CN108562573B - 一种基于二碳化三钛二维金属碳化物催化鲁米诺电化学发光探针的生物传感器及制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于二碳化三钛二维金属碳化物催化鲁米诺电化学发光探针的生物传感器及制备方法,该生物传感器包括探针和生物传感器电极,其探针包括纳米片Ti3C2 MXenes、连接分子和生物识别分子1,所述纳米片Ti3C2 MXenes与连接分子通过静电吸附连接,所述连接分子与生物识别分子1通过酰胺基团连接,所述连接分子含有伯胺基团或仲胺基团,且所述连接分子溶于水后能够带有正电荷,所述生物识别分子1为5’端带有羧基的单链DNA序列1,所述单链DNA序列1能够识别外泌体上的CD63蛋白质。本发明首次发现Ti3C2 MXenes可以改进鲁米诺的电致化学发光,并利用该性质将其制备成探针,进而制备了生物传感器。
Description
技术领域
本发明涉及材料与分析化学领域,具体的,涉及一种新型二维纳米材料-Ti3C2MXenes催化鲁米诺电化学发光以及利用羧基封端的聚(N-异丙基丙烯酰胺)(PNIPAM)聚合物分子的在合适温度下暴露更多活性位点,从而构建电化学发光生物传感器检测外泌体的方法。
背景技术
外来体是通过内溶酶体途径从多泡体释放的纳米级细胞外囊泡(30~100nm)。外泌体携带丰富的细胞遗传物质,包括跨膜和胞质蛋白、mRNA、DNA和微RNA,从而作为介导细胞间的介质信使。它们具有重要的作用,实验表明它们与疾病有关,特别是与癌症的病发有关,外泌体被认为作为诊断早期癌症的生物标志物,在癌症检测方面具有重要的意义。迄今为止,已经开发了用于外来体检测的各种方法,包括蛋白印迹法、流式细胞术或酶联免疫吸附剂法。这些方法具有的缺点有,需要昂贵的仪器、复杂的技术技能和耗时的操作等。因此,开发简单,灵敏和可靠的外泌体检测方法是一项巨大的挑战。近年来,电致化学发光(ECL)作为一种强大的分析技术,由于其高灵敏度,快速,低的背景噪音,易操作性和低成本等优点,已被广泛用于蛋白质,DNA,酶等一些物质的检测。因此,基于其众多的优点,它可以有望应用于外泌体的检测。
MXenes,是最近发现的一个新型二维(2D)早期过渡金属家族碳化物。MXenes是通过从金属导电的MAX相中选择性蚀刻Al元素而制成的,其中,MAX相包括Ti2AlC、Ti3AlC2和Ti4AlC3等多种类型。Ti3C2 MXenes是其中的一种,它结合了过渡金属碳化物的金属导电性及羟基或氧封端表面的亲水性质。在本质上,它们表现为“导电粘土”。它们本身具有导电性、催化以及比表面积大等一些性质,这些性质与石墨烯类似,因此基于这些优异的性质,Ti3C2 MXenes在催化,生物传感器,污染物处理,超级电容器,锂离子电池等众多应用中显示出巨大的前景。然而截止目前,关于Ti3C2 MXenes在生物传感器和生物医学如癌症治疗、细胞摄取和抗菌活性等方面的应用报道很少。因此,基于Ti3C2 MXenes优异的催化以及导电等性质,Ti3C2 MXenes显示出制造高灵敏度ECL生物传感器的潜力。
发明内容
为了解决现有技术的不足,本发明的目的之一是提供一种基于二碳化三钛二维金属碳化物催化鲁米诺电化学发光的生物传感器的探针,可以改进鲁米诺的电致化学发光。
为了实现上述目的,本发明的技术方案为:
一种基于二碳化三钛二维金属碳化物催化鲁米诺电化学发光探针,包括纳米片Ti3C2MXenes、连接分子和生物识别分子1,所述纳米片Ti3C2 MXenes与连接分子通过静电吸附连接,所述连接分子与生物识别分子1通过酰胺基团连接,所述连接分子含有伯胺基团或仲胺基团,且所述连接分子溶于水后能够带有正电荷,所述生物识别分子1为5’端带有羧基的单链DNA序列1,所述单链DNA序列1能够识别外泌体上的CD63蛋白质。
