KR20130097747A - 표적 항체에 대한 중화 항체의 검출을 위한 이중 기능 시험관내 표적 결합 분석평가 - Google Patents

표적 항체에 대한 중화 항체의 검출을 위한 이중 기능 시험관내 표적 결합 분석평가 Download PDF

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Abstract

시험관내 분석평가 방법이 개시된다. 이러한 비-세포-기초된 이중 기능 표적 결합 분석평가는 생물학적 샘플 (가령, 혈청 샘플) 내에 IgG 표적 항체, 예를 들면, 생물학적 약물 및 IgG 표적 항체에 대한 중화 항체 (NAb)의 존재 둘 모두를 검출하는데 유용하다.

Description

표적 항체에 대한 중화 항체의 검출을 위한 이중 기능 시험관내 표적 결합 분석평가{DUAL FUNCTION IN VITRO TARGET BINDING ASSAY FOR THE DETECTION OF NEUTRALIZING ANTIBODIES AGAINST TARGET ANTIBODIES}
본 출원은 37 C.F.R. Section 1.821(c)과 1.821(e)에 의해 요구되는 컴퓨터 판독가능 형태 (CRF) 및 종이 사본 둘 모두로서 역할하고, 그리고 본 발명에 전체로서 참고문헌으로 편입되는, 2010년 8월 10일자에 EFS-WEB를 통해 제출된 ASCII "txt" 준수 서열 목록을 내포한다. 2010년 8월 10일자에 작성된 "txt" 파일의 명칭은 A1586US PSP-SeqList081010_ST25.txt이고, 그리고 25 kb 크기를 갖는다.
본 출원 전반에서, 다양한 간행물은 괄호 또는 꺽쇠괄호 내에 인용된다. 이들 간행물의 내용은 본 발명이 속하는 분야의 최신 기술을 더욱 충실하게 설명하기 위해, 본 출원에 전체로서 참고문헌으로 편입된다.
발명의 배경
본 발명의 분야
본 발명은 치료 항체의 분야에 관계한다.
관련된 선행 기술에 관한 논의
항체-의존성 세포-매개된 세포독성 (ADCC)은 체액 면역 반응의 기전 중에서 한 가지이다. ADCC 반응에서, 면역계의 효과기 세포, 전형적으로 자연 킬러 (NK) 세포는 표적 세포의 표면 상에서 표적 단백질에 결합한 특이적 항체에 의해 결합되는 표적 세포를 능동적으로 용해시킨다. 호중구와 호산구 역시 ADCC를 매개할 수 있다. 가령, 호산구는 ADCC를 통해, 기생충으로서 공지된 일정한 기생성 벌레를 죽일 수 있다.
다양한 IgG 아이소타입의 항체가 일부 ADCC 활성을 갖는 것으로 보고되었지만, 전형적으로, IgG1과 IgG3 아이소타입은 유의미한 항체-의존성 세포 세포독성 (ADCC) 활성을 갖는 것으로 특징된다. 한 연구에서, IgG1과 IgG3 항체 둘 모두 단핵구 또는 활성화된 U937 세포 ADCC를 매개하는데 동등하게 유효한 것으로 보고되었다; IgG1은 NK-세포 매개된 ADCC에서 IgG3보다 높은 활성을 가졌다 (Rozsnyay et al., Distinctive role of IgG1 and IgG3 isotypes in Fc gamma R-mediated functions, Immunology 66(4): 491-498 (1989)). IgG3-감작화된 적혈구는 보고된 바에 따르면, IgG1-유도된 용해를 저해하였는데, 이것은 각 하위부류가 동일한 Fc 감마 R 수용체를 이용하지만, 이러한 용해가 IgG3 분자에 의해 전달될 수 없는 추가의 '신호'를 필요로 한다는 것을 암시한다. (Rozsnyay et al., ibid.). FcγRIIIa (CD16a)는 ADCC 효과기 기능을 위한 관련 수용체로서 확인되었다.
여러 연구에서 인간 IgG1 항체의 다당류로부터 푸코스 제거는 FcγRIIIa에 향상된 IgG1 결합에 의해 항체-의존성 세포 세포독성 (ADCC)의 유의미한 증강을 유발하고, 그리고 NK 세포의 효과적인 동원과 활성화에 의해 ADCC 유도에 요구되는 항원 밀도를 감소시킬 수 있는 것으로 드러났다. (Niwa et al., Enhanced Natural Killer Cell Binding and Activation by Low-Fucose IgG1 Antibody Results in Potent Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity Induction at Lower Antigen Density, Clinical Cancer Research 11: 2327 (2005); Satoh et al., Non-fucosylated therapeutic antibodies as next-generation therapeutic antibodies, Expert Opinion on Biological Therapy 6(11):1161-1173 (2006)). 이러한 현상은 치료 항체에서 특히 유용할 수 있다. 치료 단일클론성 항체, 예를 들면, 리툭시맙 (Rituxan®)과 트라스투주맙 (Herceptin®)은 신생물 및/또는 자가면역 질환의 치료에서 폭넓게 이용된다. (Stavenhagen et al., Fc Optimization of Therapeutic Antibodies Enhances Their Ability to Kill Tumor Cells In vitro and Controls Tumor Expansion In vivo via Low-Affinity Activating Fcγ Receptors, Cancer Research 67(18):8882-90 (2007); Clynes, RA et al., Inhibitory Fc receptors modulate in vivo cytoxicity against tumor targets, Nat Med 6 (4): 443-46 (2000); Hauser et al., B-cell depletion with rituximab in relapsing-remitting multiple sclerosis, NEJM 358:676-88 (2008)).
KW-0761 (일명, "모가물리주맙" 또는 "AMG 761")은 피부 T-세포 림프종 (CTCL) 또는 말초 T-세포 림프종 (PTCL)을 앓는 환자의 치료를 위해 개발되고 있다. KW-0761은 CC 케모킨 수용체 4 (CCR4) 발현 세포를 표적으로 하고 ADCC를 통해 CCR4를 발현하는 T-림프구를 고갈시키는 능력을 나타내는 면역글로불린 G, 하위부류 1 (IgG1) 카파 아이소타입의 인간화된 단일클론성 항체이다. KW-0761은 불변 (Fc) 영역에서 복합체-유형 다당류로부터 탈푸코실화 (defucosylation)로 인하여 증강된 ADCC 활성을 갖는다. (Ishii et al., Defucosylated Humanized Anti-CCR4 Monoclonal Antibody KW-0761 as a Novel Immunotherapeutic Agent for Adult T-cell Leukemia/Lymphoma, Clinical Cancer Research 16: 1520-31 (2010); Shitara et al., Human CDR-grafted antibody and antibody fragment thereof, US Patent No. 7,504,104).
중화 항체, 또는 NAb는 특정한 항원, 전형적으로 이의 생체내 합성을 유도하는 항원, 그리고 유사한 분자와 반응하는 면역글로불린 분자이다. 중화 항체는 응집소, 용균소, 용혈소, 옵소닌, 또는 침강소로서 작용 양식에 따라 분류된다. 항체는 세포-표면 수용체에 항원의 결합에 의해 활성화된 B 림프구에 의해 합성되고, 그리고 중화 항체는 예로써, 병원체의 표면 상에 존재할지도 모르는 항원의 생물학적 효과를 소멸시키거나 "중화"시킬 수 있다. 유감스럽게도, 치료 항체는 때때로, 일부 환자에서 NAb의 생산 역시 유도할 수 있고, 그리고 임상적 안전을 위하여, 치료 항체 약물이 제공되는 환자의 혈청에서 치료 항체를 지향하는 NAb의 출현을 모니터링할 수 있는 것이 중요하다.
환자의 혈청에서 ADCC를 유도할 수 있는 이런 치료 IgG 항체를 검출하고, 또한 이런 치료 항체에 대한 NAb를 검출하기 위한 신뢰성 있는 비-세포-기초된, 시험관내 분석평가 방법은 본 발명이 제공하는 바람직한 이점이다.
발명의 요약
본 발명은 시험관내 이중 기능 표적 결합 분석평가에 관계하고, 이것은 생물학적 샘플 (가령, 혈청 샘플) 내에 IgG 표적 항체, 예를 들면, 생물학적 약물 및 IgG 표적 항체에 대한 중화 항체 (NAb)의 존재 둘 모두를 검출하는데 유용하다.
한 구체예에서, 본 발명의 시험관내 분석평가 방법은 아비딘-코팅된 웰 내에서 신호를 측정함에 의해, 생리학적 조건 하에 검출을 허용하는 새로운 용적의 완충액의 존재에서, 폴리히스티딘-태그된 재조합 인간 CD16a 폴리펩티드에 결합한 폴리히스티딘에 특이적으로 결합하는 임의의 항체를 검출하는 단계, 여기서 아비딘-코팅된 웰은 미리 차단되었고 차후에, 전배양된 반응 혼합물은 생리학적 조건 하에 차단된 아비딘-코팅된 웰 내에서 배양되었고, 여기서 전배양된 반응 혼합물은 수성 혈청-내포 분석평가 완충액에서 전배양 동안 현탁되었고, 그리고 전배양된 반응 혼합물은 하기를 포함하고:
(i) CD16a 결합 부위를 갖는 Fc 도메인을 포함하는 표적 항원 결합 단백질; 그리고
(ii) 관심되는 표적 단백질의 비오틴화된 폴리펩티드 부분, 상기 폴리펩티드 부분에 표적 항원 결합 단백질이 특이적으로 결합하고; 그리고
여기서, 아비딘-코팅된 웰 내에서 전배양된 반응 혼합물의 배양 이후에, 새로운 용적의 분석평가 완충액에 현탁된 폴리히스티딘-태그된 재조합 인간 CD16a 폴리펩티드는 아비딘-코팅된 웰의 아비딘에 결합된 비오틴화된 폴리펩티드 부분에 결합된 임의의 표적 항원 결합 단백질과 함께, 생리학적 조건 하에 배양되었고; 그리고 여기서, 신호를 측정함에 의해 검출하기 이전에, 새로운 용적의 분석평가 완충액에 현탁된, 폴리히스티딘에 특이적으로 결합하는 항체는 표적 항원 결합 단백질에 결합된 임의의 폴리히스티딘-태그된 재조합 인간 CD16a 폴리펩티드와 함께, 생리학적 조건 하에 웰 내에서 배양되었다.
상기 방법의 일부 구체예는 폴리히스티딘에 특이적으로 결합하는 항체를 검출하기 이전에, 생리학적 조건 하에 웰 내에서, 새로운 용적의 분석평가 완충액에 현탁된, 접합된 신호-발생 라벨을 포함하는 항체를 배양하는 단계를 더욱 포함하고, 여기서 상기 항체는 폴리히스티딘에 특이적으로 결합하는 항체에 특이적으로 결합한다.
특정 구체예에서, 본 발명의 시험관내 분석평가 방법은 하기 단계를 포함한다:
(a) 생리학적 조건 하에 차단된 아비딘-코팅된 웰 내에서, 수성 혈청-내포 분석평가 완충액에 현탁된 전배양된 반응 혼합물을 배양하는 단계, 상기 전배양된 반응 혼합물은 하기를 포함하고:
(i) CD16a 결합 부위를 갖는 Fc 도메인을 포함하는 IgG 표적 항체; 그리고
(ii) 관심되는 표적 단백질의 비오틴화된 폴리펩티드 부분, 상기 폴리펩티드 부분에 IgG 표적 항체가 특이적으로 결합하고;
(b) 생리학적 조건 하에 웰 내에서, (a)에서 아비딘에 결합된 비오틴화된 폴리펩티드 부분에 결합된 임의의 IgG 표적 항체와 함께, 새로운 용적의 분석평가 완충액에 현탁된 폴리히스티딘-태그된 재조합 인간 CD16a 폴리펩티드를 배양하는 단계;
(c) 생리학적 조건 하에 웰 내에서, (b)에서 IgG 표적 항체에 결합된 임의의 폴리히스티딘-태그된 재조합 인간 CD16a 폴리펩티드와 함께, 폴리히스티딘에 특이적으로 결합하는 항체를 배양하는 단계, 상기 항체는 새로운 용적의 분석평가 완충액에 현탁되고; 그리고
(d) 생리학적 조건 하에 검출을 허용하는 새로운 용적의 완충액의 존재에서 웰 내에서, (c)에서 폴리히스티딘-태그된 재조합 인간 CD16a 폴리펩티드에 결합된 폴리히스티딘에 특이적으로 결합하는 임의의 항체를, 신호를 측정함에 의해 검출하는 단계.
본 발명의 일부 구체예에서, 상기 방법은 단계 (d) 이전에, 생리학적 조건 하에 웰 내에서, 새로운 용적의 분석평가 완충액에 현탁된, 접합된 신호-발생 라벨을 포함하는 항체를 배양하는 단계를 더욱 포함하고, 여기서 상기 항체는 (c)에서 폴리히스티딘에 특이적으로 결합하는 항체에 특이적으로 결합한다.
다른 유용한 구체예에서, 시험관내 분석평가 방법은 하기 단계를 포함한다:
(a) 생리학적 조건 하에 차단된 아비딘-코팅된 웰 내에서, 수성 혈청-내포 분석평가 완충액에 현탁된 전배양된 반응 혼합물을 배양하는 단계, 상기 전배양된 반응 혼합물은 하기를 포함하고:
(i) CD16a 결합 부위를 갖는 Fc 도메인을 포함하는 인간 CCR4에 대한 IgG 표적 항체;
(ii) 중화 항체의 존재에 대해 조사되는 혈청 샘플; 그리고
(iii) 인간 CCR4의 비오틴화된 폴리펩티드 부분, 상기 폴리펩티드 부분에 IgG 표적 항체가 특이적으로 결합하고;
(b) 생리학적 조건 하에 웰 내에서, (a)에서 아비딘에 결합된 인간 CCR4의 비오틴화된 폴리펩티드 부분에 결합된 임의의 IgG 표적 항체와 함께, 새로운 용적의 분석평가 완충액에 현탁된 폴리히스티딘-태그된 재조합 인간 CD16a 폴리펩티드를 배양하는 단계;
(c) 생리학적 조건 하에 웰 내에서, (b)에서 IgG 표적 항체에 결합된 임의의 폴리히스티딘-태그된 재조합 인간 CD16a 폴리펩티드와 함께, 폴리히스티딘에 특이적으로 결합하는 항체를 배양하는 단계, 상기 항체는 새로운 용적의 분석평가 완충액에 현탁되고;
(d) 생리학적 조건 하에 웰 내에서, 새로운 용적의 분석평가 완충액에 현탁된, 접합된 신호-발생 라벨을 포함하는 항체를 배양하는 단계, 여기서 상기 항체는 (c)에서 폴리히스티딘에 특이적으로 결합하는 항체에 특이적으로 결합하고; 그리고
(e) 생리학적 조건 하에 검출을 허용하는 새로운 용적의 완충액의 존재에서 웰 내에서, 임의의 발생된 신호를 검출하는 단계.
본 발명의 다양한 구체예에서, 신호는 민감성 전기화학발광 (ECL) 표지화 시스템에 의해 발생될 수 있긴 하지만, 형광 라벨 (가령, 플루오레세인, 피코에리트린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, 녹색 형광 단백질 [GFP], 증강된 GFP [eGFP], 황색 형광 단백질 [YFP], 청록색 형광 단백질 [CFP] 등), 동위원소 라벨 (가령, 125I, 14C, 13C, 35S, 3H, 2H, 13N, 15N, 18O, 17O 등), 또는 효소-연결된 (가령, 양고추냉이 과산화효소-, 베타-갈락토시다아제-, 또는 루시페라아제-기초된) 표지화 시스템 역시 유용한 구체예이다. 신호는 적절한 기구를 이용하여 검출된다.
생물학적 샘플이 IgG1 표적 항체에 대한 중화 항체를 내포하면, 표적 항체는 아비딘-코팅된 고형 기질 상에 포획되는 관심되는 비오틴화된 표적 펩티드에 결합할 수 없을 것이다. 이런 이유로, 낮은 (가령, ECL) 신호는 NAb의 존재에서 산출된다. NAb의 부재에서, 높은 (가령, ECL) 신호가 산출되는데, 그 이유는 IgG1 표적 항체가 비오틴화된 표적 펩티드와 폴리히스티딘-태그된 재조합 인간 FCγRIIIa (CD16a) 사이에 가교를 구축할 수 있기 때문이다.
본 발명의 다수의 추가적인 측면과 이점은 본 발명의 도면과 상세한 설명을 고려하면 명백할 것이다.
구체예의 상세한 설명
본 명세서에서 이용된 섹션 머리말 (section heading)은 단지 편제를 목적으로 하고 본 발명의 요부를 한정하는 것으로 간주되지 않는다.
정의
본 명세서에서 달리 정의되지 않으면, 본 출원과 관련하여 이용된 과학 용어와 기술 용어는 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 의미를 갖는다. 게다가, 문장에서 달리 요구되지 않으면, 단수 용어는 복수를 포함할 것이고, 그리고 복수 용어는 단수를 포함할 것이다. 따라서 본 명세서 및 첨부된 청구항에서 이용된 바와 같이, 단수 형태는 문맥에서 달리 명시되지 않으면, 복수 참고물을 포함한다. 가령, "단백질"에 대한 언급은 복수의 단백질을 포함한다; "세포"에 대한 언급은 복수의 세포의 집단을 포함한다.
"폴리펩티드" 및 "단백질"은 본 명세서에서 교체가능하게 이용되고, 그리고 펩티드 결합을 통해 공유 연결된 2개 또는 그 이상의 아미노산의 분자 사슬을 포함한다. 이들 용어는 특정 길이의 산물을 지칭하지 않는다. 따라서 "펩티드" 및 "올리고펩티드"는 폴리펩티드의 정의 내에 포함된다. 이들 용어는 폴리펩티드의 번역후 변형, 예를 들면, 글리코실화, 아세틸화, 인산화 등을 포함한다. 이에 더하여, 단백질 단편, 유사체, 돌연변이되거나 변이된 단백질, 융합 단백질 등은 폴리펩티드의 의미 내에 포함된다. 이들 용어는 또한, 하나 또는 그 이상의 아미노산 유사체 또는 비-정규 또는 비자연 아미노산을 포함하거나, 또는 공지된 단백질 조작 기술을 이용하여 재조합 방식으로 발현될 수 있는 분자를 포함한다. 이에 더하여, 융합 단백질은 널리 공지된 유기 화학 기술에 의해 본 명세서에서 기술된 바와 같이 유도체화될 수 있다.
언급된 용어 "단리된 단백질"은 대상 단백질이 (1) 자연에서 정상적으로 발견되는 적어도 일부의 다른 단백질이 없고, (2) 동일한 공급원, 예를 들면, 동일한 종으로부터 다른 단백질이 실질적으로 없고, (3) 이종기원성 종 또는 종류의 세포에 의해 재조합 방식으로 발현되고, (4) 적어도 약 50 퍼센트의 폴리뉴클레오티드, 지질, 탄수화물, 또는 자연에서 결합되는 기타 물질로부터 분리되고, (5) 자연에서 연관되지 않는 폴리펩티드와 작동가능하게 결합되고 (공유 또는 비공유 상호작용에 의해), 및/또는 (6) 자연에서 발생하지 않는다는 것을 의미한다. 전형적으로, "단리된 단백질"은 소정의 샘플의 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 25%, 또는 적어도 약 50%를 구성한다. 합성 기원의 게놈 DNA, cDNA, mRNA 또는 기타 RNA, 또는 이들의 임의의 조합은 이런 단리된 단백질을 인코딩할 수 있다. 바람직하게는, 단리된 단백질은 이의 치료, 진단, 예방, 연구 또는 기타 용도를 간섭하는, 자연 환경에서 발견되는 단백질 또는 폴리펩티드 또는 기타 오염물질이 실질적으로 없다.
본 명세서에서 임의의 폴리펩티드 또는 단백질뿐만 아니라 변이체를 더욱 기술함에 있어서, 1-문자 약어 시스템이 자연 발생 펩티드와 단백질 내로 일반적으로 함입되는 20개 "정규" 아미노산 잔기의 정체를 명명하는데 빈번하게 적용된다 (표 1). 이런 1-문자 약어는 의미에서, 3-문자 약어, 또는 비-단축된 아미노산 명칭과 완전히 교체가능하다.
정규 아미노산에 대한 1-문자 약어. 3-문자 약어는 괄호 안에 있다.
알라닌 (Ala) A
글루타민 (Gln) Q
류신 (Leu) L
세린 (Ser) S
아르기닌 (Arg) R
글루타민산 (Glu) E
리신 (Lys) K
트레오닌 (Thr) T
아스파라긴 (Asn) N
글리신 (Gly) G
메티오닌 (Met) M
트립토판 (Trp) W
아스파르트산 (Asp) D
히스티딘 (His) H
페닐알라닌 (Phe) F
티로신 (Tyr) Y
시스테인 (Cys) C
이소류신 (Ile) I
프롤린 (Pro) P
발린 (Val) V
아미노산 서열에서 아미노산 치환은 본 명세서에서 전형적으로, 특정 위치에서 아미노산 잔기에 대한 1-문자 약어, 그 이후에 관심되는 본래 서열과 관련하여 숫자로 나타낸 아미노산 위치, 그 이후에 치환되어 들어가는 아미노산 잔기에 대한 1-문자 기호로 명명된다. 가령, "T30D"는 관심되는 본래 서열과 관련하여, 아미노산 위치 30에서 아스파르트산염 잔기에 의한 트레오닌 잔기의 치환을 상징한다. 다른 실례, "W101F"는 관심되는 본래 서열과 관련하여, 아미노산 위치 101에서 페닐알라닌 잔기에 의한 트립토판 잔기의 치환을 상징한다. 비-정규 아미노산 잔기는 재조합 방식으로 발현하는 세포를 이용하는 단백질 조작의 공지된 기술을 이용함으로써, 본 발명의 범위 내에서 펩티드 내로 함입될 수 있다 (예로써, Link et al., Non-canonical amino acids in protein engineering, Current Opinion in Biotechnology, 14(6):603-609 (2003)을 참조한다). 용어 "비-정규 아미노산 잔기"는 자연 발생 단백질 내로 일반적으로 함입되는 20개 정규 아미노산에 속하지 않는 D- 또는 L-형태의 아미노산 잔기, 예를 들면, β-아미노산, 호모아미노산, 환형 아미노산 및 유도체화된 측쇄를 갖는 아미노산을 지칭한다. 실례에는 (L-형태 또는 D-형태에서) β-알라닌, β-아미노프로피온산, 피페리딘산, 아미노카프론산, 아미노헵탄산, 아미노피멜린산, 데스모신, 디아미노피멜린산, N α -에틸글리신, N α -에틸아스파라긴, 히드록시리신, 알로-히드록시리신, 이소데스모신, 알로-이소류신, ω-메틸아르기닌, N α -메틸글리신, N α -메틸이소류신, N α -메틸발린, γ-카르복시글루타민산염, ε-N,N,N-트리메틸리신, ε-N-아세틸리신, O-포스포세린, N α -아세틸세린, N α -포르밀메티오닌, 3-메틸히스티딘, 5-히드록시리신, 그리고 기타 유사한 아미노산, 그리고 하기 표 2에서 열거된 것들, 그리고 본 명세서에서 기술된 것들의 유도체화된 형태가 포함된다. 비록 당업자가 상이한 약어와 명명법이 동일한 물질에 적용될 수 있고 본 명세서에서 교체가능하게 나타난다는 것을 이해할 것이지만, 표 2는 본 발명에 따라 유용한 일부 예시적인 비-정규 아미노산 잔기 및 본 명세서에서 전형적으로 이용되는 연관된 약어를 내포한다.
본 발명에 따라서 펩티드 서열 내로 아미노산 부가, 삽입, 또는 치환에 유용한 비-정규 아미노산. 표 2에 열거된 약어가 본 명세서의 다른 부분에서 개시된 동일한 물질에 대한 다른 약어와 상이한 경우에, 양쪽 약어 모두 적용가능한 것으로 이해된다. 표 2에 열거된 아미노산은 L-형태 또는 D-형태일 수 있다.
