ES2223736T3 - Compuestos, metodos y equipos para identificar agentes capaces de alterar la interaccion proteina-proteina. - Google Patents

Abstract

Sistema doble híbrido inverso de mamífero para identificar un cambio en la interacción proteína-proteína comprendiendo: un constructo supresor que comprende un promotor constitutivo enlazado operativamente a una secuencia codificante de proteína represora; un constructo codificante de proteína de fusión interactiva que comprende un promotor enlazado operativamente a un operador represible, que es represible por una proteína represora codificada por dicha secuencia codificante de proteína represora, una primera secuencia codificante de proteína interactiva fusionada en armazón con una secuencia codificante de proteína de dominio de activación transcripcional y una segunda secuencia codificante de proteína interactiva fusionada en armazón con una secuencia codificante de proteína de dominio de unión a ADN; y, un constructo indicador que comprende un elemento de unión a ADN que se puede unir a dicha proteína de dominio de unión a ADN enlazada operativamente a un promotor mínimo y una secuenciacodificante indicadora.

Description

Compuestos, métodos y equipos para identificar agentes capaces de alterar la interacción proteína-proteína.

Sector técnico al que pertenece la invención

La presente invención se refiere a compuestos, métodos y equipos para identificar agentes que son capaces de alterar la interacción proteína-proteína en células de mamíferos.

Antecedentes de la invención

Las interacciones proteína-proteína están involucradas en la mayor parte de procesos biológicos y funciones celulares, tales como la formación de estructuras macromoleculares celulares, complejos de receptor y enzima, y en la regulación de rutas de transducción de señal. La determinación de las interacciones proteína-proteína en la célula constituye también un enfoque importante a la genómica funcional. La tecnología más potente para la detección de las interacciones proteína-proteína es el sistema doble híbrido de levadura, que fue descrito en primer lugar por Fields y Song (Nature 320: 245-246. 1989).

Las interacciones proteína-proteína pueden ser rotas por ciertas moléculas tales como péptidos o sustancias medicamentosas. En la actualidad la selección de estas moléculas capaces de rotura para una interacción específica proteína-proteína es realizada utilizando sistemas doble híbridos inversos de levadura (Leanna & Hannink. 1996. Nucleic Acids Res. 24, 3341-347; Vital y otros 1996. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93, 10315-10320; Shih, y otros 1996 Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93, 13896-13901) o un sistema doble híbrido inverso bacteriano (Zhang y otros 2000. Nature Biotech. 18, 71-74; Park & Raines. 2000. Nature Biotech. 18, 847-851). Si bien los sistemas doble híbridos de levadura e inverso bacteriano son útiles para algunas selecciones genéticas, no son sistemas ideales para rastrear o seleccionar moléculas terapéuticas tales como medicamentos, dado que la permeabilidad de estas moléculas terapéuticas en levadura o en bacterias es muy distinta a la de las células de mamíferos a causa de la diferente compartimentación celular entre la levadura, bacterias y células de mamíferos. En realidad, el potencial de los agentes medicamentosos candidatos necesita ser evaluado en células de mamíferos en las que se utilizarán dichos agentes medicamentosos de modo eventual. Además, diferentes modificaciones post-translacionales requeridas para interacciones específicas proteína-proteína están limitadas tanto en levaduras como en bacterias. En un sistema mamífero tendrá lugar modificación post-translacional de forma natural para interacciones específicas proteína-proteína. En la actualidad, hay pocos informes sobre sistemas dobles híbridos en mamíferos para interacciones proteína-proteína (Luo y otros 2000. Patente U.S.A. 6.114.111 Shioda y otros 2000. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 5220-5224).

No obstante, ninguno de estos sistemas de mamíferos son adecuados para selección doble híbrida inversa de alto rendimiento de agentes capaces de producir rotura, tales como moléculas terapéuticas, porque en estos sistemas de mamíferos no se reguló la expresión de las dos proteínas interactivas. Para llevar a cabo una selección de alto rendimiento de moléculas terapéuticas potenciales que rompen las interacciones proteína-proteína en células de mamíferos, es deseable que se introduczan moléculas terapéuticas en el sistema del mamífero antes de inducir la síntesis de las dos proteínas interactivas en cualquiera de las células estables o transfectadas transitoriamente. En los sistemas anteriormente conocidos la expresión constitutiva de las dos proteínas interactivas puede activar de manera inmediata el gen indicador ("reporter gene"). Como consecuencia, el efecto inhibidor, por ejemplo, de un medicamento en el bloqueo de la interacción de la proteína, no se puede evaluar con precisión por la extensión reprimida del gen indicador, dado que el gen indicador ya ha sido expresado por completo antes de la adición del agente medicamentoso en el sistema. Teóricamente, los constructos para expresar las dos proteínas interactivas pueden ser transfectados transitoriamente en las células con los medicamentos de cada pocillo a efectos de rastreo o selección. No obstante, llevar a cabo esta transfección transitoria de las células con el constructo en cada uno de los pocillos que contiene medicamento es prácticamente imposible para selección de medicamentos con elevado rendimiento, porque una persona puede ser capaz solamente de transfectar constructos en unas pocas placas de 96 pocillos cada día.

Características de la invención

De acuerdo con lo anterior, se ha desarrollado un sistema doble híbrido inverso de mamíferos para la selección o rastreo de agentes de disociación de la interacción proteína-proteína. El sistema es particularmente útil para el rastreo de alto rendimiento de pequeñas moléculas que impiden interacciones proteína-proteína. Las dos proteínas interactivas son fusionadas o bien con un dominio de unión de ADN o con un dominio de activación transcripcional de un factor de transcripción. La expresión de las dos proteínas de fusión interactivas está regulada por un supresor que es expresado de forma constitutiva en las células. Con la presencia de un inductor, la represión del promotor que dirige la expresión de las dos proteínas interactivas de fusión es elevada, conduciendo a la expresión de dos proteínas de fusión interactivas. Una vez se han producido las dos proteínas de fusión interactivas, el dominio de unión de ADN de una proteína de fusión se une a un elemento de unión de ADN en un promotor y lleva el dominio de activación de transcripción de la otra proteína de fusión interactiva al promotor a través de la interacción proteína-proteína y por lo tanto activa la transcripción del gen indicador ("reporter gene"). En presencia de un inductor y de un agente de disociación de la interacción proteína-proteína las dos proteínas interactivas dejan de interaccionar. De este modo, la transcripción del gen indicador no es activada. Como resultado de ello, la falta de expresión del gen indicador se interpreta como indicador de la identificación de un agente tal como una pequeña molécula medicamentosa terapéutica capaz de disociar la interacción proteína-proteína. Tanto el constructo de codificación de la proteína del indicador como el constructo supresor están integrados típicamente en los cromosomas de las células. La codificación del constructo para las dos proteínas de fusión interactivas es asimismo preferentemente transfectada de forma estable a células. Para análisis de alto rendimiento, los constructos de proteínas de fusión interactiva pueden ser también transfectados de forma transitoria a un lote de multimillones de células que ya se han transfectado de manera estable con el constructo que codifica la proteína del gen indicador y el constructo que codifica el supresor. Estas células pueden ser divididas en múltiples pocillos de placas que contienen agentes de pruebas y un inductor para indentificar el agente de disociación de la interacción proteína-proteína y/o el agente de no disociación de la interacción proteína-proteína en condiciones de alto rendimiento. Dado que el constructo supresor a través de la expresión constitutiva de una proteína represora híbrida regula íntimamente la expresión de las proteínas de fusión interactiva, la transfección transitoria de células con los constructos de proteínas de fusión interactivas no da como resultado la expresión de las proteínas de fusión interactivas y la subsiguiente activación del gen indicador hasta que se añade un inductor. Además, el gen indicador será expresado solamente en situaciones en las que un agente de pruebas no pueda provocar la rotura de la interacción proteína-proteína.

La presente invención proporciona un sistema doble híbrido inverso de mamífero para identificar un cambio en la interacción proteína-proteína que comprende: un constructo supresor que comprende un promotor constitutivo enlazado operativamente a una secuencia de codificación de proteína represora; un constructo de codificación de la proteína de fusión interactiva que comprende un promotor enlazado de manera operativa a un operador represible, que es represible por una proteína represora codificada por dicha secuencia de codificación de la proteína represora, una primera secuencia de codificación de proteína interactiva fusionada en el armazón ("frame") con una secuencia de codificación de proteínas de dominio de activación transcripcional y una segunda secuencia de codificación de proteína interactiva fusionada en armazón con una secuencia de codificación de proteína de dominio de unión de ADN; y, un constructo indicador que comprende un elemento de unión a ADN que se puede unir a dicha proteína de dominio de unión de ADN enlazada operativamente a un promotor mínimo y a una secuencia de codificación indicadora.

