DE60104019T2

DE60104019T2 - Zusammensetzungen, Verfahren und Reagentiensätze zur Erkennung von Protein-Protein Wechselwirkung störenden Substanzen

Info

Publication number: DE60104019T2
Application number: DE60104019T
Authority: DE
Inventors: Hui-Fen Lasalle ZHAO; Shi-Hsiang Shen
Original assignee: National Research Council of Canada
Current assignee: National Research Council of Canada
Priority date: 2000-12-18
Filing date: 2001-12-13
Publication date: 2005-07-14
Anticipated expiration: 2021-12-14
Also published as: AU2002215754A1; DE60104019D1; US20040067483A1; WO2002050259A2; CA2431898A1; ATE269899T1; WO2002050259A3; EP1343882B1; EP1343882A2; ES2223736T3

Description

UMFELD DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft Zusammensetzungen, Verfahren und Kits zum Identifizieren von Substanzen, die fähig sind Protein-Protein-Wechselwirkung in Säugetierzellen zu stören.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Protein-Protein-Wechselwirkungen finden sich in den meisten biologischen Vorgängen und zellulären Funktionen, wie der Bildung von zellulären makromolekularen Strukturen, Rezeptor- und Enzymkomplexen und in der Regulation von Signaltransduktionswegen. Die Aufklärung von Protein-Protein-Wechselwirkungen in der Zelle bildet auch einen wichtigen Ansatz in der funktionellen Genomik. Die stärkste Technologie für den Nachweis von Protein-Protein-Wechselwirkungen ist das Hefe-Zweihybridsystem, das zuerst von Fields und Song (Nature 340: 245–246. 1989) beschrieben wurde.
Protein-Protein-Wechselwirkungen können durch manche Moleküle, wie Peptide oder Arzneimittel gestört werden. Zur Zeit wird die Selektion dieser, für eine bestimmte Protein-Protein-Wechselwirkung störenden Moleküle, unter Verwendung des Hefe reversen Zweihybridsystems (Leanna & Hannink. 1996. Nucleic Acids Res. 24, 3341–3347; Vital et al. 1996. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93, 10315–10320; Shih, et al. 1996. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93, 13896–13901) oder eines bakteriellen reversen Zweihybridsystems (Zhang et al. 2000. Nature Biotech. 18, 71–74; Park & Raines. 2000. Nature Biotech. 18, 847–851) durchgeführt. Obwohl die Hefe und bakteriellen reversen Zweihybridsysteme für einige genetische Selektionen nützlich sind, sind sie keine idealen Systeme für das Screenen von therapeutischen Molekülen wie Arzneimitteln, weil die Permeabilität dieser therapeutischen Moleküle in Hefe oder in Bakterien sehr verschieden von jener in Säugetierzellen aufgrund von Unterschieden in der zellulären Kompartimentierung in Hefe-, Bakterien- und Säugetierzellen, ist. Tatsächlich muss das Potenzial von Arzneimittelkandidaten in Säugetierzellen bewertet werden, in denen diese Arz neimittel schließlich verwendet werden. Darüber hinaus sind verschiedene posttranslationelle Modifikationen, die für bestimmte Protein-Protein-Wechselwirkungen benötigt werden, sowohl in Hefe als auch in Bakterien limitiert. In einem Säugetiersystem wird post-translationelle Modifikation in einer für bestimmte Protein-Protein-Wechselwirkungen natürlichen Weise auftreten. Gegenwärtig gibt es einige Berichte über Säugetier-Zweihybridsysteme für Protein-Protein-Wechselwirkungen (Luo et al. 2000. US Patent 6,114,111 Shioda et al. 2000. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 5220–5224).
Jedoch ist keines dieser Säugetiersysteme für high throughput reverses Zweihybrid Screening von störenden Substanzen, wie therapeutischen Molekülen, geeignet, weil in diesen Säugetiersystemen die Expression der zwei interaktiven Proteine nicht reguliert war. Um high throughput Screening von potenziellen therapeutischen Molekülen, die Protein-Protein-Wechselwirkungen in Säugetierzellen stören, durchzuführen, ist es wünschenswert, dass therapeutische Moleküle in das Säugetiersystem eingeführt werden, bevor die Synthese der zwei interaktiven Proteine in entweder stabil oder transient transfizierten Zellen induziert wird. In den Systemen des Standes der Technik kann die konstitutive Expression der zwei interaktiven Proteine unverzüglich das Reportergen aktivieren. Demzufolge kann die inhibitorische Wirkung beispielsweise eines Arzneimittels auf das Blockieren der Protein-Wechselwirkung nicht exakt durch das repressive Ausmaß des Reportergens bewertet werden, weil das Reportergen bereits vor dem Hinzufügen des Arzneimittels in das System vollständig exprimiert wurde. Theoretisch können die Konstrukte zum Exprimieren der zwei interaktiven Proteine transient mit den Arzneimitteln in jeder Vertiefung zum Screenen transient in die Zellen transfiziert werden. Jedoch ist das Durchführen einer solchen transienten Transfektion der Zellen mit dem Konstrukt in jeder Vertiefung, die das Arzneimittel enthält, für high throughput Arzneimittelscreening praktisch unmöglich, weil ein Mensch nur in der Lage ist, Konstrukte in einige wenige 96-Vertiefungsplatten pro Tag zu transfizieren.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Folglich wurde ein reverses Säugetier-Zweihybridsystem zum Screenen von Substanzen, die Protein-Protein-Wechselwirkung dissoziieren, entwickelt. Das System ist besonders nützlich für high throughput Screenen von kleinen Molekülen, die Protein-Protein-Wechselwirkungen verhindern. Die zwei interaktiven Proteine sind entweder mit einer DNA-Bindungsdomäne oder mit einer transkriptionellen Aktivierungsdomäne eines Transkriptionsfaktors fusioniert. Die Expression der zwei interaktiven Fusionsproteine wird durch einen Suppressor reguliert, der konstitutiv in den Zellen exprimiert wird. Bei Anwesenheit eines Induktors wird die Repression des Promotors, der die Expression der zwei interaktiven Fusionsproteine steuert, gelöst, was zu der Expression der zwei interaktiven Fusionsproteine führt. Sobald die zwei interaktiven Fusionsproteine gebildet sind, bindet die DNA-Bindungsdomäne eines Fusionsproteins an ein DNA-Bindungselement in einem Promotor und bringt die Transkriptionsaktivierungsdomäne des anderen interaktiven Fusionsproteins über Protein-Protein-Wechselwirkung an den Promotor und aktiviert dabei die Transkription des Reportergens. Bei Anwesenheit eines Induktors und einer Substanz, die Protein-Protein-Wechselwirkung dissoziiert, können die zwei interaktiven Proteine nicht wechselwirken. Daher wird die Transkription des Reportergens nicht aktiviert. Als ein Ergebnis wird die Nichtexpression des Reportergens als ein Indikator zur Identifizierung einer Substanz, wie eines kleinen therapeutischen Arzneimittelmoleküls, das fähig ist, Protein-Protein-Wechselwirkung zu dissoziieren, verwendet.
Sowohl das Kodierkonstrukt für das Reporterprotein als auch das Suppressorkonstrukt sind typischerweise in Chromosomen der Zellen integriert. Das Konstrukt, das für die zwei interaktiven Fusionsproteine kodiert, ist ebenfalls vorzugsweise stabil in Zellen transfiziert. Für die high throughput Analyse können die Konstrukte der interaktiven Fusionsproteine auch transient in einen Batch von vielen Millionen Zellen transfiziert werden, die bereits stabil mit dem Reporterprotein-Kodierkonstrukt und dem Suppressor-Kodierkonstrukt transfiziert wurden. Diese Zellen können anschließend in viele Vertiefungen von Platten für high throughput aufgeteilt werden, die Testsubstanz und einen Induktor zur Identifizierung einer Substanz, die Protein-Protein-Wechselwirkung dissoziiert und/oder einer Substanz, die Protein-Protein-Wechselwirkung nicht dissoziiert, enthalten. Weil das Suppressorkonstrukt über die konstitutive Expression eines Hybrid-Repressorproteins die Expression der interaktiven Fusionsproteine streng kontrolliert, führt die transiente Transfektion der Zellen mit den interaktiven Fusionsproteinkonstrukten nicht zur Expression der interaktiven Fusionsproteine und der anschließenden Aktivierung des Reportergens, bis ein Induktor hinzugefügt wird. Darüber hinaus wird das Reportergen nur in den Situationen exprimiert, in denen eine Testsubstanz nicht die Störung von Protein-Protein-Wechselwirkung bewirken kann.
Die vorliegende Erfindung liefert ein reverses Säugetier-Zweihybridsystem zur Identifizierung einer Veränderung in Protein-Protein-Wechselwirkungen mit: einem Suppressorkonstrukt, einen operativ an eine Repressorprotein-Kodiersequenz gebundenen konstitutiven Promotor umfassend; einem Kodierkonstrukt für ein interaktives Fusionsprotein, umfassend einen operativ an einen repressiblen Operator gebundenen Promotor, der durch ein Repressorprotein unterdrückt werden kann, das durch die Repressorprotein-Kodiersequenz kodiert wird, eine erste Kodiersequenz für ein interaktives Protein, die in Frame mit einer Proteinkodiersequenz für eine transkriptionelle Aktivierungsdomäne fusioniert ist, und eine zweite Kodiersequenz für ein interaktives Protein, die in Frame mit einer Proteinkodiersequenz für eine DNA-Bindungsdomäne fusioniert ist; und einem Reporterkonstrukt mit einem operativ an einen Minimalpromotor gebundenen, DNA bindenden Element, welches das DNA-Bindungsdomänenprotein binden kann, und einer Reporterkodiersequenz.
In einer bevorzugten Ausführungsform kann das Kodierkonstrukt für das interaktive Fusionsprotein selbst hergestellt sein aus oder abgeleitet sein von einem ersten Kodierkonstrukt für ein Fusionsprotein aus einem interaktiven Protein und einer transkriptionellen Aktivierungsdomäne mit einem operativ an einen repressiblen Operator gebundenen Promotor, der durch ein Repressorprotein unterdrückt werden kann, das durch die Repressorprotein-Kodiersequenz kodiert wird, und einer ersten Kodiersequenz für ein interaktives Protein, die in Frame mit einer Proteinkodiersequenz für eine transkriptionelle Aktivierungsdomäne fusioniert ist; und einem zweiten Kodierkonstrukt (wegen der Einheitlichkeit verwenden wir "Kodier-" anstelle von "Gen") für ein Fusionsprotein aus einem interaktiven Protein und einer transkriptionellen Aktivierungsdomäne mit einem operativ an einen repressiblen Operator gebundenen Promotor, der durch ein Repressorprotein unterdrückt werden kann, das durch die Repressorprotein-Kodiersequenz kodiert wird, und einer zweiten Kodiersequenz für ein interaktives Protein, die in Frame mit einer Proteinkodiersequenz für eine DNA-Bindungsdomäne fusioniert ist.