아미노산 약어(들)
아세트아미도메틸 Acm
아세틸아르기닌 acetylarg
α-아미노아디프산 Aad
아미노부티르산 Abu
6-아미노헥사노익산 Ahx; εAhx
3-아미노-6-히드록시-2-피페리돈 Ahp
2-아미노인단-2-카르복실산 Aic
α-아미노-이소부티르산 Aib
3-아미노-2-나프토산 Anc
2-아미노테트랄린-2-카르복실산 Atc
아미노페닐알라닌 Aminophe; 아미노-Phe
4-아미노-페닐알라닌 4AmP
4-아미디노-페닐알라닌 4AmPhe
2-아미노-2-(1-카르바미미도일 피페리딘-4-일)아세트산 4AmPig
ArgΨ (CH2NH)-환원된 아미드 결합 rArg
β-호모아르기닌 bhArg
β-호모리신 bhomoK
β-호모 Tic BhTic
β-호모페닐알라닌 BhPhe
β-호모프롤린 BhPro
β-호모트립토판 BhTrp
4,4'-비페닐알라닌 Bip
β,β-디페닐-알라닌 BiPhA
β-페닐알라닌 BPhe
p-카르복실-페닐알라닌 Cpa
시트룰린 Cit
시클로헥실알라닌 Cha
시클로헥실글리신 Chg
시클로펜틸글리신 Cpg
2-아미노-3-구아니디노프로파노산 3G-Dpr
α,γ-디아미노부티르산 Dab
2,4-디아미노부티르산 Dbu
디아미노프로피온산 Dap
α,β-디아미노프로피온산 (또는 2,3-디아미노프로피온산 Dpr
3,3-디페닐알라닌 Dip
4-구아니디노 페닐알라닌 Guf
4-구아니디노 프롤린 4GuaPr
호모아르기닌 hArg; hR
호모시트룰린 hCit
호모글루타민 hQ
호모리신 hLys; hK; homoLys
호모페닐알라닌 hPhe; homoPhe
4-히드록시프롤린 (또는 히드록시프롤린) Hyp
2-인다닐글리신 (또는 인다닐글리신) IgI
인돌린-2-카르복실산 Idc
요오드티로신 I-Tyr
LysΨ (CH2NH)-환원된 아미드 결합 rLys
메티오닌 산화물 Met[O]
메티오닌 설폰 Met[O]2
N α -메틸아르기닌 NMeR
Nα-[(CH2)3NHCH(NH)NH2] 치환된 글리신 N-Arg
N α -메틸시트룰린 NMeCit
N α -메틸글루타민 NMeQ
N α -메틸호모시트룰린 Nα -MeHoCit
N α -메틸호모리신 NMeHoK
N α -메틸류신 Nα -MeL; NMeL; NMeLeu; NMe-Leu
N α -메틸리신 NMe-Lys
Nε-메틸-리신 N-eMe-K
Nε-에틸-리신 N-eEt-K
Nε-이소프로필-리신 N-eIPr-K
N α -메틸노르류신 NMeNle; NMe-Nle
N α -메틸오르니틴 Nα -MeOrn; NMeOrn
N α -메틸페닐알라닌 NMe-Phe
4-메틸-페닐알라닌 MePhe
α-메틸페닐알라닌 AMeF
N α -메틸트레오닌 NMe-Thr; NMeThr
N α -메틸발린 NMeVal; NMe-Val
Nε-(O-(아미노에틸)-O'-(2-프로파노일)-운데카에틸렌글리콜)-리신 K(NPeg11)
Nε-(O-(아미노에틸)-O'-(2-프로파노일)-(에틸렌글리콜)27-리신 K(NPeg27)
3-(1-나프틸)알라닌 1-Nal; 1Nal
3-(2-나프틸)알라닌 2-Nal; 2Nal
니페코트산 Nip
니트로페닐알라닌 nitrophe
노르류신 Nle
노르발린 Nva 또는 Nvl
O-메틸티로신 Ome-Tyr
옥타히드로인돌-2-카르복실산 Oic
오르니틴 Orn
OrnΨ (CH2NH)-환원된 아미드 결합 rOrn
4-피페리디닐알라닌 4PipA
4-피리디닐알라닌 4Pal
3-피리디닐알라닌 3Pal
2-피리디닐알라닌 2Pal
파라-아미노페닐알라닌 4AmP; 4-아미노-Phe
파라-요오드페닐알라닌 (또는 4-요오드페닐알라닌) pI-Phe
페닐글리신 Phg
4-페닐-페닐알라닌 (또는 비페닐알라닌) 4Bip
4,4'-비페닐 알라닌 Bip
피페콜산 Pip
4-아미노-1-피페리딘-4-카르복실산 4Pip
사르코신 Sar
1,2,3,4-테트라히드로이소퀴놀린 Tic
1,2,3,4-테트라히드로이소퀴놀린-1-카르복실산 Tiq
1,2,3,4-테트라히드로이소퀴놀린-7-히드록시-3-카르복실산 히드록실-Tic
1,2,3,4-테트라히드로노르하르만-3-카르복실산 Tpi
티아졸리딘-4-카르복실산 Thz
3-티에닐알라닌 Thi
UPAC-IUB Joint Commission on Biochemical Nomenclature (JCBN)에 의한 아미노산과 펩티드에 대한 명명법과 상징은 하기 문서에서 공개되었다: Biochem. J., 1984, 219, 345-373; Eur. J. Biochem., 1984, 138, 9-37; 1985, 152, 1; 1993, 213, 2; Internat. J. Pept. Prot. Res., 1984, 24, following p84; J. Biol. Chem., 1985, 260, 14-42; Pure Appl. Chem., 1984, 56, 595-624; Amino Acids and Peptides, 1985, 16, 387-410; Biochemical Nomenclature and Related Documents, 2nd edition, Portland Press, 1992, pages 3969.
폴리펩티드 (가령, 항원 결합 단백질, 또는 항체)의 "변이체"는 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기가 다른 폴리펩티드 서열과 관련하여, 아미노산 서열 내로 삽입되고, 아미노산 서열로부터 결실되고 및/또는 아미노산 서열 내로 치환되는 아미노산 서열을 포함한다. 변이체는 융합 단백질을 포함한다.
용어 "융합 단백질"은 상기 단백질이 하나 이상의 부모 단백질 또는 폴리펩티드로부터, 또는 동일하긴 하지만 동일한 단백질 분자에서 자연적으로 함께 발견되지 않는 상이한 순서로 단일 융합 분자 내에 위치하는 단백질로부터 유래된 폴리펩티드 성분을 포함하는 키메라라는 것을 지시한다. 전형적으로, 융합 단백질은 한 단백질로부터 폴리펩티드 서열을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이 상이한 단백질로부터 폴리펩티드 서열을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열과 인 프레임 (in frame)으로 부가되고, 그리고 링커에 의해 상기 뉴클레오티드 서열로부터 선택적으로 분리되는 융합 유전자로부터 발현된다. 융합 유전자는 이후, 단일 단백질로서 재조합 숙주 세포에 의해 발현될 수 있다.
"분비된" 단백질은 분비 신호 펩티드 서열의 결과로서 ER, 분비 소포 (secretory vesicle), 또는 세포외 공간으로 지향될 수 있는 단백질, 그리고 신호 서열을 반드시 내포하지는 않으면서 세포외 공간 내로 방출된 단백질을 지칭한다. 분비된 단백질이 세포외 공간 내로 방출되면, 분비된 단백질은 세포외 가공을 겪고 "성숙" 단백질이 생산될 수 있다. 세포외 공간 내로 방출은 세포외 유출 (exocytosis) 및 단백분해 개열 (proteolytic cleavage)을 비롯한 많은 기전에 의해 발생할 수 있다. 본 발명의 조성물의 일부 다른 구체예에서, 폴리펩티드는 숙주 세포에 의해 분비된 단백질로서 합성될 수 있고, 이것은 이후, 세포외 공간 및/또는 배지로부터 더욱 정제될 수 있다.
본 발명의 시험관내 분석평가 방법의 여러 단계에서, 분자 또는 분자의 혼합물은 수성 액체에서, 예를 들면, 혈청-내포 분석평가 완충액에서, 또는 새로운 용적의 분석평가 완충액에서 "현탁된다." 용어 "현탁된"은 분자 또는 혼합물이 액체에서 용해되거나, 액체에서 산재되거나, 액체 내에서 유동하거나, 액체 내에서 움직이거나, 또는 액체에 혼합되는 것을 의미한다.
본 명세서에서, 숙주 세포에서 재조합 DNA 기술에 의해 생산된 단백질과 관련하여 "가용성"은 수성 용액 내에 존재하는 단백질이다; 단백질이 쌍정-아르기닌 신호 아미노산 서열을 내포하면, 가용성 단백질은 그람 음성 세균 숙주에서 주변세포질 공간으로 출외되거나, 또는 분비할 수 있는 진핵 숙주 세포에 의해, 또는 적절한 유전자 (가령, kil 유전자)를 보유하는 세균 숙주에 의해 배양 배지 내로 분비된다. 따라서 가용성 단백질은 숙주 세포 내에 봉입체 (inclusion body)에서 발견되지 않는 단백질이다. 대안으로, 문맥에 따라, 가용성 단백질은 생리학적 조건 하에 관심되는 수성 완충액에서 다른 단백질 없이 현탁될 때, 세포 막에서 통합된 상태로 발견되지 않거나, 또는 시험관내에서, 유의미한 양의 불용성 집합체를 형성하지 않으면서 (즉, 전체 단백질의 10% 이하, 그리고 전형적으로 약 5% 이하로 집합체 형성) 생리학적 조건 하에 수성 완충액에 용해되거나 용해될 수 있는 단백질이고, 이런 완충액은 세제 또는 무질서화제, 예를 들면, 우레아, 구아니디늄 염산염, 또는 리튬 과염소산염을 내포하지 않는다. 대조적으로, 불용성 단백질은 숙주 세포 내에 세포질 과립 (봉입체로 지칭됨)에서 변성된 형태로 존재하는 단백질이거나, 또는 다시 한 번, 문맥에 따라, 불용성 단백질은 생리학적 조건 하에 관심되는 수성 완충액에서 다른 단백질 (생리학적으로 조화성 온도에서)없이 현탁될 때, 세포질 막, 미토콘드리아 막, 엽록체 막, 소포체 막 등이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 세포 막 내에 존재하거나, 또는 생리학적 조건 하에 시험관내 수성 완충액에서 유의미한 양의 불용성 집합체를 형성하는 (즉, 전체 단백질의 약 10% 또는 그 이상으로 집합체를 형성) 단백질이고, 이런 완충액은 세제 또는 무질서화제, 예를 들면, 우레아, 구아니디늄 염산염, 또는 리튬 과염소산염을 내포하지 않는다.
용어 "재조합"은 물질 (가령, 핵산 또는 폴리펩티드)이 인간 개입에 의해 인공적으로 또는 합성적으로 (즉, 비-자연적으로) 변경되었다는 것을 지시한다. 변경은 자연 환경 또는 상태 내에서, 또는 자연 환경 또는 상태로부터 이전된 물질에서 수행될 수 있다. 가령, "재조합 핵산"은 예로써, 클로닝, DNA 셔플링, 또는 기타 널리 공지된 분자 생물학적 절차 동안 재조합 핵산에 의해 만들어진 핵산이다. 이런 분자 생물학적 절차의 실례는 Maniatis et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y(1982)에서 발견된다. "재조합 DNA 분자"는 이런 분자 생물학적 기술에 의해 함께 연결된 DNA의 분절로 구성된다. 본 명세서에서, 용어 "재조합 단백질" 또는 "재조합 폴리펩티드"는 재조합 DNA 분자를 이용하여 발현되는 단백질 분자를 지칭한다. "재조합 숙주 세포"는 재조합 핵산을 내포하고 및/또는 발현하는 세포이다.
용어 "폴리뉴클레오티드" 또는 "핵산"은 2개 또는 그 이상의 뉴클레오티드 잔기를 내포하는 단일-가닥과 이중-가닥 뉴클레오티드 중합체 둘 모두를 포함한다. 폴리뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드 잔기는 리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드, 또는 뉴클레오티드의 어느 한쪽 유형의 변형된 형태일 수 있다. 상기 변형에는 염기 변형, 예를 들면, 브로모우리딘과 이노신 유도체, 리보오스 변형, 예를 들면, 2',3'-디데옥시리보오스, 그리고 뉴클레오티드간 연쇄 변형, 예를 들면, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포로셀레노에이트, 포스포로디셀레노에이트, 포스포로아닐로티오에이트, 포스포라닐라데이트와 포스포로아미데이트가 포함된다.
용어 "올리고뉴클레오티드"는 200개 또는 그 이하의 뉴클레오티드 잔기를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 일부 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 10개 내지 60개 염기 길이를 갖는다. 다른 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20 내지 40개 뉴클레오티드 길이를 갖는다. 올리고뉴클레오티드는 예로써, 돌연변이 유전자의 작제에서 이용을 위한 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 센스 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 정량 또는 검출의 용이함을 위한 동위원소 라벨 (가령, 125I, 14C, 13C, 35S, 3H, 2H, 13N, 15N, 18O, 17O 등), 검출 분석평가를 위한 형광 라벨, 합텐 또는 항원성 라벨을 비롯한 라벨을 포함할 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 예로써, PCR 프라이머, 클로닝 프라이머 또는 혼성화 프로브로서 이용될 수 있다.
본 명세서에서 교체가능하게 이용되는 "폴리뉴클레오티드 서열" 또는 "뉴클레오티드 서열" 또는 "핵산 서열"은 문맥에 따라, 올리고뉴클레오티드, DNA, 그리고 RNA, 핵산, 또는 뉴클레오티드 잔기의 일차 서열을 대표하는 특징적 스트링 (character string)을 비롯한 폴리뉴클레오티드 내에 뉴클레오티드 잔기의 일차 서열이다. 임의의 특정된 폴리뉴클레오티드 서열로부터, 소정의 핵산 또는 상보성 폴리뉴클레오티드 서열이 결정될 수 있다. 단일- 또는 이중-가닥일 수 있고, 그리고 센스 또는 안티센스 가닥을 나타내는 게놈 또는 합성 기원의 DNA 또는 RNA가 포함된다. 달리 특정되지 않으면, 본 명세서에서 논의된 임의의 단일-가닥 폴리뉴클레오티드 서열의 왼쪽 단부는 5' 단부이다; 이중-가닥 폴리뉴클레오티드 서열의 왼쪽 방향은 5' 방향으로서 지칭된다. 발생기 RNA 전사체의 5'에서 3' 부가의 방향은 전사 방향으로 지칭된다; RNA 전사체의 5' 단부에 5'인 RNA 전사체와 동일한 서열을 갖는 DNA 가닥 상에 서열 영역은 "상류 서열"로서 지칭된다; RNA 전사체의 3' 단부에 3'인 RNA 전사체와 동일한 서열을 갖는 DNA 가닥 상에 서열 영역은 "하류 서열"로서 지칭된다.
본 명세서에서, "단리된 핵산 분자" 또는 "단리된 핵산 서열"은 (1) 핵산의 자연 공급원에서 통상적으로 결합되는 적어도 하나의 오염물질 핵산 분자로부터 확인되고 분리되거나, 또는 (2) 관심되는 핵산의 서열이 결정될 수 있도록 배경 핵산으로부터 클로닝되거나, 증폭되거나, 태그되거나, 또는 달리 구별되는 핵산 분자이다. 단리된 핵산 분자는 자연에서 발견되는 형태 또는 환경에 있지 않지만, 단리된 핵산 분자에는 폴리펩티드 (가령, 올리고펩티드 또는 항체)를 통상적으로 발현하는 세포에 내포된 핵산 분자가 포함되고, 여기서 예로써, 핵산 분자는 자연 세포의 위치와 상이한 염색체 장소 내에 있다.
본 명세서에서, 용어 "인코딩하는 핵산 분자", "인코딩하는 DNA 서열" 및 "인코딩하는 DNA"는 데옥시리보핵산의 가닥을 따라서 데옥시리보뉴클레오티드의 순서 또는 서열을 지칭한다. 이들 데옥시리보뉴클레오티드의 순서는 mRNA 사슬을 따라서 리보뉴클레오티드의 순서를 결정하고, 또한 폴리펩티드 (단백질) 사슬을 따라서 아미노산의 순서를 결정한다. DNA 서열은 따라서, RNA 서열 및 아미노산 서열을 코딩한다.
용어 "유전자"는 생물학적 기능과 연관된 임의의 핵산을 지칭하는데 폭넓게 이용된다. 유전자는 전형적으로, 코딩 서열 및/또는 이런 코딩 서열의 발현에 필요한 조절 서열을 포함한다. 용어 "유전자"는 특정한 게놈 또는 재조합 서열뿐만 아니라 상기 서열에 의해 인코딩된 cDNA 또는 mRNA에 적용된다. "융합 유전자"는 자연적으로 함께 발견되지 않거나, 또는 인코딩된 융합 단백질 내에 존재하는 바와 동일한 서열에서 자연적으로 함께 발견되지 않는 상이한 단백질로부터 일부분을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 코딩 영역을 내포한다 (즉, 키메라 단백질). 유전자는 또한, 예로써 다른 단백질에 대한 인식 서열을 형성하는 비-발현된 핵산 분절을 포함한다. 조절 단백질, 예를 들면, 전사 인자가 결합하는 전사 제어 요소를 비롯한 비-발현된 조절 서열은 인접한 또는 인근 서열의 전사를 유발한다.
"유전자의 발현" 또는 "핵산의 발현"은 문맥에 의해 지시된 바와 같이, DNA의 RNA로의 전사 (RNA의 변형, 예를 들면, 스플라이싱 (splicing)을 선택적으로 포함), RNA의 폴리펩티드로의 번역 (아마도, 폴리펩티드의 후속 번역후 변형 포함), 또는 전사와 번역 둘 모두를 의미한다.
본 명세서에서, 용어 "코딩 영역" 또는 "코딩 서열"은 구조 유전자와 관련하여 이용될 때, mRNA 분자의 번역의 결과로서 발생기 폴리펩티드 내에서 발견되는 아미노산을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 코딩 영역은 진핵생물에서, 개시자 메티오닌을 인코딩하는 뉴클레오티드 삼중항 "ATG"에 의해 5' 측면에서, 그리고 종결 코돈을 명기하는 3가지 삼중항 (즉, TAA, TAG, TGA) 중에서 한 가지에 의해 3' 측면에서 경계를 이룬다.
용어 "제어 서열" 또는 "제어 신호"는 특정 숙주 세포에서, 이것이 결찰되는 코딩 서열의 발현과 가공에 영향을 줄 수 있는 폴리뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 이런 제어 서열의 성격은 숙주 생물체에 의존할 수 있다. 특정 구체예에서, 원핵생물에 대한 제어 서열에는 프로모터, 리보솜 결합 부위, 그리고 전사 종결 서열이 포함될 수 있다. 진핵생물에 대한 제어 서열에는 전사 인자, 전사 인핸서 서열 또는 요소, 폴리아데닐화 부위, 그리고 전사 종결 서열에 대한 하나 또는 복수의 인식 부위를 포함하는 프로모터가 포함될 수 있다. 제어 서열은 리더 서열 및/또는 융합 상대 서열을 포함할 수 있다. 프로모터와 인핸서는 전사에 관여하는 세포 단백질과 특이적으로 상호작용하는 DNA의 짧은 어레이로 구성된다 (Maniatis, et al., Science 236:1237 (1987)). 프로모터와 인핸서 요소는 효모, 곤충 및 포유동물 세포와 바이러스에서 유전자를 비롯한 다양한 진핵 공급원으로부터 단리되었다 (유사한 제어 요소, 다시 말하면, 프로모터는 원핵생물에서도 발견된다). 특정 프로모터와 인핸서의 선별은 어떤 세포 유형이 관심되는 단백질을 발현하는데 이용되는 지에 좌우된다. 일부 진핵 프로모터와 인핸서는 넓은 숙주 범위를 갖는 반면, 다른 것들은 세포 유형의 한정된 부분집합에서 기능한다 (재고를 위해, Voss, et al., Trends Biochem. Sci., 11:287 (1986) 및 Maniatis, et al., Science 236:1237 (1987)을 참조한다).
용어 "벡터"는 숙주 세포 내로 단백질 코딩 정보를 전달하는데 이용되는 임의의 분자 또는 실체 (가령, 핵산, 플라스미드, 박테리오파지 또는 바이러스)를 의미한다.
본 명세서에서, 용어 "발현 벡터" 또는 "발현 구조체"는 원하는 코딩 서열 및 특정 숙주 세포에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 발현에 필수적인 적절한 핵산 제어 서열을 내포하는 재조합 DNA 분자를 지칭한다. 발현 벡터는 전사와 번역에 영향을 주거나 이들을 제어하고, 그리고 인트론이 존재하면, 거기에 작동가능하게 연결된 코딩 영역의 RNA 스플라이싱에 영향을 주는 서열을 포함할 수 있지만 이들에 한정되지 않는다.
원핵생물에서 발현에 필수적인 핵산 서열은 프로모터, 선택적으로 오퍼레이터 서열, 리보솜 결합 부위 및 아마도 다른 서열을 포함한다. 진핵 세포는 프로모터, 인핸서, 그리고 종결과 폴리아데닐화 신호를 이용하는 것으로 알려져 있다. 분비 신호 펩티드 서열은 또한, 원하는 경우에 세포로부터 관심되는 폴리펩티드의 더욱 용이한 분리를 위해, 선택적으로 발현 벡터에 의해 인코딩되고, 관심되는 코딩 서열에 작동가능하게 연결되고, 따라서 발현된 폴리펩티드가 재조합 숙주 세포에 의해 분비될 수 있다. 이런 기술은 당분야에 충분히 공지되어 있다. (가령, Goodey, Andrew R.; et al., Peptide and DNA sequences, U.S. Patent No. 5,302,697; Weiner et al., Compositions and methods for protein secretion, U.S. Patent No. 6,022,952와 U.S. Patent No. 6,335,178; Uemura et al., Protein expression vector and utilization thereof, U.S. Patent No. 7,029,909; Ruben et al., 27 human secreted proteins, US 2003/0104400 A1).
본 명세서에서, 용어 "작동가능한 조합으로", "작동가능한 순서로" 및 "작동가능하게 연결된"은 소정의 유전자의 전사 및/또는 원하는 단백질 분자의 합성을 주동할 수 있는 핵산 분자가 생산되도록 하는 방식으로 핵산 서열의 연쇄를 지칭하다. 상기 용어는 또한, 기능성 단백질이 생산되도록 하는 방식으로 아미노산 서열의 연쇄를 지칭한다. 가령, 단백질 코딩 서열에 "작동가능하게 연결된" 벡터에서 제어 서열은 단백질 코딩 서열의 발현이 제어 서열의 전사 활성과 조화성인 조건 하에 달성되도록 거기에 결찰된다.
용어 "숙주 세포"는 핵산으로 형질전환되거나, 또는 형질전환될 수 있고, 따라서 관심되는 유전자를 발현하는 세포를 의미한다. 상기 용어에는 관심되는 유전자만 존재하면, 자손이 형태에서 또는 유전자 구성에서 본래 부모 세포와 동일한 지에 상관없이, 부모 세포의 자손이 포함된다. 다수의 가용하고 널리 공지된 임의의 숙주 세포가 본 발명의 실시에 이용될 수 있다. 특정 숙주의 선별은 당분야에서 인정되는 다수의 인자에 좌우된다. 이들에는 예로써, 선택된 발현 벡터와의 조화성 (compatibility), DNA 분자에 의해 인코딩된 펩티드의 독성, 형질전환 속도, 펩티드의 회수의 용이함, 발현 특징, 생물안정성 및 비용이 포함된다. 이들 인자의 균형은 모든 숙주가 특정 DNA 서열의 발현에 동등하게 효과적인 것은 아니라는 이해가 바탕되어야 한다. 이들 일반적 가이드라인 내에서, 배양 중인 유용한 미생물 숙주 세포에는 세균 (가령, 대장균 (Escherichia coli) 종), 효모 (가령, 사카로미세스 (Saccharomyces) 종) 및 기타 진균 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 포유동물 (인간 포함) 세포, 예를 들면, CHO 세포와 HEK-293 세포가 포함된다. 변형은 DNA 수준에서도 만들어질 수 있다. 펩티드-인코딩 DNA 서열은 선택된 숙주 세포와 더욱 조화성인 코돈으로 변화될 수 있다. 대장균 (E. coli)의 경우에, 최적화된 코돈은 당분야에 공지되어 있다. 코돈은 제한 부위가 제거되거나 침묵 제한 부위가 포함되도록 치환될 수 있는데, 이것은 선별된 숙주 세포에서 DNA의 가공을 보조할 수 있다. 그 다음, 형질전환된 숙주는 배양되고 정제된다. 숙주 세포는 원하는 화합물이 발현되도록 전통적인 발현 조건 하에 배양될 수 있다. 이런 발효 조건은 당분야에 널리 공지되어 있다.
용어 "형질감염"은 세포에 의한 외래 또는 외인성 DNA의 흡수를 의미하고, 그리고 세포는 외인성 DNA가 세포 막 내로 도입될 때, "형질감염된다." 다수의 형질감염 기술은 당분야에 널리 공지되어 있고 본 명세서에서 개시된다. 예로써, Graham et al., 1973, Virology 52:456; Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, supra; Davis et al., 1986, Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier; Chu et al., 1981, Gene 13:197을 참조한다. 이런 기술은 하나 또는 그 이상의 외인성 DNA 모이어티를 적절한 숙주 세포 내로 도입하는데 이용될 수 있다.
