CN110691853B - 利用单一荧光通道聚合酶链反应设备的多重核酸检测方法 - Google Patents

利用单一荧光通道聚合酶链反应设备的多重核酸检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种利用TaqMan探针以及肽核酸(PNA)探针的在单一荧光通道聚合酶链反应设备(PCR machine)中的多重核酸检测方法。本发明能够在混合使用设计为较低熔解温度(Tm)的肽核酸(PNA)探针以及TaqMan探针时在单一荧光通道聚合酶链反应设备(PCR machine)中同时对2个基因进行检测，因此能够节省购买高价的多通道聚合酶连锁反应设备(PCR machine)所需要的费用支出，从而实现良好的经济性能。

Description

利用单一荧光通道聚合酶链反应设备的多重核酸检测方法
技术领域
本发明涉及一种在单一荧光通道聚合酶链反应设备(PCR machine)中对多种核酸进行检测的方法，尤其涉及一种利用肽核酸(PNA)探针以及TaqMan探针在单一荧光通道聚合酶链反应设备(PCR machine)中对多种核酸进行检测的方法。
背景技术
伴随着实时聚合酶链反应设备(PCR machine)的问世，可以实时地对靶核酸进行扩增以及检测，最终成为了用于对靶以及生物标记的进行识别的核心工具并被广泛地应用于体外诊断、食品安全测试以及药物基因组学等多种应用领域。但是在生命科学产业，利用现有的实时聚合酶链反应(PCR)技术已经很难满足日益增加的对较高水准的多重核酸检测方法的需求。目前，通常使用配备4个以上荧光通道的高价实时聚合酶连锁反应设备(PCRmachine)或购买采用多重荧光标记探针的高价检测试剂盒并利用熔解曲线分析(Meltingcurve analysis)对靶核酸的检测进行确认。
虽然开发出了使用现有的实时聚合酶连锁反应设备(PCR machine)对靶基因进行多重检测的技术，但是在单一荧光通道聚合酶链反应设备(PCR machine)中检测多重核酸的方法仍然具有通道内的干涉现象以及熔解温度(Tm)变化等诸多缺点。因此，急需开发出能够在目前使用的单一荧光通道聚合酶链反应设备(PCR machine)中克服通道内的干涉现象的多重核酸检测方法。
发明内容
本发明的发明人在对利用单一荧光通道聚合酶链反应设备(PCR machine)检测2种基因的方法进行研究的过程中，着眼于因为肽核酸(PNA)探针与TaqMan探针同时经过核酸扩增过程且包含扩增过程中的信号，因此能够通过在扩增结束之后额外执行熔解曲线分析(Melting curve analysis)而检测出靶基因的特点，发现了利用TaqMan探针在扩增信号(Amplification plot)中检测出第1基因，并利用设计为较低熔解温度(Tm)值的肽核酸(PNA)探针检测出第2基因的方法。
因此，本发明的目的在于提供一种利用肽核酸(PNA)探针TaqMan探针在单一荧光通道聚合酶链反应设备中对2个基因进行检测的方法。
在本发明的一方面，提供一种在单一荧光通道聚合酶链反应设备中对2个基因进行检测的方法，包括：(a)利用第1基因的TaqMan探针以及第2基因的肽核酸(PNA)探针执行聚合酶链反应(PCR)的步骤；以及，(b)利用扩增信号(Amplification plot)对第1基因的检测进行确认，并利用熔解曲线分析(Melting curve analysis)对第2基因的检测进行确认的步骤。
在一个实施例中，步骤(a)中的上述TaqMan探针的使用浓度能够是1至10pmole/μl。
在一个实施例中，步骤(a)中的上述肽核酸(PNA)探针的熔解温度(Tm)值能够是30至60℃。
在一个实施例中，步骤(a)中的上述肽核酸(PNA)探针的使用浓度能够是5至50pmole/μl。
在一个实施例中，步骤(a)中的第2基因的正向(forward)引物与逆向(reverse)引物的引物比例为1:1。
在一个实施例中，提供一种检测方法，其特征在于：步骤(a)中的聚合酶链反应(PCR)是在95℃下执行3分钟之后再重复执行95℃(30秒)[变性(Denaturation)步骤]→55℃(30秒)[退火(Annealing)步骤]→72℃(30秒)[延伸(Extension)步骤]的过程。
