WO2019212158A1 - 단일 형광 채널 유전자증폭기기를 이용한 다중 핵산 검출 방법 - Google Patents

단일 형광 채널 유전자증폭기기를 이용한 다중 핵산 검출 방법 Download PDF

Info

Publication number
WO2019212158A1
WO2019212158A1 PCT/KR2019/004242 KR2019004242W WO2019212158A1 WO 2019212158 A1 WO2019212158 A1 WO 2019212158A1 KR 2019004242 W KR2019004242 W KR 2019004242W WO 2019212158 A1 WO2019212158 A1 WO 2019212158A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
gene
pcr
probe
amplification
curve analysis
Prior art date
Application number
PCT/KR2019/004242
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
김인수
강윤성
Original Assignee
주식회사 유디피아
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 주식회사 유디피아 filed Critical 주식회사 유디피아
Priority to CN201980000712.4A priority Critical patent/CN110691853B/zh
Publication of WO2019212158A1 publication Critical patent/WO2019212158A1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2525/00—Reactions involving modified oligonucleotides, nucleic acids, or nucleotides
    • C12Q2525/10—Modifications characterised by
    • C12Q2525/107—Modifications characterised by incorporating a peptide nucleic acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2527/00—Reactions demanding special reaction conditions
    • C12Q2527/107—Temperature of melting, i.e. Tm
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2527/00—Reactions demanding special reaction conditions
    • C12Q2527/143—Concentration of primer or probe
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2531/00—Reactions of nucleic acids characterised by
    • C12Q2531/10—Reactions of nucleic acids characterised by the purpose being amplify/increase the copy number of target nucleic acid
    • C12Q2531/113—PCR
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2537/00—Reactions characterised by the reaction format or use of a specific feature
    • C12Q2537/10—Reactions characterised by the reaction format or use of a specific feature the purpose or use of
    • C12Q2537/143—Multiplexing, i.e. use of multiple primers or probes in a single reaction, usually for simultaneously analyse of multiple analysis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2561/00—Nucleic acid detection characterised by assay method
    • C12Q2561/101—Taqman

Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting multiple nucleic acids in a single fluorescent channel PCR machine, and more particularly, to detect multiple nucleic acids in a single fluorescent channel PCR machine using a PNA probe and a TaqMan probe. It is about how to.
  • the PNA probe undergoes nucleic acid amplification at the same time as the TaqMan probe and amplifies including a signal during amplification. After the termination, the target gene can be detected through additional melting curve analysis. Using the TaqMan probe, the first gene is detected in an amplification plot and the melting temperature (Tm) is detected. A method of detecting a second gene using a PNA probe designed with a low value was found.
  • an object of the present invention is to provide a method for detecting two genes in a single fluorescent channel gene amplifier using a PNA probe and a TaqMan probe.
  • a dog gene detection method is provided.
  • the concentration of TaqMan probe of step (a) may be used in 1 to 10 pmole / ⁇ l.
  • the PNA probe of step (a) may be characterized in that the melting temperature (Tm) value of 30 to 60 °C.
  • the PNA probe of step (a) may be used at a concentration of 5-50 pmole / ⁇ l.
  • the ratio of the primer to the second gene of step (a) may be characterized in that the forward primer and the reverse primer is 1: 1.
  • the PCR of step (a) is 95 ° C., 3 minutes, followed by 95 ° C. (30 seconds) [denaturation step] ⁇ 55 ° C. (30 seconds) [bonding step] ⁇ 72 ° C. 30 seconds) (the synthesis step) provides a detection method characterized by repeating the process.
  • the first gene of step (b) is identified as an amplification signal (Amplification plot) in the PCR synthesis step (Extension) characterized in that the second gene is confirmed by Melting curve analysis (Melting curve analysis) A detection method is provided.
  • a PNA probe and a TaqMan probe in a single fluorescent channel PCR machine can be found by discovering a method of eliminating interference in a channel using a PNA probe designed by lowering the melting temperature (Tm) value. It was found how to detect two genes using.