En una realización preferente, el constructo de codificación de la proteína de fusión interactiva puede quedar constituido por su parte o se puede derivar de un primer constructo interactivo de codificación de proteína de fusión de dominio de activación de transcripción de la proteína, comprendiendo un promotor enlazado operativamente a un operador represible, que es represible por una proteína represora codificada por dicha secuencia codificadora de la proteína represora y una primera secuencia de codificación de la proteína interactiva fusionada en el armazón con una secuencia de codificación de la proteína del dominio de activación transcripcional; y un segundo constructo interactivo codificante de proteína de fusión de dominio de unión de proteína-ADN (para mayor continuidad descriptiva utilizamos "codificante" en vez de "gen") que comprende un promotor enlazado operativamente a un operador represible, que es represible por una proteína represora codificada por dicha secuencia codificadora de la proteína represora, una segunda secuencia interactiva codificante de la proteína fusionada en armazón con una secuencia codificante de proteína de dominio de unión a ADN.

Preferentemente, el sistema doble híbrido inverso en mamífero comprende adicionalmente como mínimo una secuencia con sitio de entrada de ribosoma interno (IRES). En una realización especialmente preferente, dicha primera secuencia interactiva de codificación de la proteína fusionada en armazón con una secuencia codificante de proteína de dominio de activación transcripcional está enlazada operativamente a dicha segunda secuencia interactiva codificante de proteína fusionada en armazón con la secuencia codificante de proteína del dominio de unión a ADN a través de una secuencia de sitio de entrada de ribosoma interno (IRES). El IRES puede ser típicamente una secuencia IRES sintética o un virus IRES de encefalomiocarditis.

El constructo indicador puede comprender adicionalmente una segunda secuencia codificante indicadora enlazada operativamente (preferentemente a través de un IRES) a la secuencia indicadora ya presente (primera). En una realización preferente en dicho constructo indicador se soluciona dicho promotor entre el grupo que consiste en un promotor mínimo procedente de promotor de citomegalovirus humano (CMV), promotor previo SV40, promotor adenovirus E1b, promotor de virus sincitial respiratorio (RSV), promotor EF1 y promotor de timina quinasa (TK).

La presente invención comprende también plásmidos que comprenden un sistema doble híbrido inverso de mamífero según la invención. En una realización preferente se prevé un conjunto de dos plásmidos en el que dicho constructo supresor y dicho constructo indicador están dispuestos en un primer plásmido y dicho primer constructo interactivo codificante de proteína de fusión de dominio de activación transcripcional de la proteína y dicho segundo constructo interactivo codificante de la proteína de fusión del dominio de unión a la proteína de ADN son dispuestos de manera conjunta en un segundo plásmido.

La invención comprende, además, una célula de mamífero que comprende un sistema doble híbrido inverso de mamífero según la invención, integrado preferentemente en un cromosoma de la célula.

La invención comprende, además, un método para identificar un cambio en una interacción proteína-proteína que comprende someter un sistema doble híbrido inverso de mamífero según la invención en una célula a un inductor y un agente de prueba de la rotura de la interacción proteína-proteína; y ensaya dicha célula en cuanto a expresión o no expresión de dicha secuencia codificante indicadora, no expresión de dicha secuencia codificante indicadora es indicativa de la capacidad de rotura de dicho agente de rotura de la interacción proteína-proteína de dicha prueba.

En este método el agente de rotura puede ser un agente de rotura indirecta sometido a prueba en cuanto a su capacidad de inhibir la actividad de una enzima relacionada a una enfermedad (por ejemplo, al cáncer) tal como una kinasa.

De manera alternativa el método anteriormente descrito puede comprender (a) introducir de manera estable un constructo supresor y un constructo indicador en una célula; y (b)(i) introducir de manera estable un primer constructo codificante de proteína de fusión de dominio de activación de transcripción de proteína de tipo interactivo y un segundo constructo interactivo codificante de proteína de fusión de dominio de unión de proteína de ADN en dicha célula; o bien (b)(ii) introducir transitoriamente un primer constructo interactivo codificante de la proteína de fusión del dominio de activación de transcripción de la proteína y un segundo constructo interactivo codificante de proteína de fusión de dominio de unión a ADN de la proteína en dicha célula; (c) someter una célula resultante de la etapa (b)(i) ó (b)(ii) a un inductor y a un agente de rotura de la interacción proteína-proteína de prueba; (d)ensayar dicha célula sometida a la no expresión y expresión de dicha secuencia codificante indicadora; y, (e) identificar dicho agente de rotura de la interacción proteína-proteína mencionado basándose en la no expresión de dicha secuencia codificante indicadora.

Según otro aspecto la invención da a conocer un equipo para identificar un cambio en la interacción proteína-proteína que comprende: una o varias partes alícuotas de un constructo supresor, un primer constructo interactivo codificante de proteína de fusión de dominio de activación de transcripción de proteína, un segundo constructo interactivo codificante de proteína de fusión de dominio de unión de ADN de proteína, y un constructo indicador en uno o varios plásmidos; y, una o varias partes alícuotas de un reactivo, célula, y aparato necesario para llevar a cabo un método para identificar un cambio en la interacción proteína-proteína.

El equipo puede comprender una o varias partes alícuotas de uno o varios plásmidos tal como se han definido, una o varias partes alícuotas de una célula que contiene un constructo tal como se ha definido y reactivos y aparatos apropiados.

Breve descripción de los dibujos

Las figuras 1A-1E muestran la forma general de varios constructos utilizados y los principios involucrados en llevar a cabo la presente invención.

La figura 2 muestra la rotura de la interacción proteína-proteína entre FKBP12 y del receptor RI del factor transformante de crecimiento \beta(TGF\beta) en células 293A por la molécula medicamentosa FK506.

La figura 3 muestra la rotura de la interacción proteína-proteína entre el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) y p85 en células 293A por la molécula medicamentosa AG1478.

La figura 4 muestra indicación visual de la rotura de la interacción proteína-proteína entre FKBP12 y el receptor RI de TGF\beta (figuras 4a-4d) y entre EGFR y p85 (figuras 4e-4h)en células 293A por la molécula medicamentosa FK506 y AG1478 por la no expresión del gen indicador GFP.

La figura 5 muestra la utilización de \beta-lactamasa como gen indicador en la presente invención.

Descripción detallada de la invención

La presente invención da a conocer compuestos, métodos, y dispositivos que pertenecen a un sistema doble híbrido inverso de mamífero particularmente adecuado para identificar agentes que son capaces de producir la rotura de las interacciones proteína-proteína en células de mamíferos. En una primera realización, la identificación de los agentes de rotura de la interacción proteína-proteína se puede realizar con elevado rendimiento. En otra realización, los agentes de rotura pueden ser pequeñas moléculas, péptidos o cualesquiera moléculas naturales/sintéticas con efecto terapéutico. Los agentes de rotura de la interacción proteína-proteína pueden ser las moléculas que directa o indirectamente efectúan la rotura de la interacción proteína-proteína. En el caso de rotura indirecta, estas moléculas pueden inhibir la actividad de una proteína específica, por ejemplo, una enzima. Estas enzimas pueden ser kinasas, preferentemente kinasas relacionadas con la enfermedad. La palabra rotura implica también cambio.

El sistema doble híbrido inverso de mamífero de la presente invención tiene de manera típica cuatro componentes: un constructo codificante supresor, un primer constructo interactivo codificante de la proteína de fusión del dominio de activación de transcripción de la proteína, un segundo constructo interactivo codificante de la proteína de fusión del dominio de unión del ADN de la proteína, y un constructo codificante de la proteína indicadora. Éstos pueden ser acoplados en constructos híbridos que comprenden dos o más de los componentes anteriormente indicados.

El constructo supresor comprende típicamente, en dirección 5' a 3' y con enlace operativo, un promotor constitutivo para regular la transcripción de una secuencia codificante más abajo del promotor, una secuencia codificante para una proteína represora de híbrido, y un promotor constitutivo que regula una secuencia que codifica un marcador selectivo, tal como un marcador selectivo medicamentoso por ejemplo, neomicina, higromicina, puromicina, o cualesquiera otros marcadores selectivos de medicamentos utilizables en células de mamíferos (figura 1). Las líneas de células utilizadas en la presente invención pueden proceder de mamíferos tales como un ratón, una rata, un primate, o un humano. Pueden seleccionarse células adecuadas para realizar las interacciones proteína-proteína de la presente invención, por ejemplo, entre células CHO, Cos, NIH 3T3, Hela, y células 293 de riñón embriónico humano.

Un promotor constitutivo es un elemento cis-regulador capaz de regular la expresión de una secuencia codificante más abajo de la misma de manera continua. Estos promotores constitutivos se conocen en la técnica anterior y se pueden seleccionar, por ejemplo, entre citomegalovirus humanos (CMV), SV40, virus sincitial respiratorio (RSV), promotores EF1 y kinasa de timina (TK). En una realización que se describe más adelante, el promotor constitutivo es un promotor procedente del promotor de gen inmediatamente anterior del citomegalovirus humano (CMV).