本发明的发明人首次发现Ti3C2 MXenes可以改进鲁米诺的电致化学发光,所以希望将Ti3C2 MXenes制备成鲁米诺电化学发光的生物传感器的探针,然而在对Ti3C2 MXenes修饰过程中,发现难以对Ti3C2 MXenes进行修饰。经过进一步研究发现纳米片Ti3C2 MXenes分散在水中,其表面带有负电荷,因而采用的溶于水能够带有正电荷以及氨基的物质与纳米片Ti3C2MXenes连接,便于Ti3C2 MXenes与单链DNA序列1进行连接,从而获得了基于二碳化三钛二维金属碳化物催化鲁米诺电化学发光探针。
本发明的目的之二是提供一种上述探针的制备方法,将连接分子与纳米片Ti3C2MXenes置于水中混合均匀后,搅拌一段时间离心获得沉淀,将获得的沉淀与生物识别分子1进行酰胺反应即可获得。
本发明的目的之三是提供一种与上述探针配合使用的生物传感器电极,玻碳电极表面通过金纳米颗粒修饰,金纳米颗粒与至少含有两个氨基的分子中的一个氨基通过酰胺基团进行连接,至少含有两个氨基的分子中的另一个氨基与羧基封端的聚N-异丙基丙烯酰胺(PNIPAM)中的一个羧基通过酰胺基团使羧基封端的聚N-异丙基丙烯酰胺与至少含有两个氨基的分子进行连接,羧基封端的聚N-异丙基丙烯酰胺中的另一个羧基与生物识别分子2通过酰胺基团使羧基封端的聚N-异丙基丙烯酰胺与生物识别分子2进行连接,其中,生物识别分子2为5’端带有氨基的单链DNA序列2,所述单链DNA序列2能够识别外泌体上的EpCAM蛋白质。
金纳米颗粒表面含有羧基,通过至少含有两个氨基的分子与羧基封端的聚N-异丙基丙烯酰胺进行连接,由于羧基封端的聚N-异丙基丙烯酰胺在室温条件下聚合物链伸展,使其暴露多个适配体的活性位点,因而能够使电极捕获更多的外泌体。
本发明的目的之四是提供一种上述生物传感器电极的制备方法,将金纳米颗粒分散液滴加至玻碳电极表面使金纳米颗粒附着在玻碳电极表面,通过酰胺反应将至少含有两个氨基的分子连接至金纳米颗粒,再通过酰胺反应使羧基封端的聚N-异丙基丙烯酰胺与至少含有两个氨基的分子连接,然后通过酰胺反应使生物识别分子2与羧基封端的聚N-异丙基丙烯酰胺连接。
本发明的目的之五是提供一种电致化学发光的生物传感器,包括上述探针和生物传感器电极。
本发明的目的之六是提供一种电致化学发光的试剂盒,包括上述探针、生物传感器电极及鲁米诺。
本发明的目的之七是提供一种上述探针、生物传感器电极、生物传感器或试剂盒在电致化学发光检测外泌体中的应用。
本发明的目的之八是提供一种电致化学发光检测外泌体的方法,将上述生物传感器电极浸没至待测外泌体溶液中,使外泌体附着在生物传感器电极上,然后将附着外泌体生物传感器电极浸没至上述探针溶液中,使探针附着在生物传感器电极的外泌体上,从而组成探针和生物传感器电极夹载外泌体的生物传感器,对探针和生物传感器电极夹载外泌体的生物传感器进行电化学发光检测即可。
本发明的有益效果为:
本发明首次发现Ti3C2 MXenes可以改进鲁米诺的电致化学发光,并利用该性质将Ti3C2MXenes制备成探针,然后针对该探针制备获得了与之配合使用的生物传感器电极,从而获得了生物传感器,采用该生物传感器成功对外泌体进行检测,且在外泌体的浓度为5×105~5×109个/mL范围内,该生物传感器的电化学发光信号的大小与外泌体的浓度的对数呈线性关系,相关系数R=0.9740,检测限为2.5×105个/mL。
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解,本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请,并不构成对本申请的不当限定。
图1为电化学发光生物传感器制备机理图;
图2为实施例1制备的Ti3C2 MXenes的扫描电镜(SEM)照片;
图3为实施例1制备的电化学发光生物传感器的电致化学发光强度与外泌体浓度的关系图,其中,a为5.0×105个/mL,j为5.0×109个/mL。
具体实施方式