Vorzugsweise umfasst das reverse Säugetier-Zweihybridsystem zusätzlich wenigstens eine Sequenz einer internen Ribsomomen-Eintrittsstelle (IRES). In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die Kodiersequenz für das erste interaktive Protein, die in Frame mit einer Proteinkodiersequenz für eine transkriptionelle Aktivierungsdomäne fusioniert ist, operativ durch eine Sequenz einer internen Ribosomen-Eintrittsstelle (IRES) mit der Proteinkodiersequenz für das zweite interaktive Protein, die in Frame mit einer Proteinkodiersequenz für eine DNA-Bindungsdomäne fusioniert ist, verbunden. Die IRES kann typischerweise eine synthetische IRES-Sequenz oder eine IRES eines Encephalomyocarditisvirus sein.
Das Reporterkonstrukt kann zusätzlich eine zweite Reporterkodiersequenz enthalten, die operativ (vorzugsweise durch eine IRES) mit einer bereits anwesenden (ersten) Reportersequenz verbunden ist. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Promotor in dem Reporterkonstrukt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Minimalpromotor von humanem Cytomegalovirus-(CMV)-promotor, SV40 frühem Promotor, Adenovirus E1b-Promotor, respiratorischem Synzytialvirus-(RSV-)Promotor, EF1-Promotor und Thymidinkinase-(TK-)Promotor.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch Plasmide, die ein erfindungsgemäßes reverses Säugetier-Zweihybridsystem umfassen. In einer bevorzugten Ausfüh rungsform wird ein Satz aus zwei Plasmiden bereitgestellt, wobei das Suppressorkonstrukt und das Reporterkonstrukt auf einem ersten Plasmid zur Verfügung stehen und das erste Kodierkonstrukt für ein Fusionsprotein aus einem interaktiven Protein und einer transkriptionellen Aktivierungsdomäne sowie das zweite Kodierkonstrukt für ein Fusionsprotein aus einem interaktiven Protein und einer DNA-Bindungsdomäne zusammen auf einem zweiten Plasmid zur Verfügung stehen.
Die Erfindung umfasst weiterhin eine Säugetierzelle umfassend ein erfindungsgemäßes reverses Säugetier-Zweihybridsystem, das vorzugsweise in ein Chromosom der Zelle integriert ist.
Die Erfindung umfasst weiterhin ein Verfahren zur Identifizierung einer Veränderung in einer Protein-Protein-Wechselwirkung, das Aussetzen eines erfindungsgemäßen reversen Säugetier-Zweihybridsystems in einer Zelle gegenüber einem Induktor und einer zu prüfenden, Protein-Protein-Wechselwirkungen störenden Substanz; und Prüfen der Zelle auf die Expression oder Nichtexpression der Reporterkodiersequenz umfasst, wobei Nichtexpression der Reporterkodiersequenz eine Störfähigkeit der zu prüfenden, Protein-Protein-Wechselwirkungen störenden Substanz anzeigt.
In diesem Verfahren kann die störende Substanz eine indirekt störende Substanz sein, die auf ihre Fähigkeit geprüft wird, die Aktivität eines krankheitsbezogenen Enzyms (z. B. Krebs), wie einer Kinase, zu hemmen.
Alternativ dazu kann das oben beschriebene Verfahren umfassen (a) stabiles Einführen eines Suppressorkonstrukts und eines Reporterkonstrukts in eine Zelle; und (b)(i) stabiles Einführen eines ersten Kodierkonstrukts für ein Fusionsprotein aus einem interaktiven Protein und einer transkriptionellen Aktivierungsdomäne und einem zweiten Kodierkonstrukt für ein Fusionsprotein aus einem interaktiven Protein und einer DNA-Bindungsdomäne in eine Zelle; oder (b)(ii) transientes Einführen eines ersten Kodierkonstrukts für ein Fusionsprotein aus einem interaktiven Protein und einer transkriptionellen Aktivierungsdomäne und einem zweiten Kodierkonstrukt für ein Fusionsprotein aus einem interaktiven Protein und einer DNA-Bindungsdomäne in die Zelle; (c) Aussetzen einer aus Schritt (b)(i) oder (b)(ii) gewonnenen Zelle gegenüber einem Induktor und einer zu prüfenden, Protein-Protein-Wechselwirkungen störenden Substanz; (d) Prüfen der ausgesetzten Zelle auf die Nichtexpression oder Expression der Reporterkodiersequenz; und (e) Identifizieren der die Protein-Protein-Wechselwirkungen störenden Substanz auf der Basis der Nichtexpression der Reporterkodiersequenz.
In einem anderen Aspekt liefert die Erfindung einen Reagentiensatz bzw. Kit zur Identifizierung einer Veränderung in Protein-Protein-Wechselwirkungen mit: einem oder mehreren Aliquots eines Suppressorkonstrukts, einem ersten Kodierkonstrukt für Fusionsproteine aus interaktiven Proteinen und einer transkriptionellen Aktivierungsdomäne, einem zweiten Kodierkonstrukt für Fusionsproteine aus interaktiven Proteinen und einer DNA-Bindungsdomäne und einem Reporterkonstrukt auf einem oder mehreren Plasmiden; und einem oder mehreren Aliquots eines Reagens, einer Zelle und Gerätschaften, die benötigt werden, um ein Verfahren zur Identifizierung einer Veränderung in Protein-Protein-Wechselwirkungen auszuführen.
Der Kit kann eines oder mehrere Aliquots eines oder mehrerer Plasmide, wie definiert, eines oder mehrere Aliquots einer Zelle, enthaltend ein Konstrukt, wie definiert, und geeignete Reagentien und Gerätschaften, umfassen.
KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1A–1E zeigt einen Überblick über verschiedene verwendete Konstrukte und einbezogene Prinzipien beim Ausführen der vorliegenden Erfindung.
2 zeigt die Störung einer Protein-Protein-Wechselwirkung zwischen FKBP12 und dem transformierenden Wachstumsfaktor β (TGFβ) Rezeptor RI in 293A Zellen durch das Arzneimittelmolekül FK506.
3 zeigt die Störung einer Protein-Protein-Wechselwirkung zwischen epidermalem Wachstumsfaktorrezeptor (EGFR) und p85 in 293A Zellen durch das Arzneimittelmolekül AG1478.
4 zeigt die visuelle Angabe der Störung einer Protein-Protein-Wechselwirkung zwischen FKBP12 und dem TGFβ Rezeptor RI (4a–4d) und zwischen EGFR und p85 (4e–4h) in 293A Zellen durch das Arzneimittelmolekül FK506 und AG1478 durch Nichtexpression des GFP Reportergens.
5 zeigt die Verwendung von β-Lactamase als ein Reportergen in der vorliegenden Erfindung.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung liefert Zusammensetzungen, Verfahren und Kits betreffend ein reverses Säugetier-Zweihybridsystem, das besonders geeignet ist zur Identifizierung von Substanzen, welche die Fähigkeit besitzen, Protein-Protein-Wechselwirkungen in Säugetierzellen zu stören. In einer ersten Ausführungsform kann die Identifizierung von Substanzen, welche Protein-Protein-Wechselwirkungen stören, in der Art und Weise des high throughput durchgeführt werden. In einer anderen Ausführungsform können die störenden Substanzen kleine Moleküle, Peptide oder irgendwelche synthetisch/natürlich vorkommenden Moleküle mit therapeutischer Wirkung sein. Im Falle der indirekten Störung können diese Moleküle die Aktivität eines bestimmten Proteins, beispielsweise eines Enzyms, inhibieren. Diese Enzyme können Kinasen, vorzugsweise Kinasen, die mit einer Krankheit in Verbindung stehen, sein. Das Wort Störung impliziert auch Veränderung.
Das erfindungsgemäße reverse Säugetier-Zweihybridsystem besitzt typischerweise vier Bestandteile: ein Suppressorkodierkonstrukt, ein erstes Kodierkonstrukt für Fusionsproteine aus interaktiven Proteinen und einer transkriptionellen Aktivierungsdomäne, ein zweites Kodierkonstrukt für Fusionsproteine aus interaktiven Proteinen und einer DNA-Bindungsdomäne, und ein Kodierkonstrukt für ein Reporterprotein. Diese können in Hybridkonstrukten angeordnet werden, die zwei oder mehr der oben genannten Bestandteile aufweisen.
Das Suppressorkonstrukt umfasst typischerweise, in 5' nach 3' Richtung und operativ verknüpft, einen konstitutiven Promotor zur Regulation der Transkription einer Kodiersequenz unterhalb des Promotors, eine Sequenz, die für ein Hybridrepressorprotein kodiert, und einen konstitutiven Promotor, der eine Sequenz, die für einen selektiven Marker kodiert, wie einen Arzneimittel selektiven Marker, z. B. Neomycin, Hygromycin, Puromycin oder andere Arzneimittel selektive Marker, die in Säugetierzellen (siehe 1) verwendet werden, reguliert. Die Zelllinien, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, können von einem Säugetier, wie einer Maus, einer Ratte, einem Primaten oder einem Menschen stammen. Geeignete Zellen zum Durchführen von erfindungsgemäßen Protein-Protein-Wechselwirkungen können beispielsweise ausgewählt sein aus CHO, COS, NIH 3T3, HeLa und menschliche embryonale Nieren-293-Zellen.
Ein konstitutiver Promotor ist ein cis-regulatorisches Element, das fähig ist, die Expression einer Kodiersequenz unterhalb von sich selbst in einer kontinuierlichen Weise zu regulieren. Solche konstitutiven Promotoren sind im Stand der Technik bekannt und können beispielsweise ausgewählt werden aus menschlichem Cytomegalovirus (CMV), SV40, respiratorischem Synzytialvirus (RSV), EF1- und Thymidinkinase-(TK-)Promotoren. In einer unten beschriebenen Ausführungsform ist der konstitutive Promotor ein Promotor aus dem Immediate-Early-Genpromotor von menschlichem Cytomegalovirus (CMV).