  • the method for detecting two genes simultaneously in a single fluorescence channel PCR machine according to the present invention can utilize a conventional PCR system of a single fluorescence channel. Since the cost of purchasing a PCR machine can be reduced, it can be used economically.
  • FIG. 1 is a schematic conceptual diagram illustrating a method for detecting two genes in a single fluorescent channel PCR machine obtained according to the present invention.
  • Figure 2 is a photograph showing an example of a single fluorescent channel gene amplifier (PCR machine) according to the present invention.
  • Figure 3a is a result of confirming the amplification signal (Amplification plot) using a specific PNA probe in the PCR annealing step in Example 2,
  • Figure 3b to Figure 3d shows the melting curve analysis (Melting curve analysis) results.
  • Figure 4a is a result of confirming the amplification signal (Amplification plot) using a specific PNA probe in the PCR synthesis step (Extension) in Example 3,
  • Figure 4b to Figure 4d shows the melting curve analysis (Melting curve analysis) results.
  • FIG. 5A illustrates an amplification plot using an TaqMan probe in the PCR synthesis step in Example 4, and FIG. 5B illustrates a melting curve analysis result.
  • 6A to 6E are results of evaluating whether the specific PNA probe interferes with the IS6110 amplification signal when using the symmetric primer for the psbA gene in Example 5, and confirming the amplification signal when amplifying only the IS6110 gene.
  • Results (FIG. 6A) and Melting curve analysis results (FIG. 6B); Confirming an amplification signal (Amplification plot) when the IS6110 gene and psbA were simultaneously amplified (FIG. 6C) and a melting curve analysis (FIG. 6D); And the result of merging the two results (FIG. 6E).
  • FIG. 7A to 7E show the results of evaluating the interference of the IS6110 amplification signal of the specific PNA probe with the same amount of psbA gene using the asymmetric primer for the psbA gene in Example 6, and the IS6110 gene.
  • FIG. 8A to 8E show the interference of the IS6110 amplification signal of the specific PNA probe with respect to the psbA gene using the asymmetric primer for the psbA gene in Example 6 and 100 times the amount in Example 7
  • amplification signal (Amplification plot) in the case of amplifying only the IS6110 gene (Fig. 8a) and melting curve analysis (Melting curve analysis) results (Fig. 8b); Confirming an amplification signal (Amplification plot) when the IS6110 gene and psbA were simultaneously amplified (FIG. 8C) and a melting curve analysis (FIG. 8D); And the result of merging the two results (FIG. 8E).
  • the present invention comprises the steps of (a) performing PCR using a TaqMan probe for the first gene and PNA probe for the second gene; And (b) confirming the detection of the first gene in an amplification plot and confirming the detection of the second gene in a melting curve analysis.
  • a dog gene detection method is provided.
  • the gene detection method of the present invention includes (a) performing PCR using a TaqMan probe for a first gene and a PNA probe for a second gene.
  • TaqMan probe used in step (a) is a kind of hydrolysis probe, and a reporter (FAM, etc.), which is a fluorescent substance, is bound to the 5 'end, and a quencher, which is an offset material, is bound to the 3' end.
  • the probe is specifically hybridized to a target nucleic acid (target DNA) in the annealing step of a PCR process, but fluorescence is suppressed due to a quencher.
  • target DNA target nucleic acid
  • the reporter was canceled by the quencher ( Fluorescence develops while FAM is released.
  • the concentration of TaqMan probe may be determined according to the concentration of plasmid nucleic acid (plasmid DNA), the type of primer and gene amplifier (PCR instrument), and preferably used at 1 to 10 pmole / ⁇ l, It is not limited to this.
  • the PNA (Peptide Nucleic Acid) probe used in step (a) is a pure synthetic material that does not exist in vivo and has excellent complementary binding ability with DNA or RNA.
  • the probes are characterized in that they hybridize and transmit fluorescent signals when the nucleotide sequence of the complementary gene is present regardless of the activity of exonuclease of nucleic acid polymerase.
  • the PNA probe can be designed with a melting temperature (Tm) value in the range of 30 to 60 ° C., preferably in the range of 40 to 50 ° C.
  • the melting temperature (Tm) of the PNA probe can be designed to be lower than the melting temperature (Tm) of the TaqMan probe.