용어 "형질전환"은 세포의 유전적 특징에서 변화를 지칭하고, 그리고 세포는 새로운 DNA 또는 RNA를 내포하도록 변형될 때, 형질전환된다. 가령, 세포는 형질감염, 형질도입, 또는 기타 기술에 의해 새로운 유전 물질을 도입함으로써 고유 상태로부터 유전적으로 변형되는 경우에 형질전환된다. 형질감염 또는 형질도입 이후에, 형질전환 DNA는 세포의 염색체 내로 물리적으로 통합함으로써 세포의 DNA와 재조합하거나, 또는 복제되지 않으면서 에피솜 요소로서 일시적으로 유지되거나, 또는 플라스미드로서 독립적으로 복제할 수 있다. 세포는 형질전환 DNA가 세포의 분열에서 복제될 때, "안정적으로 형질전환된" 것으로 간주된다.
단백질의 "도메인" 또는 "영역" (본 명세서에서 교체가능하게 이용됨)은 완전한 단백질까지 포함되지만 전형적으로, 완전한 단백질을 포함하지는 않는, 전체 단백질의 임의의 일부분이다. 도메인은 반드시 그러한 것은 아니지만, 단백질 사슬의 나머지 부분과 독립적으로 접힘될 수 있고 및/또는 특정 생물학적, 생화학적, 또는 구조적 기능 또는 장소 (가령, 리간드 결합 도메인, 또는 시토졸, 막통과 또는 세포외 도메인)와 상관될 수 있다.
치료의 목적으로 "포유동물"은 인간, 가축과 경작용 동물, 그리고 동물원, 스포츠, 또는 애완 동물, 예를 들면, 개, 말, 고양이, 소, 쥐, 생쥐, 원숭이 등을 비롯하여, 포유동물로서 분류되는 임의의 동물을 지칭한다.
생물학적 물질, 예를 들면, 폴리펩티드, 핵산, 숙주 세포 등과 관련하여, 본 명세서 전반에서 용어 "자연 발생"은 자연에서 발견되는 물질을 지칭한다.
용어 "항체", 또는 교체가능하게 "Ab"는 가장 넓은 의미로 이용되고, 여기에는 원하는 생물학적 활성을 나타내기만 하면, 완전하게 조립된 항체, 단일클론성 항체 (인간, 인간화된 또는 키메라 항체 포함), 다중클론성 항체, 다중특이적 항체 (가령, 이중특이적 항체), 그리고 이들의 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함하고, 항원에 결합할 수 있는 항체 단편 (가령, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, 단일 사슬 항체, 디아바디)이 포함된다. 화학적으로 유도체화된 항체를 비롯하여, 온전한 분자 및/또는 단편의 다합체 또는 집합체가 예기된다. IgG, IgM, IgD, IgA, 그리고 IgE, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1과 IgA2, 또는 임의의 알로타입을 비롯하여, 임의의 아이소타입 부류 또는 하위부류의 항체가 예기된다. 상이한 아이소타입은 상이한 효과기 기능을 갖는다; 가령, IgG1과 IgG3 아이소타입은 항체-의존성 세포 세포독성 (ADCC) 활성을 갖는다. 따라서 본 발명의 시험관내 분석평가 방법의 일부 구체예에서, IgG 표적 항체는 IgG1 (가령, KW-0761 (일명, "모가물리주맙" 또는 "AMG 761"), 리툭시맙, 또는 트라스투주맙) 또는 IgG3 항체이다.
용어 "항원 결합 단백질" (ABP)은 앞서 정의된 바와 같은 항체 또는 항체 단편, 그리고 원하는 항원-결합 특성을 갖는 CDR로부터 유래된 서열을 내포하는 재조합 펩티드 또는 기타 화합물을 포함한다.
항체-항원 상호작용은 M-1s-1 (ka)에서 결합 속도 상수, 또는 s-1 (kd)에서 해리 속도 상수, 또는 대안으로, M (KD)에서 해리 평형 상수에 의해 특징될 수 있다. 일반적으로, 항원 결합 단백질, 예를 들면, 항체 또는 항체 단편은 유사한 결합 분석평가 조건 하에 다른 무관한 단백질에 대한 친화성과 비교하여, 항원에 대한 훨씬 높은 결합 친화성을 갖고, 그리고 결과적으로, 항원을 구별할 수 있을 때, 상기 항원에 "특이적으로 결합한다." 10-9 M 또는 그 이하의 범위, 또는 10-12 M 또는 그 이하의 범위 (더욱 낮은 값은 더욱 높은 결합 친화성을 지시한다)에서 KD (해리 평형 상수)에 의해 측정된 결합 친화성, 또는 10-4 s-1 또는 그 이하의 범위, 또는 10-10 s-1 또는 그 이하의 범위에서 kd (해리 속도 상수)에 의해 측정된 친화력과 같은 특징이 바람직하다. 전형적으로, 항원 결합 단백질 (가령, 항체 또는 항체 단편)은 해리 평형 상수 (KD)가 ≤10-8 M일 때, 표적 항원에 "특이적으로 결합하는" 것으로 일컬어진다. 항원 결합 단백질 (가령, 항체 또는 항체 단편)은 KD가 ≤5x 10-9 M일 때 "높은 친화성"으로, 그리고 KD가 ≤5x 10-10 M일 때 "매우 높은 친화성"으로 항원에 특이적으로 결합한다. 한 구체예에서, 항원 결합 단백질 (가령, 항체)은 약 10-8 M과 10-10 M 사이의 KD로 결합할 것이고, 그리고 또 다른 구체예에서, 항체는 KD ≤5x 10-9 M으로 결합할 것이다. 결합 속도 상수, 해리 속도 상수, 또는 해리 평형 상수는 동역학 분석 기술, 예를 들면, 표면 플라스몬 공명 (BIAcore®; 가령, 본 발명에 전체로서 참고문헌으로 편입되는 Fischer et al., A peptide-immunoglobulin-conjugate, WO 2007/045463 A1, Example 10), 또는 제조업체에 의해 개설된 일반적 절차 또는 당분야에 공지된 기타 방법을 이용한 KinExA를 이용하여 용이하게 결정될 수 있다. BIAcore® 또는 KinExA에 의해 획득된 동역학 데이터는 제조업체에 의해 기술된 방법에 의해 분석될 수 있다.
"항원 결합 영역" 또는 "항원 결합 부위"는 특정된 항원에 특이적으로 결합하는, 항원 결합 단백질 (가령, 항체 단백질 또는 항체 단편)의 일부분을 의미한다. 가령, 항원과 상호작용하고 항원에 대한 특이성과 친화성을 항체에 공여하는 아미노산 잔기를 내포하는 항체의 일부분은 "항원 결합 영역"으로서 지칭된다. 항원 결합 영역은 전형적으로, 하나 또는 그 이상의 "상보성 결합 영역" ("CDRs")을 내포한다. 일정한 항원 결합 영역은 또한, 하나 또는 그 이상의 "프레임워크" 영역 ("FR")을 포함한다. "CDR"은 항원 결합 특이성과 친화성에 기여하는 아미노산 서열이다. "프레임워크" 영역은 CDR의 적절한 입체배열을 유지시켜 항원 결합 영역과 항원 사이에 결합을 촉진하는데 도움을 줄 수 있다.
"단리된" 항체는 생산 세포에 의해 그가 분비된 자연 환경 또는 배양 배지의 하나 또는 그 이상의 성분으로부터 확인되고 분리된 항체이다. 자연 환경 또는 배지의 "오염물질" 성분은 항체의 진단적 또는 치료적 용도를 간섭하는 물질이고, 여기에는 효소, 호르몬, 그리고 기타 단백질성 또는 비단백질성 용질이 포함될 수 있다. 일부 구체예에서, 항체는 (1) 항체의 중량으로 95% 이상, 그리고 가장 바람직하게는, 중량으로 99% 이상까지, 또는 (2) 선택적으로 착색제, 예를 들면, 쿠마시 블루 (Coomassie blue) 또는 은 착색제를 이용하여 환원 또는 비환원 조건 하에 SDS-PAGE에 의해 균질성 (homogeneity)까지 정제될 것이다. 단리된 자연 발생 항체에는 재조합 세포 내에서 in situ 항체가 포함되는데, 그 이유는 상기 항체의 자연 환경의 적어도 하나의 성분이 존재하지 않을 것이기 때문이다. 하지만, 전형적으로 단리된 항체는 적어도 하나의 정제 단계에 의해 제조될 것이다.
본 명세서에서, 용어 "단일클론성 항체"는 실질적으로 동종성 항체의 집단으로부터 획득된 항체를 지칭한다, 다시 말하면, 상기 집단을 구성하는 개별 항체는 미량으로 존재할지도 모르는 가능한 자연 발생 돌연변이를 제외하고 동일하다. 단일클론성 항체는 전형적으로 상이한 에피토프를 지향하는 상이한 항체를 포함하는 다중클론성 항체 제조물과 대조적으로, 매우 특이적이고, 개별 항원성 부위 또는 에피토프를 지향한다. 단일클론성 항체의 무제한적 실례에는 원하는 생물학적 활성을 나타내기만 하면, 뮤린, 토끼, 쥐, 닭, 키메라, 인간화된, 또는 인간 항체, 완전하게 조립된 항체, 다중특이적 항체 (이중특이적 항체 포함), 항원에 결합할 수 있는 항체 단편 (Fab, Fab', F(ab')2, Fv, 단일 사슬 항체, 디아바디 포함), 맥시바디, 나노바디, 그리고 이들의 CDR을 포함하는 재조합 펩티드, 또는 이들의 변이체 또는 유도체가 포함된다.
수식어 "단일클론성"은 항체의 실질적으로 동종성 집단으로부터 획득되는 항체의 특징을 지시하고, 그리고 임의의 특정 방법에 의한 항체의 생산을 필요로 하는 것으로 간주되지 않는다. 가령, 본 발명에 따라서 이용되는 단일클론성 항체는 Kohler et al., Nature, 256:495 [1975]에 의해 처음 개발된 하이브리도마 방법에 의해 만들어지거나, 또는 재조합 DNA 방법에 의해 만들어질 수 있다 (예로써, U.S. Patent No. 4,816,567을 참조한다). "단일클론성 항체"는 또한, 예로써 Clackson et al., Nature, 352:624-628[1991] 및 Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)에서 기술된 기술을 이용한 파지 항체 라이브러리로부터 단리될 수 있다.
용어 "면역글로불린"은 경쇄 (LC)에 각각 공유 연결된 2개의 이합체화된 중쇄 (HC)를 포함하는 완전한 항체; 단일 비이합체화 면역글로불린 중쇄 및 공유 연결된 경쇄 (HC + LC), 또는 키메라 면역글로불린 (경쇄 + 중쇄)-Fc 헤테로삼합체 (일명, "헤미바디")을 포함한다.
"항체"는 사합체성 당단백질이다. 자연-발생 항체에서, 각 사합체는 폴리펩티드 사슬의 2개의 동일한 쌍으로 구성되고, 각 쌍은 약 220개 아미노산 (약 25 kDa)의 1개 "경쇄" 및 약 440개 아미노산 (약 50-70 kDa)의 1개 "중쇄"를 갖는다. 각 사슬의 아미노-말단 부분은 항원 인식을 주로 담당하는 약 100개 내지 110개 또는 그 이상 아미노산의 "가변" ("V") 영역을 포함한다. 각 사슬의 카르복시-말단 부분은 효과기 기능을 주로 담당하는 불변 영역을 정의한다. 가변 영역은 서로 다른 항체 사이에 상이하다. 불변 영역은 서로 다른 항체 사이에 동일하다. 각 중쇄 또는 경쇄의 가변 영역 내에서, 항원에 대한 항체의 특이성을 결정하는데 도움을 주는 3개의 초가변 하위영역이 존재한다. 이들 초가변 영역 사이에 가변 도메인 잔기는 프레임워크 잔기로 불리고 일반적으로, 서로 다른 항체 사이에 다소간 상동하다. 면역글로불린은 그들의 중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라 상이한 부류에 지정될 수 있다. 인간 경쇄는 카파 (κ)와 람다 (λ) 경쇄로서 분류된다. 경쇄와 중쇄 내에서, 가변과 불변 영역은 약 12개 또는 그 이상 아미노산의 "J" 영역에 의해 연결되고, 중쇄는 약 10개 이상 아미노산의 "D" 영역을 또한 포함한다. 전반적으로, Fundamental Immunology, Ch. 7 (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989)을 참조한다. 본 발명의 범위 내에서, "항체"는 또한, 재조합 방식으로 만들어진 항체, 그리고 글리코실화가 없는 항체를 포함한다.
용어 "경쇄" 또는 "면역글로불린 경쇄"는 결합 특이성을 공여할 만큼 충분한 가변 영역 서열을 갖는 전장 경쇄 및 이의 단편을 포함한다. 전장 경쇄는 가변 영역 도메인, VL, 그리고 불변 영역 도메인, CL을 포함한다. 경쇄의 가변 영역 도메인은 폴리펩티드의 아미노-말단에 있다. 경쇄는 카파 사슬 및 람다 사슬을 포함한다.
용어 "중쇄" 또는 "면역글로불린 중쇄"는 결합 특이성을 공여할 만큼 충분한 가변 영역 서열을 갖는 전장 중쇄 및 이의 단편을 포함한다. 전장 중쇄는 가변 영역 도메인, VH, 그리고 3개의 불변 영역 도메인, CH1, CH2, 그리고 CH3을 포함한다. VH 도메인은 폴리펩티드의 아미노-말단에 있고, 그리고 CH 도메인은 카르복실-말단에 있는데, CH3이 폴리펩티드의 카르복시-말단에 가장 가깝게 위치한다. 중쇄는 뮤 (μ), 델타 (Δ), 감마 (γ), 알파 (α), 그리고 엡실론 (ε)으로서 분류되고, 그리고 항체의 아이소타입을 각각, IgM, IgD, IgG, IgA, 그리고 IgE로서 정의한다. 본 발명의 별개의 구체예에서, 중쇄는 IgG (IgG1, IgG2, IgG3과 IgG4 아류형 포함), IgA (IgA1과 IgA2 아류형 포함), IgM 및 IgE를 비롯한 임의의 아이소타입을 가질 수 있다. 이들 중에서 몇몇은 하위부류 또는 아이소타입, 예를 들면, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1과 IgA2로 더욱 세분될 수 있다. 상이한 IgG 아이소타입은 상이한 효과기 기능 (Fc 영역에 의해 매개됨), 예를 들면, 항체-의존성 세포 세포독성 (ADCC) 및 보체-의존성 세포독성 (CDC)을 가질 수 있다. ADCC에서, 항체의 Fc 영역은 면역 효과기 세포, 예를 들면, 자연 킬러와 대식세포의 표면 상에서 Fc 수용체 (FcγRs)에 결합하고, 표적화된 세포의 식균 작용 (phagocytosis) 또는 용해 (lysis)를 유발한다. CDC에서, 항체는 세포 표면에서 보체 캐스케이드 (complement cascade)를 유인함으로써, 표적화된 세포를 죽인다.
"Fc 영역", 또는 본 명세서에서 교체가능하게 이용된 "Fc 도메인" 또는 "면역글로불린 Fc 도메인"은 2개의 중쇄 단편을 내포하고, 이것은 완전한 항체에서, 항체의 CH1과 CH2 도메인을 포함한다. 이들 2개의 중쇄 단편은 2개 또는 그 이상의 이황화 결합 및 CH3 도메인의 소수성 상호작용에 의해 함께 묶여진다.
용어 "구조 수용체 결합 에피토프"는 IgG 분자의 생체내 혈청 반감기를 증가시키는 것을 담당하는 IgG 분자 (가령, IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4)의 Fc 영역의 에피토프를 지칭한다.
"알로타입"은 면역원성일 수 있는 항체 서열에서, 종종 불변 영역에서 변이이고, 그리고 인간에서 특정한 대립유전자에 의해 인코딩된다. 알로타입은 5가지 인간 IGHC 유전자, IGHG1, IGHG2, IGHG3, IGHA2와 IGHE 유전자에 대해 확인되었고, 그리고 각각, G1m, G2m, G3m, A2m, 그리고 Em 알로타입으로서 명명된다. 적어도 18가지 Gm 알로타입이 알려져 있다: nG1m(1), nG1m(2), G1m (1, 2, 3, 17) 또는 G1m (a, x, f, z), G2m (23) 또는 G2m (n), G3m (5, 6, 10, 11, 13, 14, 15, 16, 21, 24, 26, 27, 28) 또는 G3m (b1, c3, b5, b0, b3, b4, s, t, g1, c5, u, v, g5). 2가지 A2m 알로타입 A2m(1)과 A2m(2)가 있다.
항체의 구조와 산출의 상세한 설명을 위해, 본 발명에 전체로서 참고문헌으로 편입되는 Roth, D.B., and Craig, N.L., Cell, 94:411-414 (1998)을 참조한다. 간단히 말하면, 중쇄와 경쇄 면역글로불린 서열을 인코딩하는 DNA를 산출하기 위한 과정은 주로, 발달하는 B-세포에서 일어난다. 다양한 면역글로불린 유전자 분절의 재배열과 연결에 앞서, V, D, J 및 불변 (C) 유전자 분절은 일반적으로, 단일 염색체 상에서 상대적으로 근접하여 발견된다. B-세포-분화 동안, V, D, J (또는 경쇄 유전자의 경우에 단지 V와 J) 유전자 분절의 각각의 적절한 패밀리 구성원은 재조합되어 중쇄와 경쇄 면역글로불린 유전자의 기능적으로 재배열된 가변 영역을 형성한다. 이러한 유전자 분절 재배열 과정은 순차적인 것으로 보인다. 먼저, 중쇄 D-내지-J 조인트가 만들어지고, 그 이후에 중쇄 V-내지-DJ 조인트 및 경쇄 V-내지-J 조인트가 뒤따른다. V, D와 J 분절의 재배열에 더하여, 경쇄 내에 V와 J 분절이 연결되는 장소 및 중쇄의 D와 J 분절이 연결되는 장소에서, 가변 재조합에 의해 면역글로불린 중쇄와 경쇄의 일차 레퍼토리에서 추가의 다양성이 산출된다. 경쇄에서 이런 변이는 전형적으로, V 유전자 분절의 마지막 코돈 및 J 분절의 첫 번째 코돈 내에서 일어난다. 연결에서 유사한 부정확은 중쇄 염색체 상에서 D와 JH 분절 사이에서 일어나고 많게는 10개 뉴클레오티드에 걸쳐 연장될 수 있다. 게다가, 몇몇 뉴클레오티드가 D와 JH 사이에, 그리고 VH와 D 유전자 분절 사이에 삽입될 수 있는데, 이들은 게놈 DNA에 의해 인코딩되지 않는다. 이들 뉴클레오티드의 추가는 N-영역 다양성으로서 알려져 있다. 가변 영역 유전자 분절에서 이런 재배열 및 이런 연결 동안 일어날 수 있는 가변 재조합의 순 효과는 일차 항체 레퍼토리의 생산이다.
용어 "초가변" 영역은 항원-결합을 담당하는 항체의 아미노산 잔기를 지칭한다. 초가변 영역은 상보성 결정 영역 또는 CDR로부터 아미노산 잔기[즉, Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.(1991)에 의해 기술된 바와 같이, 경쇄 가변 도메인에서 잔기 24-34 (L1), 50-56 (L2) 및 89-97 (L3), 그리고 중쇄 가변 도메인에서 31-35 (H1), 50-65 (H2) 및 95-102 (H3)]를 포함한다. 비록 모든 CDR을 내포하는 전체 항원 결합 부위보다 친화성이 낮긴 하지만, 심지어 단일 CDR이 항원을 인식하고 여기에 결합할 수 있다. 전형적인 항체에서, CDR은 중쇄와 경쇄 가변 영역에서 프레임워크 내에 끼워 넣어지는데, 여기서 이들은 항원 결합과 인식을 담당하는 영역을 구성한다. 가변 영역은 프레임워크 영역 (지명된 프레임워크 영역 1-4, FR1, FR2, FR3, 그리고 FR4: Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Public Health Service N.I.H., Bethesda, MD를 참조한다; 또한, Chothia and Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196:901-917; Chothiaet al., 1989, Nature 342:877-883을 참조한다) 내에서, 적어도 3개의 중쇄 또는 경쇄 CDR을 포함한다 (Kabat et al., 1991, supra; 또한, Chothia and Lesk, 1987, supra).
초가변 "루프"로부터 잔기의 대안적 정의는 Chothia et al., J. Mol.Biol. 196: 901-917 (1987)에 의해, 경쇄 가변 도메인에서 잔기 26-32 (L1), 50-52 (L2) 및 91-96 (L3), 그리고 중쇄 가변 도메인에서 26-32 (H1), 53-55 (H2) 및 96-101 (H3)로서 기술된다.
"프레임워크" 또는 "FR" 잔기는 초가변 영역 잔기 이외의 가변 영역 잔기이다.
"항체 단편"은 온전한 전장 항체의 일부분, 바람직하게는 온전한 항체의 항원 결합 또는 가변 영역을 포함한다. 항체 단편의 실례에는 Fab, Fab', F(ab')2, 그리고 Fv 단편; 디아바디; 선형 항체 (Zapata et al., Protein Eng.,8(10):1057-1062 (1995)); 단일-사슬 항체 분자; 그리고 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체가 포함된다.
항체의 파파인 절단은 "Fab" 단편으로 불리는 2개의 동일한 항원-결합 단편을 생산하는데, 이들 각각은 단일 항원-결합 부위, 그리고 불변 영역을 내포하는 잔여 "Fc" 단편을 갖는다. Fab 단편은 모든 가변 도메인, 그리고 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 첫 번째 불변 도메인 (CH1)을 내포한다. Fc 단편은 탄수화물을 전시하고, 그리고 한 부류의 항체를 다른 부류로부터 구별하는 많은 항체 효과기 기능 (가령, 결합 보체 및 세포 수용체)을 담당한다.
펩신 처리는 항체의 VH와 VL 도메인을 포함하는 2개의 "단일-사슬 Fv" 또는 "scFv" 항체 단편을 갖는 F(ab')2 단편을 산출하고, 여기서 이들 도메인은 단일 폴리펩티드 사슬 내에 존재한다. Fab 단편은 항체 힌지 영역으로부터 하나 또는 그 이상의 시스테인을 포함하는 중쇄 CH1 도메인의 카르복시 말단에서 소수의 추가 잔기의 포함에 의해 Fab' 단편과 상이하다. 바람직하게는, Fv 폴리펩티드는 Fv가 항원 결합을 위한 원하는 구조를 형성할 수 있도록 하는, VH와 VL 도메인 사이에 폴리펩티드 링커를 더욱 포함한다. scFv의 재고를 위하여, Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. l 13, Rosenburg and Mooreeds., Springer-Verlag, NewYork, pp. 269-315(1994)를 참조한다.
"Fab 단편"은 CH1의 1개 경쇄 및 1개 중쇄의 가변 영역으로 구성된다. Fab 분자의 중쇄는 다른 중쇄 분자와 이황화 결합을 형성할 수 없다.
"Fab' 단편"은 1개 경쇄, 그리고 VH 도메인, CH1 도메인 및 CH1과 CH2 도메인 사이에 영역을 내포하는 1개 중쇄의 일부분을 내포하고, 따라서 사슬간 이황화 결합이 2개 Fab' 단편의 2개 중쇄 사이에 형성되어 F(ab')2 분자가 형성될 수 있다.
"F(ab')2 단편"은 2개 경쇄, 그리고 CH1과 CH2 도메인 사이에 불변 영역의 일부분을 내포하는 2개 경쇄를 내포하고, 따라서 사슬간 이황화 결합이 2개 중쇄 사이에 형성된다. F(ab')2 단편은 따라서, 2개 중쇄 사이에 이황화 결합에 의해 함께 묶여지는 2개의 Fab' 단편으로 구성된다.
"Fv"는 완전한 항원 인식과 결합 부위를 내포하는 최소 항체 단편이다. 이러한 영역은 단단한 비-공유 결합에서 1개 중쇄-와 1개 경쇄 가변 도메인의 이합체로 구성된다. 이러한 배열에서, 각 가변 도메인의 3개의 CDR은 상호작용하여 VH VL 이합체의 표면 상에서 항원 결합 부위를 정의한다. 단일 가변 도메인 (또는 항원에 특이적인 단지 3개의 CDR만을 포함하는 Fv의 절반)은 비록 전체 결합 부위보다 친화성이 낮긴 하지만, 항원을 인식하고 여기에 결합하는 능력을 갖는다.
"단일-사슬 항체"는 중쇄와 경쇄 가변 영역이 유연성 링커에 의해 연결되어 단일 폴리펩티드 사슬을 형성하는 Fv 분자이고, 이것은 항원-결합 영역을 형성한다. 단일 사슬 항체는 International Patent Application Publication No. WO 88/01649 및 United States Patent No. 4,946,778과 No. 5,260,203에서 상세하게 논의되고, 이들의 내용은 본 발명에 전체로서 참고문헌으로 편입된다.