Ein Hybridrepressorprotein, in der Abwesenheit eines Induktors, ist fähig, an einen Operator in einem Promotor zu binden und dabei die Expression einer Kodiersequenz unterhalb des Promotors zu unterdrücken. Solche Repressorproteine sind im Stand der Technik bekannt und können ausgewählt werden unter Lac, λ und Tet Repressoren von Escherichia coli. Das Tetracyclinrepressor-(TetR-)Protein kann an seinen Operator binden, der in einen Promotor eingeführt ist, der ober halb einer Kodiersequenz angeordnet ist, und es kann die Transkription der Kodiersequenz blockieren. In Säugetierzellen wurde jedoch gefunden, dass das TetR Protein nicht vollständig die transkriptionelle Aktivität des Promotors blockiert. Deshalb wird in einer unten beschriebenen Ausführungsform ein Hybrid-TetR Protein verwendet, das fähig ist, die Transkription einer Kodiersequenz unterhalb eines Promotors vollständig zu blockieren (Deutschle et al. 1995. Mol. Cell. Biol. 15, 1907–1914). Das Repressor TetR Protein, das in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, ist ein Hybridrepressor, in dem die TetR Kodiersequenz mit einer nukleären Lokalisationssequenz (NLS) verbunden ist, die ihrerseits mit der KRAB Domäne des menschlichen transkriptionellen Suppressor Kox1 Genes verbunden ist (Deutschle et al. 1995. Mol. Cell. Biol. 15, 1907–1914). Die Repression kann durch das Bereitstellen eines Induktors gelöst werden, der an das Repressor TetR Protein bindet, wodurch der Promotor für das Transkribieren der Kodiersequenz unterhalb des Promotors befreit wird. Solche Induktoren sind im Stand der Technik bekannt und können ausgewählt werden unter Lactose für den Lac Repressor und Tetracyclin für den Tetracyclin Repressor. In einer unten beschriebenen Ausführungsform wird Doxycyclin (Dox), ein Derivat von Tetracyclin, als der Induktor verwendet. Doxycyclin bindet an das Hybrid TetR Protein, wodurch die Bindung des Hybrid TetR Proteins an die Operatorsequenz verhindert wird, was zur Transkription der Kodiersequenz unterhalb des Promotors führt. In einer unten beschriebenen Ausführungsform ist die Kodiersequenz entweder ein erstes interaktives Protein, das an eine transkriptionelle Aktivierungsdomäne fusioniert ist oder ein zweites interaktives Protein, das an eine DNA-Bindungsdomäne fusioniert ist. In einer bevorzugten Ausführungsform kann die Kodiersequenz ein erstes interaktives Protein, das an eine Aktivierungsdomäne fusioniert ist und ein zweites interaktives Protein, das an eine DNA-Bindungsdomäne fusioniert ist, sein, die durch eine interne Ribosomen-Eintrittsstelle (IRES) Sequenz verbunden sind (Chappell et al., 2000, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 1536–1541). Diese synthetische IRES ist aktiver als die für gewöhnlich verwendete IRES des Encephalomyocarditisvirus (EMCV), und sie stellt deshalb geeignete Expressionsmengen der zwei interaktiven Proteine sicher, die durch einen gemeinsamen Promotor oberhalb der Kodiersequenzen für die interaktiven Proteine reguliert werden.
Das erste Kodierkonstrukt für ein Fusionsprotein aus einem interaktiven Protein und einer transkriptionellen Aktivierungsdomäne umfasst typischerweise in 5' nach 3' Richtung und operativ verknüpft, einen induzierbaren Promotor mit einem Operator, eine Kodiersequenz für ein erstes interaktives Protein, das in Frame mit einer Kodiersequenz einer transkriptionellen Aktivierungsdomäne (siehe 1) fusioniert ist, und eine IRES Sequenz, die mit einer Kodiersequenz für ein zweites interaktives Protein, das mit einer DNA-Bindungsdomäne fusioniert ist, verbunden ist. Die transkriptionelle Aktivierungsdomäne besitzt die Fähigkeit, die transkriptionelle Maschinerie für die Transkription eines Reportergens nach Wechselwirkung des zweiten interaktiven Proteins mit dem ersten interaktiven Protein, anzuziehen. Eine solche Wechselwirkung zwischen dem ersten interaktiven Protein und dem zweiten interaktiven Protein ist störbar durch gewisse Substanzen, die Protein-Protein-Wechselwirkungen stören, was zu der Nichtexpression des Reportergens führt.
Ein induzierbarer Promotor, in der Abwesenheit eines Induktors, ist normalerweise durch ein Repressorprotein reprimiert, wodurch es dem Promotor unmöglich ist, eine Kodiersequenz unterhalb von sich selbst zu transkribieren. Jedoch ist der induzierbare Promotor in der Anwesenheit eines Induktors in der Lage, eine Kodiersequenz unterhalb von sich selbst zu exprimieren. Solche induzierbaren Promotoren sind im Stand der Technik bekannt und können ausgewählt werden unter dem Lac, dem Lambda P(L), Tet und dem Tryptophan Operon von Escherichia coli in Verbindung mit einem Säugetier Core Promotor. In einer unten beschriebenen Ausführungsform ist der induzierbare Promotor ein Core CMV Promotor (das meiste, wenn nicht der gesamte Promotor mit Ausnahme der TATA Box), der mit einem Tetracyclin Operator (TOP) verbunden ist. Dieser Promotor wird normalerweise in der Anwesenheit des konstititutiv exprimierten TetR-NLS-KRAB Hybridrepressorproteins reprimiert, aber er ist in der Lage eine Kodiersequenz unterhalb von sich selbst in der Anwesenheit des Induktors Doxycyclin (DOX) zu exprimieren.
Ein erstes interaktives Protein ist das erste der zwei interaktiven Proteine, das in Frame mit einer Aktivierungsdomäne eines Transkriptionsfaktors fusioniert ist. Solche ersten interaktiven Proteine können beispielsweise ausgewählt sein aus irgendwelchen Partnern von wechselwirkenden Proteinen, die für Signaltransduktionen und zelluläre Vorgänge wichtig sind, wie Rezeptoren, Adaptoren, Effektoren und Enzyme, und sie können krankheitsbezogenes Signalmolekül sein. Mit Adaptor meinen wir ein Protein ohne katalytische oder transkriptionelle Aktivität, aber als ein Gerüst besitzt es Domänen, die an andere Proteine binden. Mit Effektor meinen wir ein Protein, das einen Signaltransduktionsweg vermittelt. Weiterhin können solche ersten interaktiven Proteine in der Zukunft identifiziert und mit der Aktivierungsdomäne eines Transkriptionsfaktors fusioniert werden. In den unten beschriebenen Ausführungsformen ist das erste interaktive Protein entweder ein transformierender Wachstumsfaktor Typ I Rezeptor (TGFβR) (RI) oder die p85 Untereinheit von Phosphatidylinositol-3-Kinase. Die Aktivierungsdomänen eines Transkriptionsfaktors sind ebenfalls im Stand der Technik bekannt und können ausgewählt werden unter GAL4, B42, VP16 und NF-kB p65. In den unten beschriebenen Ausführungsformen ist die Aktivierungsdomäne eines Transkriptionsfaktors ein VP16, das, mit der Hilfe der ersten und zweiten interaktiven Proteine, mit einem Minimalpromotor wechselwirkt, um die Transkription eines Reportergens zu aktivieren.
Ein zweites Kodierkonstrukt für ein Fusionsprotein aus einem interaktiven Protein und einer DNA-Bindungsdomäne umfasst typischerweise, in 5' nach 3' Richtung und operativ verbunden, einen induzierbaren Promotor mit einem oben beschriebenen Operator, eine Kodiersequenz für ein zweites interaktives Protein, die in Frame mit der Kodiersequenz einer DNA-Bindungsdomäne fusioniert ist. Die DNA-Bindungsdomäne besitzt die Fähigkeit, an ein Nukleinsäureelement oberhalb eines Minimalpromotors zu binden, das in einem Kodierkonstrukt für ein Reporterprotein, wie unten beschrieben, vorgesehen ist.
Das zweite interaktive Protein ist das interaktive Protein, das in Frame mit einer DNA-Bindungsdomäne fusioniert ist. Ein solches zweites interaktives Protein kann aus Proteinen ausgewählt werden, die mit den ersten interaktiven Proteinen wechselwirken.
Sie schließen ein, aber sind nicht beschränkt auf Proteasen, Phosphatasen, Kinasen, Rezeptoren und andere Enzymproteine. Insbesondere können Kinasen krankheitsbezogene Kinasen, wie EGFR, PDGFR, Her2, VEGFR, Met, FGFR, IGFR, Insulinrezeptor, JAKs, PKA, PKC, MAP Kinase, ZAP70, v-Abl sowie Lck, Lyn und andere Src ähnliche Kinasen, sein. Darüber hinaus können solche zweiten interaktiven Proteine ebenfalls in der Zukunft identifiziert und mit der DNA-Bindungsdomäne fusioniert werden. In unten beschriebenen Ausführungsformen ist das zweite interaktive Protein entweder das Immunophilin FKPB12 oder ein epidermaler Wachstumsfaktorrezeptor (EGFR).
Die DNA-Bindungsdomänen sind ebenfalls im Stand der Technik bekannt und können ausgewählt werden aus Tet Repressor, Lambda Repressor, Lax A DNA-Bindungssequenz, NF-kB p65 und p53. In den unten beschriebenen Ausführungsformen ist die DNA-Bindungsdomäne eine Gal4 Bindungssequenz von S. cerevisiae, die an ein Gal4 Bindungselement bindet, das oberhalb des Minimalpromotors, wie dem cytomegaloviralen (CMV) Promotor, eingeführt ist.
In einer unten beschrieben bevorzugten Ausführungsform sind das erste Kodierkonstrukt für ein Fusionsprotein aus einem interaktiven Protein und einer transkriptionellen Aktivierungsdomäne und das zweite Kodierkonstrukt für ein Fusionsprotein aus einem interaktiven Protein und einer DNA-Bindungsdomäne auf demselben Plasmid kombiniert. In einem solchen Fall ist die Kodiersequenz für das erste interaktive Protein in Frame mit der Kodiersequenz für die transkriptionelle Aktivierungsdomäne fusioniert und die Kodiersequenz für das zweite interaktive Protein ist mit der Kodiersequenz für die DNA-Bindungsdomäne fusioniert, und anschließend werden die zwei Bestandteile durch eine synthetische Sequenz einer internen Ribosomen-Eintrittsstelle (IRES) verbunden (Chappell et al. 2000 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 1536–1541). Auf diese Weise kann die Expression der zwei wechselwirkenden Proteine durch denselben Promotor oberhalb der zwei Kodiersequenzen für die interaktiven Proteine reguliert werden.