在一个实施例中，提供一种检测方法，在步骤(b)的聚合酶链反应(PCR)延伸(Extension)步骤中利用扩增信号(Amplification plot)对第1基因进行确认之后，利用熔解曲线分析(Melting curve analysis)对第2基因进行确认。
本发明发现了通过使用设计为较低熔解温度(Tm)值的肽核酸(PNA)探针排除通道内的干涉现象的方法，从而揭示了在单一荧光通道聚合酶链反应设备(PCR machine)中利用肽核酸(PNA)探针以及TaqMan探针对2个基因进行检测的方法。适用本发明的在单一荧光通道聚合酶链反应设备(PCR machine)中同时对2种基因进行检测的方法，能够使用现有的单一荧光通道聚合酶链反应设备(PCR machine)，因此能够节省购买高价的多通道聚合酶连锁反应设备(PCR machine)所需要的费用支出，从而实现良好的经济性能。
附图说明
图1是用于对适用本发明的在单一荧光通道聚合酶链反应设备(PCR machine)中对2个基因进行检测的方法进行说明的概要性概念图。
图2是对适用本发明的单一荧光通道聚合酶链反应设备(PCR machine)的一实例进行图示的照片。
图3a是在实施例2的聚合酶链反应(PCR)退火(Annealing)步骤中利用特异性肽核酸(PNA)探针对扩增信号(Amplification plot)进行确认的结果，图3b至图3d中对熔解曲线分析(Melting curve analysis)结果进行了图示。
图4a是在实施例3的聚合酶链反应(PCR)延伸(Extension)步骤中利用特异性肽核酸(PNA)探针对扩增信号(Amplification plot)进行确认的结果，图4b至图4d中对熔解曲线分析(Melting curve analysis)结果进行了图示。
图5a是在实施例4的聚合酶链反应(PCR)延伸(Extension)步骤中利用TaqMan探针对扩增信号(Amplification plot)进行确认的结果，图5b中对熔解曲线分析(Meltingcurve analysis)结果进行了图示。
图6a至图6e是对在实施例5中使用psbA基因的对称引物时特异性肽核酸(PNA)探针对IS6110扩增信号的干涉与否进行评估的结果，分别为在仅对IS6110基因进行扩增的情况下对扩增信号(Amplification plot)进行确认的结果(图6a)以及熔解曲线分析(Melting curve analysis)结果(图6b)；在同时对IS6110基因以及psbA进行扩增的情况下对扩增信号(Amplification plot)进行确认的结果(图6c)以及熔解曲线分析(Meltingcurve analysis)结果(图6d)；以及，对上述2个结果进行合并(merge)的结果(图6e)。
图7a至图7e是对在实施例6中使用psbA基因的非对称引物时与实施例5相同量的psbA基因的特异性肽核酸(PNA)探针对IS6110扩增信号的干涉与否进行评估的结果，分别为在仅对IS6110基因进行扩增的情况下对扩增信号(Amplification plot)进行确认的结果(图7a)以及熔解曲线分析(Melting curve analysis)结果(图7b)；在同时对IS6110基因以及psbA进行扩增的情况下对扩增信号(Amplification plot)进行确认的结果(图7c)以及熔解曲线分析(Melting curve analysis)结果(图7d)；以及，对上述2个结果进行合并(merge)的结果(图7e)。
图8a至图8e是对在实施例6中使用psbA基因的非对称引物时实施例7的100倍量的psbA基因的特异性肽核酸(PNA)探针对IS6110扩增信号的干涉与否进行评估的结果，分别为在仅对IS6110基因进行扩增的情况下对扩增信号(Amplification plot)进行确认的结果(图8a)以及熔解曲线分析(Melting curve analysis)结果(图8b)；在同时对IS6110基因以及psbA进行扩增的情况下对扩增信号(Amplification plot)进行确认的结果(图8c)以及熔解曲线分析(Melting curve analysis)结果(图8d)；以及，对上述2个结果进行合并(merge)的结果(图8e)。
具体实施方式