"단일-사슬 Fv" 또는 "scFv" 항체 단편은 항체의 VH와 VL 도메인을 포함하고, 여기서 이들 도메인은 단일 폴리펩티드 사슬 내에 존재하고, 그리고 Fv가 항원 결합을 위한 원하는 구조를 형성할 수 있도록 하는, VH와 VL 도메인 사이에 폴리펩티드 링커를 선택적으로 포함한다 (Bird et al., Science 242:423-426, 1988, 그리고 Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883, 1988). "Fd" 단편은 VH와 CH1 도메인으로 구성된다.
용어 "디아바디"는 2개의 항원-결합 부위를 갖는 작은 항체 단편을 지칭하고, 이들 단편은 동일한 폴리펩티드 사슬 (VH VL) 내에서 경쇄 가변 도메인 (VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인 (VH)을 포함한다. 동일한 사슬 상에서 2개의 도메인 사이에 대합 (pairing)이 허용되지 않는 짧은 링커를 이용함으로써, 이들 도메인은 다른 사슬의 상보성 도메인과 쌍을 이루도록 강제되고 2개의 항원-결합 부위가 산출된다. 디아바디는 예로써, EP 404,097; WO 93/11161; 그리고 Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)에서 더욱 상세하게 기술된다.
"도메인 항체"는 중쇄의 가변 영역 또는 경쇄의 가변 영역만을 내포하는 면역학적으로 기능성 면역글로불린 단편이다. 일부 경우에, 2개 또는 그 이상의 VH 영역은 펩티드 링커와 공유 연결되어 이가 도메인 항체가 산출된다. 이가 도메인 항체의 이들 두 VH 영역은 동일한 또는 상이한 항원을 표적으로 할 수 있다.
용어 "항원"은 선별적 결합 작용제, 예를 들면, 항원 결합 단백질 (예로써, 항체 또는 이의 면역학적으로 기능성 단편 포함)에 의해 결합될 수 있고, 그리고 추가적으로, 상기 항원에 결합할 수 있는 항체를 생산하기 위해 동물에서 이용될 수 있는 분자 또는 분자의 일부분을 지칭한다. 항원은 상이한 항원 결합 단백질, 예를 들면, 항체와 상호작용할 수 있는 하나 또는 그 이상의 에피토프를 보유할 수 있다.
용어 "에피토프"는 항원 결합 단백질 (가령, 항체)에 의해 결합된 분자의 일부분이다. 상기 용어는 항원 결합 단백질, 예를 들면, 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 결정인자 (determinant)를 포함한다. 에피토프는 연속 또는 비-연속일 수 있다 (가령, 단일-사슬 폴리펩티드에서, 폴리펩티드 서열 내에서 서로 연속하지 않지만 분자의 환경 내에서 연속하는 아미노산 잔기 항체에 의해 결합된다). 일정한 구체예에서, 에피토프는 그들이 항원 결합 단백질 (가령, 항체)을 산출하는데 이용되는 에피토프와 유사하지만, 항원 결합 단백질을 산출하는데 이용되는 상기 에피토프에서 발견되는 아미노산 잔기 중에서 일부만 포함하거나 이들을 포함하지 않는 3차원 구조를 포함한다는 점에서, 모방성일 수 있다. 대부분의 경우에, 에피토프는 단백질 상에 존재하지만, 일부 경우에 다른 종류의 분자, 예를 들면, 핵산 상에 존재할 수도 있다. 에피토프 결정인자는 아미노산, 당 측쇄, 포스포릴 또는 설포닐 기와 같은 분자의 화학적으로 활성 표면 그룹을 포함하고, 그리고 특정한 3차원 구조적 특징 및/또는 특정한 전하 특징을 가질 수 있다. 일반적으로, 특정 표적 항원에 특이적인 항체는 단백질 및/또는 거대분자의 복합 혼합물에서 표적 항원 상에 에피토프를 우선적으로 인식할 것이다.
용어 "동일성"은 서열을 정렬하고 배열함으로써 결정되는, 2개 또는 그 이상의 폴리펩티드 분자 또는 2개 또는 그 이상의 핵산 분자의 서열 간에 상관관계를 지칭한다. "동일성 퍼센트"는 비교되는 분자에서 아미노산 또는 뉴클레오티드 사이에 동일한 잔기의 퍼센트를 의미하고, 그리고 비교되는 분자의 가장 작은 크기에 기초하여 계산된다. 이들 계산을 위하여, 정렬 내에 갭 (존재하면)은 특정한 수학적 모델 또는 컴퓨터 프로그램 (즉, "알고리즘")에 의해 해결되어야 한다. 정렬된 핵산 또는 폴리펩티드의 동일성을 계산하는데 이용될 수 있는 방법에는 Computational Molecular Biology, (Lesk, A. M., ed.), 1988, New York: Oxford University Press; Biocomputing Informatics and Genome Projects, (Smith, D. W., ed.), 1993, New York: Academic Press; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, (Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds.), 1994, New Jersey: Humana Press; von Heinje, G., 1987, Sequence Analysis in Molecular Biology, New York: Academic Press; Sequence Analysis Primer, (Gribskov, M. and Devereux, J., eds.), 1991, New York: M. Stockton Press; and Carillo et al., 1988, SIAM J. Applied Math. 48:1073에서 기술된 것들이 포함된다. 가령, 서열 동일성은 두 폴리펩티드의 아미노산의 위치에서 유사성을 비교하는데 통상적으로 이용되는 표준 방법에 의해 결정될 수 있다. BLAST 또는 FASTA와 같은 컴퓨터 프로그램을 이용하여, 두 폴리펩티드 또는 두 폴리뉴클레오티드 서열은 그들의 개별 잔기의 최적 정합을 위해 정렬된다 (한쪽 또는 양쪽 서열의 전장을 따라서, 또는 한쪽 또는 양쪽 서열의 미리 결정된 부분을 따라서). 이들 프로그램은 디폴트 오프닝 페널티 (default opening penalty) 및 디폴트 갭 페널티 (default gap penalty)를 제공하고, 그리고 채점 매트릭스 (scoring matrix), 예를 들면, PAM 250 [표준 채점 매트릭스; Dayhoff et al., in Atlas of Protein Sequence and Structure, vol. 5, supp. 3 (1978)을 참조한다]가 컴퓨터 프로그램과 공동으로 이용될 수 있다. 가령, 동일성 퍼센트는 이후, 하기와 같이 계산될 수 있다: 동일성 매치의 총수는 100으로 곱셈되고, 이후 정합된 스팬 내에서 더욱 긴 서열의 길이의 합 및 두 서열을 정렬하기 위해 더욱 긴 서열 내로 도입된 갭의 숫자에 의해 나눗셈되었다. 동일성 퍼센트를 계산함에 있어서, 비교되는 서열은 서열 간에 최대 매치를 제공하는 방식으로 정렬된다.
GCG 프로그램 패키지는 동일성 퍼센트를 결정하는데 이용될 수 있는 컴퓨터 프로그램인데, 이러한 패키지는 GAP (Devereux et al., 1984, Nucl. Acid Res. 12:387; Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, WI)를 포함한다. 컴퓨터 알고리즘 GAP는 서열 동일성 퍼센트가 결정되는 두 폴리펩티드 또는 두 폴리뉴클레오티드를 정렬하는데 이용된다. 이들 서열은 그들의 개별 아미노산 또는 뉴클레오티드의 최적 정합 (알고리즘에 의해 결정된, "정합된 스팬")을 위해 정렬된다. 갭 오프닝 페널티 (gap opening penalty) (이것은 3x 평균 사선 (average diagonal)으로서 계산되고, 여기서 "평균 사선"은 이용되는 비교 매트릭스의 사선의 평균이다; "사선"은 특정 비교 매트릭스에 의한 각 완전 아미노산 매치에 지정된 스코어 또는 수이다) 및 갭 신장 페널티 (gap extension penalty) (이것은 통상적으로, 갭 오프닝 페널티의 1/10배이다)뿐만 아니라 비교 매트릭스, 예를 들면, PAM 250 또는 BLOSUM 62가 알고리즘과 공동으로 이용된다. 일정한 구체예에서, 표준 비교 매트릭스 (BLOSUM 62 비교 매트릭스에 대해 Dayhoff et al., 1978, Atlas of Protein Sequence and Structure 5:345-352 for the PAM 250 comparison matrix; Henikoff et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:10915-10919) 역시 알고리즘에 의해 이용된다.
GAP 프로그램을 이용하여 폴리펩티드 또는 뉴클레오티드 서열에 대한 동일성 퍼센트를 결정하기 위한 권장된 파라미터에는 하기가 포함된다:
알고리즘: Needleman et al., 1970, J. Mol. Biol. 48:443-453;
비교 매트릭스: Henikoff et al., 1992, supra로부터 BLOSUM 62;
갭 페널티: 12 (말단 갭에 대한 페널티 없음)
갭 길이 페널티 (Gap Length Penalty): 4
유사성의 역치: 0
두 아미노산 서열을 정렬하기 위한 일정한 정렬 계획은 이들 두 서열의 단지 짧은 영역의 정합만을 결과하고, 그리고 이러한 작은 정렬된 영역은 비록 이들 두 전장 서열 간에 유의미한 상관관계가 없다 하더라도, 매우 높은 서열 동일성을 가질 수 있다. 따라서 선택된 정렬 방법 (GAP 프로그램)은 표적 폴리펩티드의 적어도 50개 연속 아미노산에 걸치는 정렬을 유발하기 위해 이렇게 요망되면, 조정될 수 있다.
용어 "변형"은 폴리펩티드와 공동으로 이용될 때, 하나 또는 그 이상의 아미노산 변화 (치환, 삽입 또는 결실 포함); 화학적 변형; 치료 또는 진단 작용제에 접합에 의한 공유 변형; 표지화 (가령, 형광 라벨, 전기화학발광 라벨, 방사성핵종 또는 기타 동위원소 라벨, 또는 다양한 효소로); 공유 중합체 부착, 예를 들면, PEG화 (폴리에틸렌 글리콜로 유도체화) 및 비-자연 아미노산의 화학적 합성에 의한 삽입 또는 치환이 포함하지만 이들에 국한되지 않는다. 변형된 폴리펩티드는 본 발명의 방법에 이용된 변형되지 않은 분자의 결합 성질을 유지해야 한다.
"접합된"은 적어도 2개의 화학적 모이어티가 공유 연결되거나, 또는 직접적으로, 또는 선택적으로, 이들 모이어티 둘 모두에 자체적으로 공유 연결되는 펩티딜 또는 비-펩티딜 링커 모이어티를 거쳐 서로 결합되는 것을 의미한다. 가령, 공유 연쇄는 알파 아미노 기, 또는 측쇄를 비롯하여, 펩티드 또는 단백질의 아미노산 잔기를 통할 수 있다.
본 발명의 분석평가 방법의 배양 완충액 또는 시약에 대하여 "생리학적 조건 하에"는 생화학적 반응, 예를 들면, 비-공유 결합 반응이 일어나도록 허용하는 온도, pH, 그리고 이온 강도의 조건 하에 배양을 의미한다. 전형적으로, 온도는 약 37℃까지 및 pH 6.5-7.5에서 실온 또는 주위 온도이다.
"차단된"은 예로써, 반응 혼합물이 후기에 첨가될 때, 반응 혼합물 성분에 의한 웰 표면에 비-특이적 결합을 최소화시키는 목적으로 분석평가 완충액과 함께 전배양됨을 의미한다.
"반응 혼합물"은 배양의 생리학적 조건 하에, 관심되는 시험관내 생화학적 반응, 예를 들면, 비-공유 결합 반응이 일어나도록 허용하는, 필요한 모든 시약과 인자를 내포하는 수성 혼합물이다.
"아비딘"은 조류, 파충류 및 양서류의 난관에서 자연적으로 생산되고 그들의 난의 흰자에 전형적으로 저장된 사합체성 비오틴-결합 단백질, 또는 합성 방식으로 또는 재조합 방식으로 생산된 이의 이형, 및/또는 이의 단위체성 또는 다합체성 (가령, 이합체성, 삼합체성 등) 형태이다. 사합체성, 글리코실화된 형태에서, 아비딘은 66-69 kDa 크기인 것으로 추정되고, 그리고 높은 정도의 친화성과 특이성으로 최대 4개의 비오틴 분자에 동시에 결합할 수 있다. (Korpela, J., Avidin, a high affinity biotin-binding protein as a tool and subject of biological research. Med. Bio. 62:5-26 (1984)). 본 발명을 위하여, "아비딘"은 아비딘이 비오틴에 대한 높은 친화성 (10-14 M 내지 10-16 M의 순서에서 해리 평형 상수 KD)을 유지하기만 하면, 글리코실화되거나, 탈글리코실화되거나, 또는 비-글리코실화되거나, 유도체화되거나, 또는 변형될 수 있다, "아비딘"의 의미에는 뉴트라비딘 (또는 NeutrAvidin) 및 스트렙타비딘이 포함된다. "스트렙타비딘"은 세균 스트렙토미세스 아비디니 (Streptomyces avidinii)에 의해 52,800 Da 사합체성 비오틴-결합 단백질로서 자연적으로 생산되고, 여기에는 정제되거나, 또는 합성 방식으로 또는 재조합 방식으로 생산된 이의 이형, 및/또는 이의 단위체성 또는 다합체성 (가령, 이합체성, 삼합체성 등) 형태가 포함된다. 아비딘 (또는 스트렙타비딘)의 재조합 방식으로 조작된 일가 또는 다가 형태 역시 "아비딘"에 포함된다 (가령, Laitinen et al.. Genetically engineered avidins and streptavidins, Cell Mol Life Sci. 63 (24): 2992-30177 (2006); Howarth et al., A monovalent streptavidin with a single femtomolar biotin binding site, Nat Methods 3(4):267-73 (2006)). "아비딘-코팅된"은 폴리스티렌 평판의 고형 표면, 예를 들면, 웰-표면이 아비딘 모이어티로 접합되고, 이들 아비딘 모이어티가 비오틴에 높은 친화성 생리학적 조건 하에, 예를 들면, 10-14 M 내지 10-16 M의 순서에서 해리 평형 상수 KD로 여전히 비-공유 결합할 수 있다는 것을 의미한다. 본 발명의 시험관내 분석평가에서 아비딘-코팅된 웰의 일부 구체예에서, 이용되는 아비딘은 스트렙타비딘 또는 뉴트라비딘이다.
"웰 (well)"은 커버가능 구멍을 통해 수성 액체를 수용하고 내포할 수 있는 챔버이다. 가령, 마이크로역가 평판 (가령, 96- 또는 384-웰 마이크로역가 평판)의 각 개별 구획은 "웰"이다; 단일-구획 용기, 예를 들면, 배양 평판, 페트리 접시, 검사 튜브, 원뿔형 튜브, 또는 함몰 슬라이드의 함몰 역시 "웰"이다. 웰의 구멍은 커버되지 않거나, 또는 제거가능 개별 커버에 의해 별개로, 또는 단일 제거가능 커버에 의해 집합적으로 커버될 수 있다.
"비오틴"은 테트라히드로티오펜 고리와 융합된 우레이도 (테트라히드로이미디잘론) 고리 (화학식 I 참조)로 구성되는 물-용해성 B-복합 비타민, 다시 말하면, 비타민 B7이다.
[화학식 I]:
Figure pct00001

발레르산 치환기는 테트라히드로티오펜 고리의 탄소 원자 중에서 하나에 부착된다. 자연적으로, 비오틴은 지방산과 류신의 대사에서 조효소이고, 그리고 이것은 생체내에서 당신생 (gluconeogenesis)에서 일정한 역할을 수행한다. 비오틴은 사합체성 단백질 아비딘 (가령, 닭 아비딘, 세균 스트렙타비딘, 그리고 뉴트라비딘)에, 10-14 M 내지 10-16 M의 순서에서 해리 평형 상수 KD로 매우 강하게 결합하고, 이것은 강도에서 공유 결합에 근접하는 공지된 가장 강한 단백질-리간드 상호작용 중의 하나이다 (Laitinen et al.. Genetically engineered avidins and streptavidins, Cell Mol Life Sci. 63 (24): 2992-30177 (2006)). 비오틴-아비딘 비-공유 상호작용은 종종, 상이한 생물공학적 적용에 이용된다 (Laitinen et al., Genetically engineered avidins and streptavidins, Cell Mol Life Sci. 63 (24): 2992-30177 (2006)을 참조한다).
"비오틴화된"은 물질이 하나 또는 그 이상의 비오틴 모이어티에 접합된다는 것을 의미한다. 본 발명을 실시하는데 유용한 비오틴화된 펩티드는 상업적으로 (가령, Midwest Bio-Tech Inc.) 구입되거나, 또는 용이하게 합성되고 비오틴화될 수 있다. 화합물, 예를 들면, 펩티드의 비오틴화는 임의의 공지된 화학적 기술에 의해 달성될 수 있다. 이들에는 일차 아민 비오틴화, 설피드릴 비오틴화, 그리고 카르복실 비오틴화가 포함된다. 가령, 리신 측쇄 엡실론-아민과 N-말단 α-아민으로서 존재하는 펩티드 상에서 아민 기는 일차 아민 비오틴화 비오틴화를 위한 통상적인 표적이다. 아민-반응성 비오틴화 시약은 물 용해성 (water solubility)에 기초하여 2가지 군으로 분할될 수 있다.
1) 비오틴의 N-히드록시숙신이미드 (NHS)-에스테르는 수성 용액에서 불량한 용해성을 갖는다. 수성 용액에서 반응을 위하여, 이들은 먼저, 유기 용매에 용해되고, 이후 수성 반응 혼합물 내로 희석되어야 한다. 이러한 목적을 위한 가장 통상적으로 이용되는 유기 용매는 디메틸 설폭시드 (DMSO)와 디메틸 포름아미드 (DMF)인데, 이들은 낮은 농도에서 대부분의 단백질과 조화성이다.
2) 비오틴의 설포-NHS-에스테르는 물에서 더욱 용해성이고, 그리고 사용 직전에 물에 용해되는데, 그 이유는 이들이 쉽게 가수분해되기 때문이다. 설포-NHS-에스테르의 물 용해성은 N-히드록시숙신이미드 고리 상에서 그들의 설폰산염 기에 기인하고, 그리고 유기 용매에서 시약을 용해시키는 필요를 제거한다.
NHS-와 설포-NHS-에스테르의 화학적 반응은 본질적으로 동일하다: 아미드 결합이 형성되고, 그리고 NHS 또는 설포-NHS가 이탈 기 (leaving group)가 된다. 에스테르에 대한 표적이 탈양자화된 일차 아민이기 때문에, 상기 반응은 pH 7 이상에서 우세하다. NHS-에스테르의 가수분해는 주요 경쟁 반응이고, 그리고 가수분해의 속도는 pH가 증가함에 따라 증가한다. NHS-와 설포-NHS-에스테르는 pH 7에서 수 시간의 반감기를 갖지만, pH 9에서 단지 몇분의 반감기를 갖는다. 펩티드의 일차 아민에 NHS-에스테르를 접합하기 위한 조건은 4-37℃ 범위에서 배양 온도, 7-9 범위에서 반응 pH 값, 그리고 몇분 내지 약 12시간의 배양 시간을 포함한다. 아민 (가령, Tris 또는 글리신)을 내포하는 완충액은 피해야 하는데, 그 이유는 이들이 상기 반응과 경쟁하기 때문이다. HABA 염료 (2-(4-히드록시아조벤젠) 벤조산) 방법이 비오틴화의 정도를 결정하는데 이용될 수 있다. 간단히 말하면, HABA 염료는 아비딘에 결합되고 특징적인 흡광도를 산출한다. 비오틴이 비오틴화된 단백질 또는 기타 분자의 형태에서 도입될 때, 이것은 염료를 제거하고 500 nm에서 흡광도에서 변화를 유발한다. 흡광도 범위는 샘플 내에 비오틴의 수준에 직접적으로 비례한다.
본 명세서에서 교체가능하게 이용되는 "CD16a" 또는 "FCGR3" 또는 "IGFR3" 명칭으로 알려져 있는 "FCγRIIIa"는 면역글로불린 G Fc 수용체 III을 의미한다. 인간 CD16a (GenBank Accession AAH17865)는 하기 아미노산 서열을 포함한다:
1 mwqlllptal lllvsagmrt edlpkavvfl epqwyrvlek dsvtlkcqga yspednstqw
61 fhneslissq assyfidaat vddsgeyrcq tnlstlsdpv qlevhigwll lqaprwvfke
121 edpihlrchs wkntalhkvt ylqngkgrky fhhnsdfyip katlkdsgsy fcrglvgskn
181 vssetvniti tqglavstis sffppgyqvs fclvmvllfa vdtglyfsvk tnirsstrdw
241 kdhkfkwrkd pqdk// 서열 번호:11.
하지만, CD16a의 다형성 서열 역시 용어 "CD16a"에 포함된다. 이런 다형성에는 176V (높은 결합 형태) 및 176F (낮은 결합 형태)가 포함된다. CD16a (서열 번호:11)의 254-아미노산 잔기 서열에는 16-잔기 신호 서열; 191-잔기 세포외 도메인 (ECD); 그리고 22-잔기 막통과 도메인 및 25-잔기 C-말단 세포질 도메인이 포함된다. "재조합 인간 CD16a 폴리펩티드"는 가용성인, 재조합 DNA 기술에 의해 생산된 서열 번호:11의 단편 (또는 이의 다형성 변이체)이다. 이런 가용성 단편의 실례는 서열 번호:11의 G17-Q208 단편이고, 이것은 추정 ECD를 포함한다:
17 gmrt edlpkavvfl epqwyrvlek dsvtlkcqga yspednstqw
61 fhneslissq assyfidaat vddsgeyrcq tnlstlsdpv qlevhigwll lqaprwvfke
121 edpihlrchs wkntalhkvt ylqngkgrky fhhnsdfyip katlkdsgsy fcrglvgskn
181 vssetvniti tqglavstis sffppgyq//서열 번호:12. "재조합 인간 CD16a 폴리펩티드"의 다른 구체예는 인간 IgG에 50 nM 이하의 추정된 KD로 결합하는 능력을 유지하는 서열 번호:12의 더욱 작은 단편을 포함한다.
"폴리히스티딘-태그된"은 재조합 인간 CD16a 폴리펩티드가 적어도 5개, 하지만 전형적으로 6개 ("헥사 히스티딘-태그" 또는 "6xHis-태그") 내지 18개 연속 히스티딘 잔기를 포함하는 재조합 인간 CD16a 폴리펩티드의 N-말단 또는 C-말단 신장으로서, 합성 기술 (가령, Peterson, US Patent No. 5,840,834, Technique for joining amino acid sequences and novel composition useful in immunoassays)에 의해, 또는 재조합 DNA 기술에 의해 접합된다는 것을 의미한다. 폴리히스티딘-태그된 재조합 인간 CD16a 폴리펩티드는 또한, 상업적으로 구입가능하다 (가령, R&D Systems Catalog #4325-FC). 폴리히스티딘에 특이적으로 결합하는 항체 및 이들을 만들기 위한 방법은 당분야에 널리 공지되어 있고, 그리고 이런 항체는 상업적으로 구입가능하다. (가령, Zentgraf et al., Antibodies active against a fusion polypeptide comprising a histidine portion, US Patent No. 6,790,940과 US Patent No. 7,713,712; Sigma-Aldrich Product #H1029; R&D Systems Catalog #MAB050). 본 발명의 시험관내 분석평가 방법의 일부 구체예에서, 폴리히스티딘에 특이적으로 결합하는 항체, 또는, 다른 구체예에서, 폴리히스티딘에 특이적으로 결합하는 항체에 특이적으로 결합하는 항체는 항체에 접합된 신호-발생 라벨, 예를 들면, 형광 라벨, 동위원소 라벨, 전기화학발광 라벨, 또는 기질을 분광측정, 비색, 형광측정, 발광측정 또는 기타 기구 (가령, 양고추냉이 과산화효소-, 베타-갈락토시다아제-, 또는 루시페라아제-기초된 검출 시스템)에 의해 쉽게 검출될 수 있는 반응물질로 전환시키는 반응을 촉진할 수 있는 효소를 더욱 포함한다.
