JP2008539728A - 膀胱癌バイオマーカーおよびその使用 - Google Patents

膀胱癌バイオマーカーおよびその使用 Download PDF

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Abstract

本発明は、膀胱癌を有さない個体と比較して、膀胱癌を有する固体においてディファレンシャルに発現される新規なバイオマーカーの同定および選択、ならびにそのバイオマーカーの組み合わせの同定および選択に関する。本発明のバイオマーカーの産物に特異的におよび／または選択的にハイブリダイズするポリヌクレオチドおよびタンパク質もまた、膀胱癌を診断する際の使用のための上記ポリヌクレオチドおよびタンパク質を含むキットと同様に、本発明の範囲内に包含される。さらに、個体における疾患の後退をモニターするため、および治療レジメンの効力をモニターするための、本発明のバイオマーカーの産物に特異的におよび／または選択的にハイブリダイズするポリヌクレオチドおよびタンパク質の使用が本発明に包含される。本発明はまた、膀胱癌についての新規な治療標的の同定における本発明のバイオマーカーの産物を使用する方法を提供する。
【選択図】図１

Description

本願は、２００５年５月２日に出願された米国仮出願第６０／６７６，９２１号および２００５年１０月２１日に出願された米国仮出願第６０／７２９，０５６号の恩典を請求し、これらは参照により本明細書に援用される。
表
本願は、それらの全体が参照により本明細書に援用される２枚組のコンパクトディスク（２枚のコンパクトディスク：表−コピー１および表−コピー２）を含む。各コンパクトディスクは同一であり、以下のファイルを含む（表１−７および１１−１２に対応する）：
Figure 2008539728
表 説明 サイズ 作製日 テキストファイル名
１ 膀胱癌バイオマーカー
２ ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ０４／０２０８３６に開示された膀胱癌バイオマーカー
３ 表１の膀胱癌バイオマーカー産物
４ 早期膀胱癌バイオマーカー
５ ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ０４／０２０８３６に開示された早期膀胱癌バイオマーカー
６ 表４の膀胱癌バイオマーカー産物
７ 膀胱癌が早期であるか否かに関わらず、正常から膀胱癌に分化するバイオマーカー
１１ 精巣癌または腎細胞癌のいずれかと比較した場合と、膀胱癌の間で区別されるバイオマーカー
１２ 表１１の膀胱癌バイオマーカー産物

１．発明の分野
本発明は、早期の膀胱癌についてのバイオマーカーを含む新規な膀胱癌のバイオマーカーの同定および選択、ならびに、膀胱癌を有さない個体と比較して、膀胱癌または表在性膀胱癌を有する個体においてディファレンシャルに発現される新規なバイオマーカーの組み合わせの同定および選択を包含する。本発明のバイオマーカーおよびバイオマーカーの組み合わせの産物の発現の測定は、個体が膀胱癌を有すると診断する際に特定の利点を実証する。本発明のバイオマーカーの産物に特異的におよび／または選択的にハイブリダイズするポリヌクレオチドおよびタンパク質がさらに、包含される。本発明はまた、本発明のバイオマーカー遺伝子に結合し、および／またはその活性を調節する化合物の同定において本発明のバイオマーカーの産物を使用する方法を提供する。このような方法を介して同定される化合物は、膀胱癌および膀胱癌の進行を研究するためのアッセイの開発のために有用である。さらに、このような方法を介して同定された化合物は、膀胱癌またはその症状の予防、治療、管理、および／または改善のための予防組成物および治療組成物の開発におけるリード化合物として有用である。
２．発明の背景
膀胱癌は、男性において４番目に多く診断される癌であり、女性において８番目に多く診断される癌である（Greenleeら、Cancer Statistics，２００１）。たばこの煙、芳香族性アミン、石炭燃焼の副産物、塩素化化合物および特定のアルデヒドへの曝露は、人が膀胱癌になるリスクを増加することが示されてきた。膀胱癌それ自体は、死亡率に対して影響が低いが、しかし、他の組織への癌の転移は、死亡のリスクを実質的に増加させる。このようなものとして、膀胱癌を同定する診断方法は有益である。特に、早期の検出および介入を可能にする診断方法は非常に利益になる。
現在使用されている膀胱癌のスクリーニング方法には、膀胱鏡検査の使用；膀胱洗浄および／または尿細胞学的検査が含まれる。これらの方法の各々は、腫瘍または他の膀胱細胞の異常を検出するために、内科医が膀胱および／または膀胱の細胞を観察することを可能にする。しかし、これらの方法は高価であり、そしてそれゆえに、膀胱癌のリスクが増加することが疑われていない人のためのスクリーニング方法としては実用的ではない。別の一般的なスクリーニング技術は、血尿分析（すなわち、尿中の血液の観察）である。血尿は膀胱癌の最も一般的な主訴であるが、これはまた、多くの他の診断の可能性を示し得る（すなわち、低い特異性）。例えば、英国において血尿外来に通院する患者の予測分析で、肉眼的血尿を有する患者の１９．２％のみが、細胞検査によって決定されるように、膀胱癌を有すると決定された。加えて、これらの方法は、早期の膀胱癌を有する患者にとって、特異性および感度がさらに低くなる。
従って、膀胱癌のリスクがある患者の検出を改善するために、比較的安価であり、十分に高感度かつ特異的である膀胱癌のスクリーニングのための方法についての必要性が当該分野において存在する。膀胱癌を有することが判った患者のための早期の介入およびより多くの治療の選択肢を可能にするために、比較的早期の段階で膀胱癌をスクリーニングするためのより高い能力を有する方法についての必要性もまた存在する。
３．発明の要旨
本発明は、新規な膀胱癌のバイオマーカーの同定および選択、ならびに早期（表在性）膀胱癌バイオマーカーの同定および選択、ならびに単純かつ比較的安価な試験を提供して、膀胱癌についてのスクリーニングを改善するためのこれらのバイオマーカーの同定および組み合わせを包含する。本明細書に開示される方法は、これらの方法を使用して同定されるバイオマーカーおよびバイオマーカーの組み合わせの産物とともに、膀胱癌のリスクが増加する患者を同定するために、患者をスクリーニングする際の特定の利点を実証する。理解されるように、本明細書のバイオマーカーの産物を測定するために、同定された本発明のバイオマーカーおよびその誘導体の産物に特異的におよび／または選択的にハイブリダイズ／結合するポリヌクレオチドおよびタンパク質もまた、個体が膀胱癌を有すると診断する際の使用のための上記ポリヌクレオチドおよびタンパク質を含むキットと同様に、本発明の範囲内に包含される。さらに、個体における膀胱癌の進行をモニターするため、および治療レジメンの効力をモニターするための、本発明のバイオマーカーの産物に特異的におよび／または選択的にハイブリダイズするポリヌクレオチドおよびタンパク質の使用が本発明に包含される。本発明はまた、膀胱癌についての新規な治療標的の同定における本発明のバイオマーカーの産物を使用する方法の同定を提供する。
３．１ 定義
以下の定義は、以下に書かれた説明の中で使用される特定の用語のために提供される。
本明細書で使用される場合、「３’末端」という用語は、存在する場合に、３’末端ヌクレオチドが、ポリＡテールに隣接するコード領域または非翻訳領域の末端ヌクレオチドである、ｍＲＮＡの最後の１０００ヌクレオチドまたはその１／３までであるｍＲＮＡの末端をいう。すなわち、ｍＲＮＡの３’末端は、存在する場合、ポリＡテールを含まない。遺伝子の「３’末端」は、遺伝子の内部または３’末端に位置するポリヌクレオチド（二本鎖または一本鎖）をいい、存在する場合、３’非翻訳領域、および遺伝子の３’タンパク質コード領域を含むがこれらに限定されない。３’領域は、８ヌクレオチド長以上の長さで、１０００ヌクレオチド長以下の長さである。３’領域の他の可能な長さには、１０ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、２５ヌクレオチド、５０ヌクレオチド、１００ヌクレオチド、２００ヌクレオチド、４００ヌクレオチド、および５００ヌクレオチドが含まれるがこれらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「５’末端」という用語は、ｍＲＮＡの最初のヌクレオチドで開始して、ｍＲＮＡの最初の１０００ヌクレオチドまたはその１／３までであるｍＲＮＡの末端をいう（ここで、全長のｍＲＮＡはポリＡテールを含まない）。遺伝子の「５’末端」は、遺伝子の内部または５’末端に位置するポリヌクレオチド（二本鎖または一本鎖）をいい、存在する場合、５’非翻訳領域、および遺伝子の５’タンパク質コード領域を含むがこれらに限定されない。５’領域は、８ヌクレオチド長以上の長さで、１０００ヌクレオチド長以下の長さである。５’領域の他の可能な長さには、１０、２０、２５、５０、１００、２００、４００、および５００ヌクレオチドが含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「増幅される」という用語は、核酸配列に適用される場合、好ましくは、ポリメラーゼ連鎖反応（MullisおよびFaloona，１９８７，Methods Enzymol.，１５５：３３５）によって、特定の核酸配列の１つ以上のコピーが、テンプレート核酸から生成されるプロセスをいう。「ポリメラーゼ連鎖反応」または「ＰＣＲ」とは、特定の核酸テンプレート配列を増幅するためのインビトロ方法をいう。ある実施形態において、ＰＣＲ反応は、反復する一連の温度サイクルを含み、典型的には、５０〜１００μｌの容量で実施される。反応混合液は、ｄＮＴＰ（４種のデオキシヌクレオチドｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰの各々）、プライマー、緩衝液、ＤＮＡポリメラーゼ、および核酸テンプレートを含む。ＰＣＲ反応は、第１のプライマーが核酸テンプレート配列の一方の鎖における１つの領域に相補的な配列を含みかつ相補的なＤＮＡ鎖の合成を開始し、第２のプライマーが標的核酸配列の第２の鎖における１つの領域に相補的な配列を含みかつ相補的なＤＮＡ鎖の合成を開始する、ポリヌクレオチドプライマーのセットを提供する工程、および、（ｉ）増幅のために必要とされるプライマーの、テンプレート配列中に含まれる標的核酸へのアニーリング、（ｉｉ）核酸ポリメラーゼがプライマー伸長産物を合成する、プライマーの伸長のＰＣＲサイクリング段階を許容する条件下で、テンプレート依存性重合剤として核酸ポリメラーゼを利用する核酸テンプレート配列を増幅する工程を含むことができる。「ポリヌクレオチドプライマーのセット」または「ＰＣＲプライマーのセット」は、２種、３種、４種またはそれ以上のプライマーを含み得る。１つの実施形態において、エキソ−Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼが、ＰＣＲ反応における核酸テンプレートを増幅するために使用される。増幅の他の方法には、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、ポリヌクレオチド特異的塩基増幅（ＮＳＢＡ）、または当該分野において公知である任意の他の方法が含まれるがこれらに限定されない。
本明細書で使用される場合、ポリペプチドの「アミノ末端」領域とは、ｍＲＮＡの内部または５’末端に位置するポリヌクレオチド配列（二本鎖または一本鎖）によってコードされるポリペプチド配列をいう。本明細書で使用される場合、「アミノ末端」領域とは、ポリペプチドの最初のアミノ酸で開始して、ポリペプチドの最初の３００アミノ酸またはその１／３までであるポリペプチドのアミノ末端をいう。ポリペプチドの「アミノ末端」領域は、３アミノ酸長以上の長さで、３５０アミノ酸長以下の長さである。ポリペプチドの「アミノ末端」領域の他の可能な長さには、５、１０、２０、２５、５０、１００、および２００アミノ酸が含まれるがこれらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「アナログ」という用語は、タンパク質性因子（例えば、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、および抗体）の状況において、第２のタンパク質性因子としての類似のまたは同一の機能を有するが、第２のタンパク質性因子の類似もしくは同一のアミノ酸配列を含む必要はなく、または第２のタンパク質性因子と類似もしくは同一の構造を有する必要はない、タンパク質性因子をいう。類似のアミノ酸配列を有するタンパク質性因子とは、以下の少なくとも１つを満たす第２のタンパク質性因子をいう：（ａ）第２のタンパク質性因子のアミノ酸配列に対して、少なくとも３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または９９％同一であるアミノ酸配列を有するタンパク質性因子；（ｂ）少なくとも５、１０、１５、２０、２５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、または１２５個の連続するアミノ酸残基、または少なくとも１５０個の連続するアミノ酸残基の第２のタンパク質性因子をコードするヌクレオチド配列に対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチドによってコードされるタンパク質性因子；および（ｃ）第２のタンパク質性因子のヌクレオチド配列に対して、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％同一であるヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質性因子。第２のタンパク質性因子に対して類似の構造を有するタンパク質性因子とは、第２のタンパク質性因子に対して、類似の二次構造、三次構造または四次構造を有するタンパク質性因子をいう。タンパク質性因子の構造は当業者に公知の方法によって決定することができ、これには、ペプチド配列決定、Ｘ線結晶解析、核磁気共鳴、円偏光二色性分析、および結晶電子顕微鏡法が含まれるがこれらに限定されない。
２つのアミノ酸配列または２つの核酸配列の同一性割合を決定するために、配列は、最適比較目的のために並べられる（例えば、ギャップが、第２のアミノ酸または核酸配列との最適なアラインメントのために、第１のアミノ酸または核酸配列の配列に導入することができる）。次いで、対応するアミノ酸の位置またはヌクレオチドの位置におけるアミノ酸残基またはヌクレオチドが比較される。第１の配列中の位置が、第２の配列中の対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドによって占められている場合には、それらの分子はその位置において同一である。これらの２つの配列間の同一性割合は、これらの配列によって共有される同一の位置の数の関数である（すなわち、同一性％＝（同一の重複する位置の数／全体の位置の数）×１００％）。１つの実施形態において、２つの配列は同じ長さである。
２つの配列間の同一性割合の同定はまた、数学的アルゴリズムを使用して達成することができる。２つの配列の比較のために利用される数学的アルゴリズムの好ましい非限定的な例は、KarlinおよびAltschul，１９９３，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. ９０：５８７３−５８７７において改変されたような、KarlinおよびAltschul，１９９０，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. ８７：２２６４−２２６８のアルゴリズムである。このようなアルゴリズムは、Altschulら、１９９０，J.Mol.Biol. ２１５：４０３のNBLASTプログラムおよびXBLASTプログラムに組み込まれている。BLASTヌクレオチド検索は、本発明の核酸分子に対して相同性であるヌクレオチド配列を得るために、例えば、スコア＝１００、ワード長＝１２に設定したNBLASTプログラムパラメーターを用いて実施することができる。BLASTタンパク質検索は、本発明のタンパク質分子に対して相同性であるアミノ酸配列を得るために、例えば、スコア＝５０、ワード長＝３に設定したXBLASTプログラムパラメーターを用いて実施することができる。比較目的のためにギャップ付きアラインメントを得るために、ギャップ付きBLASTは、Altschulら、１９９７，Nucleic Acids Res. ２５：３３８９−３４０２に記載されるように利用することができる。代替的には、PSI-BLASTは、分子間の距離が離れた関連性を検出する反復検索を実施するために使用することができる（同上）。BLASTプログラム、ギャップ付きBLASTプログラム、およびPSI-Blastプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例えば、XBLASTおよびNBLAST）のデフォルトパラメーターを使用することができる（例えば、ＮＣＢＩウェブサイトを参照のこと）。配列の比較のために利用される数学的アルゴリズムの別の好ましい非限定的な例は、MyersおよびMiller，１９８８，CABIOS ４：１１−１７のアルゴリズムである。このようなアルゴリズムは、ＧＣＧ配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であるALIGNプログラム（バージョン２．０）に組み込まれている。アミノ酸配列を比較するためにALIGNプログラムを利用する場合、ＰＡＭ１２０重み残基表、１２のギャップ長ペナルティー、４のギャップペナルティーを使用することができる。２つの配列間の同一性割合は、ギャップを許容することを伴い、または伴わずに、上記のものと同様の技術を使用して決定することができる。同一性割合を計算する際に、典型的には、正確な一致のみが計数される。
本明細書で使用される場合、「アナログ」という用語は、非タンパク質性アナログの状況において、第１の有機分子または無機分子と類似のまたは同一の機能を有し、かつ第１の有機分子または無機分子と類似の構造を有する、第２の有機分子または無機分子をいう。
本明細書で使用される場合、「バイオマーカー」という用語は、膀胱癌または膀胱癌の１つの段階を有さない個体（しかしこの個体は他の疾患を有する場合がある）と比較して、膀胱癌または膀胱癌の１つの段階を有する個体においてディファレンシャルに発現される遺伝子をいい、この用語は、膀胱癌を有さない個体と比較して、表在性膀胱癌を有する個体においてディファレンシャルに発現される遺伝子を含み得る。
「バイオマーカー特異的プライマー」という用語は、本明細書で使用される場合、本発明のバイオマーカーの１種以上のＲＮＡ産物の一部に対して相補的である二本鎖ＤＮＡを産生し得るプライマーのセットをいう。例えば、これらのプライマーは、伸長産物を作製するために本発明のバイオマーカーに相補的なＲＮＡ、ｃＤＮＡまたはＥＳＴに選択的にハイブリダイズすることができる配列である第１のプライマー、および本発明のバイオマーカーに相補的な二本鎖ＤＮＡを産生するために使用される、伸長産物に選択的にハイブリダイズすることが可能である第２のプライマーを含み得る。
「バイオマーカー特異的プローブ」という用語は、本明細書で使用される場合、固有のバイオマーカーのＲＮＡ産物に選択的かつ特異的にハイブリダイズするプローブをいう。１つの実施形態において、バイオマーカー特異的プローブは、フルオロホアまたはクエンチャーを有するプローブ、例えば、TaqMan（登録商標）プローブまたはMolecular Beacon（登録商標）プローブであり得る。別の実施形態において、バイオマーカー特異的プローブは、アレイに結合され、そして固有のバイオマーカーの１つ以上のＲＮＡ産物（または当該ＲＮＡ産物に対応するｃＤＮＡ、ＥＳＴまたはＰＣＲ）に選択的かつ特異的にハイブリダイズするプローブである。バイオマーカー特異的プローブはオリゴヌクレオチドプローブを含み得、またより長いプローブ（例えば、１００ヌクレオチド、１５０ヌクレオチド、２００ヌクレオチド、２５０ヌクレオチド、３００ヌクレオチド、３５０ヌクレオチド、４００ヌクレオチド、４５０ヌクレオチド、５００ヌクレオチドなど）であり得る。
本明細書で使用される場合、「膀胱癌」という用語は、膀胱の内側を覆う細胞が、腫瘍を形成する細胞の塊を生じるそれらの増殖を調節する能力を喪失している疾患をいう。本明細書で使用される場合、「早期膀胱癌」または「表在性膀胱癌」という用語は、非侵襲性膀胱腫瘍をいう（例えば、ＡＪＣＣガイドラインに従って決定されるＴａ型またはＴｉａ型）（Ｈｅｒｒら、２００１）。
本明細書で使用される場合、「血液核酸サンプル」という用語は、血液由来の核酸をいい、これは、全血、遠心分離した溶解血、無血清全血または末梢血白血球（ＰＢＬ）を含む分画した血液もしくは本明細書に記載されるような他の血液の画分を含み得る。全血とは、未分画の血液を意味し、これは一滴の血液を含み、ここで、一滴の血液には、５μｌ、１０μｌ、１５μｌ、２０μｌ、２５μｌ、３０μｌの容量が含まれる。遠心分離した溶解血または「溶解血」とは、本明細書に記載されるように、溶解緩衝液と混合され、かつ遠心分離された未分画の血液を意味する（実施例２を参照のこと）。無血清血液とは、本明細書に記載されるように、血清または血漿が遠心分離によって取り除かれている未分化の血液を意味する（実施例２を参照のこと）。好ましくは、血液核酸サンプルは、全血または遠心分離した溶解血であり、総ＲＮＡ、ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡに対応する核酸、例えば、ｃＤＮＡが当該血液から単離される。核酸サンプルはまた、総ＲＮＡ、ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡに由来するＰＣＲ産物を含み得る。
本明細書で使用される場合、ポリペプチドの「カルボキシ末端」領域とは、ｍＲＮＡの内部またはその３’末端に位置するポリヌクレオチド配列（二本鎖または一本鎖）によってコードされるポリペプチド配列をいう。本明細書で使用される場合、「カルボキシ末端」領域とは、ポリペプチドの最後のアミノ酸から３００アミノ酸またはそこから１／３までであるポリペプチドのカルボキシ末端をいう。「３’末端」は、存在する場合、ポリＡテールを含まない。ポリペプチドの「カルボキシ末端」領域は、３アミノ酸長以上の長さで、３５０アミノ酸長以下の長さである。ポリペプチドの「カルボキシ末端」領域の他の可能な長さには、５、１０、２０、２５、５０、１００アミノ酸および２００アミノ酸が含まれるがこれらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「組織サンプル」という用語は、血液ではなく、膀胱組織、脳組織、心臓組織、肺組織、リンパ節などを含み得る組織に由来する細胞をいう。「組織核酸サンプル」は、総ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、またはＲＮＡに対応する核酸、例えば、ｃＤＮＡである。組織核酸サンプルはまた、総ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、またはｃＤＮＡに由来するＰＣＲ産物を含み得る。
本明細書で使用される場合、「本発明のバイオマーカーの組み合わせ」という用語は、表１、表３、表４、表６、表７および表１０、表１１、または表１２に開示されるような任意の１つ以上のバイオマーカーをいう。本発明のバイオマーカーの組み合わせはまた、当該組み合わせのバイオマーカーの少なくとも１つが表１からのものである限り、表１および表２に開示されるような任意の２つ以上のバイオマーカーの任意の組み合わせを含む。本発明のバイオマーカーの組み合わせはまた、当該組み合わせのバイオマーカーの少なくとも１つが表４からのものである限り、表４および表５に開示されるような任意の２つ以上のバイオマーカーの任意の組み合わせを含む。本発明のバイオマーカーの組み合わせはまた、当該組み合わせのバイオマーカーの少なくとも１つが表１１からのものである限り、表１１および表２に開示されるような任意の２つ以上のバイオマーカーの任意の組み合わせを含む。
本明細書で使用される場合、「化合物」および「因子」という用語は交換可能に使用される。
本明細書で使用される場合、「から本質的に構成される」とは、膀胱癌を診断もしくはスクリーニングするため、および／または表在性膀胱癌を診断もしくはスクリーニングするために有用である最大数のバイオマーカーをいう。１つの実施形態において、膀胱癌または表在性膀胱癌の診断のためのバイオマーカーは、表１のバイオマーカーの少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、１００個、１２５個、１５０個、１７５個、２００個、２２５個、２５０個まで、またはすべてのいずれかから本質的に構成される。別の実施形態において、膀胱癌の診断のためのバイオマーカーは、表７のバイオマーカーの少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、１００個、１２５個、１５０個、１７５個、２００個まで、またはすべてのいずれかから本質的に構成される。別の実施形態において、膀胱癌の診断のためのバイオマーカーは、表１０のバイオマーカーの少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個まで、またはすべてのいずれかから本質的に構成される。別の実施形態において、膀胱癌の診断のためのバイオマーカーは、ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ０４／０２０８３６に開示され、かつ表２に提供されるバイオマーカーの少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、または１０個、１５個、２０個、３０個、４０個、５０個、１００個、２００個、３００個、４００個、５００個、１０００個、１５００個、２０００個、２５００個、３０００個、３５００個、４０００個まで、またはすべてのいずれかと組み合わせた、表１のバイオマーカーの少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１３個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、１００個、１２５個、１５０個、１７５個、２００個までのいずれかから本質的に構成される。別の実施形態において、表在性または早期の膀胱癌の診断のためのバイオマーカーは、表４のバイオマーカーの少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、１００個、１２５個、１５０個、１７５個、２００個、２２５個、２５０個、２７５個、３００個、３２５個、３５０個、３７５個、４００個、４２５個、４５０個、４７５個、５００個まで、またはすべてのいずれかから本質的に構成される。別の実施形態において、表在性膀胱癌の診断のためのバイオマーカーは、ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ０４／０２０８３６に開示され、かつ表５に提供されるバイオマーカーの少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、または１０個、１５個、２０個、３０個、４０個、５０個、１００個、１５０個、２００個、２５０個、３００個、３５０個、４００個、４５０個、５００個、１０００個、１５００個、２０００個、２５００個まで、またはすべてのいずれかと組み合わせた、表４のバイオマーカーの少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、１００個、１２５個、１５０個、１７５個、２００個、２２５個、２５０個、２７５個、３００個、３２５個、３５０個、３７５個、４００個、４２５個、４５０個、４７５個、５００個までのいずれかから本質的に構成される。別の実施形態において、膀胱癌および／または表在性膀胱癌の診断のためのバイオマーカーは、表１１のバイオマーカーの少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、１００個、１２５個、１５０個、１７５個、２００個、２２５個、２５０個まで、またはすべてのいずれかから本質的に構成される。別の実施形態において、膀胱癌および／または表在性膀胱癌の診断のためのバイオマーカーは、表１２のバイオマーカーの少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、１００個、１２５個、１５０個、１７５個、２００個、２２５個、２５０個まで、またはすべてのいずれかから本質的に構成される。
本明細書で使用される場合、「対照」または「対照サンプル」という用語は、本発明の状況において、当業者に公知の技術（例えば、尿中で核マトリックスタンパク質（ＮＭＰ２２（登録商標）と呼ばれる）のレベルの上昇を検出するためのＮＭＰ２２（登録商標）BladderChek（登録商標）、静脈内腎盂撮影（pyloegram）（ＩＶＰ）画像処理、ＣＴスキャン、ＭＲＩスキャン、骨スキャンまたは超音波など）を使用して、前立腺癌を有するとして、表在性癌膀胱癌を含む膀胱癌の１つ以上の段階を有するとして；膀胱癌を有さずまたは膀胱癌の段階（例えば、表在性膀胱癌）を有さないとして分類される、１つ以上の組織核酸サンプルおよび／または血液核酸サンプルおよび／または１例以上の個体をいう。対照または対照サンプルという用語はまた、正常（膀胱癌を有さない）として診断された個体、膀胱癌を有するとして診断された個体、または膀胱癌の１つの段階を有するとして診断された個体の１つ以上のサンプルから導き出されたデータの組み合わせであり得る。当業者によって理解されるように、対照という用語は、実験の状況において使用され、所望の比較に依存する。本明細書で使用される場合、「対照」という用語は、予防剤または治療剤をスクリーニングする状況において、他の条件がそれに対して比較されるアッセイまたは方法論のための基準または参照をいう。
本明細書で使用される場合、「データ」または「バイオマーカーデータ」は、一般的には、バイオマーカーによってコードされるＲＮＡおよびタンパク質のいずれかまたは両方を含むバイオマーカーの産物の豊富さまたはレベルを反映するデータをいう。
本明細書で使用される場合、「誘導体」という用語は、タンパク質性因子（例えば、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、および抗体）の状況において、１つ以上のアミノ酸残基の置換、欠失、および／または付加を行うことによって変化したアミノ酸配列を含むタンパク質性因子をいう。「誘導体」という用語はまた、本明細書で使用される場合、すなわち、タンパク質性因子への任意の型の分子の共有結合によって修飾されたタンパク質性因子をいう。例えば、しかし限定的なものではなく、抗体は、例えば、グリコシル化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、公知の保護基／封鎖基による誘導体化、タンパク質分解性切断、細胞リガンドまたは他のタンパク質への連結などによって修飾されてもよい。タンパク質性因子の誘導体は、特異的化学切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝的合成などを含むがこれらに限定されない、当業者に公知の技術を使用する化学修飾によって産生されてもよい。さらに、タンパク質性因子の誘導体は、１つ以上の非古典的なアミノ酸を含み得る。タンパク質性因子の誘導体は、それが由来したタンパク質性因子と類似のまたは同一の機能を有する。
本明細書で使用される場合、「誘導体」という用語は、非タンパク質性因子の状況において、第１の有機分子または無機分子の構造に基づいて形成される第２の有機分子または無機分子をいう。有機分子の誘導体には、例えば、ヒドロキシル基、メチル基、エチル基、カルボニル基またはアミン基によって修飾される分子が含まれるがこれに限定されない。有機分子はまた、エステル化、アルキル化、および／またはリン酸化されてもよい。
本明細書で使用される場合、本発明の１つの態様に従う「膀胱癌の診断」または「膀胱癌診断」「膀胱癌のスクリーニング」「膀胱癌の段階のスクリーニング」は、人が膀胱癌を有し、および／または表在性膀胱癌を有する可能性を決定するプロセスをいう。この用語は、膀胱癌または膀胱癌の段階を診断またはスクリーニングするための旧来の医学的診断技術、ならびに本発明によって包含されるような診断方法およびスクリーニング方法の両方をいう。膀胱癌を診断するための旧来の医学的診断技術には、理学的検査および病歴、尿検査を含む医学的説明、ならびに、尿中の核マトリックスタンパク質（ＮＭＰ２２（登録商標）と呼ばれる）のレベルの上昇を検出するためのＮＭＰ２２（登録商標）BladderChek（登録商標）、静脈内腎盂撮影（pyloegram）（ＩＶＰ）画像処理、ＣＴスキャン、ＭＲＩスキャン、骨スキャンまたは超音波などを含み得る適切な臨床検査が含まれる。特定の実施形態において、「前立腺癌の診断」とは、２つの選択肢：例えば、個体が膀胱癌または膀胱癌の特定の段階を有すること、または個体が膀胱癌または膀胱癌の特定の段階を有さないことのいずれかの決定をいう。特定の実施形態において、「膀胱癌の診断またはスクリーニング」という用語は、例えば、「膀胱癌の診断」については、個体が膀胱癌を有することの可能性の決定、または個体が膀胱癌を有さないことの可能性の決定の２つの選択肢のいずれかの決定をいう。「表在性膀胱癌の診断」については、個体が表在性膀胱癌を有すること、または膀胱癌を有さないことの可能性の決定である。別の特定の実施形態において、「診断」とは、１つの選択肢が、個体が膀胱癌を有すかまたは膀胱癌を有さないかを十分な程度の確実性をもって決定することができない（例えば、結果が受け入れ難い決定）、３つの選択肢のいずれかとしての決定をいう。
別の実施形態において、「膀胱癌の診断またはスクリーニング」は、個体が、膀胱癌もしくは膀胱癌の特定の段階を有するか、または膀胱癌もしくは膀胱癌の特定の段階を有さないとして特徴付けることができるかに関して、十分な程度の確実性をもって決定することができない選択肢を含むことができる。当業者によって理解されるように、この状況において、「十分な程度の確実性」は、診断の感度と特異性の両方についての医学的要件に依存する。より特定には、十分な程度の確実性には、５０％より高い感度および／または特異性、６０％より高い感度および／または特異性、７０％より高い感度および／または特異性、８０％より高い感度および／または特異性、９０％より高い感度および／または特異性、ならびに１００％の感度および／または特異性が含まれる。
本明細書で使用される場合、「ディファレンシャルな発現」という用語は、ＲＮＡまたはタンパク質の量またはレベルによって測定されるような、本発明の１種以上のバイオマーカーのＲＮＡおよび／またはタンパク質の産物の発現レベルの違いをいう。ＲＮＡに関しては、これは、第２のサンプル中のｍＲＮＡおよび／またはｍＲＮＡの１種以上のスプライシング変異体を含むＲＮＡの量またはレベルによって測定される、同じ１種以上のバイオマーカーの発現レベルと比較されるような、１つのサンプル中のバイオマーカーのｍＲＮＡおよび／またはｍＲＮＡの１種以上のスプライシング変異体のレベルの違いを含み得る。「ディファレンシャルに発現される」または「ディファレンシャルな発現」はまた、本発明のバイオマーカーまたは複数のバイオマーカーの１種以上のタンパク質変異体を含むタンパク質発現の量またはレベルと比較されるような、サンプルまたはサンプルの集団中の本発明のバイオマーカーによってコードされるタンパク質または１種以上のタンパク質変異体の測定を含み得る。ディファレンシャルな発現は、本明細書に記載され、かつ当業者によって理解されるように決定することができる。「ディファレンシャルに発現される」または「発現レベルの変化」という用語は、第２のサンプル中のバイオマーカーの所定の産物の測定可能な発現レベルと比較されるような、１つのサンプル中のＲＮＡの量および／またはタンパク質の量によって測定されるようなバイオマーカーの所定の産物の測定可能な発現レベルの増加または減少をいう。第１のサンプルおよび第２のサンプルは、異なる患者からのものである必要はないが、異なる時点で取られた同じ患者からのサンプルであり得る。「ディファレンシャルに発現される」または「発現レベルの変化」という用語はまた、サンプルの第２の集団中のバイオマーカーの測定可能な発現レベルと比較されるような、サンプルの集団中の所定のバイオマーカーの測定可能な発現レベルの増加または減少をいうことができる。本明細書で使用される場合、「ディファレンシャルに発現される」とは、単一のサンプルに言及する場合、対照集団の所定のバイオマーカーの平均発現レベルと比較されるような、当該サンプル中の所定のバイオマーカーの発現レベルの比率を使用して測定することができ、ここで、その比率は１．０に等しくない。ディファレンシャルに発現されるはまた、第２のサンプルの集団と比較されるような第１のサンプルの集団または単独のサンプルを、サンプルの１つの集団と、発現レベルの比率もしくはｐ−値のいずれかを使用して比較することを含むために使用することができる。ディファレンシャルな発現の統計学的な意味の尺度であるｐ−値を使用する場合、ｈｎＲＮＡおよびｍＲＮＡを含む核酸転写物は、０．３、０．２、０．１未満、０．０５未満、０．０１未満、０．００５未満、０．００１未満などのｐ値が統計学的に有意であると見なされる場合に、第１の集団と第２の集団の間でディファレンシャルに発現されると同定される。遺伝子産物の発現レベルの比率に基づいてディファレンシャルな発現を決定する場合、ＲＮＡまたはタンパク質の遺伝子産物は、第１のサンプル中のそのＲＮＡまたはタンパク質産物レベルの、第２のサンプル中のそれと比較した比率が１．０よりも大きいかまたは１．０未満である場合に、ディファレンシャルに発現される。例えば、遺伝子のＲＮＡまたはタンパク質産物の１よりも大きな比率、例えば、１．２、１．５、１．７、２、３、４、１０、２０、または１未満の比率、例えば、０．８、０．６、０．４、０．２、０．１、０．０５が、ディファレンシャルな発現を示す。本発明の別の実施形態において、ｈｎＲＮＡおよびｍＲＮＡを含む核酸転写物は、核酸集団中の第１の転写物の発現の平均レベルの、第２の集団中の発現のその平均レベルと比較した場合の比率が１．０より大きいか、または１．０未満である場合に、ディファレンシャルに発現される。例えば、１よりも大きな比率、例えば、１．２、１．５、１．７、２、３、４、１０、２０、または１未満の比率、例えば、０．８、０．６、０．４、０．２、０．１、０．０５が、ディファレンシャルな発現を示す。本発明の別の実施形態において、ｈｎＲＮＡおよびｍＲＮＡを含む核酸転写物は、第１のサンプル中の発現のそのレベルの、第２の集団中の平均と比較した場合の比率が１．０より大きいか、または１．０未満である場合に、ディファレンシャルに発現され、そして例えば、１よりも大きな比率、例えば、１．２、１．５、１．７、２、３、４、１０、２０、または１未満の比率、例えば、０．８、０．６、０．４、０．２、０．１、０．０５を含む。「ディファレンシャルに増加した発現」とは、標準、例えば、第２の集団の発現レベルの平均と比較して、１．１倍、１．２倍、１．４倍、１．６倍、１．８倍、またはそれ以上をいう。「ディファレンシャルに減少した発現」とは、標準、例えば、第２の集団の発現レベルの平均と比較して、１．０倍未満、０．８倍未満、０．６倍未満、０．４倍未満、０．２倍未満、０．１倍未満、またはそれ以下をいう。
本明細書で使用される場合、「薬効」とは、薬物の有効性をいう。「薬効」は、通常、薬物で治療されたかまたは治療されている患者の臨床的な反応によって測定される。薬物は、それが、所望の臨床的な結果、例えば、本発明に記載されるような変形性関節症の症状の緩和または変形性関節症の進行の予防を達成する場合に、高度の効力を有すると見なされる。吸収される薬物の量は、患者の反応を予測するために使用されてもよい。通則的には、薬物の用量が増加にともない、最大の所望の効果に達するまで、患者におけるより高い効果が観察されることである。最大点に達した後でより多くの薬物が投与される場合、通常は副作用が増加する。
本明細書で使用される場合、「有効量」という用語は、膀胱癌またはその１つ以上の症状の進行および／または重度を低下または改善するため、膀胱癌またはその１つ以上の症状の発生、再発、または開始を予防するため、あるいは別の治療の予防効果または治療効果を増強または改善するために十分である化合物の量をいう。
本明細書で使用される場合、「フラグメント」は、ポリペプチドまたはタンパク質のアミノ酸配列の少なくとも５個の連続するアミノ酸残基、少なくとも１０個の連続するアミノ酸残基、少なくとも１５個の連続するアミノ酸残基、少なくとも２０個の連続するアミノ酸残基、少なくとも２５個の連続するアミノ酸残基、少なくとも４０個の連続するアミノ酸残基、少なくとも５０個の連続するアミノ酸残基、少なくとも６０個の連続するアミノ酸残基、少なくとも７０個の連続するアミノ酸残基、少なくとも８０個の連続するアミノ酸残基、少なくとも９０個の連続するアミノ酸残基、少なくとも１００個の連続するアミノ酸残基、少なくとも１２５個の連続するアミノ酸残基、少なくとも１５０個の連続するアミノ酸残基、少なくとも１７５個の連続するアミノ酸残基、少なくとも２００個の連続するアミノ酸残基、または少なくとも２５０個の連続するアミノ酸残基のアミノ酸配列を含むペプチドまたはポリペプチドをいう。特定の実施形態において、タンパク質またはポリペプチドのフラグメントは、そのタンパク質またはポリペプチドの少なくとも１つの機能を保持する。別の実施形態において、タンパク質またはポリペプチドのフラグメントは、そのタンパク質またはフラグメントの少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、または５つの機能を保持する。好ましくは、抗体のフラグメントは、抗原に免疫特異的に結合する能力を保持する。
本明細書で使用される場合、「融合タンパク質」という用語は、第１のタンパク質もしくはポリペプチドもしくはそのフラグメント、またはその機能的フラグメント、またはそのアナログもしくは誘導体のアミノ酸配列、および異種タンパク質、ポリペプチド、またはペプチド（すなわち、第１のタンパク質またはそのフラグメント、アナログ、もしくは誘導体とは異なる、第２のタンパク質またはポリペプチド、またはそのフラグメント、アナログ、もしくは誘導体）のアミノ酸配列を含むポリペプチドをいう。１つの実施形態において、融合タンパク質は、異種タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドに融合された予防剤または治療剤を含む。この実施形態に従って、異種タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドは、異なる型の予防剤または治療剤であってもよく、そうでなくてもよい。
本明細書で使用される場合、「遺伝子発現パターン」、「遺伝子発現プロフィール」は交換可能に使用され、本発明の２つ以上のバイオマーカーのＲＮＡまたはタンパク質産物の発現のパターンを含む。例えば、ＲＮＡ産物への言及を有する遺伝子発現パターンまたはプロフィールはまた、「核酸アレイ発現プロフィール」と呼ぶことが可能であり、非膀胱癌個体と比較した場合に、膀胱癌または早期膀胱癌の個体のいずれかを区別するための、アレイ上で複数の核酸プローブにハイブリダイズされる複数の標的核酸配列のハイブリダイゼーションを構成する。「遺伝子発現パターン」、「遺伝子発現プロフィール」はまた、タンパク質のレベルを測定するための当該分野において公知の任意の方法論によって決定されるような、２つ以上の本発明のバイオマーカーに対応する当該タンパク質の豊富さのレベルのパターンをいう。例えば、このパターンは、パターンの数学的表現、例えば、数式、ベクトルなどであり得る。
本明細書で使用される場合、「にハイブリダイズする」および「ハイブリダイゼーション」という用語は、相補的核酸との配列特異的な非共有結合的な結合相互作用、例えば、標的核酸とアレイ上の核酸メンバーとの間の相互作用をいう。
本明細書で使用される場合、「免疫グロブリン」という用語は、免疫グロブリン遺伝子によって実質的にコードされている１つ以上のポリペプチドまたはその抗原結合フラグメントから成るタンパク質をいう。認められているヒト免疫グロブリン遺伝子には、カッパ、ラムダ、アルファ（ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）、ガンマ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、デルタ、イプシロン、およびミュー定常領域遺伝子、ならびに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が含まれる。全長免疫グロブリン「軽鎖」（約２５Ｋｄまたは２１４アミノ酸）は、ＮＨ２末端が可変領域遺伝子によってコードされ（約１１０アミノ酸）、ＣＯＯＨ末端がカッパまたはラムダ定常領域によってコードされる。全長免疫グロブリン「重鎖」（約５０Ｋｄまたは４４６アミノ酸）は、可変領域遺伝子（約１１６アミノ酸）および他の上述の定常領域遺伝子の１つ、例えば、ガンマ（約３３０アミノ酸をコードする）によって同様にコードされる。
本明細書で使用される場合、「併用して」という用語は、治療に関する場合、１つより多くの治療（例えば、１つより多くの予防剤および／または治療剤）の使用をいう。「併用して」という用語の使用は、治療（例えば、予防剤および／または治療剤）が被験体に投与される順番を制限しない。第１の治療（例えば、第１の予防剤および／または治療剤）は、第２の治療（例えば、第２の予防剤および／または治療剤）の投与の前に（例えば、５分前、１５分前、３０分前、４５分前、１時間前、２時間前、４時間前、６時間前、１２時間前、２４時間前、４８時間前、７２時間前、９６時間前、１週間前、２週間前、３週間前、４週間前、５週間前、６週間前、８週間前、または１２週間前）、それと同時に、またはその後に（例えば、５分後、１５分後、３０分後、４５分後、１時間後、２時間後、４時間後、６時間後、１２時間後、２４時間後、４８時間後、７２時間後、９６時間後、１週間後、２週間後、３週間後、４週間後、５週間後、６週間後、８週間後、または１２週間後）、被験体に投与することができる。
本明細書で使用される場合、「疾患を示す」または「膀胱癌を示す」という用語は、発現パターンに言及する場合、膀胱癌および／または早期の膀胱癌の診断である発現パターンを含み、個体が膀胱癌および／または早期の膀胱癌を有する可能性を増加するパターンを含み得る。
本明細書で使用される場合、遺伝子の「内部コード領域」という用語は、本明細書に定義されるような遺伝子の５’領域と３’領域の間に位置するポリヌクレオチド（二本鎖または一本鎖）をいう。「内部コード領域」は、８ヌクレオチド長以上の長さで、１０００ヌクレオチド長以上の長さであり得る。「内部コード領域」の他の可能な長さには、１０ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、２５ヌクレオチド、５０ヌクレオチド、１００ヌクレオチド、２００ヌクレオチド、４００ヌクレオチド、および５００ヌクレオチドが含まれるがこれらに限定されない。５’領域、３’領域および内部領域は重複しておらず、連続してもよいが必ずしもその必要はなく、対応する遺伝子の全長まで加えられてもよいが必ずしもその必要はない。
本明細書で使用される場合、ポリペプチドの「内部ポリペプチド領域」という用語は、本明細書に定義されるようなポリペプチドのアミノ末端領域とカルボキシ末端領域の間に位置するポリペプチド配列をいう。ポリペプチドの「内部ポリペプチド領域」は、３アミノ酸長以上の長さで、３５０アミノ酸長以上の長さであり得る。ポリペプチドの「内部ポリペプチド領域」の他の可能な長さには、５、１０、２０、２５、５０、１００、および２００アミノ酸が含まれるがこれらに限定されない。
アミノ末端領域、カルボキシ末端領域および内部ポリペプチド領域は重複しておらず、連続してもよいが必ずしもその必要はなく、対応するポリペプチドの全長まで加えられてもよいが必ずしもその必要はない。
本明細書で使用される場合、「単離された」または「精製された」は、核酸に関連して使用される場合、天然に存在する配列がその通常の細胞（例えば、染色体）環境から取り除かれ、または非天然環境で合成される（例えば、人工的に合成される）ことを意味する。従って、「単離された」または「精製された」配列は、無細胞溶液中にあるか、または異なる細胞環境に配置される可能性がある。「精製された」という用語は、その核酸が存在する唯一のヌクレオチドであることを意味しないが、その核酸は、それに天然に付随する非ヌクレオチド物質を本質的に含まず（約９０〜９５％純粋）、従って、単離された染色体から区別される。
本明細書で使用される場合、「単離された」または「精製された」という用語は、タンパク質因子（例えば、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質または抗体）の状況において、細胞物質を実質的に含まず、ある実施形態において、それが由来する細胞もしくは組織供給源からの異種タンパク質性因子（すなわち、夾雑タンパク質）を実質的に含まず、または化学合成された場合には、化学前駆物質もしくは他の化学物質を実質的に含まないタンパク質性因子をいう。「細胞物質を実質的に含まない」という言葉は、タンパク質性因子が、それがそこから単離されまたは組み換えにより産生された細胞の細胞成分から分離されている、タンパク質性因子の調製物を含む。従って、細胞材料を実質的に含まないタンパク質性因子には、約３０％未満、約２０％未満、約１０％未満、または約５％未満（乾燥重量）の異種タンパク質性因子（例えば、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、または抗体；「夾雑タンパク質」とも呼ばれる）を有するタンパク質性因子の調製物が含まれる。タンパク質性因子が組み換えにより産生される場合、これはまた、好ましくは、培養培地を実質的に含まず、すなわち、培養培地が、タンパク質調製物の体積の約２０％、１０％、または５％未満を表す。タンパク質性因子が化学合成によって産生される場合、このタンパク質性因子は、好ましくは、化学前駆物質または他の化学物質を実質的に含まず、すなわち、このタンパク質性因子は、このタンパク質性因子の合成に含まれる化学前駆物質または他の化学物質から分離されている。従って、タンパク質性因子のこのような調製物は、約３０％未満、約２０％未満、約１０％未満、約５％未満（乾燥重量）の、目的のタンパク質性因子以外の化学前駆物質または他の化学物質を有する。
本明細書で使用される場合、「発現レベル」という用語は、当業者によって公知である方法によって決定されるような、遺伝子に対応する所定の核酸またはタンパク質の量の決定をいう。本発明のバイオマーカーに対応するＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｍＲＮＡ、またはｍＲＮＡのスプライシング変異体に関しては、発現レベルは、ハイブリダイゼーション、ならびにSYBR（登録商標）Green、TaqMan（登録商標）およびMolecular Beacons技術の使用を含む定量リアルタイムＲＴ−ＰＣＲのような他の測定によって決定することができる。本明細書で使用される場合、ディファレンシャルな発現レベルの決定は、例えば、ノーザンブロットまたはウェスタンブロットによる分析を行うことによって、所定の核酸またはタンパク質の量の間の違いの目視的検査を含み得る。
本明細書で使用される場合、「リガンド」とは、本発明のバイオマーカーの遺伝子の１つによってコードされるポリペプチドに特異的に結合する分子である。リガンドは、核酸（ＲＮＡまたはＤＮＡ）、ポリペプチド、ペプチドまたは化学化合物であり得る。本発明のリガンドは、ペプチドリガンド、例えば、骨格ペプチド、直鎖状ペプチド、または環状ペプチドであり得る。好ましい実施形態において、ポリペプチドリガンドは抗体である。この抗体は、ヒト抗体、キメラ抗体、組み換え抗体、ヒト化抗体、モノクローナル抗体もしくはその抗原結合フラグメント、またはポリクローナル抗体であり得る。この抗体は、インタクトな免疫グロブリン、例えば、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＭまたはそのサブタイプであり得る。この抗体は、機能的部分（例えば、第２の異なるポリペプチド、治療薬物、細胞傷害性薬剤、検出可能部分、または固相担体であってもよい、生物学的機能または化学的機能を有する化合物）にコンジュゲート可能である。ポリペプチドリガンド、例えば、本発明の抗体は、高い親和性および特異性で、バイオマーカーの遺伝子の１つによってコードされるポリペプチドと相互作用する。例えば、ポリペプチドリガンドは、少なくとも１０７Ｍ−１、好ましくは、少なくとも１０８Ｍ−１、１０９Ｍ−１、または１０１０Ｍ−１の親和性定数で、バイオマーカーの遺伝子の１つによってコードされるポリペプチドに結合する。
本明細書で使用される場合、「大多数」という用語は、組成物の全体の数の５０％より多く（例えば、５１％、６０％、または７０％、または８０％または９０％または１００％まで）を表す数をいう。「大多数」という用語は、アレイに言及する場合、アレイの固体基質と安定して結合する、全体の核酸の５０％より多く（例えば、５１％、６０％、または７０％、または８０％または９０％または１００％まで）を意味する。
本明細書で使用される場合、「管理する」、「管理すること」および「管理」とは、被験体が変形性関節症の治癒をもたらさない治療（例えば、予防剤または治療剤）から導き出される有益な効果をいう。特定の実施形態において、被験体は、変形性関節症の進行または悪化を予防するために、１つ以上の治療を投与されて変形性関節症を「管理する」。
本明細書で使用される場合、「ｍＲＮＡの完全性」とは、組織サンプルまたは血液サンプルのいずれかから抽出されるｍＲＮＡの品質をいう。１つの実施形態において、ｍＲＮＡの完全性は、当該分野において周知である方法によって、例えば、ＲＮＡアガロース電気泳動（例えば、Ausubelら、John Weley & Sons,Inc.，１９９７，Current Protocols in Molecular Biology）によって調べられる場合に、ＲＮＡが分解しているか否かを調べることによって決定される。好ましくは、ｍＲＮＡサンプルは、それがそこから抽出される軟骨または血液サンプルの遺伝子発現レベルを本当に表すために良好な完全性を有する（例えば、１０％未満、好ましくは５％未満、およびより好ましくは１％未満のｍＲＮＡが分解されている）。
本明細書で使用される場合、「非応答性」および「難治性」という用語は、膀胱癌の１つ以上の症状を治療および／または軽減するために臨床的に十分ではない、現在利用可能な治療で治療された患者を説明する。
本明細書で使用される場合、「正常」とは、尿中の血液を含む、膀胱癌またはその症状のいかなる証拠も示しておらず、および膀胱癌を有するか、または彼らが膀胱癌を有するかもしれない可能性を有すると診断されていない、個体または個体の群をいう。好ましくは、当該「正常」とは、膀胱癌を有するリスクが増加してない個体または個体の群をいう。加えて、好ましくは、当該正常個体は、膀胱癌に影響を与える薬剤投与を行っておらず、いかなる他の疾患を有するとも診断されていない。より好ましくは、正常個体は、試験サンプルと比較して、同様の性別、年齢を有する。「正常」はまた、本発明に従って、正常個体から単離されたサンプルをいい、正常個体から単離された総ＲＮＡまたはｍＲＮＡを含む。正常個体から採取されたサンプルは、組織サンプルから単離されたＲＮＡを含み得る。
本明細書で使用される場合、「核酸」は、「ポリヌクレオチド」という用語と交換可能であり、一般的に、未修飾ＲＮＡもしくはＤＮＡ、または修飾ＲＮＡもしくはＤＮＡ、またはその任意の組み合わせであり得る、任意のポリヌクレオチドまたはデオキシポリヌクレオチドをいう。「核酸」には、非限定的に、一本鎖または二本鎖の核酸が含まれる。本明細書で使用される場合、「核酸」という用語はまた、１つ以上の修飾塩基を含む上記のようなＤＮＡまたはＲＮＡを含む。従って、安定性のためまたは他の理由のために修飾されたバックボーンを有するＤＮＡまたはＲＮＡは、「核酸」である。「核酸」という用語は、これが本明細書で使用される場合、このような化学的に、酵素によりまたは代謝により修飾された核酸の型、ならびにウイルスおよび細胞、例えば、単純および複雑な細胞に特異的なＤＮＡおよびＲＮＡの化学型を包含する。「核酸」または「核酸配列」はまた、一本鎖または二本鎖のＲＮＡまたはＤＮＡまたはその任意の組み合わせを含んでもよく、本発明のある実施形態に従って、発現配列タグ（ＥＳＴ）を含むことができる。ＥＳＴは、ｃＤＮＡを作るためにｍＲＮＡの領域を逆転写することによって作られた。遺伝子の発現された配列の部分である（すなわち、配列の「タグ」）。
本明細書に定義されるように、「核酸アレイ」とは、核酸メンバーが固有のあらかじめ選択された領域において担体に結合されている担体に結合された複数の固有の核酸（または「核酸メンバー」）をいう。１つの実施形態において、担体の表面に結合された核酸メンバーはＤＮＡである。好ましい実施形態において、担体の表面に結合された核酸メンバーはｃＤＮＡまたはオリゴヌクレオチドのいずれかである。別の好ましい実施形態において、担体の表面に結合された核酸メンバーは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって合成されたｃＤＮＡである。「核酸」という用語は、本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチド」という用語と置き換えることができる。別の好ましい実施形態において、「核酸アレイ」とは、サザンブロッティングおよび／またはノーザンブロッティングの技術において使用されるニトロセルロースまたは他のメンブレンに結合された複数の固有の核酸をいう。
本明細書で使用される場合、「核酸プローブ」は、相補的塩基対合相互作用を含む一連の非共有結合性相互作用を通して、アレイ上の核酸メンバーの相補的配列に結合可能である。本明細書で使用される場合、核酸プローブは、天然の塩基（すなわち、Ａ、Ｇ、Ｃ、またはＴ）または修飾塩基（７−デアザグアノシン、イノシンなど）を含み得る。加えて、核酸プローブ中の塩基は、それがハイブリダイゼーションと干渉しない限り、ホスホジエステル結合以外の連結によって結合されてもよい（すなわち、核酸プローブは、標準的なまたはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、その相補的配列にさらに特異的に結合する）。従って、核酸プローブは、構成塩基がホスホジエステル結合ではなくペプチド結合によって結合されるペプチド核酸であり得る。
本明細書で使用される場合、「核酸標的」または「核酸メンバー」は、アレイに結合可能である核酸として定義される。核酸標的は、遺伝子もしくはその一部に対応する単離された核酸配列であり得るか、または核酸標的は、サンプルから単離された総ＲＮＡもしくはｍＲＮＡであり得る。好ましくは、核酸標的または核酸マーカーは、ヒトの軟骨、血液、または滑液の抽出物由来である。より好ましくは、核酸標的は、ヒトの軟骨、血液、または滑液の抽出物、好ましくは、ｍＲＮＡ抽出物からの、一本鎖または二本鎖のＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドである。
１つの実施形態において、アレイに結合した「標的」配列の従来の核酸アレイは、完全なヒトゲノムを表現可能であり、例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘチップ、および表１に記載される遺伝子または遺伝子プローブの２つ以上から成るか、またはそれを含む単離されたバイオマーカーが、従来のアレイに適用される。
別の実施形態において、アレイに結合される配列は、本発明のバイオマーカーに対応する単離されたオリゴヌクレオチド、ｃＤＮＡ、ＥＳＴまたはＰＣＲ産物であり得、総細胞ＲＮＡがアレイに適用される。
本明細書で使用される場合、「オリゴヌクレオチド」という用語は、２つ以上、および好ましくは３つより多くのデオキシリボヌクレオチドオリゴヌクレオチドリボヌクレオチドから構成される分子として定義される。その正確なサイズは、多くの要因に依存し、次には、最終的な機能およびオリゴヌクレオチドの用途に依存する。オリゴヌクレオチドは、約８ヌクレオチドから約１，０００ヌクレオチド長までであり得る。８〜１００ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドは本発明において有用であり、好ましいオリゴヌクレオチドは、約８〜約１５塩基長、約８〜約２０塩基長、約８〜約２５塩基長、約８〜約３０塩基長、約８〜約４０塩基長、または約８〜約５０塩基長の範囲である。
本明細書で使用される場合、「医薬的に許容し得る塩」という語句は、本発明の方法を使用して同定される化合物中に存在し得る酸性基または塩基性基の塩を含むがこれに限定されない。天然で塩基性である化合物は、種々の無機酸および有機酸と広範な種々の塩を形成することが可能である。このような塩基性化合物の医薬的に許容し得る酸付加塩を調製するために使用することができる酸は、非毒性酸付加塩、すなわち、医薬的に許容し得るアニオンを含む塩を形成するものであり、これには以下が含まれるがこれらに限定されない：硫黄（sulfuric）塩、クエン性（citric）塩、マレイン性（maleic）塩、酸性（acetic）塩、シュウ酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硝酸塩、硫酸塩（sulfate）、重硫酸塩、リン酸塩、過リン酸塩、イソニコチン酸塩、酢酸塩（acetate）、乳酸塩、サリチル酸塩、クエン酸塩（citrate）、クエン酸水素塩（acid citrate）、酒石酸塩、オレイン酸塩、タンニン酸塩、パントテン酸塩、重酒石酸塩、アスコルビン酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、ゲンチシン酸塩、フマル酸塩、グルコン酸塩、グルクロン酸塩（glucaronate）、サッカラート、ギ酸塩、安息香酸塩、グルタミン酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩およびパモン酸（すなわち、１，１’−メチレン−ビス−（２−ヒドロキシ−３−ナフトエ酸））塩。アミノ部分を含む化合物は、上記に言及した酸に加えて、種々のアミノ酸との医薬的に許容し得る塩を形成し得る。天然で酸性である化合物は、種々の医薬的に許容し得るカチオンと塩基性塩を形成することが可能である。このような塩の例には、アルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩、特に、カルシウム塩、マグネシウム塩、ナトリウム塩、リチウム塩、亜鉛塩、カリウム塩、および鉄塩が含まれる。
本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチド」は、８ヌクレオチド長より長い二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、および二本鎖または一本鎖ＲＮＡを包含する。
本明細書で使用される場合、「によってコードされるポリペプチド」とは、本明細書に定義されるような、遺伝子のタンパク質コード領域の翻訳後に得られるアミノ酸配列をいう。本発明のバイオマーカーの各々についてのｍＲＮＡヌクレオチド配列は、そのＧｅｎｂａｎｋ登録番号（表３および／または表６および／または表１２を参照のこと）によって同定され、そして対応するポリペプチド配列は、タンパク質登録番号（表３および／または表６および／または表１２）によって同定される。
タンパク質またはタンパク質のフラグメントが宿主動物を免疫するために使用されるとき、タンパク質の多数の領域が、タンパク質上の所定の領域または三次元構造に特異的に結合する抗体の産生を誘導する場合があり、これらの領域または構造は、エピトープまたは抗原決定基と呼ばれる。本明細書で使用される場合、「抗原性フラグメント」とは、１つ以上のエピトープを含むポリペプチドの部分をいう。エピトープは直鎖状であり得、抗原からの直鎖状配列を本質的に含み、またはエピトープは立体構造を有し、他の配列によって遺伝子的に分離されるが、ポリペプチドリガンドのための結合部位において構造的に一緒になる配列を含む。抗原性フラグメントは、５０００、１０００、５００、４００、３００、２００、１００、５０、または２５アミノ酸長、または２０、または１０、または５アミノ酸長のいずれか１つまでであり得る。
本明細書で使用される場合、「あらかじめ選択された領域」、「所定の領域」、または「固有の位置」とは、核酸の沈降のために使用され、使用された、または使用されることが意図される基質上の局所的領域をいい、そうでない場合は、本明細書では、代替的には、「選択領域」または単に「領域」と呼ばれる。あらかじめ選択された領域は、任意の便利な形状、例えば、円形、長方形、楕円形、くさび形などを有し得る。ある実施形態において、あらかじめ選択された領域は、約１ｃｍ２より小さく、より好ましくは約１ｍｍ２未満、さらにより好ましくは約０．５ｍｍ２未満、およびある実施形態においては約０．１ｍｍ２未満である。「あらかじめ選択された領域」、「所定の領域」、または「固有の位置」における核酸は、その同一性（例えば、配列）が、領域内のその位置または固有の位置によって決定することができる。
