。
24. Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルが、化学構造：
    

    

    を有する、請求項２３に記載の方法。
25. 電気化学発光標識が、以下の式を有するルテニウム錯体を含み、カルボニル基から引いた線が、残りの分子への結合を示す請求項２２に記載の方法。
    

    
26. シグナル生成標識が、蛍光標識、同位体標識、または酵素を含む、請求項２０に記載の方法。
27. ＩｇＧ標的抗体が、モガムリズマブである、請求項１４に記載の方法。
28. ＩｇＧ標的抗体が、リツキシマブである、請求項１５に記載の方法。
29. ＩｇＧ標的抗体が、トラスツズマブである、請求項１６に記載の方法。
30. インビトロアッセイ方法であって、
    （ａ） 生理学的条件下、ブロックされたアビジンコートウエル中で、血清含有水性アッセイ緩衝液中に懸濁されたプレインキュベート反応混合物をインキュベートすること；ここで、
    プレインキュベート反応混合物は、
    （ｉ） ＣＤ１６ａ結合部位を有するＦｃドメインを含む、ヒトＣＣＲ４に対するＩｇＧ標的抗体；
    （ｉｉ） 中和抗体の存在について試験する血清試料；および
    （ｉｉｉ） ＩｇＧ標的抗体が特異的に結合するヒトＣＣＲ４のビオチン化ポリペプチド部を含み；
    （ｂ） 生理学的条件下、ウエル中で、新鮮なアッセイ緩衝液中に懸濁されたポリヒスチジンタグ組換え型ヒトＣＤ１６ａポリペプチドを、（ａ）のアビジンに結合したヒトＣＣＲ４のビオチン化ポリペプチド部に結合したいずれかのＩｇＧ標的抗体と一緒に、インキュベートすること；
    （ｃ） 生理学的条件下、ウエル中で、新鮮なアッセイ緩衝液中に懸濁されたポリヒスチジンに特異的に結合する抗体を、（ｂ）のＩｇＧ標的抗体に結合したいずれかのポリヒスチジンタグ組換え型ヒトＣＤ１６ａポリペプチドと一緒に、インキュベートすること；
    （ｄ） 生理学的条件下、ウエル中で、新鮮なアッセイ緩衝液中に懸濁された複合体化されたシグナル生成標識を含む抗体をインキュベートすること、ここで、前記抗体は（ｃ）のポリヒスチジンの特異的に結合する抗体に特異的に結合し；および
    （ｅ） 生理学的条件下、検出を可能にする新鮮な緩衝液の存在下、ウエル中で、産生された全てのシグナルを検出すること；
    を含む、方法。
31. シグナル生成標識が、電気化学発光標識を含む、請求項３０に記載の方法。
32. 電気化学発光標識が、ルテニウム錯体を含む、請求項３１に記載の方法。
33. 電気化学発光標識が、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルから生成される、請求項３２に記載の方法。
34. Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルが、化学構造：
    

    

    を有する、請求項３３に記載の方法。
35. 電気化学発光標識が、下記の式を有するルテニウム錯体を含み、カルボニル基から引いた線が、残りの分子への結合を示す、請求項３２に記載の方法。
    

    
36. シグナル生成標識が、蛍光標識、同位体標識、または酵素を含む、請求項３０に記載の方法。
37. アビジンが、ストレプトアビジンである、請求項３０に記載の方法。
38. ＩｇＧ標的抗体が、モガムリズマブである、請求項３０に記載の方法。

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