"전기화학발광" (ECL), 또는 교체가능하게 "전기발생된 화학발광"은 용액에서 전기화학 반응 동안 발생된 일종의 발광이다. ECL에서, 전기화학적으로 발생된 중간물질은 높은 에너지방출성 반응을 겪고 전자적으로 여기된 상태가 산출되고, 이후 광이 방출된다 (Forster et al., Electrogenerated Chemiluminescence, Annual Review of Analytical Chemistry 2: 359-385 (2009)). ECL 여기는 전기발생된 종류의 활동적인 전자 전달 (redox) 반응에 의해 유발된다. 이들 전자-전달 반응은 다중환형 방향족 탄화수소와 금속 복합체를 비롯한 여기된 상태의 발광단이 광여기 (photoexcitation) 없이 산출될 수 있을 만큼 충분히 에너지방출성이다. 가령, 트리프로필아민의 존재에서 [Ru(bpy)3]2+의 산화는 광여기에 의해 발생된 방사와 유사한 광 방사를 유발한다. 이런 루테늄 복합체는 본 발명의 목적을 위한 화학발광 라벨로서 유용하게 이용될 수 있다. 가령, Meso Scale Discovery (MSD; Gaithersburg, MD) 설포-TagTM ECL 검출 시스템은 루테늄 복합체를 내포하는 전기화학발광 라벨에 의존한다. 설포-TagTM 시스템에서, 하기 화학식 (II)을 갖는 활성화된 N-히드록시숙신이미드 에스테르가 라벨을 형성하는데 이용된다:
[화학식 II]
Figure pct00002

제조업체의 지시 (MSD 설포-TagTM NHS-에스테르, 17794-v2-2008May, (2008))에 따라서, 활성화된 N-히드록시숙신이미드 에스테르는 표지되는 폴리펩티드, 예를 들면, 항체와 반응된다. 앞서 언급된 바와 같이, NHS-와 설포-NHS-에스테르의 화학적 반응은 본질적으로 동일하다: 아미드 결합이 형성되고, 그리고 NHS 또는 설포-NHS가 이탈 기 (leaving group)가 된다. 에스테르에 대한 표적이 탈양자화된 일차 아민이기 때문에, 상기 반응은 pH 7 이상에서 우세하다. 펩티드의 일차 아민에 NHS-에스테르를 접합하기 위한 조건은 4-37℃ 범위에서 배양 온도, 7-9 범위에서 반응 pH 값, 그리고 몇분 내지 약 12시간의 배양 시간을 포함한다. 아민 (가령, Tris 또는 글리신)을 내포하는 완충액은 피해야 하는데, 그 이유는 이들이 상기 반응과 경쟁하기 때문이다. 표지화 반응의 표지화된 폴리펩티드 산물은 하기 화학식 (III)을 갖는 루테늄 복합체를 포함하는 전기화학발광 라벨을 포함하고, 여기서 카르보닐 기로부터 그어진 라인은 분자의 나머지 부분에 부착을 보여준다:
[화학식 III]
Figure pct00003
.
본 발명의 시험관내 분석평가 방법의 일부 구체예에서, 전배양된 반응 혼합물은 중화 항체의 존재에 대해 조사되는 혈청 샘플을 더욱 내포한다. "중화 항체" (NAb)는 생체내에서 또는 샘플에서 시험관내에서, 관심되는 항원에 특이적으로 결합함으로써 이의 혈청 역가를 감소시킬 수 있는 항체, 예를 들면, IgG 표적 항체이다. 생체내에서, NAb는 치료 분자의 활성 부위 내에 놓여있는 에피토프(들)에 직접적으로 결합함으로써, 또는 활성 부위에 매우 근접하는 에피토프(들)에 결합에 기인한 입체 방해 (steric hindrance)에 의해 이의 활성 부위를 차단함으로써 치료 분자의 생물학적 활성을 차단한다. 일정한 경우에 NAb 존재가 임상적 효과를 유발하지 않을 수도 있지만, 다른 경우에 충분한 NAb 수준에서 효능의 감소가 관찰될 수 있는데, 이것은 유사한 효능을 달성하기 위해 약물 산물의 더욱 높은 용량의 투여를 필요로 할 수 있다. (예로써, Gupta et al., Recommendations for the design, optimization, and qualification of cell-based assays used for the detection of neutralizing antibody responses elicited to biological therapeutics, Journal of Immunological Methods 321(1-2):1-18 (2007)을 참조한다)
다른 경우에, 효능의 감소가 관찰될 수 있는데, 이것은 유사한 효능을 달성하기 위하여 약물 산물의 더욱 높은 용량의 투여를 필요로 할 수 있다.
관심되는 "표적 단백질"은 항체에 대한 특이적인 표적으로서 과학적으로, 의학적으로, 임상적으로, 또는 치료적으로 관심되는 인간 단백질이 포함되지만 이에 국한되지 않는 임의의 단백질이다. 관심되는 표적 단백질의 한 가지 실례는 케모킨 수용체 유형 4 (CCR4)이다. 인간 CCR4의 아미노산 서열은 하기와 같다 (Genbank Accession P51679):
1 mnptdiadtt ldesiysnyy lyesipkpct kegikafgel flpplyslvf vfgllgnsvv
61 vlvlfkykrl rsmtdvylln laisdllfvf slpfwgyyaa dqwvfglglc kmiswmylvg
121 fysgiffvml msidrylaiv havfslrart ltygvitsla twsvavfasl pgflfstcyt
181 ernhtycktk yslnsttwkv lssleinilg lviplgimlf cysmiirtlq hcknekknka
241 vkmifavvvl flgfwtpyni vlfletlvel evlqdctfer yldyaiqate tlafvhccln
301 piiyfflgek frkyilqlfk tcrglfvlcq ycgllqiysa dtpsssytqs tmdhdlhdal // 서열 번호:1.
관심되는 표적 단백질의 다른 실례는 B-림프구 항원 CD20이다. 인간 CD20의 아미노산 서열은 하기와 같다 (Genbank Accession NP_690605):
1 mttprnsvng tfpaepmkgp iamqsgpkpl frrmsslvgp tqsffmresk tlgavqimng
61 lfhialggll mipagiyapi cvtvwyplwg gimyiisgsl laateknsrk clvkgkmimn
121 slslfaaisg milsimdiln ikishflkme slnfirahtp yiniyncepa npseknspst
181 qycysiqslf lgilsvmlif affqelviag ivenewkrtc srpksnivll saeekkeqti
241 keevvglt etssqpknee dieiipiqee eeeetetnfp eppqdqessp iendssp// 서열 번호:2.
관심되는 표적 단백질의 다른 실례는 HER2이다. 인간 HER2 (일명, 종양유전자 ERBB2, 티로신-단백질 키나아제 erbB-2, 종양유전자 NGL, NEU, 또는 TKR1)의 아미노산 서열은 하기와 같다 (Genbank Accession P04626):
1 melaalcrwg lllallppga astqvctgtd mklrlpaspe thldmlrhly qgcqvvqgnl
61 eltylptnas lsflqdiqev qgyvliahnq vrqvplqrlr ivrgtqlfed nyalavldng
121 dplnnttpvt gaspgglrel qlrslteilk ggvliqrnpq lcyqdtilwk difhknnqla
181 ltlidtnrsr achpcspmck gsrcwgesse dcqsltrtvc aggcarckgp lptdccheqc
241 aagctgpkhs dclaclhfnh sgicelhcpa lvtyntdtfe smpnpegryt fgascvtacp
301 ynylstdvgs ctlvcplhnq evtaedgtqr cekcskpcar vcyglgmehl revravtsan
361 iqefagckki fgslaflpes fdgdpasnta plqpeqlqvf etleeitgyl yisawpdslp
421 dlsvfqnlqv irgrilhnga ysltlqglgi swlglrslre lgsglalihh nthlcfvhtv
481 pwdqlfrnph qallhtanrp edecvgegla chqlcarghc wgpgptqcvn csqflrgqec
541 veecrvlqgl preyvnarhc lpchpecqpq ngsvtcfgpe adqcvacahy kdppfcvarc
601 psgvkpdlsy mpiwkfpdee gacqpcpinc thscvdlddk gcpaeqrasp ltsiisavvg
661 illvvvlgvv fgilikrrqq kirkytmrrl lqetelvepl tpsgampnqa qmrilketel
721 rkvkvlgsga fgtvykgiwi pdgenvkipv aikvlrents pkankeilde ayvmagvgsp
781 yvsrllgicl tstvqlvtql mpygclldhv renrgrlgsq dllnwcmqia kgmsyledvr
841 lvhrdlaarn vlvkspnhvk itdfglarll dideteyhad ggkvpikwma lesilrrrft
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961 idsecrprfr elvsefsrma rdpqrfvviq nedlgpaspl dstfyrslle dddmgdlvda
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1081 agsdvfdgdl gmgaakglqs lpthdpsplq rysedptvpl psetdgyvap ltcspqpeyv
1141 nqpdvrpqpp spregplpaa rpagatlerp ktlspgkngv vkdvfafgga venpeyltpq
1201 ggaapqphpp pafspafdnl yywdqdpper gappstfkgt ptaenpeylg ldvpv// 서열 번호:13.
"폴리펩티드 부분"은 표적 단백질의 항원성 펩티딜 부분을 포함하는 관심되는 표적 단백질의 부분집합이다. 전형적으로, 이런 "폴리펩티드 부분"은 적어도 5개 내지 6개 연속 아미노산 잔기를 포함하고 크게는 관심되는 전체 단백질일 수 있다. 더욱 전형적으로, "폴리펩티드 부분"은 10개 내지 40개 아미노산 잔기 길이를 갖는다. "폴리펩티드 부분"은 표적 항원 결합 단백질 또는 IgG 표적 항체의 적어도 하나의 CDR, 또는 다른 구체예에서 적어도 2개의 CDR, 또는 또 다른 구체예에서 적어도 3개의 CDR이 특이적으로 결합하는 표적 단백질의 아미노산 잔기를 포함한다.
"표적 항원 결합 단백질"은 관심되는 표적 단백질의 폴리펩티드 부분에 특이적으로 결합하고, 그리고 CD16a 결합 부위를 갖는 Fc 도메인 역시 포함하는 항원 결합 단백질이다. IgG 표적 항체는 "표적 항원 결합 단백질"의 실례이다.
"IgG 표적 항체"는 관심되는 표적 단백질의 폴리펩티드 부분에 특이적으로 결합하고, 그리고 CD16a 결합 부위를 갖는 Fc 도메인 역시 포함하는 항체이다.
항체의 생산
다중클론성 항체. 다중클론성 항체는 바람직하게는, 관련된 항원과 어쥬번트의 복수 피하 (sc) 또는 복막내 (ip) 주사에 의해 동물에서 발생된다. 대안으로, 항원은 동물의 림프절 내로 직접적으로 주사될 수도 있다 (Kilpatrick et al., Hybridoma, 16:381-389, 1997을 참조한다). 향상된 항체 반응은 면역되는 종에서 면역원성인 단백질, 예를 들면, 키홀 림펫 헤모시아닌, 혈청 알부민, 소 티로글로불린, 또는 이중기능성 또는 유도체화 작용제를 이용하여 콩 트립신 저해제, 예를 들면, 말레이미도벤조일 설포숙신이미드 에스테르 (시스테인 잔기를 통해 접합), N-히드록시숙신이미드 (리신 잔기를 통해), 글루타르알데히드, 숙신산 무수물 또는 당분야에 공지된 기타 작용제에 관련된 항원을 접합함으로써 획득될 수 있다.
동물은 예로써, 100 μg의 단백질 또는 접합체 (생쥐의 경우)를 3 볼륨의 Freund의 완전 어쥬번트와 합동시키고, 그리고 상기 용액을 복수 부위에서 피내 주사함으로써, 항원, 면역원성 접합체, 또는 유도체에 대해 면역화된다. 1개월후, 이들 동물은 복수 부위에서 피하 주사에 의해 Freund의 완전 어쥬번트에서 본래 양의 1/5 내지 1/10의 펩티드 또는 접합체가 추가 접종된다. 추가접종 주사후 7-14일 시점에, 이들 동물은 채혈되고, 그리고 혈청이 항체 역가에 대해 분석평가된다. 이들 동물은 역가 고원기까지 추가 접종된다. 바람직하게는, 이들 동물은 동일한 항원을 갖지만, 상이한 단백질에 및/또는 상이한 가교-연결 시약을 통해 접합된 접합체로 추가 접종된다. 접합체는 또한, 재조합 세포 배양액에서 단백질 융합체로서 만들어질 수 있다. 또한, 응집 작용제 (aggregating agent), 예를 들면, 백반이 면역 반응을 증강시키는데 적절하게 이용된다.
단일클론성 항체. 단일클론성 항체는 예로써, 면역화 일정의 완결후 유전자도입 동물로부터 수확된 비장 세포를 영속화함으로써, 당분야에 공지된 임의의 기술을 이용하여 생산될 수 있다. 비장 세포는 당분야에 공지된 임의의 기술을 이용하여, 예를 들면, 이들을 골수종 세포와 융합하여 하이브리도마를 생산함으로써 영속화될 수 있다. 가령, 단일클론성 항체는 Kohler et al., Nature, 256:495 (1975)에 의해 처음 개발된 하이브리도마 방법을 이용하여 만들어지거나, 또는 항체를 글리코실화시킬 수 있는 포유동물 세포주 (가령, CHO 세포)를 선택적으로 이용하여 경쇄와 중쇄의 전반적으로 동몰 생산을 용이하게 하는 "스플릿 DHFR" 방법과 같은 방법 (예로써, Page, Antibody production, EP0481790 A2 및 US Patent No. 5,545,403을 참조한다)을 비롯한 재조합 DNA 방법 (가령, Cabilly et al., Methods of producing immunoglobulins, vectors and transformed host cells for use therein, US Patent No. 6,331,415)에 의해 만들어질 수 있다.
단일클론성 하이브리도마 방법에서, 생쥐 또는 다른 적절한 숙주 포유동물, 예를 들면, 쥐, 햄스터 또는 짧은꼬리원숭이는 면역화에 이용된 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 생산하거나 생산할 수 있는 림프구를 유도하기 위해 본 명세서에서 기술된 바와 같이 면역화된다. 대안으로, 림프구는 시험관내에서 면역화될 수도 있다. 림프구는 이후, 적절한 융합 작용제, 예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜을 이용하여 골수종 세포와 융합되어 하이브리도마 세포를 형성한다 (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)).
하이브리도마 세포는 일단 제조되면, 융합되지 않은 부모 골수종 세포의 성장 또는 생존을 저해하는 하나 또는 그 이상의 물질을 가급적 내포하는 적절한 배양 배지에서 접종되고 성장된다. 가령, 부모 골수종 세포가 효소 히포크산틴 구아닌 포스포리보실 전이효소 (HGPRT 또는 HPRT)를 결여하면, 하이브리도마에 대한 배양 배지는 전형적으로, 히포크산틴, 아미노프테린, 그리고 티미딘 (HAT 배지)을 포함할 것이고, 이들 물질은 HGPRT-결함성 세포의 성장을 예방한다.
바람직한 골수종 세포는 효율적으로 융합하고, 선별된 항체-생산 세포에 의한 항체의 안정된 높은-수준 생산을 뒷받침하고, 그리고 배지에 민감성인 것들이다. 인간 골수종과 생쥐-인간 헤테로골수종 세포주는 또한, 인간 단일클론성 항체의 생산에 대해 기술되었다 (Kozbor, J. Immunol., 133: 3001 (1984) ;Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)). 하이브리도마-생산 융합 절차에서 이용을 위한 골수종 세포는 바람직하게는, 비-항체-생산이고, 높은 융합 효율을 갖고, 그리고 원하는 융합된 세포 (하이브리도마)의 성장만을 뒷받침하는 일정한 선별 배지에서 이들이 성장할 수 없도록 만드는 효소 결핍을 갖는다. 생쥐 융합체에서 이용하는데 적합한 세포주의 실례에는 Sp-20, P3-X63/Ag8, P3-X63-Ag8.653, NS1/1.Ag 4 1, Sp210-Ag14, FO, NSO/U, MPC-11, MPC11-X45-GTG 1.7과 S194/5XXO Bul이 포함된다; 쥐 융합체에 이용된 세포주의 실례에는 R210.RCY3, Y3-Ag 1.2.3, IR983F와 4B210이 포함된다. 세포 융합에 유용한 다른 세포주는 U-266, GM1500-GRG2, LICR-LON-HMy2와 UC729-6이다.
하이브리도마 세포가 성장하는 배양 배지는 항원을 지향하는 단일클론성 항체의 생산에 대해 분석평가된다. 바람직하게는, 하이브리도마 세포에 의해 생산된 단일클론성 항체의 결합 특이성은 면역침전에 의해 또는 시험관내 결합 분석평가, 예를 들면, 방사면역검정 (RIA) 또는 효소-연결된 면역흡착 분석평가 (ELISA)에 의해 결정된다. 단일클론성 항체의 결합 친화성은 예로써, BIAcore® 또는 Scatchard 분석에 의해 결정될 수 있다 (Munson et al., Anal. Biochem., 107:220 (1980); Fischer et al., A peptide-immunoglobulin-conjugate, WO 2007/045463 A1, Example 10, 이것은 본 발명에 전체로서 참고문헌으로 편입된다).
원하는 특이성, 친화성, 및/또는 활성의 항체를 생산하는 하이브리도마 세포가 확인된 이후, 이들 클론은 제한 희석 (limiting dilution) 절차에 의해 서브클로닝되고 표준 방법에 의해 성장될 수 있다 (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)). 이러한 목적을 위한 적절한 배양 배지에는 예로써, D-MEM 또는 RPMI-1640 배지가 포함된다. 이에 더하여, 하이브리도마 세포는 동물에서 복수 종양 (ascites tumor)으로서 생체내에서 성장될 수 있다.
하이브리도마 또는 mAb는 특정 성질, 예를 들면, 특정 항원 또는 표적과의 결합 친화성을 갖는 mAb를 확인하기 위해 더욱 스크리닝될 수 있다. 서브클론에 의해 분비된 단일클론성 항체는 전통적인 면역글로불린 정제 절차, 예를 들면, 단백질 A-세파로오스, 히드록실아파티트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석, 친화성 크로마토그래피, 또는 당분야에 공지된 임의의 다른 적절한 정제 기술에 의해 배양 배지, 복수액, 또는 혈청으로부터 적절하게 분리된다.
항체 및 기타 폴리펩티드의 재조합 생산. 본 발명에서는 임의의 폴리펩티드, 융합 펩티드, 또는 항원 결합 단백질을 인코딩하는 단리된 핵산, 예를 들면, 이들 핵산을 포함하는 숙주 세포, 벡터와 숙주 세포에 의해 인식되는 제어 서열에 선택적으로 작동가능하게 연결된, 본 명세서에서 기술된 본 발명의 항체 단편을 비롯한 항체 (다중클론성과 단일클론성), 그리고 이들 항체의 생산을 위한 재조합 기술을 제시하고, 이들 기술은 핵산이 발현되도록 숙주 세포를 배양하고, 그리고 숙주 세포 배양액 또는 배양 배지로부터 항체를 선택적으로 회수하는 것을 포함할 수 있다. 유사한 물질과 방법이 다른 폴리펩티드의 생산에 적용된다.
관심되는 면역글로불린 또는 폴리펩티드로부터 관련된 아미노산 서열은 직접적인 단백질 서열화에 의해 결정될 수 있고, 그리고 적절한 인코딩 뉴클레오티드 서열은 보편적 코돈 결합표에 따라 설계될 수 있다. 대안으로, 단일클론성 항체를 인코딩하는 게놈 또는 cDNA는 전통적인 절차를 이용하여 (가령, 단일클론성 항체의 중쇄와 경쇄를 인코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 이용하여) 이런 항체를 생산하는 세포로부터 단리되고 서열화될 수 있다.
DNA의 클로닝은 표준 기술을 이용하여 수행된다 (예로써, 본 발명에 참고문헌으로 편입되는 Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Guide, Vols 1-3, Cold Spring Harbor Press를 참조한다). 가령, cDNA 라이브러리는 polyA+ mRNA, 바람직하게는 막-결합된 mRNA, 그리고 인간 면역글로불린 폴리펩티드 유전자 서열에 특이적인 프로브를 이용하여 스크리닝된 라이브러리의 역전사에 의해 작제될 수 있다. 한 구체예에서, 하지만, 관심되는 면역글로불린 유전자 분절 (가령, 경쇄 또는 중쇄 가변 분절)을 인코딩하는 cDNA (또는 전장 cDNA의 일부분)를 증폭하기 위해 중합효소 연쇄 반응 (PCR)이 이용된다. 증폭된 서열은 임의의 적절한 벡터, 예를 들면, 발현 벡터, 미니유전자 벡터, 또는 파지 전시 벡터 내로 용이하게 클로닝될 수 있다. 관심되는 면역글로불린 폴리펩티드의 일부 부분의 서열을 결정하는 것이 가능하기만 하면, 이용된 클로닝의 특정 방법은 중요하지 않은 것으로 인지될 것이다.
항체 핵산에 대한 한 가지 공급원은 관심되는 항원으로 면역화된 동물로부터 B 세포를 획득하고 이를 영속 세포에 융합함으로써 생산된 하이브리도마이다. 대안으로, 핵산은 면역화된 동물의 B 세포 (또는 전체 비장)으로부터 단리될 수 있다. 항체를 인코딩하는 핵산의 또 다른 공급원은 예로써, 파지 전시 기술을 통해 산출된 이런 핵산의 라이브러리이다. 관심되는 펩티드, 예를 들면, 원하는 결합 특징을 갖는 가변 영역 펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 표준 기술, 예를 들면, 패닝 (panning)에 의해 확인될 수 있다.
면역글로불린 폴리펩티드의 전체 가변 영역을 인코딩하는 서열이 결정될 수 있다; 하지만, 때때로 가변 영역, 예를 들면, CDR-인코딩 부분의 일부분만 서열화하는 것이 적절할 것이다. 서열화는 표준 기술을 이용하여 수행된다 (예로써, 본 발명에 참고문헌으로 편입되는 Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Guide, Vols 1-3, Cold Spring Harbor Press, 그리고 Sanger, F. et al. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463-5467을 참조한다). 클로닝된 핵산의 서열을 인간 면역글로불린 유전자와 cDNA의 공개된 서열과 비교함으로써, 당업자는 서열화된 영역에 따라, (i) 하이브리도마 면역글로불린 폴리펩티드 (중쇄의 아이소타입 포함)의 생식계열 분절 이용량 및 (ii) N-영역 부가 및 체세포 돌연변이의 과정에 기인하는 서열을 비롯한 중쇄와 경쇄 가변 영역의 서열을 용이하게 결정할 수 있을 것이다. 면역글로불린 유전자 서열 정보의 한 가지 공급원은 National Center for Biotechnology Information, National Library of Medicine, National Institutes of Health, Bethesda, Md이다.
단리된 DNA는 제어 서열에 작동가능하게 연결되거나, 또는 발현 벡터 내에 배치될 수 있고, 이들은 이후, 재조합 숙주 세포에서 단일클론성 항체의 합성을 주동하기 위해, 면역글로불린 단백질을 만약 그렇지 않으면 생산하지 않는 숙주 세포 내로 형질감염된다. 항체의 재조합 생산은 당분야에 널리 공지된다.
핵산은 다른 핵산 서열과 기능성 상관관계에 놓여질 때, 작동가능하게 연결된다. 가령, 전서열 또는 분비 리더에 대한 DNA는 폴리펩티드의 분비에 참여하는 전단백질로서 발현되면, 폴리펩티드에 대한 DNA에 작동가능하게 연결된다; 프로모터 또는 인핸서는 코딩 서열의 전사에 영향을 주면, 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다; 또는 리보솜 결합 부위는 번역이 조장되도록 위치되면, 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, "작동가능하게 연결된"은 연결되는 DNA 서열이 연속이고, 그리고 분비 리더의 경우에, 연속이고 판독 단계 (reading phase)에 있다는 것을 의미한다. 하지만, 인핸서는 연속일 필요가 없다. 연결은 편의한 제한 부위에서 결찰에 의해 달성된다. 이런 부위가 존재하지 않으면, 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 링커가 전통적인 관례에 따라 이용된다.
많은 벡터는 당분야에 공지되어 있다. 벡터 성분은 하기 중에서 하나 또는 그 이상을 포함할 수 있다: 신호 서열 (예로써, 항체의 분비를 주동할 수 있다; 가령, ATGGACATGAGGGTGCCCGCTCAGCTCCTGGGGCTCCTGCTGCTGTGGCTGAGAGGTGCGCGCTGT// 서열 번호:9, 이것은 VK-1 신호 펩티드 서열 MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARC// 서열 번호:10을 인코딩한다), 복제 기점, 하나 또는 그 이상의 선별성 마커 유전자 (예로써, 항생제 또는 다른 약물 내성을 공여하거나, 영양요구성 결함 (auxotrophic deficiency)을 보완하거나, 또는 배지에서 가용하지 않은 중요한 영양소를 공급할 수 있다), 인핸서 요소, 프로모터, 그리고 전사 종결 서열, 이들 모두 당분야에 널리 공지되어 있다.
세포, 세포주, 그리고 세포 배양액은 종종, 교체가능하게 이용되고, 그리고 이와 같은 모든 명칭은 자손을 포함한다. 형질전환체와 형질전환된 세포에는 일차 대상 세포 및 이전의 횟수에 상관없이 이로부터 유래된 배양액이 포함된다. 또한, 모든 자손은 계획된 또는 우연한 돌연변이로 인하여, DNA 함량에서 정확하게 일치하지 않을 수 있는 것으로 이해된다. 본래 형질전환된 세포에 대해 스크리닝된 바와 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 돌연변이 자손이 포함된다.