Ein Reporterkonstrukt umfasst typischerweise, in 5' nach 3' Richtung und operativ verbunden, ein DNA-Bindungselement, einen Minimalpromotor und eine Reporterkodiersequenz.
Das DNA-Bindungselement wird durch die DNA-Bindungsdomäne des zweiten Fusionsproteins aus dem interaktiven Protein und der DNA-Bindungsdomäne gebunden. In den unten beschriebenen Ausführungsformen ist das DNA-Bindungselement ein Gal4 DNA-Bindungselement.
Ein Reportergen kann verwendet werden, um indirekt das Auftreten einer Reaktion zu detektieren. In der vorliegenden Erfindung wird die Nichtexpression des Reportergens als ein Anzeichen von Störung zwischen zwei interaktiven Proteinen verwendet. Solche Reportergene sind im Stand der Technik bekannt und können beispielsweise ausgewählt werden aus Genen für das grün fluoreszierende Protein (GFP) und Derivaten, Luciferase, β-Lactamase, β-Galactosidase, alkaline Phosphatase, Chloramphenicol-Acetyl-Transferase und Arzneimittel selektiven Markern, wie Neomycin, Hygromycin, Puromycin oder irgendwelchen anderen Arzneimittel selektiven Markern, die in Säugetierzellen verwendet werden können. In den unten beschriebenen Ausführungsformen werden die folgenden Reportergene verwendet: ein Gen für grün fluoreszierendes Protein (GFP), ein Gen für β-Lactamase und ein Gen für β-Galactosidase. In einer bevorzugten Ausführungsform sind zwei oder mehr Reportergene zusammen durch die IRES Sequenz für eine einfache visuelle Bewertung (für GFP) und verstärkte biochemische Bewertung (β-Lactamase Gen oder β-Galactosidase Gen) verbunden.
Die vier Bestandteile, die unten für das erfindungsgemäße reverse Säugetier-Zweihybridsystem beschrieben sind, können auf einem oder mehreren Plasmiden anwesend sein. In einer Ausführungsform werden das Suppressorkodierkonstrukt und die Kodierkonstrukte für das Reporterprotein auf einem ersten Plasmid zur Verfügung gestellt, und die Konstrukte für die zwei interaktiven Fusionsproteine werden auf einem zweiten Plasmid zur Verfügung gestellt.
1 stellt die grundlegenden Prinzipien der Erfindung durch eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung dar.
1A zeigt ein Beispiel eines Suppressorkonstrukts, das für eine verstärkte Suppression des Promotors (P) in interaktiven Proteinkonstrukten verwendet wird. Die folgenden Elemente sind operativ in 5' nach 3' Richtung verknüpft: ein CMV Promotor (P), TetR Kodiersequenz, NLS (nicht gezeigt), KRAB Domäne des menschlichen Kox1 Gens und eine Kodiersequenz für einen selektiven Marker, der durch einen Promotor (P) getrieben wird.
1B zeigt ein Beispiel eines Konstrukts für ein interaktives Fusionsprotein, wobei beide interaktiven Proteine über eine Sequenz einer internen Ribosomen-Eintrittsstelle (IRES) verbunden und durch einen gemeinsamen Promotor kontrolliert werden. Die folgenden Elemente wurden operativ in 5' nach 3' Richtung verbunden: ein Core CMV Promotor (P), Tetracyclin Operator (TOP), TATA Box des CMV Promotors, transkriptionelle Aktivierungsdomäne (AD), fusioniert mit einem ersten interaktiven Protein (X), IRES und DNA-Bindungsdomäne (BD), fusioniert mit einem zweiten interaktiven Protein (Y). In der Abwesenheit eines Induktors ist das Tetracyclin Operon besetzt durch zwei Einheiten des TetR-KRAB Repressors gezeigt, wodurch der CMV Promotor supprimiert bleibt, was zur Nichtexpression des interaktiven Fusionsproteins führt, dargestellt durch "aus".
1C zeigt ein Beispiel eines Konstrukts für ein interaktives Fusionsprotein, in dem beide interaktiven Proteine über die IRES Sequenz verbunden und durch einen gemeinsamen Promotor kontrolliert werden. Die folgenden Elemente sind operativ in 5' nach 3' Richtung verknüpft: ein Core CMV Promotor (P), Tetracyclin Operator (TOP), TATA Box aus dem CMV Promotor, transkriptionelle Aktivierungsdomäne (AD), fusioniert mit einem ersten interaktiven Protein (X), IRES und DNA-Bindungsdomäne (BD), fusioniert mit einem zweiten interaktiven Protein (Y).
In der Anwesenheit eines Induktors (Dox) wechselwirkt der Induktor mit TetR-KRAB, um das Tetracyclin Operon von den zwei Einheiten des TetR-KRAB Repressors zu befreien, wodurch die Suppression des CMV Promotor aufgehoben wird, was zur Transkription des interaktiven Fusionsproteins führt, dargestellt durch "an".
1D zeigt ein Beispiel eines Reporterkonstrukts, wobei zwei Reporterkodiersequenzen über eine IRES Sequenz verbunden sind. Die folgenden Elemente wurden operativ in 5' nach 3' Richtung verbunden: vier Gal4 Bindungselemente (Gal4 BE), eine TATA Box des CMV Minimalpromotors, eine erste Reporterkodiersequenz (Reporter 1), die IRES Sequenz und eine zweite Reporterkodiersequenz (Reporter 2). In der Anwesenheit eine Induktors (DOX), aber in der Abwesenheit einer die Protein-Protein-Wechselwirkung störenden Substanz (Arzneimittel), bindet die DNA-Bindungsdomäne (BD) des zweiten interaktiven Fusionsproteins an das Gal4 Bindungselement, und das erste interaktive Fusionsprotein interagiert mit dem zweiten interaktiven Fusionsprotein, das die transkriptionelle Aktivierungsdomäne (AD) des ersten Fusionsproteins aus interaktivem Protein und transkriptioneller Aktivierungsdomäne in Kontakt mit der DNA-Bindungsdomäne bringt, um die Transkription der Reporterkodiersequenzen zu aktivieren, dargestellt durch "an" und gezeigt durch die Anwesenheit von Punkten in einer Zelle.
1E zeigt ein Beispiel eines Reporterkonstrukts, in dem zwei Reporterkodiersequenzen über eine IRES Sequenz verbunden sind. Die folgenden Elemente sind operativ in 5' nach 3' Richtung verknüpft: vier Gal4 Bindungselemente (Gal4 BE), eine TATA Box des CMV Minimalpromotors, eine erste Reporterkodiersequenz (Reporter 1), die IRES Sequenz und die zweite Reporterkodiersequenz (Reporter 2). In der Anwesenheit eines Induktors (Dox) und einer die Protein-Protein-Wechselwirkung störenden Substanz (als Arzneimittel gezeigt), wird die Wechselwirkung zwischen den zwei interaktiven Proteinen durch das Arzneimittel gestört. In der Abwesenheit einer solchen Protein-Wechselwirkung wird die Transkription der Reporterkodiersequenz nicht aktiviert, dargestellt durch "aus" und gezeigt durch die Abwesenheit von Punkten in einer Zelle.
Die erfindungsgemäßen, wie oben beschriebenen Bestandteile können in einem Verfahren zur Identifizierung von Substanzen, die Protein-Protein-Wechselwirkung in Säugetierzellen stören, verwendet werden. Dies kann durch Transfizieren von Zellen mit den oben beschriebenen Konstrukten erreicht werden: einem Suppressorkonstrukt, einem ersten Kodierkonstrukt für ein Fusionsprotein aus einem interaktiven Protein und einer transkriptionellen Aktivierungsdomäne, einem zweiten Kodierkonstrukt für ein Fusionsprotein aus einem interaktiven Protein und einer DNA-Bindungsdomäne, und einem Reporterkonstrukt; Selektieren von Zellen hinsichtlich der Integration oder der Anwesenheit der Konstrukte; Aussetzen der selektierten Zellen gegenüber einem Induktor und zu testenden, Protein-Protein-Wechselwirkung störenden Substanzen; Prüfen der Zellen hinsichtlich der Nichtexpression und Expression der Reporterkodiersequenz; und Identifizieren der die Protein-Protein-Wechselwirkung störenden Substanz, die zur Nichtexpression der Reporterkodiersequenz führt. Die Zellen können einem Induktor und einer Substanz getrennt von der Selektion der Zellen ausgesetzt werden.
Die Zusammensetzungen und Verfahren der vorliegenden Erfindung können außerdem als ein Kit mit Anweisungen für die Verwendung zur Verfügung gestellt werden. In einer Ausführungsform kann der Kit Behälter oder eine Aufnahmevorrichtung mit einem oder mehreren Aliquots des Suppressorkonstrukts, des ersten Kodierkonstrukts für ein Fusionsprotein aus einem interaktiven Protein und einer transkriptionellen Aktivierungsdomäne, des zweiten Kodierkonstrukts für ein Fusionsprotein aus einem interaktiven Protein und einer DNA-Bindungsdomäne und des Reporterkonstrukts, die auf einem oder mehreren Plasmiden bereitgestellt werden, aufweisen. Die interaktiven Proteine in dem ersten Kodierkonstrukt für ein Fusionsprotein aus einem interaktiven Protein und einer transkriptionellen Aktivierungsdomäne und dem zweiten Kodierkonstrukt für ein Fusionsprotein aus einem interaktiven Protein und einer DNA-Bindungsdomäne können beispielsweise durch in Frame multiple Klonierungsstellen zur Klonierung irgendwelcher anderen interaktiven Proteine ersetzt werden, dessen Antwort gegenüber einer bestimmten störenden Substanz geprüft werden muss. Der Kit kann außerdem verschiedene Reagenzien und Gerätschaften einschließen, die benötigt werden, um das Verfahren durchzuführen. In einer anderen Ausführungsform kann der Kit Säugetierzellen enthalten, die einen oder mehrere Bestandteile der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen enthalten. In noch einer weiteren Ausführungsform sind die Suppressor- und die Reporterkonstrukte bereits in die Zellen eingeführt, bevor die Konstrukte für das interaktive Protein über entweder stabile oder transiente Transfektion eingeführt werden.