  • the concentration of the PNA probe may be determined according to the concentration of the plasmid DNA (plasmid DNA), the type of primer and the gene amplifier (PCR instrument), preferably 5 to 50 pmole / ⁇ l, It is not limited to this.
  • the ratio of primers to the second gene to be detected by the PNA probe provides that the forward and reverse primers are not limited to 1: 1.
  • PNA probes amplify genes in an asymmetric manner in which the amount of forward or reverse primers is higher.
  • the amount of forward and reverse primers is the same. The detection of the target nucleic acid can be easily performed. However, detection may be possible even when the amount of reverse primer is larger.
  • the PCR run conditions are 95 ° C., 3 minutes, followed by 95 ° C. (30 seconds) [denaturation step] ⁇ 55 ° C. (30 seconds) [bonding step] ⁇ 72 ° C. (30 seconds) It may be performed by repeating the process of [Extension step], may be performed by the number of repetitions that are usually performed, for example, may be performed 25 to 50 cycles, preferably 30 to 40 cycles This is not restrictive.
  • the gene detection method of the present invention includes the steps of (b) confirming the detection of the first gene in an amplification plot and confirming the detection of the second gene in a melting curve analysis.
  • the two genes may be amplification by melting curve analysis after confirming amplification in an amplification signal (Amplification plot) in a PCR extension (Extension) step.
  • the intensity of the fluorescence signal when the PCR amplification product reaches a detectable amount by fluorescence is called a threshold, and the number of amplification cycles corresponding to the threshold in the amplification signal is referred to as a threshold cycle.
  • Ct Genes from TaqMan probes are detected with an amplification plot or Ct values obtained therefrom, and also from PNA probes through Melting curve analysis.
  • the amplification signal by the PNA probe was designed to have a low melting temperature (Tm) value so that it can be observed only in the annealing step of the PCR step, and the PNA probe prepared in Table 1 and the primer set used are shown.
  • Tm melting temperature
  • the calculated melting temperature (Tm) may vary depending on the type of program used.
  • the gene to be amplified for the PNA probe test was psbA from spinnicia.
  • PCR primers and probes used in the TaqMan probe test were sequences used in products developed to diagnose infection of Mycobacteria Tuberculosis, and are shown in Table 1 and the amplification gene was IS6110.
  • the target genes were amplified using a single fluorescence channel real-time PCR instrument (ABI7500, Applied Biosystems, Foster. City, CA, see FIG. 2), and the typical PCR reaction solution compositions are shown in Table 2 below. Changed for each test.
  • Tm melting temperature
  • PCR using a PNA probe uses asymmetric amounts of forward and reverse primers
  • the test was performed under three conditions, two asymmetric and one symmetric.
  • the conditions were 95 °C, 3 minutes, followed by 95 °C (30 seconds) [denaturation step] ⁇ 55 °C (30 seconds) [Annealing step] ⁇ 72 °C (30 seconds) [Extension step ] was repeated for 35 cycles, and the results were measured by an amplification plot and a melting curve analysis.
  • Example 2 Under the same conditions as in Example 2, a test was performed to determine whether a gene amplification signal was detected during PCR synthesis using the designed PNA probe, and the results are shown in FIGS. 4A to 4D.
  • the primers and probes for the Mycobacterium tuberculosis gene, IS6110 were used to test whether the TaqMan probe detects gene amplification signals during PCR.
  • Real-time PCR was performed using three concentrations (1 ng, 100 pg and 10 pg) of plasmid DNA containing the IS6110 gene, and PCR amplification was confirmed in the synthesis (Extension, 72 °C) step. The results are shown in Figures 5a and 5b.
  • Example 3 when the fluorescence detection was set in the extension step, the PNA probe was not detected, but the gene amplification was confirmed through melting curve analysis, thereby confirming the presence of interference. I would. When amplifying the genes simultaneously by mixing the TaqMan probe and the designed specific PNA probe, it was confirmed whether there was interference of the TaqMan probe by the specific PNA probe.