本明細書で使用される場合、「予防する」、「予防すること」および「予防」という用語は、本発明の方法に従って同定される１つ以上の化合物の投与、またはこのような化合物および別の治療の組み合わせの投与から生じる、軽度の変形性関節症またはその１つ以上の症状の発生、再発、または開始の予防をいう。
「プライマー」という用語は、本明細書で使用される場合、精製制限消化物として天然に存在するか、または合成的に製造されたかに関わらず、核酸鎖に相補的であるプライマー伸長産物の合成が誘導される条件下、すなわち、ヌクレオチドおよびＤＮＡポリメラーゼなどの誘導剤の存在下、ならびに適切な温度およびｐＨに配置されたときに、合成の開始点として作用可能であるオリゴヌクレオチドをいう。プライマーは、一本鎖または二本鎖のいずれかであり得、誘導剤の存在下で所望の伸長産物の合成を開始するために十分な長さでなければならない。プライマーの正確な長さは、温度、プライマーの供給源、および使用する方法を含む多くの因子に依存する。例えば、診断的適用のために、標的配列の複雑さに依存して、オリゴヌクレオチドプライマーは、典型的には、１５〜２５個以上のヌクレオチドを含むが、これはより少ないヌクレオチドを含んでもよい。プライマーの適切な長さを決定する際に含まれる因子は、当業者に容易に公知である。一般的に、本発明によって具体化されるプライマーの設計および選択は、標準的かつ当該分野において周知である方法に従う。以下を参照のこと：Dieffenbach,C.W.，Lowe,T.M.J.，Dveksler,G.S.（１９９５）ＰＣＲ設計のための一般的概念（General Concepts for PCR Primer Design）．ＰＣＲプライマー、実験室マニュアル（PCR Primer,A Laboratory Manual）（Dieffenbach, CWおよびDveksler, G.S.編）所収、Cold Spring Harbor Laboratory Press，ニューヨーク，１３３−１５５；Innis, M.A.およびGelfand, D.H.（１９９０）ＰＣＲの最適化（Optimization of PCRs）．ＰＣＲプロトコール、方法および応用のガイド（PCR protocols,A Guide to Methods and Applications）（Innis,M.A.，Gelfand，D.H.,Sninsky,J.J.，およびWhite,T.J.編）所収、Academic Press，San Diego，３−１２；Sharrocks,A.D.（１９９４）ＰＣＲのためのプライマーの設計（The design of primers for PCR）ＰＣＲ技術、現在の技術革新（PCR Technology,Current Innovations）（Griffin,H.G.およびGriffin,A.M.編）所収、CRC Press，London，５−１１。
本明細書で使用される場合、「プローブ」という用語は、オリゴヌクレオチドおよびそのアナログを意味し、標的配列のヌクレオチド塩基との水素結合相互作用を通してポリヌクレオチド標的配列を認識する一連の範囲の化学種をいう。プローブまたは標的配列は、一本鎖もしくは二本鎖ＲＮＡ、または一本鎖もしくは二本鎖ＤＮＡ、またはＤＮＡ塩基およびＲＮＡ塩基の組み合わせであってもよい。プローブは、少なくとも８ヌクレオチド長であり、かつ完全な遺伝子の長さ未満である。プローブは、１０、２０、３０、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、４００、５００、および２０００ヌクレオチド長までであり得る。プローブは、蛍光、化学発光などによって検出可能であるタグを有するために修飾されたオリゴヌクレオチドを含むことができる。プローブはまた、検出可能タグとクエンチャー分子の両方を有するために修飾可能であり、例えば、Taqman（登録商標）およびMolecular Beacon（登録商標）プローブである。
オリゴヌクレオチドおよびそのアナログは、ＲＮＡもしくはＤＮＡ、またはＲＮＡもしくはＤＮＡのアナログであってもよく、一般的には、アンチセンスオリゴマーまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドと呼ばれる。このようなＲＮＡまたはＤＮＡアナログは以下を含むがこれらに限定されない：２−’Ｏ−アルキル糖修飾、メチルホスホネート、ホスホロチエート、ホスホロジチオエート、ホルムアセタール、３’−チオホルムアセタール、スルホン、スルファメート、およびニトロオキサイドバックボーン修飾、および塩基部分が修飾されているアナログ。加えて、オリゴマーのアナログは、糖部分が、モルホリノアナログおよびペプチド核酸（ＰＮＡ）を含むがこれらに限定されないポリマーを生じる、別の適切な部分で修飾または置き換えられたポリマーであってもよい（Egholmら、Peptide Nucleic Acids(PNA)--Oligonucleotide Analogues with an Achiral Peptide Backbone，（１９９２））。
プローブはまた、ネイティブなＤＮＡまたはＲＮＡと一緒の、またはこれらと組み合わせた、任意のオリゴヌクレオチドアナログ型の混合物であってもよい。同時に、オリゴヌクレオチドおよびそのアナログは、単独で、または１種以上のさらなるオリゴヌクレオチドもしくはそのアナログと組み合わせて使用されてもよい。
本明細書で使用される場合、「バイオマーカーの産物」または「バイオマーカー産物」とは、バイオマーカーに対応し、またはバイオマーカーによってコードされるＲＮＡまたはタンパク質をいう（すなわち、遺伝子もしくは遺伝子エレメントから転写され、または遺伝子もしくは遺伝子エレメントから転写されるＲＮＡから翻訳される）。例えば、ある実施形態において、バイオマーカーから得られるＲＮＡは、以下の種の１つ以上：ｈｎＲＮＡ、ｍＲＮＡ、および／またはｍＲＮＡの１種以上のスプライシング変異体を含むことができる。ある実施形態において、分子マーカーから得られるタンパク質は、バイオマーカーから得られるＲＮＡに対応する、血液中で検出される任意のタンパク質を含み得る。
本明細書で使用される場合、「予防剤」という用語は、変形性関節症の予防において使用することができる任意の化合物をいう。特定の実施形態において、「予防剤」という用語は、本明細書に記載されるスクリーニングアッセイにおいて同定される化合物をいう。特定の他の実施形態において、「予防剤」という用語は、変形性関節症またはその１つ以上の症状の発生、再発、または開始を予防または妨害するために有用であることが知られているか、または使用されてきたか、または現在使用されている、本明細書に記載されるスクリーニングアッセイにおいて同定された化合物以外の薬剤をいう。
本明細書で使用される場合、「予防有効量」という用語は、変形性関節症またはその１つ以上の症状の発生、再発、または開始の予防を生じるために十分である治療（例えば、予防剤）の量をいう。
本明細書で使用される場合、「タンパク質」および「ポリペプチド」および「タンパク質性因子」という用語は、任意に天然のアミノ酸および非天然アミノ酸を含み得る、ペプチド結合によって一緒に連結されたアミノ酸の鎖をいう。選択的に、タンパク質またはペプチドは、アミノ酸に加えて、他の分子を含み得る。当該鎖は任意の長さであり得る。特定の実施形態において、タンパク質は、ペプチド結合によって一緒に連結される、２００個未満、１７５個未満、１５０個未満、１２５個未満、１００個未満、５０個未満、４５個未満、４０個未満、３５個未満、３０個未満、２５個未満、２０個未満、１５個未満、１０個未満、または５個未満のアミノ酸から構成される。別の実施形態において、タンパク質は、ペプチド結合によって一緒に連結される、少なくとも２００個、少なくとも２５０個、少なくとも３００個、少なくとも３５０個、少なくとも４００個、少なくとも４５０個、少なくとも５００個またはそれ以上のアミノ酸から構成される。
本明細書で使用される場合、「複数の」または「一連の」とは、２つより多く、例えば、３以上、１０以上、１００以上、または１０００以上、または１０，０００以上をいう。
本明細書で使用される場合、「ＲＮＡ部分」および「その部分」という用語は、本発明のバイオマーカーのＲＮＡ産物の状況において、少なくとも６個、少なくとも９個、少なくとも１５個、少なくとも１８個、少なくとも２１個、少なくとも２４個、少なくとも３０個、少なくとも６０個、少なくとも９０個、少なくとも９９個、または少なくとも１０８個、またはそれ以上の、本発明のバイオマーカーのＲＮＡ産物を含むＲＮＡ転写物をいう。
本明細書で使用される場合、「本発明のバイオマーカーの産物」とは、本発明のバイオマーカーに対応する遺伝子によって発現されるＲＮＡおよび／またはタンパク質をいう。「本発明のバイオマーカーのＲＮＡ産物」は、その発現の測定が本明細書で開示される教示に従うバイオマーカーとして使用することができる、異核ＲＮＡ（「ｈｎＲＮＡ」）、ｍＲＮＡ、およびｍＲＮＡのすべてまたはいくつかのスプライシング変異体を含み得る１種以上の産物を含む。「本発明のバイオマーカーのタンパク質産物」は、タンパク質、タンパク質変異体、および任意の翻訳後修飾タンパク質を含み得る、１種以上のバイオマーカーの産物を含む。
本明細書で使用される場合、「選択的に増幅される」または「選択的増幅」とは、それによって特定の標的核酸配列の１つ以上のコピーがテンプレート核酸から選択的に生成されるプロセスをいう。選択的に増幅されるまたは選択的増幅は、核酸配列（例えば、ｍＲＮＡ）の集団を増幅するために、例えば、ランダムプライマーおよびオリゴｄＴプライマーと組み合わせた方法として使用することができる一般的な増幅と比較される。選択的増幅は、好ましくは、ポリメラーゼ連鎖反応の方法（MullisおよびFaloona，１９８７，Methods Enzymol. １５５：３３５）によって行われる。
本明細書で使用される場合、「選択的に結合する」という用語は、本発明によって包含されるタンパク質の状況において、任意の２つのペプチド、タンパク質、ポリペプチド、および抗体の特異的相互作用をいい、ここで、この相互作用は、任意の他のペプチド、タンパク質、ポリペプチド、および抗体と比較して、任意の２つのペプチド、タンパク質、ポリペプチド、および抗体の間で優先的に起こる。例えば、２つの分子がタンパク質分子である場合、第１の分子上の構造は、第２の分子上の構造を、他のタンパク質よりもむしろ、認識しかつ結合する。「選択的結合」、「選択的に結合すること」は、これらの用語が本明細書で使用される場合、分子が、その特異的結合パートナーに、その分子が非特異的分子に結合する場合よりも少なくとも２倍の親和性、および好ましくは、少なくとも１０倍、２０倍、５０倍、１００倍またはそれ以上の親和性で結合することを意味する。
本明細書で使用される場合、「選択的ハイブリダイゼーション」は、本発明の状況において、本発明によって包含されるポリヌクレオチドとＲＮＡ、またはその相補物、または本発明のバイオマーカーのタンパク質産物の間でハイブリダイゼーションをいい、ここで、このハイブリダイゼーションは、ポリヌクレオチドが、問題のゲノム中の他の遺伝子のＲＮＡ産物と比較して、本発明のバイオマーカーのＲＮＡ産物に優先的に結合するようなものである。好ましい実施形態において、「選択的にハイブリダイズする」ポリヌクレオチドは、７０％より高い、８０％より高い、９０％より高い選択性で、最も好ましくは１００％の選択性でハイブリダイズするものである（すなわち、他のＲＮＡ種との交差ハイブリダイゼーションは、好ましくは、３０％未満、２０％未満、１０％未満で起こる）。当業者に理解されるように、本発明のバイオマーカーのＲＮＡ産物に「選択的にハイブリダイズする」ポリヌクレオチドは、長さおよび組成を考慮して決定することができる。
本明細書で使用される場合、「特異的にハイブリダイズする」、「特異的ハイブリダイゼーション」とは、２つの核酸配列が実質的に相補的である（少なくとも１４〜２５ヌクレオチドのストレッチにわたって約６５％相補的、好ましくは少なくとも約７５％相補的、より好ましくは少なくとも約９０％相補的である）場合に起こるハイブリダイゼーションをいう。参照により本明細書に援用される、Kanehisa,M.，１９８４，Nucleic acids Res.，１２：２０３を参照のこと。結果として、特定の程度のミスマッチが許容されることが予測される。このようなミスマッチは小さくてもよく、例えば、モノ−、ジ−またはトリ−ヌクレオチドである。代替的には、ミスマッチの領域はループを含み得、これは、中断されない一連の４個以上のヌクレオチド中のミスマッチが存在する領域として定義される。多数の要因が２つの核酸のハイブリダイゼーション、例えば、標的核酸配列へのアレイ上の核酸メンバーのハイブリダイゼーションの効率および選択性に影響を与える。これらの要因には、核酸メンバーの長さ、ヌクレオチド配列および／または組成、ハイブリダイゼーション温度、緩衝液組成ならびに核酸メンバーがハイブリダイズすることが要求されている領域中での立体障害の可能性が含まれる。核酸の長さと、核酸が標的配列にアニールする効率と正確さの両方との間には正の相関が存在する。特に、より長い配列は、より短いものよりも高い融解温度（ＴＭ）を有し、所定の標的配列の内部で反復される可能性が少なく、それによって、非特異的ハイブリダイゼーションを最小化する。ハイブリダイゼーション温度は、核酸メンバーのアニーリング効率と反比例して変化する。同様に、ハイブリダイゼーション混合液中の有機溶媒、例えば、ホルムアミドの濃度は、アニーリング効率と反比例して増加するのに対して、ハイブリダイゼーション混合液中の塩濃度の増加はアニーリングを容易にする。ストリンジェントなアニーリング条件下では、より長い核酸は、より許容し得る条件下で十分であるより短い核酸よりも、より効率的にハイブリダイズする。
本明細書で使用される場合、「特異的に結合する」という用語は、２つの分子、例えば、リガンドおよびタンパク質もしくはペプチド、または抗体およびタンパク質もしくはペプチドの相互作用をいい、ここで、この相互作用は、それぞれの分子上の特定の構造の存在に依存する。例えば、２つの分子がタンパク質分子である場合、第１の分子上の構造は、第２の分子上の構造を、一般的なタンパク質よりも認識しかつこれに結合する。「特異的結合」は、この用語が本明細書で使用される場合、分子が、その特異的結合パートナーに、その分子が非特異的分子に結合する場合よりも少なくとも２倍の親和性、および好ましくは、少なくとも１０倍、２０倍、５０倍、１００倍またはそれ以上の親和性で結合することを意味する。
本明細書で使用される場合、「標準的なストリンジェントな条件」および「ストリンジェントな条件」という用語は、配列間で少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９７％の同一性が存在する場合にのみハイブリダイゼーションが起こることを意味し、ここで、同一性の領域は少なくとも１０ヌクレオチドを含む。１つの実施形態において、４２℃で一晩の配列のインキュベーション、続いてストリンジェントな洗浄（６５℃における０．２×ＳＳＣ）に従うストリンジェントな条件下で、配列はハイブリダイズする。洗浄のストリンジェンシーの程度は、温度、ｐＨ、イオン強度、二価カチオン濃度、容量および洗浄の持続時間を変化させることにより変化させることができる。例えば、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、プローブの融解温度の下の種々の温度においてハイブリダイゼーションを実施することによって変化することができる。プローブの融解温度は、以下の数式を使用して計算してもよい。
１４〜７０ヌクレオチド長の間のオリゴヌクレオチドプローブについては、摂氏での融解温度（Ｔｍ）は以下の数式を使用して計算してもよい：
Ｔｍ＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ［Ｎａ＋］）＋０．４１（Ｇ＋Ｃの割合）−（６００／Ｎ）
ここでＮはオリゴヌクレオチドの長さである。
例えば、ハイブリダイゼーション温度は、約１ＭのＮａ＋濃度を有するハイブリダイゼーション緩衝液中で６８℃から４２℃まで５℃ずつ減少させてもよい。ハイブリダイゼーション後、フィルターは、ハイブリダイゼーション温度において、２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳで洗浄されてもよい。これらの条件は、５０℃よりも上の「中程度のストリンジェンシー」条件および５０℃より下の「低ストリンジェンシー」条件であると見なされる。「中程度のストリンジェンシー」のハイブリダイゼーション条件の特定の例は、上記のハイブリダイゼーションが５５℃において行われる場合である。「低ストリンジェンシー」ハイブリダイゼーション条件の特定の例は、上記のハイブリダイゼーションが４５℃において行われる場合である。
ハイブリダイゼーションがホルムアミドを含む溶液中で実行される場合、アニーリングする核酸鎖の融解温度は、数式Ｔｍ＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ［Ｎａ＋］）＋０．４１（Ｇ＋Ｃの割合）−（０．６３％ホルムアミド）−（６００／Ｎ）を使用して計算することができ、ここで、Ｎはプローブの長さである。
例えば、ハイブリダイゼーションは、４２℃の温度においてホルムアミドを含む、６×ＳＳＣなどの緩衝液中で実行されてもよい。この場合、ハイブリダイゼーション緩衝液中のホルムアミドの濃度は、プローブの相同性のレベルの減少を有するクローンを同定するために、５０％から０％まで５％ずつ減少されてもよい。ハイブリダイゼーション後、フィルターは、５０℃において、６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳで洗浄されてもよい。ハイブリダイゼーション温度は、ハイブリダイゼーション溶液が上記の２５％ホルムアミドから構成される場合に「中程度のストリンジェンシー」であると見なされ、「低ストリンジェンシー」条件は、ハイブリダイゼーション溶液が２５％より下のホルムアミドから構成される場合である。「中程度のストリンジェンシー」のハイブリダイゼーション条件の特定の例は、上記のハイブリダイゼーションが３０％ホルムアミドにおいて行われる場合である。「低ストリンジェンシー」ハイブリダイゼーション条件の特定の例は、上記のハイブリダイゼーションが１０％ホルムアミドにおいて行われる場合である。
「被験体」および「患者」および「個体」は、動物（例えば、哺乳動物、両生類、爬虫類、鳥類、および昆虫）をいうために交換可能に使用される。特定の実施形態において、被験体は哺乳動物である（例えば、非ヒト哺乳動物およびヒト）。別の実施形態において、被験体はペット（例えば、イヌ、ネコ、モルモット、サルおよび鳥類）、家畜（例えば、ウマ、ウシ、ブタ、ヤギおよびニワトリ）、または実験用動物（例えば、マウスおよびラット）である。別の実施形態において、被験体は霊長類（例えば、チンパンジーおよびヒト）である。別の実施形態において、被験体はヒトである。
本明細書で使用される場合、「相乗的」という用語は、治療の相加的な効果よりも有効である、本明細書に記載された方法の１つを使用して同定された化合物および別の治療（例えば、薬剤）の組み合わせをいう。好ましくは、このような他の治療は、膀胱癌またはその症状を予防、治療、管理または改善するために使用されたか、または現在使用されている。治療（例えば、予防剤または治療剤）の組み合わせの相乗効果は、膀胱癌を有する患者への１つ以上のより少ない用量での治療の使用、および／または投与回数がより少ない当該治療の投与を可能にする。より少ない用量での治療（例えば、予防剤または治療剤）を利用することおよび／またはより少ない頻度で当該治療を投与することは、膀胱癌の予防、治療、管理、または改善において、当該治療の効力を減少させることなく、被験体への当該治療の投与に伴う毒性を減少する。加えて、相乗効果は、膀胱癌の予防、治療、管理、または改善において、治療（例えば、薬剤）の効力の改善を生じ得る。最後に、治療（例えば、予防剤または治療剤）の組み合わせの相乗効果は、いずれかの治療単独の使用に伴う有害なまたは望ましくない副作用を回避または減少し得る。
本明細書で使用される場合、「治療剤」は、膀胱癌または１つ以上の症状の治療、管理または改善において使用することができる任意の化合物をいう。
本明細書で使用される場合、「治療有効量」という用語は、膀胱癌または１つ以上のその症状の改善を生じるため、膀胱癌の進行を予防するため、膀胱癌の症状を後退させるため、または別の治療（例えば、治療剤）の治療効果を改善するために十分である治療（例えば、治療剤）の量をいう。
本明細書で使用される場合、「治療する」、「治療」および「治療すること」という用語は、本発明の方法に従って同定された１種以上の化合物の投与、または本発明の方法に従って同定された１種以上の化合物および別の治療の組み合わせの投与から生じる、膀胱癌または１つ以上のその症状の進行、重度および／または再発の減少または改善をいう。
本明細書で使用される場合、「上方制御された」または「発現レベルの増加」は、本発明の状況において、正常個体からまたは異なる同定された疾患状態もしくは段階を有する個体から単離された組織または血液中の同じ遺伝子と比較して、ＡＪＣＣ病期診断ガイドラインによって決定可能なような、産物の測定が遺伝子の発現レベルの増加を実証する、発現される遺伝子の産物をいう。「発現レベルの増加」は、本発明に従って、例えば、本発明の方法に従うハイブリダイゼーションの強度によって測定されるような、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％もしくはそれ以上の発現の増加、例えば、２０％、３０％、４０％、または５０％、６０％、７０％、８０％、９０％もしくはそれ以上の発現の増加、または１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、５０倍、１００倍またはそれ以上より大きい発現の増加である。例えば、上方制御された配列は、正常個体から単離された組織と比較して、膀胱癌を有すると特徴付けられた個体から単離された組織または血液中の発現レベルが増加している配列を含む。上方制御された配列はまた、膀胱癌の１つの段階を有すると特徴付けられた個体から単離された組織または血液中の発現が、別の段階の膀胱癌と比較して増加している配列を含み得る。
本発明は、ここで、図面を参照して説明される。
３．２ 実施形態
２つ以上の単離されたポリヌクレオチドのコレクションを含む組成物が本明細書に記載され、各々のポリヌクレオチドはバイオマーカーに選択的にハイブリダイズする。これらのバイオマーカーは表１に同定される遺伝子である。１つの実施形態において、この組成物は、表１に列挙されるこれらのバイオマーカーの任意の少なくとも２つの各々の発現レベルを測定するために使用することができる。１つの実施形態において、この組成物のポリヌクレオチドは定量ＲＴ−ＰＣＲ（ＱＲＴ−ＰＣＲ）において有用である。
２つ以上の単離されたポリヌクレオチドのコレクションを含む組成物が本明細書に記載され、各々のポリヌクレオチドはバイオマーカーに選択的にハイブリダイズする。これらのバイオマーカーは表１および／または表２に同定される遺伝子である。１つの実施形態において、この組成物は、表１および／または表２に列挙されるこれらのバイオマーカーの任意の少なくとも２つの各々の発現レベルを測定するために使用することができる。１つの実施形態において、この組成物のポリヌクレオチドは定量ＲＴ−ＰＣＲ（ＱＲＴ−ＰＣＲ）において有用である。
２つ以上の単離されたポリヌクレオチドのコレクションを含む組成物が本明細書に記載され、各々のポリヌクレオチドはバイオマーカーに選択的にハイブリダイズする。これらのバイオマーカーは表１１に同定される遺伝子である。１つの実施形態において、この組成物は、表１１に列挙されるこれらのバイオマーカーの任意の少なくとも２つの各々の発現レベルを測定するために使用することができる。１つの実施形態において、この組成物のポリヌクレオチドは定量ＲＴ−ＰＣＲ（ＱＲＴ−ＰＣＲ）において有用である。
２つ以上の単離されたポリヌクレオチドのコレクションを含む組成物が本明細書に記載され、各々のポリヌクレオチドはバイオマーカーのＲＮＡ産物に選択的にハイブリダイズする。これらのバイオマーカーのＲＮＡ産物は表３に同定される。１つの実施形態において、この組成物は、これらのＲＮＡ産物の少なくとも２つの発現レベルを測定するために使用することができる。１つの実施形態において、この組成物のポリヌクレオチドは定量ＲＴ−ＰＣＲ（ＱＲＴ−ＰＣＲ）において有用である。
２つ以上の単離されたポリヌクレオチドのコレクションを含む組成物が本明細書に記載され、各々のポリヌクレオチドはバイオマーカーに選択的にハイブリダイズする。これらのバイオマーカーは表４に同定される遺伝子である。１つの実施形態において、この組成物は、これらのバイオマーカーの少なくとも２つの発現レベルを測定するために使用することができる。１つの実施形態において、この組成物のポリヌクレオチドは定量ＲＴ−ＰＣＲ（ＱＲＴ−ＰＣＲ）において有用である。
２つ以上の単離されたポリヌクレオチドのコレクションを含む組成物が本明細書に記載され、各々のポリヌクレオチドはバイオマーカーに選択的にハイブリダイズする。これらのバイオマーカーは表４および表５に同定される遺伝子であり、これらのバイオマーカーの少なくとも１つは表４から選択される。１つの実施形態において、この組成物は、これらのバイオマーカーの少なくとも２つの発現レベルを測定するために使用することができる。１つの実施形態において、この組成物のポリヌクレオチドは定量ＲＴ−ＰＣＲ（ＱＲＴ−ＰＣＲ）において有用である。
２つ以上の単離されたポリヌクレオチドのコレクションが本明細書に記載され、各々のポリヌクレオチドはバイオマーカーのＲＮＡ産物に選択的にハイブリダイズし、このバイオマーカーのＲＮＡ産物は表６において同定される。１つの実施形態において、この組成物は、これらのＲＮＡ産物の少なくとも２つの発現レベルを測定するために使用される。１つの実施形態において、この組成物のポリヌクレオチドは定量ＲＴ−ＰＣＲ（ＱＲＴ−ＰＣＲ）において有用である。
２つ以上の単離されたポリヌクレオチドのコレクションを含む組成物が本明細書に記載され、各々のポリヌクレオチドはバイオマーカーに選択的にハイブリダイズする。これらのバイオマーカーは表７に同定される遺伝子である。１つの実施形態において、この組成物は、少なくとも２つのバイオマーカーの発現レベルを測定するために使用される。１つの実施形態において、この組成物のポリヌクレオチドは定量ＲＴ−ＰＣＲ（ＱＲＴ−ＰＣＲ）において有用である。
２つ以上の単離されたポリヌクレオチドのコレクションを含む組成物が本明細書に記載され、各々のポリヌクレオチドはバイオマーカーに選択的にハイブリダイズする。これらのバイオマーカーは表１０に同定される遺伝子である。１つの実施形態において、この組成物は、少なくとも２つのバイオマーカーの発現レベルを測定するために使用される。１つの実施形態において、この組成物のポリヌクレオチドは定量ＲＴ−ＰＣＲ（ＱＲＴ−ＰＣＲ）において有用である。
２つ以上の単離されたタンパク質のコレクションを含む組成物が本明細書に記載され、各々の単離されたタンパク質はバイオマーカーのタンパク質産物に選択的にハイブリダイズし、ここで、これらのバイオマーカーは表１に示されるような遺伝子から成る群より選択される。１つの実施形態において、この組成物は少なくとも２つのバイオマーカーの発現レベルを測定するために使用される。
２つ以上の単離されたタンパク質のコレクションを含む組成物が本明細書に記載され、各々の単離されたタンパク質はバイオマーカーのタンパク質産物に選択的にハイブリダイズし、ここで、これらのバイオマーカーは表１および表２に示されるような遺伝子であり、バイオマーカーの少なくとも１つは表１から選択される。１つの実施形態において、この組成物は少なくとも２つのバイオマーカーの発現レベルを測定するために使用される。
２つ以上の単離されたタンパク質のコレクションを含む組成物が本明細書に記載され、各々の単離されたタンパク質はバイオマーカーのタンパク質産物に選択的にハイブリダイズし、ここで、これらのバイオマーカーは表３に示されるようなタンパク質である。１つの実施形態において、この組成物は少なくとも２つのタンパク質産物の発現レベルを測定するために使用される。
２つ以上の単離されたタンパク質のコレクションを含む組成物が本明細書に記載され、各々の単離されたタンパク質はバイオマーカーのタンパク質産物に選択的にハイブリダイズし、ここで、これらのバイオマーカーは表４に示されるような遺伝子である。１つの実施形態において、この組成物は少なくとも２つのバイオマーカーの発現レベルを測定するために使用される。
２つ以上の単離されたタンパク質のコレクションを含む組成物が本明細書に記載され、各々の単離されたタンパク質はバイオマーカーのタンパク質産物に選択的にハイブリダイズし、ここで、これらのバイオマーカーは表４および表５に示されるような遺伝子から成る群より選択され、バイオマーカーの少なくとも１つは表４から選択される。１つの実施形態において、この組成物は少なくとも２つのバイオマーカーの発現レベルを測定するために使用される。
２つ以上の単離されたタンパク質のコレクションを含む組成物が本明細書に記載され、各々の単離されたタンパク質はバイオマーカーのタンパク質産物に選択的にハイブリダイズし、ここで、これらのバイオマーカーのタンパク質産物は表６に示されるようなタンパク質から選択される。１つの実施形態において、この組成物は少なくとも２つのタンパク質産物の発現レベルを測定するために使用される。
２つ以上の単離されたタンパク質のコレクションを含む組成物が本明細書に記載され、各々の単離されたタンパク質はバイオマーカーのタンパク質産物に選択的にハイブリダイズし、ここで、これらのバイオマーカーは表７に示されるような遺伝子から選択される。１つの実施形態において、この組成物はこれらのバイオマーカーの少なくとも２つの発現レベルを測定するために使用される。
２つ以上の単離されたタンパク質のコレクションを含む組成物が本明細書に記載され、各々の単離されたタンパク質はバイオマーカーのタンパク質産物に選択的にハイブリダイズし、ここで、これらのバイオマーカーは表１０に示されるような遺伝子を含む。１つの実施形態において、この組成物はこれらのバイオマーカーの少なくとも２つの発現レベルを測定するために使用される。
上記の段落で本明細書に記載される組成物において、単離されたタンパク質は、バイオマーカーのタンパク質産物へのリガンドであり、これらのリガンドは、モノクローナル抗体を含む抗体であり得る。
上記の段落で本明細書に記載される組成物において、単離されたポリヌクレオチドは、一本鎖もしくは二本鎖ＲＮＡ、または一本鎖もしくは二本鎖ＤＮＡであり得る。
個体において膀胱癌を診断または予後診断する方法が本明細書に記載され、この方法は以下の工程：
ａ）個体から得られた血液中で発現された１つ以上のＲＮＡ転写物のレベルを決定する工程であって、この１つ以上のＲＮＡ転写物が表１の１つ以上のバイオマーカーに対応する、工程、および
ｂ）工程ａ）に従う血液中の１つ以上のＲＮＡ転写物の各々のレベルを、膀胱癌を有さない１例以上の個体からの血液中の１つ以上のＲＮＡ転写物の各々のレベルと比較する工程、
を包含し、
ここで、工程ｂ）の比較において１つ以上のＲＮＡ転写物の各々のディファレンシャルな発現を検出することが、工程ａ）の個体における膀胱癌を示す。
個体において膀胱癌を診断または予後診断する方法が本明細書に記載され、この方法は以下の工程：
ａ）個体から得られた血液中で発現された２つ以上のＲＮＡ転写物のレベルを決定する工程であって、この２つ以上のＲＮＡ転写物が表１および表２の１つ以上のバイオマーカーに対応し、ＲＮＡ転写物の少なくとも１つが表１のバイオマーカーに対応する、工程、ならびに
ｂ）工程ａ）に従う血液中の１つ以上のＲＮＡ転写物の各々のレベルを、膀胱癌を有さない１例以上の個体からの血液中の１つ以上のＲＮＡ転写物の各々のレベルと比較する工程、
を包含し、
ここで、工程ｂ）の比較において１つ以上のＲＮＡ転写物の各々のディファレンシャルな発現を検出することが、工程ａ）の個体における膀胱癌を示す。
個体において膀胱癌を診断または予後診断する方法が本明細書に記載され、この方法は以下の工程：
ａ）個体から得られた血液中で発現された１つ以上のＲＮＡ転写物のレベルを決定する工程であって、この１つ以上のＲＮＡ転写物が表４の１つ以上のバイオマーカーに対応する、工程、および
ｂ）工程ａ）に従う血液中の１つ以上のＲＮＡ転写物の各々のレベルを、膀胱癌を有さない１例以上の個体からの血液中の１つ以上のＲＮＡ転写物の各々のレベルと比較する工程、
を包含し、
ここで、工程ｂ）の比較において１つ以上のＲＮＡ転写物の各々のディファレンシャルな発現を検出することが、工程ａ）の個体における膀胱癌を示す。
個体において膀胱癌を診断または予後診断する方法が本明細書に記載され、この方法は以下の工程：
ａ）個体から得られた血液中で発現された２つ以上のＲＮＡ転写物のレベルを決定する工程であって、この２つ以上のＲＮＡ転写物が表４および表５の１つ以上のバイオマーカーに対応し、ＲＮＡ転写物の少なくとも１つが表４のバイオマーカーに対応する、工程、および
ｂ）工程ａ）に従う血液中の１つ以上のＲＮＡ転写物の各々のレベルを、膀胱癌を有さない１例以上の個体からの血液中の１つ以上のＲＮＡ転写物の各々のレベルと比較する工程、
を包含し、
ここで、工程ｂ）の比較において１つ以上のＲＮＡ転写物の各々のディファレンシャルな発現を検出することが、工程ａ）の個体における膀胱癌を示す。
個体において膀胱癌を診断または予後診断する方法が本明細書に記載され、この方法は以下の工程：
ａ）個体から得られた血液中で発現された１つ以上のＲＮＡ転写物のレベルを決定する工程であって、この１つ以上のＲＮＡ転写物が表７の１つ以上のバイオマーカーに対応する、工程、および
ｂ）工程ａ）に従う血液中の１つ以上のＲＮＡ転写物の各々のレベルを、膀胱癌を有さない１例以上の個体からの血液中の１つ以上のＲＮＡ転写物の各々のレベルと比較する工程、
を包含し、
ここで、工程ｂ）の比較において１つ以上のＲＮＡ転写物の各々のディファレンシャルな発現を検出することが、工程ａ）の個体における膀胱癌を示す。
個体において膀胱癌を診断または予後診断する方法が本明細書に記載され、この方法は以下の工程：
ａ）個体から得られた血液中で発現された１つ以上のＲＮＡ転写物のレベルを決定する工程であって、この１つ以上のＲＮＡ転写物が表１０の１つ以上のバイオマーカーに対応する、工程、および
ｂ）工程ａ）に従う血液中の１つ以上のＲＮＡ転写物の各々のレベルを、膀胱癌を有さない１例以上の個体からの血液中の１つ以上のＲＮＡ転写物の各々のレベルと比較する工程、
を包含し、
ここで、工程ｂ）の比較において１つ以上のＲＮＡ転写物の各々のディファレンシャルな発現を検出することが、工程ａ）の個体における膀胱癌を示す。
個体において膀胱癌を診断または予後診断する方法が本明細書に記載され、この方法は以下の工程：
ａ）個体から得られた血液中で発現された１つ以上のＲＮＡ転写物のレベルを決定する工程であって、この１つ以上のＲＮＡ転写物の各々が表１に列挙されるバイオマーカーから選択されるバイオマーカーに対応する、工程、および
ｂ）工程ａ）に従う血液中の１つ以上のＲＮＡ転写物の各々のレベルを、膀胱癌を有する１例以上の個体からの血液中の１つ以上のＲＮＡ転写物の各々のレベルと比較する工程、
ｃ）工程ａ）に従う血液中の１つ以上のＲＮＡ転写物の各々のレベルを、膀胱癌を有さない１例以上の個体からの血液中の１つ以上のＲＮＡ転写物の各々のレベルと比較する工程、
ｄ）工程ａ）の１つ以上のＲＮＡ転写物のレベルが、工程ｃ）における転写物のレベルと比較して、工程ｂ）における転写物のレベルと一緒に分類するか否かを決定する工程
を包含し、
ここで、この決定は、膀胱癌を有する工程ａ）の個体を示す。
個体において早期の膀胱癌を診断または予後診断する方法が本明細書に記載され、この方法は以下の工程：
ａ）個体から得られた血液中で発現された１つ以上のＲＮＡ転写物のレベルを決定する工程であって、この１つ以上のＲＮＡ転写物の各々が表４に列挙されるバイオマーカーから選択されるバイオマーカーに対応する、工程、および
ｂ）工程ａ）に従う血液中の１つ以上のＲＮＡ転写物の各々のレベルを、早期の膀胱癌を有する１例以上の個体からの血液中の１つ以上のＲＮＡ転写物の各々のレベルと比較する工程、
ｃ）工程ａ）に従う血液中の１つ以上のＲＮＡ転写物の各々のレベルを、膀胱癌を有さない１例以上の個体からの血液中の１つ以上のＲＮＡ転写物の各々のレベルと比較する工程、
ｄ）工程ａ）の１つ以上のＲＮＡ転写物のレベルが、工程ｃ）における転写物のレベルと比較して、工程ｂ）における転写物のレベルと一緒に分類するか否かを決定する工程
を包含し、
ここで、この決定は、早期の膀胱癌を有する工程ａ）の個体を示す。
個体において膀胱癌を診断または予後診断する方法が本明細書に記載され、この方法は以下の工程：
ａ）個体から得られた血液中で発現された１つ以上のＲＮＡ転写物のレベルを決定する工程であって、この１つ以上のＲＮＡ転写物の各々が表７に列挙されるバイオマーカーから選択されるバイオマーカーに対応する、工程、および
ｂ）工程ａ）に従う血液中の１つ以上のＲＮＡ転写物の各々のレベルを、膀胱癌を有する１例以上の個体からの血液中の１つ以上のＲＮＡ転写物の各々のレベルと比較する工程、
ｃ）工程ａ）に従う血液中の１つ以上のＲＮＡ転写物の各々のレベルを、膀胱癌を有さない１例以上の個体からの血液中の１つ以上のＲＮＡ転写物の各々のレベルと比較する工程、
ｄ）工程ａ）の１つ以上のＲＮＡ転写物のレベルが、工程ｃ）における転写物のレベルと比較して、工程ｂ）における転写物のレベルと一緒に分類するか否かを決定する工程
を包含し、
ここで、この決定は、膀胱癌を有する工程ａ）の個体を示す。
個体において膀胱癌を診断または予後診断する方法が本明細書に記載され、この方法は以下の工程：
ａ）個体から得られた血液中で発現された１つ以上のＲＮＡ転写物のレベルを決定する工程であって、この１つ以上のＲＮＡ転写物の各々が表１０に列挙されるバイオマーカーから選択されるバイオマーカーに対応する、工程、および
ｂ）工程ａ）に従う血液中の１つ以上のＲＮＡ転写物の各々のレベルを、膀胱癌を有する１例以上の個体からの血液中の１つ以上のＲＮＡ転写物の各々のレベルと比較する工程、
ｃ）工程ａ）に従う血液中の１つ以上のＲＮＡ転写物の各々のレベルを、膀胱癌を有さない１例以上の個体からの血液中の１つ以上のＲＮＡ転写物の各々のレベルと比較する工程、
ｄ）工程ａ）の１つ以上のＲＮＡ転写物のレベルが、工程ｃ）における転写物のレベルと比較して、工程ｂ）における転写物のレベルと一緒に分類するか否かを決定する工程
を包含し、
ここで、この決定は、膀胱癌を有する工程ａ）の個体を示す。
血液サンプルが全血、一滴の血液、または溶解された全血もしくは一滴の全血から成る、膀胱癌を診断および／または予後診断する場合の方法を含む方法が本明細書に記載される。
血液サンプルからのＲＮＡを単離する工程をさらに包含する、膀胱癌を診断および／または予後診断する場合の方法を含む方法が本明細書に記載される。
定量ＲＴ−ＰＣＲ（ＱＲＴ−ＰＣＲ）を含む場合がある、１つ以上のＲＮＡ転写物の各々のレベルを決定する工程を包含する、膀胱癌を診断および／または予後診断する方法を含む方法が本明細書に記載される。
ＱＲＴ−ＰＣＲは、ある例において、１つ以上の転写物またはその組み合わせにハイブリダイズするプライマーを利用する、これらのプライマーは、１５〜２５ヌクレオチド長であるものを含む。
１つ以上のＲＮＡ転写物の各々のレベルを決定する工程、および１つ以上の転写物に対応する第１の複数の単離された核酸分子を、第２の複数の単離された核酸分子を含むアレイにハイブリダイズする工程を包含する、膀胱癌を診断および／または予後診断する場合の方法を含む方法が本明細書に記載される。これらの方法において、第１の複数の単離された核酸分子は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＰＣＲ産物またはＥＳＴを含む。
膀胱癌を診断または予後診断するためのキットが本明細書に記載され、このキットは：
ａ）表１、４、７、もしくは１０；１１、または１３のいずれかから選択されるバイオマーカーに相補的な二本鎖ＤＮＡを生じるように設計された２つのバイオマーカー特異的プライミング手段であって、ここで、第１のプライミング手段が、伸長産物を作製するためにバイオマーカーに相補的なＲＮＡ、ｃＤＮＡまたはＥＳＴに選択的にハイブリダイズし得る配列を含み、そして第２のプライミング手段が伸長産物に選択的にハイブリダイズ可能である、プライミング手段；
ｂ）逆転写酵素活性を有する酵素；
ｃ）熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素、および
ｄ）標識手段
を含み、
ここで、プライマーは、被験体中のバイオマーカーの定量的発現レベルを検出するために使用される。
個体における膀胱癌を診断または予後診断する方法が本明細書に記載され、この方法は以下の工程：
ａ）個体から得られた血液中で発現された１つ以上のタンパク質のレベルを決定する工程であって、ここで、１つ以上のタンパク質は表１に列挙される１つ以上のバイオマーカーによってコードされる、工程、および
ｂ）工程ａ）に従う血液中の１つ以上のタンパク質の各々のレベルを、肝臓癌を有さない１例以上の個体からの血液中の１つ以上のタンパク質の各々のレベルと比較する工程
を包含し、
ここで、工程ｂ）の比較における１つ以上のタンパク質の各々のレベルの違いを検出することは、工程ａ）の個体における肝臓癌を示す。
個体において膀胱癌を診断または予後診断する方法が本明細書に記載され、この方法は以下の工程：
ａ）個体から得られた血液中で発現された１つ以上のタンパク質のレベルを決定する工程であって、ここで、１つ以上のタンパク質は表１に列挙される１つ以上のバイオマーカーによってコードされる、工程
ｂ）工程ａ）に従う血液中の１つ以上のタンパク質の各々のレベルを、膀胱癌を有する１例以上の個体からの血液中の１つ以上のタンパク質の各々のレベルと比較する工程、
ｃ）工程ａ）に従う血液中の１つ以上のタンパク質の各々のレベルを、膀胱癌を有さない１例以上の個体からの血液中の１つ以上のタンパク質の各々のレベルと比較する工程、
ｄ）工程ａ）の１つ以上のタンパク質のレベルが、工程ｃ）におけるタンパク質のレベルと比較して、工程ｂ）におけるタンパク質のレベルと一緒に分類するか否かを決定する工程
を包含し、
ここで、この決定は、膀胱癌を有する工程ａ）の個体を示す。
１種以上の抗体の使用を含み、この１種以上の抗体の各々が表３に列挙されるバイオマーカーマーカーのタンパク質産物に特異的である、１種以上のタンパク質の各々のレベルを決定する工程を包含する、膀胱癌を診断または予後診断する方法を含む方法が本明細書に記載される。
モノクローナル抗体、ｆｖ、ｓｃｆｖ、ｄａｂ、ｆｄ、ｆａｂ、およびｆａｂ’２であり得る１種以上の抗体を含む、膀胱癌を診断または予後診断する方法を含む方法が本明細書に記載される。
膀胱癌を有することが知られている個体からのバイオマーカーの発現レベルを、膀胱癌を有さないことが知られている個体からのレベルと比較する工程を包含し、バイオマーカーが表１および／もしくは表２または表７または表１０または表１１および／もしくは表１２から選択される、膀胱癌の予後診断および／または診断において有用であるバイオマーカーおよび／またはバイオマーカーの組み合わせを同定する方法が本明細書に記載される。
早期の膀胱癌を有することが知られている個体からのバイオマーカーの発現レベルを、膀胱癌を有さないことが知られている個体からのレベルと比較する工程を包含し、バイオマーカーが表３および／または表４から選択される、早期の膀胱癌の予後診断および／または診断において有用であるバイオマーカーおよび／またはバイオマーカーの組み合わせを同定する方法が本明細書に記載される。
４．表
本発明の目的および特徴は、本明細書の実施例の節の後に含まれる表１−７を参照してよりいっそう理解することができる。
表１は、本発明の１つの実施形態において、膀胱癌と正常の間を区別するバイオマーカーを示す表である。バイオマーカーは、それらの遺伝子ＩＤに基づいて注記する。カラム１はＡｆｆｙＳｐｏｔＩＤであり、カラム２はｐ値であり、カラム３は倍数変化（膀胱癌／対照）であり、カラム４は遺伝子ＩＤであり、カラム５は遺伝子記号であり、そしてカラム５は遺伝子の説明である。
表２は、本発明の１つの実施形態において、ＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／ＵＳ０４／０２０８３６において以前に同定された、膀胱癌と正常の間を区別するバイオマーカーを示す表である。バイオマーカーは、それらの遺伝子ＩＤ番号に基づいて注記する。カラム１は遺伝子ＩＤであり、カラム２はヒトＲＮＡ登録番号であり、カラム３はヒトタンパク質登録番号であり、カラム４は遺伝子記号であり、そしてカラム５は遺伝子の説明である。
表３は、１つの実施形態において、核酸参照登録番号によって参照されるＲＮＡ産物、およびタンパク質参照登録番号によって参照されるタンパク質産物を含む、表１において同定されたバイオマーカーに対応する産物を示す表である。遺伝子は、それらの遺伝子ＩＤ番号に基づいて注記および同定している。カラム１はＡｆｆｙＳｐｏｔＩＤであり、カラム２は遺伝子ＩＤであり、カラム３はヒトＲＮＡ登録番号であり、カラム４はヒトタンパク質登録番号であり、カラム５は遺伝子記号であり、そしてカラム６は遺伝子の説明である。
表４は、本発明の１つの実施形態において、早期の膀胱癌と正常の間を区別するバイオマーカーを示す表である。バイオマーカーは、それらの遺伝子ＩＤに基づいて注記している。カラム１はＡｆｆｙＳｐｏｔＩＤであり、カラム２は遺伝子ＩＤであり、カラム３は遺伝子記号であり、カラム４はヒトＲＮＡ登録番号であり、カラム５はヒトタンパク質登録番号であり、そしてカラム６は遺伝子の説明である。
表５は、本発明の１つの実施形態において、ＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／ＵＳ０４／０２０８３６において以前に同定された、早期の膀胱癌と正常の間を区別するバイオマーカーを示す表である。バイオマーカーは、それらの遺伝子ＩＤ番号に基づいて注記している。カラム１は遺伝子ＩＤであり、カラム２はヒトＲＮＡ登録番号であり、カラム３はヒトタンパク質登録番号であり、カラム４は遺伝子記号であり、そしてカラム５は遺伝子の説明である。
表６は、１つの実施形態において、核酸参照登録番号によって参照されるＲＮＡ産物、およびタンパク質参照登録番号によって参照されるタンパク質産物を含む、表４において同定されたバイオマーカーに対応する産物を示す表である。遺伝子は、それらの遺伝子ＩＤ番号に基づいて注記および同定される。カラム１はＡｆｆｙＳｐｏｔＩＤであり、カラム２は遺伝子ＩＤであり、カラム３はヒトＲＮＡ登録番号であり、カラム４はヒトタンパク質登録番号であり、そしてカラム５は遺伝子記号である。
表７は、１つの実施形態において、表１と表４の間で共通して見出されるバイオマーカーを示す表である。カラム１はＡｆｆｙＳｐｏｔＩＤであり、カラム２はｐ値であり、カラム３は遺伝子ＩＤであり、カラム４は遺伝子記号であり、カラム５はヒトＲＮＡ登録番号であり、そしてカラム６はタンパク質登録番号である。
表８は、ロジットを使用する数学モデルに適用される発現データに基づいてＲＯＣ曲線を形成するために使用することができるデータを例示する表である。
表９は、可能なレポーター遺伝子およびレポーター遺伝子産物の特性を列挙する表である。
表１０は、１つの実施形態において、表１において同定し、さらに表３において注記しているバイオマーカーの特定の選択を示す表である。
表１１は、１つの実施形態において、精巣癌または腎細胞癌のいずれかと比較して、膀胱癌の間で区別される、表１においてまた同定される３４９個のバイオマーカーの選択を示す表である。バイオマーカーは、それらの遺伝子ＩＤ番号に基づいて注記する。カラム１はAffySpot IDであり、カラム２はＲｅｐｒ ＲＮＡ登録番号であり、カラム３は遺伝子ＩＤであり、カラム４は遺伝子記号であり、カラム５は倍数変化（膀胱癌／対照）であり、カラム６は疾患における調節 ｐ値 膀胱癌／対照（ＢＣｖＣ）であり、カラム７は倍数変化（膀胱癌 対 他の癌）であり、そしてカラム８は膀胱癌における調節 ｐ値（膀胱癌 対 他の癌）である。
表１２は、１つの実施形態において、表１１に同定されるバイオマーカーに対応する選択された産物を示す表であり、核酸参照登録番号によって参照されるＲＮＡ産物、およびタンパク質参照登録番号によって参照されるタンパク質産物が含まれる。遺伝子は、それらの遺伝子ＩＤ番号に基づいて注記および同定される。カラム１はＡｆｆｙＳｐｏｔＩＤであり、カラム２は遺伝子ＩＤであり、カラム３は遺伝子記号であり、カラム４はヒトＲＮＡ登録番号であり、そしてカラム５はヒトタンパク質登録番号である。
表１３は、１つの実施形態において、表１において同定されたバイオマーカーの特定の選択を示す表である。
表１４は、表１３における選択されたバイオマーカーに対応するヒトＲＮＡ産物およびヒトタンパク質産物の配列に対する登録番号を示す表である。
表１５は、表１３に列挙されるバイオマーカーに対するバイオマーカー特異的なプライマーの選択であり、これは実施例４に従って使用された。
表１６は、実施例４に記載されるような、表１３において列挙されたバイオマーカーのＲＮＡ産物の定量リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ（ＱＲＴ−ＰＣＲ）の結果を示す。
表１７は、本発明の１つの実施形態において、表１３に列挙されるようなバイオマーカーのタンパク質産物に選択的に結合する単離された抗体の実証であり、これらは市販されている。
表１８は、本発明の１つの実施形態において、表１３に注記するバイオマーカーの産物である注記しているＲＮＡ産物に相補的な二本鎖ＤＮＡを相補的に増幅する、バイオマーカー特異的プライマーおよび対応するバイオマーカー特異的プローブの選択である。
表１９は、本発明の１つの実施形態において、膀胱癌をスクリーニングするために使用することができる、選択された２つの遺伝子の組み合わせを示す。
表２０は、バイオマーカーの４つの比率の組み合わせを利用する分類子のコレクションの本発明の１つの実施形態を示し、ここで、バイオマーカーは、表１３におけるこれらのバイオマーカーから選択される。
表２１は、バイオマーカーの３つの比率の組み合わせを利用する分類子のコレクションの本発明の１つの実施形態を示し、ここで、バイオマーカーは、表１３におけるこれらのバイオマーカーから選択される。
表２２は、バイオマーカーの２つの比率の組み合わせを利用する分類子のコレクションの本発明の１つの実施形態を示し、ここで、バイオマーカーは、表１３におけるこれらのバイオマーカーから選択される。
表２３は、バイオマーカーの比率の組み合わせを利用する分類子のコレクションの本発明の１つの実施形態を示し、ここで、バイオマーカーは、表１３におけるこれらのバイオマーカーから選択される。
５．発明の詳細な説明
本発明の実務は、当業者の範囲内にある、分子生物学、微生物学および組み換えＤＮＡ技術の従来の技術を部分的に利用する。このような技術は、文献に十分に説明されている。例えば、以下を参照のこと：Sambrook, Fritsch & Maniatis，１９８９，分子クローニング：実験室マニュアル（Molecular Cloning,A Laboratory Manual）第２版；オリゴヌクレオチド合成（Oligonucleotide Synthesis）（M.J.Gait編、１９８４）；核酸ハイブリダイゼーション（Nucleic Acid Hybridization）（B.D.HarnesおよびS.J.Higgins編、１９８４）；分子クローニングの実用ガイド（A Practical Guide to Molecular Cloning）（B.Perbal，１９８４）；および酵素学の方法（Methods in Enzymology）のシリーズ（Academic Press,Inc.）；分子生物学のショートプロトコール（Short Protocols In Molecular Biology），（Ausubelら編、１９９５）。上記と下記の両方の本明細書に言及されるすべての特許、特許出願、および刊行物は、それらの全体が参照により本明細書に援用される。
本明細書に開示される発明は、膀胱癌および／または早期の膀胱癌を診断する際に有用であるバイオマーカーおよびバイオマーカーの組み合わせを同定する。これらのバイオマーカーを使用するために、本発明は、ＲＮＡ産物およびタンパク質産物を含むこれらのバイオマーカーの産物の同定について教示している。本発明はさらに、本発明のバイオマーカーのＲＮＡ産物に特異的および／または選択的にハイブリダイズする、オリゴヌクレオチド、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＣＲ産物、合成ＤＮＡ、合成ＲＮＡ、およびそのフラグメント、または天然に存在する修飾ヌクレオチドの他の組み合わせをさらに包含する。本発明はさらに、本発明のバイオマーカーのタンパク質産物に特異的および／または選択的にハイブリダイズする、タンパク質、ペプチド、抗体、リガンド、および抗原結合フラグメントを含むそのフラグメントをさらに開示する。本発明のバイオマーカーおよびバイオマーカーの組み合わせのＲＮＡ産物の発現の測定は、ＲＮＡ産物の発現を定量するために、本発明のバイオマーカーのＲＮＡ産物に特異的および／または選択的であるポリヌクレオチドを使用することによって行うことができる。本発明の特定の実施形態において、ＲＮＡ産物に特異的および／または選択的であるポリヌクレオチドは、プローブまたはプライマーである。１つの実施形態において、これらのポリヌクレオチドは、製造されたアレイにハイブリダイズ可能である核酸プローブの型である。別の実施形態において、市販のアレイは、ＲＮＡ産物の発現を測定するために使用することができ、本発明は、いずれの遺伝子の組み合わせを分析するべきかについて教示している。別の実施形態において、本発明のバイオマーカーのＲＮＡ産物に特異的および／または選択的であるポリヌクレオチドは、例えば、SYBR（登録商標）Greenを使用する、またはTaqMan（登録商標）技術もしくはMolecular Beacon技術を使用する定量リアルタイムＲＴ−ＰＣＲなどの技術においてプローブおよびプライマーの型で使用され、ここでは、使用されるポリヌクレオチドは、フォワードプライマー、リバースプライマー、TaqMan標識プローブまたはMolecular Beaconプローブの型で使用される。１つの特定の実施形態において、本発明のＲＮＡ産物の発現レベルを測定することから生成する結果は、本発明のモデルに入力することができ、これは、モデルによって規定される診断を決定するために、バイオマーカーの組み合わせを同定するために使用される。好ましい実施形態において、同じ方法が、試験個体を診断するために使用されるものと同様に、数学的モデルを生成するために使用される発現データを生成するために使用される。
本発明はさらに、本明細書に開示され、かつ本発明のバイオマーカーのタンパク質産物を測定するために当業者によって公知であるタンパク質またはポリペプチドの使用を意図する。次いで、当業者に公知である技術（例えば、ウェスタンブロッティング、免疫沈降、タンパク質マイクロアレイ分析などのような技術）が、本発明のバイオマーカーに対応するタンパク質産物のレベルを測定するために使用することができる。当業者に理解されるように、本発明のバイオマーカーのタンパク質産物の発現レベルの測定は、本発明の各々のバイオマーカーに対応するタンパク質産物の１つ以上に特異的または選択的に結合するタンパク質を必要とする。次いで、本発明のバイオマーカーのタンパク質産物の発現レベルを表示するデータは、モデルによって規定されるように診断を決定するために、生成されたモデルに入力されて組み合わせを同定することができる。好ましい実施形態において、同じ方法が、試験個体を診断するために使用されるものと同様に、数学的モデルを生成するために使用される発現データを生成するために使用される。
５．１ 本発明における使用のためのサンプル
本明細書で他に示されない限り、被験体からの膀胱組織サンプルが、血液サンプル、血清サンプル、およびリンパ節サンプルが可能であるものと同様に、本発明の方法に従って使用されてもよい。このようなサンプルを入手し、かつ本発明の方法に従って使用されてもよい被験体の例には以下が含まれるがこれらに限定されない：症状が見られない被験体、膀胱癌の１つ、２つ、３つ、４つまたはそれ以上の症状が顕在しまたはそれらを示す被験体、膀胱癌または早期の膀胱癌を有すると臨床的に診断された被験体、膀胱癌の素因がある被験体（例えば、膀胱癌の家族歴がある被験体、膀胱癌の遺伝的素因を有する被験体、および彼らに膀胱癌が生じやすくし、または膀胱癌を発症する可能性を増加する生活様式を送っている被験体）、膀胱癌を有すると疑われている被験体、膀胱関連障害について治療を受けている被験体、膀胱癌および少なくとも１つの他の症状を有する被験体（例えば、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれ以上の症状を有する被験体）、膀胱癌の治療を受けていない被験体、医療従事者（例えば、医師）によって、健常であるかまたは膀胱癌でない（すなわち、正常）と決定された被験体、膀胱癌について治療が成功した被験体を含む、膀胱癌について治療された被験体、彼らの膀胱癌を管理している被験体、ならびに膀胱癌であると診断されていない被験体。
別の実施形態において、サンプルがそこから入手されかつ利用されてもよい被験体は、早期の膀胱癌を有する。さらなる実施形態において、サンプルがそこから入手してもよい被験体は試験個体であり、ここで、その人が膀胱癌を有するか否かは未知であり、および／または試験個体がどの段階の膀胱癌を有するかは未知である。
５．１．１ 組織
１つの態様において、組織サンプルは、１例以上の被験体から、任意の公知の方法を使用して入手される。特定の実施形態において、組織は、膀胱癌を有すると疑われている個体から入手される。好ましくは、組織サンプルは、必要とされるまで、液体窒素中で保存される。特定の実施形態において、最小限０．０５ｇの組織サンプルが、総ＲＮＡを求めるために単離される。別の実施形態において、最小限０．０２５ｇの組織サンプルが、総ＲＮＡを求めるために単離される。本発明に従って有用である組織サンプルは、本発明に従う１つ以上の核酸配列またはアミノ酸配列の検出のために十分である量である。
５．１．２ 血液
本発明の１つの態様において、血液のサンプルは、当該分野で周知である方法に従って被験体から入手される。血液のサンプルは、本明細書に記載されるように、本明細書に記載されるような任意の被験体から入手してもよい。ある実施形態において、一滴の血液は、被験体の皮膚に作られた単回の針刺しから採取される。一滴の血液は、本明細書に開示されるように、１ｍｌ未満の容量を含む。ある実施形態において、針刺しから採取される一滴の血液が必要とされるすべてである。血液は、当業者に公知である技術、特に、当該分野において公知である瀉血療法を使用して、身体の任意の部分（例えば、指、手、手首、腕、脚、足、および首）から、被験体から引き出されてもよい。
採取される血液の量は、採取した部位、本発明の方法のために必要とされる量、および被験体が感じる苦痛に応じてして変化する。しかし、本発明の１つの実施形態の利点は、本発明の方法を実施するために必要とされる血液の量を少なくすることが可能であり、サンプルを入手するためにより侵襲的な手順が必要とされないことである。例えば、ある実施形態において、必要とされるすべては一滴の血液である。この一滴の血液は、例えば、単回の針刺しから入手することができる。ある実施形態において、任意の量の血液が採取され、これは、表１−７、または１０−１２のいずれかに列挙される１個、２個、３個、４個、５個、１０個またはそれ以上の遺伝子の発現を検出するために十分である。このようなものとして、ある実施形態において、採取される血液の量は、１ｍｌ以下、５００μｌ以下、２５０μｌ以下、２００μｌ以下、１００μｌ以下、５０μｌ以下、２０μｌ以下、１０μｌ以下、１μｌ以下、０．５μｌ以下、０．１μｌ以下、または０．０１μｌ以下である。しかし、本発明は、このような実施形態に限定されない。ある実施形態において、より多くの血液が利用可能であり、ある実施形態において、より多くの血液が、本発明の方法をもたらすために使用することができる。このようなものとして、種々の特定の実施形態において、採取される血液の量は、０．００１ｍｌ、０．００５ｍｌ、０．０１ｍｌ、０．０５ｍｌ、０．１ｍｌ、０．１５ｍｌ、０．２ｍｌ、０．２５ｍｌ、０．５ｍｌ、０．７５ｍｌ、１ｍｌ、１．５ｍｌ、２ｍｌ、３ｍｌ、４ｍｌ、５ｍｌ、１０ｍｌ、１５ｍｌまたはそれ以上の血液が被験体から採取される。別の実施形態において、０．００１ｍｌ〜１５ｍｌ、０．０１ｍｌ〜１０ｍｌ、０．１ｍｌ〜１０ｍｌ、０．１ｍｌ〜５ｍｌ、１〜５ｍｌの血液が被験体から採取される。
本発明のある実施形態において、血液は、Ｋ３／ＥＤＴＡチューブ中に保存される。別の実施形態において、米国特許第６，６１７，１７０号（これは参照により本明細書に援用される）に開示されるような安定剤を含む、血液を保存するためのチューブを利用することができる。別の実施形態において、Qiagen/BD系列のPreAnalytiXによって供給されるPAXgege（商標）血液ＲＮＡシステムが、血液を採取するために使用されてもよい。さらに別の実施形態において、Applied Biosystemsによって提供されるTempus（商標）血液ＲＮＡ採取チューブが使用されてもよい。Tempus（商標）採血チューブは、全血コレクションのためのＲＮＡ安定剤を含む密封真空プラスチックチューブを提供する。
採取された血液は、任意に、しかし好ましくは、本発明の方法に従う使用の前に、４℃などの冷蔵温度または氷上で保存される。ある実施形態において、血液は、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、１０時間または２４時間までのみ維持される。ある実施形態において、血液の保存に加えて、または血液の保存の代わりに、単離された核酸またはタンパク質は、より後での使用のために、一定の時間保存される。このようなバイオマーカーの保存は、１時間以上、１日以上、１週間以上、１ヶ月以上、１年以上、または無期限であり得る。
１つの態様において、全血は、当該分野で周知の瀉血療法に従って、正常個体から、または変形性関節症と診断されたかもしくは変形性関節症を有すると疑われている個体から入手される。全血は未分画の全血を含み、これは、当該分野で周知の方法に従って（例えば、好ましくは、５〜１０分間、３００〜８００×ｇにおける穏やかな遠心分離を使用する）、血清または血漿が除去されかつ残りの血液サンプルからＲＮＡまたはｍＲＮＡが単離された血液を含む。特定の実施形態において、未分画の全血はまた、溶解緩衝液（例えば、溶解緩衝液（１Ｌ）：０．６ｇ ＥＤＴＡ；１．０ｇ ＫＨＣＯ２、８．２ｇ ＮＨ４Ｃｌ、ｐＨ ７．４に調整（ＮａＯＨを使用する））と血液を混合することによって処理された全血を含み、サンプルは遠心分離され、細胞ペレットが保持され、そしてＲＮＡまたはｍＲＮＡが当該分野で公知の方法に従って抽出される（例えば、「溶解された全血」）（例えば、Sambrookらを参照のこと）。全血の使用は、これが血液中の細胞型を分離するためのコストが高くおよび時間がかかる必要性を回避するので、好ましい（Kimoto，１９９８，Mol.Gen.Genet ２５８：２３３−２３９；Chelly Jら、１９８９，Proc.Nat.Acad.Sci.USA ８６：２６１７−２６２１；Chelly Jら、１９８８，Nature ３３３：８５８−８６０）。
本発明のある実施形態において、被験体から採取した全血は分画される（すなわち、成分に分離される）。本発明の特定の実施形態において、血液細胞は、当該分野で公知の技術を使用して被験体から採取された全血から分離される。例えば、被験体から採取された血液は、Ficoll-Hypaque（Pharmacia）勾配遠心分離に供することができる。このような遠心分離は、種々の型の有核細胞から、および血漿から赤血球を分離する。特に、Ficoll-Hypaque勾配遠心分離は、本発明の方法に従って使用することができる末梢血白血球（ＰＢＬ）を単離するために有用である。
例として、しかし限定ではなく、マクロファージは、以下のようにして入手することができる。単核細胞は、シリンジによる血液の取り出し、続いてFicoll-Hypaque勾配遠心分離によって、被験体の末梢血から単離される。組織培養ディッシュは、被験体自身の血清で、またはＡＢ＋ヒト血清でプレコートし、３７℃で１時間インキュベートする。非接着細胞はピペッティングによって除去する。リン酸緩衝化生理食塩水中の冷（４℃）１ｍＭ ＥＤＴＡは、ディッシュに残った接着細胞に加えられ、ディッシュは１５分間室温で放置される。細胞は採取され、ＲＰＭＩ緩衝液で洗浄され、そしてＲＰＭＩ緩衝液に懸濁される。マクロファージの数の増加は、３７℃においてマクロファージ−コロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）とインキュベートすることによって得ることができる。Ｍａｃ−１などのマクロファージ特異的表面マーカーに対する抗体は、このような分子への親和性化合物のコンジュゲートによって標識することができ、マクロファージの検出および同定を容易にする。使用可能な親和性化合物には、ビオチン、フォトビオチン、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、またはフィコエリトリン（ＰＥ）、または当該分野で公知である他の化合物が含まれるがこれらに限定されない。次いで、標識抗体を保持している抗体が、このような抗体を結合しない細胞から、例えば、種々の細胞ソーティング方法、アフィニティークロマトグラフィー、およびパニングであるがこれらに限定されない、当該分野で公知の技術によって分離される。