Una proteína represora de híbrido, en presencia de un inductor, es capaz de unión a un operador en un promotor y reprimir por lo tanto la expresión de una secuencia codificante más abajo del promotor. Estas proteínas represoras son conocidas en la técnica anterior y se pueden seleccionar entre los represores Lac, \lambda, Y Tet de Escherichia coli. La proteína represora de tetraciclina (TetR) puede unirse a su operador insertado en un promotor situado más arriba de una secuencia codificante y puede bloquear la transcripción de la secuencia codificante. En células de mamíferos, no obstante, la proteína TetR se ha encontrado que no bloquea por completo la actividad transcripcional del promotor. Por lo tanto, en un realización que se describe más adelante, se utiliza una proteína híbrida TetR capaz de bloquear por completo la transcripción de una secuencia de codificación más abajo de un promotor (Deuschle y otros, 1995. Mol. Cell Biol. 15, 1907-1914). La proteína represora TetR utilizada en la presente invención es un híbrido-represor en el que la secuencia codificante TetR está enlazada a una secuencia de localización nuclear (NLS) que a su vez está enlazada al dominio KRAB del gen supresor transcripcional humano Kox1 (Deuschle y otros, 1995. Mol. Cell Biol. 15, 1907-1914). La represión puede ser levantada al disponer un inductor, que se une a la proteína represora TetR, liberando de esta manera el promotor de la transcripción de la secuencia de codificación más abajo del promotor. Estos inductores son conocidos en la técnica anterior y se pueden seleccionar entre la lactosa para el represor lac y la tetraciclina para el represor de tetraciclina. En una realización que se describe más adelante, se utiliza como inductor doxiciclina (Dox), un derivado de tetraciclina. La doxiciclina se une a la proteína híbrida-TetR, impidiendo de esta manera la unión de la proteína híbrida-TetR a la secuencia operadora, resultando en la transcripción de la secuencia codificante más abajo del promotor. En una realización que se describe más adelante, la secuencia codificante es o bien una primera proteína interactiva fusionada a un dominio de activación transcripcional o una segunda proteína interactiva fusionada a un dominio de unión a ADN. En una realización preferente, la secuencia de codificación puede ser una primera proteína interactiva fusionada con un dominio de activación y una segunda proteína interactiva fusionada a un dominio de unión a ADN enlazado por una secuencia de sitio de entrada de ribosoma interno (IRES) (Chappell y otros, 2000, Proc. Natl. Acad. Sci. Usa 97, 1536-1541). Este IRES sintético es más activo que el IRES habitualmente utilizado del virus de encefalomiocarditis (EMCV), y por lo tanto asegura niveles de expresión apropiados de las dos proteínas interactivas reguladas por un promotor común más arriba de las secuencias de codificación de proteínas interactivas.

El primer constructo interactivo codificante de proteína de fusión de dominio de activación transcripcional de la proteína comprende, en dirección 5' a 3' y con enlace operativo, un promotor inducible con un operador, una secuencia codificante para una primera proteína interactiva fusionada en armazón a una secuencia codificante de un dominio de activación transcripcional (figura 1) y una secuencia IRES que enlaza a una secuencia que codifica para una segunda proteína interactiva fusionada con un dominio de unión a ADN. El dominio de activación transcripcional es capaz de reclutar los medios de transcripción para efectuar la transcripción de un gen indicador cuando tiene lugar la interacción de una segunda proteína interactiva con la primera proteína interactiva. Esta interacción entre la primera proteína interactiva y la segunda proteína interactiva puede ser objeto de rotura por ciertos agentes de rotura de la interacción proteína-proteína, que conducen a la no expresión del gen indicador.

Un promotor inducible, en ausencia de un inductor, es normalmente reprimido por una proteína represora imposibilitando de esta manera que el promotor transcriba una secuencia codificante más abajo de la misma. No obstante, en presencia de un inductor, el promotor inducible es capaz de expresar una secuencia codificante más abajo del mismo. Estos promotores inducibles son conocidos en la técnica anterior y se pueden seleccionar entre Lac, lambda P(L), Tet y el operador de triptofano de Escherichia coli conjuntamente con un promotor de núcleo de mamífero. En una realización que se describe más adelante, el promotor inducible es un promotor CMV de núcleo (la mayor parte, o totalidad del promotor excepto la casilla TATA) enlazado a un operador de tetraciclina (T OP). Este promotor es reprimido normalmente en presencia de la proteína híbrido-represora constitutivamente expresada TetR-NLS-KRAB, pero es capaz de expresar una secuencia codificante más abajo de la misma en presencia de la doxiciclina inductora(DOX).

Una primera proteína interactiva es la primera de dos proteínas interactivas fusionadas en armazón a un dominio de activación de un factor de transcripción. Dichas primeras proteínas interactivas pueden ser seleccionadas, por ejemplo, de cualesquiera asociados de proteínas de interacción que son importantes para transducciones de señales celulares y procesos celulares tales como receptores, adaptadores, efectores y enzimas, y pueden ser una molécula señalizadora relacionada con la enfermedad. Por adaptador se comprenderá una proteína sin actividad catalítica o transcripcional, pero como armazón tiene dominios que se unen a otras proteínas. Por efector se comprende una proteína que efectúa la mediación de una ruta de transducción de una señal. Además, dichas primeras proteínas interactivas pueden ser identificadas también en el futuro y fusionadas con el dominio de activación de un factor de transcripción. En las realizaciones que se describen más adelante, la primera proteína interactiva es o bien un receptor tipo I de factor de crecimiento de transformación (TGF\betaR) (RI) o la subunidad p85 de fosfatidilinositol 3-quinasa. Los dominios de activación de un factor de transmisión son conocidos también en la técnica anterior y pueden ser seleccionados entre GAL4, B42, VP16 y NF-kB p65. En realizaciones que se describen más adelante, el dominio de activación de un factor de transcripción es un VP16 que interacciona, con ayuda de una primera y segunda proteínas interactivas, con un promotor mínimo para activar la transcripción de un gen indicador.

Un segundo constructo interactivo codificante de proteína de fusión del dominio de unión de ADN de proteína comprende de manera típica, en dirección 5' a 3' y con unión operativa, un promotor inducible con un operador tal como se ha descrito anteriormente, una secuencia codificante para la segunda proteína interactiva fusionada en armazón a la secuencia de codificación de un dominio de unión de ADN. El dominio de unión de ADN es capaz de unirse a un elemento de ácido nucleico más arriba de un promotor mínimo dispuesto en un constructo de codificación de proteína indicadora tal como se describe más adelante.

La segunda proteína interactiva es la proteína interactiva que se fusiona en armazón a un dominio de unión de ADN. Esta segunda proteína interactiva puede ser seleccionada de proteínas que interaccionan con las primeras proteínas interactivas.

Comprenden, sin que ello sirva de limitación, proteasas, fosfatasas, quinasas, receptores y otras proteínas de enzimas. En particular, las quinasas pueden ser quinasas relacionadas con enfermedades tales como EGFR, PDGFR, Her2, VEGFR, Met, FGFR, IGFR, receptor de insulina, JAKs, PKA, PKC, MAP quinasa, ZAP70, v-Abl, así como Lck, Lyn, y otras quinasas similares a Src. Además, estas segundas proteínas interactivas pueden también ser identificadas en un futuro y fusionadas con el dominio de unión con ADN. En realizaciones que se describen más adelante, la segunda proteína interactiva es o bien inmunofilina FKPB12 o un receptor de factor de crecimiento epidérmico (EGFR).

Los dominios de unión de ADN son también conocidos en la técnica anterior y se pueden seleccionar entre el represor Tet, represor lambda, secuencia de unión Lax A ADN, NF-kB p65, y p53. En realizaciones que se describen más adelante, el dominio de unión de ADN es una secuencia de unión Gal4 de S. cerevisiae que se une a un elemento de unión Gal4 insertado en la parte de más arriba del promotor mínimo, tal como promotor citomegalovírico (CMV).

En una realización preferente que se describe más adelante, el primer constructo interactivo codificante de proteína de fusión de dominio de activación transcripcional de proteína y el segundo constructo interactivo codificante de proteína de fusión de dominio de unión de ADN de proteína se combinan en el mismo plásmido. En este caso, la secuencia de codificación para la primera proteína interactiva es fusionada en armazón a la secuencia codificante del dominio de activación transcripcional y la secuencia codificante para la segunda proteína interactiva es fusionada a la secuencia codificante del dominio de unión de ADN y a continuación los dos componentes son enlazados por una secuencia de sitio de entrada de ribosoma interno sintético (IRES) (Chappell y otros 2000 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 1536-1541). De esta manera, se puede regular la expresión de las dos proteínas interaccionantes por el mismo promotor de más arriba de las dos secuencias de codificación de proteínas interactivas.