  • PCR was performed by mixing plasmid nucleic acid (plasmid DNA) containing three concentrations (1 ng, 100 pg and 10 pg) of IS6110 gene and 9 pg of psbA plasmid DNA, respectively. It is shown in Table 3 below. In addition, PCR was performed using only plasmid nucleic acid (plasmid DNA) containing the IS6110 gene, the composition of the reaction solution is shown in Table 4 below.
  • the amplification signal (Amplification plot) was confirmed in the PCR reaction using only TaqMan probe (Fig. 6a), but the detection was not confirmed in the melting curve analysis (Fig. 6b).
  • the amplification signal in the PCR reaction using the TaqMan probe and the PNA probe was not different from the amplification signal in the PCR reaction using the TaqMan probe alone (see FIGS. 6C and 6E).
  • the fluorescence of the PNA probe could be confirmed through melting curve analysis only in the PCR reaction result using the TaqMan probe and the PNA probe (FIG. 6D).
  • PCR was performed by varying the concentration of primers for the psbA gene in the PCR reaction solution composition (Table 3) of Example 5. 1 pm each of 3 pmole / ⁇ l psbA forward primer and 20 pmole / ⁇ l psbA reverse primer were used, and the results are shown in FIGS. 7A to 7E.
  • melting curve analysis by a specific PNA probe was not performed in a reaction in which two genes were simultaneously amplified (FIG. 7D). Unlike the result of amplifying one gene, it was estimated that interference was caused when two genes were simultaneously amplified.
  • the concentration of psbA gene was increased 100 times from 9 pg to 0.9 ng under the conditions of the same primers, and the PCR reaction was performed. The results are shown in FIGS. 8A to 8E. As shown in FIGS. 8A to 8E, when the concentration of the psbA gene was used at 0.9 ng, the psbA gene could be detected by melting curve analysis by a specific PNA probe (FIG. 8D).
  • primers are used asymmetrically when performing PCR reactions using PNA probes. However, when analyzing amplification of two or more genes as in the present invention, it is 100 times less to use the primers symmetrically. It can be detected by the nucleic acid of, showing a specific point showing better results.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 TaqMan 프로브와 PNA 프로브를 이용하는 단일 형광 채널 유전자증폭기기(PCR machine)에서의 다중 핵산 검출 방법을 제공한다. 본 발명의 융해 온도(Tm)를 낮게 디자인한 PNA 프로브와 TaqMan 프로브를 혼합하여 사용시 단일 형광 채널 유전자증폭기기(PCR machine)에서 2개의 유전자를 동시에 검출할 수 있는 장점이 있어, 고가의 신형 다채널 유전자증폭기기(PCR machine)를 구입시 지출되는 비용을 줄일 수 있어 경제적인 면에서 유용하게 사용될 수 있다.

Description

단일 형광 채널 유전자증폭기기를 이용한 다중 핵산 검출 방법
본 발명은 단일 형광 채널 유전자증폭기기(PCR machine)에서 다중 핵산을 검출하는 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 PNA 프로브와 TaqMan 프로브를 이용한 단일 형광 채널 유전자증폭기기(PCR machine)에서 다중 핵산을 검출하는 방법에 관한 것이다.
실시간 유전자증폭기기(PCR machine)가 등장하면서 실시간으로 표적 핵산의 증폭 및 검출이 가능해졌으며, 결과적으로 표적 및 바이오 마커 식별을 위한 핵심 도구가 되어 체외 진단, 식품 안전 테스트, 및 약물 유전체학 등의 다양한 응용 분야로 확대되고 있다. 그러나, 생명 공학 산업은 기존의 실시간 PCR 기술을 사용하여 높은 수준의 다중 핵산 검출법에 대한 수요가 증가함에 따라 어려움을 겪고 있다. 대부분 4채널 이상의 형광 채널을 보유한 고가의 실시간 유전자증폭기기(PCR machine)를 사용하거나 고가의 다중 형광을 표지하는 프로브를 이용한 검출 키트를 구매하여 융해 곡선 분석(Melting curve analysis)을 이용하여 표적 핵산의 검출을 확인하고 있는 실정이다.