BEISPIELE
Konstruktion von Reportergenkonstrukten
Die Minimalpromotorsequenz des Immediate Early Gens vom menschlichen Cytomegalovirus (CMV) wurde durch PCR mit einem sense Primer enthaltend eine XbaI Stelle und einem antisense Primer enthaltend zwei Restriktionsstellen, HindIII und HpaI, amplifiziert. Die amplifizierte Sequenz wurde als pG5CAT (Clontech) an den XbaI und HpaI Stellen eingeführt, um das CAT Gen zusammen mit dem Adenovirus E1b-Minimalpromotor zu ersetzen. Das resultierende Plasmid wurde als pG5CMV bezeichnet. Das Gen für grün fluoreszierendes Protein (GFP), das durch PCR aus pEGFP-C1 (Clontech) mit einer HindIII Stelle an dem 5' Ende und EcoRV und HpaI Stellen an dem 3' Ende amplifiziert wurde, wurde in pG5CMV an den HindIII und HpaI Stellen eingeführt, was zu pGSCMV-GFP führte. Eine synthetische IRES Sequenz (Chappell et al. 2000. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 1536–1541) mit einem stumpfen Ende am 5' Ende und einer EcoRV Stelle an dem 3' Ende wurde in pG5CMV-GFP an der EcoRV Stelle eingeführt, wodurch pG5CMV-GFP-IRES gebildet wurde. Das β-Lactamase oder Lac Z Gen, von denen beide durch PCR amplifiziert wurden, wurde in pG5CMV-GFP-IRES an der EcoRV Stelle durch Ligation der stumpfen Enden eingeführt, um entweder pG5CMV-GFP-IRES-β-Lac oder pG5CMV-GFP-IRES-β-Gal zu bilden. Dieses Konstrukt entspricht der Übersicht, die in den 1D & 1E gezeigt ist.
Konstruktion des Suppressorkonstrukts
Die Tetracyclin Repressor (TetR) Sequenz mit einer HindIII Stelle an dem 5' Ende wurde durch PCR aus pUHD15.1 (Gossen & Bujard. 1992. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 5547–5551) amplifiziert.
Die synthetische nukleäre Lokalisationssequenz (NLS) von 7 Aminosäuren (Kalderon et al. 1984. Cell 39, 499–509) mit einer EcoRV Stelle an dem 3' Ende wurde mit der TetR Sequenz in Frame durch PCR verbunden. Das TetR-NLS Fragment wurde in pcDNA3.1 (Invitrogen) an die HindIII und EcoRV Stellen kloniert. Der resultierende Vektor wurde als pCMV-TetR-NLS bezeichnet. Die KRAB Domäne des menschlichen Repressor Kox1 Gens (Deutschle et al. 1995. Mol. Cell. Biol. 15, 1907–1914) wurde durch RT-PCR aus Rattenniere amplifiziert und pCMV-TetR-NLS in Frame mit NLS an den EcoRV und XbaI Stellen durch Ligation der stumpfen Enden kloniert, um pCMV-TetR-KRAB zu bilden. Dieses Konstrukt entspricht der Übersicht, die in 1A gezeigt ist.
Konstruktion eines kombinierten Reporter- und Suppressorkonstrukts
Das Suppressorkonstrukt pCMV-TetR-KRAB, wie oben beschrieben, wurde mit BglII und ApaI gespalten. Ein größeres BglII-ApaI Fragment (1,8 kb) wurde isoliert und in Vektor pEGFP-C1 (Clontech) an den BglII und ApaI Stellen eingeführt. Das resultierende Plasmid wurde als pEGFP-CMV-TetR-KRAB bezeichnet. Anschließend wurden die Plasmide der gesamten Reporterkassette pG5CMV-GFP-IRES-β-lac oder pGSCMV-GFP-IRES-β-gal isoliert, gefolgt von SmaΙ Spaltung und in pEGFP-CMV-TetR-KRAB an PciΙ und BspEΙ durch Ligation der stumpfen Enden eingeführt. Das resultierende Plasmid wurde als pG5CMV-GFP-IRES-β-gal-pCMV-TetR-KRAB-IRES oder pG5CMV-GFP-IRES-β-lac-pCMV-TetR-KRAB-IRES bezeichnet und für stabile Transfektion in Zellen verwendet.
Konstruktion eines ersten Fusionsgenkonstrukts für ein interaktives Protein und eine Bindungsdomäne und eines zweiten Fusionsgenkonstrukts für ein interaktives Protein und eine Aktivierungsdomäne
Die Tetracyclin Repressor Operatorsequenzen (4 × TOP) mit einer SalI Stelle an dem 5' Ende und einer XbaI Stelle an dem 3' Ende wurden synthetisiert und in die SalI und XbaI Stellen von pG5CMV/Hygro eingeführt, was durchgeführt wurde durch Einführen der Hygromycin Expressionskassette, die aus pcDNA3.1/Hygro (Invitrogen) isoliert wurde, in die NdeI Stelle von pG5CMV. Das resultierende Plasmid wurde als pG5CMV-tetOP bezeichnet. Die CMV Core Promotorsequenz enthaltend 555 bp, abgeleitet von dem pcDNA3.1 Vektor (Nukleotid 232–787) wurde in pG5CMV-tetOP an den XhoI und SalI Stellen, zwischen denen die Gal4 Bindungselemente (5 ×) entfernt wurden, kloniert. Das resultierende Plasmid wurde als pCMV-tetOP bezeichnet. Die Gal4 DNA-Bindungsdomäne (BD) und die VP16 transkriptionelle Aktivierungsdomäne (AD), von denen beide die multiplen Klonierungsstellen (MCS) enthalten, wurden jeweils von den Vektoren pM und pVP16 (Clontech) isoliert und in pCMV-tetOP an die HindIII Stelle kloniert, so dass die anderen MCS erhalten blieben, aber die HindIII Stellen wurden durch Ligation der stumpfen Enden zerstört. Die resultierenden Plasmide wurden jeweils als pCMV-tetOP-BD und pCMV-tetOP-AD bezeichnet. Die Kodiersequenzen für interaktives Protein, X und Y, wurden individuell in die geeigneten Stellen der MCS in jeweils der AD und BD kloniert.
Konstruktion eines kombinierten ersten Kodierkonstrukts für ein Fusionsprotein aus einem interaktiven Protein und einer transkriptionellen Aktivierungsdomäne und einem zweiten Konstrukt für ein Fusionsprotein aus einem interaktiven Protein und einer DNA-Bindungsdomäne
Die synthetische Tetracyclin Repressor Operatorsequenz (4 × TOP) wurde in pUHD 10.3 (Gossen & Bujard. 1992. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 5547–5551) an den XhoI und den StuI Stellen eingeführt, um die 7 × TOP in dem Vektor pUHD 10.3 zu ersetzen. Die CMV Core Promotorsequenz enthaltend 550 bp, abgeleitet von dem pcDNA3.1 Vektor (Nukleotid 230–780) wurde in die XhoI Stelle vor der 4 × TOP kloniert, wodurch pUHD-CMV-tetOP gebildet wurde. Die isolierte "X" Proteinsequenz für die spezifische Protein-Protein-Wechselwirkung wurde in pVP16 (Clontech) an der Region der multiplen Klonierungsstelle (MCS) eingeführt, um sie mit der VP16 transkriptionellen Aktivierungsdomäne (AD) in Frame zu fusionieren. Das fusionierte AD-X Fragment wurde anschließend durch die NheI und XbaI Spaltungen isoliert, aufgefüllt und in pUHD-CMC-tetOP an den SacII und NaeI Stellen durch Ligation der stumpfen Enden eingeführt, um pUHD-CMV-tetOP-AD X zu bilden. Die synthetische IRES Sequenz wurde in den pcDNA3/Hygro an den AflII und NotI Stellen durch Ligation der stumpfen Enden eingeführt. Das resultierende Plasmid pcDNA3-IRES wurde mit den Enzymen NruI und NheI gespalten, und das CMV tetOP-AD-X Fragment, das aus pUHD-CMV-tetOP-AD-X mit den NruI und XbaI Spaltungen isoliert wurde, wurde in den gespaltenen Vektor pcDNA3-IRES eingeführt, um pCMV-tetOP-AD-X-IRES zu bilden. Die PCR amplifizierte Gal4 DNA-Bindungsdomäne (BD) aus pM (Clontech) wurde in pcDNA3 an den NheI und XbaI Stellen eingeführt, und die isolierte "Y" Proteinsequenz für die spezifische Protein-Protein-Wechselwirkung wurde mit der BD in Frame fusioniert. Das BD-Y Fragment wurde anschließend durch die NheI und XbaI Spaltungen isoliert und in pCMV-tetOP-AD-X-IRES an der XbaI Stelle eingeführt, um pCMV-tetOP-AD-X-IRES-BD-Y/Hygro herzustellen. Dieses Konstrukt entspricht dem Überblick, der in den 1B & 1C gezeigt ist.
Herstellung von Zelllinien, die verschiedene Konstrukte exprimieren
Um eine stabile Zelllinie herzustellen, welche die einzelnen oder das kombinierte Suppressor- und Reporterkonstrukt exprimiert, wurden ungefähr 10⁵–10⁶ Zellen der Zelllinie 293A in Schalen mit 60 mm Durchmesser einen Tag vor der Transfektion ausplattiert. Die Transfektion mit den Konstrukten wurde bei 80% Zellkonfluenz mit 5 μg des linearisierten Plasmids, gemischt mit 20 μl Superfect (Qiagen) durchgeführt. Nach 48 Stunden der Transfektion wurden die Zellen trypsiniert und bei 1 : 20 in dem Kulturmedium enthaltend 800 μg/ml G418 für die Selektion der transfizierten Zellen, verdünnt. Nach 3 Wochen nach der Transfektion wurden die Kolonien selektiert. Die Zellen von den selektierten einzelnen Kolonien wurden mit Dox induziert und durch Cotransfektion mit pCMV-tetOP-AD-X-IRES-BD-Y für die Protein-Protein-Wechselwirkung, welche die Reportergene aktiviert, überprüft. GFP wurde 48 Stunden nach der Transfektion gemessen, während die Aktivität von β-Lactamase und β-Galactosidase innerhalb von 24–36 Stunden nach der Transfektion bestimmt wurde. Die Zellen von den selektierten Kolonien wurden stabil mit pG5CMV-GFP-IRES-β-gal-pCMV-TetR-KRAB-IRES oder pG5CMV-GFP-IRES-β-lac-pCMV-TetR-KRAB-IRES transfiziert und weiterhin mit pCMV-tetOP-AD-X-IRES-BD-Y ko-transfiziert.