Un constructo indicador comprende de manera típica, en la dirección 5' a 3' y con enlace operativo, un elemento de unión de ADN, un promotor mínimo y una secuencia codificante indicadora.

El elemento de unión de ADN está unido por el dominio de unión de ADN de la segunda proteína de fusión del dominio de unión de ADN de la proteína interactiva. En realizaciones que se describen más adelante, el elemento de unión a ADN es un elemento de unión de ADN a Gal4.

Se puede utilizar un gen indicador para detectar de manera indirecta la aparición de una reacción. En la presente invención, la no expresión del gen indicador es utilizada como indicación de rotura entre dos proteínas interactivas. Estos genes indicadores son conocidos en la técnica anterior y se pueden solucionar, por ejemplo, entre genes para proteína fluorescente verde (GFP) y derivados, luciferasa, \beta-lactamasa, \beta-galactosidasa, fosfatasa alcalina, cloranfenicol acetil transferasa, y marcadores selectivos de medicamentos tales como neomicina, higromicina, puromicina, o cualesquiera otros marcadores selectivos de medicamentos utilizables en células de mamíferos. En realizaciones que se describen más adelante, se utilizaron los genes indicadores siguientes: un gen de proteína fluorescente verde (GFP), un gen de \beta-lactamasa, y un gen de \beta-galactosidasa. En una realización preferente, dos o más genes indicadores están enlazados entre sí por la secuencia IRES, para fácil evaluación visual (para GFP) y evaluación bioquímica mejorada (para el gen de \beta-lactamasa o el gen de \beta-galactosidasa).

Los cuatro componentes del sistema híbrido doble inverso de mamífero según la presente invención que se ha descrito se pueden encontrar presentes en uno o varios plásmidos. En una realización, el constructo de codificante supresor y los constructos codificantes de proteínas indicadores están dispuestos en un primer plásmido y los dos constructos de fusión de proteínas interactivos están dispuestos en un segundo plásmido.

La figura 1 muestra los principios básicos de la invención con intermedio de una realización de la presente invención.

La figura 1A muestra un ejemplo de un constructo supresor utilizado para la supresión incrementada del promotor (P) en constructos de proteínas interactivos. Los siguientes elementos estaban operativamente enlazados en dirección de 5' a 3': un promotor CMV (P), secuencia codificante TetR, NLS (no mostrado), dominio KRAB del gen humano Koxl, y una secuencia codificante marcadora selectiva dirigida por un promotor (P).

La figura 1B muestra un ejemplo de un constructo de proteína de fusión interactiva en el que ambas proteínas interactivas están enlazadas con intermedio de la secuencia de sitio de entrada de ribosoma interno (IRES) y están controladas por un promotor común. Los siguientes elementos fueron enlazados operativamente en dirección 5' a 3': un promotor de núcleo CMV (P), operador de tetraciclina (T OP), casilla TATA del promotor CMV, dominio de activación transcripcional (AD) fusionado a una primera proteína interactiva (X), IRES, y un dominio (BD) de unión a ADN fusionado a una segunda proteína interactiva (Y). En ausencia de inductor, se puede apreciar que el operador de tetraciclina está ocupado por dos unidades de represor TetR-KRAB manteniendo de esta manera suprimido el promotor CMV, resultando ello en la no expresión de proteína de fusión interactiva, mostrado por "off" ("inactivo").

La figura 1C muestra un ejemplo de un constructo de proteína de fusión interactiva en la que ambas proteínas interactivas están interrelacionadas a través de la secuencia IRES y están controladas por un promotor común. Los elementos siguientes estaban operativamente enlazados en dirección 5' a 3': un promotor de núcleo CMV (P), operador de tetraciclina (T OP), casilla TATA del promotor CMV, dominio de activación transcripcional (AD) fusionado a una primera proteína interactiva (X), IRES, y dominio de unión a ADN (BD) fusionado a una segunda proteína interactiva (Y). En presencia de un inductor (Dox), el inductor interacciona con el TetR-KRAB para liberar el operador de tetraciclina de dos unidades de represor de TetR-KRAB levantando de esta manera la supresión del promotor CMV, teniendo como resultado la transcripción de la proteína de fusión interactiva, mostrada por "on" ("activo").

La figura 1D muestra un ejemplo de un constructo indicador en el que dos secuencias codificantes indicadoras están enlazadas a través de una secuencia IRES. Los siguientes elementos estaban enlazados operativamente en dirección 5' a 3': cuatro elementos de unión Gal4 (Gal4 BE), una casilla TATA de promotor mínimo CMV, una primera secuencia codificante indicadora (indicador 1), la secuencia IRES, y una segunda secuencia codificante indicadora (indicador 2). En presencia de un inductor (DOX), pero en ausencia de un agente de disociación de la interacción proteína-proteína (medicamento), el dominio de unión de ADN (BD) de la segunda proteína de fusión interactiva se une al elemento de unión Gal4 y la primera proteína de fusión interactiva interacciona con la segunda proteína de fusión interactiva que lleva el dominio de activación transcripcional (AD) de la primera proteína de fusión de dominio de activación interactiva-transcripcional a contacto con el dominio de unión de ADN para activar la transcripción de las secuencias de codificación indicadoras, mostradas por "on" ("activado") y mostradas por la presencia de puntos en una célula.

La figura 1E muestra un ejemplo de un constructo indicador en el que dos secuencias codificantes indicadoras están enlazadas con intermedio de una secuencia IRES. Los siguientes elementos estaban operativamente enlazados en dirección 5' a 3': cuatro elementos de unión Gal4 (Gal4 BE), una casilla TATA del promotor mínimo CMV, una primera secuencia de codificación indicadora (indicador 1), la secuencia IRES y una segunda secuencia codificante indicadora (indicador 2). En presencia de un inductor (Dox) y un agente de disociación de interacción proteína-proteína (mostrado como medicamento), la interacción entre las dos proteínas interactivas es objeto de rotura por el medicamento. En ausencia de dicha interacción de proteína, la transcripción de la secuencia codificante indicadora no está activada, mostrada por "off" ("desactivado") y mostrado por la ausencia de puntos en una célula.

Los componentes de la presente invención tal como se han descrito pueden ser utilizados en un método para identificar agentes de rotura de la interacción proteína-proteína en células de mamíferos. Este efecto puede ser conseguido transfectando células con los constructos antes descritos: un constructo supresor, un primer constructo codificante de proteína de fusión de dominio de proteína interactiva-activación transcripcional, un segundo constructo codificante de proteína de fusión de dominio de unión de proteína interactiva-ADN, y un constructo indicador; células de selección para la integración o presencia de dichos constructos; sometiendo las células seleccionadas a un inductor y a un agente candidato de rotura de la interacción proteína-proteína; ensayando las células en cuanto a no expresión y expresión de la secuencia codificante indicadora; e identificando el agente de rotura de la interacción proteína-proteína que tiene como resultado la no expresión de la secuencia codificante indicadora. Las células pueden ser sometidas a un inductor y a un agente separadamente de la selección de las células.

Las composiciones y métodos de la presente invención pueden ser también conseguidos en un equipo con instrucciones para su utilización. En una realización el equipo puede comprender contenedores o receptáculos con una o varias partes alícuotas del constructo supresor, el primer constructo codificante de proteína de fusión del dominio de proteína interactiva-activación transcripcional, el segundo constructo codificante de proteína de fusión del dominio de unión de proteína interactiva-ADN, y el constructo indicador dispuesto en uno o varios plásmidos. Las proteínas interactivas del primer constructo codificante de proteína de fusión de dominio de proteína interactiva-activación transcripcional y el segundo constructo codificante de proteína de fusión de dominio de unión de proteína interactiva-ADN se pueden sustituir, por ejemplo, por sitios de clonado múltiple en armazón para el clonado de cualquier otras proteínas interactivas cuya respuesta a un agente específico de rotura tiene que ser comprobada. El equipo puede incluir también varios reactivos y aparatos necesarios para llevar a cabo el método. En otra realización, el equipo puede contener células de mamíferos que contienen uno o varios componentes de los compuestos de la presente invención. En otra realización adicional, los constructos supresor e indicador han sido ya introducidos en las células antes de introducir constructos de proteínas interactivas a través de transfección estable o transitoria.