예시적인 숙주 세포에는 원핵생물, 효모, 또는 고등 진핵생물 세포가 포함된다. 원핵 숙주 세포에는 전정세균, 예를 들면, 그람-음성 또는 그람-양성 생물체, 예를 들면, 장내세균, 예를 들면, 에스체르키아 (Escherichia), 예를 들면, 대장균 (E. coli), 엔테로박터 (Enterobacter), 에르비니아 (Erwinia), 클렙시엘라 (Klebsiella), 프로테우스 (Proteus), 살모넬라 (Salmonella), 예를 들면, 살모넬라 티피무리움 (Salmonella typhimurium), 세라티아 (Serratia), 예를 들면, 세라티아 마르체센스 (Serratia marcescans), 그리고 쉬겔라 (Shigella)뿐만 아니라 바실루스 (Bacillus), 예를 들면, 바실루스 서브틸리스 (B . subtilis)와 바실루스 리케니포르미스 (B . licheniformis), 슈도모나스 (Pseudomonas), 그리고 스트렙토미세스 (Streptomyces)가 포함된다. 진핵 미생물, 예를 들면, 섬유상 진균 또는 효모는 재조합 폴리펩티드 또는 항체에 대한 적절한 클로닝 또는 발현 숙주이다. 사카로미세스 세레비시에 (Saccharomyces cerevisiae), 또는 통상의 빵 효모는 하등 진핵 숙주 미생물 중에서 가장 통상적으로 이용되는 것이다. 하지만, 다수의 다른 속, 종, 그리고 균주, 예를 들면, 피치아 (Pichia), 예를 들면, 피치아 파스토리스 (P . pastoris), 쉬조사카로미세스 폼베 (Schizosaccharomyces pombe); 클루이베로미세스 (Kluyveromyces), 야로위아 (Yarrowia); 칸디다 (Candida); 트리코더마 레에시아 (Trichoderma reesia); 뉴로스포라 크라싸 (Neurospora crassa); 슈반니오미세스 (Schwanniomyces), 예를 들면, 슈바니오미세스 옥시덴탈리스 (Schwanniomyces occidentalis); 그리고 섬유상 진균, 예를 들면, 뉴로스포라 (Neurospora), 페니실륨 (Penicillium), 톨리포클라디움 (Tolypocladium), 그리고 아스페르길루스 (Aspergillus) 숙주, 예를 들면, 아스페르길루스 니둘란스 (A. nidulans) 및 아스페르길루스 니제르 (A. niger)가 통상적으로 이용가능하고 본 발명에서 유용하다.
글리코실화된 항체의 발현을 위한 숙주 세포는 다세포 생물체로부터 유래될 수 있다. 무척추 세포의 실례에는 식물과 곤충 세포가 포함된다. 스포도프테라 프루기페르다 (Spodoptera frugiperda) (모충), 아에데스 아에집티 (Aedes aegypti) (모기), 아에데스 알보픽투스 (Aedes albopictus) (모기), 드로소필라 멜라노가스터 (Drosophila melanogaster) (초파리), 그리고 봄빅스 모리 (Bombyx mori)와 같은 숙주로부터 다수의 바큘로바이러스 균주와 변이체 및 상응하는 복제허용성 곤충 숙주 세포가 확인되었다. 이런 세포의 형질감염을 위한 다양한 바이러스 균주, 예를 들면, 오토그라파 캘리포니카 (Autographa californica) NPV의 L-1 변이체 및 봄빅스 모리 (Bombyx mori) NPV의 Bm-5 균주는 공개적으로 이용가능하다.
척추동물 숙주 세포 역시 적합한 숙주이고, 그리고 이런 세포로부터 폴리펩티드 (항원 결합 단백질, 예를 들면, 항체와 항체 단편 포함)의 재조합 생산은 일과적인 절차이다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 실례는 CHOK1 세포 (ATCC CCL61), DXB-11, DG-44, 그리고 중국 햄스터 난소 세포/-DHFR을 비롯한 중국 햄스터 난소 세포 (CHO, Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216 (1980)); SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주 (COS-7, ATCC CRL 1651); 인간 태아 신장 세포주 (293 세포 또는 현탁 배양에서 성장을 위해 서브클로닝된 293 세포 [Graham et al., J. Gen Virol. 36: 59 (1977)]; 아기 햄스터 신장 세포 (BHK, ATCC CCL 10); 생쥐 세르톨리 세포 (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23: 243-251 (1980)); 원숭이 신장 세포 (CV1 ATCC CCL 70); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO-76, ATCC CRL-1587); 인간 자궁경부 암종 세포 (HELA, ATCC CCL 2); 개 신장 세포 (MDCK, ATCC CCL 34); 버펄로 쥐 간 세포 (BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐 세포 (W138, ATCC CCL 75); 인간 간종양 세포 (Hep G2, HB 8065); 생쥐 유방암 (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI 세포 (Mather et al., Annals N.Y Acad. Sci. 383: 44-68 (1982)); MRC 5 세포 또는 FS4 세포; 또는 포유동물 골수종 세포이다.
숙주 세포는 폴리펩티드 (항원 결합 단백질, 예를 들면, 항체 포함)의 생산을 위해 앞서 기술된 핵산 또는 벡터로 형질전환되거나 형질감염되고, 그리고 프로모터를 유도하거나, 형질전환체를 선별하거나, 또는 원하는 서열을 인코딩하는 유전자를 증폭하기 위해 적절하게 변형된 전통적인 영양 배지에서 배양된다. 이에 더하여, 신규한 벡터 및 선별성 마커에 의해 분리된 전사 단위의 복수 사본을 갖는 형질감염된 세포주는 폴리펩티드, 예를 들면, 항체의 발현에 특히 유용하다.
본 발명에 유용한 폴리펩티드를 생산하는데 이용되는 숙주 세포는 다양한 배지에서 배양될 수 있다. 상업적으로 구입가능한 배지, 예를 들면, Ham의 F10 (Sigma), 최소 필수 배지 ((MEM), (Sigma), RPMI-1640 (Sigma), 그리고 Dulbecco의 변형된 Eagle 배지 ((DMEM), Sigma)가 숙주 세포를 배양하는데 적합하다. 이에 더하여, Ham et al., Meth. Enz. 58: 44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem. 102: 255 (1980), U.S. Patent Nos. 4,767,704; 4,657,866; 4,927,762; 4,560,655; 또는 5,122,469; WO90103430; WO 87/00195; 또는 U.S. Patent Re. No. 30,985에서 기술된 임의의 배지가 숙주 세포에 대한 배양 배지로서 이용될 수 있다. 임의의 이들 배지는 필요에 따라, 호르몬 및/또는 기타 성장 인자 (가령, 인슐린, 트랜스페린, 또는 표피 성장 인자), 염 (가령, 염화나트륨, 칼슘, 마그네슘, 그리고 인산염), 완충액 (가령, HEPES), 뉴클레오티드 (가령, 아데노신과 티미딘), 항생제 (가령, 젠타마이신TM 약물), 미량 원소 (통상적으로 마이크로몰 범위의 최종 농도로 존재하는 무기 화합물로서 정의됨), 그리고 글루코오스 또는 등가의 에너지 공급원으로 보충될 수 있다. 당업자에게 공지된 임의의 다른 필요 보충물 역시 적절한 농도에서 포함될 수 있다. 배양 조건, 예를 들면, 온도, pH, 등은 발현을 위해 선별된 숙주 세포에서 기존에 이용된 조건이고, 그리고 당업자에게 명백할 것이다.
숙주 세포의 배양 시에, 재조합 폴리펩티드는 세포내에서, 주변세포질 공간에서 생산되거나, 또는 배지 내로 직접적으로 분비될 수 있다. 폴리펩티드, 예를 들면, 항원 결합 단백질 (가령, 항체)가 첫 번째 단계로서 세포내 생산되면, 숙주 세포 또는 용해된 단편인 지에 상관없이 미립자 잔해는 예로써, 원심분리 또는 한외여과에 의해 제거된다.
항체 또는 항체 단편은 예로써, 관심되는 항원 또는 단백질 A 또는 단백질 G를 친화성 리간드로서 이용한 히드록실아파티트 크로마토그래피, 양이온 또는 음이온 교환 크로마토그래피, 또는 바람직하게는, 친화성 크로마토그래피를 이용하여 정제될 수 있다. 단백질 A는 인간 γ1, γ2, 또는 γ4 중쇄에 기초하여, 폴리펩티드를 비롯한 단백질을 정제하는데 이용될 수 있다 (Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62: 1-13 (1983)). 단백질 G는 모든 생쥐 아이소타입 및 인간 γ3에 대해 권장된다 (Guss et al., EMBO J. 5: 15671575 (1986)). 친화성 리간드가 부착되는 매트릭스는 대부분의 경우에 아가로즈이지만, 다른 매트릭스도 가능하다. 기계적으로 안정된 매트릭스, 예를 들면, 조절 공극 유리 (controlled pore glass) 또는 폴리(스티렌디비닐)벤젠은 아가로즈로 달성될 수 있는 것보다 더욱 빠른 유속 및 더욱 짧은 처리 시간을 가능하게 한다. 단백질이 CH 3 도메인을 포함하는 경우에, Bakerbond ABXTM 수지 (J. T. Baker, Phillipsburg, N.J.)가 정제에 유용하다. 회수되는 항체에 따라, 단백질 정제를 위한 다른 기술, 예를 들면, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 크로마토포커싱 (chromatofocusing), SDS-PAGE, 그리고 황산암모늄 침전 역시 가능하다.
키메라, 인간화된, 인간 조작된 TM , Xenomouse ® 단일클론성 항체. 설치류 단일클론성 항체의 가변 Ig 도메인이 인간 불변 Ig 도메인에 융합되는 키메라 단일클론성 항체는 당분야에 공지된 표준 절차를 이용하여 산출될 수 있다 (Morrison, S. L., et al. (1984) Chimeric Human Antibody Molecules; Mouse Antigen Binding Domains with Human Constant Region Domains, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 6841-6855; 그리고, Boulianne, G. L., et al, Nature 312, 643-646 . (1984)를 참조한다. 예로써, (1) 비-인간 상보성 결정 영역 (CDRs)을 인간 프레임워크와 불변 영역에 접목 (당분야에서 "CDR 접목"을 통한 인간화로서 지칭되는 과정)함으로써, 또는 (2) 전체 비-인간 가변 도메인을 이식하지만, 표면 잔기의 치환으로 이들을 인간-유사 표면으로 "감춤 (cloaking)"(당분야에서 "판자 만들기 (veneering)"로 지칭되는 과정)으로써, 또는 (3) 항원-결합 또는 항체 구조에 참여하는 각 잔기의 가능성 및 면역원성에 대한 이의 가능성에 기초하여, 선별된 비-인간 아미노산 잔기가 인간에 더욱 유사하도록 변형함으로써, 항체 서열을 인간화하거나, 또는 항체 서열을 인간에 더욱 유사하도록 변형하기 위한 다수의 기술이 보고되었다. 예로써, Jones et al., Nature 321:522 525 (1986); Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 81:6851 6855 (1984); Morrison and Oi, Adv. Immunol., 44:65 92 (1988); Verhoeyer et al., Science 239:1534 1536 (1988); Padlan, Molec. Immun. 28:489 498 (1991); Padlan, Molec. Immunol. 31(3):169 217 (1994); 그리고 Kettleborough, C.A. et al., Protein Eng. 4(7):773 83 (1991); Co, M. S., et al. (1994), J. Immunol. 152, 2968-2976); Studnicka et al. Protein Engineering 7: 805-814 (1994)를 참조하고, 이들 각각은 본 발명에 전체로서 참고문헌으로 편입된다.
예로써, (1) 비-인간 상보성 결정 영역 (CDRs)을 인간 프레임워크와 불변 영역에 접목 (당분야에서 "CDR 접목"을 통한 인간화로서 지칭되는 과정)함으로써, 또는 (2) 전체 비-인간 가변 도메인을 이식하지만, 표면 잔기의 치환으로 이들을 인간-유사 표면으로 "감춤 (cloaking)"(당분야에서 "판자 만들기 (veneering)"로 지칭되는 과정)으로써, 또는 (3) 항원-결합 또는 항체 구조에 참여하는 각 잔기의 가능성 및 면역원성에 대한 이의 가능성에 기초하여, 선별된 비-인간 아미노산 잔기가 인간에 더욱 유사하도록 변형함으로써, 항체 서열을 인간화하거나, 또는 항체 서열을 인간에 더욱 유사하도록 변형하기 위한 다수의 기술이 보고되었다. 예로써, Jones et al., Nature 321:522 525 (1986); Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 81:6851 6855 (1984); Morrison and Oi, Adv. Immunol., 44:65 92 (1988); Verhoeyer et al., Science 239:1534 1536 (1988); Padlan, Molec. Immun. 28:489 498 (1991); Padlan, Molec. Immunol. 31(3):169 217 (1994); 그리고 Kettleborough, C.A. et al., Protein Eng. 4(7):773 83 (1991); Co, M. S., et al. (1994), J. Immunol. 152, 2968-2976); Studnicka et al. Protein Engineering 7: 805-814 (1994)를 참조하고, 이들 각각은 본 발명에 전체로서 참고문헌으로 편입된다.
항체는 또한, 내인성 면역글로불린 생산을 갖지 않고 인간 면역글로불린 좌위를 내포하도록 조작된 유전자도입 동물을 이용하여 생산될 수 있다 (예로써, Mendez et al., Nat . Genet . 15:146-156 (1997)을 참조한다). 가령, WO 98/24893에서는 인간 Ig 좌위를 갖는 유전자도입 동물을 개시하고, 여기서 이들 동물은 내인성 중쇄와 경쇄 좌위의 비활성화로 인하여 기능성 내인성 면역글로불린을 생산하지 못한다. WO 91/10741에서는 또한, 면역원에 대한 면역 반응을 증가시킬 수 있는 유전자도입 비-영장류 포유동물 숙주를 개시하고, 여기서 이들 항체는 영장류 불변 및/또는 가변 영역을 갖고, 그리고 여기서 내인성 면역글로불린 인코딩 좌위는 치환되거나 비활성화된다. WO 96/30498에서는 포유동물에서 면역글로불린 좌위를 변경하기 위한, 예를 들면, 불변 또는 가변 영역의 전부 또는 일부를 대체하여 변형된 항체 분자를 형성하기 위한 Cre/Lox 시스템의 용도를 개시한다. WO 94/02602에서는 비활성화된 내인성 Ig 좌위 및 기능성 인간 Ig 좌위를 갖는 비-인간 포유동물 숙주를 개시한다. U.S. Patent No. 5,939,598에서는 유전자도입 생쥐를 만드는 방법을 개시하고, 여기서 이들 생쥐는 내인성 중쇄를 결여하고, 그리고 하나 또는 그 이상의 이종 불변 영역을 포함하는 외인성 면역글로불린 좌위를 발현한다.
앞서 기술된 유전자도입 동물을 이용하여, 선별된 항원성 분자에 대한 면역 반응이 발생될 수 있고, 그리고 항체 생산 세포는 동물로부터 이전되고 인간-유래된 단일클론성 항체를 분비하는 하이브리도마를 생산하는데 이용될 수 있다. 면역화 프로토콜, 어쥬번트 등은 당분야에 공지되어 있고, 그리고 예로써, WO 96/33735에서 기술된 바와 같이 유전자도입 생쥐의 면역화에 이용된다. 단일클론성 항체는 상응하는 단백질의 생물학적 활성 또는 생리학적 효과를 저해하거나 중화시키는 능력에 대해 조사될 수 있다. 또한, Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immuno., 7:33 (1993); Mendez et al., Nat. Genet. 15:146-156 (1997); 그리고 U.S. Pat. No. 5,591,669, U.S. Patent No. 5,589,369, U.S. Patent No. 5,545,807; 그리고 U.S Patent Application No. 20020199213을 참조한다. U.S. Patent Application No. 20030092125에서는 원하는 에피토프에 동물의 면역 반응을 편향시키기 위한 방법을 기술한다. 인간 항체는 또한, 시험관내 활성화된 B 세포에 의해 생산될 수도 있다 (U.S. Pat. Nos. 5,567,610과 5,229,275를 참조한다).
파지 전시 기술에 의한 항체 생산
재조합 인간 항체 유전자의 레퍼토리를 만들고, 그리고 섬유상 박테리오파지의 표면 상에 인코딩된 항체 단편을 전시하기 위한 기술의 개발은 인간-유래된 항체를 산출하기 위한 다른 수단을 제공하였다. 파지 전시는 예로써, Dower et al., WO 91/17271, McCafferty et al., WO 92/01047, 그리고 Caton and Koprowski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6450-6454 (1990)에서 기술되고, 이들 각각은 본 발명에 전체로서 참고문헌으로 편입된다. 파지 기술에 의해 생산된 항체는 통상적으로, 세균에서 항원 결합 단편, 예를 들면, Fv 또는 Fab 단편으로서 생산되고, 따라서 효과기 기능을 결여한다. 효과기 기능은 2가지 전략 중에서 한 가지에 의해 도입될 수 있다: 이들 단편은 포유동물 세포에서 발현을 위한 완전한 항체로, 또는 효과기 기능을 유인할 수 있는 두 번째 결합 부위를 갖는 이중특이적 항체 단편으로 조작될 수 있다.
전형적으로, 항체의 Fd 단편 (VH-CH1)과 경쇄 (VL-CL)는 PCR에 의해 개별적으로 클로닝되고 조합 파지 전시 라이브러리에서 무작위로 재조합되고, 이들은 이후, 특정 항원에 결합에 대해 선별될 수 있다. 이들 항체 단편은 파지 표면 상에서 발현되고, 그리고 항원 결합에 의한 Fv 또는 Fab (이런 이유로, 항체 단편을 인코딩하는 DNA를 내포하는 파지)의 선별은 패닝 (panning)으로 불리는 절차인 여러 라운드의 항원 결합과 재-증폭을 통해 달성된다. 항원에 특이적인 항체 단편은 농축되고 최종적으로 단리된다.
파지 전시 기술은 또한, "인도된 선별 (guided selection)"로 불리는 설치류 단일클론성 항체의 인간화를 위한 접근법에서 이용될 수 있다 (Jespers, L. S., et al., Bio/Technology 12, 899-903 (1994)을 참조한다). 이를 위하여, 생쥐 단일클론성 항체의 Fd 단편은 인간 경쇄 라이브러리와 공동으로 전시될 수 있고, 그리고 결과의 하이브리드 Fab 라이브러리는 이후, 항원으로 선별될 수 있다. 생쥐 Fd 단편은 따라서, 선별을 인도하는 주형을 제공한다. 차후에, 선별된 인간 경쇄는 인간 Fd 단편 라이브러리와 합쳐진다. 결과의 라이브러리의 선별은 완전한 인간 Fab를 산출한다.
파지-전시 라이브러리로부터 인간 항체를 유도하기 위한 다양한 절차가 보고되었다 (예로써, Hoogenboom et al., J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol, 222:581-597 (1991); U.S. Pat. Nos. 5,565,332와 5,573,905; Clackson, T., and Wells, J. A., TIBTECH 12, 173-184 (1994)를 참조한다). 특히, 파지 전시 라이브러리로부터 유래된 항체의 시험관내 선별과 진화는 강력한 도구가 되었다. Burton, D. R., and Barbas III, C. F., Adv. Immunol. 57, 191-280 (1994); 그리고 Winter, G., et al., Annu. Rev. Immunol. 12, 433-455 (1994); U.S. patent application no. 20020004215와 WO92/01047; 2003년 10월 9일자 공개된 U.S. patent application no. 20030190317과 U.S. Patent No. 6,054,287; U.S. Patent No. 5,877,293. Watkins, "Screening of Phage-Expressed Antibody Libraries by Capture Lift," Methods in Molecular Biology, Antibody Phage Display: Methods and Protocols 178: 187-193을 참조하고, 그리고 2003년 3월 6일자 공개된 U.S. Patent Application Publication No. 20030044772에서는 고형 서포트 상에서 후보 결합 분자의 고정화를 수반하는 방법인 캡처 리프트 (capture lift)에 의한 파지-발현된 항체 라이브러리 또는 기타 결합 분자를 스크리닝하기 위한 방법을 기술한다.
항원 결합 단백질의 다른 구체예
앞서 언급된 바와 같이, 항체 단편은 온전한 전장 항체의 일부분, 바람직하게는 온전한 항체의 항원 결합 또는 가변 영역을 포함하고, 그리고 항체 단편으로부터 형성된 선형 항체와 다중특이적 항체를 포함한다. 항체 단편의 무제한적 실례에는 항체가 원하는 생물학적 활성을 유지하기만 하면, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, Fd, 도메인 항체 (dAb), 상보성 결정 영역 (CDR) 단편, 단일-사슬 항체 (scFv), 단일 사슬 항체 단편, 맥시바디, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, 미니바디, 선형 항체, 킬레이트화 재조합 항체, 트리바디 또는 비바디, 인트라바디, 나노바디, 소형 모듈 면역요법제 (small modular immunopharmaceuticals, SMIPs), 항원-결합-도메인 면역글로불린 융합 단백질, 카멜화된 항체, VHH 내포 항체, 또는 이들의 뮤테인 또는 유도체, 그리고 폴리펩티드에 특정한 항원 결합을 공여할 만큼 충분한 면역글로불린의 적어도 일부분, 예를 들면, CDR 서열을 내포하는 폴리펩티드가 포함된다. 이런 항원 단편은 완전한 항체의 변형에 의해 생산되거나, 또는 재조합 DNA 기술 또는 펩티드 합성을 이용하여 de novo 합성될 수 있다.
추가의 항체 단편에는 VH 도메인으로 구성되는 도메인 항체 (dAb) 단편이 포함된다 (Ward et al., Nature 341:544-546, 1989).
"선형 항체"는 한 쌍의 항원 결합 영역을 형성하는 한 쌍의 탠덤 Fd 분절 (VH-CH1-VH-CH1)을 포함한다. 선형 항체는 이중특이적 또는 단일특이적일 수 있다 (Zapata et al. Protein Eng. 8:1057-62 (1995)).
펩티드 링커 (힌지 없음)를 거쳐, 또는 IgG 힌지를 거쳐 CH3에 융합된 scFv로 구성되는 "미니바디"는 Olafsen, et al., Protein Eng Des Sel. 2004 Apr;17(4):315-23에서 기술되었다.
용어 "맥시바디"는 면역글로불린의 Fc 영역에 부착된 이가 scFvs 공유를 지칭하고, 예로써 Fredericks et al, Protein Engineering, Design & Selection, 17:95-106 (2004) 및 Powers et al., Journal of Immunological Methods, 251:123-135 (2001)를 참조한다.
경쇄가 없는 기능성 중쇄 항체는 일정한 종의 동물, 예를 들면, 수염 상어, 워베공 상어, 그리고 낙타과, 예를 들면, 낙타, 단봉 낙타, 알파카 및 야마에서 자연 발생한다. 항원-결합 부위는 이들 동물에서 단일 도메인, VHH 도메인으로 축소된다. 이들 항체는 중쇄 가변 영역만을 이용한 항원-결합 영역을 형성한다, 다시 말하면, 이들 기능성 항체는 구조 H2L2만을 갖는 중쇄의 동종이합체 ("중쇄 항체" 또는 "HCAbs"로서 지칭됨)이다. 카멜화된 VHH는 보고된 바에 따르면, 힌지, CH2, 그리고 CH3 도메인을 내포하고 CH1 도메인을 결여하는 IgG2와 IgG3 불변 영역과 재조합한다. 고전적 VH-단독 단편은 가용성 형태로 생산하기 어렵지만, 프레임워크 잔기가 VHH에 더욱 유사하도록 변경될 때, 용해성과 특이적 결합에서 향상이 획득될 수 있다. (예로써, Reichman, et al., J Immunol Methods 1999, 231:25-38을 참조한다). 카멜화된 VHH 도메인은 높은 친화성으로 항원에 결합하고 (Desmyter et al., J. Biol. Chem. 276:26285-90, 2001), 그리고 용해 상태에서 높은 안정성을 갖는 (Ewert et al., Biochemistry 41:3628-36, 2002) 것으로 밝혀졌다. 카멜화된 중쇄를 갖는 항체를 산출하기 위한 방법은 예로써, U.S. Patent Publication Nos. 2005/0136049와 2005/0037421에서 기술된다. 대안적 스카폴드는 상어 V-NAR 스카폴드에 더욱 가깝게 정합하고 긴 침투 루프 구조를 위한 프레임워크를 제공할 수 있는 인간 가변-유사 도메인으로부터 만들어질 수 있다.
중쇄 항체의 가변 도메인이 단지 15 kDa의 분자 질량 (molecular mass)을 갖는 가장 작은 완전 기능성 항원-결합 단편이기 때문에, 이러한 실체는 나노바디로서 지칭된다 (Cortez-Retamozo et al., Cancer Research 64:2853-57, 2004). 나노바디 라이브러리는 Conrath et al., Antimicrob Agents Chemother 45: 2807-12, 2001에서 기술된 바와 같은 면역화된 단봉 낙타로부터 산출될 수 있다.