本发明提供一种在单一荧光通道聚合酶链反应设备中对2个基因进行检测的方法，包括：(a)利用第1基因的TaqMan探针以及第2基因的肽核酸(PNA)探针执行聚合酶链反应(PCR)的步骤；以及，(b)利用扩增信号(Amplification plot)对第1基因的检测进行确认，并利用熔解曲线分析(Melting curve analysis)对第2基因的检测进行确认的步骤。
适用本发明的基因检测方法，包括：(a)利用第1基因的TaqMan探针以及第2基因的肽核酸(PNA)探针执行聚合酶链反应(PCR)的步骤。
在步骤(a)中使用的TaqMan探针为水解(Hydrolysis)探针的一种，是在5’端结合荧光物质即报道基因(羧基荧光素(FAM)等)而在3’端结合抵消物质即淬灭物质(quencher)的形态，上述探针在聚合酶链反应(PCR)过程的退火(Annealing)步骤中会与靶核酸(target DNA)进行特异性杂交(hybridize)，但淬灭物质(quencher)会对荧光的显色进行抑制。但是在延伸(Extension)步骤中，原本结合到核酸模板(template)中的TaqMan探针会因为核酸聚合酶(polymerase)的核酸外切酶(exonuclease)的活性而发生水解，从而使原本被淬灭物质(quencher)抵消的报道基因(羧基荧光素(FAM)等)发生游离并使荧光显色。
在一个实施例中，能够根据质粒核酸(plasmid DNA)的浓度、引物以及聚合酶链反应设备(PCR设备)的类型确定TaqMan探针的浓度，较佳地能够使用1～10pmole/μl，但并不限定于此。
此外，在步骤(a)中使用的PNA(Peptide Nucleic Acid，肽核酸)探针是不存在于生体内的纯合成物质，与脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)的互补结合能力非常优秀。此外，上述探针具有与核酸聚合酶(polymerase)的核酸外切酶(exonuclease)的活性无关，在有互补基因的碱基序列存在时发生杂交(hybridize)并发出荧光信号的特征。
在一个实施例中，能够将肽核酸(PNA)探针的熔解温度(Tm)值设计为30～60℃的范围，较佳地能够设计为40～50℃的范围。肽核酸(PNA)探针的熔解温度(Tm)能够设计为低于TaqMan探针的熔解温度(Tm)。
在一个实施例中，能够根据质粒核酸(plasmid DNA)的浓度、引物以及聚合酶链反应设备(PCR设备)的类型确定肽核酸(PNA)探针的浓度，较佳地能够使用5～50pmole/μl，但并不限定于此。
在一个实施例中，通过肽核酸(PNA)探针检测的第2基因的正向(forward)引物与逆向(reverse)引物的引物比例并不限定于1:1。通常，肽核酸(PNA)探针以正向(forward)或逆向(reverse)引物的量较多的非对称(asymmetric)方式执行基因扩增，但是在本发明中，在正向(forward)引物与逆向(reverse)引物的量相同的情况下能够更加轻易地执行对靶核酸的检测。但是，在逆向(reverse)引物的量更多的情况下也能够执行检测。
在一个实施例中，聚合酶链反应(PCR)的执行条件能够是在95℃下执行3分钟之后再重复执行95℃(30秒)[变性(Denaturation)步骤]→55℃(30秒)[退火(Annealing)步骤]→72℃(30秒)[延伸(Extension)步骤]的过程，能够以通常执行的重复次数执行，例如能够执行25～50次，较佳地能够执行30～40次，但并不限定于此。
适用本发明的基因检测方法，包括：(b)利用扩增信号(Amplification plot)对第1基因的检测进行确认，并利用熔解曲线分析(Melting curve analysis)对第2基因的检测进行确认的步骤。
在步骤(b)中，2个基因能够是在聚合酶链反应(PCR)延伸(Extension)步骤中利用扩增信号(Amplification plot)对其扩增进行确认之后再利用熔解曲线分析(Meltingcurve analysis)对其扩增进行确认。在聚合酶链反应(PCR)扩增产物达到可利用荧光进行检测的量时的荧光信号强度被称之为临界值(threshold)，在上述扩增信号(Amplification plot)中与临界值对应的扩增循环次数称之为阈值循环次数(thresholdcycle；Ct)值。通过扩增信号(Amplification plot)或从中获得的阈值循环次数(Ct)值对来自TaqMan探针的基因进行检测，并通过熔解曲线分析(Melting curve analysis)对来自肽核酸(PNA)探针的基因进行检测。