应该指出,以下详细说明都是示例性的,旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明,本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是,这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式,而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的,除非上下文另外明确指出,否则单数形式也意图包括复数形式,此外,还应当理解的是,当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时,其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
本申请所述的鲁米诺(Luminol),又名发光氨。化学名称为3-氨基苯二甲酰肼。常温下是一种蓝色晶体或者米黄色粉末,是一种比较稳定的人工合成的有机化合物。化学式为C8H7N3O2。
本申请所述的酰胺反应是指羧基与伯胺基团或仲胺基团反应生成酰胺基团的过程。
正如背景技术所介绍的,现有技术中存在极少关于Ti3C2 MXenes在生物传感器和生物医学如癌症治疗、细胞摄取和抗菌活性等方面的应用的记载的不足,为了解决如上的技术问题,本申请提出了一种基于二碳化三钛二维金属碳化物催化鲁米诺电化学发光探针的生物传感器及制备方法。
本申请的一种典型实施方式,提供了一种基于二碳化三钛二维金属碳化物催化鲁米诺电化学发光探针,包括纳米片Ti3C2 MXenes、连接分子和生物识别分子1,所述纳米片Ti3C2 MXenes与连接分子通过静电吸附连接,所述连接分子与生物识别分子1通过酰胺基团连接,所述连接分子含有伯胺基团或仲胺基团,且所述连接分子溶于水后能够带有正电荷,所述生物识别分子1为5’端带有羧基的单链DNA序列1,所述单链DNA序列1能够识别外泌体上的CD63蛋白质。
本申请的发明人首次发现Ti3C2 MXenes可以改进鲁米诺的电致化学发光,所以希望将Ti3C2 MXenes制备成鲁米诺电化学发光的生物传感器的探针,然而在对Ti3C2 MXenes修饰过程中,发现难以对Ti3C2 MXenes进行修饰。经过进一步研究发现纳米片Ti3C2 MXenes分散在水中,其表面带有负电荷,因而采用的溶于水能够带有正电荷的连接分子对纳米片Ti3C2MXenes与单链DNA序列1进行连接,从而获得了基于二碳化三钛二维金属碳化物催化鲁米诺电化学发光探针。
优选的,所述连接分子为聚乙烯亚胺(PEI)。重均分子量为70000。聚乙烯亚胺是一种溶于水的高分子化合物,其溶解与水中,在其水溶液中聚乙烯亚胺的表面分布有大量的正电荷,能够与纳米片Ti3C2 MXenes表面的负电荷进行静电吸附。
优选的,所述单链DNA序列1由5’至3’的序列为TTTTTT CAC CCC CAC CTC GCTCCCGTG ACA CTA ATG CTA(SEQ ID NO.1)。
本申请的提供了一种上述探针的制备方法,将连接分子与纳米片Ti3C2 MXenes置于水中混合均匀后,搅拌一段时间离心获得沉淀,将获得的沉淀与生物识别分子1进行酰胺反应即可获得。
优选的,搅拌时间为1~1.5h。离心分离的转速超过10000rpm。
优选的,所述酰胺反应的反应体系为1-(3-(二甲基氨基)丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺钠盐(NHS)。
本申请优选了一种刻蚀Ti3AlC2的方法,将Ti3AlC2粉末浸入48±2%(质量)HF中并在45±2℃下搅拌24±0.5小时,将粉末颗粒离心并以4500~5500rpm每次洗涤数次5分钟洗涤5~6次,弃去上清液,室温下干燥,获得多层的Ti3C2Tx颗粒。