血液細胞は、蛍光活性化細胞ソーター（ＦＡＣＳ）を使用して分別することができる。蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）は、粒子の蛍光特性に基づいて、細胞を含む、粒子を分離するための公知の方法である。例えば、Kamarch，１９８１，Methods Enzymol １５１：１５０−１６５を参照のこと。個別の粒子中の蛍光部分のレーザー励起は小さな電気的変化を生じ、混合物からの正の粒子および含まれるがこれらに限定されないの粒子の電磁的な分離を可能にする。特定の血液細胞の細胞表面上に存在する血液細胞の抗原決定基を検出するために使用される抗体またはリガンドは、ＦＩＴＣまたはフィコエリトリンなどの蛍光色素で標識される。細胞は、標識された抗体またはリガンドが細胞に結合することを可能にするために十分な時間の間、蛍光標識された抗体またはリガンドとともにインキュベートされる。細胞は細胞ソーターを通して処理され、他の細胞からの目的の細胞の分離を可能にする。ＦＡＣＳ分別粒子は、分離を容易にするために、マイクロタイタープレートの個別のウェルに直接的に沈降可能である。
磁気ビーズもまた、本発明のある実施形態において、血液細胞を分離するために使用することができる。例えば、血液細胞は、磁気ビーズ（０．５〜１００ｍ直径）を結合するそれらの能力に基づいて粒子を分離するための方法である、磁気活性化細胞ソーティング（ＭＡＣＳ）技術を使用して分別することができる。種々の有用な修飾は、磁気ミクロスフェア上で実施することができ、これには、細胞−固相表面分子またはハプテンを特異的に認識する抗体の共有結合的付加が含まれる。次いで、選択されたビーズを物理的に操作するために磁場が適用される。特定の実施形態において、血液細胞表面マーカーに対する抗体が磁気ビーズにカップリングされる。次いで、ビーズは、血液細胞培養と混合され、結合を可能にする。次いで、細胞は磁場を通過し、目的の血液細胞表面マーカーを有する細胞を分離する。次いで、これらの細胞は分離することができる。
ある実施形態において、培養ディッシュの表面は抗体でコートされ、パニングと呼ばれる方法によって血液細胞を分離するために使用されてもよい。個別のディッシュは、特定の血液細胞に特異的な抗体でコートすることができる。細胞は、最初に、目的の血液細胞特異的な抗体でコードされたディッシュに加えることができる。完全に濯いだ後、ディッシュに結合したままである細胞は、目的の血液細胞マーカーを発現する細胞である。細胞表面抗原決定基またはマーカーの例には以下が含まれるがこれらに限定されない：Ｔリンパ球およびナチュラルキラー細胞についてのＣＤ２、Ｔリンパ球についてのＣＤ３、白血球についてのＣＤ１１ａ、Ｔリンパ球についてのＣＤ２８、Ｂリンパ球についてのＣＤ１９、Ｂリンパ球についてのＣＤ２０、Ｂリンパ球についてのＣＤ２１、Ｂリンパ球についてのＣＤ２２、Ｂリンパ球についてのＣＤ２３、白血球についてのＣＤ２９、単球についてのＣＤ１４、血小板についてのＣＤ４１、血小板についてのＣＤ６１、顆粒球についてのＣＤ６６、顆粒球についてのＣＤ６７、ならびに単球およびマクロファージについてのＣＤ６８。
全血は、白血球、血小板、赤血球などの細胞型に分画することができ、このような細胞型は本発明の方法に従って使用することができる。白血球は標準的な技術を使用して、顆粒球および無顆粒白血球にさらに分離することができ、このような細胞は本発明の方法に従って使用することができる。顆粒球は、標準的な技術を使用して、好中球、好酸球、および好塩基球に分離することができ、このような細胞は本発明の方法に従って使用することができる。無顆粒白血球は、標準的な技術を使用して、リンパ球（例えば、Ｔリンパ球およびＢリンパ球）および単球に分離することができ、このような細胞は本発明の方法に従って使用することができる。Ｔリンパ球は、標準的な技術を使用して、細胞傷害性Ｔ細胞から分離されたＢリンパ球およびヘルパーＴ細胞から分離することができ、このような細胞は本発明の方法に従って使用することができる。分離された血液細胞は、本発明の方法における使用の前に標準的な技術によって凍結することができる。
本発明に従って有用である血液サンプルは、本発明に従う１つ以上の核酸またはアミノ酸配列の検出のために十分である量である。特定の実施形態において、本発明に従って有用である血液サンプルは、１μｌ〜１００ｍｌ、好ましくは１０μｌ〜５０ｍｌ、より好ましくは１０μｌ〜２５ｍｌ、および最も好ましくは１０μｌ〜１ｍｌの範囲の量である。
５．１．３ 血清
本発明の１つの態様において、血清は、最初に血液サンプルを単離する工程、および当該分野において周知の方法に従って血液の残りから血清を分離するために、その後のサンプルを回転（遠心分離）させる工程から入手される。血清サンプルは、本明細書に記載されるような任意の被験体から入手してもよい。採取した血清の量は、血液を採取した部位、本発明の方法のために必要とされる量、および被験体の快適さに依存して変化する。しかし、本発明の１つの実施形態の利点は、本発明の方法を実施するために十分な血清を提供するために必要とされる血液の量を少なくすることが可能であり、サンプルを入手するためにより侵襲的な手順が必要とされないことである。例えば、ある実施形態において、必要とされるすべては一滴の血液であり、採取される血清の量は、１ｍｌ以下、５００μｌ以下、２５０μｌ以下、２００μｌ以下、１００μｌ以下、５０μｌ以下、２０μｌ以下、１０μｌ以下、１μｌ以下、０．５μｌ以下、０．１μｌ以下、または０．０１μｌ以下である。しかし、本発明は、このような実施形態に限定されない。ある実施形態において、より多くの血液が利用可能であり、ある実施形態において、より多くの血液が、本発明の方法をもたらすために使用することができる。
５．２ ＲＮＡ調製
本発明の１つの態様において、ＲＮＡは、本発明のバイオマーカーのＲＮＡ産物を測定するために個体から単離される。ＲＮＡは、本明細書に記載されるように、組織サンプルから単離される。サンプルは、単一の患者からのものであり得、または複数の患者からプールすることができる。
別の態様において、ＲＮＡは、本明細書に記載されるように、変形性関節症を有するヒトの血液サンプルから直接的に単離される。サンプルは、単一の患者からのものであり得、または複数の患者からプールすることができる。
総ＲＮＡは、当該分野において周知である方法に従って、組織サンプルから抽出される。１つの実施形態において、ＲＮＡは、以下の方法に従って組織から精製される。個体または患者からの目的の組織の取り出し後、組織は、液体窒素中で急速冷凍し、ＲＮＡの分解を予防する。一定量の組織グアニジニウム溶液の添加の際に、組織試料は、ティシュマイザー中で、２回または３回の１０秒間のバーストにより粉砕する。組織グアニジニウム溶液（１Ｌ）を調製するために、５９０．８ｇのグアニジニウム イソチオシアネートを、約４００ｍｌ ＤＥＰＣ処理Ｈ２Ｏ中に溶解する。２５ｍｌの２Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ ７．５（最終０．０５Ｍ）および２０ｍｌ Ｎａ２ＥＤＴＡ（最終０．０１Ｍ）を加え、溶液は一晩攪拌し、容量は９５０ｍｌに調整し、そして５０ｍｌ ２−ＭＥを加える。
ホモジナイズした組織サンプルは、１２℃において１２，０００×ｇ、１０分間の遠心分離に供される。得られた上清は、０．１容量の２０％ Ｓａｒｋｏｓｙｌの存在下で、６５℃で２分間インキュベートし、９ｍｌの５．７Ｍ ＣｓＣｌ溶液（０．１ｇ ＣｓＣｌ／ｍｌ）の上に重層し、そして２２℃において１１３，０００×ｇ、一晩の遠心分離によって分離する。上清の注意深い除去後、チューブを転倒し、水分を流す。チューブの底（ＲＮＡペレットを含む）は５０ｍｌプラスチックチューブに配置し、３ｍｌ組織再懸濁緩衝液（５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％（ｖ／ｖ）Ｓａｒｋｏｓｙｌ、５％（ｖ／ｖ）２−ＭＥ）の存在下で４℃にて一晩（またはより長く）インキュベートして、ＲＮＡペレットの完全な再懸濁を可能にする。得られるＲＮＡ溶液は、２５：２４：１ フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール、続いて２４：１ クロロホルム／イソアミルアルコールで連続的に抽出し、３Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ ５．２および２．５体積の１００％エタノールの添加によって沈殿させ、そしてＤＥＰＣ水中で再懸濁させる（Chirgwinら、１９７９，Biochemistry，１８：５２９４）。
代替的には、ＲＮＡは、以下の単一段階プロトコールに従って組織から単離される。目的の組織は、１００ｍｇ組織あたり１ｍｌ変性溶液（４Ｍ グアニジニウムチオサルフェート、２５ｍＭ クエン酸ナトリウム、ｐＨ ７．０、０．１Ｍ ２−ＭＥ、０．５％（ｗ／ｖ）Ｎ−ラウリルサルコシン）中、ガラステフロン(登録商標)ホモジナイザー中での均質化によって調節される。５ｍｌポリプロピレンチューブへのホモジネートの移動後、０．１ｍｌの２Ｍ 酢酸ナトリウム、ｐＨ ４、１ｍｌ 水飽和フェノール、および０．２ｍｌの４９：１ クロロホルム／イソアミルアルコールを連続して加える。サンプルは、各成分の添加後に混合し、すべての成分の添加後、０〜４℃で１５分間インキュベートする。このサンプルは、４℃にて１０，０００×ｇ、２０分間の遠心分離によって分離し、１００％イソプロパノールを１ｍｌ添加によって沈殿し、−２０℃にて３０分間インキュベートし、そして４℃にて１０，０００×ｇで１０分間の遠心分離によってペレット化する。得られるＲＮＡペレットは、０．３ｍｌ変性溶液に溶解し、微量遠心チューブに移し、０．３ｍｌの１００％イソプロパノールの添加により−２０℃で３０分間沈殿し、そして４℃にて１０，０００×ｇで１０分間遠心分離する。このＲＮＡペレットは、７０％エタノール中で洗浄し、乾燥させ、そして１００〜２００μｌ ＤＥＰＣ処理水またはＤＥＰＣ処理０．５％ ＳＤＳ中に再懸濁する（ChomczynskiおよびSacchi，１９８７，Anal.Biochem.，１６２：１５６）。
好ましくは、組織サンプルは液体窒素下で微細に粉末化され、総ＲＮＡはTRIzol（登録商標）試薬（GIBCO/BRL）を使用して抽出される。
代替的には、ＲＮＡは血液から単離される。１つの実施形態において、ＲＮＡは、以下のプロトコールによって単離される。溶解緩衝液は、１部の血液に対して３部の溶解緩衝液の比率で、血液サンプルに加えられる（溶解緩衝液（１Ｌ）０．６ｇ ＥＤＡＴ；１．０ｇ ＫＨＣＯ２、８．２ｇ ＮＨ４Ｃｌ、ｐＨ ７．４に調整（ＮａＯＨを使用する））。試料は混合し、透明になるまで５〜１０分間氷上に配置する。溶解したサンプルを、４℃にて１０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を吸引する。ペレットは５ｍｌ 溶解緩衝液に再懸濁し、４℃にて１０００ｒｐｍで１０分間再度遠心分離する。ペレット化した細胞は、TRIzol（登録商標）（GIBCO/BRL）を元の血液サンプルの１０ｍｌ毎に約６ｍｌのTRIzol（登録商標）の割合で使用し、そして十分に渦状に掻き回してホモジナイズする。サンプルは室温で５分間放置する。ＲＮＡは１ｍｌのTRIzol（登録商標）あたり１．２ｍｌのクロロホルムを使用して抽出する。サンプルは４℃にて１２，０００×ｇで５分間遠心分離し、上層を回収する。上層に、イソプロパノールを、１ｍｌのTRIzol（登録商標）あたり０．５ｍｌの割合で加える。サンプルは−２０℃にて一晩、または−２０℃にて１時間放置する。ＲＮＡは公知の方法に従ってペレット化し、ＲＮＡペレットは風乾し、そしてペレットはＤＥＰＣ処理ｄｄＨ２Ｏ中に再懸濁する。ＲＮＡサンプルはまた、７５％エタノール中に保存することができ、ここで、サンプルは輸送のために室温では安定である。
代替的には、ＲＮＡは、上記のようにTRIzol（登録商標）（GIBCO/BRL）を使用して、滑液から単離される。
ＲＮＡの純度および完全性は、２６０／２８０ｎｍにおける吸光度、およびアガロースゲル電気泳動、それに続く紫外光下での検査によって評価される。
５．３ 本発明のバイオマーカー
１つの実施形態において、本発明は、バイオマーカーの産物の発現レベルの測定が軽度の膀胱癌の存在を示すバイオマーカーおよびバイオマーカーの組み合わせを提供する。別の実施形態において、本発明は、当該バイオマーカーの産物の発現レベルの測定が、個体が膀胱癌および／または早期の膀胱癌の存在を有するか否かを診断するために使用することができるバイオマーカーおよびバイオマーカーの組み合わせを提供する。
表１は、本発明のバイオマーカーについての遺伝子名および関連する遺伝子ＩＤ（以前には遺伝子座リンクＩＤ）のリストを提供し、ここで、バイオマーカーの発現レベルの測定が、個々にまたは組み合わせてかのいずれかで、膀胱癌を有するか、または膀胱癌を有さないかとして個体を診断するために使用することができる。当業者によって理解されるように、遺伝子ＩＤは、列挙されたバイオマーカーに対応するすべてのＲＮＡ転写物、およびすべてのタンパク質の配列を決定するために使用することができる。
表２は、ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ０４／０２０８３６に開示されるバイオマーカーを提供し、これは、膀胱癌を診断するために、または膀胱癌を有する人もしくは膀胱癌を有さない人の間を区別するために、本明細書に教示されるような表１に開示される１種以上のバイオマーカーと組み合わせて使用することができる。
表３は、特に、表１に列挙されるバイオマーカーのＲＮＡ産物に対応する参照登録番号、およびバイオマーカーのタンパク質産物に対応する参照登録番号を示す。
表４は、本発明のバイオマーカーのための遺伝子名および付随する遺伝子ＩＤのリストを提供し、ここで、バイオマーカーの発現レベルの測定は、個々にまたは組み合わせてかのいずれかで、早期の膀胱癌を有するか、または膀胱癌を有さないとして個体を診断するために使用することができる。当業者によって理解されるように、遺伝子ＩＤは、本発明のバイオマーカーに対応するすべてのＲＮＡ転写物、およびすべてのタンパク質の配列を決定するために使用することができる。
表５は、ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ０４／０２０８３６に開示されるバイオマーカーを提供し、これは、早期の膀胱癌を診断するために、または早期の膀胱癌を有する人もしくは膀胱癌を有さない人の間を区別するために、本明細書に教示されるような表４に開示される１種以上のバイオマーカーと組み合わせて使用することができる。
表６は、特に、表４に列挙されるバイオマーカーのＲＮＡ産物に対応する参照登録番号、およびバイオマーカーのタンパク質産物に対応する参照登録番号を開示する。
表７は、特に、膀胱癌であるかそうでないかを区別する、本発明のバイオマーカーについての遺伝子名および付随する遺伝子ＩＤのリストを開示する。
表１０は、特に、膀胱癌であるかそうでないかを区別する、表１に同定されるバイオマーカーの選択のための遺伝子名および付随する遺伝子ＩＤのリストを開示する。
表１１は、本発明のバイオマーカーの選択のための遺伝子名および関連する遺伝子ＩＤ（以前には遺伝子座リンクＩＤ）のリストを提供し、ここで、バイオマーカーの発現レベルの測定が、個々にまたは組み合わせてかのいずれかで、膀胱癌を有するか；または膀胱癌を有さないかとして個体を診断するために使用することができる。当業者によって理解されるように、遺伝子ＩＤは、列挙されたバイオマーカーに対応するすべてのＲＮＡ転写物、およびすべてのタンパク質の配列を決定するために使用することができる。
表１２は、特に、表１１に列挙されるバイオマーカーのＲＮＡ産物に対応する参照登録番号、およびバイオマーカーのタンパク質産物に対応する参照登録番号を開示する。
従って、本発明は、上記に概略された目的の各々のためのこれらのバイオマーカーおよびバイオマーカーの組み合わせの発現を測定するために、当業者に公知であり、かつ本明細書に概略された方法の使用を包含する。
５．４ バイオマーカーの組み合わせ
１つの実施形態において、本発明のバイオマーカーの組み合わせは、表１に列挙されたバイオマーカーの２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、１０個、２０個、３０個、４０個、５０個、１００個、１２５個、１５０個、１７５個、２００個まで、またはすべての任意の数の任意の組み合わせを含む。本発明の別の実施形態において、本発明のバイオマーカーの組み合わせは、表２に列挙されたバイオマーカーの任意の１つ、または１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、１０個、２０個、３０個、４０個、５０個、１００個、２５０個、５００個、７５０個、１０００個、１５００個、２０００個、２５００個、３０００個、３５００個、４０００個まで、またはすべての任意の数と組み合わせた、表１に列挙されたバイオマーカーの任意の１つ、または１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、１０個、２０個、３０個、４０個、５０個、１００個、１２５個、１５０個、１７５個、２００個まで、もしくはすべての任意の数の任意の組み合わせを含み、その産物の発現の測定は、個体が膀胱癌を有するかまたは膀胱癌を有さないかを診断するために使用することができる。別の実施形態において、本発明のバイオマーカーの組み合わせは、表３に列挙されたＲＮＡ産物および／またはタンパク質産物の２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、１０個、２０個、３０個、４０個、５０個、１００個、１５０個、２００個、２５０個、３００個、３５０個、４００個、４５０個、５００個、１０００個、１２５０個、１５００個、１７５０個、２０００個、まで、またはすべての任意の数の任意の組み合わせを含む。別の実施形態において、本発明のバイオマーカーの組み合わせは、表４に列挙されたバイオマーカーの２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、１０個、２０個、３０個、４０個、５０個、１００個、１２５個、１５０個、１７５個、２００個、２５０個、３００個、３５０個、４００個、４５０個、５００個まで、またはすべての任意の数の任意の組み合わせを含む。別の本発明の実施形態において、本発明のバイオマーカーの組み合わせは、表５に列挙されたバイオマーカーの任意の１つ、または１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、１０個、２０個、３０個、４０個、５０個、１００個、１５０個、２００個、２５０個、３００個、３５０個、４００個、４５０個、５００個、１０００個、１２５０個、１５００個、１７５０個、２０００個、２２５０個まで、もしくはすべての任意の数と組み合わせた、表４に列挙されたバイオマーカーの任意の１つ、または１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、１０個、２０個、３０個、４０個、５０個、１００個、１２５個、１５０個、１７５個、２００個、２５０個、３００個、３５０個、４００個、４５０個、５００個、まで、もしくはすべての任意の数の任意の組み合わせを含み、その産物の発現の測定は、個体が早期の膀胱癌を有するかまたは膀胱癌を有さないかを診断するために使用することができる。別の実施形態において、本発明のバイオマーカーの組み合わせは、表６に列挙されたＲＮＡ産物および／またはタンパク質産物の２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、１０個、２０個、３０個、４０個、５０個、１００個、１５０個、２００個、２５０個、３００個、３５０個、４００個、４５０個、５００個、１０００個、１２５０個、１５００個、１７５０個、２０００個、２２５０個、２５００個、２７５０個、３０００個、３２５０個、まで、またはすべての任意の数の任意の組み合わせを含む。別の本発明の実施形態において、本発明のバイオマーカーの組み合わせは、表７に列挙されたバイオマーカーの１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、１０個、２０個、３０個、４０個、５０個、７５個、１００個、１２５個、１５０個、１７５個、２００個、まで、またはすべての任意の数の任意の組み合わせを含む。別の実施形態において、本発明のバイオマーカーの組み合わせは、表１０に列挙されたバイオマーカーの２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、まで、またはすべての任意の数の任意の組み合わせを含む。
例えば、ｎ個の遺伝子のサブセットｍの可能な組み合わせの数は、以下の一般式を使用して、Ｆｅｌｌｅｒ，確率理論の序論（Intro to Probability Theory）、第３版、第１巻、１９６８、J.Wiley編に記載されている：
ｍ！／（ｎ）！（ｍ−ｎ）！
１つの実施形態において、ｎが２でありｍが１９である場合、
１９！／２！（１９−２）！＝１９×１８×１７×１６×１５×１４×１３×１２×１１×１０×９×８×７×６×５×４×３×２×１／（２×１）（１９×１８×１７×１６×１５×１４×１３×１２×１１×１０×９×８×７×６×５×４×３×２×１）＝１．２１６ １０１７／７．１１ １０１４＝１７１
通りの固有の２個の遺伝子の組み合わせが存在する。これらの２個の遺伝子の組み合わせの各々の遺伝子発現の測定は、患者が膀胱癌を有するか否かを決定するために独立して使用することができる。ｍが１９でありｎが３である別の特定の例において、１９！／３！（１９−３）！通りの固有の３個の遺伝子組み合わせが存在する。これらの固有の３個の遺伝子の組み合わせの各々は、患者が膀胱癌を有するか否かを決定するためのモデルとして独立して働くことができる。
５．５ 特に有用なバイオマーカーの組み合わせ
本発明の表１−７および表１０−１３のいずれかに列挙されたバイオマーカーの組み合わせは、それぞれ、膀胱癌および／または早期の膀胱癌を診断するために有用であるが、本発明はさらに、膀胱癌を診断するために特に有用であり得る、任意の特定の表または表の組み合わせからのバイオマーカーの組み合わせを選択および評価する手段を提供する。
バイオマーカーの有用な組み合わせを同定するために、バイオマーカーの組み合わせの各バイオマーカーの発現レベルを反映するデータを使用して、本発明の数学的モデルが、膀胱癌および／または早期の膀胱癌と、非膀胱癌の間を区別することが可能である分類子を発生するために使用され、ここで各バイオマーカーは、表１−７および表１０−１３の１つ以上において同定されるバイオマーカーから選択される。次いで、分類子は、膀胱癌および／または早期の膀胱癌を有するとして個体を診断することが最も可能である分類子（および従ってバイオマーカーの組み合わせ）を選択するために、膀胱癌および／または早期の膀胱癌と、非膀胱癌の間を区別するそれらの能力について、評価およびスコアリングされる。
分類子は、トレーニング集団内の各個体についての２つ以上の選択されたバイオマーカーの産物の発現レベルを表すデータを使用することによって、および数学的モデルを適用することによって作製される。得られる分類子が所望の有用性を有することを確実にするために、トレーニング集団の表現型特徴が重要である。例えば、１つの実施形態において、使用されるトレーニング集団は、２つの表現型亜集団−膀胱癌を有することが知られている個体、および膀胱癌を有さないことが知られている個体から構成され、バイオマーカーは、表１および／もしくは表２または表７または表１０または表１１および／もしくは表１２から選択される。別の実施形態において、使用されるトレーニング集団は、２つの表現型亜集団−早期の膀胱癌を有することが知られている個体、および膀胱癌を有さないことが知られている個体から構成され、バイオマーカーは、表３および／もしくは表４から選択される。
数学的モデルへの入力であるデータは、評価されるバイオマーカーの組み合わせの各バイオマーカーの産物の発現レベルとして代表的な任意のデータであり得る。１つの実施形態において、各バイオマーカーについての数学モデルへのデータ入力は、バイオマーカーのＲＮＡ産物を測定すること、および／またはバイオマーカーのタンパク質産物を測定することを含む、遺伝子発現レベルを測定するために当業者に公知である任意の方法を使用して得られたデータである。好ましい実施形態において、数学的モデルへのデータ入力は、定量リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）を使用して入手されたデータである。
バイオマーカーの特に有用な組み合わせを同定するために、表１、表２、表１および表２の組み合わせ、表４、表５、表４および表５の組み合わせ、表７または表１０のいずれか１つについてのバイオマーカーのすべての可能な組み合わせについて分類子を発生することが可能であり、次いで、分類子をスコアリングして、膀胱癌または早期の膀胱癌を診断するために最も有用であるスコアリングされた分類子を選択することができる。
分類子を発生するために、数学的モデルが使用される。本発明に従って有用である数学的モデルは以下から選択することができる：回帰モデル、ロジスティック回帰モデル、ニューラルネットワーク、クラスター化モデル、主成分分析、最近傍分類子分析、線形判別分析、二次判別分析、サポートベクタマシン、決定木、遺伝的アルゴリズム、バギングを使用する分類子最適化、ブースティングを使用する分類子最適化、ランダム部分空間法を使用する分類子最適化、射影追跡、および加重投票。
生成した分類子は、次に、５節において概説されるように、膀胱癌を有し、および／または早期膀胱癌を有するとして個体を診断するために、十分な感度および／または特異性の分類子を同定するために、スコアリングおよび／またはランク付けされる。分類子をスコアリングするために、分類子は、本明細書に記載されるようなトレーニング集団の各個体を正確に呼び出す分類子の能力を決定するために試験することができる。生成した分類子はまた、「スコアリング集団」の１つ以上の個体を正確に呼び出す分類子の能力を決定することによって、評価またはスコアリングすることができる。スコアリング集団は、以下の５．７節に記載されるトレーニング集団と類似しているが、しかし、スコアリング集団は、分類子を生成するために使用されない、１つ以上の個体を形成する。このようにして、スコアリング集団は、例えば、膀胱癌（第１の表現型亜群）を有するとすでに診断された個体（第１の表現型群）および膀胱癌を有さない個体（第２の表現型群）から構成される。１つの実施形態において、スコアリング集団は、トレーニング集団において使用されない１つ以上のメンバーに加えて、トレーニング集団のメンバーを含む。ある実施形態において、５パーセント以下、１０パーセント以下、２０パーセント以下、３０パーセント以下、５０パーセント以下、または９０パーセント以下のトレーニング集団のメンバーが、スコアリング集団と共通である。
当業者によって理解されるように、このことは、その表現型の特徴付けが未知である個体を適切に特徴付けする分類子の能力を予測することを可能にする。
得られる分類子は、当該試験個体が膀胱癌および／または早期の膀胱癌を有するか否かを決定するために、未知のまたは試験個体を診断するために使用することができる。１つの実施形態において、２つ以上の分類子（「分類子群」）が試験個体の診断を決定するために使用することができる。例えば、ある実施形態において、上位１０個にランク付けされた分類子、上位２０個にランク付けされた分類子、または上位１００個にランク付けされた分類子が選択される。ある実施形態において、上位１個〜上位５００個にランク付けされた分類子のいずれかが選択される。分類子の群が診断のために使用される例において、１つの実施形態において、各分類子は、被験体の診断が分類子の組み合わせの結果として決定されるように、被験体の診断に一票を与える。他の実施形態において、異なる重み付けスキーマが各分類子に適用される。例えば、重み付けスキーマは、元の分類子のスコア、ログオッズ比（「ロジット」）、各分類子についての係数のサイズ、これらのいくつかの組み合わせなどのような要因に基づく重み付けを含み得る。
１つの実施形態において、分類子または分類子群は、上記のように診断することのために直接的に使用される。しかし、別の実施形態において、同定される組み合わせは、遺伝子を同定した分類子とは独立して使用することができる。例えば、１０個の遺伝子から生じるプロフィールが試験個体を評価するためにモニターすることができ、ここで、試験個体の遺伝子発現プロフィールは、膀胱癌を有する個体からの１０個の遺伝子のプロフィール、および膀胱癌を有さない個体からの１０個の遺伝子のプロフィールと比較される。
５．６ 膀胱癌および早期の膀胱癌の診断のために特に有用なバイオマーカーの組み合わせを選択するための数学的モデルへの入力のためのデータ
例えば、膀胱癌を有するか、または膀胱癌を有さない個体を診断する際に有用であるこれらのバイオマーカーを同定するために、表１および／または表２および／または表７および／または表１０および／または表１１のバイオマーカーの１つ以上のｍＲＮＡ産物の発現レベルを反映するデータが、個体のトレーニング集団、膀胱癌を有する第１の表現型亜群、および膀胱癌を有さない個体の第２の表現型亜群の中で使用される。トレーニング集団を、指定された表現型亜群に特徴付けする目的のために、膀胱癌診断の任意の方法を使用することができる。好ましい実施形態において、細胞検査が利用されて、トレーニング集団の目的のための膀胱癌の診断を決定する。
別の実施形態において、早期の膀胱癌を有するか、または膀胱癌を有さないとして個体を診断する際に有用であるバイオマーカーを同定するために、トレーニング集団中の個体から、表４および／または表５のバイオマーカーの１つ以上のｍＲＮＡ産物の発現レベルを反映するデータは、早期の膀胱癌を有する個体および膀胱癌を有さない個体から構成される。
別の実施形態において、表１および／または表２および／または表７および／または表１０のバイオマーカーの１つ以上のタンパク質産物の発現レベルを反映するデータが、個体のトレーニング集団、膀胱癌を有する第１の表現型亜群、および膀胱癌を有さない個体の第２の表現型亜群の中で使用される。トレーニング集団を、指定された表現型亜群に特徴付けする目的のために、膀胱癌診断の任意の方法を使用することができる。
別の実施形態において、表１および／または表２および／または表７および／または表１０および／または表１１のバイオマーカーの１つ以上のタンパク質産物の発現レベルを反映するデータが、個体のトレーニング集団、膀胱癌を有する第１の表現型亜群、および膀胱癌を有さない個体の第２の表現型亜群の中で使用される。トレーニング集団を、指定された表現型亜群に特徴付けする目的のために、膀胱癌診断の任意の方法を使用することができる。
５．７ トレーニング集団
ある実施形態において、参照集団またはトレーニング集団は１０から３０例の被験体を含む。別の実施形態において、トレーニング集団は３０から５０例の被験体を含む。さらに別の実施形態において、参照集団は、５０から１００例、１００から５００例、５００から１０００例、または１０００例より多くの被験体を各々含む２つ以上の集団を含む。
ある実施形態において、トレーニング集団の各表現型亜群のメンバー（すなわち、膀胱癌メンバーおよび非膀胱癌メンバー）は、好ましくは、少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、１個以上、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、１個から１０００個の間の他の表現型に関して類似の分布を有する。例えば、年齢、性別、遺伝子バリエーションの情報（例えば、遺伝子ＳＮＰ変異、制限フラグメント長多型、マイクロサテライトマーカー、制限フラグメント長多型、および短いタンデムリピートの存在、非存在または特徴）、治療レジメン；同時罹患率；代謝物の濃度、血中の化学物質の濃度、ならびに／または健康および／もしくは健康状態の他の指標である。
５．８ 数学的モデル
５．８．１ 回帰モデル
ある実施形態において、試験されるバイオマーカーの各々の組み合わせのための発現データは、回帰モデル、好ましくは、ロジスティック回帰モデルの中で使用される。このような回帰モデルは、試験されるバイオマーカーの各々の可能な組み合わせについての数式を決定し、各数式は、モデルによって提示される各個々のバイオマーカーの発現レベルを反映するデータによって乗算される係数を提供する。
一般的に、目的の重回帰の数式は以下のように書くことができる：
Ｙ＝α＋β１Ｘ１＋β２Ｘ２＋・・・βｋＸｋ＋ε
ここで、従属変数Ｙは、第１の表現型形質（例えば、軽度の変形性関節症）の存在（Ｙがポジティブ）または非存在（Ｙがネガティブ）である。このモデルは、従属変数Ｙが、説明変数ｋ（トレーニング集団の中の第１の表現型サブグループおよび第２の表現型サブグループ中の被験体からのｋ個の選択遺伝子についての目的の組織中での遺伝子産物のレベルに代表的な測定値）、プラス種々の特定されていない除外された因子を包含する誤差項に依存することを述べている。上記に同定されるモデルにおいて、パラメーターβ１は、従属変数に対する第１の説明変数Ｘ１の効果を測定し、他の説明変数は一定に保持する。同様に、β２はＹに対する説明変数Ｘ２の効果を与え、残りの説明変数は一定に保持する。
ロジスティック回帰モデルは、直線回帰の非線形変換である、ロジスティック回帰モデルは「ロジット」モデルと呼ばれ、以下のように表現することができる：
ｌｎ［ｐ／（１−ｐ）］＝α＋β１Ｘ１＋β２Ｘ２＋・・・βｋＸｋ＋ε または
［ｐ／（１−ｐ）］＝ｅｘｐαｅｘｐβ１Ｘ１ｅｘｐβ２Ｘ２×・・・×ｅｘｐβｋＸｋｅｘｐε
ここで、
ｌｎは自然対数ｌｏｇｅｘｐ、ここでｅｘｐ＝２．７１８２８・・・であり、
ｐは事象Ｙが起こる確率、ｐ（Ｙ＝１）であり、
ｐ／（１−ｐ）は「オッズ比」であり、
ｌｎ［ｐ／（１−ｐ）］はログオッズ比、または「ロジット」であり、そして
モデルのすべての他の成分は、上記の一般的な回帰方程式と同じである。αおよびεについての項が同じ定数にまとめられ得ることが当業者によって認識される。確かに、好ましい実施形態において、単一の項がαおよびεを表すために使用される。「ロジスティック」分布は、Ｓ字型分布の関数である。ロジット分布は、見積もられる確率（ｐ）を０から１の間となるように制約する。
本発明のある実施形態において、ロジスティック回帰モデルは、最尤推定値（ＭＬＥ）によってフィットされる。換言すると、係数（例えば、α、β１、β２、・・・）は、最尤によって決定される。尤度は、条件付き確率（例えば、Ｐ（Ｙ｜Ｘ）、Ｘを仮定したＹの確率）である。尤度関数（Ｌ）は、サンプルデータセットの中で起こる従属変数の値（Ｙ１、Ｙ２、．．．、Ｙｎ）の特定のセットを観察する確率を測定する。これは、従属変数の積の確率として書かれる：
Ｌ＝Ｐｒｏｂ（Ｙ１＊Ｙ２＊＊＊Ｙｎ）
尤度関数が高いほど、サンプル中でＹを観察する確率が高くなる。ＭＬＥは、可能な限り大きな尤度関数（ＬＬ＜０）または可能な限り小さな尤度関数の−２倍ｌｏｇ（−２ＬＬ）を生じる係数（α、β１、β２、．．．）を見出すことを含む。ＭＬＥにおいて、パラメーターα、β１、β２、．．．のある初期の見積もりが作成される。次いで、これらのパラメーターの見積もりを与えるデータの尤度が計算される。これらのパラメーターの見積もりは改善され、データの尤度が再計算される。このプロセスは、パラメーターの見積もりが大きく変化しなくなるまで（例えば、確率における．０１または．００１未満の変化）、反復される。ロジスティック回帰の例およびロジスティック回帰モデルのフィッティングは、その全体が本明細書に援用される、Hastie，統計学習の初歩（The Elements of Statistical Learning），Springer，ニューヨーク，２００１，ｐｐ．９５−１００において見出される。
５．８．２ ニューラルネットワーク
別の実施形態において、本発明のバイオマーカーの各々について測定される発現は、ニューラルネットワークをトレーニングするために使用することができる。ニューラルネットワークは、２段階回帰または分類モデルである。ニューラルネットワークは、出力ユニットのレイヤーに重みのレイヤーによって接続された入力ユニットのレイヤー（およびバイアス）を含む、レイヤー構造を有する。回帰のために、出力単位のレイヤーは、典型的には、１つのみの出力ユニットを含む。しかし、ニューラルネットワークは、シームレスに複数の定量的応答を扱うことができる。このようにして、ニューラルネットワークは、２つより多くの集団の間を区別するバイオマーカーの同定を可能にするように適用することができる。１つの特定の例において、ニューラルネットワークは、膀胱癌を有さない個体と比較した場合に、膀胱癌に特異的であるバイオマーカーの組み合わせを同定するために、表３に記されるものを含む表１におけるバイオマーカーの産物からの発現データを使用してトレーニングすることができる。結果として、トレーニングしたニューラルネットワークは、段階特異的なバイオマーカーとして有用であるバイオマーカーの組み合わせを直接的に同定するために使用することができる。ある実施形態において、EasyNN-Plusバージョン４．０ｇソフトフェアパッケージ（Neural Planner Software Inc.）において見出される１０個のニューロンの単一の隠れレイヤー（１０個の隠れレイヤー）を含む、逆伝搬ニューラルネットワーク（例えば、Abdi，１９９４，「ニューラルネットワークプライマー（A neural network primer）」，J.Biol.System．２，２４７−２８３を参照のこと）が使用される。
ニューラルネットワークは、その全体が本明細書に援用されるDudaら、２００１，Pattern Classification，第２版、John Wiley & Sons,Inc.，ニューヨーク；およびHastieら、２００１，The Elements of Statistical Learning,Springer-Verlag，ニューヨークに記載されている。
５．８．３ 他の数学的モデル
上記のパターン分類および統計学的技術は、膀胱癌分類のためのモデルを構築するために使用することができるモデルの型、例えば、以下の単なる例である：その全体が参照により本明細書に援用されるDudaおよびHart，パターン分析およびシーン分析（Pattern Classification and Scene Analysis），１９７３，John Wiley & Sons,Inc.，ニューヨークの２１１〜２５６頁に記載されるようなクラスタリング；主成分分析（参照により本明細書に援用される、Jolliffe，１９８６，主成分分析（Principal Component Analysis），Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，ニューヨークを参照のこと）；最近傍分類子分析（例えば、Duda，パターン分析（Pattern Classification）第２版、２００１，John Wiley & Sons,Inc；およびHastie，２００１，統計学習の初歩（The Elements of Statistical Learning），Springer，ニューヨークを参照のこと）；線形判別分析（例えば、Duda，パターン分析（Pattern Classification），第２版、２００１，John Wiley & Sons,Incを参照のこと）；およびHastie，２００１，統計学習の初歩（The Elements of Statistical Learning），Springer，ニューヨーク；VenablesおよびRipley，１９９７，s-plusを用いる現代の応用統計学（Modern Applied Statistics with s-plus），Springer，ニューヨーク）；サポートベクタマシン（例えば、これらのすべてが参照により本明細書に援用される、CristianiniおよびShawe-Taylor，２０００，サポートベクタマシンへの序論（An Introduction to Support Vector Machines），Cambridge University Press，Cambridge，Boserら、１９９２，「最適マージン分類子のためのトレーニングアルゴリズム（A training algorithm for optimal margin classifiers）」，コンピューター学習理論ＡＣＭワークショップ第５回年次総会議事録（Proceedings of the 5th Annual ACM Workshop on Computational Learning Theory），ACM Press, Pittsburgh，ペンシルヴェニア，ｐｐ．１４２−１５２；Vapnik，１９９８，統計学習理論（Statistical Learning Theory），Wiley，ニューヨークを参照のこと）。
５．９ 分類子を選択するためのバイオマーカーの組み合わせの選択
続く節における使用のためのバイオマーカーのすべてを選択することが好ましい。従って、バイオマーカーのすべての可能な組み合わせが、バイオマーカーの各々の産物のレベルを表すデータを使用して評価される。ある実施形態において、すべての可能な組み合わせを選択することは不可能であり、そこでバイオマーカーのサブセットが最初に選択され、次いで、バイオマーカーのサブセットの組み合わせが使用される。理解されるように、選択されるバイオマーカーの所望の数に基づく選択の判断基準は、バイオマーカーの産物のレベルを表すデータを得るために利用可能である供給源、ならびに／または選択されるバイオマーカーの可能な組み合わせのすべてもしくは一部の分類子を計算および評価するために利用可能であるコンピューター資源に依存する。ある実施形態において、評価することができる選択されるバイオマーカーの所望の数は、４，０００；３，０００；２，０００；１，０００；９００；８００；７００；６００；５００；４００；３００；２００；１９０；１８０；１７０；１６０；１５０；１４０；１３０；１２０；１１０；１００；９０；８０；７０；６０；５０；４０；３０；２０；１０である。
本発明の１つの実施形態において、表１におけるバイオマーカーの各々の可能な組み合わせが評価される。本発明の別の実施形態において、表１のバイオマーカーの２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、２０個、３０個、４０個、５０個、６０個などの各々の可能な組み合わせが評価される。本発明の別の実施形態において、表１のバイオマーカーのすべてのうちの２個および／または３個および／また４個および／または５個および／または６個および／または７個および／または８個および／または９個および／または１０個の各々の可能な組み合わせが評価される。本発明の別の実施形態において、表１のバイオマーカーの一部の２個および／または３個および／また４個および／または５個および／または６個および／または７個および／または８個および／または９個および／または１０個の各々の可能な組み合わせが評価される。本発明の別の実施形態において、評価される表１のバイオマーカーの一部は、表１のバイオマーカーの２０個、３０個、４０個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個、１００個、１２５個、１５０個、１７５個、２００個、２２５個、または２５０個である。本発明の別の実施形態において、選択される表１のバイオマーカーの一部は、個々のｐ値に基づいてランク付けされ、ここで、ｐ値は、膀胱癌を有するメンバーと膀胱癌を有さないメンバーとを区別する各バイオマーカーの個々の能力を示し、次いで、上位の６０個、５０個、４０個、３０個、２０個、または１０個に個々にランク付けされたバイオマーカーが選択され、選択されたバイオマーカーのすべてのうちの２個および／または３個および／または４個および／または５個および／または６個および／または７個および／または８個および／または９個および／または１０個が分類子を作製するために利用され、この分類子は、膀胱癌を有するメンバーと膀胱癌を有さないメンバーとを区別する能力について評価される。さらに別の実施形態において、そのｐ値が、０．５未満；０．１未満；０．０５未満；０．０１未満；０．００５未満；０．００１未満；０．０００５未満；０．０００１未満；０．００００５未満；０．００００１未満；０．０００００５未満；０．０００００１未満などである、表１のバイオマーカーのサブセットが選択される。ある実施形態において、表１のバイオマーカーのサブセットは、２つ以上の形質の亜集団の間でバイオマーカー産物によって示されるディファレンシャルな発現レベルに基づいて選択される。血液中でディファレンシャルな倍数変化を測定する際に、倍数変化の違いは全く小さいことがあり得るので、ある実施形態においては、バイオマーカーの選択は、倍数変化が、１．２より大きい、１．３より大きい、１．４より大きい、１．５より大きい、１．６より大きい、１．７より大きい、１．８より大きい、１．９より大きい、２．０より大きい、２．１より大きい、２．２より大きい、２．３より大きい、２．４より大きい、２．５より大きい、２．６より大きい、２．７より大きい、２．８より大きい、２．９より大きい、３．０より大きい、３．１より大きい、３．２より大きい、３．３より大きい、３．４より大きい、３．５より大きい、４．０より大きいなどである、ディファレンシャルな倍数変化に基づくことが注目される。ある実施形態において、当業者によって理解されるように、ｐ値と倍数変化の両方に基づいて、組み合わせを形成するためのバイオマーカーを選択しておくことが有益である。従って、ある実施形態において、バイオマーカーは、バイオマーカーデータから生じるｐ値に基づいて上記に概説されるように最初に選択され、次いでバイオマーカーデータから決定されるディファレンシャルな倍数変化に基づいて選択される。別の実施形態において、バイオマーカーは、ディファレンシャルな倍数変化に基づいて最初に選択され、次いで、下位選択がｐ値に基づいて行われる。ある実施形態において、選択判断基準およびその後のランク付けの１つ以上の使用は、分類子を形成する際の使用のために、上位の２．５％、５％、７．５％、１０％、１２．５％、１５％、１７．５％、２０％、３０％、４０％、５０％またはそれ以上のランク付けされたバイオマーカーの選択を可能にする。別の本発明の実施形態において、表１および表２の組み合わせにおけるバイオマーカーの各々の可能な組み合わせは、表１からの少なくとも１つのバイオマーカーが評価される組み合わせに含まれるという条件で評価される。本発明の別の実施形態において、表２の１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、２０個、３０個、４０個、５０個、６０個などのバイオマーカーと組み合わせた、表１の１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、２０個、３０個、４０個、５０個、６０個などのバイオマーカーの各々の可能な組み合わせが評価される。本発明の別の実施形態において、表１および表２の組み合わせにおけるバイオマーカーのすべての２個および／または３個および／または４個および／または５個および／または６個および／または７個および／または８個および／または９個および／または１０個の組み合わせについての全数検索が評価される。本発明の別の実施形態において、表１および表２のバイオマーカーの一部の２個および／または３個および／または４個および／または５個および／または６個および／または７個および／または８個および／または９個および／または１０個の各々の可能な組み合わせが評価される。本発明の別の実施形態において、評価される表１および表２のバイオマーカーの一部は、表２におけるバイオマーカーの１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、２０個、３０個、４０個、５０個、７５個、１００個、１５０個、２００個、３００個などと組み合わせた、表１におけるバイオマーカーの２０個、３０個、４０個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個、１００個、１２５個、１５０個、１７５個、２００個、２２５個、または２５０個であり、これらが利用される。本発明のさらに別の実施形態において、選択される表１および表２のバイオマーカーの一部は、個々のｐ値に基づいて選択およびランク付けされ、ここで、ｐ値は、膀胱癌を有するメンバーと有さないメンバーとを区別する各バイオマーカーの個々の能力を示す。さらに別の実施形態において、そのｐ値が、０．５未満；０．１未満；０．０５未満；０．０１未満；０．００５未満；０．００１未満；０．０００５未満；０．０００１未満；０．００００５未満；０．００００１未満；０．０００００５未満；０．０００００１未満などである、表１および表２のバイオマーカーのサブセットが選択される。ある実施形態において、表１および表２のバイオマーカーのサブセットは、バイオマーカー産物によって示されるディファレンシャルな発現レベルに基づいて選択される。血液中でディファレンシャルな倍数変化を測定する際に、倍数変化の違いは全く小さいことがあり得るので、ある実施形態においては、バイオマーカーの選択は、倍数変化が、１．２より大きい、１．３より大きい、１．４より大きい、１．５より大きい、１．６より大きい、１．７より大きい、１．８より大きい、１．９より大きい、２．０より大きい、２．１より大きい、２．２より大きい、２．３より大きい、２．４より大きい、２．５より大きい、２．６より大きい、２．７より大きい、２．８より大きい、２．９より大きい、３．０より大きい、３．１より大きい、３．２より大きい、３．３より大きい、３．４より大きい、３．５より大きい、４．０より大きいなどである、ディファレンシャルな倍数変化に基づくことが注目される。ある実施形態において、当業者によって理解されるように、ｐ値と倍数変化の両方に基づいて、組み合わせを形成するためのバイオマーカーを選択しておくことが有益である。従って、ある実施形態において、バイオマーカーは、バイオマーカーデータから生じるｐ値に基づいて上記に概説されるように最初に選択され、次いで当該バイオマーカーの下位選択が、バイオマーカーデータから決定されるディファレンシャルな倍数変化に基づいて選択される。別の実施形態において、バイオマーカーは、ディファレンシャルな倍数変化に基づいて最初に選択され、次いで、下位選択がｐ値に基づいて行われる。ある実施形態において、選択判断基準およびその後のランク付けの１つ以上の使用は、上位の２．５％、５％、７．５％、１０％、１２．５％、１５％、１７．５％、２０％、３０％、４０％、５０％またはそれ以上のランク付けされたバイオマーカーの選択が使用されることを可能にし、その結果、選択されたバイオマーカーのすべての２個および／または３個および／または４個および／または５個および／または６個および／または７個および／または８個および／または９個および／または１０個の各々の可能な組み合わせが利用されて分類子を作製し、これらの分類子は、膀胱癌を有するメンバーと有さないメンバーとを区別する能力について評価される。
本発明の別の実施形態において、表４におけるバイオマーカーの各々の可能な組み合わせが評価される。本発明の別の実施形態において、表４のバイオマーカーの２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、２０個、３０個、４０個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個、１００個、１５０個、２００個、２５０個、３００個、３５０個、４００個、４５０個、５００個などの各々の可能な組み合わせが評価される。本発明の別の実施形態において、表４のバイオマーカーのすべてのうちの２個および／または３個および／また４個および／または５個および／または６個および／または７個および／または８個および／または９個および／または１０個の各々の可能な組み合わせが評価される。本発明の別の実施形態において、表４のバイオマーカーの一部の２個および／または３個および／また４個および／または５個および／または６個および／または７個および／または８個および／または９個および／または１０個の各々の可能な組み合わせが評価される。本発明の別の実施形態において、評価される表４のバイオマーカーの一部は、表４のバイオマーカーの２０個、３０個、４０個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個、１００個、１２５個、１５０個、１７５個、２００個、２２５個、２５０個、３００個、３５０個、４００個、４５０個、または５００個である。本発明のさらに別の実施形態において、選択される表４のバイオマーカーの一部は、個々のｐ値に基づいてランク付けされ、ここで、ｐ値は、膀胱癌を有するメンバーと有さないメンバーとを区別する各バイオマーカーの個々の能力を示し、次いで、上位の６０個、５０個、４０個、３０個、２０個、または１０個に個々にランク付けされたバイオマーカーが選択され、選択されたバイオマーカーのすべてのうちの２個および／または３個および／または４個および／または５個および／または６個および／または７個および／または８個および／または９個および／または１０個が分類子を作製するために利用され、この分類子は、膀胱癌を有するメンバーと有さないメンバーとを区別する能力について評価される。さらに別の実施形態において、選択される表４のバイオマーカーの一部は、そのｐ値が、０．５未満；０．１未満；０．０５未満；０．０１未満；０．００５未満；０．００１未満；０．０００５未満；０．０００１未満；０．００００５未満；０．００００１未満；０．０００００５未満；０．０００００１未満などであるものである。ある実施形態において、表４のバイオマーカーのサブセットは、バイオマーカー産物によって示されるディファレンシャルな発現レベルに基づいて、分類子への入力のために組み合わせを形成するように選択される。血液中でディファレンシャルな倍数変化を測定する際に、倍数変化の違いは全く小さいことがあり得るので、ある実施形態においては、バイオマーカーの選択は、倍数変化が、１．２より大きい、１．３より大きい、１．４より大きい、１．５より大きい、１．６より大きい、１．７より大きい、１．８より大きい、１．９より大きい、２．０より大きい、２．１より大きい、２．２より大きい、２．３より大きい、２．４より大きい、２．５より大きい、２．６より大きい、２．７より大きい、２．８より大きい、２．９より大きい、３．０より大きい、３．１より大きい、３．２より大きい、３．３より大きい、３．４より大きい、３．５より大きい、４．０より大きいなどである、ディファレンシャルな倍数変化に基づくことが注目される。ある実施形態において、当業者によって理解されるように、ｐ値と倍数変化の両方に基づいて、組み合わせを形成するためのバイオマーカーを選択しておくことが有益である。従って、ある実施形態において、バイオマーカーは、バイオマーカーデータから生じるｐ値に基づいて上記に概説されるように最初に選択され、次いで当該バイオマーカーの下位選択が、バイオマーカーデータから決定されるディファレンシャルな倍数変化に基づいて選択される。別の実施形態において、バイオマーカーは、ディファレンシャルな倍数変化に基づいて最初に選択され、次いで、下位選択がｐ値に基づいて行われる。ある実施形態において、選択判断基準およびその後のランク付けの１つ以上の使用は、上位の２．５％、５％、７．５％、１０％、１２．５％、１５％、１７．５％、２０％、３０％、４０％、５０％またはそれ以上のランク付けされたバイオマーカーの選択が使用されることを可能にし、その結果、選択されたバイオマーカーのすべての２個および／または３個および／または４個および／または５個および／または６個および／または７個および／または８個および／または９個および／または１０個の各々の可能な組み合わせが利用されて分類子を作製し、これらの分類子は、膀胱癌を有するメンバーと有さないメンバーとを区別する能力について評価される。別の本発明の実施形態において、表４および表５の組み合わせにおけるバイオマーカーの各々の可能な組み合わせは、表４からの少なくとも１つのバイオマーカーが評価される組み合わせに含まれるという条件で評価される。本発明の別の実施形態において、表５の１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、２０個、３０個、４０個、５０個、６０個などのバイオマーカーと組み合わせた、表４の１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、２０個、３０個、４０個、５０個、６０個などのバイオマーカーの各々の可能な組み合わせが評価される。本発明の別の実施形態において、表４および表５の組み合わせにおけるバイオマーカーのすべての２個および／または３個および／または４個および／または５個および／または６個および／または７個および／または８個および／または９個および／または１０個の組み合わせについての全数検索が評価される。本発明の別の実施形態において、表４および表５のバイオマーカーの一部の２個および／または３個および／または４個および／または５個および／または６個および／または７個および／または８個および／または９個および／または１０個の各々の可能な組み合わせが評価される。本発明の別の実施形態において、評価される表４および表５のバイオマーカーの一部は、表５におけるバイオマーカーの１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、２０個、３０個、４０個、５０個、７５個、１００個、１５０個、２００個、３００個、５００個、１０００個、１２５０個、１５００個、１７５０個、２０００個、２２５０個などと組み合わせた、表４におけるバイオマーカーの２０個、３０個、４０個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個、１００個、１２５個、１５０個、１７５個、２００個、２２５個、または２５０個、３００個、３５０個、４００個、４５０個、５００個であり、これらが利用される。本発明のさらに別の実施形態において、選択される表４のバイオマーカーの一部は、個々のｐ値に基づいてランク付けされ、ここで、ｐ値は、膀胱癌を有するメンバーと有さないメンバーとを区別する各バイオマーカーの個々の能力を示し、次いで、上位の６０個、５０個、４０個、３０個、２０個、または１０個に個々にランク付けされたバイオマーカーが選択され、選択されたバイオマーカーのすべてのうちの２個および／または３個および／または４個および／または５個および／または６個および／または７個および／または８個および／または９個および／または１０個の各々の可能な組み合わせが分類子を作製するために利用され、この分類子は、膀胱癌を有するメンバーと有さないメンバーとを区別する能力について評価される。本発明のさらに別の実施形態において、選択される表４および表５のバイオマーカーの一部は、そのｐ値が、０．５未満；０．１未満；０．０５未満；０．０１未満；０．００５未満；０．００１未満；０．０００５未満；０．０００１未満；０．００００５未満；０．００００１未満；０．０００００５未満；０．０００００１未満などであるものである。ある実施形態において、表４および表５のバイオマーカーのサブセットは、バイオマーカー産物によって示されるディファレンシャルな発現レベルに基づいて、分類子への入力のための組み合わせを形成するように選択される。血液中でディファレンシャルな倍数変化を測定する際に、倍数変化の違いは全く小さいことがあり得るので、ある実施形態においては、バイオマーカーの選択は、倍数変化が、１．２より大きい、１．３より大きい、１．４より大きい、１．５より大きい、１．６より大きい、１．７より大きい、１．８より大きい、１．９より大きい、２．０より大きい、２．１より大きい、２．２より大きい、２．３より大きい、２．４より大きい、２．５より大きい、２．６より大きい、２．７より大きい、２．８より大きい、２．９より大きい、３．０より大きい、３．１より大きい、３．２より大きい、３．３より大きい、３．４より大きい、３．５より大きい、４．０より大きいなどである、ディファレンシャルな倍数変化に基づくことが注目される。ある実施形態において、当業者によって理解されるように、ｐ値と倍数変化の両方に基づいて、組み合わせを形成するためのバイオマーカーを選択しておくことが有益である。従って、ある実施形態において、バイオマーカーは、バイオマーカーデータから生じるｐ値に基づいて上記に概説されるように最初に選択され、次いでバイオマーカーデータから決定されるディファレンシャルな倍数変化に基づいて選択される。別の実施形態において、バイオマーカーは、ディファレンシャルな倍数変化に基づいて最初に選択され、次いで、下位選択がｐ値に基づいて行われる。ある実施形態において、選択判断基準およびその後のランク付けの１つ以上の使用は、上位の２．５％、５％、７．５％、１０％、１２．５％、１５％、１７．５％、２０％、３０％、４０％、５０％またはそれ以上のランク付けされたバイオマーカーの選択が使用されることを可能にし、その結果、選択されたバイオマーカーのすべての２個および／または３個および／または４個および／または５個および／または６個および／または７個および／または８個および／または９個および／または１０個の各々の可能な組み合わせが利用されて分類子を作製し、これらの分類子は、膀胱癌を有するメンバーと有さないメンバーとを区別する能力について評価される。
本発明の別の実施形態において、表７におけるバイオマーカーの各々の可能な組み合わせが評価される。本発明の別の実施形態において、表７のバイオマーカーの２個、３個、４個、５個、１０個、２０個、３０個、４０個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個、１００個、１２５個、１５０個、１７５個、２００個などの各々の可能な組み合わせが評価される。本発明の別の実施形態において、表７におけるバイオマーカーは、個々のｐ値に基づいて（表１に記されるように）ランク付けされ、ここで、ｐ値は、膀胱癌を有するメンバーと有さないメンバーとを区別する各バイオマーカーの個々の能力を示し、次いで、上位の６０個、５０個、４０個、３０個、２０個、または１０個に個々にランク付けされたバイオマーカーが、膀胱癌を有するメンバーと有さないメンバーとを区別することが最も可能である組み合わせを選択するように、すべての可能な組み合わせの中で評価される。さらに別の実施形態において、表７のバイオマーカーのすべてのうちの２個および／または３個および／また４個および／または５個および／または６個および／または７個および／または８個および／または９個および／または１０個の組み合わせが、膀胱癌と非膀胱癌の間を区別可能である分類子を作製するために利用される。さらに別の実施形態において、表７のバイオマーカーの２個、３個、４個、５個、１０個、２０個、３０個、４０個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個、１００個、１２５個、１５０個、１７５個、または２００個の組み合わせが、分類子を作製するために使用され、次いで、これらは、膀胱癌と非膀胱癌の間を区別可能であるそれらの能力について評価される。さらに別の実施形態において、表７の上位２００個、１７５個、１５０個、１２５個、１００個、９０個、８０個、７０個、６０個、５０個、４０個、３０個、２０個、または１０個（ｐ値に基づく）の２個および／または３個および／また４個および／または５個および／または６個および／または７個および／または８個および／または９個および／または１０個の組み合わせが、分類子を作製するために使用され、次いで、これらは、膀胱癌と非膀胱癌の間を区別可能であるそれらの能力について評価される。本発明のさらに別の実施形態において、選択される表７のバイオマーカーの一部は、そのｐ値が、０．５未満；０．１未満；０．０５未満；０．０１未満；０．００５未満；０．００１未満；０．０００５未満；０．０００１未満；０．００００５未満；０．００００１未満；０．０００００５未満；０．０００００１未満などであるものである。ある実施形態において、表７のバイオマーカーのサブセットは、バイオマーカー産物によって示されるディファレンシャルな発現レベルに基づいて、分類子への入力のために組み合わせを形成するように選択される。血液中でディファレンシャルな倍数変化を測定する際に、倍数変化の違いは全く小さいことがあり得るので、ある実施形態においては、バイオマーカーの選択は、倍数変化が、１．２より大きい、１．３より大きい、１．４より大きい、１．５より大きい、１．６より大きい、１．７より大きい、１．８より大きい、１．９より大きい、２．０より大きい、２．１より大きい、２．２より大きい、２．３より大きい、２．４より大きい、２．５より大きい、２．６より大きい、２．７より大きい、２．８より大きい、２．９より大きい、３．０より大きい、３．１より大きい、３．２より大きい、３．３より大きい、３．４より大きい、３．５より大きい、４．０より大きいなどである、ディファレンシャルな倍数変化に基づくことが注目される。ある実施形態において、当業者によって理解されるように、ｐ値と倍数変化の両方に基づいて、組み合わせを形成するためのバイオマーカーを選択しておくことが有益である。従って、ある実施形態において、バイオマーカーは、バイオマーカーデータから生じるｐ値に基づいて上記に概説されるように最初に選択され、次いで当該バイオマーカーの下位選択が、バイオマーカーデータから決定されるディファレンシャルな倍数変化に基づいて選択される。別の実施形態において、バイオマーカーは、ディファレンシャルな倍数変化に基づいて最初に選択され、次いで、下位選択がｐ値に基づいて行われる。ある実施形態において、選択判断基準およびその後のランク付けの１つ以上の使用は、上位の２．５％、５％、７．５％、１０％、１２．５％、１５％、１７．５％、２０％、３０％、４０％、５０％またはそれ以上のランク付けされたバイオマーカーの選択が使用されることを可能にし、その結果、選択されたバイオマーカーのすべての２個および／または３個および／または４個および／または５個および／または６個および／または７個および／または８個および／または９個および／または１０個の各々の可能な組み合わせが利用されて分類子を作製し、これらの分類子は、膀胱癌を有するメンバーと有さないメンバーとを区別する能力について評価される。