接下来，将结合实施例对本发明进行更详细的说明。但是，下述实施例只是用于对本发明进行示例性说明，本发明的范围并不限定于此。
<实施例>
1.特异性肽核酸(PNA)的探针碱基序列的设计以及制备
为了能够仅在聚合酶链反应(PCR)的退火(Annealing)步骤中观察到肽核酸(PNA)探针的扩增信号而设计了较低的熔解温度(Tm)值，在表1中显示出了所制备的肽核酸(PNA)探针以及所使用的引物组。熔解温度(Tm)的计算值可能会因为所使用的程序类型而存在差异。在肽核酸(PNA)试验中使用的扩增对象基因是菠菜(spinacia)的psbA。
在TaqMan探针试验中使用的聚合酶链反应(PCR)引物以及探针是在为了对结核杆菌(Mycobacteria Tuberculosis)的感染进行诊断而开发的产品中使用的碱基序列，具体如表1所示，扩增对象基因为IS6110。
利用单一荧光通道聚合酶链反应(PCR)设备(ABI7500，Applied Biosystems，加利福尼亚州福斯特城，参阅图2)对对象基因进行扩增，一般的聚合酶链反应(PCR)反应液的组成如下述表2所示，引物以及探针的浓度根据各个试验进行了适当的变更。
【表1】
Figure BDA0002070887380000061
【表2】
聚合酶链反应(PCR)所需的构成成分 使用量(μl)
2×聚合酶链反应预混液(PCR premixture) 10.0
正向(forward)聚合酶链反应(PCR)引物 1.0
逆向(reverse)聚合酶链反应(PCR)引物 1.0
聚合酶链反应(PCR)探针(10pmole/μl) 1.0
核酸 2.0
蒸馏水 5.0
总体积 20.0
2.通过实时聚合酶链反应(PCR)的在特异性肽核酸(PNA)探针的退火(Annealing)步骤中的符合性评估
为了能够仅在聚合酶链反应(PCR)过程的退火(Annealing)步骤中检测到扩增信号而设计了较低的特异性肽核酸(PNA)探针的熔解温度(Tm)值，且为了确认以上述方式设计的肽核酸(PNA)探针的设计是否正确且在聚合酶链反应(PCR)过程中是否能够有效地对基因扩增信号进行检测而执行了测试。
因为使用肽核酸(PNA)探针的聚合酶链反应(PCR)通常是将正向(forward)引物以及逆向(reverse)引物的量以非对称(asymmetric)方式使用，因此以2种非对称方式以及1种对称方式的3种条件执行了测试。即，以按照20:3的比例投入更多逆向(reverse)引物的条件、投入等量的正向(forward)以及逆向(reverse)引物的条件以及按照20:3的比例投入更多正向(forward)引物的条件分别执行了聚合酶链反应(PCR)。以上述条件在95℃下执行3分钟之后再重复执行95℃(30秒)[变性(Denaturation)步骤]→55℃(30秒)[退火(Annealing)步骤]→72℃(30秒)[延伸(Extension)步骤]的过程35次，并通过扩增信号(Amplification plot)以及熔解曲线分析(Melting curve analysis)对其结果进行了测定。
如图3a至图3d所示，在3种条件中的投入更多逆向(reverse)引物的条件(A)、投入等量的条件(B)下能够通过熔解曲线分析(Melting curve analysis)观察到了扩增现象，但是在投入更多正向(forward)引物的条件(C)下通过熔解曲线分析(Melting curveanalysis)没有观察到扩增现象(图3a至图3d)。这估计是因为可与肽核酸(PNA)探针结合的核酸链(DNA strand)没有被有效扩增。这是因为在以非对称(asymmetric)方式使用聚合酶链反应(PCR)引物时，与投入量更多的引物结合的核酸链(DNA strand)必然会发生更多扩增。
借此可以确认，为了能够将在本发明中设计的特异性肽核酸(PNA)探针碱基序列有效地用于既定目的，需要使用更多逆向(reverse)引物或使用等量的正向(forward)引物以及逆向(reverse)引物。
3.通过实时聚合酶链反应(PCR)在特异性肽核酸(PNA)探针的延伸(Extension)步骤中执行符合性测试