적절한 재조합 방법의 추가 실례, 그리고 본 발명의 약리학적으로 활성 독소 펩티드 유사체에 접합된, 이합체성 Fc 융합 단백질 ("펩티바디") 또는 키메라 면역글로불린(경쇄 + 중쇄)-Fc 헤테로삼합체 ("헤미바디")를 비롯한, 포유동물 세포에 의한 항원 결합 단백질의 구체예의 재조합 발현에 유용한 예시적인 DNA 구조체는 예로써, Sullivan et al., Toxin Peptide Therapeutic Agents, US2007/0071764 및 WO 2008/088422로서 공개된 Sullivan et al., Toxin Peptide Therapeutic Agents, PCT/US2007/022831에서 발견되고, 이들 둘 모두 본 발명에 전체로서 참고문헌으로 편입된다.
펩티드
본 발명에서 이용을 위한 펩티드 또는 폴리펩티드 조성물은 본 명세서에서 앞서 기술된 바와 같이, 재조합 DNA 기술을 이용하여, 또는 화학적 펩티드 합성에 의해 만들어질 수 있다. 고형 상 합성은 개별 펩티드를 만드는 선호되는 기술인데, 그 이유는 이것이 소형 펩티드를 만드는 가장 비용-효과적인 방법이기 때문이다. 가령, 널리 공지된 고형 상 합성 기술은 보호 기, 링커, 그리고 고형 상 서포트의 이용뿐만 아니라 특정한 보호와 탈보호 반응 조건, 링커 개열 조건, 스캐빈저의 이용, 그리고 고형 상 펩티드 합성의 기타 양상을 포함한다. 적절한 기술은 당분야에 널리 공지되어 있다. (가령, Merrifield (1973), Chem. Polypeptides, pp. 335-61 (Katsoyannis and Panayotis eds.); Merrifield (1963), J. Am. Chem. Soc. 85: 2149; Davis et al. (1985), Biochem. Intl. 10: 394-414; Stewart and Young (1969), Solid Phase Peptide Synthesis; U.S. Pat. No. 3,941,763; Finn et al.(1976), The Proteins (3rd ed.) 2:105-253; 그리고 Ericksonetal.(1976), The Proteins (3rd ed.) 2: 257-527; "Protecting Groups in Organic Synthesis," 3rd Edition, T. W. Greene and P. G. M. Wuts, Eds., John Wiley & Sons, Inc., 1999; NovaBiochem Catalog, 2000; "Synthetic Peptides, A User's Guide," G. A. Grant, Ed., W.H. Freeman & Company, New York, N.Y., 1992; "Advanced Chemtech Handbook of Combinatorial & Solid Phase Organic Chemistry," W. D. Bennet, J. W. Christensen, L. K. Hamaker, M. L. Peterson, M. R. Rhodes, and H. H. Saneii, Eds., Advanced Chemtech, 1998; "Principles of Peptide Synthesis, 2nd ed.," M. Bodanszky, Ed., Springer-Verlag, 1993; "The Practice of Peptide Synthesis, 2nd ed.," M. Bodanszky and A. Bodanszky, Eds., Springer-Verlag, 1994; "Protecting Groups," P. J. Kocienski, Ed., Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Germany, 1994; "Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis, A Practical Approach," W. C. Chan and P. D. White, Eds., Oxford Press, 2000, G. B. Fields et al., Synthetic Peptides: A User's Guide, 1990, 77-183). 본 발명의 요부 조성물을 만드는데 적용될 수 있는, 당분야에 공지된 합성과 정제 방법의 추가 실례에 대하여, 예로써 Sullivan et al., Toxin Peptide Therapeutic Agents, US2007/0071764 및 WO 2008/088422 A2로서 공개된 Sullivan et al., Toxin Peptide Therapeutic Agents, PCT/US2007/022831을 참조하고, 이들 둘 모두 본 발명에 전체로서 참고문헌으로 편입된다.
링커.
본 명세서에서 교체가능하게 이용되는 바와 같이, "링커" 또는 "링커 모이어티"는 본 발명의 조성물에 내포된 폴리펩티드 사슬 (가령, 면역글로불린 HC 또는 면역글로불린 LC 또는 면역글로불린 Fc 도메인)의 아미노산 잔기에 공유 결합되는 생물학적으로 허용되는 펩티딜 또는 비-펩티딜 유기 기를 지칭하고, 상기 링커 모이어티는 폴리펩티드 사슬을 다른 분자 또는 화학적 모이어티에 공유 연결하거나 접합시킨다. 많은 유용한 펩티딜과 비-펩티딜 링커는 당분야에 공지되어 있고, 그리고 다수는 Sullivan et al., Toxin Peptide Therapeutic Agents, US 2007/0071764 A1에서 상세하게 기술된다. 본 발명에 이용된 성분 또는 시약에서 임의의 링커 모이어티의 존재는 선택적이다. 존재할 때, 링커의 화학 구조는 중요하지 않은데, 그 이유는 이것이 하나 또는 그 이상의 다른 기능성 모이어티에 관련하여 한 기능성 모이어티를 위치시키거나, 합병하거나, 연결하거나, 또는 이의 제시 또는 위치를 최적화시키는 스페이서로서 주로 역할하기 때문이다.
본 발명은 하기 실시예에 의해 예시되고, 이들 실시예는 본 발명을 한정하는 것으로 의도되지 않는다.
도면의 간단한 설명
도 1에서는 관심되는 비오틴화된 ("B") 표적 단백질 (가령, CCR4)에 특이적으로 결합하는 IgG1 표적 항체 (가령, KW-0761, 일명 "모가물리주맙" 또는 "AMG 761")를 검출하고, 그리고 혈청 샘플에서 중화 항체를 검출하기 위해 배열되는, 본 발명의 이중 기능 분석평가의 구체예의 개략적 표현을 도시한다. 이러한 구체예에서, 아비딘-코팅된 평판은 스트렙타비딘 ("SA")으로 코팅된 "MSD 6000 평판" (Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD)에 의해 대표되고, 그리고 설포-TAGTM 단백질 접합체 (Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD) 전기화학발광 (ECL) 항체 표지화 시스템이 검출 목적으로 이용된다. SECTOR® Imager 6000 평판 판독기 ("MSD 6000")가 검출에 이용되었다.
도 2에서는 IgG1 표적 항체에 대한 중화 항체를 검출하기 위한 본 발명의 시험관내 분석평가의 구체예의 단계의 흐름도를 도시한다.
도 3에서는 본 발명의 분석평가에서 분석평가 완충액 (0% PHS) 또는 혼주된 인간 혈청 ("PHS": 5% PHS 또는 20% PHS; (v/v))의 존재에서, KW-0761 (일명, "모가물리주맙" 또는 "AMG 761")에 대한 대표적인 용량 반응을 도시한다.
도 4에서는 비오틴화된 CCR4 펩티드에 KW-0761 (일명, "모가물리주맙" 또는 "AMG 761")의 결합이 다중클론성 항-KW-0761 중화 항체의 존재에 의해 용량 의존성 방식으로 저해된다는 것을 증명한다.
도 5에서는 리툭시맙이 실시예 3에서 개시되고 변형된 바와 같이, 도 1과 도 2에서 개략적으로 표현된 동일한 분석평가 형식에서, 비오틴화된 CD20 펩티드에 용량 의존성 방식으로 결합한다는 것을 증명한다. "MBT4736"은 서열 번호:7을 지칭한다; "MBT4737"은 서열 번호:8을 지칭한다.
실시예
실시예 1: KW-0761에 대한 중화 항체에 대한 스크리닝 분석평가
개발 중인 KW-0761 (일명, "모가물리주맙" 또는 "AMG 761") 치료 약물은 생체내에서 항체 의존성 세포-매개된 세포독성 (ADCC)의 기전을 통해 기능하는 인간화된 IgG1 항-CCR4 항체이다. (Ishii et al., Defucosylated Humanized Anti-CCR4 Monoclonal Antibody KW-0761 as a Novel Immunotherapeutic Agent for Adult T-cell Leukemia/Lymphoma, Clinical Cancer Research 16: 1520-31 (2010); Shitara et al., Human CDR-grafted antibody and antibody fragment thereof, US Patent No. 7,504,104). 상기 약물은 표적 세포 상에서 인간 CCR4 케모킨 수용체 및 효과기 세포 상에서 인간 FCγRIIIa (CD16a)에 결합한다. 결과적으로, 효과기 세포는 표적 세포를 죽일 수 있다. MSD 전기화학발광 (ECL) 검출 방법을 이용함으로써 KW-0761에 대한 중화 항체 (NAb)의 검출을 위한 이중 기능 표적 결합 분석평가의 구체예가 개발되었다. 도 1에서는 관심되는 비오틴화된 표적 단백질 (가령, CCR4)에 특이적으로 결합하는 IgG1 표적 항체 (가령, KW-0761)를 검출하고, 그리고 혈청 샘플에서 중화 항체를 검출하기 위해 배열되는, 본 발명의 분석평가의 구체예의 개략적 표현을 도시한다.
간단히 말하면, 본 발명의 이러한 구체예에서, IgG 표적 항체 (치료 약물, 예를 들면, KW-0761; Ishii et al., Defucosylated Humanized Anti-CCR4 Monoclonal Antibody KW-0761 as a Novel Immunotherapeutic Agent for Adult T-cell Leukemia/Lymphoma, Clinical Cancer Research 16: 1520-31 (2010); Shitara et al., Human CDR-grafted antibody and antibody fragment thereof, US Patent No. 7,504,104), 조사되는 혈청 샘플, 그리고 표적 단백질의 폴리펩티드 부분 (가령, 비오틴-CCR4 펩티드 접합체)을 내포하는 반응 혼합물은 평판 (가령, 96-웰 스트렙타비딘-코팅된 평판, MSD 카탈로그 # L11SA-1, Meso Scale Discovery [MSD], Gaithersburg, MD)에서 스트렙타비딘-코팅된 웰에 첨가된다. 반응 혼합물이 평판에서 배양된 이후, 평판은 폴리히스티딘-태그된 재조합 인간 FCγRIIIa (CD16a)의 첨가에 앞서 세척되고, 그 이후에 항-폴리히스티딘 생쥐 단일클론성 항체와 함께 배양된다; 상이한 동물 종으로부터 항-폴리히스티딘 단일클론성 항체 역시 편의한 경우에, 이용될 수 있다. 최종적으로, 전기화학발광 (ECL) 신호는 설포-TAGTM-표지된 염소 항-생쥐 항체 (MSD 카탈로그 # R32AC-1; 상이한 동물 종으로부터 표지화된 항체 역시 상기 항체가 이용되는 항-폴리히스티딘 항체와 특이적으로 반응하기만 하면, 편의한 경우에 이용될 수 있다) 및 MSD로부터 구입된 리드 완충액 T (MSD 카탈로그 # R92TC-1)의 첨가로 산출된다. 도 2에서는 본 발명의 이러한 구체예에서 분석평가 방법 단계의 흐름도를 도시한다. 혈청 샘플이 IgG 표적 항체에 대한 중화 항체를 내포하면, IgG 표적 항체는 스트렙타비딘-코팅된 웰 표면 상에 포획되는 비오틴-CCR4 펩티드에 결합할 수 없을 것이다. 결과적으로, NAb의 존재에서 낮은 ECL 신호가 산출된다. NAb의 부재에서, 높은 ECL 신호가 산출되는데, 그 이유는 상기 약물이 비오틴-CCR4 펩티드와 히스티딘 태그된 재조합 인간 FCγRIIIa (CD16a) 사이에 가교를 구축할 수 있기 때문이다. 만약 스크리닝 분석평가가 NAb의 존재를 지시하면, 확증 분석평가, 예를 들면, 본 명세서에서 실시예 2에 기술된 것이 권장된다.
스크리닝 분석평가 프로토콜. 하기의 상세한 분석평가 프로토콜이 수행되었다:
1. 96-웰 평판 (MSD 카탈로그 # L11SA-1, Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD)에서 스트렙타비딘-코팅된 웰은 각각, 이들 웰의 적절한 차단을 보장하기 위해 주위 온도에서 적어도 1시간 동안 각 웰에 대해 150 μL의 분석평가 완충액 (Dulbecco의 인산염 완충된 염수 [pH 7.1 ± 0.1; "DPBS"; Invitrogen으로부터 획득됨] + 1% (v/v) 소 혈청 알부민 ["BSA"])으로 차단되었다. 차단은 차단된 웰이 동일자에 본 발명의 분석평가에 이용되기만 하면, 편의한 경우에 1시간 이상 동안 수행될 수 있다. 이들 웰은 차단후 200 μL/웰 DPBS로 1회 세척되었다. 선택된 분석평가 완충액은 마이너스 칼슘 또는 마그네슘 디케이션이었지만, 이들 디케이션은 본 발명의 분석평가를 간섭하는 것으로 생각되지 않는다.
2. 분석평가 완충액에서 IgG 표적 항체 KW-0761 (20 ng/mL 최종 농도), 혈청 샘플 (10% (v/v) 최종 농도), 그리고 비오틴-CCR4 펩티드 접합체 (80 ng/mL 최종 농도)를 내포하는 반응 혼합물 (50 μL/웰)이 제조되었고, 용적은 반응 혼합물이 하기 단계 3에서 이전되어야 하는 원하는 숫자의 웰에 충분하도록 조정되었다.
(a) 혈청 샘플: 10 μL의 50% (v/v) 혈청 샘플 + 분석평가 완충액에 희석된 30 μL의 34 ng/mL-KW-0761.
(b) 하기 대조 샘플 역시 만들어졌다:
"N" 대조: 10 μL의 50% (v/v) 혼주된 인간 혈청 [정상 공여자로부터] ("PHS"; Bioreclamation, Inc., Long Island, NY로부터 구입됨) + 30 μL 분석평가 완충액; 또는
"D" 대조: 10 μL의 50% (v/v) PHS + 분석평가 완충액에 희석된 30 μL의 34 ng/mL KW-0761; 또는
"P" 대조: 항-KW-0761 항체 (-70℃에서 보관된 1.02 mg/mL의 농도에서 토끼 항-KW-0761 다중클론 스톡)로 스파이킹된 10 μL의 50% (v/v) PHS + 분석평가 완충액에 희석된 30 μL의 34 ng/mL KW-0761.
이들 대조 또는 혈청 샘플에서 PHS의 50% (v/v)까지 희석은 동등한 부피의 분석평가 완충액과 합동시킴으로써 달성되었다. 상기 #2(a) 또는 #2(b)에서 샘플은 온건하게 진탕하면서, U- 또는 V-바닥 폴리프로필렌 평판에서 주위 온도에서 1시간 (±15분) 동안 배양되었고, 그 이후:
(c) 비오틴-CCR4 펩티드 접합체 (-70℃에서 보관된 1 mg/mL-스톡 용액으로부터 제조된 분석평가 완충액에 희석된 10 μL의 400 ng/mL 비오틴-CCR4 펩티드; 일단 해동되면, 스톡은 1개월 이하 동안 4℃에 유지되었다)는 반응 혼합물을 형성하기 위해 상기 #2(a) 또는 #2(b)에서 샘플 내로 등분되었다. CCR4의 비오틴화된 폴리펩티드 부분은 하기 아미노산 서열을 가졌다:
MNPTDIADTTLDESIYSNYYLYESIPKPK(비오틴)-OH// 서열 번호:3 (Midwest Bio-Tech Inc., 카탈로그 # MBT3898로부터 구입됨); 또는 대안으로, MNPTDIADTTLDESIYSNYYLYESIPKPCTK(비오틴)-OH// 서열 번호:4, 이것은 전통적인 화학적 기술에 의해 합성되고 비오틴화되었다.
3. 상기 단계 #2로부터 반응 혼합물 (혈청 샘플 또는 대조 샘플(들) 포함)은 상기 단계 #1로부터 스트렙타비딘-코팅된 평판 (MSD 카탈로그 # L11SA-1, Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD) 상에서 각 지정된 웰에 이전되었다. 각 웰은 50 μL의 반응 혼합물이 제공되었다. 스트렙타비딘-코팅된 평판은 이후, 온건하게 진탕하면서, 주위 온도에서 1시간 (±15분) 동안 배양되고, 그 이후 이들 웰은 세척마다 웰당 DPBS, 200 μL로 3회 세척되었다.
4. 분석평가 완충액에 희석된 50 μL의 80 ng/mL 폴리히스티딘 태그된 재조합 FCγRIII (R&D Systems, 카탈로그 #4325-FC로부터 구입됨)은 스트렙타비딘-코팅된 평판 상에서 각 지정된 웰에 첨가되고, 온건하게 진탕하면서 주위 온도에서 1시간 (±15분) 동안 배양되고, 그 이후 이들 웰은 세척마다 웰당 DPBS, 200 μL로 3회 세척되었다.
5. 분석평가 완충액에 희석된 100 μL의 1 μg/mL의 생쥐 항-폴리히스티딘 Mab (R&D Systems, 카탈로그 #MAB050로부터 구입됨)은 스트렙타비딘-코팅된 평판 상에서 각 지정된 웰에 첨가되고, 온건하게 진탕하면서 주위 온도에서 45-60분 동안 배양되고, 그 이후 이들 웰은 세척마다 웰당 DPBS, 200 μL로 3회 세척되었다.
6. 분석평가 완충액에 희석된 100 μL의 1 μg/mL의 염소 항-생쥐 설포-TAGTM (MSD 카탈로그 #R32AC-1)은 MSD 평판 상에서 각 지정된 웰에 첨가되고, 온건하게 진탕하면서 주위 온도에서 30-45분 동안 배양되고 (평판은 배양 동안 포일로 씌워졌다), 그 이후 이들 웰은 세척마다 웰당 DPBS, 200 μL로 3회 세척되었다.
7. 150 μL의 1x 리드 완충액 T (MSD 카탈로그 # R92TC-1; 물을 이용하여 4x 스톡으로부터 1x로 희석됨)는 각 웰에 첨가되고 SECTOR® Imager 6000 판독기 ("MSD 6000"; Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD)로 판독되었다.
분석평가 완충액 (0% PHS) 또는 혼주된 인간 혈청 (PHS: 5% PHS 또는 20% PHS; (v/v))의 존재에서 본 발명의 분석평가에서 KW-0761에 대한 대표적인 용량 반응은 도 3에 도시된다.
도 4에서는 비오틴화된 CCR4 펩티드에 KW-0761의 결합이 다중클론성 항-KW-0761 중화 항체의 존재에 의해, 용량 의존성 방식으로 저해된다는 것을 증명한다.
실시예 2: 확증 분석평가를 위한 일반적인 단백질 G/L 고갈 프로토콜
예로써, 본 명세서에서 실시예 1에 기술된 바와 같은 본 발명의 스크리닝 분석평가가 혈청 샘플에서 중화 항체의 존재를 지시하면, 민감성 확증 분석평가가 권장된다. 하기 확증 분석평가 프로토콜은 본 명세서에서 실시예 1에 기술된 스크리닝 분석평가 프로토콜에서 단백질 G/L 배양액으로부터 혈청 샘플 여과액을 이용한다:
1. 단백질 G 아가로즈 수지 (Pierce 카탈로그 # 20520) 및 단백질 L 아가로즈 수지 (Pierce 카탈로그 # 22851)는 동등한 비율로 혼합되고, 이후 수지 혼합물은 Dulbecco의 인산염 완충된 염수 (pH 7.1 ± 0.1; "DPBS"; Invitrogen으로부터 구입됨)로 희석되어 50% 비드 슬러리 ("단백질 G/L")가 산출되었다. (대용적의 50% 비드 슬러리는 시약으로서 사전에 제조되고, 3개월 유효 기간이 제공되고, 그리고 2℃ 내지 8℃에서 보관될 수 있다).
2. 세파로오스 6B 수지 (Sigma 카탈로그 # 6B100)는 DPBS로 희석되어 50% 비드 슬러리 ("세파로오스 6B")가 산출되었다. (대용적의 50% 비드 슬러리는 시약으로서 사전에 제조되고, 3개월 유효 기간이 제공되고, 그리고 2℃ 내지 8℃에서 보관될 수 있다). 세파로오스 6B 처리는 단백질 G/L 수지로 처리되는 각 샘플에 대한 대조로서 수행된다. 혈청 샘플 내에 존재하는 NAb는 단백질 G/L 수지 처리에 의해 제거될 수 있지만, 세파로오스 6B 수지 처리에 의해 제거될 수 없다.
3. 수지 비드를 연속적으로 현탁 상태에 유지하면서, 120 μL의 단백질 G/L (상기 #1에서 제조됨) 또는 세파로오스 6B (상기 #2에서 제조됨)는 멀티스크린 필터 평판 (가령, Millipore 카탈로그 # MSHVS4510)의 적절한 웰 내로 적하되었다.
4. 수용자 96-웰 평판은 필터 평판 (상기 #3에서 제조됨) 아래에 배치되고, 그리고 필터 평판은 원심분리 (1000-2000 RPM)를 이용하여 DPBS로 2회 (200 μL/웰/세척) 세척되었다. 필터 평판으로부터 모든 병류 (flow-through)는 수집되고 폐기되었다. 최종 원심분리는 웰 내에서 상대적으로 건성 수지 펠릿을 남길 것이다.
5. 조사되는 혈청 샘플은 1 볼륨의 각 혈청 샘플을 동등한 볼륨의 분석평가 완충액 (Dulbecco의 인삼염 완충된 염수 [pH 7.1 ± 0.1; "DPBS"; Invitrogen로부터 구입됨] + 1% (v/v) 소 혈청 알부민 ["BSA"])과 합동시킴으로써 50% (v/v)로 희석되었다.
6. 각 희석된 혈청 샘플은 상응하는 단백질 G/L 펠릿 및 세파로오스 6B 펠릿에 첨가되었다. 필터 평판 웰은 뚜껑 또는 탑실 (top seal)로 씌워졌다.
7. 새로운 수용자 96-웰 평판은 수용자 평판으로서 필터 평판 아래에 배치되고, 그리고 수용자 평판/필터 평판 조합은 적어도 30분 동안 평판 교반기 또는 유사한 장치를 이용하여 활발하게 혼합되었다. 30분의 혼합후, 수용자 평판/필터 평판 조합은 수용자 평판에서 여과액을 수집하기 위해 1000-2000 RPM에서 원심분리되었다.
8. 상기 #7에서 수집된 여과액은 확증 분석평가에 직접적으로 이용되었는데, 이의 단계는 본 명세서에서 실시예 1에 기술된 스크리닝 분석평가 절차에서 단계와 동일하였다. 각 반응 혼합물에 대하여, 단백질 G/L 처리로부터 10 μL의 여과액 (또는 세파로오스 6B 여과액 대조)은 분석평가 완충액에 희석된 30 μL의 34 ng/mL의 KW-0761 (일명, "모가물리주맙" 또는 "AMG 761")에 첨가되어야 한다. 여과된 혈청 샘플과 약물 혼합물이 배양된 이후 (상기 실시예 1, 단계 #2(a)에서처럼), 10 μL의 400 ng/mL의 비오틴-CCR4가 첨가되고 완전한 반응 혼합물이 만들어진다 (상기 실시예 1, 단계 #2(c)에서처럼). 실시예 1에서 나머지 단계 #3-7이 수행되었다.
실시예 3: 리툭시맙 표적 결합 분석평가
리툭시맙 (Roche Group의 구성원인 Genentech로부터 Rituxan®으로서 구입가능)은 CD20+ B 세포를 선별적으로 표적으로 하는 단일클론 IgG1 치료 항체이다. (Hauser et al., B-cell depletion with rituximab in relapsing-remitting multiple sclerosis, NEJM 358:676-88 (2008)). 리툭시맙의 제안된 작용 기전 중의 한 가지는 ADCC이다. 본 명세서에서 실시예 1에서 기술된 바와 같은, KW-0761에 대해 개발된 표적 결합 분석평가 형식은 (i) 상기 실시예 1, 단계 #2(a)-(b)에서 KW-0761을 유사한 양의 리툭시맙으로 대체함으로써; (ii) 상기 실시예 1, 단계 #2(b)에서 토끼 항-KW-0761 항체를 유사한 양의 토끼 항-리툭시맙 항체로 대체함으로써; 그리고 (iii) 상기 실시예 1, 단계 #2(c)에서 비오틴화된-CCR4 펩티드 접합체를 유사한 양의 비오틴-CD20 펩티드 접합체 (가령, MBT4736: (비오틴)-[Ahx]KGGYNCEPA NPSEKNSPST QYCYS IQSL // 서열 번호:7; 또는 MBT4737: YNCEPANPSEKNSPSTQYCYSIQSLK[Ahx] K(비오틴) NH2 // 서열 번호:8; 둘 모두 Midwest Bio-Tech Inc로부터 구입됨.; 다른 구체예에서, (비오틴)KGGYNCEPANPSEKNSPSTQYCYSIQSL// 서열 번호:5 또는 YNCEPANPSEKNSPSTQYCYSIQSLKK(비오틴)// 서열 번호:6이 대신 이용되고, 이들은 전통적인 화학적 기술에 의해 합성되고 비오틴화되었다)로 대체함으로써, Fc 도메인 내에 CD16a 결합 부위를 갖는 리툭시맙에 맞게 개작될 수 있다. 실시예 1에서 모든 다른 단계 (#3-7)는 실질적인 변형 없이 직접적으로 개작가능하다.