さらに別の実施形態において、表１０のバイオマーカーのすべての２個および／または３個および／または４個および／または５個および／または６個および／または７個および／または８個および／または９個および／または１０個のすべての組み合わせが利用されて分類子を作製し、これらは、膀胱癌を有するメンバーと有さないメンバーとを区別することができる。
本発明の別の実施形態において、表１１のバイオマーカーの２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、２０個、３０個、４０個、５０個、６０個などの各々の可能な組み合わせが評価される。本発明の別の実施形態において、表１１のバイオマーカーのすべてのうちの２個および／または３個および／また４個および／または５個および／または６個および／または７個および／または８個および／または９個および／または１０個の各々の可能な組み合わせが評価される。本発明の別の実施形態において、表１１のバイオマーカーの一部の２個および／または３個および／また４個および／または５個および／または６個および／または７個および／または８個および／または９個および／または１０個の各々の可能な組み合わせが評価される。本発明の別の実施形態において、評価される表１１のバイオマーカーの一部は、表１１におけるバイオマーカーの２０個、３０個、４０個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個、１００個、１２５個、１５０個、１７５個、２００個、２２５個、または２５０個である。本発明のさらに別の実施形態において、選択される表１１のバイオマーカーの一部は、個々のｐ値に基づいてランク付けされ、ここで、ｐ値は、膀胱癌を有するメンバーと有さないメンバーとを区別する各バイオマーカーの個々の能力を示し、次いで、上位の６０個、５０個、４０個、３０個、２０個、または１０個に個々にランク付けされたバイオマーカーが選択され、選択されたバイオマーカーのすべてのうちの２個および／または３個および／または４個および／または５個および／または６個および／または７個および／または８個および／または９個および／または１０個の各々の可能な組み合わせが分類子を作製するために利用され、この分類子は、膀胱癌を有するメンバーと有さないメンバーとを区別する能力について評価される。本発明のさらに別の実施形態において、選択される表１１のバイオマーカーの一部は、そのｐ値が、０．５未満；０．１未満；０．０５未満；０．０１未満；０．００５未満；０．００１未満；０．０００５未満；０．０００１未満；０．００００５未満；０．００００１未満；０．０００００５未満；０．０００００１未満などであるものである。ある実施形態において、表１１のバイオマーカーのサブセットは、バイオマーカー産物によって示されるディファレンシャルな発現レベルに基づいて、分類子への入力のための組み合わせを形成するように選択される。血液中でディファレンシャルな倍数変化を測定する際に、倍数変化の違いは全く小さいことがあり得るので、ある実施形態においては、バイオマーカーの選択は、倍数変化が、１．２より大きい、１．３より大きい、１．４より大きい、１．５より大きい、１．６より大きい、１．７より大きい、１．８より大きい、１．９より大きい、２．０より大きい、２．１より大きい、２．２より大きい、２．３より大きい、２．４より大きい、２．５より大きい、２．６より大きい、２．７より大きい、２．８より大きい、２．９より大きい、３．０より大きい、３．１より大きい、３．２より大きい、３．３より大きい、３．４より大きい、３．５より大きい、４．０より大きいなどである、ディファレンシャルな倍数変化に基づくことが注目される。ある実施形態において、当業者によって理解されるように、ｐ値と倍数変化の両方に基づいて、組み合わせを形成するためのバイオマーカーを選択しておくことが有益である。従って、ある実施形態において、バイオマーカーは、バイオマーカーデータから生じるｐ値に基づいて上記に概説されるように最初に選択され、次いでバイオマーカーデータから決定されるディファレンシャルな倍数変化に基づいて選択される。別の実施形態において、バイオマーカーは、ディファレンシャルな倍数変化に基づいて最初に選択され、次いで、下位選択がｐ値に基づいて行われる。ある実施形態において、選択判断基準およびその後のランク付けの１つ以上の使用は、上位の２．５％、５％、７．５％、１０％、１２．５％、１５％、１７．５％、２０％、３０％、４０％、５０％またはそれ以上のランク付けされたバイオマーカーの選択が使用されることを可能にし、その結果、選択されたバイオマーカーのすべての２個および／または３個および／または４個および／または５個および／または６個および／または７個および／または８個および／または９個および／または１０個の各々の可能な組み合わせが利用されて分類子を作製し、これらの分類子は、膀胱癌を有するメンバーと有さないメンバーとを区別する能力について評価される。本発明の別の実施形態において、表１１および表２の組み合わせにおけるバイオマーカーの各々の可能な組み合わせは、表１１からの少なくとも１つのバイオマーカーが評価される組み合わせに含まれるという条件で評価される。本発明の別の実施形態において、表２の１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、２０個、３０個、４０個、５０個、６０個などのバイオマーカーと組み合わせた、表１１の１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、２０個、３０個、４０個、５０個、６０個などのバイオマーカーの各々の可能な組み合わせが評価される。本発明の別の実施形態において、表１および表２の組み合わせにおけるバイオマーカーのすべての２個および／または３個および／または４個および／または５個および／または６個および／または７個および／または８個および／または９個および／または１０個の組み合わせについての全数検索が評価される。本発明の別の実施形態において、表１１および表２のバイオマーカーの一部の２個および／または３個および／または４個および／または５個および／または６個および／または７個および／または８個および／または９個および／または１０個の各々の可能な組み合わせが評価される。本発明の別の実施形態において、評価される表１１および表２のバイオマーカーの一部は、表２におけるバイオマーカーの１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、２０個、３０個、４０個、５０個、７５個、１００個、１５０個、２００個、３００個などと組み合わせた、表１１におけるバイオマーカーの２０個、３０個、４０個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個、１００個、１２５個、１５０個、１７５個、２００個、２２５個、または２５０個であり、これらが利用される。本発明のさらに別の実施形態において、選択される表１１のバイオマーカーの一部は、個々のｐ値に基づいてランク付けされ、ここで、ｐ値は、膀胱癌を有するメンバーと有さないメンバーとを区別する各バイオマーカーの個々の能力を示し、次いで、上位の６０個、５０個、４０個、３０個、２０個、または１０個に個々にランク付けされたバイオマーカーが選択され、選択されたバイオマーカーのすべてのうちの２個および／または３個および／または４個および／または５個および／または６個および／または７個および／または８個および／または９個および／または１０個の各々の可能な組み合わせが分類子を作製するために利用され、この分類子は、膀胱癌を有するメンバーと有さないメンバーとを区別する能力について評価される。本発明のさらに別の実施形態において、選択される表１１および表２のバイオマーカーの一部は、そのｐ値が、０．５未満；０．１未満；０．０５未満；０．０１未満；０．００５未満；０．００１未満；０．０００５未満；０．０００１未満；０．００００５未満；０．００００１未満；０．０００００５未満；０．０００００１未満などであるものである。ある実施形態において、表１１および表２のバイオマーカーのサブセットは、バイオマーカー産物によって示されるディファレンシャルな発現レベルに基づいて、分類子への入力のための組み合わせを形成するように選択される。血液中でディファレンシャルな倍数変化を測定する際に、倍数変化の違いは全く小さいことがあり得るので、ある実施形態においては、バイオマーカーの選択は、倍数変化が、１．２より大きい、１．３より大きい、１．４より大きい、１．５より大きい、１．６より大きい、１．７より大きい、１．８より大きい、１．９より大きい、２．０より大きい、２．１より大きい、２．２より大きい、２．３より大きい、２．４より大きい、２．５より大きい、２．６より大きい、２．７より大きい、２．８より大きい、２．９より大きい、３．０より大きい、３．１より大きい、３．２より大きい、３．３より大きい、３．４より大きい、３．５より大きい、４．０より大きいなどである、ディファレンシャルな倍数変化に基づくことが注目される。ある実施形態において、当業者によって理解されるように、ｐ値と倍数変化の両方に基づいて、組み合わせを形成するためのバイオマーカーを選択しておくことが有益である。従って、ある実施形態において、バイオマーカーは、バイオマーカーデータから生じるｐ値に基づいて上記に概説されるように最初に選択され、次いでバイオマーカーデータから決定されるディファレンシャルな倍数変化に基づいて選択される。別の実施形態において、バイオマーカーは、ディファレンシャルな倍数変化に基づいて最初に選択され、次いで、下位選択がｐ値に基づいて行われる。ある実施形態において、選択判断基準およびその後のランク付けの１つ以上の使用は、上位の２．５％、５％、７．５％、１０％、１２．５％、１５％、１７．５％、２０％、３０％、４０％、５０％またはそれ以上のランク付けされたバイオマーカーの選択が使用されることを可能にし、その結果、選択されたバイオマーカーのすべての２個および／または３個および／または４個および／または５個および／または６個および／または７個および／または８個および／または９個および／または１０個の各々の組み合わせが利用されて分類子を作製し、これらの分類子は、膀胱癌を有するメンバーと有さないメンバーとを区別する能力について評価される。
５．１０ 分類子の評価
一旦、１つ以上の分類子が数学的モデルを使用して計算されると、分類子は、いずれの分類子が所望の目的のために有効であるかを決定するために評価することができる。本発明の１つの好ましい実施形態において、、各分類子は、膀胱癌を有するかまたは膀胱癌を有さないとしてトレーニング集団の各個体を適切に特徴付けするその能力について、評価およびスコアリングされる。例えば、標準的であり、開示されている標準的な統計学的手法を使用する相互検証、リーブアウト相互検証、ｎ−倍相互検証、ジャックナイフ解析を使用して、分類子を評価することができる。本明細書で使用される場合、分類子を評価するプロセスは「スコアリング」と呼ばれる。ある実施形態において、ある実施形態において、スコアリングはトレーニング集団を使用して行われる。別の実施形態において、スコアリングは本明細書に記載されるような「スコアリング集団」を使用して行われる。さらに別の実施形態において、スコアリングは「トレーニング集団」と「スコアリング集団」の両方を使用して行われる。１つの実施形態において、スコアリング集団には、トレーニング集団において使用されない１つ以上のメンバーに加えて、トレーニング集団のメンバーが含まれる。ある実施形態において、５パーセント以下、１０パーセント以下、２０パーセント以下、３０パーセント以下、５０パーセント以下、または９０パーセント以下のトレーニング集団のメンバーがスコアリング集団に共通である。
ある実施形態において、割合補正予測の統計値が各分類子をスコアリングするために使用される。「割合補正予測」統計値は、推定のｐが０．５以上である場合は、事象が起こることが予測され、そうでない場合は起こらないことが予測されると仮定する。これらの確率が０または１であることを仮定することによって、何パーセントのトレーニング集団が正確にサンプリングされたかを決定するために、トレーニング集団中のサンプルの値に対して、比較を行うことができる。
１つの実施形態において、トレーニング集団の個々の個体を適切に特徴付けるその能力について分類子を評価するために使用される方法は、分類子の感度（ＴＰＦ、真の正の画分）および１−特異性（ＴＮＦ、真の負の画分）を評価する方法である。例えば、１つの実施形態において、受信者動作特性（「ＲＯＣ」）が利用される。ＲＯＣは、生成した方程式の診断結果の感度と特異性の両方を評価するためのいくつかのパラメーターを提供する。例えば、１つの実施形態において、ＲＯＣ面積（曲線下面積）が、方程式を評価するために使用される。好ましい実施形態において、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９よりも大きなＲＯＣ面積が好ましい。他方、１．０の完全なＲＯＣ面積スコアは、１００％感度と１００％特異性の両方を有することを示す。
関連分野における当業者によって理解されるように、曲線下面積は、ＲＯＣ曲線中に含まれる二次元情報を一次元情報に転換する。別の実施形態において、ＲＯＣ曲線の二次元態様からの情報が直接的に利用される。例えば、ＲＯＣ曲線はまた、分類子の感度および特異性に関する情報を提供する。ある実施形態において、分類子は、感度または特異性のいずれかに基づいて選択される。これは、重要なスコアリング指標であり得る。例えば、高い特異性（すなわち、より少ない数の偽陰性）を有する診断分類子は、人を正常であると誤って診断することよりもむしろ、個体が疾患を有すると誤って診断することが安全である状況において重要である可能性がある。そのため、ある実施形態において、カットオフは感度または特異性のいずれかについて設定することができ、そして分類子は残りの変数に基づいて等級付けまたはスコアリングすることができる。ある実施形態において、ＲＯＣ曲線は、データを生成するために、任意の公知の方法を使用して、各分類子について生成される。ある実施形態において、データは、マイクロアレイを使用して生成される。ある実施形態において、データは、定量ＲＴ−ＰＣＲを利用して生成される。
ある実施形態において、分類子は、マルチカテゴリーロジットモデルによって特徴付けられた加重ロジスティック回帰モデルである。例えば、ある実施形態において、分類子は、２つの異なる形質群の間を区別する。別の実施形態において、分類子は、２つより多くの異なる形質群の間を区別する。マルチカテゴリーロジットモデルを含むロジットモデルは、Ａｇｒｅｓｔｉ，カテゴリーデータ分析の序説（An Introduction to Categorical Data Analysis），John Wiley & Sons,Inc.，１９９６，ニューヨーク，７章および８章において記載され、これは参照により本明細書に援用される。表１０は、ロジット：
ｌｎ［ｐ／（１−ｐ）］＝α＋β１Ｘ１＋β２Ｘ２＋ε
を使用する数学的モデルに適用される発現データに基づくＲＯＣ曲線を形成するために使用されるデータを例示する。
Figure 2008539728
表８における各行は、スコアリング集団における異なる標本に対応する。左の列は、サンプリングされた分類子についてのロジットの結果を表す。表８における標本は、左の列に列挙されたロジットスコアによってランク付けされる。右の列は、回帰方程式によって考慮される形質の存在または非存在について詳述する。表８はＲＯＣ曲線を計算するために使用することができ、ここでは、表８における各行が、ＲＯＣ曲線のデータ点を計算するために閾値のカットオフ値と見なされる。次いで、ＲＯＣ曲線下の面積は、分類子の予測し得る質を評価するために計算することができる。
５．１１ 本明細書のバイオマーカーの産物
当業者によって理解されるように、膀胱癌と非膀胱癌との間でディファレンシャルに発現されるバイオマーカーの１つ以上の組み合わせの同定は、同定される組み合わせのバイオマーカー（遺伝子）の産物の発現を反映するデータを使用して、試験個体についての膀胱癌の診断を可能にする。
本発明のバイオマーカーの各々の産物は、ＲＮＡとタンパク質の両方を含む。本発明のバイオマーカーのＲＮＡ産物は本発明のバイオマーカーの転写産物であり、ｈｎＲＮＡ、ｍＲＮＡ、およびｍＲＮＡの１つ以上のスプライシング変異体の集団を含む。本発明を実施するために、本発明のバイオマーカーのＲＮＡ産物の集団の１つ以上の測定は、診断の目的のために使用することができる。より特定には、膀胱癌および／または早期の膀胱癌と非膀胱癌との間でディファレンシャルに発現されるバイオマーカーのＲＮＡ産物の集団の測定が本発明に包含される。
本発明の１つの実施形態において、測定される本発明のバイオマーカーのＲＮＡ産物は、ｈｎＲＮＡ、ｍＲＮＡ、およびｍＲＮＡのすべてのスプライシング変異体を含むＲＮＡ産物の集団である。別の実施形態において、測定される本発明のバイオマーカーのＲＮＡ産物はｍＲＮＡの集団である。本発明の別の実施形態において、測定される本発明のバイオマーカーのＲＮＡ産物は、血液中で発現されるｍＲＮＡの集団である。本発明のさらに別の実施形態において、測定される本発明のバイオマーカーのＲＮＡ産物は、ｍＲＮＡの１つ以上のスプライシング変異体の集団である。本発明のさらに別の実施形態において、測定される本発明のバイオマーカーのＲＮＡ産物は、血液中で発現されるｍＲＮＡの１つ以上のスプライシング変異体の集団である。別の実施形態において、本発明のバイオマーカーのＲＮＡ産物は、表１−２、４−５、７および１０のいずれか１つにおいて同定される遺伝子座リンク（遺伝子ＩＤ）に対応するすべてのｍＲＮＡである。本発明の別の実施形態において、測定される本発明のバイオマーカーのＲＮＡ産物は、表３および６のいずれか１つにおいて遺伝子座リンク（遺伝子ＩＤ）に対応するＲＮＡ産物である。本発明の別の実施形態において、測定される本発明のバイオマーカーのＲＮＡ産物は、血液中で発現される、遺伝子座リンク（遺伝子ＩＤ）に対応するＲＮＡ産物である。
本発明のバイオマーカーのタンパク質産物もまた本発明の範囲に含まれ、これは本発明のバイオマーカーから生じるタンパク質産物の全体の集団を含む。当業者によって理解されるように、本発明のバイオマーカーから生じるタンパク質の全体の集団には、タンパク質、ｍＲＮＡスプライシング変異体から生じるタンパク質変異体、および翻訳後修飾されたタンパク質が含まれる。１つの実施形態において、本発明のバイオマーカーのタンパク質産物は、表１−２、４−５、７および表１０−１１に同定される遺伝子座リンク（遺伝子ＩＤ）に対応するすべてのタンパク質である。本発明の別の実施形態において、測定される本発明のバイオマーカーのタンパク質産物は、表３および表６のいずれか１つにおける遺伝子座リンク（遺伝子ＩＤ）に対応するタンパク質である。本発明のさらに別の実施形態において、本発明のバイオマーカーのタンパク質産物は、血液中で発現される、遺伝子座リンク（遺伝子ＩＤ）に対応するタンパク質である。本発明を実施するために、本発明のバイオマーカーのタンパク質産物の１つ以上の集団の測定を、診断の目的のために使用することができる。より特定には、膀胱癌および／または早期の膀胱癌を有する個体と膀胱癌を有さない個体との間でディファレンシャルに発現されるバイオマーカーのタンパク質産物の集団の測定は、診断の目的のために有用であり、本発明に包含される。
本発明の１つの実施形態において、測定される本発明のバイオマーカーのタンパク質産物は、本発明のバイオマーカーのＲＮＡ産物から翻訳されるタンパク質産物の全体の集団である。別の実施形態において、本発明のバイオマーカーのタンパク質産物は、血液中で発現されるタンパク質産物である。本発明のさらに別の実施形態において、本発明のバイオマーカーの任意の１種以上のタンパク質産物は、ｍＲＮＡスプライシング変異体の任意の１つ以上から翻訳されるタンパク質産物の任意の１つ以上である。本発明のさらに別の実施形態において、本発明のバイオマーカーのタンパク質産物は、血液中で発現されたｍＲＮＡスプライシング変異体の任意の１つ以上から翻訳されるタンパク質産物の任意の１つ以上である。
５．１２ 膀胱癌および／または早期の膀胱癌を診断するために同定される組み合わせの使用
本明細書に記載されるように、試験されたバイオマーカーの組み合わせの各バイオマーカーの発現レベルに対応するデータを使用する数学的モデル（例えば、ロジスティック回帰モデル）の適用は、分類子を作成する。分類子は、試験されたバイオマーカーの組み合わせの各々のバイオマーカーの発現レベルに代表的なデータを、個体が膀胱癌および／もしくは早期の膀胱癌を有するかまたは膀胱癌を有さないか診断的決定に転換するために数学的関数を使用する。分類子は、入力のための試験個体についてのデータを診断的決定をもたらす分類子または分類子の群の中の各々の分類子に提供することによって、膀胱癌および／もしくは早期の膀胱癌を有するかまたは膀胱癌を有さないかとして個体を診断するために、直接的に使用することができる。例えば、分類子がロジスティック回帰を使用して作成される場合、分類子は以下のような形態をとる：
Ｙ＝α＋β１Ｘ１＋β２Ｘ２＋・・・＋βｋＸｋ＋ε
ここで、この式のＸ１、Ｘ２、．．．Ｘｋは、目的の組織中での遺伝子産物のレベルに代表的な測定値を表し、ｋは分類子を生成するために使用される組み合わせのバイオマーカーを選択する。従って、試験個体を診断するために、この式の各バイオマーカーについての測定値は入力であり、Ｙの値は当該試験個体の診断を決定する。
同定された組み合わせはまた、分類子とは独立して使用することができる。例えば、３個のバイオマーカーを使用する分類子が選択される場合は、（例えば、高い感度および高い特異性を示す０．９のＲＯＣ曲線下面積スコアを有する）、試験個体における３個のバイオマーカーの各々についての産物の豊富さを測定することができ、そして試験個体の発現のパターンが、膀胱癌および／もしくは早期の膀胱癌を有する対照ならびに膀胱癌を有さない対照とより類似しているか否かを決定するために、３個のバイオマーカーの各々の豊富さの測定を、膀胱癌および／もしくは早期の膀胱癌を有する個体の対照集団からの１つ以上の個体と、ならびに／または膀胱癌を有さない個体の対照集団からの１つ以上の個体と比較することができる。好ましい実施形態において、個体を診断するために、例えば、分類子への入力のための、試験個体中で同定された組み合わせのバイオマーカーのＲＮＡおよび／またはタンパク質の生成物の発現レベルの測定によって、生成した分類子を使用する。１つの実施形態において、試験個体を診断するために使用されるものと同じ方法が、数学的モデルを生成するために使用される発現データを生成するために使用される。
５．１３ 膀胱癌の回帰をモニターするために同定される組み合わせの使用
本発明は、早期の膀胱癌を有するか、または膀胱癌を有さないとして個体を診断する目的のための組み合わせについてのバイオマーカーおよび分類子の有用な組み合わせを同定する能力について教示している。膀胱癌を有さないものと比較して、早期の膀胱癌について診断する組み合わせおよび分類子もまた、例えば、治療に応答して、それらの膀胱癌の重度に関して、個体において症状が後退したか否かを決定する際に有用であることが当業者によって理解される。例えば、個体は、同定された組み合わせの１つ以上を使用する治療の前に早期の膀胱癌を有すると診断することができる。治療に続いて、個体は、当該個体がより早期の膀胱癌を有しているか否かを決定するために再度試験することができる。個体が治療の前の段階であると、もはや同定することができない事象において、このことはそれ自体、治療が有効であることを示唆し得る。加えて、治療は、個体が今や膀胱癌を有さないと診断されるように、膀胱癌の段階の後退に導き得る。
５．１４ 本発明のバイオマーカーの産物を測定するために使用されるポリヌクレオチド
本発明のバイオマーカーのＲＮＡ産物の発現を測定する手段として、本発明のサンプル中でＲＮＡ発現を測定するための１つ以上の方法と併用して、当業者によって理解されるような以下のものの１つ以上を使用することができる：オリゴヌクレオチド、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＣＲ産物、合成ＤＮＡ、合成ＲＮＡ、または本発明のバイオマーカーのＲＮＡ産物の１つ以上に特異的にハイブリダイズする天然に存在する修飾ヌクレオチドの別の組み合わせ。別の特定の実施形態において、オリゴヌクレオチド、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＣＲ産物、合成ＤＮＡ、合成ＲＮＡ、または本発明のバイオマーカーのＲＮＡ産物の１つ以上に選択的にハイブリダイズする天然に存在する修飾オリゴヌクレオチドの他の組み合わせが使用される。好ましい実施形態において、オリゴヌクレオチド、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＣＲ産物、合成ＤＮＡ、合成ＲＮＡ、または本発明のバイオマーカーのＲＮＡ産物の１つ以上に特異的と選択的の両方でハイブリダイズする天然に存在する修飾ヌクレオチド オリゴヌクレオチドの他の組み合わせが使用される。
５．１５ 本発明のバイオマーカーのＲＮＡ産物を測定するための技術
アレイハイブリダイゼーション
本発明の１つの実施形態において、本発明のＲＮＡ産物を測定するために使用されるポリヌクレオチドは、本発明の１つの態様に従うアレイを含むために、担体に安定して結合された核酸メンバーとして使用することができる。核酸メンバーの長さは、８〜１０００ヌクレオチド長さの範囲であり得、本発明のバイオマーカーのＲＮＡ産物に特異的であるように選択される。１つの実施形態において、これらのメンバーは、本発明のバイオマーカーのＲＮＡ産物について特異的および／または選択的である。さらに別の実施形態において、これらのメンバーは、本発明のバイオマーカーのｍＲＮＡ産物について特異的および／または選択的である。好ましい実施形態において、これらのメンバーは、本発明のバイオマーカーのｍＲＮＡ産物のすべての変異体について特異的および／または選択的である。さらに別の好ましい実施形態において、これらのメンバーは、本発明のバイオマーカーのｍＲＮＡ産物の１つ以上の変異体について特異的および／または選択的である。核酸メンバーは一本鎖および／もしくは二本鎖であってもよく、ならびに／またはオリゴヌクレオチドもしくはｃＤＮＡから増幅されたＰＣＲフラグメントであってもよい。好ましくは、オリゴヌクレオチドは、約２０〜３０ヌクレオチド長である。ＥＳＴは、好ましくは、１００〜６００ヌクレオチド長である。本発明のバイオマーカーの発現された領域の一部を、アレイ上のプローブとして利用できることが当業者によって理解される。より特定には、本発明の遺伝子および／または本発明の遺伝子から導き出されたｃＤＮＡもしくはＥＳＴに相補的であるオリゴヌクレオチドが有用である。本発明のある実施形態において、本発明のバイオマーカーのＲＮＡ産物に特異的および／または選択的にハイブリダイズすることが可能であるポリヌクレオチドは、本発明における使用のためにアレイにスポットすることができる。オリゴヌクレオチドベースのアレイのために、プローブとして有用である目的の遺伝子に対応するオリゴヌクレオチドの選択は、当該分野において十分に理解されている。より特定には、標的核酸へのハイブリダイズを可能にする領域を選択することが重要である。オリゴヌクレオチドのＴｍ、ＣＧ含量パーセント、二次構造の程度および核酸の長さなどの因子は重要な因子である。例えば、米国特許第６，５５１，７８４号を参照のこと。１つの実施形態において、アレイは、表３ならびに表６および／または表１２に記される特異的ＲＮＡおよび／またはタンパク質産物を含む、表１、表２、表４、表５ならびに表７および／または表１０および／または表１１に開示されるような本発明のバイオマーカーの各々の産物の１つ以上にハイブリダイズ可能である、１０〜１０００ヌクレオチドの間の配列から成る。
本発明のアレイにハイブリダイズし、かつこれを用いて分析される標的核酸サンプルは、好ましくは、ヒトの軟骨、血液、または滑液に由来する。この手順の限界は、標的核酸サンプルとしての使用のために利用可能であるＲＮＡの量にある。好ましくは、少なくとも１マイクログラムの総ＲＮＡが本発明に従う使用のために得られる。より少ない量のＲＮＡは、ｍＲＮＡの亜種（例えば、ポリＴオリゴヌクレオチド）に指向されるＰＣＲおよびプライマーと組み合わせて使用することができる。
標的の調製
本発明に従うアレイのための標的は、好ましくは、ヒトの血液および／またはヒトの膀胱組織に由来する。
標的核酸は、１つ以上の型の化学結合、通常は、相補的塩基対形成を通して、通常は水素結合形成を通して、相補的配列の核酸プローブまたは核酸メンバーに結合可能である。
本明細書で使用される場合、「ｍＲＮＡ転写物に由来する核酸」または「ｍＲＮＡに対応する核酸」とは、ｍＲＮＡ転写物またはそのサブ配列の合成が最終的にそのためのテンプレートとして働いている核酸をいう。従って、ｍＲＮＡから逆転写されたｃＤＮＡ、そのｃＤＮＡから転写されたＲＮＡ、ｃＤＮＡから増幅されたＤＮＡ、増幅したＤＮＡから転写されたＲＮＡなどは、すべてｍＲＮＡ転写物から誘導され、またはｍＲＮＡ転写物に対応し、このような誘導された産物または対応する産物の検出は、サンプル中の元の転写物の存在および／または豊富さを示すか、またはそれに比例する。従って、適切な標的核酸サンプルには、遺伝子のｍＲＮＡ転写物、ｍＲＮＡから逆転写されたｃＤＮＡ、ｃＤＮＡから転写されたｃＲＮＡ、遺伝子から増幅されたＤＮＡ、増幅されたＤＮＡから転写されたＲＮＡなどが含まれるがこれらに限定されない。本発明で使用される核酸標的は、好ましくは、ヒトの軟骨、血液、または滑液に由来する。好ましくは、標的は、ヒトの軟骨、血液、または滑液の抽出物に由来する核酸である。核酸は、当該分野において公知の方法、例えば、逆転写またはＰＣＲを使用して、ヒトの軟骨、血液、または滑液のｍＲＮＡ抽出物から合成された一本鎖または二本鎖のＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドであり得る。
最も単純な実施形態において、このような核酸標的は、組織または血液のサンプルから単離されたｍＲＮＡ（例えば、ｃＤＮＡ）に対応する総ｍＲＮＡまたは核酸のサンプルを含む。別の実施形態において、総ｍＲＮＡは、例えば、酸グアニジウム−フェノール−クロロホルム抽出法を使用して所定のサンプルから単離され、ポリＡ＋ｍＲＮＡは、オリゴｄＴカラムクロマトグラフィーまたは（ｄＴ）ｎ磁気ビーズを使用することによって単離される（例えば、Sambrookら、分子クローニング：実験室マニュアル（Molecular Cloning,A Laboratory Manual）（第２版），１−３巻，Cold Spring Harbor Laboratory，（１９８９）、または分子生物学の現在のプロトコール（Current Protocols in Molecular Biology），F.Ausubelら編Greene Publishing and Wiley-Interscience，ニューヨーク（１９８７）を参照のこと）。好ましい実施形態において、総ＲＮＡは、TRIzol（登録商標）試薬（GIBCO/BRL，Invitrogen Life Technologies，カタログ番号１５５９６）を使用して抽出される。ＲＮＡの純度および完全性は、２６０／２８０ｎｍの吸収によって、およびアガロースゲル電気泳動、その後の紫外光下での検査によって評価される。
ある実施形態において、例えば、限られた量の組織が使用される場合に、ハイブリダイゼーションの前に標的核酸サンプルを増幅することが所望される。当業者は、いずれの増幅方法を使用するかに関わらず、定量的な結果が所望される場合には、増幅された核酸の相対的な頻度を維持または制御する方法を使用するための配慮がなされなくてはならないことを認識する。「定量的」増幅の方法は当業者に周知である。例えば、定量ＰＣＲは、同じプライマーを使用する既知量の対照配列の同時増幅を含む。このことは、ＰＣＲ反応を較正するために使用されてもよい内部標準を提供する。次いで、高密度アレイは、増幅された核酸の定量のための内部標準に特異的なプローブを含んでもよい。定量ＰＣＲのための詳細なプロトコールは、ＰＣＲプロトコール、方法および応用のガイド（PCR Protocols,A Guide to Methods and Applications），Innisら、Academic Press,Inc. ニューヨーク州，（１９９０）に提供されている。
他の適切な増幅方法には、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（Innisら、ＰＣＲプロトコール、方法および応用のガイド（PCR Protocols,A Guide to Methods and Applications）．Academic Press,Inc.San Diego，（１９９０））、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（WuおよびWallace，１９８９，Genomics，４：５６０；Landegrenら、１９８８，Science，２４１：１０７７ならびにBarringerら、１９９０，Gene，８９：１１７を参照のこと）、転写増幅（Kwohら、１９８９，Proc.Natl.Acad.Set USA，８６：１１７３）、および自律的（self-sustained）配列複製（Guatelliら、１９９０，Proc.Nat.Acad.Sci USA，８７：１８７４）が含まれるがこれらに限定されない。
特に好ましい実施形態において、標的核酸サンプルのｍＲＮＡは、逆転写酵素、ならびにオリゴｄＴおよびファージＴ７プロモーターをコードする配列から成るプライマーを用いて逆転写され、一本鎖ＤＮＡテンプレートを提供する。第２のＤＮＡ鎖は、ＤＮＡポリメラーゼを使用して重合される。二本鎖ｃＤＮＡの合成後、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼが加えられ、ＲＮＡはｃＤＮＡテンプレートから転写される。各単独のｃＤＮＡテンプレートからの転写の逐次的なラウンドは、増幅ＲＮＡを生じる。インビトロ転写の方法は当業者に周知であり（例えば、Sambrook、前出を参照のこと）、この特定の方法は、Van Gelderら、１９９０，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，８７：１６６３−１６６７によって詳細に記載されており、彼らは、この方法に従うインビトロ増幅が、種々のＲＮＡ転写物の相対的な頻度を保存することを実証している。さらに、Eberwineら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA，８９：３０１０−３０１４は、元の出発物質の１０６倍の増幅よりも多くを達成するために、インビトロ転写を介する２ラウンドの増幅を使用し、それによって、生物学的サンプルが制限されている場合でさえ、発現のモニタリングを可能にするプロトコールを提供する。
標的または核酸プローブの標識
標的またはプローブのいずれかを標識することができる。
分子に結合されるか、または分子に取り込まれる任意の分析的に検出可能なマーカーが、本発明において使用されてもよい。分析的に検出可能なマーカーとは、分析的に検出および定量される任意の分子、部分、または原子をいう。
本発明における使用のために適切な検出可能な標識には、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的、または化学的な手段による、検出可能な任意の組成物が含まれる。本発明における有用な標識には、標識されたストレプトアビジンコンジュゲートを用いる染色のためのビオチン、磁気ビーズ（例えば、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標））、蛍光色素（例えば、フルオレセイン、テキサスレッド、ローダミン、緑色蛍光タンパク質など）、放射性標識（例えば、３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、または３２Ｐ）、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、およびＥＬＩＳＡにおいて一般的に使用される他の酵素）、およびコロイド金または着色ガラスもしくはプラスチック（例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックスなど）のビーズなどの比色分析用ビーズが含まれる。このような標識の使用について教示している特許には、米国特許第３，８１７，８３７号；同第３，８５０，７５２号；同第３，９３９，３５０号；同第３，９９６，３４５号；同第４，２７７，４３７号；同第４，２７５，１４９号；および同第４，３６６，２４１号が含まれ、これらの全体は参照により本明細書に援用される。
このような標識を検出する手段は当業者に周知である。従って、例えば、放射性標識は、写真フィルムまたはシンチレーションカウンターを使用して検出されてもよく、蛍光マーカーは放射光を検出するための光検出器を使用して検出されてもよい。酵素標識は、典型的には、基質とともに酵素を提供すること、および基質に対する酵素の作用によって生じる反応生成物を検出することによって検出され、比色分析標識は、着色した標識を単に可視化することによって検出される。
標識は、当業者に周知である多数の手段のいずれかによって組み込まれてもよい。しかし、好ましい実施形態において、標識は、サンプル核酸の調製における増幅段階の間に同時に組み込まれる。従って、例えば、標識プライマーまたは標識ヌクレオチドを用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、標識された増幅産物を提供する。好ましい実施形態において、上記のような転写増幅は、標識ヌクレオチド（例えば、フルオレセイン標識ＵＴＰおよび／またはＣＴＰ）を使用して、転写された核酸に標識を組み込む。
代替的には、標識は、元の核酸サンプル（例えば、ｍＲＮＡ、ポリＡ ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡなど）に、または増幅が完了した後で増幅産物に直接的に加えられてもよい。核酸に標識を結合させる手段は当業者に周知であり、これには例えば、ニックトランスレーション、または核酸のキナーゼ処理、続いてサンプル核酸を標識（例えば、蛍光団）に結合する核酸リンカーの結合（ライゲーション）による末端標識（例えば、標識ＲＮＡを用いる）が含まれる。
好ましい実施形態において、蛍光修飾は、シアニン色素、例えば、Ｃｙ−３／Ｃｙ−５ ｄＵＴＰ、Ｃｙ−３／Ｃｙ−５ ｄＣＴＰ（Amersham Pharmacia）またはａｌｅｘａ色素（Khanら、１９９８，Cancer Res. ５８：５００９−５０１３）による。
好ましい実施形態において、比較のために使用される２つの標的サンプルが、区別できる検出シグナルを生じる異なる蛍光色素を用いて標識され、例えば、正常軟骨から作られた標的はＣｙ５で標識され、軽度の変形性関節症である軟骨から作られた標的はＣｙ３で標識される。異なって標識される標的サンプルは、同じマイクロアレイに同時にハイブリダイズされる。好ましい実施形態において、標識された標的は、当該分野において公知の方法を使用して、例えば、エタノール沈殿またはカラム精製によって精製される。
好ましい実施形態において、標的は、マイクロアレイから生成するシグナルを標準化するために、マイクロアレイ上の対照プローブにハイブリダイズする１つ以上の対照分子を含む。好ましくは、標識された標準化標的は、上記のようにマイクロアレイにスポットされる対照オリゴヌクレオチドに完全に相補的である核酸配列である。ハイブリダイゼーション後に標準化対照から得られるシグナルは、ハイブリダイゼーション条件、標識の強度、「読み取り」効率、および完全なハイブリダイゼーションのシグナルをアレイ間で変動させ得る他の要因の変動についての対照を提供する。好ましい実施形態において、アレイ中の他のすべてのプローブから読み取られるシグナル（例えば、蛍光強度）は、対照プローブからのシグナル（例えば、蛍光強度）によって除算され、それによって測定を標準化する。
好ましい標準化標的は、サンプル中に存在する他の標的の平均長を反映するように選択されるが、しかし、これらは、一定の長さを網羅するように選択される。標準化対照はまた、アレイ中の他のプローブの（平均）塩基組成を反映するように選択することができるが、しかし、好ましい実施形態において、１つまたは数個のみの標準化プローブが使用され、これらのプローブは、これらが十分にハイブリダイズし（すなわち、二次構造を有さず、かつ自己ハイブリダイズしない）、かついかなる標的分子とも一致しないように選択される。
標準化プローブは、ハイブリダイゼーション効率の空間的な変動を制御するために、アレイ中の任意の位置に、またはアレイの全体を通して複数の位置に局在化される。好ましい実施形態において、標準化対照は、アレイの角または端、ならびに中央部に局在化される。
ハイブリダイゼーション条件
核酸ハイブリダイゼーションは、プローブまたは標的核酸メンバーおよびその相補的標的が、相補的塩基対形成を通して、安定なハイブリッド二重鎖を形成することができる条件下で、変性したプローブまたは標的核酸メンバーおよびその標的核酸を提供する工程を含む。次いで、ハイブリッド二重鎖を形成しない核酸は洗い流されて、代表的には、結合した検出可能な標識の検出を通して検出されるハイブリダイズした核酸を残す。核酸が、温度を上昇させること、または核酸を含む緩衝液の塩濃度を減少させることで変性されることは一般的に認識されている。低ストリンジェンシー条件（例えば、低温および／または高塩）下では、アニールした配列が完全に相補的ではない場合でさえ、ハイブリッド二重鎖（例えば、ＤＮＡ：ＤＮＡ、ＲＮＡ：ＲＮＡ、またはＲＮＡ：ＤＮＡ）が形成する。従って、ハイブリダイゼーションの特異性は、より低いストリンジェンシーで減少する。逆に、より高いストリンジェンシー（例えば、高温または低塩）において、首尾よいハイブリダイゼーションはより少ないミスマッチを必要とする。
本発明は、Ｄｉｇハイブリダイゼーションミックス（Boehringer）；または、例えば、Ausubelら、前出およびSambrookら、前出に記載されるようなホルムアミドベースのハイブリダイゼーション溶液を含むハイブリダイゼーション条件を提供する。
ハイブリダイゼーション条件を最適化する方法は当業者に周知である（例えば、生化学および分子生物学における実験室技術（Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology）、第２４巻：核酸プローブを用いるハイブリダイゼーション（Hybridization With Nucleic acid Probes）P.Tijssen編、Elsevier, ニューヨーク州，（１９９３）を参照のこと）。
ハイブリダイゼーション後、ハイブリダイズしていない標識された核酸または未標識核酸は、洗浄によって便利に担体表面から除去され、それによって、基質表面上のハイブリダイズした標的核酸のパターンを生成する。種々の洗浄溶液は当業者に公知であり、使用されてもよい。標識され、ハイブリダイズされたオリゴヌクレオチドおよび／または核酸の生じたハイブリダイゼーションパターンは、種々の方法で可視化または検出されてもよく、特定の検出の様式は試験核酸の特定の標識に基づいて選択され、ここで、代表的な検出手段には、シンチレーション計数、オートラジオグラフィー、蛍光測定、熱量分析、光放射測定などが含まれる。
画像の取得およびデータ分析
上記のようなハイブリダイゼーションならびに任意の洗浄工程および／またはその後の処理の後、生じたハイブリダイゼーションパターンが検出される。ハイブリダイゼーションパターンを検出または可視化する際に、標識の強度またはシグナルの値は、検出されるだけではなく定量され、それによって、ハイブリダイゼーションの各スポットからのシグナルが測定され、既知数の末端標識された標的核酸によって放出されるシグナルに対応する単位値に対して比較され、ハイブリダイゼーションパターンにおけるアレイ上の特定のスポットにハイブリダイズされる各末端標識された標的のコピー数の計数または絶対値を得ることが意味される。
アレイへのハイブリダイゼーションから収集されたデータを分析するための方法は当該分野において周知である。例えば、ハイブリダイゼーションの検出が蛍光標識を含む場合、データ分析は、収集したデータから基質の位置の関数として蛍光強度を決定する工程、異常値、すなわち、あらかじめ決定した統計学的分布から逸脱したデータを除外する工程、および残りのデータから試験核酸の相対的な結合親和性を計算する工程を含むことができる。得られるデータは、結合したオリゴヌクレオチドおよび／または核酸と試験核酸との間の結合親和性に従って変化する、各領域における強度を有する画像として表示される。
以下の検出プロトコールは、比較される２つの軟骨サンプルの同時分析のために使用され、ここで、各サンプルは、異なる蛍光色素を用いて標識される。
マイクロアレイの各エレメントは、第１の蛍光色についてスキャンされる。各アレイエレメントにおける蛍光の強度は、サンプル中の遺伝子の発現レベルに比例する。
スキャニング操作は第２の蛍光標識について反復する。２つの蛍光強度の比率は、２つの組織サンプルにおける相対的発現レベルの高度に正確かつ定量的な測定を提供する。
好ましい実施形態において、固定化された標的核酸配列の蛍光強度は、レーザー励起光源ならびにＣｙ３蛍光およびＣｙ５蛍光のために適切な干渉フィルターを備えた特注の共焦点顕微鏡を用いて得られた画像から決定した。個別のスキャンを、ピクセルあたり２２５μｍ２の解像度および６５，５３６グレーレベルで各蛍光について行った。ハイブリダイゼーションの領域を同定するための画像のセグメント化、２つの蛍光画像の間の強度の標準化、および各標的における標準化された平均蛍光値の計算は記載されている通りである（Khanら、１９９８，Cancer Res. ５８：５００９−５０１３．Chenら、１９９７，Biomed，Optics ２：３６４−３７４）。画像間の標準化は、標識の異なる効率および２つの異なる蛍光を用いる検出について調整するために使用される。これは、アレイ上にスポットされた一連の内部対照遺伝子の１つのシグナル強度の比率の値と釣り合わせることによって達成される。
別の好ましい実施形態において、アレイは、Ｃｙ３およびＣｙ５のチャンネルでスキャンされ、個別の１６ビットＴＩＦＦ画像として保存される。これらの画像は取り込まれ、アレイ上の各スポットからのハイブリダイゼーション強度データをキャプチャするためのグリッド化プロセスを含むソフトウェアを使用して分析する。各スポットの蛍光強度およびバックグラウンドを差し引いたハイブリダイゼーション強度が収集され、Ｃｙ５対Ｃｙ３の測定された平均強度の比率が計算される。直線回帰アプローチが標準化のために使用され、測定されたＣｙ５対Ｃｙ３の強度のスキャッタープロットは１の傾きを有するはずであることを前提とする。比率の平均が計算され、そして使用されて、データをリスケールし、傾きを１に調整する。１に等しくない発現の比率は、ディファレンシャルな遺伝子発現の表示として使用される。
特に好ましい実施形態において、サンプル中の１つ以上の核酸配列の転写レベル（およびそれによって発現）を定量することが所望される場合、標的核酸サンプルは、遺伝子のｍＲＮＡ転写物の濃度またはｍＲＮＡ転写物に由来する核酸の濃度が、その遺伝子の転写レベル（およびそれゆえに発現レベル）に比例するものである。同様に、ハイブリダイゼーションシグナル強度がハイブリダイズした核酸の量に比例することが好ましい。この比例は、比較的厳密であることが好ましいが（例えば、転写速度の倍加は、サンプル核酸プール中のｍＲＮＡ転写物の倍加およびハイブリダイゼーションシグナルの倍加を生じる）、当業者は、比例がより緩和されおよび非線形でさえあり得、さらに有意な結果をもたらすことを認識する。従って、例えば、標的ｍＲＮＡの濃度の５倍の違いがハイブリダイゼーション強度において３〜６倍の違いを生じるアッセイは、大部分の目的のために十分である。より正確な定量化が必要とされる場合、適切な対照は、本明細書に記載されるようなサンプル調製およびハイブリダイゼーションに導入されるバリエーションについて補正するために実行される。加えて、「標準」標的ｍＲＮＡの段階的希釈は、当業者に周知である方法に従って較正曲線を準備するために使用される。当然、転写物の存在または非存在の単純な検出が所望される場合、複雑な対照または較正が必要とされない。
例えば、アレイ上の核酸メンバーがハイブリダイゼーション後に標識されない場合、このことは、この核酸メンバーを含む遺伝子が、いずれのサンプル中においても発現されないことを示す。核酸メンバーが単色で標識される場合には、これは、標識された遺伝子が１つのサンプル中でのみ発現されたことを示す。アレイを含む核酸メンバーの両方の色での標識は、その遺伝子が両方のサンプル中で発現されたことを示す。細胞あたり１回だけ発現された遺伝子さえもが検出される（１００，０００中１部の感度）。比較される２つのサンプル中での発現強度の違いは、ディファレンシャルな発現を示し、２つのサンプル中の強度の比率は１．０に等しくなく、好ましくは０．７未満または１．２より上、より好ましくは０．５未満または１．５より上である。
ＲＴ−ＰＣＲ
本発明の態様において、本発明のバイオマーカーのＲＮＡ産物の発現レベルは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）との併用で逆転写（ＲＴ）を使用して、サンプルからのバイオマーカーのＲＮＡ産物を増幅することによって測定することができる。本発明の１つの実施形態に従って、ＲＴは、当業者によって理解されるように定量的であり得る。
総ＲＮＡ、またはサンプルからのｍＲＮＡがテンプレートとして使用され、本発明のバイオマーカーの転写される部分に特異的なプライマーが、逆転写を開始するために使用される。ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写する方法は周知であり、Sambrookら、１９８９、前出に記載されている。プライマー設計は、市販のソフトウェア（例えば、Primer Designer 1.0, Scientific Sofwareなど）を利用し、標準的かつ当該分野において周知である方法を使用して達成することができる。
本発明によって包含されるプライマーを設計および選択するために使用されるプロトコールの１つの実施形態は、SYBR-Greenアッセイを用いるリアルタイムＰＣＲにおける使用のためのプライマーの設計に含まれる原理および工程を説明する。好ましくは、このプロトコールは、The National Center for Biotechnology Information（ＮＣＢＩ）のサーチエンジンおよびPrimerQuestプライマー設計ソフトウェアの適用を使用する。PrimerQuestは、Integrated DNA Technologies,Inc.（ＩＤＴ）のために開発されたウェブベースのソフトウェアである。このソフトウェアは、Whitehead Institute for Biomedical Researchによって開発されたPrimer3に基づく。
１つの実施形態において、本発明によって包含されるプライマーを設計するために使用されるガイドラインは、産物またはアンプリコンの長さが、好ましくは１００〜１５０塩基であること、最適Ｔｍが好ましくは６０℃であり、５８〜６２℃の範囲が許容し得ること、および最も好ましくはＧＣ含量が５０％であり、４５〜５５％の好ましい範囲もまた許容し得ることである。「プライマー−ダイマー」形成を減少させるために、各々のプライマーの３’末端の、それ自体または他のプライマーに対する、３塩基の相補的ストリングが回避されていることが有益である。プライマー配列の中およびプライマーの対の間の相補的配列が回避されていることも有益である。好ましくは、３’末端における３つ以上のＧまたはＣの連続は、３塩基より長い単一の塩基の反復と同様に回避される。バランスのとれていないＧ／ＣおよびＡ／Ｔリッチドメインの分布は好ましくは回避され、１つの特定の実施形態において、プライマーは、３’末端にＧまたはＣを有する。３’末端にＴを有するプライマーはミスマッチに対してより高い耐容性を有するので、プライマーの３’末端がＴになっていないことが有益である。とりわけ、３’末端におけるミスマッチが回避されていることが有益である；そして３’末端に少なくとも７個の固有の塩基を配置することが有用である。選択されるプライマーの自己相補性を回避することを補助するために、スコアリングスキームを使用して有用なプライマーを選択することもできる。従って、例えば、所定のマッチについての＋１のスコア、ミスマッチについての−１、単一のｐｂギャップについての−２であり、次いで、可能な限り低いスコアを有するプライマーが選択され、しかし、１つの実施形態において、プライマーは５未満のスコアを有する。好ましくは、ゲノム増幅は回避され、このようにして、任意の１つのプライマーがイントロンに及ぶべきであることが好ましい。好ましくは、プライマーは、プライマーの半分または少なくとも７個のヌクレオチドが１つのエクソンの３’末端、および残りは隣接するエクソンの５’末端までハイブリダイズするように、設計されるべきである。加えて、さらなる選択される実施形態において、プライマーは、ゲノム配列の増幅を区別し、または妨害するように、エクソン−エクソン結合部を横切って設計される。別の選択される実施形態において、プライマーは、既知のＳＮＰを回避するように設計される。
プライマーソフトウェアプログラムは、以下のウェブサイトリンク：biotools.idtdna.com/primerquest/を通して利用可能である「The Primer Questソフトウェア」などのように、本発明によって包含されるプライマーの設計および選択において補助するために使用することができる。
以下のウェブサイトリンクは、好ましくは、遺伝子または配列の説明、登録ＩＤまたは配列ＩＤ、遺伝子記号、RefSeq番号、および／またはUniGene番号などの妥当なバイオマーカー情報を使用して、バイオマーカープライマー設計における使用のためにヒトゲノムデータベースからの配列情報を検索およびアップデートする際に有用である：１）the NCBI LocusLinkホームページ：www.ncbi.nlm.nih.gov/LocusLink/、および２）Ensemble Human Genome Browser:www.ensembl.org/Homo_sapiens。
一旦、プライマーがそこから生成される正確な標的ＤＮＡ配列が得られたら、目的の遺伝子について、LocusLinkのリンクから、またはEnsembl Gene Browserから、Exon-Intron Boundariesに留意しておくことが好ましい。プライマー設計を最適化するための１つの好ましい手段は、PrimerQuestソフトウェアの中の基本（BASIC）、標準（STANDARD）および拡張（ADVANCE）の３つのオプションを使用することである。
PrimerQuestソフトウェアのBASIC関数の好ましい使用は、最初に、配列情報の下で、プライマーの名称を［Name］ボックスに入力し、そして標的配列を［Sequence］ボックスにカットアンドペーストし、リアルタイムＰＣＲのパラメーター設定を使用してＰＣＲプライマーを設計するように選択することである。標準的な配列設計の下では、返すプライマーセットの数として５０を選択し、使用するミスプリンティングライブラリーとしてヒトを選択することが好ましい。標準プライマー設計の拡張機能（the Advanced Function of Standard Primer Design）の下では、以下の選択を入力しておくことが有益である：最適プライマーサイズ：２０（ｎｔ）、最適プライマーＴｍ：６０（℃）、最適プライマーＧＣ％：５０（％）、産物サイズ範囲：１００〜１５０。さらに、標準機能の下では、好ましくは以下のオプションが微調整され得る：プライマー選択；除外領域、含有領域および開始コドン位置。別の実施形態において。
一旦、必要とされるパラメーターが入力または選択されると、可能なプライマー選択のためのPrimer Quest検索が開始され、潜在的なフォワードプライマーおよびリバースプライマーに対する詳細な説明を生じ、これには、実際の配列、その開始位置、長さ、Ｔｍ、ＧＣ％、産物サイズペナルティー値、および二次構造を予測するための手段−ｍＦｏｌｄが含まれる。以下の２つの判断基準が最も有用である：好ましくはΔＧは−３．０ ｋｃａｌ．ｍｏｌ−１よりも大きい値となるべきであり、そして好ましくはＴＭは５０℃未満、かつ５５℃以下となるべきである。ドットプロットは解釈することがより少し困難となるが、一般的には、ドットプロット中の黒いドットの長い対角線を生じるプライマーを選択することは好ましくない。その理由は、ヘアピンを形成する可能性が高いからである。
好ましくは、プライマーは、標的遺伝子に対して固有であり、偽遺伝子に一致しないはずであり、これは、プライマーの特異性を調べるために［BLAST］を使用することによって確証することができる。好ましくは、IDT BioToolsによって提供されるOligo Analyzer 3.0は、自己ダイマーおよびヘテロダイマー形成の可能性を調べるために使用することができる。好ましくは、IDT BioToolsまたはPrimer 3によって提供される情報およびガイドラインは、本発明のバイオマーカーの研究のために最高の可能なプライマー対の選択のために使用することができる。融解曲線分析およびアガロースゲル電気泳動分離によって決定されるような、予測産物に一致するサイズを有する単一のアンプリコンを生成したプライマーのみが、バイオマーカー研究において使用されることが好ましい。
以下の関連する参考文献は、参照により本発明に援用される：Dieffenbach,C.W.，Lowe,T.M.J.，Dveksler,G.S.（１９９５）ＰＣＲプライマー設計のための一般的概念（General Concepts for PCR Primer Design）．ＰＣＲプライマー、実験室マニュアル（PCR Primer, A Laboratory Manual）（Dieffenbach,C.W.およびDveksler,G.S.編）所収、Cold Spring Harbor Laboratory Press，ニューヨーク，１３３−１５５、Innis,M.A.およびGelfand,D.H.（１９９０）ＰＣＲの最適化（Optimization of PCRs）．ＰＣＲプロトコール、方法および応用へのガイド（PCR protocols,A Guide to Methods and Applications）（Innis,M.A.，Gelfand,D.H.，Sninsky,J.J.およびWhite,T.J.編）所収、Academic Press，San Diego，３−１２、Sharrocks,A.D.（１９９４）ＰＣＲのためのプライマーの設計（The design of primers for PCR）．ＰＣＲ技術、現在の技術革新（PCR Technology,Current Innovations）（Griffin,H.G.およびGriffin,A.M.編）所収CRC Press，London，５−１１。
逆転写の産物は、引き続いて、ＰＣＲのためのテンプレートとして使用される。
ＰＣＲは、目的の標的配列を増幅するために、耐熱性のＤＮＡ−依存性ＤＮＡポリメラーゼによって触媒されるＤＮＡ複製の複数サイクルを使用することによって、特定の核酸配列を迅速に増幅するための方法を提供する。ＰＣＲは、増幅される核酸、増幅される配列に隣接する二本の単鎖オリゴヌクレオチドプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシリボヌクレオシド三リン酸、緩衝液および塩の存在を必要とする。
ＰＣＲの方法は当該分野で周知である。ＰＣＲは、MullisおよびFaloona，１９８７，Methods Enzymol.，１５５：３３５に記載されるように実施され、これは参照により本明細書に援用される。ＰＣＲは、テンプレートＤＮＡ（少なくとも１ ｆｇ；より有用には、１〜１０００ｎｇ）および少なくとも２５ｐｍｏｌのオリゴヌクレオチドプライマーを使用して実施される。典型的な反応混合液は以下を含む：２μｌのＤＮＡ、２５ｐｍｏｌのオリゴヌクレオチドプライマー、２．５μｌの１０Ｈ ＰＣＲ緩衝液１（Perkin-Elmer，Foster City，カリフォルニア）、０．４μｌの１．２５μＭ ｄＮＴＰ、０．１５μｌ（または２．５単位）のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Perkin Elmer,Foster City，カリフォルニア）および総量２５μｌまでの脱イオン水。ミネラルオイルを重層し、プログラム可能なサーマルサイクラーを使用してＰＣＲを実施する。
ＰＣＲサイクルの各段階の長さおよび温度、ならびにサイクルの数は、効果におけるストリンジェンシーの要求に従って調整される。アニーリングの温度およびタイミングは、プライマーがテンプレートとアニールすることが予想される効率と、許容されるミスマッチの程度の両方によって決定される。プライマーアニーリング条件のストリンジェンシーを最適化する能力は、当業者の知識の十分に範囲内にある。３０℃から７２℃の間のアニーリング温度が使用される。テンプレート分子の最初の変性は、通常、９２℃から９９℃の間で４分間行われ、続いて、変性（９４〜９９℃で１５秒間〜１分間）、アニーリング（上記に議論したように決定する温度；１〜２分間）、および伸長（７２℃、１分間）から成る２０〜４０サイクルを行う。最終の伸長段階は、一般的に、７２℃で４分間実行され、４℃での無期限（０〜２４時間）段階が続いてもよい。
実際上定量的であるＱＲＴ−ＰＣＲもまた、遺伝子発現レベルの定量的測定を提供するために実施することができる。ＱＲＴ−ＰＣＲにおいて、逆転写およびＰＣＲは２段階で実行することができ、またはＰＣＲと組み合わせた逆転写を同時に実施することができる。Taqman（Perkin Elmer，Foster City，カリフォルニア）などの市販のキットが存在するこれらの技術の１つは、転写物特異的アンチセンスプローブを用いて実施される。このプローブは、ＰＣＲ産物（例えば、遺伝子に由来する核酸フラグメント）に特異的であり、オリゴヌクレオチドの５’末端に複合体化されたクエンチャーおよび蛍光レポータープローブとともに調製される。異なる蛍光マーカーが異なるレポーターに結合され、１つの反応中で２つの産物の測定を可能にする。Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼが活性化される場合、これは、その５’−から−３’のエキソヌクレアーゼ活性によって、テンプレートに結合したプローブの蛍光レポーターを切断する。クエンチャーの非存在下では、ここでレポーターは蛍光を発する。レポーター中の色の変化は、各々の特異的産物の量に比例し、フルオロメーターによって測定され、そのため、各色の量が測定され、ＰＣＲ産物が定量される。ＰＣＲ反応は、多くの個体に由来するサンプルが同時に処理および測定されるように、９６ウェルプレート中で実施される。Taqmanシステムは、ゲル電気泳動を必要としないというさらなる利点を有し、標準曲線とともに使用するときには定量を可能にする。
ＰＣＲ産物を定量的に検出するために有用な第２の技術は、市販のQuantiTect SYBR Green PCR（Qiagen，Valencia，カリフォルニア）などの挿入色素を使用することである。ＲＴ−ＰＣＲは、蛍光標識としてSYBR greenを使用して実施され、これは、ＰＣＲ段階の間にＰＣＲ産物に組み込まれ、ＰＣＲ産物の量に比例して蛍光を産生する。
TaqmanシステムとQuantiTect SYBRシステムの両方は、ＲＮＡの逆転写に続いて使用することができる。逆転写は、ＰＣＲ段階と同じ反応混合液中で実施することができ（１段階プロトコール）、または逆転写は、ＰＣＲを利用する増幅の前に最初に実施することができる（２段階プロトコール）かのいずれかである。
加えて、ｍＲＮＡ発現産物を定量的に測定するための他のシステムが知られており、これには、分子ビーコン（Molecular Beacons（登録商標））が含まれ、これは、蛍光分子およびクエンチャー分子を有するプローブを使用し、このプローブは、ヘアピン型のときは蛍光分子がクエンチされ、ハイブリダイズされると蛍光が増加して遺伝子発現の定量的測定を与えるような、ヘアピン構造を形成することが可能である。
TaqMan（商標）、SybrGreen、Molecular Beacons（登録商標）などを使用するＱＲＴ−ＰＣＲは、増幅されるＲＮＡのレベルを反映する定量値を決定するために使用することができる。蛍光は、設定された蛍光の閾値レベル（少なくともバックグラウンド蛍光よりも上）において測定され、閾値レベルに到達するサイクルが決定される（Ｃｔ値）。従って、Ｃｔ値は、増幅産物（アンプリコン）の蛍光があらかじめ設定した閾値レベルにある、濃度依存的なＰＣＲサイクル数である。閾値は、蛍光がバックグラウンドを超えて区別可能になるレベル、またはより好ましくは、対数増幅を反映するレベルであり得る。数学モデルへの入力のための値を同定する目的のために、好ましくはΔＣｔが使用される。ΔＣｔは、測定される遺伝子の産物（すなわち、増幅されている）と対照遺伝子（時折、ハウスキーピング遺伝子と呼ばれる）との間で決定されるようなＣｔ値の変化である。当業者によって理解されるように、対照遺伝子は、発現レベルが変化しない遺伝子と想定されている。典型的な対照遺伝子はＢ−アクチンまたはＧＡＰＤＨである。