Zelllinien, die stabil die einzelnen oder kombinierten Suppressor-, Reporter- und die Konstrukte für interaktive Fusionsproteine exprimieren, wurden weiterhin durch G418 (400 μg/ml) und Hygromycin (200 μg/ml) zum Screenen von Substanzen, die Protein-Protein-Wechselwirkung stören, selektiert. Ähnliche Verfahren wurden auf andere Säugetier Zelllinien wie BHK, COS, CHO, NIH3T3 Zellen für die Herstellung stabiler Zelllinien zum Screenen von Substanzen, die Protein-Protein-Wechselwirkung stören oder Substanzen, die Protein-Protein-Wechselwirkung nicht stören, verwendet.
Um transiente Expression von interaktiven Proteinen für high throughput Screenen zu verwenden, wurden viele Millionen Zellen, die stabil den Repressor und die Reporter exprimieren, mit pCMV-tetOP-AD-X-IRES-BD-Y über Nacht transfiziert und anschließend auf Platten mit 96 oder 384 Vertiefungen, die sowohl Dox als auch Arzneimittel enthielten, aufgeteilt. Nach zusätzlichen 24 Stunden wurde die Expressionsmenge der Reporter gemessen, um Substanzen zu identifizieren, die Protein-Protein-Wechselwirkung stören oder um Substanzen zu identifizieren, die nicht stören. Dieses Verfahren kann zum Screenen von Arzneimitteln verwendet werden.
Detektion von Reportergenexpression
Grün fluoreszierendes Protein (GFP). Um die Expression von GFP direkt zu untersuchen, wurden Zellen in niedrig Fluoreszenz Testplatten in 96 oder 384 Vertiefungen mit 100 oder 50 μl DMEM Medium kultiviert. Es wurden Dox und Substanzen in unten beschriebenen Konzentrationen hinzugefügt. Nach 48 Stunden der Behandlung wurde das Medium in jeder Vertiefung gegen PBS ausgetauscht. Die Intensität von GFP wurde direkt bei 485 nm Anregung und 525 nm Emission mit einem Fluoreszenz Plattenlesegerät für multiple Vertiefungen (CytoFluor II, PerSeptive Biosystems oder Wallac Victor V Stacker, Perkin-Elmer) gemessen.
Lactamase. Zum Nachweis von segregierter β-Lactamase Aktivität wurden Zellen in Platten mit 96 oder 384 Vertiefungen in 100 oder 50 μl DMEM Medium ohne Phenolrot angezogen. Die Zellen wurden mit Dox in einer Endkonzentration von 1 μg/ml für 12–24 Stunden hinsichtlich Reporterproteinexpression induziert. 50 μl oder 100 μl Reaktionslösung enthaltend 100 mM Phosphat, pH 7,0, 10 μM Nitrocefin, 0,5 μM Ölsäure wurden zu jeder Vertiefung hinzugefügt. Die Reaktion wurde bei 37°C für 30–60 Minuten durchgeführt. In einigen Experimenten wurde Clavulansäure, ein Inhibitor für β-Lactamase, in einer Konzentration von 25 μM hinzugefügt. β-Lactamase Aktivität wurde als ein Anstieg in der Absorption bei 488 nm gemessen.
β-Galactosidase. Ebenso wie bei den β-Lactamase Aktivitätstests wurden Zellen in 100 oder 50 μl DMEM Medium ohne Phenolrot in Platten mit 96 oder 384 Vertiefungen und dem Substrat angezogen. Nach der Lyse der Zellen mit Lysispuffer wurde Chlorphenolrot β-D-Galactophranosid (CPRG) für β-Galactosidase in die Zelllysate in einer Endkonzentration von 100 μg/ml mit Dox und Substanzen für 24–36 Stunden hinzugefügt. Die Aktivität des Enzyms wurde als ein Anstieg der Absorption bei 570 nm gemessen.
Zerstörung der TGFR (RI) und FKBP12 Wechselwirkung durch FK506
Eine der gut charakterisierten Protein-Protein-Wechselwirkungen, die durch das vorwärts gerichtete Hefe-Zweihybridsystem entdeckt wurde, ist die Wechselwirkung des transformierenden Wachstumsfaktor Typ 1 Rezeptor (TGFR) (RI) mit dem Immunophilin FKPB12 (Wang et al. 1994. Science 265: 674–676). Das FKBP12 ist ein Zielmolekül des Makrolids FK506. Es wurde herausgefunden, dass FK506 mit dem TGFR (RI) hinsichtlich der Bindung an FKBP12 konkurrierte und somit mit der Wechselwirkung zwischen dem TGFR (RI) und FKPB12 interferierte (Wang et al. 1994. Science 265: 674–676). Das erfindungsgemäße reverse Säugetier-Zweihybridsystem wurde mit diesem Paar der Protein-Protein-Wechselwirkung untersucht, um zu bewerten, ob die Wirkung von FK506 in der Störung der Wechselwirkung nachgewiesen werden kann. Um dies zu erreichen, wurde die cytoplasmatische Domäne des TGFR (RI) mit der transkriptionellen Aktivierungsdomäne (AD) von VP16 fusioniert, und FKBP12 wurde mit der Gal4 DNA-Bindungsdomäne (BD) fusioniert.
Ein stabile Zelllinie, die das Konstrukt TetR-KRAB, das GFP Reporterkonstrukt und das Konstrukt pCMV-tetOP-AD-RI-IRES-BD-FKBP12 enthielt, wurde selektiert, um die Wirkung des Arzneimittelmoleküls FK506 auf die Wechselwirkung zwischen TGFR (RI) und FKPB12 zu bewerten. Die Intensität der GFP Expression wurde 48 Stunden nach der Behandlung der Zellen mit dem Induktor Dox und der Substanz FK506 beobachtet.
2 zeigt, dass in der Abwesenheit von Dox die Expression von GFP in Kontroll (DMSO behandelten) Zellen, nahezu nicht nachweisbar war. Das Hinzufügen von Dox induzierte die Expression der interaktiven Proteine und aktivierte die Expression des GFP Reportergens. Wenn jedoch das Arzneinmittel FK506 zusammen mit Dox hinzugefügt wurde, wurde die Expression von GFP nahezu aufgehoben. Der Kinaseinhibitor AG1478 (Levitzki & Gazit. 1995. Science 267: 1782–1788), eine Verbindung ohne Bezug, welche die Wechselwirkung von TGFR (RI) und FKPB12 nicht beeinflusst, übte keine Wirkung auf die Dox induzierte GFP Expression aus. Um die in 2 gezeigten Ergebnisse zu erhalten, wurden Zellen, die stabil das Suppressor TetR-KRAB Konstrukt, das GFP Reporterkonstrukt und das Konstrukt pCMV-tetOP-AD-RI-IRES-BD-FKBP12 exprimieren, mit 1 μg/ml Dox, 100 nM FK506 und 2,5 μM AD1478 für 48 Stunden behandelt. Die Expression des GFP Reportergens wurde nach der Behandlung bewertet. Die Daten stellen den Durchschnitt und die Standardabweichung aus drei unabhängigen Experimenten dar.
Die 4a bis 4d zeigen die visuelle Bewertung der GFP Expression wenn das Konstrukt pCMV-tetOP-AD-RI-IRES-BD-FKBP12 transient in einer stabilen Zelllinie exprimiert wurde, die das Suppressorkonstrukt TetR-KRAB und das GFP Reporterkonstrukt enthielt. Um die Ergebnisse, die in 4a bis 4d gezeigt sind, zu erhalten, wurden Zellen, die stabil mit dem TetR-KRAB Konstrukt und dem GFP Reporterkonstrukt transfiziert wurden, transient mit dem Konstrukt pCMV-tetOP-AD-RI-IRES-BD-FKBP12 transfiziert. Nach 12 Stunden nach der Transfektion wurden der Induktor Dox und die Arzneimittel FK506 und AG1478 der Kultur hinzugefügt. Es wurden Photomitographen von den Zellen nach 48 Stunden nach der Behandlung der Zellen aufgenommen, welche die Expression von GFP zeigten. Die Konzentration des verwendeten AG1478 betrug 2,8 μM und jene von FK506 betrug 100 nM. Ähnliche Ergebnisse wurden in Zellen beobachtet, die stabil hinsichtlich des Suppressor TetR-KRAB Konstrukts, des GFP Reporterkonstrukts und des Konstrukts pCMV-tetOP-AD-RI-IRES-BD-FKBP12 selektiert wurden.
Diese Daten zeigten, dass das Arzneimittelmolekül FK506 die Wechselwirkung von FKBP12 mit dem Rezeptor RI wirksam störte, und diese spezifische Störung der wechselwirkenden Proteine durch das Arzneimittel wurde klar gezeigt durch Überwachen der Expression von GFP in lebenden Zellen. Die stabile Zelllinie, die das RI und FKBP12 Paar von wechselwirkenden Proteinen exprimiert, könnte verwendet werden, um andere Kandidaten von immunsuppressiven Arzneimitteln zu screenen.
Störung der EGFR und p85 Wechselwirkung durch den Kinase Inhibitor AG1478
Die Verwendung der vorliegenden Erfindung zum Screenen von potenziellen therapeutischen Molekülen wurde außerdem mit einem anderen Paar von wechselwirkenden Proteinen, dem epidermalen Wachstumsfaktor Rezeptor (EGFR) und der p85 Untereinheit von Phosphatidylinositol-3-Kinase gezeigt. Es ist bekannt, dass die cytoplasmatische Domäne der EGFR Familie an Tyrosinresten autophosphoryliert werden kann, wenn sie in dem Zellkern überexprimiert wird (Xie & Hung. 1994. Biochem. Biophys. Res. Commun. 203: 1589–1599). Der autophosphorylierfe EGFR rekrutiert Signalproteine durch die Wechselwirkung zwischen den phosphorylierten Tyrosinresten und den Src Homologie 2 (SH) Domänen der Signalproteine. Die p85 Untereinheit ist eine der Signalmoleküle, die an den EGFR bindet (Hu et al. 1992. Mol. Cell. Biol. 12, 981–900). AG1478 ist ein potenter Inhibitor für die Kinase des EGFR (Levitzki & Gazit. 1995. Science 267: 1782–1788). Wir nahmen an, dass die Inhibition der EGFR Kinase Aktivität mit AG1478 die Tyrosin Autophosphorylierung des Rezeptors EGFR aufheben würde, was zu der Verhinderung der Wechselwirkung zwischen p85 und EGFR führt. Deshalb untersuchten wir, ob die inhibitorische Aktivität von AG1478 durch das vorliegende reverse Zweihybridsystem über störende Wechselwirkung des EGFR und p85 nachgewiesen werden könnte. Wie oben beschrieben, wurde jeweils der EGFR in Frame mit der Gal4 DNA-Bindungsdomäne fusioniert, und p85 wurde in Frame mit der Aktivierungsdomäne von VP16 fusioniert. Eine stabile Zelllinie, die das Suppressorkonstrukt TetR-KRAB, das GFP Reporterkonstrukt und das Konstrukt pCMV-tetOP-AD-p85-IRES-BD-EGFR enthielt, wurde mit geeigneten Antibiotika selektiert. Die Intensität der GFP Expression wurde nach 48 Stunden Behandlung der Zellen mit dem Induktor Dox und den Arzneimitteln FK506 oder AG1478 überwacht.