为了确认在利用所设计的肽核酸(PNA)探针执行聚合酶链反应(PCR)延伸(Extension)的过程中是否能够检测到基因扩增信号，在与实施例2相同的条件下执行了测试，其结果如图4a至图4d所示。
如图4a至图4d所示，在延伸(Extension)步骤中对基因扩增信号(Amplificationplot)进行确认的结果，在3种条件中没有观察到扩增信号(Amplification plot)(图4a)，但是在熔解曲线分析(Melting curve analysis)中的条件(A)以及条件(B)的引物条件下均观察到了扩增现象(图4b至图4d)。即，虽然实际上基因已经得到扩增，但是因为在延伸(Extension，72℃)步骤中肽核酸(PNA)探针与靶碱基序列(target sequence)发生了分离，因此并没有检测到荧光，而在熔解曲线分析(Melting curve analysis)中能够因为基因得到扩增而检测到荧光。
4.通过实时聚合酶链反应(PCR)执行TaqMan探针的符合性测试
为了确认TaqMan探针在聚合酶链反应(PCR)过程中是否能够有效地检测到基因扩增信号，利用结核杆菌基因即IS6110的引物以及探针执行了测试。利用包含IS6110基因的3种浓度(1ng、100pg以及10pg)的质粒核酸(plasmid DNA)执行了实时聚合酶链反应(PCR)并在延伸(Extension，72℃)步骤中对聚合酶链反应(PCR)扩增与否进行了确认，其结果如图5a以及图5b所示。
如图5a以及图5b所示，根据质粒核酸(plasmid DNA)的浓度，扩增信号(Amplification plot)呈现出了在较高的浓度下被较早检测而在较低的浓度下被较晚检测的扩增曲线形态(图5a)，而通过熔解曲线分析(Melting curve analysis)无法确认基因是否得到扩增(图5b)。
5.在使用psbA基因的对称引物时对特异性肽核酸(PNA)探针的IS6110扩增信号的干涉与否确认
因为在实施例3中将荧光检测设定在延伸(Extension)步骤中时没有能够通过肽核酸(PNA)探针检测到扩增，但是通过熔解曲线分析(Melting curve analysis)实质性地确认了基因的扩增，因此对是否存在干涉现象进行了确认。确认了在将TaqMan探针与所设计的特异性肽核酸(PNA)混合并同时进行扩增时特异性肽核酸(PNA)探针是否会对TaqMan探针造成干涉。
将包含3种浓度(1ng、100pg以及10pg)的IS6110基因的质粒核酸(plasmid DNA)与9pg的psbA质粒核酸(plasmid DNA)分别进行混合并执行了聚合酶链反应(PCR)，其反应液的组成如下述表3所示。此外，仅使用包含IS6110基因的质粒核酸(plasmid DNA)执行了聚合酶链反应(PCR)，其反应液的组成如下述表4所示。
以上述条件在95℃下执行3分钟之后再重复执行95℃(30秒)[变性(Denaturation)步骤]→55℃(30秒)[退火(Annealing)步骤]→72℃(30秒)[延伸(Extension)步骤]的过程35次，并在延伸(Extension)步骤中执行了对扩增信号的检测。此外，psbA基因的正向(forward)以及逆向(reverse)引物使用了相同的浓度(10pmole)。
【表3】
聚合酶链反应(PCR)所需的构成成分 使用量(μl)
2×聚合酶链反应预混液(PCR premixture) 10.0
IS6110正向(forward)引物 1.0
IS6110逆向(reverse)引物 1.0
IS6110探针 1.0
psbA正向(forward)引物 1.0
psbA逆向(reverse)引物 1.0
psbA肽核酸(PNA)探针 1.0
psbA核酸(9pg/μl) 2.0
IS6110核酸(3种浓度) 2.0
总体积 20.0
【表4】
聚合酶链反应(PCR)所需的构成成分 使用量(μl)
2×聚合酶链反应预混液(PCR premixture) 10.0
IS6110正向(forward)引物 1.0
IS6110逆向(reverse)引物 1.0
IS6110探针 1.0
IS6110核酸(3种浓度) 2.0
蒸馏水 5.0
总体积 20.0