ＲＮＡ発現を定量的に測定するためのさらなる技術には以下が含まれるがこれらに限定されない：ポリメラーゼ連鎖反応、リガーゼ連鎖反応、Ｑベータレプリカーゼ（例えば、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ８７／００８８０号を参照のこと）、等温増幅法（例えば、Walkerら、（１９９２）PNAS ８９：３８２−３９６を参照のこと）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、修復鎖反応、非対称定量ＰＣＲ（例えば、米国出願第ＵＳ２００３３０１３４３０７Ａ１号を参照のこと）、およびFujaら、２００４，Journal of Biotechnology １０８：１９３−２０５において記載されている多重ミクロスフェアビーズアッセイ。
遺伝子発現レベルは、核酸配列増幅（ＮＡＳＢＡ）および３ＳＲを含む、転写ベースの増幅システム（ＴＡＳ）を使用して、サンプルからＲＮＡを増幅することによって測定することができる。例えば、Kwohら、（１９８９）PNAS USA ８６：１１７３；国際公開ＷＯ８８／１０３１５；および米国特許第６，３２９，１７９号を参照のこと。ＮＡＳＢＡにおいては、核酸は、従来のフェノール／クロロホルム抽出、熱変性、溶解緩衝液を用いる処理、ならびにＤＮＡおよびＲＮＡの単離のためのミニスピンカラム、またはＲＮＡの塩化グアニジニウム抽出を使用して、増幅のために調製されてもよい。これらの増幅技術は、標的特異的配列を有するプライマーをアニーリングする工程を含む。重合後、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドはＲＮａｓｅＨで消化されるのに対し、二本鎖ＤＮＡ分子は再度熱変性される。いずれの場合においても、一本鎖ＤＮＡは、第２の標的特異的プライマーの添加によって完全に二本鎖にされ、その後重合を行う。次いで、二本鎖ＤＮＡ分子は、Ｔ７またはＳＰ６などのポリメラーゼによって多重的に転写される。等温サイクル反応においては、ＲＮＡは、二本鎖ＤＮＡに逆転写され、Ｔ７またはＳＰ６などのポリメラーゼによって１回転写される。得られる産物は、短縮型または完全型に関わらず、標的特異的配列を示す。
いくつかの技術が、増幅産物を分離するために使用されてもよい。例えば、増幅産物は、従来の方法を使用して、アガロース、アガロース／アクリルアミド、またはポリアクリルアミドのゲル電気泳動によって分離されてもよい。Sambrookら、１９８９を参照のこと。電気泳動なしでＰＣＲ産物を定量的に検出するためのいくつかの技術もまた、本発明に従って使用されてもよい（例えば、ＰＣＲプロトコール、方法および応用のガイド（PCR Protocols,A Guide to Methods and Applications）、Innisら、Academic Press,Inc. ニューヨーク州，（１９９０）を参照のこと）。例えば、クロマトグラフィー技術が、分離をもたらすために利用されてもよい。本発明において使用されてもよい、多くの種類のクロマトグラフィー：吸着、分配、イオン交換および分子ふるい、ＨＰＬＣ、ならびにカラムクロマトグラフィー、ペーパークロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、およびガスクロマトグラフィーを含む、これらを使用するための多くの特定化された技術（Freifelder，生化学および分子生物学への物理生化学の応用（Physical Biochemistry Applications to Biochemistry and Molecular Biology）、第２版，Wm.Freeman and Co., New York，ニューヨーク州，１９８２）が存在する。
分離の方法論の別の例は、種々の型の小分子リガンドを用いて、ＰＣＲ反応中に使用されるオリゴヌクレオチドプライマーを共有結合的に標識することによって行われる。１つのそのような分離において、異なるリガンドが各ヌクレオチド上に存在する。リガンドの１つに特異的に結合する分子、おそらく、リガンドがビオチンの場合は抗体またはアビジンが、９６ウェルＥＬＩＳＡプレートなどのプレートの表面をコートするために使用される。このような調製したプレートの表面へのＰＣＲ反応の適用に際して、ＰＣＲ産物が、表面への特異性を伴って結合される。未結合の試薬を除去するためのプレートの洗浄後、第１のリガンドに結合する第２の分子を含む溶液が加えられる。第２の分子は、ある種のレポーター系と結び付けられている。第２の分子は、ＰＣＲ産物が産生された場合にのみプレートに結合し、それによって、両方のオリゴヌクレオチドプライマーが最終ＰＣＲ産物に取り込まれる。次いで、ＰＣＲ産物の量が、ＥＬＩＳＡ反応が検出および定量されるものと同じだけ、市販のプレートリーダーにおいて検出および定量される。本明細書に記載されるものなどのＥＬＩＳＡ様システムは、商品名C-Trackで、Raggio Italgene社によって開発されている。
増幅産物は、目的の核酸配列の増幅を確認するために、可視化されなければならない。１つの典型的な可視化方法は、臭化エチジウムを用いるゲルの染色、およびＵＶ光下での可視化を含む。代替的には、増幅産物が、放射性標識または蛍光定量標識されたヌクレオチドで全体的に標識される場合、増幅産物は、分離後に、適切な刺激的なスペクトル下で、Ｘ線フィルムに曝露されるか、または可視化されてもよい。
１つの実施形態において、可視化は間接的に達成される。増幅産物の分離後、標識された核酸プローブが、目的の増幅された核酸配列と接触される。プローブは、好ましくは、発色団とコンジュゲートされるが、放射性標識されてもよい。別の実施形態において、プローブは、抗体またはビオチンなどの結合パートナーにコンジュゲートされ、ここで、結合対の他のメンバーは検出可能な部分を有する。
別の実施形態において、検出は、サザンブロッティングおよび標識プローブを用いるハイブリダイゼーションによる。サザンブロッティングに含まれる技術は当業者に周知であり、分子プロトコールに関する多くの標準的な書籍の中に見つけることができる。Sambrookら、１９８９、前出を参照のこと。手短に述べると、増幅産物は、ゲル電気泳動によって分離される。次いで、このゲルはニトロセルロースなどのメンブレンと接触され、核酸の転写および非共有結合を可能にする。続いて、メンブレンは、標的増幅産物とハイブリダイズ可能である発色団コンジュゲートプローブとともにインキュベートされる。検出は、Ｘ線フィルムまたはイオン放射検出デバイスへのメンブレンの露出による。
前述の１つの例は、参照により本明細書に援用される米国特許第５，２７９，７２１号に記載されており、これは、自動化された電気泳動および核酸の転写のための装置および方法を開示する。この装置は、ゲルの外部的な操作なしで電気泳動およびブロッティングを可能にし、本発明に従う方法を実行するために理想的に適している。
ヌクレアーゼ保護アッセイ
本発明の別の実施形態において、ヌクレアーゼ保護アッセイ（リボヌクレアーゼ保護アッセイとＳ１ヌクレアーゼ保護アッセイの両方を含む）を、本発明のバイオマーカーのＲＮＡ産物を検出および定量するために使用することができる。ヌクレアーゼ保護アッセイにおいて、アンチセンスプローブ（例えば、放射性標識またはアイソトープ以外で標識される）は、溶液中でＲＮＡサンプルにハイブリダイズする。ハイブリダイゼーション後、一本鎖の、ハイブリダイズしていないプローブおよびＲＮＡはヌクレアーゼによって分解される。残っている保護フラグメントを分離するために、アクリルアミドゲルが使用される。典型的には、溶液ハイブリダイゼーションは、メンブレンベースのハイブリダイゼーションよりも効率がよく、溶液ハイブリダイゼーションは、ブロットハイブリダイゼーションの最大２０〜３０μｇと比較して、サンプルＲＮＡの１００μｇまでに対応することができる。
最も一般的な形態のヌクレアーゼ保護アッセイであるリボヌクレアーゼ保護アッセイは、ＲＮＡプローブの使用を必要とする。オリゴヌクレオチドおよび他の一本鎖ＤＮＡプローブのみを、Ｓ１ヌクレアーゼを含むアッセイにおいては使用することができる。一本鎖のアンチセンスプローブは、典型的には、ヌクレアーゼによるプローブ：標的ハイブリッドの切断を防止するために、標的ＲＮＡに対して完全に相同でなければならない。
ノーザンブロット
標準的なノーザンブロットアッセイもまた、ＲＮＡ転写物サイズを確認するため、選択的スプライシングＲＮＡを同定するため、および本発明のバイオマーカーのＲＮＡ産物の相対量を同定するために、当業者に公知である従来のノーザンハイブリダイゼーション技術に従って使用することができる。ノーザンブロットにおいて、ＲＮＡサンプルは、最初に、変性条件下で、アガロースゲル中の電気泳動を介してサイズによって分離される。次いで、ＲＮＡは、メンブレンに転写され、架橋され、そして標識プローブとハイブリダイズされる。非アイソトープ性または高比活性の放射標識プローブを使用することができ、これには、ランダムプライミングされ、ニックトランスレーションされ、またはＰＣＲ生成されたＤＮＡプローブ、インビトロ転写されたＲＮＡプローブ、およびオリゴヌクレオチドが含まれる。加えて、部分的な相同性のみを有する配列（例えば、異なる種からのｃＤＮＡまたはエクソンを含む可能性があるゲノムＤＮＡフラグメント）がプローブとして使用されてもよい。全長、一本鎖ＤＮＡ、またはＤＮＡ配列のフラグメントのいずれかを含む標識プローブ、例えば、放射標識ｃＤＮＡは、少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも５０個、または少なくとも１００個までの任意の長さのヌクレオチド長であってもよい。プローブは、当業者に公知である任意の多くの異なる方法によって標識することができる。これらの研究のために最も一般的に利用される標識は、放射性元素、酵素、紫外光に曝露されたときに蛍光を発する化学物質その他である。多数の蛍光物質が公知であり、標識として利用することができる。これらには以下が含まれるがこれらに限定されない：フルオレセイン、ローダミン、オーラミン、テキサスレッド、ＡＭＣＡブルー、およびルシファーイエロー。特定の検出物質は、ヤギにおいて調製され、イソチシアネートを通してコンジュゲートされた抗ウサギ抗体である。タンパク質もまた、放射性元素または酵素で標識することができる。放射活性標識は、現在利用可能な計数手段のいずれかによって検出することができる。アイソトープの非限定的な例には、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、３６Ｃｌ、５１Ｃｒ、５７Ｃｏ、５８Ｃｏ、５９Ｆｅ、９０Ｙ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、および１８６Ｒｅが含まれる。酵素標識も同様に有用であり、現在利用されている比色分析、分光光度法、蛍光分光光度法、電流測定法、またはガス定量法の技術のいずれかによって検出することができる。酵素は、カルボジイミド、ジイソシアネート、グルタルアルデヒドなどのような架橋分子との反応によって、選択した粒子にコンジュゲートされる。当業者に公知の任意の酵素を利用することができる。このような酵素の例には、ペルオキシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、グルコースオキシダーゼおよびペルオキシダーゼ、ならびにアルカリホスファターゼが含まれるがこれらに限定されない。米国特許第３，６５４，０９０号、同第３，８５０，７５２号、および同第４，０１６，０４３号は、代替的な標識の材料および方法のそれらの開示について、一例として参照される。
５．１６ 本発明のバイオマーカーのタンパク質産物を測定するための技術
タンパク質産物
標準的な技術はまた、サンプル中に存在する目的のタンパク質の量を決定するために利用することができる。例えば、標準的な技術は、例えば、イムノアッセイ、例えば、ウェスタンブロット、免疫沈降とそれに続くドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）など、免疫組織化学などを使用して利用することができ、サンプル中に存在する関心対象のタンパク質の量を決定することができる。関心対象のタンパク質を検出するための好ましい薬剤は、関心対象のタンパク質に結合可能である抗体、好ましくは、検出可能な標識を有する抗体である。
このような検出方法のために、分析されるサンプルからのタンパク質は、当業者に周知である技術を使用して容易に単離することができる。タンパク質単離方法は、例えば、HarlowおよびLane（Harlow,E.およびLane,D.，抗体：実験室マニュアル（Antibodies:A Laboratory Manual），Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，ニューヨーク（１９８８））に記載されるものなどであり得る。
目的のタンパク質の検出のために好ましい方法は、タンパク質特異的抗体との相互作用を介するそれらの検出を含む。例えば、目的のタンパク質を指向する抗体は、本明細書に記載されるように利用することができる。抗体は、当業者に周知である標準的な技術を利用して生成することができる。例えば、本願の５．１９．１節、および参照により本明細書に援用される、このような抗体生成技術のより詳細な議論のための米国特許出願第２００４００１８２００号の５．２節を参照のこと。手短に述べると、このような抗体は、ポリクローナル抗体、より好ましくは、モノクローナル抗体であり得る。例えば、インタクトな抗体、または抗原結合フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２）を使用することができる。好ましくは、抗体はヒト抗体またはヒト化抗体である。
例えば、目的のタンパク質に特異的な抗体または抗体のフラグメントは、タンパク質の存在を定量的または定性的に検出するために使用することができる。これは、例えば、免疫蛍光技術によって達成することができる。抗体（またはそのフラグメント）は、加えて、目的のタンパク質のインサイチュ検出のために、免疫蛍光または免疫電子顕微鏡法におけるように、組織学的に利用することができる。インサイチュ検出は、患者から組織学的試料（例えば、生検試料）を取り出すこと、およびタンパク質に指向されるそれに対する標識抗体をその試料に適用することによって達成することができる。抗体（またはフラグメント）は、好ましくは、標識抗体（またはフラグメント）を生物学的サンプルに重層することによって適用される。このような手順の使用を通して、目的のタンパク質の存在だけでなく、サンプル中の細胞（例えば、軟骨細胞およびリンパ球）におけるその分布、その存在もまた決定することが可能である。広範な種々の周知の組織学的方法（染色手順など）は、このようなインサイチュ検出を達成するために利用することができる。
目的のタンパク質についてのイムノアッセイは、典型的には、目的のタンパク質を同定することが可能である検出可能に標識された抗体の生物学的サンプルをインキュベートすること、および当該分野において周知である多数の技術のいずれかによって、結合した抗体を検出することを含む。以下により詳細に議論されるように、「標識された」という用語は、例えば、検出可能な物質を抗体にカップリングする（例えば、物理的に結合する）ことを介する、抗体の直接的な標識をいうことができ、直接的に標識される別の試薬との反応性による抗体の間接的な標識もまたいうことができる。間接的な標識の例には、蛍光標識された二次抗体を使用する一次抗体の検出が含まれる。
例えば、生物学的サンプルは、ニトロセルロースなどの相担体またはキャリア、または細胞、細胞粒子、もしくは可溶性タンパク質を固定化することが可能な他の担体に、接触させ、かつ固定化させることができる。次いで、担体は、適切な緩衝液で洗浄し、続いて、検出可能に標識したフィンガープリント遺伝子特異的抗体を用いる処理を行うことができる。次いで、相担体は、非結合抗体を除去するために緩衝液で２回めの洗浄を行うことができる。次いで、担体上の結合標識の量を、従来の手段によって検出することができる。
「相担体またはキャリア」は、タンパク質性因子の状況において、抗原または抗体を結合することが可能である任意の担体を意図する。周知の担体またはキャリアには、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然および修飾セルロース、ポリアクリルアミド、斑糲岩、およびマグネタイトが含まれる。キャリアの性質は、本発明の目的のために、ある程度可溶性であるか、または不溶性であるかのいずれかであり得る。担体材料は、結合した分子が抗原または抗体に結合可能である限り、実質的に任意の可能な構造配置を有することができる。従って、担体の配置は、ビーズにおけるように球状、または試験管の内部表面もしくはロッドの外部表面におけるように円筒形であり得る。代替的には、表面は、シート、試験ストリップなどのように平面であり得る。好ましい担体にはポリスチレンビーズが含まれる。当業者は、抗体もしく抗原を結合するための多くの他の適切なキャリアを知っており、または日常的な実験の使用によってこれらを確認することができる。
特異的抗体を検出可能に標識することができる１つの方法は、抗体を酵素に連結すること、およびエンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）（Voller,A.，「酵素結合免疫吸着アッセイ（The Enzyme Linked Immunosorbent Assay）（ELISA）」，１９７８，Diagnostic Horizons2：１−７，Microbiological Associates Quarterly Publication，Walkersville，メリーランド）；Voller,A. ら、１９７８，J.Clin.Pathol. ３１：５０７−５２０；Butler,J.E.，１９８１，Meth.Enzymol. ７３：４８２−５２３；Maggio,E.（編），１９８０，エンザイムイムノアッセイ（Enzyme Immunoassay) ，CRC Press，Boca Raton，フロリダ；Ishikawa,E.ら（編），１９８１，エンザイムイムノアッセイ（Enzyme Immunoassay），Kgaku Shoin，東京）における使用による。抗体に結合される酵素は、例えば、分光光度法的、蛍光分析的、または視覚的な手段によって検出することができる化学部分を産生するような様式で、適切な基質、好ましくは、発色性基質と反応する。
抗体を検出可能に標識するために使用することができる酵素には、例えば、以下が含まれるがこれらに限定されない：リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、スタフィロコッカスヌクレアーゼ、Δ−５−ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、α−グリセロリン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼ、およびアセチルコリンエステラーゼ。検出は、酵素についての発色性基質を利用する比色分析法によって達成することができる。検出はまた、同様に調製された標準物質と比較して、基質の酵素反応の程度の視覚的比較によって達成することができる。
検出はまた、種々の他のイムノアッセイのいずれかを使用して達成することができる。例えば、抗体または抗体フラグメントを放射性標識することによって、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）の使用を通して目的のタンパク質を検出することが可能である（例えば、Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，Ｂ．，ラジオイムノアッセイの原理、ラジオイムノアッセイ技術の第７回訓練課程（Principles of Radioimmunoassays,Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniquesを参照のこと、これは、参照により本明細書に援用される）。放射性同位元素（例えば、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓまたは３Ｈ）は、ガンマカウンターもしくはシンチレーションカウンターの使用のような手段によって、またはオートラジオグラフィーによって検出することができる。
蛍光化合物で抗体を標識することもまた可能である。蛍光標識された抗体が適切な波長の光に曝露されるとき、その存在は、蛍光によって検出することができる。最も一般的に使用される蛍光標識化合物には、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルアルデヒド、およびフルオレスカミンである。
抗体はまた、１５２Ｅｕまたはランタニド系列のその他の金属などの蛍光放出金属を使用して検出可能に標識することができる。これらの金属は、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）またはエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）などの金属キレート基を使用して、金属に結合させることができる。
抗体はまた、それを化学発光化合物にカップリングすることによって検出可能に標識することができる。次いで、化学発光タグ化抗体の存在は、化学反応の過程の間に生じる化学発光の存在を検出することによって決定される。特に有用な化学発光標識化合物の例は、ルミノール、イソルミノール、セロマチック（theromatic）アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩およびシュウ酸エステルである。
同様に、生物発光化合物は、本発明の抗体を標識するために使用することができる。生物発光は、触媒性タンパク質が化学発光反応の効率を増加させる、生物学的系において見出される化学発光の型である。生物発光タンパク質の存在は、発光の存在を検出することによって決定される。標識の目的のための重要な生物発光化合物は、ルシフェリン、ルシフェラーゼ、およびエクオリンである。
タンパク質アレイ
本発明のバイオマーカーのタンパク質産物に特異的および／または選択的に結合するポリペプチドは、タンパク質アレイ上に固定化することができる。タンパク質アレイは、例えば、本発明のバイオマーカーのポリペプチドタンパク質産物の存在について、医学的サンプル（膀胱組織および／または血液など）をスクリーニングするために、診断ツールとして使用することができる。タンパク質はまた、抗体ならびに他のリガンド、例えば、本発明のバイオマーカーによってコードされるポリペプチドに結合するリガンドを含むことができる。
ポリペプチドアレイを産生する方法は、例えば、以下に記載されている：De Wildtら、２０００，Nature Biotech.１８：９８９−９９４；Luekingら、１９９９，Anal.Biochem.２７０：１０３−１１１；Ge，２０００，Nuc.Acids Res.２８：ｅ３；MacBeathおよびSchreiber，２０００，Science ２８９：１７６０−１７６３；国際公開番号ＷＯ０１／４０８０３およびＷＯ９９／５１７７３Ａ１；ならびに米国特許第６，４０６，９２１号。アレイのためのポリペプチドは、例えば、市販のロボット装置、例えば、Genetic MicroSystemsおよびAffymetrix（Santa Clara，カリフォルニア、米国）またはBioRobotics（Cambridge，英国）からの装置を使用して、高速でスポットすることができる。アレイ基質は、例えば、ニトロセルロース、プラスチック、ガラス、例えば、表面修飾ガラスであり得る。アレイはまた、多孔質マトリックス、例えば、アクリルアミド、アガロース、または別のポリマーを含むことができる。
例えば、アレイは、例えば、De Wildt、前出に記載されるような抗体のアレイであり得る。ポリペプチドリガンドを産生する細胞は、アレイ形式でフィルター上で増殖させることができる。ポリペプチド産生が誘導され、発現された抗体が細胞の位置においてフィルターに固定化される。アレイの各アドレスにおける結合の程度に関する情報は、例えば、コンピュータデータベースの中に、プロフィールとして保存することができる。
１つの実施形態において、アレイは、本発明のバイオマーカーの１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、またはすべての任意の数またはその任意の組み合わせから構成されるタンパク質産物のアレイである。別の実施形態において、アレイは、表１に列挙されたバイオマーカーの１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、またはすべての任意の数またはその任意の組み合わせから本質的に構成されるタンパク質産物のアレイである。別の実施形態において、アレイは、表３に記述されるものを含む、表１に列挙されるバイオマーカーの１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、またはすべての任意の数またはその任意の組み合わせ、および表２からの１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個までの任意の数から本質的に構成されるタンパク質産物のアレイであり、ここで、当該組み合わせの少なくとも１つのバイオマーカーは表１から選択される。別の実施形態において、アレイは、表４に列挙されるバイオマーカーの１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、またはすべての任意の数またはその任意の組み合わせから本質的に構成されるタンパク質産物のアレイである。別の実施形態において、アレイは、表６に記述されるものを含む、表４に列挙されるバイオマーカーの１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、またはすべての任意の数またはその任意の組み合わせ、および表５からの１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個までの任意の数から本質的に構成されるタンパク質産物のアレイであり、ここで、当該組み合わせの少なくとも１つのバイオマーカーは表４から選択される。別の実施形態において、アレイは、表７に列挙されるバイオマーカーの１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、またはすべての任意の数またはその任意の組み合わせから本質的に構成されるタンパク質産物のアレイである。
１つの態様において、本発明は、本発明のバイオマーカーのタンパク質産物に選択的に結合するアレイに結合される、抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。
５．１７ タンパク質産生
標準的な組み換え核酸法は、本発明のポリペプチドまたは抗体（例えば、本発明のバイオマーカーのタンパク質産物）を発現するために使用することができる。一般的に、ポリペプチドをコードする核酸配列は、核酸発現ベクターにクローニングされる。当然、タンパク質が複数のポリペプチド鎖を含む場合、各鎖は、発現ベクター、例えば、同じかまたは異なる細胞で発現される、同じかまたは異なるベクターにクローニングされなくてはならない。タンパク質が十分に小さい、すなわち、タンパク質が、５０アミノ酸未満のペプチドである場合、このタンパク質は、自動化有機合成方法を使用して合成することができる。本発明のバイオマーカーの５’領域、３’領域、または内部コード領域を含むポリペプチドは、本発明のバイオマーカーの５’領域、３’領域、または内部コード領域に対応するヌクレオチド配列のみを含む核酸発現ベクターから発現される。本発明のバイオマーカーのタンパク質産物、または本発明のバイオマーカーの５’領域、３’領域、もしくは内部コード領域によってコードされるポリペプチドに指向される抗体を産生するための方法。
ポリペプチドを発現するための発現ベクターは、ポリペプチドまたはそのフラグメントをコードするセグメントに加えて、目的の核酸に操作可能に連結された、例えば、プロモーターを含む調節配列を含むことができる。多数の適切なベクターおよびプロモーターが当業者に公知であり、本発明の組み換え構築物を生成するために市販されている。以下のベクターが例として提供される：細菌：ｐＢｓ、phagescript、ＰｓｉＸ１７４、pBluescript ＳＫ、ｐＢｓ ＫＳ、ｐＮＨ８ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８ａ、ｐＮＨ４６ａ（Stratagene，La Jolla，カリフォルニア、米国）；ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、およびｐＲＩＴ５（Pharmacia，Uppsala，スウェーデン）。真核生物：ｐＷＬｎｅｏ、ｐＳＶ２ｃａｔ、ｐＯＧ４４、ＰＸＴＩ、ｐＳＧ（Stratagene）ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、およびｐＳＶＬ（Pharmacia）。好ましいライブラリーの１つの好ましいクラスは、以下に説明されるファージライブラリーである。
当業者に周知である方法は、本発明のポリヌクレオチドおよび適切な転写／翻訳制御シグナルを含むベクターを構築するために使用することができる。これらの方法には、インビトロ組み換えＤＮＡ技術、合成技術、およびインビボ組み換え／遺伝子組み換えが含まれる。例えば、Sambrook & Russell，分子クローニング：実験室マニュアル、第３版（Molecular Cloning,A Laboratory Manual）第３版、Cold Spring Harbor Laboratory，ニューヨーク州（２００１）およびAusubelら、分子生物学の現在のプロトコール（Current Protocols in Molecular Biology）Greene Publishing Associates and Wiley Interscience，ニューヨーク州（１９８９）に記載される技術を参照のこと。プロモーター領域は、ＣＡＴ（クロラムフェニコールトランスフェラーゼ）ベクターまたは選択マーカーを有する他のベクターを使用して、任意の所望の遺伝子から選択することができる。２つの適切なベクターはｐＫＫ２３２−８およびｐＣＭ７である。特に指定される細菌プロモーターには、ｌａｃＩ、ｌａｃＺ、Ｔ３、Ｔ７、ｇｐｔ、lambda P、およびｔｒｃが含まれる。真核生物プロモーターには、ＣＭＶ最早期プロモーター、ＨＳＶチミジンキナーゼプロモーター、早期および後期ＳＶ４０、レトロウイルスからのＬＴＲプロモーター、マウスメタロチオネイン−Ｉプロモーター、および種々の当該分野で公知の組織特異的プロモーターが含まれる。特定の実施形態において、プロモーターは誘導可能なプロモーターである。別の実施形態において、プロモーターは構成的プロモーターである。さらに別の実施形態において、プロモーターは組織特異的プロモーターである。
一般的に、組み換え発現ベクターは、複製起点および宿主細胞の形質転換を可能にする選択マーカー、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのアンピシリン耐性遺伝子およびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの栄養要求性マーカー（ＵＲＡ３遺伝子、ＬＥＵ２遺伝子、ＨＩＳ３遺伝子、およびＴＲＰｌ遺伝子など）、ならびに下流の構造的配列の転写を方向付ける高度に発現される遺伝子に由来するプロモーターを含む。このようなプロモーターは、とりわけ、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）などの糖分解酵素、ａ−因子、酸性ホスファターゼ、または熱ショックタンパク質をコードするオペロンに由来し得る。本発明のポリヌクレオチドは、翻訳開始配列および終結配列、および好ましくは、細胞膜周辺腔または細胞外培地への翻訳されたタンパク質の分泌を方向付け可能なリーダー配列と、適切な段階でアセンブルされる。任意に、本発明の核酸は、所望の特性、例えば、発現された組み換え産物の安定化または簡単な精製を付与するＮ末端同定ペプチド（Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｐｅｐｔｉｄｅ）を含む融合タンパク質をコードすることができる。細菌のための有用な発現ベクターは、任意に、機能的プロモーターとともに操作可能な読み枠において、適切な翻訳開始シグナルおよび終結のシグナルと一緒に本発明のポリヌクレオチドを挿入することによって構築される。ベクターは、ベクターの維持を確実にするため、および所望される場合、宿主中での増幅を提供するために、１つ以上の表現型選択マーカーおよび複製起点を含む。形質転換のための適切な真核生物宿主には、E.coli、Bacillus subtilis、Salmonella typhimurium、およびPseudomonas属、Streptomyces属、およびStaphylococcus属の中の種々の種が含まれるが、その他もまた、選択の問題として利用されてもよい。
代表的であるが非限定的な例として、細菌のための有用な発現ベクターは、周知のクローニングベクターｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ ３７０１７）の遺伝因子を含む市販のプラスミドに由来する、選択マーカーおよび細菌の複製起点を含むことができる。このような市販のベクターには、例えば、ｐＫＫ２２３−３（Pharmacia Fine Chemicals,Uppsala，スウェーデン）およびｐＧＥＭ１（Promega, Madison，ウィスコンシン、米国）が含まれる。
本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含むように遺伝子操作された宿主細胞を提供する。例えば、このような宿主細胞は、公知の形質転換、トランスフェクション、または感染の方法を使用して宿主細胞に導入された本発明の核酸を含むことができる。本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを発現するように遺伝子操作された宿主細胞を提供し、ここで、このようなポリヌクレオチドは、細胞中でポリヌクレオチドの発現を駆動する、宿主細胞に対して異種である調節配列と操作可能に結合されている。
本発明はさらに、本発明のベクターを含む宿主細胞を提供し、ここで、核酸は、公知の形質転換、トランスフェクション、または感染の方法を使用して宿主細胞に導入されている。宿主細胞は、哺乳動物細胞などの真核生物宿主細胞、酵母細胞などの下等真核生物宿主細胞であり得、または宿主細胞は、細菌細胞などの原核生物細胞であり得る。宿主細胞への組み換え構築物の導入は、例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ、デキストラン媒介トランスフェクション、またはエレクトロポレーションによってもたらすことができる（Davis,L.ら、分子生物学の基本的方法（Basic Methods in Molecular Biology）（１９８６））。無細胞翻訳系もまた、本発明のＤＮＡ構築物に由来するＲＮＡを使用してこのようなタンパク質を産生するために利用することができる。
任意の宿主／ベクター系を、表２に列挙される遺伝子またはスプライシング変異体の１つ以上を発現するために使用することができる。原核生物または真核生物の宿主を用いる使用のための適切なクローニングベクターおよび発現ベクターは、分子クローニング：実験室マニュアル（Molecular Cloning,A Laboratory Manual）第２版、Cold Spring Harbor，ニューヨーク（１９８９）によって記載され、この開示は参照によりその全体が本明細書に援用される。最も好ましい宿主細胞は、通常は特定のポリペプチドを発現しないもの、または低い自然レベルでそのポリペプチドを発現するものである。
特定の実施形態において、宿主細胞は、誘導可能な調節エレメントの制御下で本明細書のポリヌクレオチドを含む内因性遺伝子を発現するように操作されており、この場合において、内因性遺伝子の調節配列は、相同組み換えによって置き換えられてもよい。本明細書に記載されるように、遺伝子ターゲッティングは、異なる遺伝子から単離された調節配列、または遺伝子操作法によって合成された新規な調節配列で、遺伝子の既存の調節領域を置き換えるためにために使用してもよい。このような調節配列は、プロモーター、エンハンサー、骨格結合領域（scaffold-attachment regions）、ネガティブ調節エレメント、転写開始部位、調節タンパク質結合部位、または当該配列の組み合わせから構成されてもよい。代替的には、産生されるＲＮＡまたはタンパク質の構造または安定性に影響を与える配列は、置換、除去、付加、またそうでない場合はターゲッティングによって修飾されてもよく、これには、ポリアデニル化シグナル、ｍＲＮＡ安定性エレメント、スプライシング部位、タンパク質の輸送もしくは分泌特性を増強もしくは修飾するためのリーダー配列、またはタンパク質分子もしくはＲＮＡ分子の機能もしくは安定性を変化もしくは改善する他の配列が含まれる。
本発明の宿主はまた、酵母または他の真菌であってもよい。酵母において、構成的プロモーターまたは誘導可能なプロモーターを含む多数のベクターが使用されてもよい。書評としては以下を参照のこと：Ausubelら（編）、分子生物学の現在のプロトコール（Current Protocols in Molecular Biology），２巻，Greene Publish.Assoc. & Wiley Interscience，１３章（１９８８）；Grantら、１９８７，「酵母のための発現ベクターおよび分泌ベクター（Expression and Secretion Vectors for Yeast）」，Methods Enzymol.１５３：５１６−５４４；Glover，ＤＮＡクローニング（DNA Cloning），ＩＩ巻，IRL Press，Wash.,D.C.，３章（１９８６）；Bitter，１９８７，「酵母における異種遺伝子発現（Heterologous Gene Expression in Yeast）」，Methods Enzymol. １５２：６７３−６８４；およびStrathernら（編），酵母サッカロミセスの分子生物学（The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces），Cold Spring Harbor Press，Ｉ巻およびＩＩ巻（１９８２）。
適切なものとなり得る酵母株には、Saccharomyces cerevisiae、Schizosaccharomyces pombe、Kluyveromyces株、Candida、または異種タンパク質を発現することが可能な任意の酵母株が含まれる。適切なものとなり得る細菌株には、Escherichia coli，Serratia marescansなどの腸内細菌科、Bacillus subtilisなどの桿菌、Salmonella typhimurium、シュードモナスまたは異種タンパク質を発現することが可能な任意の細菌株が含まれる。タンパク質が酵母または細菌の中で作られる場合、機能的タンパク質を得るために、例えば、適切な部位のリン酸化またはグリコシル化によって、そこで産生されたタンパク質を修飾することが必要な場合がある。このような共有結合は、公知の化学的または酵素的な方法を使用して達成されてもよい。
種々の哺乳動物細胞培養系もまた、組み換えタンパク質を発現するために利用することができる。哺乳動物発現系の例には以下が含まれる：Gluzman，１９８１，Cell ２３：１７５（１９８１）によって記載されたサル腎臓線維芽細胞のＣＯＳ−７株などのサルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト腎臓２９３細胞、ヒト上皮Ａ４３１細胞、ヒトＣｏｌｏ２０５細胞、３Ｔ３細胞、ＣＶ−１細胞、正常２倍体細胞、一次組織のインビトロ培養に由来する細胞株、一次外植片、ＨｅＬａ細胞、マウスＬ細胞、ＢＨＫ、ＨＬ−６０、Ｕ９３７、ＨａＫ、Ｃ１２７、３Ｔ３、またはジャーカット細胞、および適合可能なベクターを発現可能な他の細胞株。哺乳動物発現ベクターは、複製起点、適切なプロモーター、ならびにまた、任意の必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライシングドナーおよびアクセプターの部位、転写終結配列、および５’隣接非転写配列を含む。
タンパク質の発現において利用される微生物細胞は、凍結−融解サイクリング、超音波処理、機械的破壊、または細胞溶解剤の使用を含む、任意の便利な方法によって破壊することができる。細菌培養において産生される組み換えポリペプチドは、通常、細胞ペレットからの初回抽出、続いて塩析、水性イオン交換、またはサイズ排除クロマトグラフィーの工程の１つ以上によって単離される。ある実施形態において、テンプレート核酸はまた、ポリペプチドタグ、例えば、ペンタ−またはヘキサ−ヒスチジンをコードする。
組み換えタンパク質は、当該分野で周知の技術を使用して単離することができる。例えば、Ｓｃｏｐｅｓ（タンパク質精製：原理および実践（Protein Purification:Principles and Practice），Springer-Verlag，ニューヨーク（１９９４））は、組み換えタンパク質（および非組み換えタンパク質）を精製するための多数の一般的方法を提供する。これらの方法には、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、選択的沈殿、透析、および疎水性相互作用クロマトグラフィーが含まれる。
本明細書に記載されるもののバリエーション、改変、および他の実行は、本発明の技術思想および範囲から逸脱することなく、当業者によって行われる。
本明細書に記載される本発明がより完全に理解され得るために、以下の実施例が示される。本実施例は、例示的なものにすぎず、いかなる方法においても本発明を限定するものとして解釈されないことが理解されるべきである。
５．１８ 膀胱癌またはその症状の予防、治療、管理、または改善における使用のための化合物を同定するための方法
５．１８．１ バイオマーカーの発現または活性を調節する化合物を同定するための方法
本発明は、本発明のバイオマーカーの産物に結合する化合物を同定する方法を提供する。本発明はまた、本発明のバイオマーカーの産物の発現および／または活性を調節する化合物を同定するための方法を提供する。このような方法を介して同定された化合物は、膀胱癌を研究するための１つ以上の動物モデルの開発のために有用である。さらに、このような方法を介して同定された化合物は、変形性関節症またはその症状の予防、治療、管理、および／または改善のための予防用組成物および治療用組成物の開発におけるリード化合物として有用である。このような方法は、インビボで予防剤および治療剤となり得る物質を試験する際に含まれる労力および莫大な費用が、本明細書に記載されるインビトロおよびエキソビボの方法を介して同定されたこれらの化合物に効率的に集中するという点で特に有用である。
本発明は、膀胱癌またはその症状を予防、治療、管理、または改善する能力について試験される化合物を同定するための方法を提供し、上記方法は、（ａ）本発明のバイオマーカーの１種以上のタンパク質産物もしくはそのフラグメント、または本発明のバイオマーカーの１つ以上のＲＮＡ産物もしくはそのフラグメントを発現する細胞を、試験化合物と接触させる工程；および（ｂ）タンパク質産物、タンパク質フラグメント、ＲＮＡ産物、またはＲＮＡ部分に結合する試験化合物の能力を決定し、その結果、化合物がタンパク質産物、タンパク質フラグメント、ＲＮＡ産物、ＲＮＡ部分に結合する場合に、膀胱癌またはその症状を予防、治療、管理、または改善する能力について試験される化合物が同定される工程を包含する。細胞は、例えば、酵母細胞または哺乳動物起源の細胞であり得る。タンパク質産物、タンパク質フラグメント、ＲＮＡ産物、またはＲＮＡ部分に結合する試験化合物の能力を決定する工程は、例えば、試験化合物を放射性同位元素または酵素標識とカップリングすることによって達成することができ、その結果、タンパク質産物、タンパク質フラグメント、ＲＮＡ産物、またはＲＮＡ部分への試験化合物の結合は、複合体中の標識化合物を検出することによって決定することができる。例えば、試験化合物は、直接的または間接的のいずれかで、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、または３Ｈで標識され、放射性同位元素は、放射能の放出の直接的計数によって、またはシンチレーション計数によって検出することができる。代替的には、試験化合物は、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、またはルシフェラーゼで酵素により標識され、そして酵素標識は、適切な基質の生成物への転換の測定によって検出することができる。特定の実施形態において、アッセイは、本発明の１種以上のバイオマーカーのタンパク質産物もしくはそのフラグメント、または本発明のバイオマーカーの１つ以上のＲＮＡ産物もしくはそのフラグメントを発現する細胞を、タンパク質産物、タンパク質フラグメント、ＲＮＡ産物、またはＲＮＡ部分に結合する公知の化合物と接触させて、アッセイ混合液を形成する工程、アッセイ混合液を試験化合物と接触させる工程、およびタンパク質産物、タンパク質フラグメント、ＲＮＡ産物、またはＲＮＡ部分と相互作用する試験化合物の能力を決定する工程を包含し、ここで、タンパク質産物、タンパク質フラグメント、ＲＮＡ産物、またはＲＮＡ部分と相互作用する試験化合物の能力を決定する工程は、公知の化合物と比較して、タンパク質産物、タンパク質フラグメント、ＲＮＡ産物、またはＲＮＡ部分に優先的に結合する試験化合物の能力を決定することを含む。
本発明は、膀胱癌またはその症状を予防、治療、管理、または改善する能力について試験される化合物を同定するための方法を提供し、当該方法は、（ａ）本発明の１種以上のバイオマーカーのタンパク質産物もしくはそのフラグメント、または本発明の１種以上のバイオマーカーのＲＮＡ産物もしくはその部分を、試験化合物と接触させる工程；および（ｂ）タンパク質産物、タンパク質フラグメント、ＲＮＡ産物、またはＲＮＡ部分に結合する試験化合物の能力を決定し、その結果、化合物がタンパク質産物、タンパク質フラグメント、ＲＮＡ産物、ＲＮＡ部分に結合する場合に、膀胱癌またはその症状を予防、治療、管理、または改善する能力について試験される化合物が同定される工程を包含する。タンパク質産物またはタンパク質フラグメントへの試験化合物の結合は、直接的または間接的のいずれかで決定することができる。特定の実施形態において、アッセイは、本発明の１種以上のバイオマーカーのタンパク質産物もしくはそのフラグメント、または本発明の１種以上のバイオマーカーのＲＮＡ産物もしくはその部分を、タンパク質産物、タンパク質フラグメント、ＲＮＡ産物、またはＲＮＡ部分に結合する公知の化合物と接触させて、アッセイ混合液を形成する工程、アッセイ混合液を試験化合物と接触させる工程、およびタンパク質産物、タンパク質フラグメント、ＲＮＡ産物、またはＲＮＡ部分と相互作用する試験化合物の能力を決定する工程を包含し、ここで、タンパク質産物、タンパク質フラグメント、ＲＮＡ産物、またはＲＮＡ部分と相互作用する試験化合物の能力を決定する工程は、公知の化合物と比較して、タンパク質産物、タンパク質フラグメント、ＲＮＡ産物、またはＲＮＡ部分に優先的に結合する試験化合物の能力を決定することを含む。当該分野で周知の技術を、試験化合物と、本発明のバイオマーカーのタンパク質産物もしくはそのフラグメント、または本発明のバイオマーカーのＲＮＡ産物もしくはその部分との間の結合を決定するために使用することができる。
本発明の上記のアッセイ方法のある実施形態において、本発明のバイオマーカーのＲＮＡ産物もしくはその部分の非複合体化型、標的分子、またはその両方からの複合体化型の分離を容易にするために、ならびにアッセイの自動化を適合させるために、本発明のバイオマーカーのＲＮＡ産物もしくはその部分またはその標的分子を固定化することが所望されてもよい。本発明の上記のアッセイ方法の１つより多くの実施形態において、タンパク質の一方または両方の非複合体型からの複合体化型の分離を容易にするために、ならびにアッセイの自動化を適合させるために、本発明のバイオマーカーのタンパク質産物もしくはそのフラグメントまたはその標的分子のいずれかを固定化することが所望されてもよい。本発明のバイオマーカーのタンパク質産物またはそのフラグメントへの試験化合物の結合は、反応物質を含むために適切な任意の容器中で達成することができる。このような容器の例には、マイクロタイタープレート、試験管、および微量遠心管が含まれる。１つの実施形態において、タンパク質の一方または両方がマトリックスに結合することを可能にするドメインを加える融合タンパク質を提供することができる。例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合タンパク質は、グルタチオンセファロースビーズ（Sigma Chemical;St.Louis，ミズーリ）またはグルタチオン誘導体化マイクロタイタープレートに吸着させることができ、次いでこれらは、試験化合物、または試験化合物および非吸着標的タンパク質もしくは本発明のバイオマーカーのタンパク質産物もしくはそのフラグメントと合わされ、この混合物は、複合体形成に貢献する条件下で（例えば、塩およびｐＨについて生理学的条件下で）インキュベートされる。インキュベート後、ビーズまたはマイクロタイタープレートを洗浄して、あらゆる未結合成分を除去し、複合体形成は、例えば、上記のように、直接的または間接的のいずれかで測定される。代替的には、複合体は、マトリックスから解離させることができ、本発明のバイオマーカーのタンパク質産物またはそのフラグメントの結合のレベルは、標準的な技術を使用して決定することができる。
マトリックス上にタンパク質を固定化するための他の技術はまた、本発明のスクリーニングアッセイにおいて使用することができる。例えば、本発明のバイオマーカーのタンパク質産物もしくはそのフラグメント、または標的分子のいずれかを、ビオチンおよびストレプトアビジンのコンジュゲートを利用して固定化させることができる。ビオチン化された、本発明のバイオマーカーのタンパク質産物または標的分子は、当該分野において周知の方法（例えば、ビオチン化キット（biotinylation kit）、Pierce Chemicals;Rockford，イリノイ）を使用してビオチン−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド）から調製され、そしてストレプトアビジンコートされた９６ウェルプレート（Pierce Chemical）のウェルに固定化することができる。代替的には、本発明のバイオマーカーのタンパク質産物またはそのフラグメントと反応性である抗体をプレートのウェルに誘導体化し、そしてタンパク質を、抗体のコンジュゲートによってウェル中でトラップすることができる。このような複合体を検出するための方法には、ＧＳＴ−固定化複合体について上記に記載したものに加えて、本発明のバイオマーカーのタンパク質産物と反応性である抗体を使用する複合体の免疫検出、ならびに本発明のバイオマーカーのタンパク質産物もしくはそのフラグメント、または標的分子と関連する酵素活性を検出することに依存する酵素結合アッセイが含まれる。
試験化合物に対する、本発明のバイオマーカーのタンパク質産物またはそのフラグメントの相互作用または結合もまた、ツーハイブリッドアッセイまたはスリーハイブリッドアッセイにおける「おとりタンパク質（bait protein）」としてこのようなタンパク質またはタンパク質フラグメントを使用して決定することができる（例えば、米国特許第５，２８３，３１７号；Zervosら（１９９３）Cell ７２：２２３−２３２；Maduraら（１９９３）J.Biol.Chem. ２６８：１２０４６−１２０５４；Bartelら（１９９３）Bio/Techniques １４：９２０−９２４；Iwabuchiら（１９９３）Oncogene ８：１６９３−１６９６；および国際公開番号ＷＯ９４／１０３００を参照のこと）。
本発明は、変形性関節症またはその症状を予防、治療、管理、または改善する能力について試験される化合物を同定するための方法を提供し、当該方法は、（ａ）本発明の１種以上のバイオマーカーのタンパク質産物またはＲＮＡ産物を発現する細胞を試験化合物と接触させる工程；（ｂ）インキュベーション時間の後、（ａ）に存在するタンパク質産物またはＲＮＡ産物の量を決定する工程；および（ｃ）（ａ）における量を、試験化合物と接触させていない対応する対照細胞中に存在する量と比較し、その結果、タンパク質産物またはＲＮＡ産物の量が、対照中の量と比較して変化している場合、変形性関節症またはその症状を予防、治療、管理、または改善する能力について試験される化合物が同定される工程を包含する。特定の実施形態において、発現レベルは、本明細書に記載されるアッセイ（例えば、マイクロアレイまたはＲＴ−ＰＣＲ）または当業者に周知のアッセイを利用することによって決定されるように、対照における発現レベルと比較して、５％、１０％、１５％、２５％、３０％、４０％、５０％、５〜２５％、１０〜３０％、少なくとも１倍、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、４倍、５倍、１０倍、２５倍、１〜１０倍、または５〜２５倍変化する。代替的な実施形態において、このような方法は、細胞中に存在する、表１に列挙されるような本発明のバイオマーカー（表３に記される特異的な産物を含む）、または表２に列挙されるバイオマーカーの産物の任意の１つ以上と組み合わせた表１に列挙されるような本発明のバイオマーカー（表３に記される特異的な産物を含む）の、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１２個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、少なくとも３５個、少なくとも４０個、少なくとも４５個、少なくとも５０個、１〜５個、１〜１０個、５〜１０個、５〜２５個、または１０〜４０個、すべて、またはその任意の組み合わせのいずれかのタンパク質産物またはＲＮＡ産物の量を決定する工程、およびこれらの量を対照中に存在する量と比較する工程を包含する。
さらに別の代替的な実施形態において、このような方法は、細胞中に存在する、表４に列挙されるような本発明のバイオマーカー（表６に記される特異的な産物を含む）、または表５に列挙されるバイオマーカーの産物の任意の１つ以上と組み合わせた表４に列挙されるような本発明のバイオマーカー（表６に記される特異的な産物を含む）の、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１２個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、少なくとも３５個、少なくとも４０個、少なくとも４５個、少なくとも５０個、１〜５個、１〜１０個、５〜１０個、５〜２５個、または１０〜４０個、すべて、またはその任意の組み合わせのいずれかのタンパク質産物またはＲＮＡ産物の量を決定する工程、およびこれらの量を対照中に存在する量と比較する工程を包含する。
本発明に記載される細胞ベースのアッセイにおいて利用される細胞は、当該分野において公知である技術を利用して、本発明のバイオマーカーを発現するように操作することができる。例えば、参照により本明細書に援用される、「組み換え発現ベクターおよび宿主細胞（Recombinant Expression Vectors and Host Cells）」という表題の米国特許第６，２４５，５２７号のＩＩＩ節を参照のこと。代替的には、本発明のバイオマーカーを内因的に発現する細胞を使用することができる。例えば、不死化膀胱組織細胞が使用されてもよい。
特定の実施形態において、軟骨細胞は、「正常」個体、または膀胱癌および／もしくは早期の膀胱癌を有する個体から単離され、そして種々の長さの時間（すなわち、３０分間、１時間、５時間、２４時間、４８時間および９６時間）、試験化合物の存在下および非存在下でインキュベートされる。予防薬剤または治療薬剤についてスクリーニングする場合、本発明のバイオマーカーの全長配列のクローン、またはその機能的部分は、不死化膀胱組織細胞をトランスフェクトするために使用される。トランスフェクトされた細胞は、種々の長さの時間（すなわち、１、２、３、５、７、１０、または１４日間）、試験化合物の存在下または非存在下で培養される。インキュベーション後、標的核酸サンプルが細胞から調製され、そして正常由来の細胞、膀胱癌由来の細胞または早期の膀胱癌由来の細胞においてディファレンシャルに発現される核酸配列に対応する核酸プローブにハイブリダイズされる。核酸プローブは、例えば、当該分野で周知でありかつ本明細書に記載される方法に従って、放射活性標識で標識される。ハイブリダイゼーションは、例えば、Ausubelら、前出またはSambrookら、前出において記載されるように、ノーザンブロットによって実行される。膀胱癌または早期の膀胱癌のいずれか１つからのＲＮＡと比較して、正常からのアレイ上のサンプルに対する、標的の、本明細書に定義したようなディファレンシャルなハイブリダイゼーションは、ディファレンシャルに発現された細胞特異的核酸配列に対応するＲＮＡの発現レベルを示す。試験化合物の存在下におけるインキュベーション工程の結果としての標的配列の発現レベルの変化は、対応する軟骨細胞特異的核酸配列の発現を増加または減少する化合物を示す。
本発明はまた、膀胱癌またはその症状を予防、治療、管理、または改善する能力について試験される化合物を同定するための方法を提供し、当該方法は、（ａ）無細胞抽出物を、本発明の１種以上のバイオマーカーのタンパク質産物またはＲＮＡ産物をコードする核酸配列、および試験化合物と接触させる工程；（ｂ）（ａ）に存在するタンパク質産物またはＲＮＡ産物の量を決定する工程；ならびに（ｃ）（ａ）における量を、試験化合物と接触させていない対応する対照と比較し、その結果、タンパク質産物またはＲＮＡ産物の量が、対照中の量と比較して変化している場合、膀胱癌またはその症状を予防、治療、管理、または改善する能力について試験される化合物が同定される工程を包含する。特定の実施形態において、発現レベルは、本明細書に記載されるアッセイ（例えば、マイクロアレイまたはＲＴ−ＰＣＲ）または当業者に周知のアッセイを利用することによって決定されるように、対照サンプルにおける発現レベルと比較して、５％、１０％、１５％、２５％、３０％、４０％、５０％、５〜２５％、１０〜３０％、少なくとも１倍、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、４倍、５倍、１０倍、２５倍、１〜１０倍、または５〜２５倍変化する。代替的な実施形態において、このような方法は、抽出物中に存在する本発明のバイオマーカーの、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１２個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、少なくとも３５個、少なくとも４０個、少なくとも４５個、少なくとも５０個、１〜５個、１〜１０個、５〜１０個、５〜２５個、または１０〜４０個、すべて、またはその任意の組み合わせのタンパク質産物またはＲＮＡ産物の量を決定する工程、およびこれらの量を対照中に存在する量と比較する工程を包含する。
特定の実施形態において、本発明のバイオマーカーのＲＮＡ産物の量が決定され、別の実施形態において、本発明のバイオマーカーのタンパク質産物の量が決定されるのに対して、さらに別の実施形態において、本発明のバイオマーカーのＲＮＡ産物およびタンパク質産物の量が決定される。本発明のバイオマーカーのＲＮＡ産物またはタンパク質産物の量を決定するために、標準的な方法および組成物を利用することができる。このような方法および組成物は、上記に詳細に記載されている。
特定の実施形態において、本明細書に記載されるスクリーニングアッセイにおいて、本発明のバイオマーカーのタンパク質産物またはＲＮＡ産物の量はキットを利用して決定される。このようなキットは、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、少なくとも３５個、少なくとも４０個、少なくとも４５個、少なくとも５０個、すべて、またはその任意の組み合わせの本発明のバイオマーカーの、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、少なくとも３５個、少なくとも４０個、少なくとも４５個、少なくとも５０個、またはそれ以上までの任意の数のタンパク質産物またはＲＮＡ産物の発現を測定するために必要とされる材料および試薬を含む。特定の実施形態において、このキットはさらに、種々の方法において利用される、以下のような１種以上のさらなる試薬を含んでもよい：（１）血液または組織からＲＮＡを精製するための試薬；（２）試験核酸を生成するためのプライマー；（３）任意に１種以上の一意に標識されたｄＮＴＰおよび／またはｒＮＴＰ（例えば、ビオチン化またはＣｙ３もしくはＣｙ５タグ化ｄＮＴＰ）を伴うｄＮＴＰおよび／またはｒＮＴＰ；（４）合成後標識試薬、例えば、蛍光色素の化学的に活性な誘導体；（５）酵素、例えば、逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼなど；（６）種々の緩衝媒体、例えば、ハイブリダイゼーション緩衝液および洗浄緩衝液；（７）スピンカラムなどのような標識プローブ精製試薬および成分；ならびに（８）タンパク質精製試薬；（９）シグナル生成および検出試薬、例えば、ストレプトアビジン−アルカリホスファターゼコンジュゲート、化学蛍光基質または化学発光基質など。特定の実施形態において、キットは、対照としての使用のための前標識され品質管理されたタンパク質およびまたはＲＮＡ転写物（好ましくは、ｍＲＮＡ）を含む。
ある実施形態において、キットはｑＲＴ−ＰＣＲキットである。別の実施形態において、キットは、核酸アレイおよびタンパク質アレイである。本発明に従うこのようなキットは、そのため、本発明の関連するタンパク質メンバーまたは核酸メンバーを有するアレイ、およびパッケージング手段を少なくとも含む。代替的には、本発明のタンパク質メンバーまたは核酸メンバーはアレイにあらかじめパッケージされてもよい。
特定の実施形態において、本発明のバイオマーカーのＲＮＡ産物を測定するためのキットは、ＲＮＡ産物の発現を測定するために必要な材料および試薬を含む。例えば、マイクロアレイまたはＲＴ−ＰＣＲキットが使用されてもよく、これは、本発明のバイオマーカーの少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、少なくとも３５個、少なくとも４０個、少なくとも４５個、少なくとも５０個、またはすべての任意の数、またはその任意の組み合わせのＲＮＡ産物のレベルを測定するために必要な試薬および材料のみを含む。代替的には、ある実施形態において、キットは、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、またはすべての本発明のバイオマーカーの任意の数、またはその任意の組み合わせのＲＮＡ産物のレベルを測定するために必要なものに限定されない試薬および材料を含むことができる。例えば、マイクロアレイキットは、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、少なくとも３５個、少なくとも４０個、少なくとも４５個、少なくとも５０個、またはそれ以上までの任意の数の本発明のバイオマーカー以外の遺伝子のＲＮＡ産物のレベルを測定するために必要な試薬および材料に加えて、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、またはすべての本発明のバイオマーカーの任意の数、またはその任意の組み合わせのＲＮＡ産物のレベルを測定するために必要な試薬および材料を含んでもよい。特定の実施形態において、マイクロアレイまたはＲＴ−ＰＣＲキットは、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、少なくとも３５個、少なくとも４０個、少なくとも４５個、少なくとも５０個までの任意の数、もしくは任意の組み合わせの本発明のバイオマーカーのＲＮＡ産物のレベル、ならびに１個、２個、３個、４個、５個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、５５個、６０個、６５個、７０個、７５個、８０個、８５個、９０個、９５個、１００個、１２５個、１５０個、１７５個、２００個、２２５個、２５０個、３００個、３５０個、４００個、４５０個、５００個、１０００個、５０００個、１５，０００個、２０，０００個もしくはそれ以上までの任意の数の本発明のバイオマーカー以外の遺伝子、または１〜１０個、１〜１００個、１〜１５０個、１〜２００個、１〜３００個、１〜４００個、１〜５００個、１〜１０００個、２５〜１００個、２５〜２００個、２５〜３００個、２５〜４００個、２５〜５００個、２５〜１０００個、１００〜１５０個、１００〜２００個、１００〜３００個、１００〜４００個、１００〜５００個、１００〜１０００個または５００〜１０００個、１０００〜５０００個、５０００〜１０，０００個、１０，０００〜２０，０００個もしくはそれ以上の任意の数の本発明のバイオマーカー以外の遺伝子のＲＮＡ産物のレベルを測定するために必要な試薬および材料を含む。