Ejemplos Construcción de constructos de genes indicadores

La mini secuencia promotora del gen inmediato-previo de citomegalovirus (CMV) humano fue amplificada por PCR con un cebador de sentido conteniendo un lugar XbaI y un cebador antisentido conteniendo dos sitios de restricción, HindIII y HpaI. La secuencia amplificada fue insertada en pG5CAT (Clontech) en los sitios XbaI y HpaI para sustituir el gen CAT junto con el promotor mínimo E1b de adenovirus. El plásmido resultante fue designado pG5CMV. El gen de proteína fluorescente verde (GFP) amplificado por PCR a partir de pEGFP-C1 (Clontech) con un lugar HindIII en el extremo 5' y los lugares EcoRV y Hpa1 en el extremo 3', fue insertado en pG5CMV en los sitios HindIII y HpaI, dando como resultado pG5CMV-GFP. Una secuencia IRES sintética (Chappell y otros. 2000. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 1536-1541) con el extremo romo ("blunt end") en el extremo 5' y un sitio EcoRV en el extremo 3' fue insertada en pG5CMV-GFP en el sitio EcoRV, formando pG5CMV-GFP-IRES. La \beta-lactamasa o gen Lac Z, que fueron amplificados ambos por PCR, fue insertada en el pG5CMV-GFP-IRES en el lugar EcoRV por ligado primario ("blunt ligation") para generar pG5CMV-GFP-IRES-\beta-Lac ó pG5CMV-GFP-IRES-\beta-Gal. Este constructo es similar al mostrado en las figuras 1D y 1E.

Construcción de un constructo supresor

La secuencia supresora de tetraciclina (TetR) con un lugar HindIII en el extremo 5' fue amplificada por PCR a partir de pUHD15.1 (Gossen & Bujard. 1992. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 5547-5551).

La secuencia de localización nuclear sintética (NLS) de 7 amino ácidos (Kalderon y otros. 1984. Cell 39, 499-509) con un sitio EcoRV en el extremo 3' fue unida con la secuencia TetR en armazón por PCR. El fragmento TetR-NLS fue clonado en pCADN3.1 (Invitrogen) en los sitios HindIII y EcoRV. El vector resultante fue designado pCMV-TetR-NLS. El dominio KRAB del gen supresor humano Kox1(Deuschle y otros.1995. Mol.Cell. Biol. 15, 1907-1914) fue amplificado por RT-PCR a partir de riñón de rata y clonado en pCMV-TetR-NLS en armazón con NLS en los lugares EcoRV y XbaI por ligado primario para formar pCMV-TetR-KRAB. Este constructo es similar al perfil mostrado en la figura 1A.

Construcción de un constructo indicador y supresor combinado

El constructo supresor pCMV-TetR-KRAB, tal como se ha descrito anteriormente, fue digerido con BgIII y ApaI. El fragmento mayor BgIII-ApaI (1,8kb) fue aislado e insertado en el vector pEGFP-C1 (Clontech) en los lugares BgIII y ApaI. El plásmido resultante fue designado pEGFP-CMV-TetR-KRAB. A continuación, todo el cassette indicador plásmidos pG5CMV-GFP-IRES-\beta-lac ó pG5CMV-GFP-IRES-\beta-gal fue aislado siguiendo digestión SmaI e insertado en pEGFP-CMV-TetR-KRAB en PciI y BspEI por ligado primario. El plásmido resultante fue designado como pG5CMV-GFP-IRES-\beta-gal-pCMV-TetR-KRAB-IRES ó pG5CMV-GFP-IRES-\beta-lac-pCMV-TetR-KRAB-IRES y utilizado para transfección estable a células.

Construcción de un primer constructo de gen de fusión de proteína interactiva-dominio de unión y un segundo constructo de gen de fusión de proteína interactiva-dominio de activación

Se sintetizaron las secuencias del operador represor de tetraciclina (4xTOP) con un lugar SalI en el extremo 5' y un lugar XbaI en el extremo 3' y se insertaron en los lugares SalI y XbaI de pG5CMV/Hygro que fue preparado por inserción del cassette de expresión de higromicina aislado de pcDNA3.1/Hygro (Invitrogen) en el lugar NdeI de pG5CMV. El plásmido resultante fue designado pG5CMV-tetOP. La secuencia promotora de núcleo de CMV conteniendo 555 bp derivado del vector pcDNA3.1 (nucleótidos 232-787) fue clonado en pG5CMV-tetOP en los lugares XhoI y SalI entre los que se eliminaron los elementos de unión Gal4 (5x). El plásmido resultante fue designado pCMV-tetOP. El dominio de unión (BD) de Gal4 a ADN y el dominio de activación (AD) transcripcional VP16, que contienen ambos los lugares múltiples de clonado (MCS), fueron aislados respectivamente de los vectores pM y pVP16 (Clontech), y clonados en pCMV-tetOP en el lugar HindIII de manera tal que se conservaron los otros MCS, pero los lugares HindIII fueron destruídos por ligado primario. Los plásmidos resultantes fueron designados pCMV-tetOP-BD y pCMV-tetOP-AD, respectivamente. Las secuencias codificantes de proteínas interactivas, X e Y, se clonaron individualmente en los lugares apropiados de MCS situados en AD y BD, respectivamente.

Construcción de un primer constructo combinado codificante de proteína de fusión de proteína interactiva-dominio de activación transcripcional y un segundo constructo de proteína de fusión de proteína interactiva-dominio de unión ADN

Se insertó la secuencia operadora represora de tetraciclina sintética (4xTOP) en pUHD 10.3 (Gossen & Bujard.1992. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 5547-5551) en los lugares XhoI y StuI para sustituir 7x TOP en el vector pUHD 10.3. La secuencia promotora de núcleo CMV conteniendo 550 bp, derivada de vector pcDNA3.1 (nucleótidos 230-780) fue clonada en el lugar XhoI por delante de 4xTOP, produciendo pUHD-CMV-tetOP. La secuencia de proteína aislada "X" para la interacción proteína-proteína específica fue insertada en pVP16 (Clontech) en la región del lugar de clonado múltiple (MCS) para su fusión con el dominio de activación (AD) transcripcional Vp16 en armazón. El fragmento AD-X fusionado fue aislado a continuación por digestiones NheI y XbaI, llenado e insertado en pUHD-CMV-tetOP en los lugares SacII y NaeI por ligado primario para generar pUHD-CMV-tetOP-AD X. La secuencia IRES sintética fue insertada en el pcDNA3/Hygro en los lugares AfI II y NotI por ligado primario. El plásmido resultante pcDNA3-IRES fue sometido a digestión con las enzimas NruI y NheI, y el fragmento CMV tetOP-AD-X, aislado de pUHD-CMV-tetOP-AD-X con las digestiones NruI y XbaI, fue insertado en el vector sometido a digestión de pcDNA3-IRES para formar pCMV-tetOP-AD-X-IRES. El dominio de unión (BD) amplificado-PCR Gal4 ADN de pM(Clontech) fue insertado en pcDNA3 en los lugares NheI y XbaI y la secuencia de proteína "Y" aislada para la interacción específica proteína-proteína fue fusionada con el BD en armazón. El fragmento BD-Y fue aislado a continuación por digestiones NheI y XbaI e insertado en pCMV-tetOP-AD-X-IRES en el lugar XbaI para el constructo pCMV-tetOP-AD-X-IRES-BD-Y/Hygro. Este constructo se asemeja al perfil mostrado en las figuras 1B & 1C.

Generación de líneas celulares que expresan varios constructos

Para establecer una línea celular estable que expresa el constructo individual o el constructo combinado supresor e indicador, se aplicaron aproximadamente 10^{5}-10^{6} células de la línea celular 293A en un platillo de 60 mm de diámetro un día antes de la transfección. Se llevó a cabo la transfección con los constructos con la confluencia de células al 80% con 5 \mug del plásmido linealizado mezclado con 20 \mul de Superfect (Qiagen). Después de 48 horas de la transfección, se tripsinizaron células, y se diluyeron a la proporción 1:20 en el medio de cultivo conteniendo 800 \mug/ml de G418 para la selección de las células transfectadas. Después de 3 semanas después de la transfección, se seleccionaron colonias. Las células de las colonias individuales seleccionadas fueron inducidas con Dox, y comprobadas por co-transfección con pCMV-tetOP-AD-X-IRES-BD-Y para la interacción proteína-proteína que activa los genes indicadores. Se midió GFP 48 horas después de la transfección, mientras que la actividad de \beta-lactamasa ó \beta-galactosidasa fue determinada dentro de 24-36 horas después de la transfección. Las células de las colonias seleccionadas transfectadas de manera estable con pG5CMV-GFP-IRES-\beta-gal-pCMV-TetR-KRAB-IRES ó pG5CMV-GFP-IRES-\beta-lac-pCMV-TetR-KRAB-IRES se cotransfectaron adicionalmente con pCMV-tetOP-AD-X-IRES-BD-Y.

Se seleccionaron adicionalmente líneas celulares expresando de manera estable el supresor individual o combinado, indicador, y los constructos de proteínas de fusión interactivas por G418 (400\mug/ml) e higromicina (200 \mug/ml) para rastreo de los agentes de ruptura de la interacción proteína-proteína. Se aplicaron procesos similares a otras líneas celulares de mamíferos tales como BHK, Cos, CHO, NIH3T3 para establecer líneas celulares estables para el rastreo o selección de los agentes de ruptura de la interacción proteína-proteína o de los agentes que no producen ruptura de la interacción proteína-proteína.