本申请优选了一种纳米片Ti3C2 MXenes的制备方法,将多层的Ti3C2Tx颗粒浸入二甲基亚砜(DMSO)搅拌一段时间,搅拌时间优选为24±0.5h,离心去除上清液,然后加入去离子水,在细胞裂解器中粉碎后再离心即可。获得Ti3C2 MXenes的胶体溶液。进一步优选的,粉碎之前的离心转速超过10000rpm,更进一步优选为12000rpm,粉碎之后的转速为3000~4000rpm,更进一步优选的为3500rpm。
本申请提供了一种与上述探针配合使用的生物传感器电极,玻碳电极表面通过金纳米颗粒修饰,金纳米颗粒与至少含有两个氨基的分子中的一个氨基通过酰胺基团进行连接,至少含有两个氨基的分子中的另一个氨基与羧基封端的聚N-异丙基丙烯酰胺(PNIPAM)中的一个羧基通过酰胺基团使羧基封端的聚N-异丙基丙烯酰胺与至少含有两个氨基的分子进行连接,羧基封端的聚N-异丙基丙烯酰胺中的另一个羧基与生物识别分子2通过酰胺基团使羧基封端的聚N-异丙基丙烯酰胺与生物识别分子2进行连接,其中,生物识别分子2为5’端带有氨基的单链DNA序列2,所述单链DNA序列2能够识别外泌体中上的EpCAM蛋白质。
金纳米颗粒表面含有羧基,通过至少含有两个氨基的分子与羧基封端的聚N-异丙基丙烯酰胺进行连接,由于在合适的温度下羧基封端的聚N-异丙基丙烯酰胺会暴露多个适配体的活性位点,因而能够使电极捕获更多的外泌体。
所述至少含有两个氨基的分子可以为乙二胺、丙二胺、对苯二胺、辛二胺、丙三胺、二乙四胺,本申请优选的至少含有两个氨基的分子为乙二胺。
优选的,所述羧基封端的聚N-异丙基丙烯酰胺的数均分子量为1000~5000。来自于SIGMA-ALORICH。
优选的,所述单链DNA序列2由5’至3’的序列为TTTTTT CAC TAC AGA GGT TGC GTCTGT CCC ACG TTG TCA TGG GGG GTT GGC CTG(SEQ ID NO.2)。
本申请提供了一种上述生物传感器电极的制备方法,将金纳米颗粒分散液滴加至玻碳电极表面使金纳米颗粒附着在玻碳电极表面,通过酰胺反应将至少含有两个氨基的分子连接至金纳米颗粒,再通过酰胺反应使羧基封端的聚N-异丙基丙烯酰胺与至少含有两个氨基的分子连接,然后通过酰胺反应使生物识别分子2与羧基封端的聚N-异丙基丙烯酰胺连接。
优选的,制备方法中的涉及的反应温度、处理温度为37±0.5℃。例如酰胺反应的温度、金纳米颗粒附着在玻碳电极表面的处理温度等。
玻碳电极在附着金纳米颗粒之前需要进行预处理以清洁玻碳电极的表面,优选的,玻碳电极在附着金纳米颗粒之前的预处理为先抛光再洗涤。
本申请还提供了一种电致化学发光的生物传感器,包括上述探针和生物传感器电极。
本申请还提供了一种电致化学发光的试剂盒,包括上述探针、生物传感器电极及鲁米诺。
本申请还提供了一种上述探针、生物传感器电极、生物传感器或试剂盒在电致化学发光检测外泌体中的应用。
本申请还提供了一种电致化学发光检测外泌体的方法,将上述生物传感器电极浸没至待测外泌体溶液中,使外泌体附着在生物传感器电极上,然后将附着外泌体生物传感器电极浸没至上述探针溶液中,使探针附着在生物传感器电极的外泌体上,从而组成探针和生物传感器电极夹载外泌体的生物传感器,对探针和生物传感器电极夹载外泌体的生物传感器进行电化学发光检测即可。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案,以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。
材料:
aptamer1:5'-COOH-TTTTTT CAC CCC CAC CTC GCT CCC GTG ACA CTA ATG CTAaptamer2:5'-NH2-TTTTTT CAC TAC AGA GGT TGC GTC TGT CCC ACG TTG TCA TGG GGGGTT GGC CTG、获自上海生工生物工程技术服务有限公司。Ti3AlC2(98%)购自福斯曼科技有限公司(中国北京)。羧基封端的聚N-异丙基丙烯酰胺(PNIPAM,Mn=2000)和鲁米诺购自Sigma-Aldrich。HAuCl4·3H2O(48%,w/w)获自Shanghai Reagent(中国上海)。1-(3-(二甲基氨基)丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺钠盐(NHS)、乙二胺(EDA)和二甲基亚砜(DMSO)均购自北京化工有限公司(中国北京)