核酸マイクロアレイキットについては、このキットは、一般的に、担体表面に結合されたプローブを含む。プローブは、検出可能な標識で標識されてもよい。特定の実施形態において、プローブは、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、またはすべての任意の数の本発明のバイオマーカー、またはその任意の組み合わせの、５’領域、３’領域、内部コーディング領域、エクソン、イントロン、エクソンジャンクション、またはエクソン−イントロンジャンクションに特異的である。マイクロアレイキットは、アッセイならびにアッセイの実施から得られるデータを解釈および分析するための方法を実施するための説明書を含んでもよい。キットはまた、ハイブリダイゼーション試薬、および／またはプローブが標的核酸配列にハイブリダイズするときに産生されるシグナルを検出するために必要な試薬を含んでもよい。一般的に、マイクロアレイキットのための材料および試薬は、１つ以上の容器の中にある。キットの各成分は、一般的に、それ自体が適切な容器の中にある。
ＲＴ−ＰＣＲおよび／またはｑＲＴ−ＰＣＲキットについては、このキットは、一般的に、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、またはすべての任意の数の本発明のバイオマーカー、またはその任意の組み合わせの特定のＲＮＡ産物（エクソン、イントロン、エクソンジャンクション、およびエクソン−イントロンジャンクション）に特異的である、あらかじめ選択されたプライマーを含む。ＲＴ−ＰＣＲキットはまた、核酸を逆転写および／または増幅するために適切である酵素（例えば、Ｔａｑなどのポリメラーゼ）、ならびに逆転写および増幅のための反応混合液のために必要であるデオキシヌクレオチドおよび緩衝液を含んでもよい。ＲＴ−ＰＣＲおよび／またはｑＲＴ−ＰＣＲキットはまた、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、またはすべての任意の数の本発明のバイオマーカー、またはその任意の組み合わせに特異的なプローブを含んでもよい。このプローブは、検出可能な標識（例えば、蛍光標識）で標識されてもよく、標識されなくてもよい。ＲＴ−ＰＣＲキットの各成分は、一般的に、それ自体が適切な容器の中にある。従って、これらのキットは、一般的に、各々個々の試薬、酵素、プライマーおよびプローブのために適切な別個の容器を含む。さらに、ＲＴ−ＰＣＲキットは、アッセイならびにアッセイの実施から得られるデータを解釈および分析するための方法を実施するための説明書を含んでもよい。
抗体ベースのキットについては、このキットは、例えば、以下を含むことができる：（１）目的のタンパク質（１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、またはすべての任意の数の本発明のバイオマーカー、またはその任意の組み合わせのタンパク質産物）に結合する第１の抗体（これは担体に結合してもよく、結合しなくてもよい）；そして場合により、（２）タンパク質または第１の抗体のいずれかに結合し、そして検出可能な標識（例えば、蛍光標識、放射性同位元素または酵素）にコンジュゲートされている第２の異なる抗体。抗体ベースのキットはまた、免疫沈降を実行するためのビーズを含んでもよい。抗体ベースのキットの各成分は、一般的に、それ自体が適切な容器の中にある。従って、これらのキットは、一般的に、各抗体のために適切な別個の容器を含む。さらに、抗体ベースのキットは、アッセイならびにアッセイの実施から得られるデータを解釈および分析するための方法を実施するための説明書を含んでもよい。
レポーター遺伝子ベースのアッセイもまた、変形性関節症またはその症状を予防、治療、管理、または改善する能力について試験される化合物を同定するために行われてもよい。特定の実施形態において、本発明は、変形性関節症またはその症状を予防、治療、管理、または改善する能力について試験される化合物を同定するための方法を提供し、当該方法は、（ａ）本発明のバイオマーカーの調節エレメント（例えば、プロモーター／エンハンサーエレメント）に操作可能に連結されたレポーター遺伝子を含むレポーター遺伝子構築物を発現する細胞と、化合物を接触させる工程；（ｂ）当該レポーター遺伝子の発現を測定する工程；および（ｃ）（ａ）における量を、試験化合物と接触させていない対応する対照細胞に存在する量と比較し、その結果、発現したレポーター遺伝子の量が、対照細胞中の量と比較して変化している場合、変形性関節症またはその症状を予防、治療、管理、または改善する能力について試験される化合物が同定される工程を包含する。この実施形態に従って、細胞は、バイオマーカーを天然に発現してもよく、またはバイオマーカーを発現するように操作されてもよい。別の実施形態において、本発明は、変形性関節症またはその症状を予防、治療、管理、または改善する能力について試験される化合物を同定するための方法を提供し、当該方法は、（ａ）無細胞抽出物、および本発明のバイオマーカーの調節エレメント（例えば、プロモーター／エンハンサーエレメント）に操作可能に連結されたレポーター遺伝子を含むレポーター遺伝子構築物と、化合物を接触させる工程；（ｂ）当該レポーター遺伝子の発現を測定する工程；ならびに（ｃ）（ａ）における量を、試験化合物と接触させていない対応する対照に存在する量と比較し、その結果、発現したレポーター遺伝子の量が、対照における量と比較して変化している場合、変形性関節症またはその症状を予防、治療、管理、または改善する能力について試験される化合物が同定される工程を包含する。
当業者に周知である任意のレポーター遺伝子が、本発明の方法に従って使用されるレポーター遺伝子構築物中で使用されてもよい。レポーター遺伝子とは、その存在（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロット、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡなどによる）または活性のいずれかによって容易に検出可能である、ＲＮＡ転写物またはタンパク質をコードするヌクレオチド配列をいう。レポーター遺伝子の非限定的な例は、以下の表９に列挙されている。レポーター遺伝子は入手され、当業者に周知である任意の方法によってエレメントのヌクレオチド配列が決定されてもよい。レポーター遺伝子のヌクレオチド配列は、例えば、文献から、またはＧｅｎＢａｎｋなどのデータベースから入手することができる。代替的には、レポーター遺伝子をコードするポリヌクレオチド配列は、適切な供給源からの核酸から生成されてもよい。特定のレポーター遺伝子をコードする核酸を含むクローンが利用可能でないが、レポーター遺伝子の配列が公知である場合、レポーターをコードする核酸は化学合成されてもよく、または適切な供給源（例えば、ｃＤＮＡライブラリー、またはレポーター遺伝子を発現する任意の組織もしくは細胞から生成したｃＤＮＡライブラリー、またはそこから単離した核酸、好ましくはポリＡ＋ＲＮＡ）からＰＣＲによって入手してもよい。一旦、レポーター遺伝子のヌクレオチド配列が決定されると、レポーター遺伝子のヌクレオチド配列は、例えば、アミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を作製するために、ヌクレオチド配列の操作のために当該分野で周知の方法、例えば、組み換えＤＮＡ技術、部位特異的変異誘発、ＰＣＲなど（例えば、Sambrookら、１９９０，分子クローニング、実験室マニュアル、第２版（Molecular Cloning,A Laboratory Manual），Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，ニューヨーク、およびAusubelら編、１９９８，分子生物学の現在のプロトコール（Current Protocols in Molecular Biology），John Wiley & Sons，ニューヨークに記載される技術を参照のこと、これらの両方はそれらの全体が参照により本明細書に援用される）を使用して操作され、異なるアミノ酸配列を有するレポーター遺伝子を生成してもよい。
Figure 2008539728
本発明に従って、本発明のバイオマーカーの１つ以上、すべて、または任意の組み合わせを天然にまたは正常に発現する細胞は、本明細書に記載される方法において使用することができる。代替的には、細胞は、当該分野で周知でありかつ本明細書に記載される方法において使用される技術を使用して、本発明のバイオマーカーの１つ以上、すべて、もしくは任意の組み合わせ、またはレポーター遺伝子を発現するように操作することができる。このような技術の例には、リン酸カルシウム沈殿（例えば、Graham & Van der Eb，１９７８，Virol．５２：５４６を参照のこと）、デキストラン媒介トランスフェクション、リン酸カルシウム媒介トランスフェクション、ポリブレン媒介トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リポソーム中での核酸のカプセル化、および核への核酸の直接的マイクロインジェクションが含まれるがこれらに限定されない。
特定の実施形態において、本明細書に記載される方法において使用される細胞は、軟骨細胞、リンパ球（Ｔリンパ球またはＢリンパ球）、単球、好中球、マクロファージ、好酸球、好塩基球、赤血球、または血小板である。好ましい実施形態において、本明細書に記載される方法において使用される細胞は膀胱細胞である。別の好ましい実施形態において、本明細書に記載される方法において使用される細胞はリンパ球である。別の好ましい実施形態において、本明細書に記載される方法において使用される細胞は白血球である。別の好ましい実施形態において、本明細書に記載される方法において使用される細胞は白血球である。別の好ましい実施形態において、本明細書に記載される方法において使用される細胞は血液中の全細胞である。別の実施形態において、本明細書に記載される方法において使用される細胞は、供給源、例えば、組織から誘導された不死化細胞株である。
核酸の翻訳を、そして場合により、しかし好ましくは、転写を可能にする任意の無細胞抽出物を、本明細書に記載される方法に従って使用することができる。無細胞抽出物は、任意の種起源の細胞から単離されてもよい。例えば、無細胞翻訳抽出物は、ヒト細胞、培養マウス細胞、培養ラット細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、アフリカツメガエルの卵母細胞、ウサギ網状赤血球、コムギ胚芽、またはライムギ胚芽から単離されてもよい（例えば、Krieg & Melton，１９８４，Nature ３０８：２０３およびDignamら、１９９０ Methods Enzymol．１８２：１９４−２０３を参照のこと）。代替的には、無細胞翻訳抽出物、例えば、ウサギ網状赤血球溶解物およびコムギ胚芽抽出物は、例えば、Promega，（Madison，ウィスコンシン）から購入することができる。好ましい実施形態において、無細胞抽出物は、ヒト細胞から単離された抽出物である。特定の実施形態において、ヒト細胞はHeLa細胞、リンパ球、または膀胱細胞である。
本発明のバイオマーカーのＲＮＡ産物および／またはタンパク質産物の発現レベルを調節する能力に加えて、少なくとも特定の例においては、化合物が本発明のバイオマーカーのタンパク質産物の活性を調節することが所望され得る。従って、本発明は、膀胱癌またはその症状を予防、治療、管理、または改善する能力について試験される化合物を同定する方法を提供し、これには、本発明の１種以上のバイオマーカーのタンパク質産物の活性を調節する化合物を同定するための方法が含まれる。このような方法は以下の工程を包含し得る：（ａ）本発明の１種以上のバイオマーカーのタンパク質産物を発現する細胞を試験化合物と接触させる工程；（ｂ）インキュベーション時間後に、タンパク質産物の活性レベルを決定する工程；および（ｃ）この活性レベルを、試験化合物と接触させていない対応する対照における活性と比較し、その結果、（ａ）における活性のレベルが、対照細胞における活性のレベルと比較して変化している場合、膀胱癌またはその症状を予防、治療、管理、または改善する能力について試験される化合物が同定される工程。特定の実施形態において、活性レベルは、本明細書に記載されるアッセイ（例えば、マイクロアレイまたはＲＴ−ＰＣＲ）または当業者に周知のアッセイを利用することによって決定されるように、対照における発現レベルと比較して、５％、１０％、１５％、２５％、３０％、４０％、５０％、５〜２５％、１０〜３０％、少なくとも１倍、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、４倍、５倍、１０倍、２５倍、１〜１０倍、または５〜２５倍変化する。代替的な実施形態において、このような方法は、細胞中に存在する本発明のバイオマーカーの、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１２個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、少なくとも３５個、少なくとも４０個、少なくとも４５個、少なくとも５０個、１〜５個、１〜１０個、５〜１０個、５〜２５個、または１０〜４０個、またはすべての任意の数、またはその任意の組み合わせのタンパク質産物の活性レベルを決定する工程、およびこれらの活性レベルを対照中に存在するレベルと比較する工程を包含する。
本発明は、膀胱癌またはその症状を予防、治療、管理、または改善する能力について試験される化合物を同定する方法を提供し、この方法は以下の工程を包含する：（ａ）無細胞抽出物を、本発明の１種以上のバイオマーカーのタンパク質産物をコードする核酸および試験化合物と接触させる工程；（ｂ）インキュベーション時間後に、タンパク質産物の活性レベルを決定する工程；ならびに（ｃ）この活性レベルを、試験化合物と接触させていない対応する対照における活性と比較し、その結果、（ａ）における活性のレベルが、対照における活性のレベルと比較して変化している場合、膀胱癌またはその症状を予防、治療、管理、または改善する能力について試験される化合物が同定される工程。特定の実施形態において、活性レベルは、本明細書に記載されるアッセイ（例えば、マイクロアレイまたはＲＴ−ＰＣＲ）または当業者に周知のアッセイを利用することによって決定されるように、対照における発現レベルと比較して、１％？５％、１０％、１５％、２５％、３０％、４０％、５０％、５〜２５％、１０〜３０％、少なくとも１倍、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、４倍、５倍、１０倍、２５倍、１〜１０倍、または５〜２５倍変化する。代替的な実施形態において、このような方法は、サンプル中に存在する本発明のバイオマーカーの、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１２個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、少なくとも３５個、少なくとも４０個、少なくとも４５個、少なくとも５０個、１〜５個、１〜１０個、５〜１０個、５〜２５個、または１０〜４０個、またはすべての任意の数、またはその任意の組み合わせのタンパク質産物の活性レベルを決定する工程、およびこれらの活性レベルを対照中に存在する活性レベルと比較する工程を包含する。
標準的な技術を、本発明のバイオマーカーのタンパク質産物の活性のレベルを決定するために利用することができる。
５．１８．２ 化合物の生物学的活性
膀胱癌またはその症状を予防、治療、管理、または改善する能力について試験される化合物（便宜上、本明細書では「リード」化合物と呼ぶ）の同定に際して、化合物をさらに調べることができる。例えば、本発明の方法を介して同定された化合物は、癌および好ましくは膀胱癌の受け入れられている動物モデルにおいてインビボでさらに試験することができる。さらに、これらの方法を介して同定された化合物は、それらの特異性に関して分析することができる。
１つの実施形態において、リード化合物の効果は、細胞増殖または標的細胞の生存度を測定することによってアッセイすることができる。このようなアッセイは、膀胱癌に関与する細胞型に代表的な細胞（例えば、膀胱管壁細胞）を用いて実行することができる。代替的には、患者からの細胞を培養することの代わりに、リード化合物は、細胞株の細胞を使用してスクリーニングされてもよい。
当該分野において周知の多くのアッセイが、リード化合物への曝露後に患者の細胞または細胞株の生存および／または増殖を評価するために使用することができ；例えば、細胞増殖は、ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）取り込み（例えば、Hoshinoら、１９８６，Int.J.Cancer ３８，３６９；Campanaら、１９８８，J.Immunol.Meth.１０７：７９を参照のこと）または（３Ｈ）−チミジン取り込み（Chen,J.，１９９６，Oncogene １３：１３９５−４０３；Jeoung,J.，１９９５，J.Biol.Chem．２７０：１８３６７−７３）を測定することによって、直接細胞計数によって、プロトオンコジーン（例えば、ｆｏｓ、ｍｙｃ）または細胞周期マーカー（Ｒｂ、ｃｄｃ２、サイクリンＡ、Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｅなど）などの公知の遺伝子の転写、翻訳、または活性の変化を検出することによって、アッセイすることができる。このようなタンパク質およびＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）および活性のレベルは、当該分野で周知の任意の方法によって決定することができる。例えば、タンパク質は、市販の抗体を使用して、ウェスタンブロッティングまたは免疫沈降などの公知の免疫診断法によって定量することができる。ｍＲＮＡは、当該分野において周知でありかつ日常的な方法を使用して、例えば、ノーザン分析、ＲＮａｓｅ保護、逆転写と関連付けたポリメラーゼ連鎖反応を使用して、定量することができる。細胞生存度は、トリパンブルー染色または当該分野で公知の他の細胞死もしくは生存度マーカーを使用することによって評価することができる。特定の実施形態において、細胞ＡＴＰのレベルが、細胞生存度を決定するために測定される。分化は、例えば、形態学的変化に基づいて目視的に評価することができる。
動物モデル
化合物は、ヒトにおける使用の前に、適切な動物モデル系において試験することができる。このような動物モデル系には、ラット、マウス、ニワトリ、ウシ、サル、ブタ、イヌ、ウサギなどが含まれるがこれらに限定されない。当該分野で周知である任意の動物系が使用されてもよい。特定の実施形態において、化合物は、マウスモデルにおいて試験される。化合物は、反復して投与することができる。
受け入れられる動物モデルは、膀胱癌またはその症状の予防、治療、管理、または改善のために、上記の方法を介して同定された化合物の効力を決定するために利用することができる。
毒性
本発明に従って同定された化合物の毒性および／または効力は、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に対して致死的な用量）およびＥＤ５０（集団の５０％において治療的に有効な用量）を決定するために、細胞培養または実験動物において標準的な薬学的手順によって決定することができる。本発明に従って同定される化合物の細胞毒性を評価するために使用することができる細胞または細胞株には、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）、Ｃａｃｏ−２細胞、およびＨｕｈ７細胞が含まれるがこれらに限定されない。毒性効果と治療効果との用量比が治療指数であり、これは比率ＬＤ５０／ＥＤ５０として表現することができる。大きな治療指数を示す、本発明に従って同定された化合物が好ましい。毒性の副作用を示す、本発明に従って同定された化合物が使用されてもよいが、罹患していない細胞に対する損傷の可能性を最小限に抑えるために、罹患した組織の部位にこのような薬剤を標的化する送達系を設計し、それによって副作用を減少させるという配慮がなされるべきである。
細胞培養アッセイおよび動物研究から得られたデータは、ヒトにおける使用のために本発明に従って同定された化合物の一連の用量を処方する際に使用することができる。このような薬剤の用量は、好ましくは、ほとんど毒性がないかまたは全く毒性がない、ＥＤ５０を含む一連の循環濃度にある。この用量は、利用される剤形および使用される投与経路に依存して、この範囲内で変動してもよい。本発明の方法において使用される任意の薬剤について、治療有効用量は、最初に細胞培養アッセイから見積もることができる。用量は、細胞培養において決定されるような、ＩＣ５０（症状の最大半減阻害を達成する化合物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成するように動物モデルにおいて処方されてもよい。このような情報は、ヒトにおいて有用な用量をより正確に決定するために使用することができる。血漿中のレベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーによって測定されてもよい。
コンジナーまたはアナログの設計
所望の生物学的活性を示す化合物は、有用な薬理学的活性を有するコンジナーまたはアナログの開発または設計のためのリード化合物として使用することができる。例えば、一旦リード化合物が同定されると、分子モデリング技術は、より有効であり得る化合物の変異体を設計するために使用することができる。分子モデリングシステムの例は、CHARMおよびQUANTAプログラム（Polygen Corporation,Waltham，マサチューセッツ）である。CHARMは、エネルギー最小化および分子動力学の関数を実行する。QUANTAは、構造、グラフィックモデリング、および分子構造の分析を実行する。QUANTAは、相互作用的な構成、修飾、可視化、および互いとの分子の振る舞いの分析を可能にする。
多くの論文が、特定のタンパク質と相互作用的である薬物のコンピュータモデリングを概説しており、これらは例えば以下である：Rotivinenら、１９８８，Acta Pharmaceutical Fennica ９７：１５９−１６６；Ripka，１９９８，New Scientist ５４−５７；McKinaly & Rossmann，１９８９，Annu.Rev.Pharmacol.Toxiciol. ２９：１１１−１２２；Perry & Davies，ＯＳＡＲ：薬物設計における定量的構造−活性関係（Quantitative Structure-Activity Relationships in Drug Design）ｐｐ．１８９−１９３（Alan R.Liss,Inc.1989）;Lewis & Dean，１９８９，Proc.R.Soc.Lond. ２３６：１２５−１４０および１４１−１６２；Askewら、１９８９，J.Am.Chem.Soc.１１１：１０８２−１０９０。化学物質をスクリーニングしかつ図形的に描く他のコンピュータプログラムは、BioDesign,Inc.（Pasadena，カリフォルニア），Allelix,Inc.（Mississauga，Ontario，カナダ），およびHypercube,Inc.（Cambridge，オンタリオ）などの会社から利用可能である。これらは、最初に、特定のタンパク質に特異的である薬物への適用のために設計されるが、これらは任意の同定された領域に特異的である薬物の設計に適合させることができる。アナログおよびコンジナーは、生物学的活性についての上記のスクリーニングを使用して、関心対象のタンパク質（すなわち、本発明のバイオマーカーのタンパク質産物）への結合について試験することができる。代替的には、スクリーニングにおいて確認されるように、ほとんど生物学的活性がないか、または全く生物学的活性がないリード化合物もまた、生物学的活性を有する化合物のアナログおよびコンジナーを設計するために使用することができる。
５．１８．３ 化合物
本明細書に記載される方法によって試験および同定することができる化合物には、以下を含む任意の販売元から入手できる化合物を含むことができるがこれらに限定されない：Aldrich（1001 West St.Paul Ave.,Milwaukee，ウィスコンシン、53233）、Sigma Chemical（P.O. Box 14508，St Louis，ミズーリ、63178）、Fluka Chemie AG（Industriestrasse 25,CH-9471 Buchs，スイス（Fluka Chemical Corp.980 South 2nd Street,Ronkonkoma，ニューヨーク、11779））、Eastman Chemical Company，Fine Chemicals（P.O Box 431,Kingsport，テネシー、37662）、Boehringer Mannheim GmbH（Sandhofer Strasse 116,D-68298 Mannheim）、Takasago（4 Volvo Drive,Rockleigh，ニュージャージー、07647），SST Corporation（635 Brighton Road,Clifton，ニュージャージー、07012）、Ferro（111 West Irene Road,Zachary，ＬＡ 70791）、Riedel-deHaen Aktiengesellschaft（P.O. Box D-30918，Seelze，ドイツ）、PPG Industries Inc.,Fine Chemicals（One PPG Place,34th Floor,Pittsburgh，ペンシルヴェニア、5272）。さらに、微生物、真菌、植物、または動物の抽出物を含む、任意の種類の天然産物が、本明細書の方法を使用してスクリーニングされてもよい。
合成または天然の化合物の大規模なライブラリーからの化合物をスクリーニングすることができる。サッカリド、ペプチド、および核酸ベースの化合物のランダムまたは指向性の合成のために、多数の手段が現在使用されている。合成化合物ライブラリーは、Maybridge Chemical Co.（Trevillet,Cornwall，英国）、Comgenex（Princeton，ニュージャージー）、Brandon Associates（Merrimack，ニューハンプシャー）、およびMicrosource（New Milford，コネティカット）を含む多くの会社から市販されている。珍しい化学ライブラリーはAldrich（Milwaukee，ウィスコンシン）から利用可能である。コンビナトリアルライブラリーが利用可能でありかつ調製される。代替的には、細菌、真菌、植物、または動物の抽出物の型である天然の化合物のライブラリーは、例えば、Pan Laboratories（Bothell，ワシントン州）もしくはMycoSearch（ノースカロライナ）から利用可能であり、または当該分野において周知の方法によって容易に製造可能である。加えて、天然および合成的に製造されたライブラリーおよび化合物は、従来の化学的、物理的、および生化学的な手段を通して容易に修飾される。
さらに、小分子試験化合物を含む、試験化合物の多様なライブラリーが利用されてもよい。本発明の方法を使用してスクリーニングされたライブラリーは、種々の型の化合物を含むことができる。本発明の方法に従ってスクリーニングすることができるライブラリーの例には以下が含まれるがこれらに限定されない：ペプトイド；ランダムバイオオリゴマー；ヒダンドイン、ベンゾジアゼピン、およびジペプチドなどのディバーソマー；ビニル性ポリペプチド；非ペプチド性ペプチド模倣物；オリゴカルバメート；ペプチジルホスホネート；ペプチド核酸ライブラリー；抗体ライブラリー；炭水化物ライブラリー；および小分子ライブラリー（好ましくは、有機小分子ライブラリー）。ある実施形態において、スクリーニングされるライブラリー中の化合物は核酸またはペプチド分子である。非限定的な例において、ペプチド分子は、ファージディスプレイライブラリー中に存在し得る。別の実施形態において、化合物の型には以下が含まれるがこれらに限定されない：天然に存在しないアミノ酸、例えば、Ｄ−アミノ酸、アミノ酸のリンアナログ、例えば、α−アミノリン酸およびα−アミノリン酸、または非ペプチド結合を有するアミノ酸を含むペプチドを含むペプチドアナログ、核酸アナログ、例えば、ホスホロチオエートおよびＰＮＡ、ホルモン、抗原、合成または天然に存在する薬物、鎮静剤、ドーパミン、セロトニン、カテコールアミン、トロンビン、アセチルコリン、プロスタグランジン、有機分子、フェロモン、アデノシン、スクロース、グルコース、ラクトース、およびガラクトース。ポリペプチドまたはタンパク質のライブラリーもまた、本発明のアッセイにおいて使用することができる。
特定の実施形態において、コンビナトリアルライブラリーは、ベンゾジアゼピン、イソプレノイド、チアゾリジノン、メタチアザノン、ピロリジン、モルホリノ化合物、およびベンゾジアゼピンを含むがこれらに限定されない小分子有機ライブラリーである。別の実施形態において、コンビナトリアルライブラリーは、ペプトイド；ランダムバイオ−オリゴマー；ベンゾジアゼピン；ヒダンドイン、ベンゾジアゼピンおよびジペプチドなどのディバーソマー；ビニル性ポリペプチド；非ペプチド性ペプチド模倣物；オリゴカルバメート；ペプチジルホスホネート；ペプチド核酸ライブラリー；抗体ライブラリー；または炭水化物ライブラリーを含む。コンビナトリアルライブラリーは、それ自体市販されている。例えば、ライブラリーは、例えば、SpecsおよびBioSpecs B.V.（Rijswijk，オランダ）、Chembridge Corporation（San Diego，カリフォルニア）、Contract Service Company（Dolgoprudny，Moscow Region，ロシア）、Comgenex USA Inc.（Princeton，ニュージャージー）、Maybridge Chemicals Ltd.（Cornwall PL34 OHW，英国）、Asinex（Moscow，ロシア）、ComGenex（Princeton，ニュージャージー）、Ru,Tripos,Inc.（St.Louis，ミズーリ）、ChemStar,Ltd（Moscow，ロシア）、3D Pharmaceuticals（Exton，ペンシルヴェニア）、およびMartek Biosciences（Columbia，メリーランド）から商業的に入手してもよい。
好ましい実施形態において、ライブラリーは、ライブラリーの化合物が、細胞の取り込みのためにより受け入れ可能であるようにあらかじめ選択される。例えば、化合物は、細胞に入る化合物の可能性を増強する、サイズ、親油性、疎水性、および水素結合などであるがこれらに限定されない特定のパラメーターに基づいて選択される。別の実施形態において、化合物は、三次元または四次元コンピューター計算プログラムによって分析される。
本発明の方法に従う使用のためのコンビナトリアル化合物ライブラリーが合成されてもよい。薬理学的、生物学的、または他の活性についてスクリーニングすることができる、有機小化合物の大きなコレクションまたはライブラリーの作製に向けた合成方法には大きな関心が存在する。巨大なコンビナトリアルライブラリーを作製するために適用される合成方法は、溶液中で、または相中で、すなわち、担体上で実施される。固相合成は、過剰量の試薬を容易に加え、各反応段階後に洗い流すことができるので、多段階反応を実行すること、および反応を高収率で完了させることをより容易にする。固相コンビナトリアル合成はまた、単離、精製、およびスクリーニングを改善する傾向がある。しかし、より旧来の液相化学は、固相化学よりもより広範な種々の有機反応を支援する。
本発明のコンビナトリアル化合物ライブラリーは、その全体が参照により本明細書に援用される、Ｋｉｌｃｏｉｎらへの米国特許第６，１９０，６１９号に記載される装置を使用して合成されてもよい。米国特許第６，１９０，６１９号は、複数の別個の化合物の並行した合成のため、または化合物のコンビナトリアルライブラリーのための複数の反応容器を保持することが可能である合成装置を開示している。
１つの実施形態において、コンビナトリアル化合物ライブラリーは、溶液中で合成することができる。その全体が参照により本明細書に援用される、Bogerらへの米国特許第６，１９４，６１２号に開示される方法は、コンビナトリアルライブラリーの溶液相合成のためのテンプレートとして有用である化合物を特徴とする。テンプレートは、液体／液体または固体／液体の抽出を使用して、反応産物が未反応の反応物質から容易に精製できるように設計される。テンプレートを使用してコンビナトリアル合成によって産生される化合物は、好ましくは、有機小分子である。ライブラリー中のある化合物は、非ペプチドまたはペプチドの効果を模倣してもよい。コンビナトリアル化合物ライブラリーの固相合成とは対照的に、液相合成は、多段階固相合成の個々の段階をモニターするために特定化されたプロトコールの使用を必要としない（Egnerら、１９９５，J.Org.Chem.６０：２６５２；Andersonら、１９９５，J.Org.Chem.６０：２６５０；Fitchら、１９９４，J.Org.Chem.５９：７９５５；Lookら、１９９４，J.Org.Chem.４９：７５８８；Metzgerら、１９９３，Angew.Chem.,Int.Ed.Engl.３２：８９４；Youngquistら、１９９４，Rapid Commun.Mass Spect.８：７７；Chuら、１９９５，J.Am.Chem.Soc.１１７：５４１９；Brummelら、１９９４，Science ２６４：３９９；およびStevanovicら、１９９３，Bioorg.Med.Chem.Lett.３：４３１）。
本発明の方法のために有用なコンビナトリアル化合物ライブラリーは、固相担体上で合成することができる。１つの実施形態において、合成の間に担体を分離および混合するプロトコールである分割合成法は、固相担体上の化合物のライブラリーを合成するために使用される（例えば、Lamら、１９９７，Chem.Rev.９７：４１−４４８；Ohlmeyerら、１９９３，Proc.Natl.Acad.Sci.USA ９０：１０９２２−１０９２６およびそこに引用される参考文献を参照のこと）。最終ライブラリーにおける各固相担体は、その表面に結合された実質的に１つの型の化合物を有する。１つの産物が各担体に結合されている、固相担体上でコンビナトリアルライブラリーを合成するための他の方法は、当業者に公知である（例えば、Nefziら、１９９７，Chem.Rev.９７：４４９−４７２を参照のこと）。
本発明のある実施形態において、化合物は、リンカーを介して固相担体に結合させることができる。リンカーは、統合型でありかつ固相担体の一部であり得、または非統合型であり得、固相担体上で合成され、もしくは合成後にそこに結合されるかのいずれかである。リンカーは、固相担体への化合物の結合の点を提供するためだけではなく、リンカーの性質に依存して、異なる分子の基が異なる条件下で固相担体から切断されることを可能にするためにも有用である。例えば、リンカーは、とりわけ、求電子的に切断され、求核的に切断され、光切断可能であり、酵素切断され、金属によって切断され、還元条件下で切断され、または酸化条件下で切断されることが可能である。好ましい実施形態において、化合物は、化合物の高スループットスクリーニングの前に、固相担体から切断される。
ライブラリーが化合物のアレイまたはマイクロアレイを含み、ここで、各化合物がアドレスまたは識別子を有する場合、化合物は、例えば、個々の試験アッセイに適用された元の化合物リストに対してポジティブサンプルを相互参照することによって、逆重畳することができる。
ライブラリーがペプチドまたは核酸ライブラリーである場合、化合物の配列は、ペプチドまたは核酸の配列決定を方向付けることによって決定することができる。このような方法は当業者に周知である。
多数の物理化学的技術が、化合物を新規に特徴付けるために使用することができる。このような技術の例には、質量スペクトル分析、ＮＭＲスペクトル分析、Ｘ線結晶解析、および振動スペクトル分析が含まれるがこれらに限定されない。
５．１９ 膀胱癌またはその症状を予防、治療、管理、または改善するための同定された化合物の使用
本発明は、膀胱癌またはその症状を予防、治療、管理、または改善する方法を提供し、当該方法は、本発明の方法に従って同定された１種以上の化合物を、その必要がある被験体に投与する工程を包含する。好ましい実施形態において、被験体はヒトである。
１つの実施形態において、本発明は、膀胱癌またはその症状を予防、治療、管理、または改善する方法を提供し、当該方法は、本発明の方法に従って同定された１種以上の化合物の予防的または治療的有効量の１回の用量を、その必要がある被験体に投与する工程を包含する。特定の実施形態において、本発明の方法に従って同定された化合物は、このような化合物が膀胱癌またはその症状を予防、治療、管理、または改善するために以前に使用された場合には、膀胱癌またはその症状を予防、治療、または改善するために投与されない。別の実施形態において、本発明の方法に従って同定された化合物は、このような化合物が膀胱癌またはその症状を予防、治療、管理、または改善するために使用されることが示唆されている場合には、膀胱癌またはその症状を予防、治療、または改善するために投与されない。別の実施形態において、本発明の方法に従って同定された化合物が、本発明の１つのみのバイオマーカーのタンパク質産物またはＲＮＡ産物に特異的に結合し、ならびに／またはその発現および／もしくは活性のレベルを変化させる。さらに別の実施形態において、本発明の方法に従って同定された化合物は、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、少なくとも３５個、少なくとも４０個、またはそれ以上までの任意の数の本発明のバイオマーカーのタンパク質産物またはＲＮＡ産物に特異的に結合し、ならびに／またはその発現および／もしくは活性のレベルを変化させる。
特定の実施形態において、本発明の方法に従って同定された化合物は、膀胱細胞または不死化膀胱癌の同化活性および／または異化活性を増加または減少する。好ましくは、このような化合物は、軟骨細胞の同化活性および／または異化活性を、未処理の膀胱細胞または不死化膀胱癌と比較して、１．０倍より多く、より好ましくは、１．５〜５倍、および最も好ましくは、５〜１００倍、増加または減少する。別の実施形態において、本発明の方法に従って同定された化合物は、膀胱癌の症状を含む、膀胱癌に関連する症状および／または変化の少なくとも１つを改善する。特定の実施形態において、膀胱癌またはその症状を予防、治療、管理、または改善するために投与される予防薬剤または治療薬剤は、合成化合物または天然産物（例えば、植物抽出物または培養上清）、または化合物の混合物である。
本発明はまた、膀胱癌またはその症状を予防、治療、管理、または改善する方法を提供し、当該方法は、本明細書に記載されるスクリーニング方法を利用して同定された１種以上の化合物、および１種以上の他の治療（例えば、予防薬剤または治療薬剤および外科手術）をその必要がある被験体に投与する工程を包含する。特定の実施形態において、このような治療は現在使用されているか、使用されてきたか、または膀胱癌またはその症状の予防、治療、管理、または改善において有用であることが知られている（本明細書以下の節に列挙される予防薬剤または治療薬剤を含むがこれらに限定されない）。本発明の併用療法（例えば、予防薬剤または治療薬剤）は、逐次的にまたは同時に投与することができる。特定の実施形態において、本発明の併用療法は、本発明に従って同定された化合物、および当該化合物と同じ作用のメカニズムを有する少なくとも１つの他の治療を含む。別の特定の実施形態において、本発明の併用療法は、本発明の方法に従って同定された化合物、および当該化合物とは異なる作用のメカニズムを有する少なくとも１つの治療（例えば、予防薬剤または治療薬剤）を含む。本発明の併用療法は、化合物とともに、相加効果または相乗効果を有するように機能させることにより、本発明の化合物の予防効果または治療効果を改善する。本発明の併用療法は、治療（例えば、予防薬剤または治療薬剤）に関連する副作用を減少する。
併用療法の予防薬剤または治療薬剤は、同じ医薬組成物中で被験体に投与することができる。代替的には、併用療法の予防薬剤または治療薬剤は、個別の医薬組成物中で同時に被験体に投与することができる。予防薬剤または治療薬剤は、同じまたは異なる投与経路によって被験体に投与されてもよい。
特定の実施形態において、本明細書に記載されるアッセイにおいて同定された１種以上の化合物を含む医薬組成物は、膀胱癌またはその症状を予防、治療、管理、または改善するために、被験体、好ましくは、ヒトに投与される。本発明に従って、医薬組成物はまた、１種以上の予防薬剤または治療薬剤を含んでもよい。好ましくは、このような薬剤は、現在使用されているか、使用されてきたか、または膀胱癌またはその症状の予防、治療、管理、または改善において有用であることが知られている
本発明の方法に従って同定された化合物は、膀胱癌のための第１の、第２の、第３の、第４の、または第５の一連の治療として使用されてもよい。本発明は、膀胱癌のための従来の治療に対して不応性である被験体において、膀胱癌またはその症状を治療、管理、または改善するための方法を提供し、当該方法は、本発明の方法に従って同定された化合物の予防有効量または治療有効量の用量を上記被験体に投与する工程を包含する。
本発明は、膀胱癌のための既存の単独の薬剤治療に対して不応性である被験体において、膀胱癌またはその症状を治療、管理、または改善するための方法を提供し、当該方法は、本発明の方法に従って同定された化合物の予防有効量または治療有効量の用量、および１種以上の他の治療（予防薬剤または治療薬剤）の予防有効量または治療有効量の用量を当該被験体に投与する工程を包含する。本発明はまた、他の治療に対して不応性であることが判明したが、もはやその治療を受けていない患者に対して、任意の他の治療（例えば、外科手術）と併用して、本発明の方法に従って同定された化合物を投与することによって、膀胱癌を治療または管理するための方法を提供する。本発明はまた、膀胱癌を有し、かつ以前に他の治療を受けたという理由により免疫抑制された患者の治療または管理のための方法を提供する。本発明はまた、ホルモン療法および／または生物療法／免疫治療が毒性が強すぎることが判明したか、または毒性が強いと判明する可能性があり、すなわち、治療または管理される被験体にとって受け入れがたいまたは耐え難い副作用を生じる、膀胱癌の治療または管理のための代替方法を提供する。
５．１９．１ 膀胱癌またはその症状を治療、管理、または改善する際の使用のための化合物
膀胱癌またはその症状を予防、治療、管理、および／または改善するために、本発明の方法に従って使用することができる化合物の代表的な非限定的な例は、以下に詳細に記載される。
第１に、このような化合物は、例えば、本発明のバイオマーカーのタンパク質産物またはＲＮＡ産物の発現または活性を下方制御することができる、アンチセンス、リボザイム、または三重らせん化合物を含むことができる。このような化合物は以下のサブセクションで詳細に説明される。
第２に、このような化合物は、例えば、本発明のバイオマーカーのタンパク質産物もしくはＲＮＡ産物の発現、または本発明のバイオマーカーのタンパク質産物の活性を調節することができる抗体組成物を含むことができる。特定の実施形態において、この抗体組成物は、本発明のバイオマーカーのタンパク質産物もしくはＲＮＡ産物の発現、または本発明のバイオマーカーのタンパク質産物の活性を下方制御する。このような化合物は、以下のサブセクションに詳細に記載される。
第３に、このような化合物は、例えば、本発明のバイオマーカーのタンパク質産物を含むことができる。本発明は、膀胱癌またはその症状を予防、治療、管理、および／または改善するために、本発明のバイオマーカーのタンパク質産物を模倣するように選択されるペプチドまたはペプチド模倣物の使用を包含する。さらに、このような化合物は、例えば、本発明のバイオマーカーのタンパク質産物もしくはＲＮＡ産物の発現、または本発明のバイオマーカーのタンパク質産物の活性を調節することができる、ドミナントネガティブポリペプチドを含むことができる。
本発明の方法はまた、膀胱癌またはその症状を予防、治療、管理、または改善するための本発明のバイオマーカーのタンパク質産物の誘導体、アナログ、およびフラグメントの使用を包含する。特に、本発明は、膀胱癌またはその症状を予防、治療、管理、または改善するためのこのようなタンパク質の１つ以上のドメインを含む本発明のバイオマーカーのタンパク質産物のフラグメントの使用を包含する。別の特定の実施形態において、本発明は、本発明のバイオマーカーのタンパク質産物、または融合物として発現されるこのようなタンパク質のアナログ、誘導体、もしくはフラグメント、またはキメラタンパク質産物（ペプチドを介して異種タンパク質配列に結合された結合されたタンパク質、フラグメント、アナログ、または誘導体を含む）の使用を包含する。
特定の実施形態において、本発明のバイオマーカーの少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、少なくとも３５個、少なくとも４０個、少なくとも４５個、少なくとも５０個、またはそれ以上のアンチセンスヌクレオチドは、膀胱癌またはその症状を予防、治療、管理、または改善するために投与される。別の実施形態において、本発明のバイオマーカーのタンパク質産物、またはそのフラグメント、アナログ、もしくは誘導体の１つ以上が、膀胱癌またはその症状を予防、治療、管理、または改善するために投与される。別の実施形態において、本発明のタンパク質産物に特異的に結合する１つ以上の抗体は、膀胱癌またはその症状を予防、治療、管理、または改善するために投与される。別の実施形態において、１つ以上のドミナントネガティブポリペプチドが、膀胱癌またはその症状を予防、治療、管理、または改善するために投与される。
アンチセンス、リボザイム、三重らせん組成物
標準的な技術は、本明細書に記載される方法の一部としての使用のために、アンチセンス、三重らせん、またはリボザイム分子を産生するために利用することができる。最初に、標準的な技術は、アンチセンス核酸分子、すなわち、例えば、二本鎖ｃＤＮＡ分子のコード鎖に相補的であるかまたはｍＲＮＡ配列に相補的である、目的のポリペプチドをコードするセンス核酸に相補的である分子の産生のために利用することができる。従って、アンチセンス核酸は、センス核酸に対して水素結合することができる。アンチセンス核酸は、全体のコード鎖、またはその一部のみ、例えば、タンパク質コード領域（またはオープンリーディングフレーム）のすべてまたは一部に相補的であり得る。アンチセンス核酸分子は、目的のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列のコード鎖の非コード領域のすべてまたは一部に対するアンチセンスであり得る。非コード領域（「５’および３’非翻訳領域」）は、コード領域に隣接する５’および３’配列であり、アミノ酸に翻訳されない。
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、約５個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、または５０個またはそれ以上までの任意の数のヌクレオチドの長さであり得る。本発明のアンチセンス核酸は、当該分野で公知の手順を使用して、化学合成および酵素的ライゲーションを使用して構築することができる。例えば、アンチセンス核酸（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、天然に存在するヌクレオチド、または分子の生物学的安定性を増加するようにもしくはアンチセンスとセンスの核酸との間に形成される二重鎖の物理的安定性を増加するように設計された様々に修飾されたヌクレオチドを使用して、化学的に合成することができ、例えば、ホスホロチオエート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチドを使用することができる。アンチセンス核酸を生成するために使用することができる修飾ヌクレオチドの例には以下が含まれる：５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルクエオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルクエオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキシン、シュドウラシル、クエオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、および２，６−ジアミノプリン。代替的には、アンチセンス核酸は、核酸がアンチセンス方向でサブクローニングされた発現ベクターを使用して生物学的に産生することができる（すなわち、挿入された核酸から転写されたＲＮＡは、目的の標的核酸に対してアンチセンス方向である）。
アンチセンス核酸分子は、これらが目的のポリペプチドをコードする細胞ｍＲＮＡにハイブリダイズするかまたはこれに結合するように、被験体に投与され、またはインサイチュで生成されて、それによって、例えば、転写および／または翻訳を阻害することによって発現を阻害する。このハイブリダイゼーションは、安定な二重鎖を形成するために相補的な従来のヌクレオチドによってであり得、または例えば、ＤＮＡ二重鎖に結合するアンチセンス核酸分子の場合には、二重らせんの大きな溝の中での特異的相互作用を通してであり得る。本発明のアンチセンス核酸分子の投与経路の例には、組織、例えば、関節（例えば、膝、腰、肘、および指関節）の部位における直接注射が含まれる。代替的には、アンチセンス核酸は、選択された細胞を標的とするように修飾し、次いで、全身投与することができる。例えば、全身投与のために、アンチセンス分子は、それらが、選択された細胞、例えば、Ｔ細胞または軟骨細胞の表面上で発現される受容体または抗原に特異的に結合するように、アンチセンス核酸分子を、細胞表面受容体または抗原に結合するペプチドまたは抗体に連結することによって、修飾することができる。アンチセンス核酸はまた、以下に記載されるベクター、例えば、遺伝子治療ベクターを使用して、細胞に送達することができる。アンチセンス分子の十分な細胞内濃度を達成するために、アンチセンス核酸分子が強力なｐｏｌ ＩＩまたはｐｏｌ ＩＩＩプロモーターの制御下に配置されているベクター構築物が好ましい。
目的のアンチセンス核酸分子は、α−アノマー性核酸分子であり得る。α−アノマー性核酸分子は、相補的ＲＮＡと特異的二本鎖ハイブリッドを形成し、ここでは、通常のα−単位とは反対に、鎖が互いに平行になっている（Gaultierら、１９８７，Nucleic Acids Res.１５：６６２５−６６４１）。アンチセンス核酸分子はまた、２’−ｏ−メチルリボヌクレオチド（Inoueら、１９８７，Nucleic Acids Res.１５：６１３１−６１４８）またはキメラＲＮＡ−ＤＮＡアナログ（Inoueら、１９８７，FEBS Lett.２１５：３２７−３３０）を含むことができる。
リボザイムは、ｍＲＮＡなどの一本鎖核酸を切断可能であるリボヌクレアーゼ活性を有する触媒性ＲＮＡ分子であり、このリボザイムはこの一本鎖核酸に対する相補的領域を有し、そしてまた、標準的な技術を使用して生成することができる。従って、リボザイム（例えば、ハンマーヘッドリボザイム（HaselhoffおよびGerlach，１９８８，Nature ３３４：５８５−５９１において記載される））は、ｍＲＮＡ転写物を触媒的に切断し、それによって、ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質の翻訳を阻害することができる。目的のポリペプチドをコードする核酸分子についての特異性を有するリボザイムは、本明細書に開示されるｃＤＮＡのヌクレオチド配列に基づいて設計することができる。例えば、Tetrahymena Ｌ−１９ ＩＶＳ ＲＮＡの誘導体を構築することができ、ここでは、活性部位のヌクレオチド配列は、Cechら、米国特許第４，９８７，０７１号；およびＣｅｃｈら、米国特許第５，１１６，７４２号において切断されるヌクレオチド配列に相補的である。代替的には、目的のポリペプチドをコードするｍＲＮＡは、ＲＮＡ分子のプールから、特異的リボヌクレアーゼ活性を有する触媒ＲＮＡを選択するために使用することができる。例えば、BartelおよびSzostak，１９９３，Science ２６１：１４１１−１４１８を参照のこと。
三重らせん構造もまた、周知の技術を使用して生成することができる。例えば、目的のポリペプチドの発現は、ポリペプチドをコードする遺伝子の調節領域（例えば、プロモーターおよび／またはエンハンサー）に相補的なヌクレオチド配列を標的とすることによって阻害され、標的細胞中で遺伝子の転写を防ぐ三重らせん構造を形成することができる。一般的には、Helene，１９９１，Anticancer Drug Des.６（６）：５６９−８４；Helene，１９９２，Ann.N.Y.Acad.Sci.６６０：２７−３６；およびMaher，１９９２，Bioassays １４（１２）：８０７−１５を参照のこと。
種々の実施形態において、核酸組成物は、例えば、分子の安定性、ハイブリダイゼーション、または溶解性を改善するために、塩基部分、糖部分、またはリン酸バックボーンにおいて修飾することができる。例えば、核酸のデオキシリボースリン酸バックボーンは、修飾されて、ペプチド核酸を生成することができる（例えば、Hyrupら、１９９６，Bioorganic & Medicinal Chemistry ４（１）：５−２３を参照のこと）。本明細書で使用される場合、「ペプチド核酸」または「ＰＮＡ」という用語は、デオキシリボースリン酸バックボーンがシュドペプチドバックボーンによって置き換えられ、４つの天然の核酸塩基のみが保持されている、核酸模倣物、例えば、ＤＮＡ模倣物をいう。ＰＮＡの中性バックボーンは、低イオン強度の条件下で、ＤＮＡおよびＲＮＡへの特異的ハイブリダイゼーションを可能にすることが示されてきた。ＰＮＡオリゴマーの合成は、Hyrupら、１９９６，前出；Perry-O’Keefeら、１９９６，Proc.Natl.Acad.Sci.USA ９３：１４６７０−６７５において記載されるように、標準的な固相ペプチド合成プロトコールを使用して実施することができる。
ＰＮＡは、例えば、親油基または他の補助基をＰＮＡに結合させることにより、ＰＮＡ−ＤＮＡキメラの形成によって、またはリポソームもしくは当該分野で公知である他の薬物送達の技術の使用によって、例えば、ＰＮＡの安定性または細胞の取り込みを増強するために、修飾することができる。例えば、ＰＮＡおよびＤＮＡの有利な特性を合わせ得るＰＮＡ−ＤＮＡキメラを生成することができる。このようなキメラは、ＤＮＡ認識酵素、例えば、ＲＮＡｓｅ ＨおよびＤＮＡポリメラーゼがＤＮＡ部分と相互作用することを可能にするのに対して、ＰＮＡ部分は、高い結合親和性および特異性を提供する。ＰＮＡ−ＤＮＡキメラは、塩基の重なり、核酸塩基間の結合の数、および配向によって選択される適切な長さのリンカーを使用して連結することができる（Hyrup，１９９６、前出）。ＰＮＡ−ＤＮＡキメラの合成は、Hyrup，１９９６、前出およびFinnら、１９９６，Nucleic Acids Res.２４（１７）：３３５７−６３において記載されるように実施することができる。例えば、ＤＮＡ鎖は、標準的なホスホルアミダイトカップリング化学および修飾ヌクレオシドアナログを使用して、固相担体上で合成することができる。５’−（４−メトキシトリチル）アミノ−５’−デオキシ−チミジンホスホルアミダイトなどの化合物は、ＰＮＡと、ＤＮＡの５’末端の間の連結に使用することができる（Magら、１９８９，Nucleic Acids Res.１７：５９７３−８８）。次いで、ＰＮＡプロモーターは、５’ＰＮＡセグメントおよび３’ＤＮＡセグメントを有するキメラ分子を産生するために、段階的な様式でカップリングされる（Finnら、１９９６，Nucleic Acids Res.２４（１７）：３３５７−６３）。代替的には、キメラ分子は、５’ＤＮＡセグメントおよび３’ＰＮＡセグメントを伴って合成することができる（Peterserら、１９７５，Bioorganic Med.Chem.Lett.５：１１１９−１１１２４）。
別の実施形態において、ヌクレオチドは、ペプチドなどの他の付加基（例えば、インビボで宿主細胞受容体を標的とするため）、または細胞膜（例えば、Letsingerら、１９８９，Proc.Natl.Acad.Sci.USA ８６：６５５３−６５５６；Lemaitreら、１９８７，Proc.Natl.Acad.Sci.USA ８４：６４８−６５２；国際公開番号ＷＯ８８／０９８１０を参照のこと）もしくは血液脳関門（例えば、国際公開番号ＷＯ８９／１０１３４を参照のこと）を横切る通過を容易にする因子を含んでもよい。加えて、オリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーション誘発性切断剤（例えば、Krolら、１９８８，Bio/Techniques ６：９５８−９７６を参照のこと）または挿入剤（例えば、Zon，１９８８，Pharm.Res. ５：５３９−５４９を参照のこと）で修飾することができる。この目的のために、オリゴヌクレオチドは、別の分子、例えば、ペプチド、ハイブリダイゼーション誘発性架橋剤、輸送剤、ハイブリダイゼーション誘発性切断剤などにコンジュゲートされてもよい。
抗体組成物
１つの実施形態において、本発明の１種以上のバイオマーカーの１種以上のタンパク質産物に特異的に結合する抗体が、膀胱癌またはその症状を予防、治療、管理、または改善するために、被験体、好ましくは、ヒトに投与される。別の実施形態において、本発明の１種以上のバイオマーカーの１種以上のタンパク質産物に特異的に結合する抗体の任意の組み合わせが、膀胱癌またはその症状を予防、治療、管理、または改善するために、被験体、好ましくは、ヒトに投与される。特定の実施形態において、本発明の１種以上のバイオマーカーの１種以上のタンパク質産物に特異的に結合する１種以上の抗体が、膀胱癌またはその症状を予防、治療、管理、または改善するために、他の型の治療と併用して、被験体、好ましくは、ヒトに投与される。特定の実施形態において、本発明の１種以上のバイオマーカーの１種以上のタンパク質産物に特異的に結合する当該分野で公知の抗体が、膀胱癌またはその症状を予防、治療、管理、または改善するために、単独で、または他の型の治療と併用して、被験体、好ましくは、ヒトに投与される。別の実施形態において、本発明の１種以上のバイオマーカーの１種以上のタンパク質産物に特異的に結合する当該分野で公知の抗体が、膀胱癌またはその症状を予防、治療、管理、または改善するために、単独で、または他の型の治療と併用して、被験体、好ましくは、ヒトに投与されない。
本発明の１種以上のバイオマーカーの１種以上のタンパク質産物に特異的に結合する１種以上の抗体は、当業者に公知である種々の送達系を使用して、被験体、好ましくは、ヒトに投与することができる。例えば、このような抗体は、リポソーム、微粒子、またはマイクロカプセル中でのカプセル化によって投与することができる。例えば、米国特許第５，７６２，９０４号、米国特許第６，００４，５３４号、および国際公開番号ＷＯ９９／５２５６３を参照のこと。加えて、このような抗体は、抗体を発現可能な組み換え細胞、またはレトロウイルス、他のウイルスベクター、もしくは抗体を発現可能な非ウイルスベクターを使用して投与することができる。
本発明の１種以上のバイオマーカーの１種以上のタンパク質産物に特異的に結合する抗体は、任意の公知の供給源から入手することができる。代替的には、本発明の１種以上のバイオマーカーの１種以上のタンパク質産物に特異的に結合する抗体は、抗体の合成のために当該分野で公知の任意の方法によって、特に、化学合成によって、または組み換え発現技術によって産生することができる。
抗体には以下が含まれるがこれらに限定されない：ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、二特異的抗体、多特異的抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、ラクダ化抗体、キメラ抗体、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）（Birdら、（１９８８）Science ２４２：４２３−４２６；およびHustonら、（１９８８）Proc.Natl.Acad.Sci USA ８５：５８７９−５８８３）、単鎖抗体、単一ドメイン抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）フラグメント、ジスルフィド連結Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、および抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例えば、本発明の抗体に対する抗Ｉｄ抗体を含む）、ならびに上記のいずれかの抗原結合フラグメントおよび／またはエピトープ結合フラグメント。「抗体」という用語は、本明細書に記載される場合、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性なフラグメント、すなわち、抗原決定部位を含む分子をいう。免疫グロブリン分子は、任意の型（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＹ）、クラス（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）、またはサブクラスであり得る。免疫グロブリン分子の免疫学的に活性なフラグメントの例には、Ｆ（ａｂ）フラグメント（ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインから成る一価のフラグメント）およびＦ（ａｂ’）２フラグメント（ヒンジ領域におけるジスルフィド結合によって連結された２つのＦａｂフラグメントを含む二価フラグメント）が含まれ、これらは、ペプシンまたはパパインなどの酵素を用いて抗体を処理することによって生成することができる。免疫学的に活性なフラグメントにはまた以下が含まれるがこれらに限定されない：Ｆｄフラグメント（ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインから成る）、Ｆｖフラグメント（抗体の単一アームのＶＬドメインおよびＶＨドメインから成る）、ｄＡｂフラグメント（ＶＨドメインから成る；Wardら、（１９８９）Nature ３４１：５４４−５４６）、および相補性決定領域（ＣＤＲ）。抗原に特異的に結合する抗体は、抗体の合成のために当該分野で公知の任意の方法によって、特に、化学合成によって、または組み換え発現技術によって産生することができる。
抗原に特異的に結合するポリクローナル抗体は、当該分野において周知の種々の手順によって産生することができる。例えば、ヒト抗原は、ウサギ、マウス、ラットなどを含むがこれらに限定されない種々の宿主動物に投与して、ヒト抗原に特異的なポリクローナル抗体を含む血清の産生を誘導することができる。種々のアジュバントが、宿主種に依存して、免疫学的応答を増加させるために使用されてもよく、これには以下が含まれるがこれらに限定されない：フロイント（完全および不完全）、水酸化アルミニウムなどのミネラルゲル、リゾレシチンなどの界面活性剤、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルジョン、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、ならびにＢＣＧ（カルメット−ゲラン杆菌）およびコリネバクテリウム パルバムなどの有用なものとなり得るヒトアジュバント。このようなアジュバントもまた当該分野で周知である。
「一特異性抗体」という用語は、特定の標的、例えば、エピトープについての単一の結合特異性および親和性を示す抗体をいう。この用語はモノクローナル抗体を含む。モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ、組み換え、およびファージディスプレイ技術、またはそれとの併用を含む当該分野で公知である広範な種々の技術を使用して調製することができる。例えば、参照として援用される、米国特許ＲＥ３２，０１１号、米国特許第４，９０２，６１４号、同第４，５４３，４３９号、同第４，４１１，９９３号および同第４，１９６，２６５号；Kennettら（編）、モノクローナル抗体、ハイブリドーマ：生物学的分析の新たな次元（Monoclonal Antibodies,Hybridomas:A New Dimension in Biological Analyses），Plenum Press（１９８０）；ならびにHarlowおよびLane（編），抗体実験室マニュアル（Antibodies.A Laboratory Manual），Cold Spring Harbor Laboratory Press（１９８８）を参照のこと。例えば、モノクローナル抗体は、当該分野で公知の技術を含むハイブリドーマ技術を使用して産生することができ、例えば、Harlowら、抗体：実験室マニュアル（Antibodies:A Laboratory Manual），第二版（Cold Spring Harbor Laboratory Press，１９８８）；Hammerlingら、モノクローナル抗体およびＴ細胞ハイブリドーマ（Monoclonal Antibodies and T-CeIl Hybridomas）５６３−６８１所収（Elsevier，ニューヨーク州，１９８１）において教示されている（上記文献はその全体が参照により援用される）。組み換え技術を通して抗体の産生を可能にする他の技術（例えば、Stratacyte, La Jolla，カリフォルニア、から利用可能である市販の系を含む、William D. Huseら、１９８９，Science，２４６：１２７５−１２８１；L. Sastryら、１９８９，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，８６：５７２８−５７３２；およびMichelle Alting-Meesら、Strategies in Molecular Biology，３：１−９（１９９０）によって記載される技術）もまた、モノクローナル抗体を構築するために利用されてもよい。「モノクローナル抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、ハイブリドーマ技術を通して産生される抗体に限定されない。「モノクローナル抗体」という用語は、任意の真核生物、原核生物、またはファージクローンを含む単一クローンから誘導される抗体をいい、それが産生された方法には関わらない。