3 zeigt, dass die Expression von GFP in Kontroll (DMSO behandelten) Zellen nicht signifikant war. Dox induzierte eine hohe Menge an GFP Expression, die nicht durch FK506 beeinflusst wurde, ein Arzneimittel ohne Bezug, das nicht mit EGFR und p85 Wechselwirkung interferiert. Jedoch wirkte das Hinzufügen des EGFR Kinase Inhibitors AG1478 zu der Kultur nahezu vollständig der Dox induzierten Aktivierung des GFP Reportergens entgegen, was anzeigte, dass der Inhibitor die Wechselwirkung zwischen dem EGFR und p85 störte. Um die in 3 gezeigten Ergebnisse zu erhalten, wurden Zellen, welche stabil die Konstrukte TetR-KRAB, GFP und pCMV-tetOP-AD-p85-IRES-BD-EGFR enthielten, mit 1 μg/ml Dox, 100 nM FK506 und 2,5 μM AD1478 für 48 Stunden behandelt. Die Expression des GFP wurde nach der Behandlung bewertet. Die Daten zeigen den Durchschnitt und die Standardabweichung für drei unabhängige Experimente.
Die 4e bis 4h zeigen die visuelle Bewertung der GFP Expression. Diese wurde erreicht durch transientes Transfizieren der stabilen Zelllinie, die TetR-KRAB und GFP Konstrukte mit dem pCMV-tetOP-AD-p85-IRES-BD-EGFR Konstrukt enthielt. Ähnliche Ergebnisse wurden erhalten mit Zellen, die stabil mit dem Suppressorkonstrukt TetR-KRAB, dem GFP Reporterkonstrukt und pCMV-tetOP-AD-p85-IRES-BD-EGFR transfiziert wurden. Diese Ergebnisse legen nahe, dass das erfindungsgemäße reverse Zweihybridsystem nicht nur verwendet werden kann, um Moleküle zu screenen, die direkt mit spezifischen Protein-Wechselwirkungen interferieren, sondern auch, um Moleküle zu screenen, die Enzyminhibitoren sind, solange die Wechselwirkung des Enzyms mit seinem Partnerprotein von seiner enzymatischen Aktivität abhängig ist, die durch den Inhibitor inhibiert werden kann. Um die Ergebnisse, die in 4e bis 4h gezeigt sind, zu erhalten, wurden Zellen, die stabil mit TetR-KRAB und GFP Konstrukten transfiziert waren, weiterhin transient mit dem Konstrukt pCMV-tetOP-AD-p85-IRES-BD-EGFR transfiziert. Nach 12 Stunden nach der Transfektion wurde der Induktor Dox und die Arzneimittel FK506 und AG1478 der Kultur hinzugefügt. Es wurden Photomikrographen der Zellen, die Expression von GFP zeigten, 48 Stunden nach der Behandlung der Zellen aufgenommen. Die Konzentration des verwendeten AG1478 betrug 2,5 μM, und jene von FK506 betrug 100 nM.
Das oben beschriebene Beispiel zeigt, dass das vorliegende reverse Säugetier-Zweihybridsystem auch ein angenehmes und wirksames Werkzeug für zellbasiertes Screenen von Inhibitorkandidaten für eine Vielzahl von Enzymen wie Proteasen, Phosphatasen und Kinasen zur Verfügung stellt. Insbesondere liefert das System ein angenehmes und wirksames Werkzeug für zellbasiertes Screenen von Kandidateninhibitoren für gewisse krankheitsbezogene Kinasen, wie EGFR, PDGFR, Her2, VEGFR, JAKs, Met, FGFR, IGFR, Insulin Rezeptor, JAKs, ZAP70, v-Abl, Lck, Lyn und andere Src ähnlichen Kinasen. Die Wirksamkeit und Selektivität des vorliegenden Systems wurden auch in dem primären Screenen von Inhibitoren für die EGFR und Her2 Rezeptorkinasen gezeigt.
Verwendung von β-Lactamase als ein Reporter in der vorliegenden Erfindung
Während GFP ein angenehmer Reporter für die direkte Beobachtung von Arzneimittelwirkungen auf Protein-Protein-Wechselwirkungen für Anwendungen in Platten mit einer Vielzahl von Vertiefungen ist, ist es kein sensitiver Reporter, weil der Mangel an enzymatischer Amplifikation seine großen Mengen an Expression für den Nachweis benötigt (10⁵ bis 10⁶ Moleküle pro Zelle) (Zlokarnik et al. 1998. Science 279: 84–88). Aus dem gleichen Grund kann die Messung von GFP nicht innerhalb von 48 Stunden nach der Dox Induktion durchgeführt werden. Die Verwendung eines alternativen Reportergens, β-Lactamase, für die vorliegende reverse Zweihybridsystem Erfindung, wird offenbart. Gegenwärtig sind sowohl colorimetrische als auch nicht toxische Fluoreszenzsubstrate zur Verwendung in β-Lactamasetests verfügbar. Weil die Sensitivität des β-Lactamase Reporters hauptsächlich durch die Inkubationszeit mit seinem Substrat bestimmt wird, ist der β-Lactamase basierte Test sehr sensitiv. Mit einem Fluoreszenzsubstrat kann die Expression von β-Lactamase in Mengen so niedrig wie 100 Moleküle pro Zelle nachgewiesen werden (Zlokarnik et al. 1998. Science 279: 84–88). Die Aktivität von β-Lactamase kann exakt bestimmt werden durch Hinzufügen seines Substrates direkt zu der Kultur und Messen der Folge der Reaktion, wie eine Farbveränderung oder ein großer Wechsel der Fluoreszenzemissonswellenlänge.
5 zeigt β-Lactamase Aktivität in dem Medium nach 12 Stunden nach Dox Induktion. Die Aktivität von β-Lactamase in einer 30 Minuten Inkubation zeigte eine dosisabhängige Wirkung von AG1478 auf das Stören der Wechselwirkung zwischen EGFR und p85. Um die in 5 gezeigten Ergebnisse zu erhalten, wurden Zellen, die stabil das TetR-KRAB Konstrukt, das GFP-β-Lactamase Konstrukt und das AD-p85-IRES-BD-EGFR Konstrukt exprimierten, in 100 oder 50 μl DMEM ohne Phenolrot angezogen und mit Dox und dem Inhibitor AG1478 in den angegebenen Konzentrationen für 12 Stunden behandelt. Das Substrat Nitrocefin, in 100 oder 50 μl des Reaktionspuffers, wurde zu jedem Test hinzugefügt. Die Reaktion wurde für 30 Minuten bei 22°C durchgeführt. Die Aktivität der segregierten β-Lactamase in das Medium wurde direkt durch Absorption bei 488 m in einem Plattenlesegerät für multiple Vertiefungen gemessen.
Ähnliche Ergebnisse wurden unter Verwendung von β-Galactosidase als ein Reporter (Daten nicht gezeigt) erhalten. Für das high throughput Screenen von Arzneimitteln unter Verwendung der vorliegenden Erfindung wurden auch Kodiersequenzen für zwei Reporterproteine umfassend entweder GFP und β-Lactamase Gene oder GFP und Lac Z Gene, in demselben Plasmid unter Verwendung einer IRES Sequenz zum alternativen Nachweis der Reporter konstruiert.
Ähnliche Ergebnisse können unter Verwendung einer Kombination der Konstrukte pCMV-tetOP-AD-RI und pCMV-tetOP-BD-FKBP12 anstelle von pCMV-tetOP-AD-IRES-BD-FKBP12 erhalten werden.

Claims

Reverses Säugetier-Zweihybridsystem zur Identifizierung einer Veränderung in Protein-Protein-Wechselwirkungen mit: einem Suppressorkonstrukt, einen operativ an eine Repressorprotein-Kodiersequenz gebundenen konstitutiven Promotor umfassend; einem Kodierkonstrukt für ein interaktives Fusionsprotein, umfassend einen operativ an einen repressiblen Operator gebundenen Promotor, der durch ein Repressorprotein unterdrückt werden kann, das durch die Repressorprotein-Kodiersequenz kodiert wird, eine erste Kodiersequenz für ein interaktives Protein, die in Frame mit einer Proteinkodiersequenz für eine transkriptionelle Aktivierungsdomäne fusioniert ist, und eine zweite Kodiersequenz für ein interaktives Protein, die in Frame mit einer Proteinkodiersequenz für eine DNA-Bindungsdomäne fusioniert ist; und einem Reporterkonstrukt mit einem operativ an einen Minimalpromotor gebundenen, DNA bindenden Element, welches das DNA-Bindungsdomänenprotein binden kann, sowie einer Reporterkodiersequenz.
Reverses Säugetier-Zweihybridsystem nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Kodierkonstrukt für das interaktive Fusionsprotein umfasst: ein erstes Kodierkonstrukt für ein Fusionsprotein aus einem interaktiven Protein und einer transkriptionellen Aktivierungsdomäne mit einem operativ an einen repressiblen Operator gebundenen Promotor, der durch ein Repressorprotein unterdrückt werden kann, das durch die Repressorprotein-Kodiersequenz kodiert wird, und einer ersten Kodiersequenz für ein interaktives Protein, die in Frame mit einer Proteinkodiersequenz für eine transkriptionelle Aktivierungsdomäne fusioniert ist; und ein zweites Genkonstrukt für ein Fusionsprotein aus einem interaktiven Protein und einer transkriptionellen Aktivierungsdomäne mit einem operativ an einen repressiblen Operator gebundenen Promotor, der durch ein Repressorprotein unterdrückt werden kann, das durch die Repressorprotein-Kodiersequenz kodiert wird, und einer zweiten Kodiersequenz für ein interaktives Protein, die in Frame mit einer Proteinkodiersequenz für eine DNA-Bindungsdomäne fusioniert ist.