实施例1
MXenes-aptamer1纳米探针的合成
将Ti3AlC2(1.0g)粉末浸入15mL 48%(质量)HF中并在45℃下搅拌24小时。将粉末颗粒以5000rpm离心洗涤数次,每次5分钟,弃去上清液,在室温下干燥,即可获得分层的Ti3C2Tx,在4℃下储存备用。
将分层的Ti3C2(0.05g)粉末浸入1mL DMSO中并在室温下搅拌24小时,以12000rpm离心洗涤5次,每次5分钟,然后弃去上清液并加入去离子水在细胞裂解器中粉碎2小时,最后,将溶液以3500rpm离心60分钟,保留上清液(即为纳米片Ti3C2 MXenes分散液)并在4℃下保存备用。其结构表征见图2。
将200μL的(0.005g/mL)PEI和3mL的纳米片Ti3C2 MXenes混合,然后在该溶液中加入2mL去离子水,将所得溶液在室温下缓慢搅拌1小时,该溶液以12000rpm离心10分钟,弃去上清液并加入去离子水。EDC(400mM)和NHS(100mM)和aptamer1(1μM,5'-COOH-TTTTTT CACCCC CAC CTC CTC GCT CCC GTG ACA CTA ATG CTA)混合物在37℃下活化1小时。此后,将200μL获得的Ti3C2 MXenes-PEI溶液在37℃下添加到aptamer1的混合溶液(120μL)中1小时,最后,将混合物以12000rpm离心10分钟,弃去上清液并加入去离子水。
玻碳电极表面预处理
将玻碳电极(GCE)用0.3μm的Al2O3粉末在麂皮上进行打磨抛光处理,然后分别用乙醇、去离子水超声清洗3min,用纯净氮气将电极表面吹干。
清洗吹干的玻碳电极作工作电极,Ag/AgCl作参比电极,铂丝作对电极,在铁氰化钾溶液中,-0.2~0.6V,100mV/s,扫描CV至稳定。如此反复,直至玻碳电极的氧化还原电势差达到80mV的活化标准,将玻碳电极用水洗净,氮气吹干。
电极的组装
AuNPs修饰处理后的GCE:取AuNPs(18nm)分散液(制备方法:在剧烈搅拌下将100mL的0.01%(w/v)HAuCl4溶液煮沸,然后在沸腾的溶液中快速加入0.588mL的0.2mol/mL柠檬酸三钠溶液。该溶液变成深红色,表明AuNPs的形成,然后溶液继续搅拌并冷却。将胶体储存在4℃下备用)6μL滴到玻碳电极表面,37℃下孵化待干,接着将电极浸泡在400μM EDC、100μM NHS、以及2mg/mL的EDA的120μL的混合溶液中中,37℃下孵化2h。同时在此期间,将1mgmL-1的羧基封端的PNIPAM、400μM EDC、100μM NHS各40μL混合,室温下活化1h。将在EDA中孵化的玻碳电极,继续浸泡在已活化1h的PNIPAM溶液中,孵化1h。随后将电极浸没在1μM(40μL)aptamer2中,37℃下孵化,洗净吹干后得到生物传感器电极,记为aptamer2/PNIPAM/AuNPs/GCE。
传感器的组装
将aptamer2/PNIPAM/AuNPs/GCE浸没在5.0×105-5×109个/mL的外泌体中,在37℃的环境中2h。洗净吹干后得到捕获外泌体的电极,记为exosomes/aptamer2/PNIPAM/AuNPs/GCE。
将已捕获外泌体的电极用蒸馏水洗净吹干后,置于探针溶液中37℃下孵化2h,待反应完全之后用蒸馏水进行清洗,氮气吹干,即得到制备好的电化学发光生物传感器。该传感器的制备过程如图1所示。