ハイブリドーマ技術を使用して特異的抗体を産生およびスクリーニングするための方法は、日常的でありかつ当該分野で周知である。手短に述べると、マウスは本発明のバイオマーカーのタンパク質産物で免疫することができ、一旦免疫応答が検出されると、例えば、タンパク質に特異的な抗体がマウス血清中で検出され、マウス脾臓が採取され、そして脾細胞が単離される。次いで、脾細胞が、周知の技術によって、任意の適切なミエローマ細胞、例えば、ＡＴＣＣから利用可能である細胞株ＳＰ２０からの細胞に融合される。ハイブリドーマは、限界希釈によって選択およびクローニングされる。加えて、ＲＩＭＭＳ（反復免疫複数部位）技術が動物を免疫するために使用することができる（その全体が参照により援用される、Kilptrackら、１９９７，Hybridoma １６：３８１−９）。次いで、ハイブリドーマクローンは、本発明のポリペプチドを結合することが可能な抗体を分泌する細胞について、当該分野で公知の方法によってアッセイする。高レベルの抗体を一般的に含む腹水は、ポジティブハイブリドーマクローンを用いてマウスを免疫することによって生成することができる。
従って、本発明は、本発明の抗体を分泌するハイブリドーマ細胞を培養することによって抗体を生成する方法を提供し、好ましくは、ハイブリドーマは、本発明のバイオマーカーのタンパク質産物で免疫したマウスから単離した脾細胞を、ミエローマ細胞と融合すること、次いで、タンパク質またはタンパク質フラグメントに結合することができる抗体を分泌するハイブリドーマクローンについての融合物から生じるハイブリドーマをスクリーニングすることによって生成される。
本発明のバイオマーカーのタンパク質産物の特異的エピトープを認識する抗体フラグメントは、当業者に公知である任意の技術によって生成されてもよい。例えば、本発明のＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントは、パパイン（Ｆａｂフラグメントを産生するため）またはペプシン（Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを産生するため）などの酵素を使用する、免疫グロブリン分子のタンパク質分解的切断によって産生されてもよい。Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、可変領域、軽鎖定常領域および重鎖のＣＨ１ドメインを含む。さらに、本発明の抗体はまた、当該分野で公知の種々のファージディスプレイ法を使用して生成することができる。
ファージディスプレイ法において、機能的抗体ドメインは、それらをコードするポリヌクレオチド配列を有するファージ粒子の表面上に表示される。特に、ＶＨドメインおよびＶＬドメインをコードするＤＮＡ配列が動物ｃＤＮＡライブラリー（例えば、罹患した組織のヒトまたはマウスｃＤＮＡライブラリー）から増幅される。ＶＨドメインおよびＶＬドメインをコードするＤＮＡは、ＰＣＲによってｓｃＦｖリンカーとともに組み換えられ、ファージミドベクターにクローニングされる。このベクターはＥ．ｃｏｌｉ中にエレクトロポレーションされ、このE.coliはヘルパーファージで感染される。これらの方法において使用されるファージは、典型的には、ｆｄおよびＭ１３を含む糸状ファージであり、ＶＨドメインおよびＶＬドメインは通常、ファージの遺伝子ＩＩＩまたは遺伝子ＶＩＩＩのいずれかへの組み換えにより融合される。特定の抗原に結合する抗原結合ドメインを発現するファージは、例えば、標識抗原、または固体表面もしくはビーズに結合もしくは捕捉された抗原を使用して選択または同定することができる。本発明の抗体を作製するために使用することができるファージディスプレイ法の例には以下に開示されるものが含まれ、これらは各々その全体が参照により本明細書に援用される：Brinkmanら、１９９５，J.Immunol.Methods １８２：４１−５０；Amesら、１９９５，J.Immunol.Methods １８４：１７７−１８６；Kettleboroughら、１９９４，Eur.J.Immunol.２４：９５２−９５８；Persicら、１９９７，Gene １８７：９−１８；Burtonら、１９９４，Advances in Immunology ５７：１９１−２８０；ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＧＢ９１／Ｏ１ １３４；国際出願番号ＷＯ９０／０２８０９、ＷＯ９１／１０７３７、ＷＯ９２／０１０４７、ＷＯ９２／１８６１９、ＷＯ９３／１ １２３６、ＷＯ９５／１５９８２、ＷＯ９５／２０４０１、およびＷＯ９７／１３８４４；ならびに米国特許第５，６９８，４２６号、同第５，２２３，４０９号、同第５，４０３，４８４号、同第５，５８０，７１７号、同第５，４２７，９０８号、同第５，７５０，７５３号、同第５，８２１，０４７号、同第５，５７１，６９８号、同第５，４２７，９０８号、同第５，５１６，６３７号、同第５，７８０，２２５号、同第５，６５８，７２７号、同第５，７３３，７４３号、および同第５，９６９，１０８号。
上記の参考文献に記載されるように、ファージ選択後、ファージからの抗体コード領域は、例えば、以下に記載されるように、単離され、ヒト抗体を含む全体の抗体または任意の他の所望の抗原結合フラグメントを生成するために使用され、そして哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母、および細菌を含む任意の所望の宿主の中で発現される。Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２フラグメントを組み換えにより産生するための技術もまた、国際出願番号ＷＯ９２／２２３２４；Mullinaxら、１９９２，BioTechniques １２（６）：８６４−８６９；Sawaiら、１９９５，AJRI ３４：２６−３４；およびBetterら、１９８８，Science ２４０：１０４１−１０４３に開示されるものなどの当該分野で公知の方法を使用して利用することができる（当該参考文献はそれらの全体が参照により援用される）。
全体の抗体を生成するために、ＶＨまたはＶＬヌクレオチド配列、制限部位、および制限部位を保護するための隣接配列を含むＰＣＲプライマーが、ｓｃＦｖクローン中のＶＨまたはＶＬ配列を増幅するために使用することができる。当業者に公知であるクローニング技術を利用して、ＰＣＲ増幅されたＶＨドメインは、ＶＨ定常領域、例えば、ヒトγ４定常領域を発現するベクターにクローニングすることができ、そしてＰＣＲ増幅されたＶＬドメインは、ＶＬ定常領域、例えば、ヒトκまたはλ定常領域を発現するベクターにクローニングすることができる。好ましくは、ＶＨドメインまたはＶＬドメインを発現するためのベクターは、ＥＦ−１αプロモーター、分泌シグナル、可変ドメイン、定常ドメイン、およびネオマイシンなどの選択マーカーのためのクローニング部位を含む。ＶＨドメインおよびＶＬドメインはまた、必要な定常領域を発現する１つのベクターにクローニングされてもよい。次いで、重鎖転換ベクターおよび軽鎖転換ベクターが、当業者に公知の技術を使用して、細胞株に同時トランスフェクトされ、全長抗体、例えば、ＩｇＧを発現する安定なまたは一過性の細胞株を生成する。
ヒトにおける抗体のインビボ使用およびインビトロ検出アッセイを含む、ある使用において、ヒト抗体またはキメラ抗体を使用することが好ましい可能性がある。完全なヒト抗体は、ヒト被験体の治療的処置のために特に所望される。ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン配列から誘導された抗体ライブラリーを使用して、上記のファージディスプレイ法を含む当該分野で公知である種々の方法によって作製することができる。米国特許第４，４４４，８８７号および同第４，７１６，１１１号；ならびに国際公開番号ＷＯ９８／４６６４５、同ＷＯ９８／５０４３３、同ＷＯ９８／２４８９３、同ＷＯ９８／１６６５４、同ＷＯ９６／３４０９６、同ＷＯ９６／３３７３５、および同ＷＯ９１／１０７４１もまた参照のこと。これらは各々その全体が参照により本明細書に援用される。
抗体はまた、トランスジェニック動物によって産生させることができる。特に、ヒト抗体は、機能的内因性免疫グロブリンを発現することが不可能であるが、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現することができるトランスジェニックマウスを使用して産生することができる。例えば、重鎖および軽鎖免疫グロブリン遺伝子複合体は、ランダムにまたは相同組み換えによって、マウス胚性幹細胞に導入されてもよい。代替的には、ヒト可変領域、定常領域、および多様な領域が、ヒト重鎖および軽鎖遺伝子に加えて、マウス胚性幹細胞に導入されてもよい。マウス重鎖および軽鎖免疫グロブリン遺伝子は、相同組み換えによるヒト免疫グロブリン遺伝子座の導入とは個別に、またはそれと同時に、機能しないようにしてもよい。特に、ＪＨ領域の同型の欠失は内因性抗体産生を妨害する。修飾された胚性幹細胞は増大され、胚盤胞に微量注入されてキメラマウスを産生する。次いで、キメラマウスは繁殖され、ヒト抗体を発現する同型の子孫を生じる。トランスジェニックマウスは、選択された抗原、例えば、本発明のポリペプチドのすべてまたは一部を用いて通常の様式で免疫される。抗原に対して指向されるモノクローナル抗体は、従来のハイブリドーマ技術を使用して、免疫したトランスジェニックマウスから得ることができる。トランスジェニックマウスによって保有されるヒト免疫グロブリン導入遺伝子は、Ｂ細胞分化の間に再編成し、続いてクラススイッチングおよび体細胞変異を受ける。従って、このような技術を使用して、治療的に有用なＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭおよびＩｇＥ抗体を産生することが可能である。ヒト抗体を産生するためのこの技術の概要を見る場合は、LonbergおよびHuszar（１９９５，Int.Rev.Immunol.１３：６５−９３）を参照のこと。ヒト抗体およびヒトモノクローナル抗体を産生するためのこの技術、およびこのような抗体を産生するためのプロトコールの詳細な議論については、例えば、国際公開番号ＷＯ９８／２４８９３、同ＷＯ９６／３４０９６、および同ＷＯ９６／３３７３５；ならびに米国特許第５，４１３，９２３号、同第５，６２５，１２６号、同第５，６３３，４２５号、同第５，５６９，８２５号、同第５，６６１，０１６号、同第５，５４５，８０６号、同第５，８１４，３１８号、および同第５，９３９，５９８号を参照のこと。これらはそれらの全体が参照により本明細書に援用される。加えて、Abgenix,Inc.（Freemont，カリフォルニア）およびGenpharm（San Jose，カリフォルニア）などの会社が、上記のものと類似の技術を使用して、選択された抗原に対して指向されるヒト抗体を提供するために従事すること可能である。
米国特許第５，８４９，９９２号は、例えば、トランスジェニック動物の乳腺中で抗体を発現する方法を記載している。乳特異的プロモーター、および目的の抗体をコードする核酸、および分泌のためのシグナル配列を含む導入遺伝子が構築される。このようなトランスジェニック動物の雌によって産生される乳は、そこに分泌された目的の抗体を含む。この抗体は乳から精製することができ、またはある応用においては、直接的に使用することができる。
キメラ抗体は、抗体の異なる部分が異なる免疫グロブリン分子から誘導される分子である。キメラ抗体を産生するための方法は当該分野で公知である。例えば、Morrison，１９８５，Science ２２９：１２０２；Oiら、１９８６，BioTechniques ４：２１４；Gilliesら、１９８９，J.Immunol.Methods １２５：１９１−２０２；ならびに米国特許第５，８０７，７１５号、同第４，８１６，５６７号、同第４，８１６，３９７号、および同第６，３３１，４１５号を参照のこと。これらはそれらの全体が参照により本明細書に援用される。
ヒト化抗体は、所定の抗原に結合可能であり、そしてヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を実質的に有するフレームワーク領域、および非ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を実質的に有するＣＤＲを含む、抗体またはその変異体またはフラグメントである。ヒト化抗体は、少なくとも１つ、および典型的には２つの可変ドメイン（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂｃ、Ｆｖ）のすべてを実質的に含み、ここで、すべてまたは実質的にすべてのＣＤＲ領域は非ヒト免疫グロブリン（すなわち、ドナー抗体）のそれに対応し、そしてすべてまたは実質的にすべてのフレームワーク領域はヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のそれである。好ましくは、ヒト化抗体はまた、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリンのそれを含む。通常、抗体は、軽鎖ならびに少なくとも重鎖の可変ドメインの両方を含む。抗体はまた、重鎖のＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、およびＣＨ４領域を含んでもよい。ヒト化抗体は、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＥを含む免疫グロブリンの任意のクラス、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を含む任意のアイソタイプから選択することができる。通常、定常ドメインは、ヒト化抗体が細胞毒性活性を示すことが所望される場合、補体結合定常ドメインであり、そしてクラスは典型的にはＩｇＧ１である。このような細胞毒性活性が所望されない場合、定常ドメインはＩｇＧ２クラスであり得る。ヒト化抗体は、１つより多くのクラスまたはアイソタイプからの配列を含んでもよいが、所望のエフェクター機能を最適化するために特定の定常ドメインを選択することは、当業者の範囲内である。ヒト化抗体のフレームワークおよびＣＤＲ領域は、親の配列に対して正確に一致する必要はなく、例えば、ドナーＣＤＲまたはコンセンサスフレームワークは、少なくとも１つの残基の置換、挿入、または欠失によって変異されてもよく、その結果、その部位におけるＣＤＲまたはフレームワーク残基は、コンセンサスまたはインポート抗体のいずれにも一致しない。しかし、このような変異は広範囲ではない。通常、ヒト化抗体残基の少なくとも７５％、より頻繁には９０％、および最も好ましくは９５％より多くが、親のＦＲおよびＣＤＲ配列のそれに一致する。ヒト化抗体は、以下を含むがこれらに限定されない、当該分野で公知である種々の技術を使用して産生することができる：ＣＤＲ移植（欧州特許第ＥＰ２３９，４００号；国際公開番号ＷＯ９１／０９９６７；および米国特許第５，２２５，５３９号、同第５，５３０，１０１号、同第５，５８５，０８９号）、ベニアリングまたは再表面化（欧州特許第ＥＰ５９２，１０６号および同第ＥＰ５１９，５９６号；Padlan，１９９１，Molecular Immunology ２８（４／５）：４８９−４９８；Studmckaら、１９９４，Protein Engineering ７（６）：８０５−８１４；およびRoguskaら、１９９４，PNAS ９１：９６９−９７３）、チェーンシャッフリング（米国特許第５，５６５，３３２号）、ならびに例えば、米国特許第６，４０７，２１３号、米国特許第５，７６６，８８６号、ＷＯ９３１７１０５、Tanら、２００２，J.Immunol.１６９：１１１９−２５、Caldasら、２０００，Protein Eng.１３（５）：３５３−６０、Moreaら、２０００，Methods ２０（３）：２６７−７９、Bacaら、１９９７，J.Biol.Chem.２７２（１６）：１０６７８−８４、Roguskaら、１９９６，Protein Eng. ９（１０）：８９５−９０４、Coutoら、１９９５，Cancer Res. ５５（２３補遺）：５９７３ｓ−５９７７ｓ、Coutoら、１９９５，Cancer Res. ５５（８）：１７１７−２２、Sandhu JS，１９９４，Gene １５０（２）：４０９−１０、およびPedersenら、１９９４，J.Mol.Biol.２３５（３）：９５９−７３に開示される技術。しばしば、フレームワーク領域中のフレームワーク残基は、抗原結合を変化させるため、好ましくは、改善するために、ＣＤＲドナー抗体から対応する残基で置換される。これらのフレームワーク置換は、当該分野で周知の方法によって、例えば、特定の位置における例外的なフレームワーク残基を同定するために、抗原結合のために重要なフレームワーク残基を同定するためのＣＤＲおよびフレームワーク残基の相互作用のモデリングならびに配列比較によって同定される（例えば、Queenら、米国特許第５，５８５，０８９号；およびRiechmannら、１９８８，Nature ３３２：３２３を参照のこと、これらはそれらの全体が参照により本明細書に援用される）。
単一ドメイン抗体、例えば、軽鎖を欠く抗体は、当該分野で周知である方法によって産生することができる。Riechmannら、１９９９，J.Immuno.２３１：２５−３８；Nuttallら、２０００，Curr.Pharm.Biotechnol. １（３）：２５３−２６３；Muylderman，２００１，J.Biotechnol. ７４（４）：２７７３０２；米国特許第６，００５，０７９号；ならびに国際公開番号ＷＯ９４／０４６７８、同ＷＯ９４／２５５９１、および同ＷＯ０１／４４３０１を参照のこと。これらは各々その全体が参照により本明細書に援用される。
さらに、抗原に特異的に結合する抗体は、次には、当業者に周知の技術を使用して抗原を「模倣する」抗イディオタイプ抗体を生成するために利用することができる（例えば、Greenspan & Bona，１９８９，FASEB J. ７（５）：４３７−４４４；およびNissinoff，１９９１，J.Immunol.１４７（８）：２４２９−２４３８を参照のこと）。このような抗体は、膀胱癌またはその症状の予防、治療、管理、または改善の際に、単独でまたは他の治療と併用して使用することができる。
本発明は、抗原に特異的に結合する抗体またはそのフラグメントをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを含む。本発明はまた、高ストリンジェンシー、中程度のストリンジェンシー、またはより低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下で、本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む。
当該分野で公知である任意の方法によって、ポリヌクレオチドは入手され、そしてポリヌクレオチドのヌクレオチド配列は決定されてもよい。公知の抗体をコードするヌクレオチド配列は、当該分野で周知である方法を使用して決定することができ、すなわち、特定のアミノ酸をコードすることが知られているヌクレオチドコドンは、抗体をコードするアミノ酸を生成するのと同様の方法でアセンブルされる。抗体をコードするこのようなポリヌクレオチドは、化学合成されたオリゴヌクレオチドからアセンブルされてもよく（例えば、Kutmeierら、１９９４，BioTechniques １７：２４２に記載されるように）、これは、手短に述べると、抗体、そのフラグメント、または変異体をコードする配列の一部を含む重複するオリゴヌクレオチドの合成、アニーリング、およびこれらのオリゴヌクレオチドのライゲーション、ならびに次いで、ＰＣＲによるライゲーションしたオリゴヌクレオチドの増幅を含む。
代替的には、抗体をコードするポリヌクレオチドは、適切な供給源からの核酸から生成されてもよい。特定の抗体をコードする核酸を含むクローンが利用可能でないが、しかし抗体分子の配列が知られている場合、免疫グロブリンをコードする核酸は、化学合成されてもよく、または、配列の３’末端および５’末端にハイブリダイズ可能な合成プライマーを使用するＰＣＲ増幅によって、もしくは例えば、抗体をコードするｃＤＮＡライブラリーからのｃＤＮＡクローンを同定するために特定の遺伝子配列に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを使用するクローニングによって、適切な供給源（例えば、抗体ｃＤＮＡライブラリー、または抗体を発現する任意の組織もしくは細胞、例えば、本発明の抗体を発現するために選択されるハイブリドーマ細胞から生成されたｃＤＮＡライブラリー、もしくはそこから単離された核酸、好ましくはポリＡ＋ＲＮＡ）から入手してもよい。次いで、ＰＣＲによって生成された増幅された核酸は、当該分野において周知である任意の方法を使用して複製可能なクローニングベクターにクローニングされてもよい。
一旦、抗体のヌクレオチド配列が決定されると、抗体のヌクレオチド配列は、異なるアミノ酸配列を有する抗体を産生するために、例えば、アミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を操作するために、ヌクレオチド配列の操作のために当該分野で周知である方法、例えば、組み換えＤＮＡ技術、部位特異的変異誘発、ＰＣＲなど（例えば、Sambrookら、１９９０，分子クローニング：実験室マニュアル、第２版（Molecular Cloning,A Laboratory Manual），Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，ニューヨークおよびAusubelら編、１９９８，分子生物学の現在のプロトコール（Current Protocols in Molecular Biology），John Wiley & Sons，ニューヨークに記載される技術を参照のこと、これらは両方ともそれらの全体が参照により本明細書に援用される）を使用して操作されてもよい。
一旦、本発明の抗体分子、抗体の重鎖もしくは軽鎖、またはそのフラグメント（好ましくは、しかし必須ではないが、重鎖または軽鎖の可変ドメインを含む）が得られると、抗体分子産生のためのベクターが、当該分野において周知である技術を使用する組み換えＤＮＡ技術によって産生されてもよい。
１つの好ましい実施形態において、モノクローナル抗体は哺乳動物細胞中で産生される。クローン抗体またはその抗原結合フラグメントを発現するために好ましい哺乳動物宿主細胞には、例えば、KaufmanおよびSharp（１９８２，Mol.Biol.１５９：６０１−６２１）において記載されるような、ＤＨＦＲ選択マーカーとともに使用されるチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（UrlaubおよびChasin（１９８０，Proc.Natl.Acad.Sci.USA ７７：４２１６−４２２０）に記載されるｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞を含む）、リンパ球細胞株、例えば、ＮＳ０ミエローマ細胞およびＳＰ２細胞、ＣＯＳ細胞、およびトランスジェニック動物、例えば、トランスジェニック哺乳動物からの細胞が含まれる。例えば、細胞は、哺乳動物の上皮細胞である。
多様な免疫グロブリンドメインをコードする核酸配列に加えて、組み換え発現ベクターは、さらなる配列、例えば、宿主細胞中のベクターの複製を調節する配列（例えば、複製起点）および選択マーカー遺伝子配列を有してもよい。選択マーカー遺伝子は、ベクターが導入された宿主細胞の選択を容易にする（例えば、米国特許第第４，３９９，２１６号、同第４，６３４，６６５号、および同５，１７９，０１７号を参照のこと）。例えば、典型的には、選択マーカー遺伝子は、ベクターが導入された宿主細胞に、Ｇ４１８、ハイグロマイシン、またはメトトレキサートなどの薬物に対する耐性を付与する。好ましい選択マーカー遺伝子には、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子（メトトレキサート選択／増幅を伴うｄｈｆｒ−宿主細胞における使用のため）およびｎｅｏ遺伝子（Ｇ４１８選択のため）が含まれる。
本発明の抗体またはその抗原結合部分の組み換え発現のための例示的な系において、抗体重鎖と抗体軽鎖の両方をコードする組み換え発現ベクターが、リン酸カルシウム媒介トランスフェクションによって、ｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞に導入される。組み換え発現ベクターの中で、抗体重鎖および軽鎖遺伝子は、高いレベルの遺伝子の転写を駆動するために、各々、エンハンサー／プロモーター調節エレメント（例えば、ＳＶ４０、ＣＭＶ、アデノウイルスなどから誘導され、例えば、ＣＭＶエンハンサー／ＡｄＭＬＰプロモーター調節エレメントまたはＳＶ４０エンハンサー／ＡｄＭＬＰプロモーター調節エレメントである）に操作可能に連結される。組み換え発現ベクターはまたＤＨＦＲ遺伝子を有し、これは、メトトレキサート選択／増幅を使用して、ベクターでトランスフェクトされたＣＨＯ細胞の選択を可能にする。選択された形質転換体宿主細胞は、抗体重鎖および軽鎖の発現を可能にするために培養され、インタクトな抗体が培養培地から回収される。標準的な分子生物学技術が、組み換え発現ベクターを調製し、宿主細胞をトランスフェクトし、形質転換体を選択し、宿主細胞を培養し、そして培養培地から抗体を回収するために使用される。例えば、ある抗体は、プロテインＡまたはプロテインＧを用いるアフィニティークロマトグラフィーによって単離することができる。
Ｆｃドメインを含む抗体については、抗体産生系は、好ましくは、Ｆｃ領域がグリコシル化されている抗体を合成する。例えば、ＩｇＧ分子のＦｃドメインは、ＣＨ２ドメイン中のアスパラギン２９７においてグリコシル化される。このアスパラギンは、二分岐型オリゴサッカリドを用いる修飾のための部位である。このグリコシル化が、Ｆｃ□受容体および補体Ｃ１ｑによって媒介されるエフェクター機能のために必要とされることが実証されている（BurtonおよびWoof，１９９２，Adv.Immunol. ５１：１−８４；Jefferisら、１９９８，Immunol.Rev.１６３：５９−７６））。好ましい実施形態において、Ｆｃドメインは、アスパラギン２９７に対応する残基を適切にグリコシル化する哺乳動物発現系中で産生される。Ｆｃドメインはまた、他の真核生物翻訳後修飾を含むことができる。
一旦、抗体分子が組み換え発現によって産生されると、これは、免疫グロブリン分子の精製のための当該分野で公知である任意の方法によって、例えば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティー、特にプロテインＡに特異的である抗原についての親和性によるアフィニティー、およびサイズ分画カラムクロマトグラフィー）、遠心分離、溶解度の違いによって、またはタンパク質の精製のための任意の他の標準的な技術によって精製されてもよい。さらに、抗体またはそのフラグメントは、精製を容易にするために、当該分野で公知である異種ポリペプチド配列に融合されてもよい。
遺伝子治療技術
遺伝子治療は、発現されたか、または発現可能な核酸の被験体への投与によって実施される治療をいう。当該分野において利用可能な遺伝子治療のための任意の治療を、本発明に従って使用することができる。例示的な方法は以下に記載される。
特定の実施形態において、本発明の１種以上のバイオマーカーについての１種以上のアンチセンスオリゴヌクレオチドが、遺伝子治療によって膀胱癌またはその症状を予防、治療、管理、または改善するために投与される。別の実施形態において、本発明の１種以上のバイオマーカーの１種以上のタンパク質産物に特異的に結合する１種以上の抗体をコードするヌクレオチドを含む１種以上の核酸分子は、遺伝子治療によって膀胱癌またはその症状を予防、治療、管理、または改善するために投与される。別の実施形態において、本発明の１種以上のバイオマーカーまたはそのアナログ、誘導体、もしくはフラグメントのタンパク質産物をコードするヌクレオチドを含む１種以上の核酸分子は、遺伝子治療によって膀胱癌またはその症状を予防、治療、管理、または改善するために投与される。さらに別の実施形態において、本発明の１種以上のバイオマーカーの１種以上のタンパク質産物の１種以上のドミナントネガティブポリペプチドをコードするヌクレオチドを含む１種以上の核酸分子は、遺伝子治療によって膀胱癌またはその症状を予防、治療、管理、または改善するために投与される。
遺伝子治療の方法の一般的な書評については、Goldspielら、１９９３，Clinical Pharmacy １２：４８８−５０５；WuおよびWu，１９９１，Biotherapy ３：８７−９５；Tolstoshev，１９９３，Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol. ３２：５７３−５９６；Mulligan，１９９３，Science ２６０：９２６−９３２；ならびにMorganおよびAnderson，１９９３，Ann.Rev.Biochem. ６２：１９１−２１７；１９９３，５月、TIBTECH １１（５）：１５５−２１５）を参照のこと。使用することができる組み換えＤＮＡ技術の分野において一般的に公知である方法は、Ausubelら（編）、１９９３，分子生物学の現在のプロトコール（Current Protocols in Molecular Biology），John Wiley & Sons，ニューヨーク；およびKriegler，１９９０，遺伝子移入および発現、実験室マニュアル（Gene Transfer and Expression,A Laboratory Manual），Stockton Press，ニューヨークに記載されている。
１つの態様において、本発明の組成物は、本発明の１種以上のバイオマーカーの１種以上のタンパク質産物に特異的に結合する１種以上の抗体をコードする核酸配列を含み、当該核酸配列は、適切な宿主の中で１種以上の抗体を発現する発現ベクターの一部である。特に、このような核酸配列は抗体に操作可能に連結されたプロモーターを有し、当該プロモーターは、誘導可能にまたは構成的、そして場合により組織特異的である。
別の態様において、本発明の組成物は、本発明の１種以上のバイオマーカーの１種以上のタンパク質産物のドミナントネガティブポリペプチドをコードする核酸配列を含み、当該核酸配列は、適切な宿主の中でドミナントネガティブポリペプチドを発現する発現ベクターの一部である。特に、このような核酸配列はドミナントネガティブポリペプチドに操作可能に連結されたプロモーターを有し、当該プロモーターは、誘導可能にまたは構成的、そして場合により組織特異的である。別の特定の実施形態において、ドミナントネガティブコード配列および任意の他の所望の配列が、ゲノム中の所望の位置において相同組み換えを促進する領域によって隣接されている核酸分子が使用され、従って、ドミナントネガティブ核酸の染色体内発現を提供する（KollerおよびSmithies，１９８９，Proc.Natl.Acad.Sci.USA ８６：８９３２−８９３５；Zijlstraら、１９８９，Nature ３４２：４３５−４３８）。
患者への核酸の送達は、直接的であってもよく、この場合、患者は核酸または核酸保有ベクターに直接的に曝露され、または間接的であってもよく、この場合、細胞はインビトロで核酸において形質転換され、次いで患者に移植されるかのいずれかである。これらの２つのアプローチは、それぞれ、インビボまたはエキソビボ遺伝子治療として知られている。
特定の実施形態において、核酸配列は、インビボで直接的に投与され、ここでは核酸が発現されてコードされた産物を産生する。これは、当該分野で公知である任意の多数の方法によって、例えば、適切な核酸発現ベクターの一部としてこれを構築し、その結果、これらが細胞内になることによって、例えば、欠損性もしくは弱毒化レトロウイルスもしくは他のウイルスベクターを使用する感染によって（例えば、米国特許第４，９８０，２８６号を参照のこと）、または裸のＤＮＡの直接的注入によって、または微粒子ボンバードメントの使用によって（例えば、遺伝子銃；Biolistic，Dupont）、または脂質もしくは細胞表面受容体もしくはトランスフェクション剤でコートすること、リポソーム、微粒子、もしくはマイクロカプセル中でのカプセル化、または核に入ることが知られているペプチドに連結させてこれを投与することによって、受容体媒介エンドサイトーシスを受けるリガンドに連結してこれを投与すること（例えば、WuおよびWu，１９８７，J.Biol.Chem.２６２：４４２９−４４３２を参照のこと）（これは、受容体を特異的に発現する細胞型を標的とするために使用することができる）によって、などによって達成することができる。別の実施形態において、リガンドがエンドソームを破壊するために融合性ウイルスペプチドを含み、核酸がリソソーム分解を回避することを可能にする核酸−リガンド複合体を形成することができる。さらに別の実施形態において、核酸は、特異的受容体を標的とすることによって、細胞特異的な取り込みおよび発現のためにインビボで標的化することができる（例えば、国際公開番号ＷＯ９２／０６１８０ １９９２年４月１６日（Wuら）；ＷＯ９２／２２６３５ １９９２年１２月２３日（Wilsonら）；ＷＯ９２／２０３１６ １９９２年１１月２６日（Findeisら）；ＷＯ９３／１４１８８ １９９３年７月２２日（Ｃｌａｒｋｅら）、ＷＯ９３／２０２２１ １９９３年１０月１４日（Youngら）を参照のこと）。代替的には、核酸は、相同組み換えによって、発現のために、細胞内に導入され、そして宿主細胞ＤＮＡ中に組み込まれることができる（KollerおよびSmithies，１９８９，Proc.Natl.Acad.Sci.USA ８６：８９３２−８９３５；Zijlstraら、１９８９，Nature ３４２：４３５−４３８）。
例えば、レトロウイルスベクターを使用することができる。これらのレトロウイルスベクターは、ウイルスゲノムへのパッケージングのため、および宿主細胞ＤＮＡへの組み込みのために必要ではないレトロウイルス配列を除外するように改変されている。遺伝子治療において使用される、目的の抗体、または目的のタンパク質もしくはそのフラグメントをコードする核酸配列が、患者への遺伝子の送達を容易にする、１種以上のベクターにクローニングされる。レトロウイルスベクターに関するさらなる詳細は、Boesenら、１９９４，Biotherapy ６：２９１−３０２において見出すことができ、これは、造血幹細胞を化学療法に対してより抵抗性にするために、その幹細胞にｍｄｒ１遺伝子を送達するためのレトロウイルスベクターの使用を記載する。遺伝子治療におけるレトロウイルスベクターの使用を例示している他の参考文献は以下である：Clowesら、１９９４，J.Clin.Invest.９３：６４４−６５１；Kiemら、１９９４，Blood ８３：１４６７−１４７３；SalmonsおよびGunzberg，１９９３，Human Gene Therapy ４：１２９−１４１；ならびにGrossmanおよびWilson，１９９３，Curr.Opin.in Genetics and Devel. ３：１１０−１１４。
アデノウイルスは、遺伝子治療において使用することができる他のウイルスベクターである。アデノウイルスは、呼吸上皮に遺伝子を送達するためにとりわけ魅力的な媒体である。アデノウイルスは、天然で呼吸上皮に感染し、そこで軽度の疾患を引き起こす。アデノウイルスベースの送達系についての他の標的は肝臓、中枢神経系、内皮細胞、および筋肉である。アデノウイルスは、分裂していない細胞に感染することができる利点を有する。KozarskyおよびWilson，１９９３，Current Opinion in Genetics and Development ３：４９９−５０３は、アデノウイルスベースの遺伝子治療の書評を提示する。Boutら、１９９４，Human Gene Therapy ５：３−１０は、アカゲザルの呼吸上皮に遺伝子を移入するためのアデノウイルスベクターの使用を実証した。遺伝子治療におけるアデノウイルスの使用の他の例は、Rosenfeldら、１９９１，Science ２５２：４３１−４３４；Rosenfeldら、１９９２，Cell ６８：１４３−１５５；Mastrangeliら、１９９３，J.Clin.Invest.９１：２２５−２３４；ＰＣＴ公開ＷＯ９４／１２６４９；およびWangら、１９９５，Gene Therapy ２：７７５−７８３において見出すことができる。好ましい実施形態において、アデノウイルスベクターが使用される。
アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）もまた、遺伝子治療における使用について提案されてきた（Walshら、１９９３，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.２０４：２８９−３００；米国特許第５，４３６，１４６号）。
遺伝子治療に対する別のアプローチは、エレクトロポレーション、リポフェクション、リン酸カルシウム媒介トランスフェクション、またはウイルス感染のような方法によって、組織培養中の細胞に遺伝子を移入することを含む。通常、移入の方法は、細胞への選択マーカーの移入を含む。次いで、細胞は、移入された遺伝子を取り込みかつそれを発現する細胞を単離するための選択下に配置される。次いで、これらの細胞は患者に送達される。
この実施形態において、核酸は、得られる組み換え細胞のインビボでの投与の前に細胞に導入される。このような導入は、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、核酸配列を含むウイルスまたはバクテリオファージベクターでの感染、細胞融合、染色体媒介遺伝子移入、マイクロセル媒介遺伝子移入、スフェロプラスト融合などを含むがこれらに限定されない、当該分野で公知である任意の方法によって実行することができる。細胞への外来性遺伝子の導入のための多数の技術が公知であり（例えば、LoefflerおよびBehr，１９９３，Meth.Enzymol. ２１７：５９９−６１８；Cohenら、１９９３，Meth.Enzymol. ２１７：６１８−６４４；Cline，１９８５，Pharmac.Ther. ２９：６９−９２を参照のこと）、レシピエント細胞の必要な発生的および生理学的機能が破壊されていない場合は、本発明に従って使用されてもよい。これらの技術は、細胞への核酸の安定な移入を提供するはずであり、その結果、核酸は、細胞によって発現可能であり、好ましくは遺伝性であり、その細胞子孫によって発現可能である。
得られる組み換え細胞は、当該分野で公知である種々の方法によって患者に送達することができる。組み換え血液細胞（例えば、造血幹細胞または前駆細胞）および／または軟骨細胞は、好ましくは、静脈内投与される。使用のために想定される細胞の量は、所望の効果、患者の状態などに依存し、当業者によって決定することができる。
核酸を遺伝子治療の目的のために導入することができる細胞には、任意の所望される、利用可能な細胞型が含まれ、これには以下が含まれるがこれらに限定されない：上皮細胞、内皮細胞、ケラチノサイト、軟骨細胞、線維芽細胞、筋肉細胞、肝細胞；Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、単球、マクロファージ、好中球、好酸球、巨核球、顆粒球などの血液細胞；例えば、骨髄、臍帯血、末梢血、胎児肝臓などから得られるような種々の幹細胞または前駆細胞、特に造血幹細胞または前駆細胞。
好ましい実施形態において、遺伝子治療のために使用される細胞は、患者において自己由来のものである。
組み換え細胞が遺伝子治療において使用される１つの実施形態において、目的の抗体、または目的のタンパク質またはそのフラグメントをコードする核酸配列は、これらが細胞またはそれらの子孫によって発現可能であるように細胞に導入され、次いで、組み換え細胞が治療効果を得るためにインビボで投与される。特定の実施形態において、幹細胞または前駆細胞が使用される。単離することができ、かつインビトロで維持することができる任意の幹細胞および／または前駆細胞が、本発明のこの実施形態に従って使用できる可能性を有している（例えば、国際公開番号ＷＯ９４／０８５９８、１９９４年４月２８日；StempleおよびAnderson，１９９２，Cell ７１：９７３−９８５；Rheinwald，１９８０，Meth.Cell Bio. ２１Ａ：２２９；およびPittelkowおよびScott，１９８６，Mayo Clinic Proc. ６１：７７１を参照のこと）。
目的の抗体、目的のタンパク質またはそのフラグメントをコードする核酸配列の発現を制御するために使用されてもよいプロモーターは、構成的、誘導可能、または組織特異的であってもよい。非限定的な例には以下が含まれる：ＳＶ４０初期プロモーター領域（BernoistおよびChambon，１９８１，Nature ２９０：３０４−３１０）、ラウス肉腫ウイルスの３’長末端反復に含まれるプロモーター（Yamamotoら、１９８０，Cell ２２：７８７−７９７）、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Wagnerら、１９８１，Proc.Natl.Acad.Sci.USA ７８：１４４１−１４４５）、メタロチオネイン遺伝子の調節配列（Brinsterら、１９８２，Nature ２９６：３９−４２）；β−ラクタマーゼプロモーターなどの原核生物発現ベクター（Villa-Kamaroffら、１９７８，Proc.Natl.Acad.Sci.USA ７５：３７２７−３７３１）、またはｔａｃプロモーター（DeBoerら、１９８３，Proc.Natl.Acad.Sci.USA ８０：２１−２５）；以下もまた参照のこと：「組み換え細菌からの有用なタンパク質（Useful proteins from recombinant bacteria）」Scientific American，１９８０，２４２：７４−９４所収；ノパリンシンテターゼプロモーター領域を含む植物発現ベクター（Herrera-Estrellaら、Nature ３０３：２０９−２１３）またはカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ ＲＮＡプロモーター（Gardnerら、１９８１，Nucl.Acids Res.９：２８７１）、および光合成酵素リブロース二リン酸カルボキシラーゼのプロモーター（Herrera-Estrellaら、１９８４，Nature ３１０：１１５−１２０）；Ｇａｌ ４プロモーターのような酵母もしくは他の真菌からのプロモーターエレメント、ＡＤＣ（アルコールデヒドロゲナーゼ）プロモーター、ＰＧＫ（ホスホグリセロールキナーゼ）プロモーター、アルカリホスファターゼプロモーター、およびトランスジェニック動物において組織特異性を示し、かつ利用されてきた以下の動物転写制御領域：膵腺房細胞において活性であるエラスターゼＩ遺伝子制御領域（Swiftら、１９８４，Cell ３８：６３９−６４６；Ornitzら、１９８６，Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol. ５０：３９９−４０９；MacDonald，１９８７，Hepatology ７：４２５−５１５）；膵臓β細胞において活性であるインスリン遺伝子制御領域（Hanahan，１９８５，Nature ３１５：１１５−１２２）、リンパ細胞において活性である免疫グロブリン遺伝子制御領域（Grosschedlら、１９８４，Cell ３８：６４７−６５８；Adamesら、１９８５，Nature ３１８：５３３−５３８；Alexanderら、１９８７，Mol.Cell.Biol.７：１４３６−１４４４）、精巣、乳房、リンパ、および肥満細胞において活性であるマウス乳房腫瘍ウイルス制御領域（Lederら、１９８６，Cell ４５：４８５−４９５）、肝臓において活性であるアルブミン遺伝子制御領域（Pinkertら、１９８７，Genes and Devel.１：２６８−２７６）、肝臓において活性であるα−フェトプロテイン遺伝子制御領域（Krumlaufら、１９８５，Mol.Cell.Biol. ５：１６３９−１６４８；Hammerら、１９８７，Science ２３５：５３−５８）；肝臓において活性であるα１−アンチトリプシン遺伝子制御領域（Kelseyら、１９８７，Genes and Devel. １：１６１−１７１）、骨髄細胞において活性であるβ−グロビン遺伝子制御領域（Mogramら、１９８５，Nature ３１５：３３８−３４０；Kolliasら、１９８６，Cell ４６：８９−９４）；脳の乏突起膠細胞において活性であるミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域（Readheadら、１９８７，Cell ４８：７０３−７１２）；骨格筋において活性であるミオシン軽鎖−２遺伝子制御領域（Sani，１９８５，Nature ３１４：２８３−２８６）、および視床下部において活性である性腺刺激ホルモン放出ホルモン制御領域（Masonら、１９８６，Science ２３４：１３７２−１３７８）。
特定の実施形態において、遺伝子治療の目的のために導入される核酸は、核酸の発現が転写の適切なインデューサーの存在または非存在を制御することによって制御可能であるように、コード領域に操作可能に連結された誘導可能なプロモーターを含む。
５．２０ 医薬組成物
本発明の方法を使用して同定される生物学的に活性な化合物またはその医薬的に許容し得る塩は、膀胱癌に罹患している被験体、好ましくは、哺乳動物、より好ましくは、ヒトに投与することができる。特定の実施形態において、化合物またはその医薬的に許容し得る塩は、以下の膀胱癌および／または早期の膀胱癌に罹患している患者、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトに投与される。別の実施形態において、化合物またはその医薬的に許容し得る塩は、膀胱癌に対する予防的手段として、患者、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトに投与される。これらの実施形態に従って、患者は子供、成人、または高齢者であってもよく、ここで「子供」は２４ヶ月齢から１８歳の齢の被験体、「成人」は１８歳以上の年齢の被験体、および「高齢者」は６５歳以上の年齢の被験体である。
患者に投与されるとき、化合物またはその医薬的に許容し得る塩は、好ましくは、任意に医薬的に許容し得る媒体を含む組成物の成分として投与される。この組成物は、経口で、または任意の他の便利な経路によって、例えば、注入またはボーラス注射によって、上皮または皮膚粘膜裏層（例えば、口腔粘膜、直腸、および腸粘膜など）を通しての吸収によって投与されてもよく、そして別の生物学的に活性な薬剤と一緒に投与されてもよい。投与は、全身性または局所的であり得る。種々の送達系、例えば、リポソーム、微粒子、マイクロカプセル、カプセルなどの中でのカプセル化が公知であり、化合物およびその医薬的に許容し得る塩を送達するために使用することができる。
投与の方法には、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻内、硬膜外、経口、舌下、鼻内、脳内、膣内、経皮、直腸、吸入により、または局所的に、特に、耳に、鼻に、眼に、もしくは皮膚に、が含まれるがこれらに限定されない。投与の様式は、実務者の裁量に任されている。多くの例において、投与は、化合物またはその医薬的に許容し得る塩の血流への放出を生じる。
特定の実施形態において、化合物またはその医薬的に許容し得る塩を局所的に投与することが所望され得る。これは、例えば、しかし限定ではなく、手術の際の局所的注入、局所的適用、例えば、手術後に創傷包帯とともに、注射によって、カテーテルによって、坐剤によって、または移植物によって達成されてもよく、当該移植物は、シアラスティック（sialastic）メンブレンなどのメンブレンまたは繊維を含む、多孔性、非多孔性、またはゼラチン質材料である。
特定の実施形態において、化合物またはその医薬的に許容し得る塩を、脳室内、くも膜下腔内、および硬膜外の注射を含む任意の適切な経路によって、中枢神経系に導入することが所望され得る。脳室内注射は、例えば、Ommayaリザーバーなどのリザーバーに接続した脳室内カテーテルによって容易にされてもよい。
肺投与もまた、例えば、吸入器または噴霧器、およびエアロゾル剤を有する製剤の使用によって、またはフルオロカーボンもしくは合成肺界面活性物質中での灌流を介して、利用することができる。特定の実施形態において、化合物およびその医薬的に許容し得る塩は、旧来の結合剤および媒体、例えば、トリグリセリドを用いて、坐剤として製剤化することができる。
別の実施形態において、化合物およびその医薬的に許容し得る塩は、ベシクル中で、特にリポソーム中で送達することができる（以下を参照のこと：感染性疾患および癌の治療におけるリポソーム（Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer），Lopez-BeresteinおよびFidler（編），Liss，ニューヨーク，pp.３５３−３６５（１９８９）所収；Lopez-Berestein，同上pp.３１７−３２７；一般的には同上を参照のこと）。
さらに別の実施形態において、化合物およびその医薬的に許容し得る塩は、制御放出系において送達することができる（例えば、Goodson，制御放出の一般的適用（Medical Applications of Controlled Release），前出，２巻，pp.１１５−１３８（１９８４）所収を参照のこと）。Langer，１９９０，Science ２４９：１５２７−１５３３の書評において議論されている他の制御放出系が使用されてもよい。１つの実施形態において、ポンプが使用されてもよい（Langer，前出；Sefton，１９８７，CRC Crit.Ref.Biomed.Eng. １４：２０１；Buchwaldら、１９８０，Surgery ８８：５０７；Saudekら、１９８９，N.Engl.J.Med.３２１：５７４を参照のこと）。別の実施形態において、ポリマー材料を使用することができる（以下を参照のこと：制御放出の医学的応用（Medical Applications of Controlled Release），LangerおよびWise（編），CRC Pres.，Boca Raton，フロリダ（１９７４）；薬物の生物学的利用能、薬物製品設計、および性能の制御（Controlled Drug Bioavailability,Drug Product Design and Performance）， SmolenおよびBall（編）， Wiley，ニューヨーク（１９８４）; RangerおよびPeppas; １９８３，J.Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem. ２３：６１；以下もまた参照のこと：Levyら、１９８５，Science ２２８：１９０；Duringら、１９８９，Ann.Neurol.２５：３５１；Howardら、１９８９，J.Neurosurg.７１：１０５）。さらに別の実施形態において、制御放出系は、化合物のＲＮＡ標的またはその医薬的に許容し得る塩に近接させて配置することができ、従って、全身用量の一部分のみを必要とする。
本明細書に記載される化合物は、投与のために適切な医薬組成物に取り込むことができる。このような組成物は、典型的には、活性化合物および医薬的に許容し得るキャリアを含む。本明細書で使用される場合、「医薬的に許容し得るキャリア」という言葉は、薬学的投与と適合可能である任意のおよびすべての、溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含むことが意図される。医薬品として活性な物質のためのこのような媒体および薬剤の使用は当該分野において周知である。従来の媒体または薬剤が活性化合物と適合可能でない場合を除いて、組成物中でのその使用が意図される。補助的な活性化合物もまた、組成物中に取り込むことができる。
本発明は、目的のポリペプチドまたは核酸の発現または活性を調節するための医薬組成物を調製するための方法を含む。このような方法は、目的のポリペプチドまたは核酸の発現または活性を調節する薬剤とともに、医薬的に許容し得るキャリアを製剤化する工程を包含する。このような組成物は、さらなる活性薬剤をさらに含むことができる。従って、本発明はさらに、目的のポリペプチドまたは核酸の発現または活性を調節する薬剤、および１種以上のさらなる活性化合物とともに、医薬的に許容し得るキャリアを製剤化することによって、医薬組成物を調製するための方法を包含する。
本発明の医薬組成物は、その意図された投与経路と適合するように製剤化される。投与経路の例には、非経口、例えば、静脈内、皮内、皮下、経口（例えば、吸入）、経皮（局所的）、経粘膜、および直腸の投与が含まれる。静脈内投与が好ましい。非経口、経皮、または皮下適用のために使用される溶液または懸濁液は以下の成分を含むことができる：滅菌希釈液、例えば、注射のための水、生理食塩水溶液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒；抗微生物剤、例えば、ベンジルアルコールまたはメチルパラベン；抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウム；キレート剤、例えば、エチレンジアミン四酢酸；緩衝剤、例えば、酢酸、クエン酸、またはリン酸、および張度の調整のための薬剤、例えば、塩化ナトリウムまたはデキストロース。ｐＨは酸または塩基、例えば、塩酸または水酸化ナトリウムで調整することができる。非経口調製物は、アンプル、使い捨てシリンジ、またはガラスもしくはプラスチック製の複数用量バイアルの中に密封することができる。
注射用途のために適切な医薬組成物は、滅菌水溶液（水溶性である場合）または分散液、および滅菌注射液または分散液の即席調製のための滅菌粉末を含む。静脈内投与のために、適切なキャリアは、生理食塩水、静菌水、Cremophor EL（商標）（ＢＡＳＦ；Parsippany，ニュージャージー）またはリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）を含む。すべての場合において、組成物は滅菌でなくてはならず、シリンジを容易に通過する程度に流動性であるべきである。これは、製造および保存の条件下で安定でなくてはならず、細菌および真菌などの微生物の夾雑作用に対抗して保存されなければならない。キャリアは、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、およびこれらの適切な混合物を含む溶媒または分散媒体であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散液の場合には必要とされる粒子サイズの維持によって、および界面活性剤の使用によって維持することができる。微生物の作用の妨害は、種々の抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チロメサールなどによって達成することができる。多くの場合において、等張剤、例えば、糖、ポリアルコール、例えば、マンニトール、ソルビトール、塩化ナトリウムを組成物中に含めることが好ましい。注射組成物の吸収の延長は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸マグネシウムおよびゼラチンを組成物中に含めることによってもたらすことができる。
滅菌注射溶液は、必要とされる量で、活性化合物（例えば、ポリペプチドまたは抗体）を上記に列挙した成分の１つまたは組み合わせとともに適切な溶媒中に取り込むこと、および必要とされる場合、その後の濾過滅菌によって調製することができる。一般的に、分散液は、基本的な分散媒体および上記に列挙したものからの必要とされる他の成分を含む滅菌媒体に、活性化合物を取り込むことによって調製される。滅菌注射溶液の調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製の方法は、真空乾燥および凍結乾燥であり、これは、以前に滅菌濾過したその溶液から、活性成分および任意のさらなる所望の成分の粉末を生じる。
経口組成物は、一般的に、不活性希釈剤または可食性キャリアを含む。これらは、ゼラチンカプセル中に密封し、または錠剤に圧縮することができる。経口治療投与の目的のために、活性化合物は、賦形剤とともに取り込み、そして錠剤、トローチ、またはカプセルの剤形で使用することができる。経口組成物はまた、うがい薬としての使用のために流体キャリアを使用して調製することができ、ここで、流体キャリア中の化合物は、経口で投与され、そして口の中をすすぎ、そして吐き出されまたは飲み込まれる。
薬学的に適合する結合剤および／またはアジュバント材料は、組成物の一部として含めることができる。錠剤、丸薬、カプセル、トローチなどは、以下の成分のいずれか、もしくは類似の性質の化合物を含むことができる：結合剤、例えば、微結晶セルロース、トラガカントガムもしくはゼラチン；賦形剤、例えば、デンプンもしくはラクトース、崩壊剤、例えば、アルギン酸、Primogel、もしくはコーンスターチ；滑沢剤、例えば、ステアリン酸マグネシウムもしくはSterotes；流動促進剤、例えば、コロイド状二酸化ケイ素；甘味料、例えば、スクロースもしくはサッカリン；または香料、例えば、ペパーミント、サリチル酸メチル、もしくはオレンジ香料。
吸入による投与のために、化合物は、適切な噴霧剤、例えば、二酸化炭素などのガスを含む加圧容器もしくは分配器、または噴霧器からのエアロゾルスプレーの剤形で送達される。
全身投与はまた、経粘膜または経皮手段によってであり得る。経粘膜または経皮投与のために、浸透される障壁に対して適切な浸透剤が製剤中で使用される。このような浸透剤は、当該分野で一般的に公知であり、そして例えば、経粘膜投与のために、界面活性剤、胆汁酸塩、およびフシジン酸誘導体を含む。経粘膜投与は、鼻スプレーまたは坐剤の使用を通して達成することができる。経皮投与のために、活性化合物は、当該分野で一般的に公知であるように、軟膏剤（ointments）、軟膏（salves）、ゲル、またはクリームに製剤化される。
化合物はまた、直腸送達のための坐剤（例えば、ココアバターおよび他のグリセリドなどの従来の坐剤基剤を用いる）または保持浣腸剤の剤形で調製することができる。
１つの実施形態において、活性化合物は、身体からの迅速な放出に対して化合物を保護するキャリア、例えば、移植物およびマイクロカプセル化送達系を含む、制御放出製剤とともに調製される。生物分解性、生体適合性のポリマー、例えば、エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸を使用することができる。このような製剤の調製のための方法は、当業者には明らかである。材料はまた、Alza CorporationおよびNova Pharmaceuticals,Inc.から市販品されている。リポソーム懸濁液（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体を用いて感染細胞に標的化されるリポソームを含む）もまた、医薬的に許容し得るキャリアとして使用することができる。これらは、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号に記載されるように、当業者に公知である方法に従って調製することができる。
投与の容易さおよび用量の均一性のために単位剤形で経口または非経口組成物を製剤化することがとりわけ有利である。単位剤形とは、本明細書で使用される場合、投与される被験体のための単位となる用量として適している物理的に別個の単位をいい；各単位は、必要とされる薬学的キャリアと共同して、所望の治療的効果を生じるために計算された活性化合物の所定の量を含む。本発明の単位剤形についての詳細は、活性化合物の固有の特性、および達成される特定の治療効果、および個体の治療のためにこのような活性化合物を化合物化することの当該分野における固有の制限によって、およびこれらに直接的に依存して指示される。
抗体については、好ましい用量は、体重の０．１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ（より好ましくは、０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ、０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ、または０．１〜１．０ｍｇ／ｋｇ）である。抗体が脳において作用する場合は、５０ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇの用量が通常適切である。一般的に、部分的なヒト抗体および完全なヒト抗体は、他の抗体よりもヒトの身体中でより長い半減期を有する。従って、より低い用量およびより低い頻度の薬剤投与がしばしば可能である。脂質化などの修飾は、抗体を安定化するため、ならびに取り込みおよび組織浸透（例えば、脳への）を増強するために使用することができる。抗体の脂質化のための方法は、Cruikshankら、（１９９７，J.Acquired Immune Deficiency Syndromes and Human Retrovirology １４：１９３）によって記載されている。
ある一定の実施形態において、タンパク質またはポリペプチドの有効量（すなわち、有効用量）は、０．００１〜３０ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは、０．０１〜２５ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは、約０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ体重、およびさらにより好ましくは、約０．１〜１．０ｍｇ／ｋｇ、１〜１０ｍｇ／ｋｇ、２〜９ｍｇ／ｋｇ、３〜８ｍｇ／ｋｇ、４〜７ｍｇ／ｋｇ、または５〜６ｍｇ／ｋｇ体重の範囲である。
当業者は、疾患または障害の重度、過去の治療歴、全体的健康状態および／または被験体の年齢、および存在する他の疾患を含むがこれらに限定されない特定の要因が、被験体を有効に治療するために必要とされる用量に影響を与える場合があることを認識する。さらに、タンパク質、ポリペプチド、または抗体の治療有効量を用いる被験体の治療は、一連の治療を含むことができる。
上記の化合物に加えて、本発明は、目的の核酸またはポリペプチドの発現または活性を調節する小分子の使用を包含する。小分子の非限定的な例には以下が含まれる：ペプチド、ペプチド模倣物、アミノ酸、アミノ酸アナログ、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドアナログ、ヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、モルあたり約１０，０００グラム未満の分子量を有する有機化合物または無機化合物（すなわち、ヘテロ有機化合物および有機金属化合物）、モルあたり約５，０００グラム未満の分子量を有する有機化合物または無機化合物、モルあたり約１，０００グラム未満の分子量を有する有機化合物または無機化合物、モルあたり約５００グラム未満の分子量を有する有機化合物または無機化合物、ならびにこのような化合物の塩、エステル、および他の医薬的に許容し得る形態。
小分子薬剤の適切な用量は、通常の技能を有する医師、獣医、または研究者の知識の範囲内にある多数の要因に依存することが理解される。小分子の用量は、例えば、治療される被験体またはサンプルの同一性、サイズ、および状態に依存して、さらに組成物が投与される経路、および適用可能である場合、実務者が小分子に所望する、本発明の核酸またはポリペプチドに対して有する効果に依存して変化する。例示的な用量は、被験体またはサンプル重量のキログラムあたりの、小分子のミリグラムまたはマイクログラム量を含む（例えば、約１マイクログラム／キログラム〜約５００ミリグラム／キログラム、約１００マイクログラム／キログラム〜約５ミリグラム／キログラム、または約１マイクログラム／キログラム〜約５０マイクログラム／キログラム）。さらに、小分子の適切な用量は、調節される発現または活性に関する小分子の効力に依存することが理解される。このような適切な用量は、本明細書に記載されるアッセイを使用して決定されてもよい。本発明のポリペプチドまたは核酸の発現または活性を調節するために、１種以上のこれらの小分子が被験体（例えば、ヒト）に投与される場合、医師、獣医、または研究者は、例えば、最初は比較的低用量で処方し、引き続いて、適切な応答が得られるまで、用量を増加させてもよい。加えて、任意の特定の動物被験体についての特定の用量レベルは、利用される特定の化合物の活性、被験体の齢、体重、全体的健康、性別、および食事、投与の時間、投与経路、排出速度、任意な薬物の組み合わせ、および調節される発現または活性の程度を含む種々の要因に依存することが理解される。