其结果，在仅使用TaqMan探针的聚合酶链反应(PCR)中可以观察到扩增信号(Amplification plot)(图6a)，但在熔解曲线分析(Melting curve analysis)中没有观察到扩增现象(图6b)。在混合使用TaqMan探针以及肽核酸(PNA)探针的聚合酶链反应(PCR)中的扩增信号(Amplification plot)与仅使用TaqMan探针的聚合酶链反应(PCR)中的扩增信号之间没有呈现出差异(参阅图6c以及图6e)。此外，只有在混合使用TaqMan探针以及肽核酸(PNA)探针的聚合酶链反应(PCR)结果中才能够通过熔解曲线分析(Melting curveanalysis)观察到肽核酸(PNA)探针的荧光(图6d)。
6.在使用psbA基因的非对称引物时对特异性肽核酸(PNA)探针的IS6110扩增信号的干涉与否确认
在实施例2以及实施例3中利用特异性肽核酸(PNA)探针的psbA基因聚合酶链反应(PCR)中，在使用较高的逆向(reverse)引物浓度的情况以及使用相同的正向(forward)以及逆向(reverse)引物浓度的情况的两种条件下均检测到了psbA基因。以此为基础，确认了在使用较高的逆向(reverse)引物浓度且混合IS6110以及psbA基因执行聚合酶链反应(PCR)时是否能够同时检测到2个基因。
在实施例5中的聚合酶链反应(PCR)液组成(表3)条件下，以不同的psbA基因的引物浓度执行了聚合酶链反应(PCR)。分别使用各类3pmole/μl的psbA正向(forward)引物以及20pmole/μl的psbA逆向(reverse)引物1μl，其结果如图7a至图7e所示。
如图7a至图7e所示，在同时对2个基因进行扩增的反应中，在特异性肽核酸(PNA)探针的熔解曲线分析(Melting curve analysis)中没有观察到扩增信号(图7d)。与对1个基因进行扩增的结果不同，估计在同时对2个基因进行扩增时出现了干涉现象。
在相同的引物条件下将psbA基因的浓度从9pg提升100倍到0.9ng并执行聚合酶链反应(PCR)，其结果如图8a至图8e所示。如图8a至图8e所示，在使用0.9ng浓度的psbA基因的情况下，能够通过特异性肽核酸(PNA)探针在熔解曲线分析(Melting curve analysis)中检测到psbA基因(图8d)。
通常，在利用肽核酸(PNA)探针执行聚合酶连锁反应(PCR)时以非对称方式使用引物，但是在如本发明的对2个以及2个以上的基因扩增进行分析时，以对称方式使用引物能够以少100倍的量检测出核酸，因此能够得到更加良好的结果。

Claims (5)

1.一种在单一荧光通道聚合酶链反应设备中对2个基因进行检测的方法，其特征在于，包括：
(a)利用第1基因的TaqMan探针以及第2基因的肽核酸(PNA)探针执行聚合酶链反应(PCR)的步骤；第2基因的正向(forward)引物与逆向(reverse)引物的引物比例为1:1；
(b)利用扩增信号(Amplification plot)对第1基因的检测进行确认之后，利用熔解曲线分析(Melting curve analysis)对第2基因的检测进行确认的聚合酶链反应(PCR)延伸(Extension)步骤。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：
步骤(a)中的上述TaqMan探针的使用浓度是1至10pmole/μl。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：
步骤(a)中的上述肽核酸(PNA)探针的熔解温度(Tm)值是30至60℃。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：
步骤(a)中的上述肽核酸(PNA)探针的使用浓度是5至50pmole/μl。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：
步骤(a)中的聚合酶链反应(PCR)是在95℃下执行3分钟之后再重复执行95℃，30秒，变性(Denaturation)步骤→55℃，30秒，退火(Annealing)步骤→72℃，30秒，延伸(Extension)步骤的过程。
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