对制备好的传感器进行电化学发光检测,检测结果如图3所示,采用的外泌体浓度分别为5.0×105个/mL(a)、1×106个/mL(b)、2.5×106个/mL(c)、5×106个/mL(d)、107个/mL(e)、5×107个/mL(f)、108个/mL(g)、5×108个/mL(h)、109个/mL(i)、5×109个/mL(j),随着外泌体浓度的增加,电化学发光信号逐渐增大。在外泌体的浓度为5.0×105-5×109个/mL范围内,电化学发光信号的大小与外泌体的浓度的对数呈线性关系,相关系数R=0.9740,检测限为2.5×105个/mL
同时,制备的ECL生物传感器的还可以检测不同外来体例如MCF-7(乳腺癌细胞),HepG2(肝癌细胞)和B16(黑色素瘤细胞)外泌体。检测浓度都为107个/mL的三种不同的外泌体,产生的ECL信号是不同的。其中检测MCF-7外泌体的信号是最大的,其次是HepG2外泌体,最小的是B16外泌体。事实表明,设计的ECL生物传感器具有极好的选择性。
实施例2
本实施例与实施例1相同,不同之处在于:
电极的组装
AuNPs修饰处理后的GCE:取AuNPs(18nm)分散液6μL滴到玻碳电极表面,37℃下孵化待干,接着将电极浸泡在400μM EDC、100μM NHS、以及2mg/mL的EDA中,37℃下孵化2h。同时在此期间,将1mg mL-1的羧基封端的PNIPAM、400μM EDC、100μM NHS各40μL混合,室温下活化1h。将在EDA中孵化的玻碳电极,继续浸泡在已活化1h的PNIPAM溶液中,孵化1h。随后将电极浸没在0.8μM aptamer2中,37℃下孵化2h,洗净吹干后得到生物传感器电极,记为aptamer2/PNIPAM/AuNPs/GCE。
传感器的组装
将aptamer2/PNIPAM/AuNPs/GCE浸没在不同浓度的外泌体中,在25℃的环境中1h。洗净吹干后得到捕获外泌体的电极,记为exosomes/aptamer2/PNIPAM/AuNPs/GCE。
将已捕获外泌体的电极用蒸馏水洗净吹干后,置于探针溶液中37℃下孵化1h,待反应完全之后用蒸馏水进行清洗,氮气吹干,即得到制备好的电化学发光生物传感器。
实施例3
本实施例与实施例1相同,不同之处在于:
电极的组装
AuNPs修饰处理后的GCE:取AuNPs(18nm)分散液6μL滴到玻碳电极表面,37℃下孵化待干,接着将电极浸泡在400μM EDC、100μM NHS、以及2mg/mL的EDA中,37℃下孵化2h。同时在此期间,将1mg mL-1的羧基封端的PNIPAM、400μM EDC、100μM NHS各40μL混合,室温下活化1h。将在EDA中孵化的玻碳电极,继续浸泡在已活化1h的PNIPAM溶液中,孵化1h。随后将电极浸没在1.2μM aptamer2中,37℃下孵化1.5h,洗净吹干后得到生物传感器电极,记为aptamer2/PNIPAM/AuNPs/GCE。
传感器的组装
将aptamer2/PNIPAM/AuNPs/GCE浸没在不同浓度的外泌体中,在50℃的环境中30min。洗净吹干后得到捕获外泌体的电极,记为exosomes/aptamer2/PNIPAM/AuNPs/GCE。
将已捕获外泌体的电极用蒸馏水洗净吹干后,置于探针溶液中37℃下孵化30min,待反应完全之后用蒸馏水进行清洗,氮气吹干,即得到制备好的电化学发光生物传感器。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已,并不用于限制本申请,对于本领域的技术人员来说,本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本申请的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 青岛大学
<120> 一种基于二碳化三钛二维金属碳化物催化鲁米诺电化学发光探针的生物传感
器及制备方法
<130> 2018
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ttttttcacc cccacctcgc tcccgtgaca ctaatgcta 39