기존의 실시간 유전자증폭기기(PCR machine)를 활용하면서 표적 유전자를 다중 검출할 수 있는 기술들이 개발되고 있으나, 단일 형광 채널 유전자증폭기기(PCR machine)에서 다중 핵산을 검출하는 방법은 채널 내에서의 간섭 현상 및 융해 온도 (Tm) 변화 등 여러 단점을 여전히 가지고 있다. 이에 기존에 사용하던 단일 형광 채널 유전자증폭기기(PCR machine)에서 채널 내에서의 간섭 현상을 극복할 수 있는 다중 핵산 검출법의 개발이 절실하다.
본 발명의 발명자들은 단일 형광 채널 유전자증폭기기(PCR machine)에서 2 개의 유전자를 검출하는 방법에 대하여 연구하던 중, PNA 프로브는 TaqMan 프로브와 동시에 핵산 증폭 과정을 거치며 증폭 과정중의 신호를 포함하여 증폭이 종결된 후 추가적인 융해 곡선 분석(Melting curve analysis)을 통하여 표적 유전자를 검출할 수 있음에 착안하여, TaqMan 프로브를 이용하여 증폭 신호(Amplification plot)에서 제 1 유전자를 검출하고, 융해 온도(Tm) 값을 낮게 설계한 PNA 프로브를 이용하여 제 2 유전자를 검출하는 방법을 발견하였다.
따라서, 본 발명은 PNA 프로브와 TaqMan 프로브를 이용한 단일 형광 채널 유전자증폭기기에서의 2개 유전자의 검출 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 일 측면에 따라, (a) 제 1 유전자에 대한 TaqMan 프로브 및 제 2 유전자에 대한 PNA 프로브를 이용하여 PCR을 수행하는 단계; 및 (b) 제 1 유전자의 검출을 증폭 신호(Amplification plot)로 확인하고, 제 2 유전자의 검출을 융해 곡선 분석(Melting curve analysis)으로 확인하는 단계를 포함하는 단일 형광 채널 유전자증폭기기에서의 2개 유전자 검출 방법이 제공된다.
일 구현예에서, 단계 (a)의 상기 TaqMan 프로브의 농도는 1 내지 10 pmole/㎕로 사용할 수 있다.
일 구현예에서, 단계 (a)의 상기 PNA 프로브는 융해 온도(Tm) 값이 30 내지 60 ℃인 것이 특징일 수 있다.
일 구현예에서, 단계 (a)의 상기 PNA 프로브가 농도 5 내지 50 pmole/㎕로 사용할 수 있다.
일 구현예에서, 단계 (a)의 제 2 유전자에 대한 프라이머의 비율이 정방향(forward) 프라이머와 역방향(reverse) 프라이머가 1:1인 것이 특징일 수 있다.
일 구현예에서, 단계 (a)의 PCR이 95 ℃, 3분에 이어 95 ℃(30초)[변성 (Denaturation) 단계] → 55 ℃(30초)[결합(Annealing) 단계] → 72 ℃(30초)[합성(Extension) 단계]의 과정을 반복하는 것을 특징으로 하는 검출 방법을 제공한다.
일 구현예에서, 단계 (b)의 제 1 유전자가 PCR 합성(Extension) 단계에서 증폭 신호(Amplification plot)로 확인된 후 제 2 유전자가 융해 곡선 분석(Melting curve analysis)으로 확인되는 것을 특징으로 하는 검출 방법을 제공한다.
본 발명에 의해, 융해 온도(Tm) 값을 낮추어 설계한 PNA 프로브를 사용하여 채널 내의 간섭 현상을 배제할 수 있는 방법을 발견함으로써, 단일 형광 채널 유전자증폭기기(PCR machine)에서 PNA 프로브와 TaqMan 프로브를 이용하여 2개 유전자를 검출하는 방법이 밝혀졌다. 본 발명에 따른 단일 형광 채널 유전자증폭기기(PCR machine)에서 동시에 2개 유전자를 검출하는 방법은 기존의 단일 형광 채널의 유전자증폭기기(PCR machine)를 활용할 수 있으므로, 고가의 다채널 유전자증폭기기(PCR machine)를 구입시 지출되는 비용을 줄일 수 있어 경제적인 면에서 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명에 따라 얻어진 단일 형광 채널 유전자증폭기기(PCR machine)에서의 2개 유전자 검출방법을 설명하기 위한 개략적인 개념도이다.