실험은 인간 혈청 샘플이 부재하고 요구되는 임의의 PHS가 분석평가 완충액 (DPBS [pH 7.1 ± 0.1] + 1% [v/v] 소 혈청 알부민)으로 대체되고, 분석평가 완충액에 희석된 PHS를 내포하는 "N" 대조가 부재하고, 항-리툭시맙 항체를 갖는 "P" 대조가 부재하고, 그리고 "D" 대조가 분석평가 방법에서 리툭시맙의 적정을 허용하기 위하여 복수 농도의 리툭시맙에서 수행된다는 점에서 변형됨 점을 제외하고, 실시예 1에 기술된 동일한 분석평가 형식에서 수행되었다 (도 5 참조). 폴리히스티딘 태그된 재조합 인간 FCγRIIIa/CD16a는 스트렙타비딘-코팅된 평판에서 포획된 비오틴-CD20 펩티드 (서열 번호:7 또는 서열 번호:8) / 리툭시맙 복합체에 결합하도록 첨가되었다 (실시예 1, 단계 #1 참조). 본 발명의 스크리닝 분석평가는 본 명세서에서 실시예 1에서처럼 모든 다른 측면에서 더욱 수행되었다. 간단히 말하면, ECL 신호는 항-폴리히스티딘 단일클론성 항체, 그 이후에 설포-TAGTM-표지된 염소 항-생쥐 항체 및 리드 완충액 T의 첨가로 발생되고, 그리고 신호는 실시예 1에서 기술된 바와 같이, SECTOR® Imager 6000 판독기 ("MSD 6000"; Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD)로 검출되었다. 도 5에서는 본 실험으로부터 대표적인 데이터를 도시하고, 비오틴화된 CD20 펩티드 접합체에 결합된 리툭시맙이 본 실시예 3에서 기술된 바와 같이 변형된 점을 제외하고, 실시예 1에서 기술된 바와 동일한 분석평가 형식에서 용량-의존성 방식으로 검출될 수 있다는 것을 증명하였다.
SEQUENCE LISTING <110> CHEN, Xinyi Cynthia CIVOLI, Francesca GUPTA, Shalini <120> DUAL FUNCTION IN VITRO TARGET BINDING ASSAY FOR THE DETECTION OF NEUTRALIZING ANTIBODIES AGAINST TARGET ANTIBODIES <130> A-1586-US-PSP <140> XX/XXX,XXX <141> 2010-08-10 <160> 13 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 360 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Asn Pro Thr Asp Ile Ala Asp Thr Thr Leu Asp Glu Ser Ile Tyr 1 5 10 15 Ser Asn Tyr Tyr Leu Tyr Glu Ser Ile Pro Lys Pro Cys Thr Lys Glu 20 25 30 Gly Ile Lys Ala Phe Gly Glu Leu Phe Leu Pro Pro Leu Tyr Ser Leu 35 40 45 Val Phe Val Phe Gly Leu Leu Gly Asn Ser Val Val Val Leu Val Leu 50 55 60 Phe Lys Tyr Lys Arg Leu Arg Ser Met Thr Asp Val Tyr Leu Leu Asn 65 70 75 80 Leu Ala Ile Ser Asp Leu Leu Phe Val Phe Ser Leu Pro Phe Trp Gly 85 90 95 Tyr Tyr Ala Ala Asp Gln Trp Val Phe Gly Leu Gly Leu Cys Lys Met 100 105 110 Ile Ser Trp Met Tyr Leu Val Gly Phe Tyr Ser Gly Ile Phe Phe Val 115 120 125 Met Leu Met Ser Ile Asp Arg Tyr Leu Ala Ile Val His Ala Val Phe 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Trp Lys Asn Thr Ala Leu His Lys Val Thr Tyr Leu Gln Asn 130 135 140 Gly Lys Gly Arg Lys Tyr Phe His His Asn Ser Asp Phe Tyr Ile Pro 145 150 155 160 Lys Ala Thr Leu Lys Asp Ser Gly Ser Tyr Phe Cys Arg Gly Leu Val 165 170 175 Gly Ser Lys Asn Val Ser Ser Glu Thr Val Asn Ile Thr Ile Thr Gln 180 185 190 Gly Leu Ala Val Ser Thr Ile Ser Ser Phe Phe Pro Pro Gly Tyr Gln 195 200 205 Val Ser Phe Cys Leu Val Met Val Leu Leu Phe Ala Val Asp Thr Gly 210 215 220 Leu Tyr Phe Ser Val Lys Thr Asn Ile Arg Ser Ser Thr Arg Asp Trp 225 230 235 240 Lys Asp His Lys Phe Lys Trp Arg Lys Asp Pro Gln Asp Lys 245 250 <210> 12 <211> 192 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> G17-Q208 fragment of human CD16a <400> 12 Gly Met Arg Thr Glu Asp Leu Pro Lys Ala Val Val Phe Leu Glu Pro 1 5 10 15 Gln Trp Tyr Arg Val Leu Glu Lys Asp Ser Val Thr Leu Lys Cys Gln 20 25 30 Gly Ala Tyr Ser Pro Glu Asp Asn Ser Thr Gln Trp Phe His Asn Glu 35 40 45 Ser Leu Ile Ser Ser Gln Ala Ser Ser Tyr Phe Ile Asp Ala Ala Thr 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Gly Cys Gln Val Val Gln Gly Asn Leu Glu Leu Thr Tyr 50 55 60 Leu Pro Thr Asn Ala Ser Leu Ser Phe Leu Gln Asp Ile Gln Glu Val 65 70 75 80 Gln Gly Tyr Val Leu Ile Ala His Asn Gln Val Arg Gln Val Pro Leu 85 90 95 Gln Arg Leu Arg Ile Val Arg Gly Thr Gln Leu Phe Glu Asp Asn Tyr 100 105 110 Ala Leu Ala Val Leu Asp Asn Gly Asp Pro Leu Asn Asn Thr Thr Pro 115 120 125 Val Thr Gly Ala Ser Pro Gly Gly Leu Arg Glu Leu Gln Leu Arg Ser 130 135 140 Leu Thr Glu Ile Leu Lys Gly Gly Val Leu Ile Gln Arg Asn Pro Gln 145 150 155 160 Leu Cys Tyr Gln Asp Thr Ile Leu Trp Lys Asp Ile Phe His Lys Asn 165 170 175 Asn Gln Leu Ala Leu Thr Leu Ile Asp Thr Asn Arg Ser Arg Ala Cys 180 185 190 His Pro Cys Ser Pro Met Cys Lys Gly Ser Arg Cys Trp Gly Glu Ser 195 200 205 Ser Glu Asp Cys Gln Ser Leu Thr Arg Thr Val Cys Ala Gly Gly Cys 210 215 220 Ala Arg Cys Lys Gly Pro Leu Pro Thr Asp Cys Cys His Glu Gln Cys 225 230 235 240 Ala Ala Gly Cys Thr Gly Pro Lys His Ser Asp Cys Leu Ala Cys Leu 245 250 255 His Phe Asn His Ser Gly Ile Cys Glu Leu His Cys Pro Ala Leu Val 260 265 270 Thr Tyr Asn Thr Asp Thr Phe Glu Ser Met Pro Asn Pro Glu Gly Arg 275 280 285 Tyr Thr Phe Gly Ala Ser Cys Val Thr Ala Cys Pro Tyr Asn Tyr Leu 290 295 300 Ser Thr Asp Val Gly Ser Cys Thr Leu Val Cys Pro Leu His Asn Gln 305 310 315 320 Glu Val Thr Ala Glu Asp Gly Thr Gln Arg Cys Glu Lys Cys Ser Lys 325 330 335 Pro Cys Ala Arg Val Cys Tyr Gly Leu Gly Met Glu His Leu Arg Glu 340 345 350 Val Arg Ala Val Thr Ser Ala Asn Ile Gln Glu Phe Ala Gly Cys Lys 355 360 365 Lys Ile Phe Gly Ser Leu Ala Phe Leu Pro Glu Ser Phe Asp Gly Asp 370 375 380 Pro Ala Ser Asn Thr Ala Pro Leu Gln Pro Glu Gln Leu Gln Val Phe 385 390 395 400 Glu Thr Leu Glu Glu Ile Thr Gly Tyr Leu Tyr Ile Ser Ala Trp Pro 405 410 415 Asp Ser Leu Pro Asp Leu Ser Val Phe Gln Asn Leu Gln Val Ile Arg 420 425 430 Gly Arg Ile Leu His Asn Gly Ala Tyr Ser Leu Thr Leu Gln Gly Leu 435 440 445 Gly Ile Ser Trp Leu Gly Leu Arg Ser Leu Arg Glu Leu Gly Ser Gly 450 455 460 Leu Ala Leu Ile His His 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Gln Gln Lys Ile Arg Lys Tyr Thr Met Arg 675 680 685 Arg Leu Leu Gln Glu Thr Glu Leu Val Glu Pro Leu Thr Pro Ser Gly 690 695 700 Ala Met Pro Asn Gln Ala Gln Met Arg Ile Leu Lys Glu Thr Glu Leu 705 710 715 720 Arg Lys Val Lys Val Leu Gly Ser Gly Ala Phe Gly Thr Val Tyr Lys 725 730 735 Gly Ile Trp Ile Pro Asp Gly Glu Asn Val Lys Ile Pro Val Ala Ile 740 745 750 Lys Val Leu Arg Glu Asn Thr Ser Pro Lys Ala Asn Lys Glu Ile Leu 755 760 765 Asp Glu Ala Tyr Val Met Ala Gly Val Gly Ser Pro Tyr Val Ser Arg 770 775 780 Leu Leu Gly Ile Cys Leu Thr Ser Thr Val Gln Leu Val Thr Gln Leu 785 790 795 800 Met Pro Tyr Gly Cys Leu Leu Asp His Val Arg Glu Asn Arg Gly Arg 805 810 815 Leu Gly Ser Gln Asp Leu Leu Asn Trp Cys Met Gln Ile Ala Lys Gly 820 825 830 Met Ser Tyr Leu Glu Asp Val Arg Leu Val His Arg Asp Leu Ala Ala 835 840 845 Arg Asn Val Leu Val Lys Ser Pro Asn His Val Lys Ile Thr Asp Phe 850 855 860 Gly Leu Ala Arg Leu Leu Asp Ile Asp Glu Thr Glu Tyr His Ala Asp 865 870 875 880 Gly Gly Lys Val Pro Ile Lys Trp Met Ala Leu Glu Ser Ile Leu Arg 885 890 895 Arg Arg Phe Thr His Gln Ser Asp Val Trp Ser Tyr Gly Val Thr Val 900 905 910 Trp Glu Leu Met Thr Phe Gly Ala Lys Pro Tyr Asp Gly Ile Pro Ala 915 920 925 Arg Glu Ile Pro Asp Leu Leu Glu Lys Gly Glu Arg Leu Pro Gln Pro 930 935 940 Pro Ile Cys Thr Ile Asp Val Tyr Met Ile Met Val Lys Cys Trp Met 945 950 955 960 Ile Asp Ser Glu Cys Arg Pro Arg Phe Arg Glu Leu Val Ser Glu Phe 965 970 975 Ser Arg Met Ala Arg Asp Pro Gln Arg Phe Val Val Ile Gln Asn Glu 980 985 990 Asp Leu Gly Pro Ala Ser Pro Leu Asp Ser Thr Phe Tyr Arg Ser Leu 995 1000 1005 Leu Glu Asp Asp Asp Met Gly Asp Leu Val Asp Ala Glu Glu Tyr 1010 1015 1020 Leu Val Pro Gln Gln Gly Phe Phe Cys Pro Asp Pro Ala Pro Gly 1025 1030 1035 Ala Gly Gly Met Val His His Arg His Arg Ser Ser Ser Thr Arg 1040 1045 1050 Ser Gly Gly Gly Asp Leu Thr Leu Gly Leu Glu Pro Ser Glu Glu 1055 1060 1065 Glu Ala Pro Arg Ser Pro Leu Ala Pro Ser Glu Gly Ala Gly Ser 1070 1075 1080 Asp Val Phe Asp Gly Asp Leu Gly Met Gly Ala Ala Lys Gly Leu 1085 1090 1095 Gln Ser Leu Pro Thr His Asp Pro Ser Pro Leu Gln Arg Tyr Ser 1100 1105 1110 Glu Asp Pro Thr Val Pro Leu Pro Ser Glu Thr Asp Gly Tyr Val 1115 1120 1125 Ala Pro Leu Thr Cys Ser Pro Gln Pro Glu Tyr Val Asn Gln Pro 1130 1135 1140 Asp Val Arg Pro Gln Pro Pro Ser Pro Arg Glu Gly Pro Leu Pro 1145 1150 1155 Ala Ala Arg Pro Ala Gly Ala Thr Leu Glu Arg Pro Lys Thr Leu 1160 1165 1170 Ser Pro Gly Lys Asn Gly Val Val Lys Asp Val Phe Ala Phe Gly 1175 1180 1185 Gly Ala Val Glu Asn Pro Glu Tyr Leu Thr Pro Gln Gly Gly Ala 1190 1195 1200 Ala Pro Gln Pro His Pro Pro Pro Ala Phe Ser Pro Ala Phe Asp 1205 1210 1215 Asn Leu Tyr Tyr Trp Asp Gln Asp Pro Pro Glu Arg Gly Ala Pro 1220 1225 1230 Pro Ser Thr Phe Lys Gly Thr Pro Thr Ala Glu Asn Pro Glu Tyr 1235 1240 1245 Leu Gly Leu Asp Val Pro Val 1250 1255

Claims (38)

  1. 아비딘-코팅된 웰 내에서, 생리학적 조건 하에 검출을 허용하는 새로운 용적의 완충액의 존재 하에 신호를 측정함에 의해, 폴리히스티딘-태그된 재조합 인간 CD16a 폴리펩티드에 결합한 폴리히스티딘에 특이적으로 결합하는 임의의 항체를 검출하는 단계를 포함하며,
    여기서 아비딘-코팅된 웰은 미리 차단되고 차후에 전배양된 반응 혼합물은 생리학적 조건 하에 차단된 아비딘-코팅된 웰 내에서 배양되고, 여기서 전배양된 반응 혼합물은 수성 혈청-내포 분석평가 완충액에서 전배양 동안 현탁되고, 그리고 전배양된 반응 혼합물은 하기 (i) 및 (ii)를 포함하고:
    (i) CD16a 결합 부위를 갖는 Fc 도메인을 포함하는 표적 항원 결합 단백질; 그리고
    (ii) 표적 항원 결합 단백질이 특이적으로 결합하는, 관심되는 표적 단백질의 비오틴화된 폴리펩티드 부분; 그리고
    여기서, 아비딘-코팅된 웰 내에서 전배양된 반응 혼합물의 배양 이후에, 새로운 용적의 분석평가 완충액에 현탁된 폴리히스티딘-태그된 재조합 인간 CD16a 폴리펩티드는 아비딘-코팅된 웰의 아비딘에 결합된 비오틴화된 폴리펩티드 부분에 결합된 임의의 표적 항원 결합 단백질과 함께, 생리학적 조건 하에 배양되고; 그리고 여기서, 신호를 측정함에 의해 검출하기 이전에, 새로운 용적의 분석평가 완충액에 현탁된, 폴리히스티딘에 특이적으로 결합하는 항체는 표적 항원 결합 단백질에 결합된 임의의 폴리히스티딘-태그된 재조합 인간 CD16a 폴리펩티드와 함께, 생리학적 조건 하에 웰 내에서 배양되는 것인,
    시험관내 분석평가 방법.
  2. 청구항 1에 있어서, 폴리히스티딘에 특이적으로 결합하는 항체를 검출하기 이전에, 생리학적 조건 하에 웰 내에서, 새로운 용적의 분석평가 완충액에 현탁된, 접합된 신호-발생 라벨을 포함하는 항체를 배양하는 단계를 더욱 포함하고, 여기서 상기 항체는 폴리히스티딘에 특이적으로 결합하는 항체에 특이적으로 결합하는 것인 방법.
  3. 청구항 1에 있어서, 전배양된 반응 혼합물은 중화 항체의 존재에 대해 조사되는 혈청 샘플을 더욱 포함하는 것인 방법.
  4. 청구항 1에 있어서, 표적 항원 결합 단백질은 IgG1 또는 IgG3 항체인 방법.
  5. 청구항 1에 있어서, 관심되는 표적 단백질은 CCR4인 방법.
  6. 청구항 1에 있어서, 관심되는 표적 단백질은 CD20인 방법.
  7. 청구항 1에 있어서, 관심되는 표적 단백질은 HER2인 방법.
  8. 청구항 1에 있어서, 아비딘은 스트렙타비딘인 방법.
  9. 청구항 1에 있어서, 폴리히스티딘에 특이적으로 결합하는 항체는 접합된 신호-발생 라벨을 더욱 포함하는 것인 방법.
  10. 청구항 8에 있어서, 신호-발생 라벨은 형광 라벨, 동위원소 라벨, 전기화학발광 라벨, 또는 효소를 포함하는 것인 방법.
  11. (a) 생리학적 조건 하에 차단된 아비딘-코팅된 웰 내에서, 수성 혈청-내포 분석평가 완충액에 현탁된 전배양된 반응 혼합물을 배양하며, 상기 전배양된 반응 혼합물은
    (iii) CD16a 결합 부위를 갖는 Fc 도메인을 포함하는 IgG 표적 항체; 그리고
    (iv) IgG 표적 항체가 특이적으로 결합하는, 관심되는 표적 단백질의 비오틴화된 폴리펩티드 부분
    을 포함하는 것인 단계;
    (b) 생리학적 조건 하에 웰 내에서, (a)에서 아비딘에 결합된 비오틴화된 폴리펩티드 부분에 결합된 임의의 IgG 표적 항체와 함께, 새로운 용적의 분석평가 완충액에 현탁된 폴리히스티딘-태그된 재조합 인간 CD16a 폴리펩티드를 배양하는 단계;
    (c) 생리학적 조건 하에 웰 내에서, (b)에서 IgG 표적 항체에 결합된 임의의 폴리히스티딘-태그된 재조합 인간 CD16a 폴리펩티드와 함께, 새로운 용적의 분석평가 완충액에 현탁된 폴리히스티딘에 특이적으로 결합하는 항체를 배양하는 단계; 그리고
    (d) 생리학적 조건 하에 검출을 허용하는 새로운 용적의 완충액의 존재 하에 웰 내에서, (c)에서 폴리히스티딘-태그된 재조합 인간 CD16a 폴리펩티드에 결합된 폴리히스티딘에 특이적으로 결합하는 임의의 항체를, 신호를 측정함에 의해 검출하는 단계
    를 포함하는 시험관내 분석평가 방법.
  12. 청구항 11에 있어서, 전배양된 반응 혼합물은 중화 항체의 존재에 대해 조사되는 혈청 샘플을 더욱 내포하는 것인 방법.
  13. 청구항 11에 있어서, IgG 표적 항체는 IgG1 또는 IgG3 항체인 방법.
  14. 청구항 11에 있어서, 관심되는 표적 단백질은 CCR4인 방법.
  15. 청구항 11에 있어서, 관심되는 표적 단백질은 CD20인 방법.
  16. 청구항 11에 있어서, 관심되는 표적 단백질은 HER2인 방법.
  17. 청구항 11에 있어서, 아비딘은 스트렙타비딘인 방법.
  18. 청구항 11에 있어서, 폴리히스티딘에 특이적으로 결합하는 항체는 접합된 신호-발생 라벨을 더욱 포함하는 것인 방법.
  19. 청구항 18에 있어서, 신호-발생 라벨은 형광 라벨, 동위원소 라벨, 전기화학발광 라벨, 또는 효소를 포함하는 것인 방법.
  20. 청구항 11에 있어서, 단계 (d) 이전에, 생리학적 조건 하에 웰 내에서, 새로운 용적의 분석평가 완충액에 현탁된, 접합된 신호-발생 라벨을 포함하는 항체를 배양하는 단계를 더욱 포함하고, 여기서 상기 항체는 (c)에서 폴리히스티딘에 특이적으로 결합하는 항체에 특이적으로 결합하는 것인 방법.
  21. 청구항 20에 있어서, 신호-발생 라벨은 전기화학발광 라벨을 포함하는 것인 방법.
  22. 청구항 21에 있어서, 전기화학발광 라벨은 루테늄 복합체를 포함하는 것인 방법.
  23. 청구항 22에 있어서, 전기화학발광 라벨은 N-히드록시숙신이미드 에스테르로부터 형성되는 것인 방법.
  24. 청구항 23에 있어서, N-히드록시숙신이미드 에스테르는 하기 화학 구조를 갖는 것인 방법:
    Figure pct00004
    .
  25. 청구항 22에 있어서, 전기화학발광 라벨은 하기 화학식을 갖는 루테늄 복합체를 포함하고, 여기서 카르보닐 기로부터 그어진 라인은 분자의 나머지 부분에 부착을 보여주는 것인 방법:
    Figure pct00005
    .
  26. 청구항 20에 있어서, 신호-발생 라벨은 형광 라벨, 동위원소 라벨, 또는 효소를 포함하는 것인 방법.
  27. 청구항 14에 있어서, IgG 표적 항체는 모가물리주맙인 방법.
  28. 청구항 15에 있어서, IgG 표적 항체는 리툭시맙인 방법.
  29. 청구항 16에 있어서, IgG 표적 항체는 트라스투주맙인 방법.
  30. (a) 생리학적 조건 하에 차단된 아비딘-코팅된 웰 내에서, 수성 혈청-내포 분석평가 완충액에 현탁된 전배양된 반응 혼합물을 배양하며, 상기 전배양된 반응 혼합물은
    (i) CD16a 결합 부위를 갖는 Fc 도메인을 포함하는 인간 CCR4에 대한 IgG 표적 항체;
    (ii) 중화 항체의 존재에 대해 조사되는 혈청 샘플; 그리고
    (iii) IgG 표적 항체가 특이적으로 결합하는, 인간 CCR4의 비오틴화된 폴리펩티드 부분
    을 포함하는 것인 단계;
    (b) 생리학적 조건 하에 웰 내에서, (a)에서 아비딘에 결합된 인간 CCR4의 비오틴화된 폴리펩티드 부분에 결합된 임의의 IgG 표적 항체와 함께, 새로운 용적의 분석평가 완충액에 현탁된 폴리히스티딘-태그된 재조합 인간 CD16a 폴리펩티드를 배양하는 단계;
    (c) 생리학적 조건 하에 웰 내에서, (b)에서 IgG 표적 항체에 결합된 임의의 폴리히스티딘-태그된 재조합 인간 CD16a 폴리펩티드와 함께, 새로운 용적의 분석평가 완충액에 현탁된 폴리히스티딘에 특이적으로 결합하는 항체를 배양하는 단계;
    (d) 생리학적 조건 하에 웰 내에서, 새로운 용적의 분석평가 완충액에 현탁된, 접합된 신호-발생 라벨을 포함하는 항체를 배양하며, 여기서 상기 항체는 (c)에서 폴리히스티딘에 특이적으로 결합하는 항체에 특이적으로 결합하는 것인 단계; 그리고
    (e) 생리학적 조건 하에 검출을 허용하는 새로운 용적의 완충액의 존재 하에 웰 내에서, 임의의 발생된 신호를 검출하는 단계
    를 포함하는 시험관내 분석평가 방법.
  31. 청구항 30에 있어서, 신호-발생 라벨은 전기화학발광 라벨을 포함하는 것인 방법.
  32. 청구항 31에 있어서, 전기화학발광 라벨은 루테늄 복합체를 포함하는 것인 방법.
  33. 청구항 32에 있어서, 전기화학발광 라벨은 N-히드록시숙신이미드 에스테르로부터 형성되는 것인 방법.
  34. 청구항 33에 있어서, N-히드록시숙신이미드 에스테르는 하기 화학 구조를 갖는 것인 방법:
    Figure pct00006
    .
  35. 청구항 32에 있어서, 전기화학발광 라벨은 하기 화학식을 갖는 루테늄 복합체를 포함하고, 여기서 카르보닐 기로부터 그어진 라인은 분자의 나머지 부분에 부착을 보여주는 것인 방법:
    Figure pct00007
    .
  36. 청구항 30에 있어서, 신호-발생 라벨은 형광 라벨, 동위원소 라벨, 또는 효소를 포함하는 것인 방법.
  37. 청구항 30에 있어서, 아비딘은 스트렙타비딘인 방법.
  38. 청구항 30에 있어서, IgG 표적 항체는 모가물리주맙인 방법.
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