Para utilizar la expresión transitoria de proteínas interactivas para rastreo de elevado rendimiento, se transfectaron multi-millones de células expresando de manera estable el represor y los indicadores con pCMV-tet OP-AD-X-IRES-BD-Y durante una noche y luego se dividieron en placas de 96 ó 384 pocillos conteniendo Dox y medicamentos. Depués de otras 24 horas, se midió el nivel de expresión de los indicadores para indentificar los agentes de ruptura de la interacción proteína-proteína o agentes que no producen ruptura. Este método puede ser utilizado para rastreo o selección de medicamentos.

Detección de la expresión de gen indicador ("Reporter Gen")

Proteína de fluorescencia verde (GFP). Para ensayo directo de la expresión de GFP, se cultivaron células en 96 ó 384 pocillos de placas de ensayo de baja fluorescencia con 100 ó 50 \mul de medio DMEM. Se añadieron el Dox y los agentes a las concentraciones que se describen más adelante. Después de 48 horas de tratamiento, el medio de cada pocillo fue sustituido por PBS. La intensidad de GFP fue medida directamente a la excitación de 485 nm y emisión de 525 nm con un lector de placas de múltiples pocillos por fluorescencia (CytoFluor II, PerSeptive Biosystems o Wallac Victor V Stacker, Perkin Elmer).

\beta-lactamasa. Para detectar la actividad de la \beta-lactamasa segregada se cultivaron células en placas de 96 ó 384 pocillos en 100 ó 50 \mul de medio DMEM sin rojo fenol. Las células fueron inducidas con Dox a una concentración final de 1 \mug/ml durante 12-24 horas para expresión de la proteína indicadora. 50 \mul o 100 \mul de solución de reacción conteniendo fosfato 100 mM, pH 7,0, 10 \muM de nitrocefina, 0,5 \muM de ácido oleico, se añadió a cada pocillo. La reacción fue llevada a cabo a 37ºC durante un tiempo de 30-60 minutos. En algunos experimentos se añadió ácido clavulánico, un inhibidor para \beta-lactamasa, a una concentración de 25 \muM. Se midió la actividad de \beta-lactamasa como incremento de absorbancia a 488 nm.

\beta-galactosidasa. Igual que en el ensayo de actividad de \beta-lactamasa se cultivaron células en 100 ó 50 \mul de medio DMEM sin rojo fenol en placas de 96 ó 384 pocillos y el substrato. Después de lisado de las células con tampón de lisado, se añadió rojo clorofenol \beta-D-galactofaranósido (CPRG) para \beta-galactosidasa en los lisados de las células a una concentración final de 100 \mug/ml con Dox y agentes durante 24-36 horas. La actividad del enzima fue medida como incremento de absorbancia a 570 nm.

Ruptura de TGFR (RI) e interacción de FKBP12 por FK506

Una de las bien caracterizadas interacciones proteína-proteína descubiertas por el sistema doble híbrido directo de levadura es la interacción del receptor de tipo I del factor de crecimiento transformante (TGFR) (RI) con la inmunofilina FKPB12 (Wang y otros 1994. Science 265: 674-676). El FKBP12 es un objetivo del macrólido FK506. Se descubrió que el FK506 competía con el TGFR (RI) para unión con FKBP12, y por lo tanto interfería con la interacción entre el TGFR (RI) y FKPB12 (Wang y otros 1994. Science 265: 674-676). El sistema doble híbrido inverso para mamíferos de la presente invención fue comprobado con este par de interacción proteína-proteína para evaluar si el efecto de FK506 en la ruptura de la interacción podía ser detectado. A estos efectos, el dominio citoplasmático del TGFR (RI) fue fusionado con el dominio de activación transcripcional (AD) de VP16 y FKBP12 fue fusionado con el dominio de unión de Gal4 ADN (BD).

Una línea celular estable que tiene el constructo TetR-KRAB, el constructo indicador GFP, y el constructo pCMV-tetOP-AD-RI-IRES-BD-FKBP12, fue seleccionada para evaluar el efecto de la molécula medicamentosa FK506 sobre la interacción entre TGFR (RI) y FKPB12. La intensidad de la expresión de GFP fue supervisada durante 48 horas de tratamiento de las células con el inductor Dox y el agente FK506.

La figura 2 muestra que en ausencia de Dox, la expresión de GFP en células de control (tratadas con DMSO) era casi indetectable. La adición de Dox indujo la expresión de las proteínas interactivas y activó la expresión del gen indicador GFP. No obstante, cuando se añadió el medicamento FK506 conjuntamente con Dox, se suprimió de modo casi completo la expresión de GFP. El inhibidor de quinasa AG1478 (Levitzki & Gazit. 1995. Science 267: 1782-1788), un compuesto no relacionado que no afecta la interacción de TGFR (RI) y FKPB12 no ejerció efecto sobre la expresión de GFP inducida por Dox. En la obtención de los resultados mostrados en la figura 2, las células que expresan de manera estable el constructo supresor TetR-KRAB, el constructo indicador GFP, y el constructo pCMV-tetOP-AD-RI-IRES-BD-FKBP12, fueron tratadas con 1 \mug/ml de Dox, 100 nM de FK506, y 2,5 \muM de AD1478 durante 48 horas. La expresión del gen indicador GFP fue evaluada siguiendo el tratamiento. Los datos representan los promedios y desviación estándar de tres experimentos independientes.

Las figuras 4a-4d muestran la evaluación visual de la expresión de GFP cuando el constructo pCMV-tetOP-AD-RI-IRES-BD-FKBP12 fue expresado de manera transitoria en una línea celular estable que contiene el constructo supresor TetR-KRAB y el constructo indicador GFP. En la obtención de los resultados mostrados en las figuras 4a-4d, las células que fueron transfectadas de manera estable con el constructo TetR-KRAB y el constructo indicador GFP fueron transfectadas de forma transitoria con el constructo pCMV-tetOP-AD-RI-IRES-BD-FKBP12. Después de 12 horas después de la transfección, el Dox inductor y los medicamentos FK506 y AG1478 fueron añadidos al cultivo. Se tomaron micrografías de las células mostrando la expresión de GFP 48 horas después del tratamiento de las células. La concentración de AG1478 utilizada fue de 2,5 \muM y la de FK506 fue de 100 nM. Se observaron resultados similares en células seleccionadas de manera estable para el constructo supresor TetR-KRAB, el constructo indicador GFP, y el constructo pCMV-tetOP-AR-RI-IRES-BD-FKBP12.

Estos datos demuestran que la molécula medicamentosa FK506 efectúa de manera eficaz la rotura de la interacción de FKBP12 con el receptor RI y que dicha rotura específica de las proteínas interaccionantes por el medicamento se detectaba de manera clara al controlar la expresión de GFP en las células vivas. La línea celular estable que expresa el par de proteínas interaccionantes RI y FKBP12 se podía utilizar para el rastreo de otros medicamentos inmunosupresores candidatos.

Rotura de la interacción de EGFR y p85 por el inhibidor de quinasa AG1478

La utilidad de la presente invención para detectar moléculas terapéuticas potenciales quedó demostrada adicionalmente con otro par de proteínas interactivas, el receptor de factor de crecimiento epidérmico (EGFR) y la subunidad p85 de fosfatidilinositol 3-quinasa. Es conocido que el dominio citoplásmico de la familia EGFR puede ser autofosforilado sobre residuos de tirosina cuando se sobreexpresa en el núcleo (Xie & Hung. 1994. Biochem. Biophys. Res. Commun. 203: 1589-1599). La familia EGFR autofosforilada recluta proteínas señalizadoras a través de la interacción entre los residuos de tirosina fosforilada y los dominios Src homólogos 2(SH2) de las proteínas señalizadoras. La subunidad p85 es una de las moléculas señalizadoras que se unen al EGFR (Hu y otros 1992. Mol. Cell. Biol. 12, 981-900). El AG1478 es un potente inhibidor para la quinasa del EGFR (Levitzki & Gazit. 1995. Science 267: 1782-1788). Los inventores razonaron que la inhibición de la actividad de EGFR quinasa con AG1478 suprimiría la autofosforilación de tirosina del receptor EGFR, con el resultado de la eliminación de la interacción entre p85 y EGFR. Por lo tanto, los inventores examinaron si la actividad inhibidora de AG1478 podía ser detectada por el presente sistema doble híbrido inverso a través de la rotura de la interacción de EGFR y p85. Tal como se ha descrito anteriormente, el EGFR fue fusionado en armazón con el dominio de unión Gal4 ADN y p85 fue fusionado en armazón con el dominio de activación de VP16 en armazón, respectivamente. Se seleccionó con antibióticos apropiados una línea celular estable que contenía el constructo supresor TetR-KRAB, el constructo indicador GFP, y el constructo pCMV-tetOP-AD-p85-IRES-BD-EGFR. La intensidad de la expresión de GFP fue controlada siguiendo un tratamiento de 48 horas de las células con el inductor Dox y los medicamentos FK506 o AG1478.