<210> 2
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ttttttcact acagaggttg cgtctgtccc acgttgtcat ggggggttgg cctg 54
Claims (8)
1.一种基于二碳化三钛二维金属碳化物催化鲁米诺电化学发光探针,其特征是,包括纳米片Ti3C2MXenes、连接分子聚乙烯亚胺和生物识别分子1,所述纳米片Ti3C2MXenes与连接分子通过静电吸附连接,所述连接分子与生物识别分子1通过酰胺基团连接,所述连接分子含有伯胺基团或仲胺基团,且所述连接分子溶于水后能够带有正电荷,所述生物识别分子1为5’端带有羧基的单链DNA序列1;所述单链DNA序列1由5’至3’的序列为TTTTTT CACCCC CAC CTC GCT CCC GTG ACA CTA ATG CTA,能够识别外泌体上的CD63蛋白质。
2.一种权利要求1所述的探针的制备方法,其特征是,将连接分子与纳米片Ti3C2MXenes置于水中混合均匀后,搅拌一段时间离心获得沉淀,将获得的沉淀与生物识别分子1进行酰胺反应即可获得;搅拌时间为1~1.5h;离心分离的转速超过10000rpm;所述酰胺反应的反应体系为1-(3-(二甲基氨基)丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺钠盐。
3.一种与权利要求1所述的探针配合使用的生物传感器电极,其特征是,玻碳电极表面通过金纳米颗粒修饰,金纳米颗粒与至少含有两个氨基的分子中的一个氨基通过酰胺基团进行连接,至少含有两个氨基的分子中的另一个氨基与羧基封端的聚N-异丙基丙烯酰胺中的一个羧基通过酰胺基团使羧基封端的聚N-异丙基丙烯酰胺与至少含有两个氨基的分子进行连接,羧基封端的聚N-异丙基丙烯酰胺中的另一个羧基与生物识别分子2通过酰胺基团使羧基封端的聚N-异丙基丙烯酰胺与生物识别分子2进行连接,其中,生物识别分子2为5’端带有氨基的单链DNA序列2,所述单链DNA序列2能够识别外泌体上的EpCAM蛋白质;至少含有两个氨基的分子为乙二胺;所述羧基封端的聚N-异丙基丙烯酰胺的数均分子量为1000~5000;所述单链DNA序列2由5’至3’的序列为TTTTTT CAC TAC AGA GGT TGC GTC TGT CCCACG TTG TCA TGG GGG GTT GGC CTG。
4.一种权利要求3所述的生物传感器电极的制备方法,其特征是,将金纳米颗粒分散液滴加至玻碳电极表面使金纳米颗粒附着在玻碳电极表面,通过酰胺反应将至少含有两个氨基的分子连接至金纳米颗粒,再通过酰胺反应使羧基封端的聚N-异丙基丙烯酰胺与至少含有两个氨基的分子连接,然后通过酰胺反应使生物识别分子2与羧基封端的聚N-异丙基丙烯酰胺连接;制备方法中的涉及的反应温度、处理温度为室温或者37±0.5℃。
5.一种电致化学发光的生物传感器,其特征是,包括权利要求1所述的探针和权利要求3所述的生物传感器电极。
6.一种电致化学发光的试剂盒,其特征是,包括权利要求1所述的探针、权利要求3所述的生物传感器电极及鲁米诺。
7.一种权利要求1所述的探针、权利要求3所述的生物传感器电极、权利要求5所述的生物传感器或权利要求6所述的试剂盒在电致化学发光检测外泌体中的应用。
8.一种电致化学发光检测外泌体的方法,其特征是,将权利要求3所述的生物传感器电极浸没至待测外泌体溶液中,使外泌体附着在生物传感器电极上,然后将附着外泌体生物传感器电极浸没至权利要求1所述探针的溶液中,使探针附着在生物传感器电极的外泌体上,从而组成探针和生物传感器电极夹载外泌体的生物传感器,对探针和生物传感器电极夹载外泌体的生物传感器进行电化学发光检测即可。
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