Reverses Säugetier-Zweihybridsystem nach Anspruch 1, zusätzlich zumindest eine Sequenz interner Ribosomen-Eintrittsstellen (IRES) umfassend.
Reverses Säugetier-Zweihybridsystem nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die in Frame mit einer Proteinkodiersequenz für eine transkriptionelle Aktivierungsdomäne fusionierte Kodiersequenz für interaktive Proteine durch eine Sequenz interner Ribosomen-Eintrittsstellen (IRES) operativ an die in Frame mit einer Proteinkodiersequenz für eine DNA-Bindungsdomäne fusionierte zweite Kodiersequenz für interaktive Proteine gebunden ist.
Reverses Säugetier-Zweihybridsystem nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Reporterkonstrukt zusätzlich eine zweite, operativ an die benannte Reporterkodiersequenz gebundene Reporterkodiersequenz umfasst.
Reverses Säugetier-Zweihybridsystem nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die erste Reporterkodiersequenz über eine Sequenz interner Ribosomen-Eintrittsstellen (IRES) operativ an die zweite Reporterkodiersequenz gebunden ist.
Reverses Säugetier-Zweihybridsystem nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der konstitutive Promotor im Suppressorkonstrukt aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Promotoren des humanen Cytomegalovirus (CMV), des SV40, des respiratorischen Synzytialvirus (RSV), des EF1 und Thyminkinase-(TK)Genen besteht.
Reverses Säugetier-Zweihybridsystem nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Repressorprotein-Kodiersequenz im Suppressorkonstrukt für ein Protein kodiert, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Lac-Repressor, λ-Repressor, Tet-Repressor und hybridem Tet-Repressor (TetR) besteht.
Reverses Säugetier-Zweihybridsystem nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass bei dem hybriden TetR das TetR-Protein durch eine Kernlokalisierungssequenz (NLS) mit der KRAB-Domäne des humanen Transkriptionssuppressors Kox1 verbunden ist.
Reverses Säugetier-Zweihybridsystem nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Suppressorkonstrukt zusätzlich einen arzneimittel-selektiven Marker umfasst, der Resistenz gegenüber einem Arzneimittel liefert.
Reverses Säugetier-Zweihybridsystem nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Promotor und der repressible Operator im interaktiven Fusionsprotein-Kodierkonstrukt aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus einem mit dem Tetracyclin-Operator verbundenen Kernpromotor des humanen Cytomegalovirus (CMV), des SV40, des respiratorischen Synzytialvirus (RSV), des EF1 und der Thyminkinase (TK) besteht.
Reverses Säugetier-Zweihybridsystem nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Kodierkonstrukit für interaktive Fusionsproteine für ein Protein kodiert, das aus der aus Rezeptoren, Adaptoren, Effektoren und Enzymen bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Reverses Säugetier-Zweihybridsystem nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die erste Kodiersequenz für interaktive Proteine für ein krankheitsbezogenes Signalmolekül kodiert.
Reverses Säugetier-Zweihybridsystem nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Kodiersequenz für transkriptionelle Aktivierungsdomänen aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus den Kodiersequenzen GAL4, B42, VP16 und NF-kB p65 besteht.
Reverses Säugetier-Zweihybridsystem nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die zweite Kodiersequenz für interaktive Proteine für ein Protein kodiert, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einer Protease, einer Phosphatase, einer Kinase, einem Rezeptor und einem Enzym besteht.
Reverses Säugetier-Zweihybridsystem nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Kinase eine krankheitsbezogene Kinase ist.
Reverses Säugetier-Zweihybridsystem nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass die krankheitsbezogene Kinase aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus EGFR, PDGFR, Her2, VEGFR, Met, FGFR, IGFR, Insulinrezeptor, JAKs, PKA, PKC, MAP-Kinase, ZAP70, v-Abl sowie Lck, Lyn oder anderen Src-artigen Kinasen besteht.
Reverses Säugetier-Zweihybridsystem nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Kodiersequenz für die DNA-Bindungsdomäne aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Gal4-DNA-Bindungsdomäne, Lac-Repressor, Tet-Repressor, Lambda-Repressor, Lax A-DNA-Bindungssequenz, NF-kB p65 und p53 besteht.
Reverses Säugetier-Zweihybridsystem nach Anspruch 3 oder 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Sequenz interner Ribosomen-Eintnttsstellen (IRES) aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einer synthetischen IRES-Sequenz und einer Encephalomyocarditisvirus-(EMCV-)IRES besteht.
Reverses Säugetier-Zweihybridsystem nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das DNA-Bindungselement im Reporterkonstrukt aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Gal4-Bindungselement, Lac-Operator, Tet-Operator, Lambda-Operator, Lax A-Bindungselement und p53-Bindungsstellen besteht.
Reverses Säugetier-Zweihybridsystem nach einem beliebigen der Ansprüche 1, 4 und 5, dadurch gekennzeichnet, dass der Promotor im Reporterkonstrukt aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einem Minimalpromotor aus humanem Cytomegalovirus-(CMV-)promotor, frühem SV40-Promotor, Adenovirus E1b-Promotor, respiratorischem Synzytialvirus-(RSV-)Promotor, EF1-Promotor und Thyminkinase-(TK-)Promotor besteht.
Reverses Säugetier-Zweihybridsystem nach einem beliebigen der Ansprüche 1, 4 und 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Reporterkodiersequenz für ein Protein kodiert, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einem grün fluoreszierenden Protein (GFP) oder einem GFP-aktiven Abkömmling, einer Luciferase, einer β-Lactamase, einer β-Galactosidase, einer alkalischen Phosphatase und Chloramphenicol-Acetyltransferase besteht.
Plasmid, das reverse Säugetier-Zweihybridsystem nach Anspruch 1 umfassend.
Satz aus zwei Plasmiden, das reverse Säugetier-Zweihybridsystem nach Anspruch 1 umfassend, dadurch gekennzeichnet, dass das Suppressorkonstrukt sowie das Reporterkonstrukt auf einem ersten Plasmid zur Verfügung stehen und das erste Kodierkonstrukt für Fusionsproteine aus interaktiven Proteinen und einer transkriptionellen Aktivierungsdomäne sowie das zweite Kodierkonstrukt für Fusionsproteine aus interaktiven Proteinen und einer DNA-Bindungsdomäne zusammen auf einem zweiten Plasmid zur Verfügung stehen.
Säugetierzelle, ein reverses Säugetier-Zweihybridsystem nach Anspruch 1 umfassend.
Säugetierzelle nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, dass das reverse Säugetier-Zweihybridsystem in ein Chromosom in dieser Zelle integriert ist.
Verfahren zur Identifizierung einer Veränderung in Protein-Protein-Wechselwirkungen, umfassend: ein reverses Säugetier-Zweihybridsystems nach einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 22 in einer Zelle einem Induktor und einer zu prüfenden, Protein-Protein-Wechselwirkungen störenden Substanz auszusetzen; und die Zelle auf die Expression oder Nichtexpression der Reporterkodiersequenz zu prüfen, wobei Nichtexpression der Reporterkodiersequenz eine Störfähigkeit der zu prüfenden, Protein-Protein-Wechselwirkungen störenden Substanz anzeigt.
Verfahren nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, dass die störende Substanz eine indirekt störende Substanz ist, die auf ihre Fähigkeit geprüft wird, die Aktivität eines krankheitsbezogenen Enzyms zu hemmen.
Verfahren zur Identifizierung einer Veränderung in Protein-Protein-Wechselwirkungen, umfassend: a) ein Suppressorkonstrukt und ein Reporterkonstrukt stabil in eine Zelle einzuführen; b.1) ein erstes Kodierkonstrukt für Fusionsproteine aus interaktiven Proteinen und einer transkriptionellen Aktivierungsdomäne sowie ein zweites Kodierkonstrukt für Fusionsproteine aus interaktiven Proteinen und einer DNA-Bindungsdomäne in die Zelle einzuführen; oder b.2) ein erstes Kodierkonstrukt für Fusionsproteine aus interaktiven Proteinen und einer transkriptionellen Aktivierungsdomäne sowie ein zweites Kodierkonstrukt für Fusionsproteine aus interaktiven Proteinen und einer DNA-Bindungsdomäne vorübergehend in die Zelle einzuführen; c) eine aus Schritt b.1 oder b.2 gewonnene Zelle einem Induktor und einer zu prüfenden, Protein-Protein-Wechselwirkungen störenden Substanz auszusetzen; d) die ausgesetzte Zelle auf die Nichtexpression oder Expression der Reporterkodiersequenz zu prüfen; und e) auf der Basis der Nichtexpression der Reporterkodiersequenz die die Protein-Protein-Wechselwirkungen störende Substanz zu identifizieren.
Verfahren zur Identifizierung einer Veränderung in Protein-Protein-Wechselwirkungen nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, dass die Zelle eine Säugetierzelle ist.
Reagentiensatz zur Identifizierung einer Veränderung in Protein-Protein-Wechselwirkungen mit: einem oder mehreren aliquoten Teilen eines Suppressorkonstrukts, einem ersten Kodierkonstrukt für Fusionsproteine aus interaktiven Proteinen und einer transkriptionellen Aktivierungsdomäne, einem zweiten Kodierkonstrukt für Fusionsproteine aus interaktiven Proteinen und einer DNA-Bindungsdomäne und einem Reporterkonstrukt auf einem oder mehreren Plasmiden; und einem oder mehreren aliquoten Teilen eines Reagens, einer Zelle sowie Gerätschaften, die benötigt werden, um ein Verfahren zur Identifizierung einer Veränderung in Protein-Protein-Wechselwirkungen auszuführen.
Reagentiensatz zur Identifizierung einer Veränderung in Protein-Protein-Wechselwirkungen mit: einem oder mehreren aliquoten Teilen eines oder mehrerer Konstrukte auf einem oder mehreren Plasmiden, wie in Anspruch 31 definiert; einem oder mehreren aliquoten Teilen einer Zelle, die ein oder mehrere Konstrukte enthält, wie in Anspruch 31 definiert; und einem oder mehreren aliquoten Teilen eines Reagens sowie Gerätschaften, die benötigt werden, um ein Verfahren zur Identifizierung einer Veränderung in Protein-Protein-Wechselwirkungen auszuführen.