La figura 3 muestra que la expresión de GFP fue insignificante en células de control (tratadas con DMSO). Dox indujo un elevado nivel de expresión de GFP que no quedó afectado por FK506, un medicamento no relacionado que no interfiere con la interacción con EGFR y p85. No obstante, la adición del AG1478 inhibidor de EGFR quinasa al cultivo antagonizó de modo casi completo la activación inducida por Dox del gen indicador GFP, indicando que el inhibidor producía la rotura de la interacción entre EGFR y p85. En la obtención de los resultados mostrados en la figura 3, las células que contienen de manera estable los constructos TetR-KRAB, GFP, y pCMV-tetOP-AD-p85-IRES-BD-EGFR fueron tratadas con 1 \mug/ml de Dox, 100 nM de FK506, y 2,5 \muM de AD1478 durante 48 horas. La expresión de GFP fue evaluada siguiendo el tratamiento. Los datos representan el promedio y desviación estándar de tres experimentos independientes.

Las figuras 4e-4h muestran la evaluación visual de la expresión de GFP. Esto fue realizado por transfección transitoria de la línea celular estable que contenía los constructos TetR-KRAB y GFP con el constructo pCMV-tetOP-AD-p85-IRES-BD-EGFR. Se obtuvieron resultados similares con células transfectadas de manera estable con el constructo supresor TetR-KRAB, el constructo indicador GFP y pCMV-tetOP-AD-p85-IRES-BD-EGFR. Estos resultados sugieren que el sistema doble híbrido inverso de la presente invención puede ser utilizado no solamente para el rastreo de moléculas que directamente interfieren con interacciones específicas en proteínas, sino también para rastrear moléculas que son inhibidores de enzimas siempre que la interacción de la enzima con su proteína asociada dependa de su actividad enzimática que se puede inhibir por el inhibidor. En la obtención de los resultados mostrados en las figuras 4e-4h, células que habían sido transfectadas de manera estable con los constructos TetR-KRAB y GFP fueron transfectadas adicionalmente de modo transitorio con el constructo pCMV-tetOP-AD-p85-IRES-BD-EGFR. Después de 12 horas después de la transfección, el inductor Dox y los medicamentos FK506 o AG1478 fueron añadidos al cultivo. Se tomaron micrografías de las células que muestran la expresión de GFP 48 horas después del tratamiento de las células. La concentración de AG1478 utilizada fue de 2,5 \muM y la de FK506 fue de 100 nM.

El ejemplo descrito anteriormente demuestra que el presente sistema doble híbrido inverso para mamíferos proporciona también una herramienta conveniente y potente para el rastreo basado en células de inhibidores candidatos para una serie de enzimas tales como proteasas, fosfatasas y quinasas. En particular, el sistema proporciona una herramienta conveniente y potente para el rastreo de basado en células de inhibidores candidatos para ciertas quinasas relacionadas con enfermedades tales como EGFR, PDGFR, Her2, VEGFR, JAKs, Met, FGFR, IGFR, receptor de insulina, JAKs, ZAP70, v-Abl, Lck, Lyn y otras quinasas parecidas a Src. La potencia y selectividad del presente sistema quedaron demostrados también en el rastreo primario de inhibidores para las quinasas de EGFR y del receptor Her2.

Utilización de \beta-lactamasa como indicador en la presente invención

Si bien GFP es un indicador conveniente para la observación directa de efectos de medicamentos en interacciones proteína-proteína para múltiples aplicaciones de placas con múltiples pocillos, no es un indicador sensible dado que la falta de amplificación enzimática requiere su alto nivel de expresión para detección (10^{5} a 10^{6} moléculas por célula) (Zlokarnik y otros 1998. Science 279: 84-88). Por la misma razón, la medición de GFP no puede ser llevada a cabo habitualmente hasta 48 horas después de la inducción Dox. La utilización de un gen indicador alternativo, \beta-lactamasa, para el presente sistema doble híbrido inverso de la invención se da a conocer asimismo. En la actualidad, se dispone tanto de sustratos colorimétricos como de fluorescencia no tóxicos para su utilización en ensayos de \beta-lactamasa. Dado que la sensibilidad del indicador de \beta-lactamasa está determinada principalmente por el tiempo de incubación con su sustrato, el ensayo basado en \beta-lactamasa es muy sensible. Con un sustrato fluorescente, la expresión de \beta-lactamasa se puede detectar a niveles reducidos del orden de 100 moléculas por célula (Zlokarnik y otros. 1998. Science 279:84-88). La actividad de \beta-lactamasa se puede determinar de manera precisa añadiendo su sustrato directamente al cultivo y midiendo la consecuencia de la reacción tal como cambio de color o gran desplazamiento de la longitud de onda de emisión de fluorescencia.

La figura 5 muestra actividad \beta-lactamasa en el medio después de 12 horas de inducción de Dox. La actividad de \beta-lactamasa en una incubación de 30 minutos mostró un efecto dependiente de la dosis de AG1478 en la ruptura de la interacción entre EGFR y p85. En la obtención de los resultados mostrados en la figura 5, se cultivaron células que expresaban de manera estable el constructo TetR-KRAB, el constructo GFP-\beta-lactamasa, y el constructo AD-p85-IRES-BD-EGFR en 100 ó 50 \mul de DMEM sin Rojo Fenol y tratados con Dox y el inhibidor AG1478 a las concentraciones indicadas durante 12 horas. Se añadió a cada ensayo el sustrato nitrocefina, en 100 ó 50 \mul del tampón de la reacción. La reacción fue llevada a cabo durante 30 minutos a 22ºC. La actividad de la \beta-lactamasa segregada en el medio fue medida directamente por absorbencia a 488 nm en un lector de placas con pocillos múltiples.

Se obtuvieron resultados similares utilizando \beta-galactosidasa como indicador (no se muestran datos). Para el rastreo de alto rendimiento de medicamentos utilizando la presente invención, dos secuencias codificantes de proteína indicadora comprendiendo GFP y genes \beta-lactamasa o GFP y genes Lac Z se construyeron en el mismo plásmido utilizando una secuencia IRES para detección alternativa de los indicadores.

Se pueden obtener resultados similares utilizando una combinación de los constructos pCMV-tetOP-AD-RI y pCMV-TetOP-BD-FKBP12 en vez de pCMV-tetOP-AD-IRES-BD-FKBP12.

Claims (32)

1. Sistema doble híbrido inverso de mamífero para identificar un cambio en la interacción proteína-proteína comprendiendo:

un constructo supresor que comprende un promotor constitutivo enlazado operativamente a una secuencia codificante de proteína represora;

un constructo codificante de proteína de fusión interactiva que comprende un promotor enlazado operativamente a un operador represible, que es represible por una proteína represora codificada por dicha secuencia codificante de proteína represora, una primera secuencia codificante de proteína interactiva fusionada en armazón con una secuencia codificante de proteína de dominio de activación transcripcional y una segunda secuencia codificante de proteína interactiva fusionada en armazón con una secuencia codificante de proteína de dominio de unión a ADN; y,

un constructo indicador que comprende un elemento de unión a ADN que se puede unir a dicha proteína de dominio de unión a ADN enlazada operativamente a un promotor mínimo y una secuencia codificante indicadora.

2. Sistema doble híbrido inverso de mamíferos, según la reivindicación 1, en el que dicho constructo codificante de proteína de fusión interactiva comprende:

un primer constructo codificante de proteína de fusión de dominio de proteína interactiva-activación transcripcional que comprende un promotor enlazado operativamente a un operador represible, que es represible por una proteína represora codificada por dicha secuencia de codificación de proteína represora y una primera secuencia codificante de proteína interactiva fusionada en armazón con una secuencia de codificación de proteína de dominio de activación transcripcional; y,

un segundo constructo de gen de proteína de fusión de dominio de proteína interactiva-unión a ADN que comprende un promotor enlazado operativamente a un operador represible, que es represible por una proteína represora codificada por dicha secuencia de codificación de proteína represora, una segunda secuencia codificante de proteína interactiva fusionada en armazón con una secuencia codificante de proteína de dominio de unión a ADN.

3. Sistema doble híbrido inverso de mamíferos, según la reivindicación 1, que comprende adicionalmente como mínimo una secuencia de lugar de entrada de ribosoma interno (IRES).

4. Sistema doble híbrido inverso de mamíferos, según la reivindicación 1, en el que dicha primera secuencia codificante de proteína interactiva fusionada en armazón con una secuencia codificante de proteína de dominio de activación transcripcional está enlazada operativamente a dicha segunda secuencia codificante de proteína interactiva fusionada en armazón con una secuencia codificante de proteína de dominio de unión a ADN a través de una secuencia de lugar de entrada de ribosoma interno (IRES).