医薬組成物は、投与のための指示書とともに、容器、パック、またはディスペンサーに含めることができる。
５．２１ キット
本発明は、本発明のバイオマーカーの少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、少なくとも３５個、少なくとも４０個、少なくとも４５個、少なくとも５０個、すべて、またはその任意の組み合わせのタンパク質およびＲＮＡ産物の発現を測定するためのキットを提供する。このようなキットは、このようなタンパク質およびＲＮＡ産物の発現を測定するために必要とされる材料および試薬を含む。特定の実施形態において、このキットは、例えば、以下のような、種々の方法において利用される１種以上のさらなる試薬をさらに含んでもよい：（１）血液または組織からのＲＮＡを安定化および／または精製するための試薬；（２）試験核酸を生成するためのプライマー；（３）任意に１種以上の一意に標識されたｄＮＴＰおよび／またはｒＮＴＰ（例えば、ビオチン化またはＣｙ３もしくはＣｙ５タグ化ｄＮＴＰ）を伴うｄＮＴＰおよび／またはｒＮＴＰ（あらかじめ混合するかまたは個別のいずれか）；（４）合成後標識試薬、例えば、蛍光色素の化学的に活性な誘導体；（５）酵素、例えば、逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼなど；（６）種々の緩衝媒体、例えば、反応緩衝液、ハイブリダイゼーション緩衝液および洗浄緩衝液；（７）標識プローブ精製試薬および成分、例えば、スピンカラムなど；ならびに（８）タンパク質精製試薬；（９）シグナル生成および検出試薬、例えば、ストレプトアビジン−アルカリホスファターゼコンジュゲート、化学蛍光基質または化学発光基質など。特定の実施形態において、このキットは、対照としての使用のための、サンプル（例えば、血液または軟骨細胞または滑液）から単離された、前標識され品質管理されたタンパク質およびまたはＲＮＡを含む。
ある実施形態において、キットはＲＴ−ＰＣＲキットまたはｑＲＴ−ＰＣＲキットである。別の実施形態において、キットは、核酸アレイおよびタンパク質アレイである。本発明に従うこのようなキットは、そのため、関連する本発明のタンパク質メンバーまたは核酸メンバーを有するアレイ、およびパッケージング手段を少なくとも含む。代替的には、本発明のタンパク質メンバーまたは核酸メンバーはアレイにあらかじめパッケージされてもよい。
ある実施形態において、キットは定量ＲＴ−ＰＣＲキットである。１つの実施形態において、定量ＲＴ−ＰＣＲキットは以下を含む：（ａ）本発明のバイオマーカーの各々の組み合わせを増幅するために使用されるプライマー；（ｂ）緩衝液および逆転写酵素を含む酵素；（ｃ）１種以上の耐熱性ポリメラーゼ；ならびに（ｄ）Sybr（登録商標）Green。別の実施形態において、本発明のキットはまた、（ａ）参照対照ＲＮＡおよび（ｂ）スパイク対照ＲＮＡを含む。
本発明は、（ａ）個体を膀胱癌および／または早期の膀胱癌を有すると診断することのために有用であるキットを提供する。例えば、本発明の特定の実施形態において、このキットは、フォワードプライマーおよびリバースプライマーを含み、ここで、フォワードプライマーおよびリバースプライマーは、個体が膀胱癌および／または早期の膀胱癌を有するか否かを決定する際に有用である、本発明に従って同定されるようなバイオマーカーの各々に対応するｍＲＮＡ種のすべての発現を定量するように設計される。特定の実施形態において、少なくとも１種のプライマーが、エクソンジャンクションにまたがるように設計される。
本発明は、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、少なくとも３５個、少なくとも４０個、少なくとも４５個、少なくとも５０個、すべての数の、サンプル中の本発明のバイオマーカー、またはその任意の組み合わせのタンパク質産物またはＲＮＡ産物の発現に基づいて膀胱癌を検出、診断、モニタリング、および予後診断するために有用であるキットを提供する。特定の実施形態において、このようなキットは、膀胱癌と関連していることが先行技術によって示唆されている本発明のバイオマーカーのタンパク質産物またはＲＮＡ産物の発現を測定するための材料および試薬を含まない。別の実施形態において、このようなキットは、膀胱癌と関連していることが先行技術によって示唆されている本発明のバイオマーカー、および少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、少なくとも３５個、少なくとも４０個、少なくとも４５個、またはそれ以上の本発明のバイオマーカー以外の遺伝子のタンパク質産物またはＲＮＡ産物の発現を測定するための材料および試薬を含む。
本発明は、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、少なくとも３５個、少なくとも４０個、少なくとも４５個、少なくとも５０個、またはすべての任意の数の、サンプル中の本発明のバイオマーカー、またはその任意の組み合わせのタンパク質産物またはＲＮＡ産物の発現に基づいて被験体が受ける１つ以上の治療の効力をモニターするために有用であるキットを提供する。特定の実施形態において、このようなキットは、膀胱癌と関連していることが先行技術によって示唆されている本発明のバイオマーカーのタンパク質産物またはＲＮＡ産物の発現を測定するための材料および試薬を含まない。別の実施形態において、このようなキットは、膀胱癌と関連していることが先行技術によって示唆されている本発明のバイオマーカー、および少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、少なくとも３５個、少なくとも４０個、少なくとも４５個、またはそれ以上までの任意の数の本発明のバイオマーカー以外の遺伝子のタンパク質産物またはＲＮＡ産物の発現を測定するための材料および試薬を含む。
本発明は、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、少なくとも３５個、少なくとも４０個、少なくとも４５個、少なくとも５０個、またはすべての任意の数の、サンプル中の本発明のバイオマーカー、またはその任意の組み合わせのタンパク質産物またはＲＮＡ産物の発現に基づく治療に対して、被験体が応答性であるか否かを決定するために使用するキットを提供する。特定の実施形態において、このようなキットは、膀胱癌と関連していることが先行技術によって示唆されている本発明のバイオマーカーのタンパク質産物またはＲＮＡ産物の発現を測定するための材料および試薬を含まない。別の実施形態において、このようなキットは、膀胱癌と関連していることが先行技術によって示唆されている本発明のバイオマーカー、および少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、少なくとも３５個、少なくとも４０個、少なくとも４５個、またはそれ以上までの任意の数の本発明のバイオマーカー以外の遺伝子のタンパク質産物またはＲＮＡ産物の発現を測定するための材料および試薬を含む。
本発明は、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、少なくとも３５個、少なくとも４０個、少なくとも４５個、少なくとも５０個、またはすべての任意の数の、サンプル中の本発明のバイオマーカー、またはその任意の組み合わせのＲＮＡ産物の発現を測定するためのキットを提供する。特定の実施形態において、このようなキットは、本発明のバイオマーカーのＲＮＡ産物の発現を測定するために必要な材料および試薬を含む。例えば、膀胱癌についてのマイクロアレイまたはＲＴ−ＰＣＲキットが製造されてもよく、これは、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、少なくとも３５個、少なくとも４０個、少なくとも４５個、少なくとも５０個、またはすべての任意の数の本発明のバイオマーカー、またはその任意の組み合わせのＲＮＡ産物のレベルを測定するために必要な試薬および材料のみを含む。代替的には、ある実施形態において、このキットは、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、またはすべての任意の数の本発明のバイオマーカー、またはその任意の組み合わせのＲＮＡ産物のレベルを測定するために必要なものに限定されない試薬および材料を含むことができる。例えば、マイクロアレイキットは、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、少なくとも３５個、少なくとも４０個、少なくとも４５個、少なくとも５０個、またはすべての任意の数の本発明のバイオマーカー、またはその任意の組み合わせのＲＮＡ産物のレベルを測定するために必要な試薬および材料に加えて、膀胱癌と必ずしも関連しないか、またはそれを示さないＲＮＡ産物のレベルを測定するために必要な試薬および材料を含んでもよい。特定の実施形態において、マイクロアレイまたはＲＴ−ＰＣＲキットは、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、少なくとも３５個、少なくとも４０個、少なくとも４５個、少なくとも５０個までの任意の数、もしくはその任意の組み合わせの本発明のバイオマーカーのＲＮＡ産物のレベル、ならびに１個、２個、３個、４個、５個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、５５個、６０個、６５個、７０個、７５個、８０個、８５個、９０個、９５個、１００個、１２５個、１５０個、１７５個、２００個、２２５個、２５０個、３００個、３５０個、４００個、４５０個、もしくはそれ以上までの任意の数の本発明のバイオマーカー以外の遺伝子、または１〜１０個、１〜１００個、１〜１５０個、１〜２００個、１〜３００個、１〜４００個、１〜５００個、１〜１０００個、２５〜１００個、２５〜２００個、２５〜３００個、２５〜４００個、２５〜５００個、２５〜１０００個、１００〜１５０個、１００〜２００個、１００〜３００個、１００〜４００個、１００〜５００個、１００〜１０００個、５００〜１０００個の本発明のバイオマーカー以外の遺伝子のＲＮＡ産物のレベルを測定するために必要な試薬および材料を含む。
核酸マイクロアレイキットについては、このキットは、一般的に、固相担体表面に結合されたプローブを含む。プローブは、検出可能な標識で標識されてもよい。特定の実施形態において、プローブは、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、またはすべての任意の数の本発明のバイオマーカー、またはその任意の組み合わせのＲＮＡ産物の、エクソン、イントロン、エクソンジャンクション、またはエクソン−イントロンジャンクションに特異的である。マイクロアレイキットは、アッセイならびにアッセイの実施から得られるデータを解釈および分析するための方法を実施するための説明書を含んでもよい。特定の実施形態において、このキットは膀胱癌を診断するための説明書を含んでもよい。このキットはまた、ハイブリダイゼーション試薬および／またはプローブが標的核酸配列にハイブリダイズするときに産生されるシグナルを検出するために必要な試薬を含んでもよい。一般的に、マイクロアレイキットのための材料および試薬は、１つ以上の容器の中にある。キットの各成分は、一般的に、それ自体が適切な容器の中にある。
ＲＴ−ＰＣＲキットについては、このキットは、一般的に、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、またはすべての任意の数の本発明のバイオマーカー、またはその任意の組み合わせの特定のＲＮＡ産物（エクソン、イントロン、エクソンジャンクション、およびエクソン−イントロンジャンクション）に特異的である、あらかじめ選択されたプライマーを含む。このＲＴ−ＰＣＲキットはまた、核酸を逆転写および／または増幅するために適切である酵素（例えば、Ｔａｑなどのポリメラーゼ）、ならびに逆転写および増幅のための反応混合液のために必要であるデオキシヌクレオチドおよび緩衝液を含んでもよい。このＲＴ−ＰＣＲキットはまた、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、またはすべての任意の数の本発明のバイオマーカー、またはその任意の組み合わせのＲＮＡ産物に特異的なプローブを含んでもよい。このプローブは、検出可能な標識（例えば、蛍光標識）で標識されてもよく、標識されなくてもよい。ＲＴ−ＰＣＲキットの各成分は、一般的に、それ自体が適切な容器の中にある。従って、これらのキットは、一般的に、各々個々の試薬、酵素、プライマーおよびプローブのために適切な別個の容器を含む。さらに、このＲＴ−ＰＣＲキットは、アッセイならびにアッセイの実施から得られるデータを解釈および分析するための方法を実施するための説明書を含んでもよい。特定の実施形態において、このキットは、膀胱癌を診断するための説明書を含む。
特定の実施形態において、キットはリアルタイムＲＴ−ＰＣＲキットである。このようなキットは、９６ウェルプレート、ならびにSYBR Green検出において必要である試薬および材料を含んでもよい。このキットは、β−アクチンが結果を標準化するために使用することができるような試薬および材料を含んでもよい。このキットはまた、水、リン酸緩衝化生理食塩水、およびファージＭＳ２ ＲＮＡなどの対照を含んでもよい。さらに、このキットは、アッセイならびにアッセイの実施から得られるデータを解釈および分析するための方法を実施するための説明書を含んでもよい。特定の実施形態において、説明書は、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、またはすべての任意の数の本発明のバイオマーカー、またはその任意の組み合わせのＲＮＡ産物のレベルが、例えば、５倍〜１０倍異なる２つの濃度で試験されるべきであることを述べる。
抗体ベースのキットについては、このキットは、例えば、以下を含むことができる：（１）目的のタンパク質（例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、またはすべての任意の数の本発明のバイオマーカー、またはその任意の組み合わせのタンパク質産物）に結合する第１の抗体（これは担体に結合してもよく、結合しなくてもよい）；そして場合により、（２）タンパク質または第１の抗体のいずれかに結合し、そして検出可能な標識（例えば、蛍光標識、放射性同位元素または酵素）に結合体化されている第２の異なる抗体。抗体ベースのキットはまた、免疫沈降を実行するためのビーズを含んでもよい。抗体ベースのキットの各成分は、一般的に、それ自体が適切な容器の中にある。従って、これらのキットは、一般的に、各抗体のために適切な別個の容器を含む。さらに、抗体ベースのキットは、アッセイならびにアッセイの実施から得られるデータを解釈および分析するための方法を実施するための説明書を含んでもよい。特定の実施形態において、このキットは、膀胱癌を診断するための説明書を含む。
以下の実施例は非限定的であり、本発明の種々の態様および特徴を単に代表するものである。
実施例１
マイクロアレイの構築
本発明の１つの態様に従うアレイを以下のように構築した。
増幅のために使用したのと同じ９６ウェルチューブ中のＯＡ軟骨ｃＤＮＡライブラリーからのｃＤＮＡクローンのＰＣＲ産物（約４０μｌ）を、４μｌ（１／１０体積）の３Ｍ 酢酸ナトリウム（ｐＨ ５．２）および１００μｌ（２．５体積）のエタノールを用いて沈殿させ、−２０℃で一晩保存した。次いで、これらを３，３００ｒｐｍで１時間、４℃にて遠心分離した。得られたペレットを５０μｌ氷冷７０％エタノールで洗浄し、再度３０分間遠心分離した。次いでペレットを空気乾燥し、そして５０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）または２０μｌ ３×ＳＳＣ中で一晩十分に再懸濁した。次いで、サンプルを、γアミノプロピルシラン（Gamma Amino Propyl Silane）（Corning ＣＭＴ−ＧＡＰＳまたはＣＭＴ−ＧＡＰ２、カタログ番号４０００３、４０００４）またはポリリジン−コートスライド（Sigmaカタログ番号Ｐ０４２５）の上に、単独でまたは二連でのいずれかで、ロボットＧＭＳ４１７または４２７アレイヤー（Affymetrix，カリフォルニア）を使用して沈降させた。マイクロアレイ上のＤＮＡスポットの境界は、ダイアモンドスクライバーを用いてマークする。本発明は、１０〜２０，０００個のＰＣＲ産物が、アレイを調製するために固相担体にスポットされているアレイを提供する。
アレイは、粒子を含まない温かいｄｄＨ２Ｏのディッシュの上にスライドを約１分間浮かせることによって再水和し（スポットはわずかに膨潤するが互いに混ざることはない）、７０〜８０℃の逆さにしたヒーティングブロック上で３秒間、瞬間的に乾燥させる。次いで、ＤＮＡをスライドにＵＶ架橋させ（Stratagene，Stratalinker、６５ｍＪ−６５０×１００μＪである「６５０」にディスプレイを設定）、または２〜４時間、８０℃でベーキングする。アレイはスライドラックに配置する。空のスライドチャンバーを準備し、以下の溶液で満たす：３．０グラムの無水コハク酸（Aldrich）を１８９ｍｌの１−メチル−２−ピロリドン（試薬の迅速な添加が極めて重要である）に溶解する；無水コハク酸の最後のフレークが溶解した直後に、２１．０ｍｌの０．２Ｍホウ酸ナトリウムを混合し、溶液をスライドチャンバーに注ぐ。スライドラックを迅速かつ均一にスライドチャンバーに浸し、数秒間激しく上下に振盪し、必ずスライドと溶液が離れないようにし、次いで、１５〜２０分間、軌道シェーカー上で混合する。次いで、スライドラックを、２分間、９５℃ｄｄＨ２Ｏに穏やかに浸し、続いて、９５％エタノールに５回浸す。次いで、過剰のエタノールをペーパータオルに滴下させて、スライドを空気乾燥させる。次いで、アレイは使用するまで室温にてスライドボックスに保存する。
実施例２
未分画全血からのＲＮＡ単離
（ａ）溶解血液
１０ｍｌの末梢全血をＥＤＴＡバキュテイナー（Vacutainer）チューブ（Becton Dickinson，Franklin Lakes，ニュージャージー）中に採取し、処理するまで氷上に保存した（６時間以内）。遠心分離の際に、血液サンプルは、血漿、バフィコート、および赤血球の層に分離された。血漿を除去し、低張緩衝液（１．６ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ ＫＨＣＯ３、１５３ｍＭ ＮＨ４Ｃｌ、ｐＨ７．４）を３：１の体積比で加えて、赤血球を溶解した。この混合物を遠心分離して細胞ペレットを得、これを、製造業者の説明書に従って、１．０ｍｌのTRIzol（登録商標）試薬（Invitrogen Corp.,Carlsbad，カリフォルニア）および０．２ｍｌのクロロホルム中に溶解しかつホモジナイズした。遠心分離後、イソプロパノールを水相に１：１の比率で加え、−２０℃で沈殿させた。その後遠心分離によりＲＮＡペレットを得、これを実験的使用のために水に再懸濁した。ＲＮＡの品質は、製造業者によって指示されるように、Agilent 2100 Bioanalyzer RNA 6000 Nano Chips上で評価し、ＲＮＡの量は、Beckman-Coulter DU640 Spectrophotometerにおいて、２６０ｎｍにおける吸収によって決定した。
（ｂ）遠心分離した溶解血液
１０ｍｌ全血をバキュテイナーに取り、４℃にて２，０００ｒｐｍ（８００ｇ）で５分間遠心分離し、そして血漿上清を除去する。溶解緩衝液を、１部の血液に対して３部の溶解緩衝液の比率で血液サンプルに加える（溶解緩衝液（１Ｌ）０．６ｇ ＥＤＴＡ；１．０ｇ ＫＨＣＯ２、８．２ｇ ＮＨ４Ｃｌ、ｐＨ７．４に調整（ＮａＯＨを使用））。サンプルを混合し、透明になるまで５〜１０分間、氷上に配置する。溶解したサンプルを、４℃にて１０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を吸引する。ペレットを５ｍｌ溶解緩衝液に再懸濁し、再度、４℃にて１０００ｒｐｍで１０分間遠心分離する。ペレット化した細胞を、元の血液サンプルの１０ｍｌ毎に約６ｍｌのTRIzol（GIBCO/BRL）の比率でTRIzolを使用して、ホモジナイズし、十分に渦状にかき回す。サンプルを室温で５分間放置する。ＲＮＡは、１ｍｌのTRIzolあたり１．２ｍｌのクロロホルムを使用して抽出する。サンプルは、４℃にて１２，０００×ｇで５分間遠心分離し、上層を回収する。この上層に、イソプロパノールを、１ｍｌのTRIzolあたり０．５ｍｌの比率で加える。サンプルを、−２０℃で一晩または−２０℃で１時間静置する。ＲＮＡを、公知の方法に従ってペレット化し、ＲＮＡペレットを空気乾燥し、そしてペレットをＤＥＰＣ処理ｄｄＨ２Ｏに再懸濁する。ＲＮＡサンプルはまた、７５％エタノール中で保存することができ、この条件ではサンプルは輸送のための室温では安定である。
（ｃ）無血清全血から
１０ｍｌ全血をバキュテイナーに取り、４℃にて２，０００ｒｐｍ（８００ｇ）で５分間遠心分離し、そして血漿層を除去する。ペレット化した細胞を、元の血液サンプルの１０ｍｌ毎に約６ｍｌのTRIzol（登録商標）の比率でTRIzol（GIBCO/BRL）を使用して、ホモジナイズし、十分に渦状に掻き回す。サンプルを室温で５分間放置する。ＲＮＡは、１ｍｌのTRIzolあたり１．２ｍｌのクロロホルムを使用して抽出する。サンプルは、４℃にて１２，０００×ｇで５分間遠心分離し、上層を回収する。この上層に、イソプロパノールを、１ｍｌのTRIzolあたり０．５ｍｌの比率で加える。サンプルを、−２０℃で一晩または−２０℃で１時間静置する。ＲＮＡを、公知の方法に従ってペレット化し、ＲＮＡペレットを空気乾燥し、そしてペレットをＤＥＰＣ処理ｄｄＨ２Ｏに再懸濁する。ＲＮＡサンプルはまた、７５％エタノール中で保存することができ、この条件ではサンプルは輸送のための室温では安定である。
（ｄ）PAXGENE（商標）を使用して全血から
２．５ｍｌ全血をPAXgene Blood ＲＮＡチューブに回収し、PAXgene（商標）Blood ＲＮＡキットプロトコールの説明書に従って処理する。手短に述べると、PAXgene（商標）チューブ中での少なくとも２時間の血液の保存後、血液サンプルを遠心分離し、上清を廃棄する。残りのサンプルに、３６０μｌの供給された緩衝液ＢＲ１を加え、サンプルをスピンカラムにピペットし、そして遠心分離し、次いで、多数の洗浄段階で洗浄し、最後に溶出および保存する。
（ｅ）PAXGENE（商標）およびその後にグロビン減少を使用して全血から
上記の（ｄ）に記されるようにPAXgene（商標）から単離されたＲＮＡは、引き続いて、「グロビン減少プロトコール（Globin Reduction Protocol）」という表題のＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（登録商標）テクニカルノートに記載されているように、グロビンｍＲＮＡを選択的に除去するように処理される。α１、α２およびβグロビン種に特異的なオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション緩衝液とともにインキュベートされ、ＲＮＡｓｅ ＨがグロビンｍＲＮＡの分解を特異的に標的とするために使用され、そしてｃＲＮＡが、グロビンｍＲＮＡを除去するために使用されたAffymetrixからのカラムを洗浄する。
実施例３
標的核酸の調製およびハイブリダイゼーション
ｍＲＮＡからの蛍光ＤＮＡプローブの調製
ＲＮＡの蛍光標識標的核酸サンプルは、本発明のアレイを用いる分析のために調製する。
１μｇオリゴ−ｄＴプライマーは、膀胱癌を有すると診断された患者の未分画全血から単離した１０μｇの総ＲＮＡに、総量１０μｌで、７０℃で１０分間加熱し、そして氷上で冷却することによってアニールした。患者は、登録医によって膀胱癌に関して陽性または陰性を診断された。陽性結腸の病理診断の次に切除した組織の組織学的試験を行った。ｍＲＮＡは、最終濃度の５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、７５ｍＭ ＫＣｌ、３ｍＭ ＭｇＣ１２、２５ｍＭ ＤＴＴ、２５ｍＭ 未標識ｄＮＴＰ、４００単位のSuperscript II（２００Ｕ／μＬ，Gibco BRL）、および１５ｍＭのＣｙ３またはＣｙ５（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を含む２５μｌ容量中で、４２℃にて４０分間サンプルをインキュベートすることによって逆転写した。反応は、２．５μｌの５００ｍＭ ＥＤＴＡおよび５μｌの１Ｍ ＮａＯＨの添加ならびに６５℃で１０分間のインキュベーションにより停止した。反応混合液は、１２．５μｌの１Ｍ ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７．６）の添加により中和する。
標識した標的核酸サンプルは、セントリコン（Centricon）−３０微量濃縮器（Ａｍｉｃｏｎ）中での遠心分離によって精製した。
標識核酸は、１００℃で２分間加熱することによって変性させ、３７℃で２０〜３０分間インキュベートし、その後２２ｍｍ×２２ｍｍガラスカバースリップの下の核酸アレイ上に配置した。ハイブリダイゼーションは、３×ＳＳＣの小さなリザーバーによって湿度維持された特注のスライドチャンバー中で、６５℃で１４〜１８時間実行した。アレイは、２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ、続いて１×ＳＳＣおよび０．１×ＳＳＣを用いて、浸漬および２〜５分間の攪拌によって洗浄した。最後に、アレイは、Microplus carriersにおけるBeckman ＧＳ−６卓上遠心分離機中のスライドラック中で、６５０ＲＰＭにて２分間の遠心分離によって乾燥させた。
総ＲＮＡ（５μｇ）は、製造業者の説明書に従って、標識し、膀胱癌を有する個体または膀胱癌を有さない個体からの他の同様に調製したサンプルとともに、Affymetrix U133 Plus 2.0遺伝子チップ（Affymetrix；Santa Clara，カリフォルニア）にハイブリダイズした。手短に述べると、ハイブリダイゼーションシグナルは、各アレイについて全体トリム平均シグナル強度値（the global trimmed mean signal intensity value）を５００に調整することによって決定された倍率を使用して、Affymetrix GCOSソフトウェア（バージョン１．１．１）の中で倍率を変え、そしてGeneSpringバージョン７．２（Silicon Genetics；Redwood City，カリフォルニア）にインポートした。次いで、シグナル強度を、各チップの５０パーセンタイル値に、そして各個々の遺伝子について、全体のサンプルセットのメジアン強度に中心を置いた。サンプルの各群の少なくとも８０％でＧＣＯＳソフトウェアによって存在または境界として呼び出された遺伝子のみをさらなる分析のために使用した。ディファレンシャルに発現された遺伝子は、１）ノンパラメトリックWilcoxon-Mann-Whitneyノンパラメトリック検定（Ｐ＜０．０５）、２）パラメトリックｔ検定（Ｐ＜０．０５）、および３）監視なしの分析方法（１４）を使用して同定した。監視されていない分析方法において、シグナル強度でふるいにかけた遺伝子は、サンプルの少なくとも１５％において、平均から離れた、少なくとも２倍の発現レベルの変化（上昇または下降）を有する遺伝子を選択するために使用した。階層的クラスター分析は、GeneSpring v6.0における平均重心連鎖を用いる類似性測定として、各々同定された遺伝子セットについてのサンプル間でのSpearman相関を使用して相関分析を評価するために各々の比較において実施した。膀胱癌を有する個体を膀胱癌を有さない個体と比較する実験からの結果は表１に提供される。早期の膀胱癌を有する個体を膀胱癌を有さない個体と比較する実験からの結果は表４に提供される。膀胱癌を有する個体を、精巣癌または腎細胞癌を有する個体と比較する実験からの結果は表１１に提供される。膀胱癌のバイオマーカーとしての表１に同定される遺伝子の選択は以下の表１０に示される。これらの遺伝子は、これらが有意なｐ値を伴う有意な倍数変化を実証するため、特に有用である。
Figure 2008539728
Figure 2008539728
実施例４
定量リアルタイムＰＣＲ
Affymetrix U133 Plus 2.0遺伝子チップを使用して同定され、かつ以下の表１３に記される表１からの遺伝子の選択は定量リアルタイムＰＣＲ（ＱＲＴ−ＰＣＲ）を使用して定量した。表１３は選択されたバイオマーカーのリストを提供する。表１４は、表１３に記されるバイオマーカーの産物のリストを提供する。表１５に記されるプライマーを使用する定量リアルタイムＰＣＲの結果の要約は表１６に示す。ＱＲＴ−ＰＣＲは、QiagenからのSYBR（登録商標）Greenキット（製品番号２０４１４３）および／またはApplied Biosystems PCR試薬キット（カタログ番号４３３４９７３）のいずれかを使用して行った。アンプリコンは、Prism 7500装置（Applied Biosystems）を使用してリアルタイムで検出した。
逆転写は、Applied BiosystemsからのHigh-Capacity cDNA Archiveキット（製品番号４３２２１７１）を使用して最初に実施し、そこで利用されるプロトコールに従った。
より詳細には、精製したＲＮＡは、本明細書で以前に記載されたように、逆転写酵素緩衝液、ｄＮＴＰ、ランダムプライマーおよび逆転写酵素とともにインキュベートし、そして２５℃で１０分間インキュベートし、続いて３７℃で２時間インキュベートし、そして得られた混合物は定量ＰＣＲのための出発産物として利用した。
逆転写から得られるｃＤＮＡは、提供されるようなQuantiTect SYBR（登録商標）Green PCR Master Mixとともにインキュベートし、そしてマグネシウム濃度については調整を行わなかった。ウラシル−Ｎ−グリコシラーゼは加えなかった。本発明の遺伝子に特異的なフォワードプライマーとリバースプライマーの両方の５μｌを加え、反応をインキュベートし、そしてABI PRISM 7700／ABI GeneAmp 5700／iCycler／DNA Engine Opticonを利用して標準的なプロトコールに従ってモニターした。候補バイオマーカーについてのフォワードプライマーおよびリバースプライマーは「PrimerQuest」を使用して設計した。これは、http://biotoo1s.i.dtdna.com/primerquest（Integrated DNA Technologies，Coralville，ＩＡ）において見出されるツールである。ハウスキーピング遺伝子（β−アクチン）と比較した各々の遺伝子についてのΔＣｔ測定は、熱解離における融解温度［Ｔｍ］を決定し、そしてアガロースゲル上での検査は、特異的ＰＣＲ増幅の確認および各反応ウェル中でのプライマー−ダイマー形成の欠如を提供した。個々の標的遺伝子分子について、各遺伝子とβ−アクチンハウスキーピング遺伝子との間のＣｔ値の変化は、ΔＣｔ＝Ｃｔ（標的遺伝子）−Ｃｔ（ハウスキーピング遺伝子）として計算した。
ＱＲＴ ＰＣＲはまた、例えば、QiagenからのSYBR（登録商標）Greenキット（製品番号２０４１４３）を使用して、表３に記される産物に対して、表１に開示された残りのバイオマーカーのＲＮＡ産物に対して実施することができる。
１段階（逆転写およびＰＣＲを合わせる）または２段階（最初に逆転写、次いでその後のＰＣＲ）のいずれかを使用することができる。２段階プロトコールの場合において、逆転写は、最初にApplied BiosystemsからのHigh-Capacity cDNA Archiveキット（製品番号４３２２１７１）を使用して実施し、そこで利用されるプロトコールに従った。
より詳細には、以前に本明細書に記載された精製ＲＮＡを、逆転写酵素緩衝液、ｄＮＴＰ、ランダムプライマー、および逆転写酵素とともにインキュベートし、そして２５℃で１０分間、続いて３７℃で２時間インキュベートし、得られる混合物を定量ＰＣＲのための出発産物として利用した。
逆転写酵素から得られるｃＤＮＡは、提供されるようなQuantiTect SYBR（登録商標）Green PCR Master Mixとともにインキュベートすることができ、マグネシウム濃度については調整を行わない。ウラシル−Ｎ−グリコシラーゼは任意である。本発明の遺伝子に特異的なフォワードプライマーとリバースプライマーの両方の５μｌを加え、反応をインキュベートし、そしてABI PRISM 7700／ABI GeneAmp 5700／iCycler／DNA Engine Opticonを利用して標準的なプロトコールに従ってモニターする。
表１３
表１のバイオマーカーの選択。表は、Hugo遺伝子名（遺伝子記号）、Entez遺伝子ＩＤ（以前には遺伝子座リンク）および遺伝子の説明を示す。
Figure 2008539728
表１４
表１３に記されるバイオマーカーの産物。Genbankからの参照配列についてのヒトＲＮＡ受託番号およびヒトタンパク質受託番号とともに、Enrez 遺伝子ＩＤが列挙される。
Figure 2008539728
表１５ 表１３に記されるバイオマーカーの定量リアルタイムＲＴ−ＰＣＲのために利用されるプライマー。プライマーが増幅される参照配列が、５’および３’プライマーならびにアンプリコンサイズとともに示される。
Figure 2008539728
Figure 2008539728
表１６ ２０例の膀胱癌患者を１４例の膀胱癌を有さない個体と比較する、表１３に記されるバイオマーカーの定量リアルタイムＲＴ−ＰＣＲの結果を要約する。
Figure 2008539728
表１７ 表１３に記される本発明のバイオマーカーのタンパク質産物に対する市販の抗体
Figure 2008539728
Figure 2008539728
実施例５
TAQMAN（登録商標）ＱＲＴ ＰＣＲは、QiagenからのQuantiTect（商標）Probe ＲＴ−ＰＣＲシステム（製品番号２０４３４３）を、TAQMAN（登録商標）二重標識プローブおよび目的の遺伝子に対応するプライマーとともに使用して実施することができる。TAQMAN（登録商標）プローブおよびプライマーは、Applied Biosystems Assays-On-Demand（商標）に注文することができる。
二重標識プローブは、蛍光団とクエンチャー分子の両方を含む。クエンチャーとの蛍光レポーターの近接性は、レポーターが蛍光の発生を妨害するが、ＰＣＲ伸長段階の間にＴａｑポリメラーゼの５’−３’エキソヌクレアーゼ活性が蛍光団を遊離し、このことは蛍光団が蛍光を発することを可能にする。このようにして、蛍光の量は生成したＰＣＲ産物の量と相関する。本発明および表１３において開示される選択されたバイオマーカーの産物に従って利用可能であるTAQMAN（登録商標）プローブの例は、表１８に示される。
Figure 2008539728
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実施例６
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲの統計学的解析
膀胱癌（またはその段階）を有するか、または膀胱癌を有さないと分類された個体から単離された血液サンプルに対するリアルタイムＰＣＲは、トレーニング集団における本発明のバイオマーカーの豊富さのレベルに対応するデータを得るために公知の方法を使用して統計学的に解析した。
膀胱癌を有する個体および膀胱癌を有さない個体の集団を選択する。例えば、年齢、性別、肥満度指数（ＢＭＩ）などの表現型について類似の分布の個体を選択した。年齢およびＢＭＩに基づいて比較を行うことができるサンプルの選択は、当業者によって理解されるように、順位に関するＫＷ一元分散分析を使用して決定する。
実施例７
表１に記載されるバイオマーカーの産物を使用する、正常個体からの遺伝子発現プロフィールと比較した、膀胱癌を有する個体からの血液サンプルの遺伝子発現プロフィールの分析
本実施例は、健常患者から採取した血液サンプルと比較して、膀胱癌を有する患者から採取した血液サンプルにおけるディファレンシャルな遺伝子発現を検出することによって本発明の個々のバイオマーカーを同定するための、特許請求された発明の使用を実証する。
血液サンプルは、本明細書に定義されたような膀胱癌を有すると臨床的に診断された患者；本明細書に定義されたような膀胱癌を有さないと臨床的に診断された患者および１例以上の試験患者から採取する。次いで、本発明のバイオマーカーの組み合わせの遺伝子発現プロフィールを分析し、試験個体プロフィールを２つの対照プロフィールと比較する。
溶解した全血からの総ｍＲＮＡを各患者から採取し、TRIzol（商標）試薬（ＧＩＢＣＯ）を使用して最初に単離し、次いで、各血液サンプルについて蛍光標識したプローブを、生成し、変性させ、そして表１に記載されるような遺伝子の各々に対応するオリゴヌクレオチドを含むＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（登録商標）Ｕ１３３ バージョン２．０マイクロアレイにハイブリダイズさせる。次いで、アレイに対する特異的ハイブリダイゼーションの検出は、ＧＭＳスキャナー４１８を用いるスキャニング、およびScanalyzerソフトウェア（Michael Eisen，スタンフォード大学）を用いる実験データの処理、続いてGeneSpringソフトウェア（Silicon Genetics，カリフォルニア）分析によって測定する。２つの対照集団および試験個体の間の、バイオマーカーに対応する血液サンプル中のＲＮＡのディファレンシャルな発現は、Wilcox Mann Whitney順位和検定（Glantz SA.Primer of Biostatistics.5th ed. ニューヨーク，米国：McGraw-Hill Medical Publishing Division，２００２）を使用する統計学的解析によって決定される。
実施例８
膀胱癌または膀胱癌の段階を非膀胱癌から区別する際に有用な分類子および組み合わせを同定するためのロジスティック回帰の適用
表１０および／または表１３におけるバイオマーカーについてのＲＮＡ産物のレベルに対応するデータは、QiagenのQuantiTest（商標）Green ＰＣＲキットを使用する定量リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ（ＱＲＴ−ＰＣＲ）を使用して、参照（トレーニング集団）に対して決定することができる。１つの場合において、参照集団は、膀胱癌を有する個体（膀胱癌の段階には関係ない）および膀胱癌を有さない個体から成る。別の例において、参照集団は、膀胱癌の段階を有する個体（例えば、早期の膀胱癌）および膀胱癌を有さない個体から成る（早期の膀胱癌のスクリーニング／診断のために有用な組み合わせを同定するため）。各遺伝子の参照集団中の個体の各々からのΔＣｔ値（すなわち、ハウスキーピング遺伝子からのＣｔに対して、表１０のバイオマーカーのＲＮＡ産物のＣｔを比較する）から成る参照データセットは、あるものは膀胱癌を有し、あるものは膀胱癌を有さない個体の集団を横切ってＱＲＴ−ＰＣＲから生成したデータを使用して作製することができる。ハウスキーピング遺伝子は、その名称が暗示するように、膀胱癌を有する個体と膀胱癌を有さない個体との間で統計学的な違いを伴って変化しないものであることに留意のこと。本発明者らは、ＧＡＰＤＨまたはβ−アクチンのいずれもハウスキーピング遺伝子として有用ではないことに気付き、そのため、別のハウスキーピング遺伝子、例えば、ＲＰＬＰ０、Ｂ２Ｍ、ＲＰＳ１８などが利用されるべきである。ロジスティック回帰モデルは、生成したΔＣｔ値を使用して、１０個の遺伝子の各々の可能な組み合わせに適用することができる。このようにして、以下の数式１の型である得られる分類子が生成される。
Ｘ＝ロジット（Ｐ）＝ｌｎ（Ｐ／（１−Ｐ））＝ｂ０＋ｂ１ΔＣｔ１＋ｂ２ΔＣｔ２＋．．．＋ｂｎΔＣｔｎ （式１）
ここで、Ｐ＝患者サンプルが「疾患である」（例えば、膀胱癌を有する）と診断される確率である。このようにして、Ｘ＝ロジットは上記のように定義することができる。
Ｘ≧閾値である場合、Ｙ＝１（診断＝「疾患を有する」、例えば、膀胱癌を有する）であり、Ｘ＜閾値である場合、Ｙ＝０（診断＝「対照」）である。理解されるように、閾値は、必要とされる所望の特異性または感度を設定するために選択される。得られるＲＯＣ面積および残りの感度または特異性が決定され、従って、生成された診断が真の陽性または偽陽性の結果である確率の尺度を提供する。
相互検証
上記のような方法を使用して、これらの組み合わせに特異的な有用なバイオマーカーおよび分類子の組み合わせを同定したら、公知の１つ以上の方法を使用するトレーニングセットを使用して、結果を相互検証できる。例えば、ＷＥＫＡ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗｗ．ｃｓ．ｗａｉｋａｔｏ．ａｃ．ｎｚ／〜ｍｌ／ｗｅｋａ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）（２２）を使用して、得られる分類子を相互検証できる。１つの実施形態において、２つの異なる相互検証スキームが使用可能である。例えば、WEKA MetaAnalysis関数は、単純ロジスティックモデルを使用して、トレーニングデータセットおよび解析された各々の新たに解析されたデータセットの１００個のブートストラップの複製を構築するために使用することができる。次いで、得られるロジスティック式（分類子）の各々を、１０倍の相互検証によって解析し、すべての数式についての結果を平均することができる（「ブートストラップ集合」）。
予測（ブラインド）試験
１つ以上の得られる分類子をさらに確証および選択するために、臨床サンプルのブラインドセットを試験することができる。対照および膀胱癌を有する被験体から成る試験セットを使用する。好ましくは、ブラインド試験セット個体の誰も、参照データセットを作製する際に使用されなかった。各ブラインドサンプルについての測定値は、トレーニングセットによって定義され、かつ相互検証された得られる分類子の１つ以上を使用して評価することができる。加えて、得られる分類子の２つ以上を使用する投票スキームもまた使用できる。例えば、初期計算、バイナリロジックゲート、および「コミッティマシン」投票から成るアルゴリズムを使用することができる。初期計算：ロジット関数Ｘｉは参照データセットに対して、ＲＯＣ面積＞例えば、０．６、０．７、０．８、または０．９を与えた数式（Ｉ＝１〜Ｎ）の各々について計算することができる。ロジックゲート：Ｘｉ＜ｊの閾値である場合、（ここで、ｊは数式の数を示す）、ブラインドサンプルは、数式番号ｊについてスコアＳｉ＝−１を与えられる。Ｘｉ≧ｊの閾値である場合は、これは数式番号ｊについてスコアＳｉ＝＋１を与えられる。コミッティマシンによる投票（２３）：次いで、投票は、診断のために使用される１０個以上のロジット式からのスコアに対して取ることができる。定義により、投票＝Σ Ｓｉである。投票≦０である場合、サンプルは「前立腺癌なし」と呼ばれるのに対して、投票＞０である場合、サンプルは「疾患を有するかまたは膀胱癌を有する」と呼ばれる。
実施例９
非膀胱癌から膀胱癌を区別する際に有用である、分類子を生じる数学的モデルとしての選択されたバイオマーカーの２つの遺伝子の「比率」の適用
ハウスピーピング遺伝子を同定する必要性を回避するために、２つの発現された遺伝子のディファレンシャルな発現を直接的に比較するストラテジーが実行され、驚くべきことに、ハウスキーピング遺伝子を利用する場合よりも有益であることが判明した。（血液からではなく）組織からのｃ−ＤＮＡアレイデータを使用する、疾患群の区別のための対様遺伝子比率の使用は以前に記載されている（１６、１７）。この技術は、生物学的因子および技術的因子によって引き起こされる個体間の変動を減少し、また、データの獲得のための発現測定プラットフォームとは独立している。対様遺伝子法の他の利点は、この方法が、サンプル量の入力とは比較的に独立しており、ハウスキーピング遺伝子を負荷対照として使用することを不要にし、そしてこの方法は少量のＲＮＡのみを必要とするという事実を含む。最後に、下方制御された遺伝子に対する、上方制御された遺伝子の比率の使用はシグナルを増幅し、従って、アッセイをより高感度にする。
表１０に示されるように、５つのバイオマーカーが、膀胱癌患者と対照患者との間で上方制御され、そして５つのバイオマーカーが下方制御されたとして同定された。本実施例において、２つのバイオマーカーの組み合わせ（１つは上方制御され、１つは下方制御される（ここで、上方制御されるとは、膀胱癌を有さない患者と比較して、膀胱癌を有する患者においてより高いレベルの発現を有する遺伝子をいい、下方制御されるとは、膀胱癌を有さない患者と比較して、膀胱癌を有する患者においてより低いレベルの発現を有する遺伝子をいう））は、表１０に列挙されたバイオマーカーからの異なる対の組み合わせの診断能力を決定するために、ロジスティック回帰への入力のために選択した。多数の組み合わせが最大確率ロジスティック回帰において評価され、「膀胱癌」対「対照」の区別能力を決定した（ＲＯＣ面積＞０．５）。
Figure 2008539728
 試験された対のうち、ＩＧＦＢＰ７とＣＨＤ２との比率ΔＣｔから成るトレーニング集団を使用することが、膀胱癌患者（ｎ＝２０）を正常患者（ｎ＝１４）から区別する際に最高の性能であった。この対のスコアリングは、０．９０７のＡＵＣ、８０．０％の感度（９５％ ＣＩ ５６．３〜９４．１％）、および９２．９％の特異性（９５％ ＣＩ ６６．１〜９８．８％）を生じる。ＩＧＦＢＰ７とＮＥＬＬ２の間のΔＣｔは２番目によいとランク付けられ、０．８７９のＡＵＣ、９０．０％の感度（９５％ ＣＩ ６８．３〜９８．５％）、および８５．７％の特異性（９５％ ＣＩ ５７．２〜９７．８％）であった。
この比率は、引き続いて、より多くの個体から成る第２のトレーニング集団に対して試験され、すなわち、このコホートにおいて生じるアッセイの感度は８３％であり、４０例の膀胱癌の症例のうちの３４例が正確に予測された。注目すべきものとして、このアッセイによって膀胱癌を有さないと誤って予測された６例の膀胱癌の患者のうちの３例が、切除された表在性膀胱癌を有する患者であった。このことは、患者の予後診断を決定する際に有用であり得る。アッセイの特異性は９３％であり、２７例の健常対照のうちの２例のみが膀胱癌を有するとして誤って予測された。
実施例９
膀胱癌であるかそうでないかを区別する際に有用である分類子を生じる数学的モデルとしての選択されたバイオマーカーの２つの遺伝子の「比率」の適用
表１３からのマーカーのサブセットを、膀胱癌を有する患者をスクリーニングおよび／または診断するためのバイオマーカーの使用のための遺伝子の比率の有用な組み合わせをより徹底的に同定するために選択した。膀胱癌を有する２０例の個体および膀胱癌を有さない１４例の個体から成る参照トレーニング集団を選択した。参照データセットは、選択されたバイオマーカーＳＮＸ１６、ＣＳＰＧ６、ＩＧＦＢＰ７、およびＣＴＳＤおよびＴＮＦＲＳＦ７、ＮＥＬＬ２、およびＣＨＤ２のＲＮＡ産物の比率のΔＣｔに対応する。従って、ΔＣｔ比率は、QiagenのQuantiTect（商標）SYBR（登録商標）Green ＰＣＲキットを使用する定量リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ（ＱＲＴ−ＰＣＲ）を使用して、ＣＨＤ２／ＣＴＳＤ、ＣＨＤ２／ＳＮＸ１６、ＣＨＤ２／ＣＳＰＧ６、ＣＨＤ２／ＩＧＦＢＰ７、ＣＨＤ２／ＴＮＦＲＳＦ７、ＣＨＤ２／ＮＥＬＬ２、ＮＥＬＬ２／ＳＮＸ１６、ＮＥＬＬ２／ＣＳＰＧ６、ＮＥＬＬ２／ＩＧＦＢＰ７、ＮＥＬＬ２／ＣＴＳＤ、ＮＥＬＬ２／ＴＮＦＲＳＦ７、ＴＮＦＲＳＦ７／ＳＮＸ１６、ＴＮＦＲＳＦ７／ＣＳＰＧ６、ＴＮＦＲＳＦ７／ＩＧＦＢＰ７、ＴＮＦＲＳＦ７／ＣＳＴＤ、ＣＴＳＤ／ＳＮＸ１６、ＣＴＳＤ／ＣＳＰＧ６、ＣＴＳＤ／ＩＧＦＢＰ７、ＩＧＦＢＰ７／ＳＮＸ１６、ＩＧＦＢＰ７／ＣＳＰＧ６、およびＣＳＰＧ６／ＳＮＸ１６について決定した。ここで、各対のＣｔは、Ｃｔ値のより良好な比較を可能にするために、単一の９６ウェルプレート中で測定した（当業者によって理解されるように、類似の結果が、異なる色の蛍光を用いて、多重プローブおよびTaqManプローブを使用して得ることが可能な点に留意すること）。この様式で対を同定することは、単一項として遺伝子の対の発現レベルを表示するために、値の項をロジスティック回帰に入力することを可能にする。それゆえに、１つの比率、２つの比率、３つの比率、４つの比率、５つの比率、６つの比率、またはすべての比率の組み合わせを作製することができ、その結果、以下の数式のロジスティック回帰式（分類子）が得られる：
Ｘ＝ロジット（Ｐ）＝ｌｎ（Ｐ／（１−Ｐ））＝ｂ０＋ｂ１ΔＣｔ１＋ｂ２ΔＣｔ２＋．．．＋ｂｎΔＣｔｎ （式１）
Ｐ＝患者サンプルが「疾患である」（例えば、膀胱癌を有する）と診断される確率である場合、以下のように、単一の比率の組み合わせについての型を取る：
Ｘ＝ロジット（Ｐ）＝ｌｎ（Ｐ／（１−Ｐ））＝ｂ０＋ｂ１ΔＣｔ１ （式２）
ここで、ΔＣｔ１は上記に記された比率のいずれか１つに対応するデータである。
または、以下のように、２つの比率の組み合わせについての型を取る：
Ｘ＝ロジット（Ｐ）＝ｌｎ（Ｐ／（１−Ｐ））＝ｂ０＋ｂ１ΔＣｔ１＋ΔＣｔ２ （式３）
ここで、ΔＣｔ１は上記に記された比率のいずれか１つに対応するデータであり、ΔＣｔ２もまた上記に記された比率のいずれかに対応するデータである。
同様に、すべての３つの比率の組み合わせ、４つの比率の組み合わせ、および５つの比率の組み合わせを試験した。
ＲＯＣ面積＞０．５、０．５５より上、０．６より上、０．６５より上、０．７より上、０．７５より上、０．８より上、０．８５より上、０．９より上または０．９５より上を有する各々の得られる分類子は、膀胱癌を有する試験個体または膀胱癌を有さない試験個体を診断またはスクリーニングするために使用することができる。単一の比率、２つの比率、３つの比率、および４つの比率の組み合わせから生じる分類子のグラフの結果を表１−４に示す。
代表的な分類子は、膀胱癌を有する４０例の個体および２７例の対照個体の拡大されたトレーニング集団を使用する４つの比率であり、表１９に示され、３つの比率の代表的な分類子は表２０に示され、２つの比率の代表的な分類子は表２１に示され、そして単一の比率の代表的な分類子は以下の表２２に示される。
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本願を通して引用されるすべての参考文献、特許、および特許出願（公開された特許出願を含む）の内容は、参照により本明細書に援用される。
等価物
当業者は、本明細書に記載された本発明の特定の実施形態に対する多くの等価物を、日常的な実験を超えないものを使用して、認識するか、または確認する。このような等価物は添付の特許請求の範囲に含まれることが意図される。
実施例９に記述される７個のバイオマーカーの比率の２１通りのすべての可能な組み合わせを示す本発明の１つの実施形態のグラフ表示である。各々の可能なバイオマーカーの組み合わせから生じるロジスティック回帰の各分類子についてのＲＯＣは青で記している。各々の得られる分類子について、感度は赤で記し、ここで特異性は９０％に設定されている。感度が９０％に設定されている各分類子についての特異性は緑色で記している。 実施例９に記す７個のバイオマーカーの２つの比率の２１０通りのすべての可能な組み合わせを示す本発明の１つの実施形態のグラフ表示である。各々の可能なバイオマーカーの組み合わせから生じるロジスティック回帰の各分類子についてのＲＯＣは青で記している。各々の得られる分類子について、感度は赤で記し、ここで特異性は９０％に設定されている。感度が９０％に設定されている各分類子についての特異性は緑色で記している。 実施例９に記す７個のバイオマーカーの３つの比率の１３３０通りの可能な組み合わせのうちの１２９５通りを示す本発明の１つの実施形態のグラフ表示である（全数検索を行うことは可能であるが、しかしこの場合は完了しなかったことに注意のこと）。各々の可能なバイオマーカーの組み合わせから生じるロジスティック回帰の各分類子についてのＲＯＣは青で記している。各々の得られる分類子について、感度は赤で記し、ここで特異性は９０％に設定されている。感度が９０％に設定されている各分類子についての特異性は緑色で記している。 実施例９に記す７個のバイオマーカーの４つの比率の５９８５通りの可能な組み合わせのうちの５２５０通りを示す本発明の１つの実施形態のグラフ表示である（分析のためのコンピューターの時間の長さを単に増加させることで、全数検索を行うことは可能であることに注意のこと）。各々の可能なバイオマーカーの組み合わせから生じるロジスティック回帰の各分類子についてのＲＯＣは青で記している。各々の得られる分類子について、感度は赤で記し、ここで特異性は９０％に設定されている。感度が９０％に設定されている各分類子についての特異性は緑色で記している。

Claims (32)

  1. 被験体において膀胱癌または膀胱癌の段階をスクリーニングする方法であって：
    （ａ）該被験体の単離された血液サンプル中で、表１３に示されるバイオマーカーの群から選択される第１のバイオマーカーのＲＮＡ産物のレベル；および該バイオマーカーの群から選択される第２のバイオマーカーのＲＮＡ産物のレベルを決定する工程；ならびに
    （ｂ）該第１のバイオマーカーおよび第２のバイオマーカーの各々について、該ＲＮＡ産物の対照レベルを、該バイオマーカーによってコードされ、かつ１例以上の対照被験体からの単離された血液サンプル中で検出されるＲＮＡの対照レベルと比較する工程であって、ここで、該バイオマーカーの各々について、工程（ａ）のＲＮＡの該レベルと該対照レベルとの統計学的に有意な違いの決定が、該被験体における膀胱癌、または該膀胱癌の段階を示す、工程
    を包含する、方法。
  2. 被験体において膀胱癌または膀胱癌の段階をスクリーニングする方法であって：
    （ａ）該被験体の単離された血液サンプル中で、表１３に示されるバイオマーカーの群から選択されるバイオマーカーによってコードされるＲＮＡのレベルを決定する工程；ならびに
    （ｂ）該レベルを対照レベルと比較する工程であって、該対照レベルは該バイオマーカーによってコードされ、かつ１例以上の対照被験体の単離された血液サンプル中で検出されるＲＮＡ産物のレベルであり、ここで、工程（ａ）の該レベルと該対照レベルとの違いが、該被験体における膀胱癌、または該膀胱癌の段階を示す、工程
    を包含する、方法。
  3. 該バイオマーカーの群がＳＮＸ１６、ＣＳＰＧ６、ＩＧＦＢＰ７、ＣＴＳＤおよびＴＮＦＲＳＦ７、ＮＥＬＬ２、ならびにＣＨＤ２に限定される、請求項１または２のいずれかに記載の方法。
  4. 該単離された血液サンプルが全血から成る、請求項１または２のいずれかに記載の方法。
  5. 該単離された血液サンプルが一滴の血液から成る、請求項１または２のいずれかに記載の方法。
  6. 該バイオマーカーの各々についての工程（ａ）の該ＲＮＡのレベルの決定が、該被験体の血液サンプルからＲＮＡを最初に単離することによってもたらされる、請求項１に記載の方法。
  7. 該バイオマーカーの各々についての工程（ａ）の該ＲＮＡのレベルの決定が、定量リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ（ＱＲＴ−ＰＣＲ）を使用してもたらされる、請求項１に記載の方法。
  8. 該バイオマーカーの各々についての工程（ａ）の該ＲＮＡのレベルの決定が、該バイオマーカーの各々のＲＮＡ産物に相補的な少なくとも１つのプローブを含むアレイに、該バイオマーカーの各々によってコードされる該ＲＮＡ産物をハイブリダイズすることによってもたらされる、請求項１に記載の方法。
  9. 該バイオマーカーの各々についての工程（ａ）の該ＲＮＡのレベルの決定が、該ＲＮＡ産物に由来するｃＤＮＡ、ＰＣＲ産物、またはＥＳＴを、該バイオマーカーの各々のｃＤＮＡ、ＰＣＲ産物、またはＥＳＴに相補的な少なくとも１種のプローブを含むアレイにハイブリダイズさせることでもたらされる、請求項１に記載の方法。
  10. 対照レベルが膀胱癌を有さない１例以上の個体に由来する、請求項１に記載の方法。
  11. 被験体において膀胱癌または膀胱癌の段階をスクリーニングする方法であって：
    （ａ）該被験体の単離された血液サンプル中で、表１３に示されるバイオマーカーの群から選択される第１のバイオマーカーのタンパク質産物のレベル；および該バイオマーカーの群から選択される第２のバイオマーカーのタンパク質産物のタンパク質発現レベルを決定する工程；ならびに
    （ｂ）該第１のバイオマーカーおよび第２のバイオマーカーの各々について、該タンパク質産物のレベルを、該バイオマーカーによってコードされ、かつ１例以上の対照被験体からの単離された血液サンプル中で検出されるタンパク質産物の対照レベルと比較する工程であって、ここで、該バイオマーカーの各々について、工程（ａ）のタンパク質産物の該レベルと該対照レベルとの統計学的に有意な違いの決定が、該被験体における膀胱癌、または膀胱癌の段階を示す、工程
    を包含する、方法。
  12. 被験体において膀胱癌または膀胱癌の段階をスクリーニングする方法であって：
    （ａ））該被験体の単離された血液サンプル中で、表１３に示されるバイオマーカーの群から選択されるバイオマーカーによってコードされるタンパク質産物のレベルを決定する工程；ならびに
    （ｂ）該レベルを対照レベルと比較する工程であって、該対照レベルは該バイオマーカーによってコードされ、かつ１例以上の対照被験体の単離された血液サンプル中で検出されるタンパク質産物のレベルであり、ここで、工程（ａ）の該レベルと該対照レベルとの違いの決定が、該被験体における膀胱癌、または膀胱癌の段階を示す、工程
    を包含する、方法。
  13. 少なくとも２種の固有のバイオマーカーのタンパク質産物に選択的に結合する２種以上の単離されたタンパク質のコレクションを含む組成物であって、ここで、該固有のバイオマーカーの各々が表１３に列挙されるバイオマーカーの群から選択される、組成物。
  14. バイオマーカー特異的プライマーの２つ以上のセットのコレクションを含む組成物であって、ここで、各セットが１つの固有のバイオマーカーに相補的な二本鎖ＤＮＡを選択的に増幅し、該固有のバイオマーカーの各々が表１３に列挙されるバイオマーカーの群から選択される、組成物。
  15. バイオマーカー特異的プライマーの３つ以上のセットのコレクションを含む組成物であって、ここで、各セットが１つの固有のバイオマーカーに相補的な二本鎖ＤＮＡを選択的に増幅し、該固有のバイオマーカーの各々が表１３に列挙されるバイオマーカーの群から選択される、組成物。
  16. バイオマーカー特異的プライマーの４つ以上のセットのコレクションを含む組成物であって、ここで、各セットが１つの固有のバイオマーカーに相補的な二本鎖ＤＮＡを選択的に増幅し、該固有のバイオマーカーの各々が表１３に列挙されるバイオマーカーの群から選択される、組成物。
  17. バイオマーカー特異的プライマーの５つ以上のセットのコレクションを含む組成物であって、ここで、各セットが１つの固有のバイオマーカーに相補的な二本鎖ＤＮＡを選択的に増幅し、該固有のバイオマーカーの各々が表１３に列挙されるバイオマーカーの群から選択される、組成物。
  18. バイオマーカー特異的プライマーの２つ以上のセットのコレクションを含む組成物であって、ここで、各セットが１つの固有のバイオマーカーに相補的な二本鎖ＤＮＡを選択的に増幅し、該固有のバイオマーカーの各々が、ＳＮＸ１６、ＣＳＰＧ６、ＩＧＦＢＰ７、ならびにＣＴＳＤおよびＴＮＦＲＳＦ７、ＮＥＬＬ２およびＣＨＤ２から成るバイオマーカーの群より選択される、組成物。
  19. バイオマーカー特異的プライマーの３つ以上のセットのコレクションを含む組成物であって、ここで、各セットが１つの固有のバイオマーカーに相補的な二本鎖ＤＮＡを選択的に増幅可能であり、該固有のバイオマーカーの各々が、ＳＮＸ１６、ＣＳＰＧ６、ＩＧＦＢＰ７、ならびにＣＴＳＤおよびＴＮＦＲＳＦ７、ＮＥＬＬ２およびＣＨＤ２から成るバイオマーカーの群より選択される、組成物。
  20. 少なくとも２種の固有のバイオマーカーのタンパク質産物に選択的に結合する２種以上の単離されたタンパク質のコレクションを含む組成物であって、ここで、固有のバイオマーカーの各々が、ＳＮＸ１６、ＣＳＰＧ６、ＩＧＦＢＰ７、ならびにＣＴＳＤおよびＴＮＦＲＳＦ７、ＮＥＬＬ２およびＣＨＤ２から成るバイオマーカーの群より選択される、組成物。
  21. 該単離されたタンパク質が抗体である、請求項２０に記載の組成物。
  22. 単離された生物学的サンプル中で、その各々が固有のバイオマーカーによってコードされる少なくとも２種の別個のタンパク質の存在を選択的に結合するための、請求項１３に記載の組成物の使用であって、ここで、該固有のバイオマーカーの各々が表１３に示されるバイオマーカーから成る群から選択される、使用。
  23. 単離された生物学的サンプル中で、少なくとも２種の固有のバイオマーカーに相補的な二本鎖ＤＮＡを選択的に増幅するための、請求項１４に記載の組成物の使用であって、ここで、該固有のバイオマーカーの各々が表１３に列挙されるバイオマーカーから成る群から選択される、使用。
  24. 単離された生物学的サンプル中で、少なくとも３種の固有のバイオマーカーに相補的な二本鎖ＤＮＡを選択的に増幅するための、請求項１５に記載の組成物の使用であって、ここで、該固有のバイオマーカーの各々が表１３に列挙されるバイオマーカーから成る群から選択される、使用。
  25. 単離された生物学的サンプル中で、少なくとも４種の固有のバイオマーカーに相補的な二本鎖ＤＮＡを選択的に増幅するための、請求項１６に記載の組成物の使用であって、ここで、該固有のバイオマーカーの各々が表１３に列挙されるバイオマーカーから成る群から選択される、使用。
  26. 単離された生物学的サンプル中で、少なくとも５種の固有のバイオマーカーに相補的な二本鎖ＤＮＡを選択的に増幅するための、請求項１７に記載の組成物の使用であって、ここで、該固有のバイオマーカーの各々が表１３に列挙されるバイオマーカーから成る群から選択される、使用。
  27. 単離された生物学的サンプル中で、少なくとも２種の固有のバイオマーカーに相補的な二本鎖ＤＮＡを選択的に増幅するための、請求項１８に記載の組成物の使用であって、ここで、該固有のバイオマーカーの各々がＳＮＸ１６、ＣＳＰＧ６、ＩＧＦＢＰ７、ならびにＣＴＳＤおよびＴＮＦＲＳＦ７、ＮＥＬＬ２およびＣＨＤ２から成るバイオマーカーの群より選択される、使用。
  28. 単離された生物学的サンプル中で、少なくとも３種の固有のバイオマーカーに相補的な二本鎖ＤＮＡを選択的に増幅するための、請求項１９に記載の組成物の使用であって、ここで、該固有のバイオマーカーの各々がＳＮＸ１６、ＣＳＰＧ６、ＩＧＦＢＰ７、ならびにＣＴＳＤおよびＴＮＦＲＳＦ７、ＮＥＬＬ２およびＣＨＤ２から成るバイオマーカーの群より選択される、使用。
  29. 被験体から単離された血液サンプル中で、膀胱癌または膀胱癌の段階についてスクリーニングするための、請求項１３、１４、１５、１６、１７、１８または１９のいずれか一項に記載の組成物の使用。
  30. 請求項１に記載の方法を実施するためのキットであって、該キットは、バイオマーカー特異的プライマーの各セットが固有のバイオマーカーに相補的な二本鎖ＤＮＡを生じ、固有のバイオマーカーは各々該バイオマーカーの群から選択される、バイオマーカー特異的プライマーの少なくとも２つのセット；
    （ｂ）逆転写酵素活性を有する酵素；
    （ｃ）耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素、および
    （ｄ）標識手段
    を含み；
    ここで、該プライマーセットの各々は、被験体中での該固有のバイオマーカーの定量的発現レベルを検出するために使用される、キット。
  31. 請求項１に記載の方法を実施するためのキットであって、該キットは、バイオマーカー特異的プライマーの各セットが固有のバイオマーカーに相補的な二本鎖ＤＮＡを生じ、各固有のバイオマーカーはＳＮＸ１６、ＣＳＰＧ６、ＩＧＦＢＰ７、ＣＴＳＤ、ＴＮＦＲＳＦ７、ＮＥＬＬ２、ＣＨＤ２から成るバイオマーカーの群より選択される、バイオマーカー特異的プライマーの少なくとも２つのセット；
    （ｂ）逆転写酵素活性を有する酵素；
    （ｃ）耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素、および
    （ｄ）標識手段
    を含み；
    ここで、該プライマーセットの各々は、被験体中での該固有のバイオマーカーの定量的発現レベルを検出するために使用される、キット。
  32. キットであって、
    （ａ）請求項１４、１５、１６、１７、１８または１９のいずれか一項に記載の組成物；
    （ｂ）逆転写酵素活性を有する酵素；
    （ｃ）耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素、および
    （ｄ）標識手段
    を含み；
    ここで、バイオマーカー特異的プライマーのセットの各々が、被験体中で固有のバイオマーカーの定量的発現レベルを検出するために使用される、キット。
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