5. Sistema doble híbrido inverso de mamíferos, según la reivindicación 1, en el que dicho constructo indicador comprende adicionalmente una segunda secuencia codificante indicadora enlazada operativamente a dicha secuencia codificante indicadora.

6. Sistema doble híbrido inverso de mamíferos, según la reivindicación 5, en el que dicha primera secuencia codificante indicadora está enlazada operativamente a dicha segunda secuencia codificante indicadora a través de una secuencia de lugar de entrada de ribosoma interno (IRES).

7. Sistema doble híbrido inverso de mamíferos, según la reivindicación 1, en el que en dicho constructo supresor dicho promotor constitutivo es seleccionado de un grupo que consiste en promotores de citomegalovirus humano (CMV), SV40, virus sincitial respiratorio (RSV), EF1, y genes de timina kinasa (TK).

8. Sistema doble híbrido inverso de mamíferos, según la reivindicación 1, en el que en dicho constructo supresor dicha secuencia codificadora de proteínas supresora codifica para una proteína seleccionada entre el grupo que consiste en represor Lac, represor \lambda, represor Tet, y represor híbrido-Tet (TetR).

9. Sistema doble híbrido inverso de mamíferos, según la reivindicación 8, en el que dicho TetR híbrido tiene la proteína TetR enlazada con el dominio KRAB del supresor de transcripción humana Kox1 por una secuencia de localización nuclear (NLS).

10. Sistema doble híbrido inverso de mamíferos, según la reivindicación 1, en el que dicho constructo supresor comprende adicionalmente un marcador selectivo de medicamentos que proporciona resistencia a un medicamento.

11. Sistema doble híbrido inverso de mamíferos, según la reivindicación 1, en el que en dicho constructo codificante de proteína de fusión interactiva, dicho promotor y operador represible son seleccionados del grupo que consiste en citomegalovirus humano de núcleo (CMV), SV40, virus sincitial respiratorio (RSV), EF1 y promotor de timina kinasa (TK) enlazado con operador de tetraciclina.

12. Sistema doble híbrido inverso de mamíferos, según la reivindicación 1, en el que dicho constructo de codificación de proteína de fusión interactiva codifica para una proteína seleccionada del grupo que consiste en receptores, adaptadores, efectores y enzimas.

13. Sistema doble híbrido inverso de mamíferos, según la reivindicación 12, en el que dicha primera secuencia codificante de proteína interactiva codifica para una molécula señalizadora relacionada con una enfermedad.

14. Sistema doble híbrido inverso de mamíferos, según la reivindicación 1, en el que dicha secuencia codificante de dominio de activación transcripcional es seleccionada del grupo que consiste en secuencias codificantes GAL4, B42, VP16 y NF-kB p65.

15. Sistema doble híbrido inverso de mamíferos, según la reivindicación 1, en el que dicha segunda secuencia codificante de proteína interactiva codifica para una proteína seleccionada del grupo que consiste en una proteasa, una fosfatasa, una kinasa, un receptor y una enzima.

16. Sistema doble híbrido inverso de mamíferos, según la reivindicación 15, en el que dicha kinasa es una kinasa relacionada con una enfermedad.

17. Sistema doble híbrido inverso de mamíferos, según la reivindicación 16, en el que dicha kinasa relacionada con una enfermedad es seleccionada entre el grupo que consiste en EGFR, PDGFR, Her2, VEGFR, Met, FGFR, IGFR, receptor de insulina, JAKs, PKA, PKC, MAP kinasa, ZAP70, v-Abl, y Lck, Lyn, u otra kinasa similar a Src.

18. Sistema doble híbrido inverso de mamíferos, según la reivindicación 1, en el que la secuencia codificadora del dominio de unión a ADN es seleccionada entre el grupo que consiste en el dominio de unión Gal4 ADN, represor Lac, represor Tet, represor lambda, secuencia de unión Lax A ADN, NF-kB p65 y p53.

19. Sistema doble híbrido inverso de mamíferos, según la reivindicación 3 ó 5, en el que dicha secuencia de lugar de entrada de ribosoma interno (IRES) es seleccionada del grupo que consiste en una secuencia IRES sintética y un virus de encefalomiocarditis (EMCV)IRES.

20. Sistema doble híbrido inverso de mamíferos, según la reivindicación 1, en el que en dicho constructo indicador dicho elemento de unión a ADN seleccionado entre el grupo que consiste en el elemento de unión de Gal4, operador Lac, operador Tet, operador lambda, elemento de unión Lax A y lugares de unión p53.

21. Sistema doble híbrido inverso de mamíferos, según cualquiera de las reivindicaciones 1, 4 y 5, en el que en dicho constructo indicador dicho promotor es seleccionado entre el grupo que consiste en un promotor mínimo de promotor de citomegalovirus humano (CMV), promotor previo SV40, promotor de adenoviurs E1b, promotor de virus sincitial respiratorio (RSV), promotor EF1 y promotor de timina kinasa (TK).

22. Sistema doble híbrido inverso de mamíferos, según cualquiera de las reivindicaciones 1, 4, y 5, en el que dicha secuencia codificante indicadora codifica para una proteína seleccionada entre el grupo que consiste en proteína fluorescente verde (GFP) o derivado con actividad GFP, una luciferasa, una \beta-lactamasa, una \beta-galactosidasa, una fosfatasa alcalina y cloranfenicol acetil transferasa.

23. Plásmido que comprende el sistema doble híbrido inverso de mamífero según la reivindicación 1.

24. Equipo de dos plásmidos que comprende el sistema doble híbrido inverso de mamífero según la reivindicación 1, en el que dicho constructo supresor y dicho constructo indicador están dispuestos en un primer plásmido y dichos primer constructo codificante de proteína de fusión de dominio de proteína interactiva-activación transcripcional y dicho segundo constructo codificante de proteína de fusión de dominio de proteína interactiva-unión a ADN quedan dispuestos conjuntamente en un segundo plásmido.

25. Célula de mamífero que comprende un sistema doble híbrido inverso de mamífero según la reivindicación 1.

26. Célula de mamífero, según la reivindicación 25, en la que dicho sistema doble híbrido inverso de mamífero está integrado en un cromosoma de dicha célula.

27. Método para la identificación de un cambio en la interacción proteína-proteína que comprende:

someter a un sistema doble híbrido inverso de mamífero, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22, en una célula a un inductor y un agente de prueba de la ruptura de la interacción proteína-proteína;

y ensayar dicha célula para la expresión o no expresión de dicha secuencia codificante indicadora, siendo indicativa la no expresión de dicha secuencia codificante indicadora de la capacidad de ruptura de dicho agente de prueba de ruptura de la interacción proteína-proteína

28. Método, según la reivindicación 27, en el que dicho agente de ruptura es un agente de ruptura indirecto sometido a prueba en cuanto a capacidad de inhibir la actividad de una enzima relacionada con una enfermedad.

29. Método para la identificación de un cambio en la interacción proteína-proteína que comprende:

(a) introducir de manera estable un constructo supresor y un constructo indicador a una célula;

(b)(i) introducir de manera estable un primer constructo codificante de proteína de fusión de dominio de activación de proteína interactiva-activación transcripcional y un segundo constructo codificante de proteína de fusión de dominio de proteína interactiva-unión a ADN en dicha célula; o bien

(b)(ii) introducir transitoriamente un primer constructo codificante de proteína de fusión de dominio de proteína interactiva-activación transcripcional y un segundo constructo codificante de proteína de fusión de domino de proteína interactiva-unión a ADN en dicha célula;

(c) someter una célula resultante de las etapas (b)(i) ó (b)(ii) a un inductor y un agente de prueba de la ruptura de la interacción proteína-proteína;

(d) ensayar dicha célula a la no expresión y expresión de dicha secuencia codificante indicadora; y,

(e) identificar dicho agente de rotura de la interacción proteína-proteína basado en la no expresión de dicha secuencia codificante indicadora.

30. Método para identificar un cambio en la interacción proteína-proteína, según la reivindicación 28, en el que dicha célula es una célula de mamífero.

31. Equipo para identificar un cambio en la interacción proteína-proteína que comprende:

una o varias partes alícuotas de un constructo supresor, un primer constructo codificante de proteína de fusión de dominio de proteína interactiva-activación transcripcional, un segundo constructo codificante de proteína de fusión de domino de proteína interactiva-unión a ADN, y un constructo indicador en uno o varios plásmidos; y,

una o varias partes alícuotas de un reactivo, célula y aparato necesarios para conducir un método para identificar un cambio en la interacción proteína-proteína.

32. Equipo para identificar un cambio en la interacción proteína-proteína que comprende:

una o varias partes alícuotas de uno o varios constructos en uno o varios plásmidos, tal como se define en la reivindicación 31;

una o varias partes alícuotas de una célula que contiene uno o varios constructos, tal como se define en la reivindicación 31; y,

una o varias partes alícuotas de un reactivo y aparato necesarios para llevar a cabo un método para identificar un cambio en la interacción proteína-proteína.