도 2는 본 발명에 따른 단일 형광 채널 유전자증폭기기(PCR machine)의 일 예를 나타낸 사진이다.
도 3a는 실시예 2에서 PCR 결합(Annealing) 단계에서 특이 PNA 프로브를 사용하여 증폭 신호(Amplification plot)를 확인한 결과이고, 도 3b 내지 도 3d는 융해 곡선 분석(Melting curve analysis) 결과를 나타낸 것이다.
도 4a는 실시예 3에서 PCR 합성(Extension) 단계에서 특이 PNA 프로브를 사용하여 증폭 신호(Amplification plot)를 확인한 결과이고, 도 4b 내지 도 4d는 융해 곡선 분석(Melting curve analysis) 결과를 나타낸 것이다.
도 5a는 실시예 4에서 PCR 합성(Extension) 단계에서 TaqMan 프로브를 사용하여 증폭 신호(Amplification plot)를 확인한 결과이고, 도 5b는 융해 곡선 분석(Melting curve analysis) 결과를 나타낸 것이다.
도 6a 내지 도 6e는 실시예 5에서 psbA 유전자에 대한 대칭 프라이머를 이용시 특이 PNA 프로브의 IS6110 증폭 신호에 대한 간섭 여부를 평가한 결과로서, IS6110 유전자만을 증폭시킨 경우의 증폭 신호(Amplification plot)를 확인한 결과(도 6a) 및 융해 곡선 분석(Melting curve analysis) 결과(도 6b); IS6110 유전자와 psbA를 동시에 증폭시킨 경우의 증폭 신호(Amplification plot)를 확인한 결과(도 6c) 및 융해 곡선 분석(Melting curve analysis) 결과(도 6d); 및 상기 2개 결과를 병합(merge)한 결과(도 6e)이다.
도 7a 내지 도 7e은 실시예 6에서 psbA 유전자에 대한 비대칭 프라이머를 이용하고, 실시예 5와 동일한 양의 psbA 유전자에 대한 특이 PNA 프로브의 IS6110 증폭 신호에 대한 간섭 여부를 평가한 결과로서, IS6110 유전자만을 증폭시킨 경우의 증폭 신호(Amplification plot)를 확인한 결과(도 7a) 및 융해 곡선 분석(Melting curve analysis) 결과(도 7b); IS6110 유전자와 psbA를 동시에 증폭시킨 경우의 증폭 신호(Amplification plot)를 확인한 결과(도 7c) 및 융해 곡선 분석(Melting curve analysis) 결과(도 7d); 및 상기 2개 결과를 병합(merge)한 결과(도 7e)이다.
도 8a 내지 도 8e는 실시예 6에서 psbA 유전자에 대한 비대칭 프라이머를 이용하고, 실시예 7에서의 100배의 양을 이용한 psbA 유전자에 대한 특이 PNA 프로브의 IS6110 증폭 신호에 대한 간섭 여부를 평가한 결과로서, IS6110 유전자만을 증폭시킨 경우의 증폭 신호(Amplification plot)를 확인한 결과(도 8a) 및 융해 곡선 분석(Melting curve analysis) 결과(도 8b); IS6110 유전자와 psbA를 동시에 증폭시킨 경우의 증폭 신호(Amplification plot)를 확인한 결과(도 8c) 및 융해 곡선 분석(Melting curve analysis) 결과(도 8d); 및 상기 2개 결과를 병합(merge)한 결과(도 8e)이다.
본 발명은 (a) 제 1 유전자에 대한 TaqMan 프로브 및 제 2 유전자에 대한 PNA 프로브를 이용하여 PCR을 수행하는 단계; 및 (b) 제 1 유전자의 검출을 증폭 신호(Amplification plot)에서 확인하고, 제 2 유전자의 검출을 융해 곡선 분석(Melting curve analysis)에서 확인하는 단계를 포함하는 단일 형광 채널 유전자증폭기기에서의 2개 유전자 검출 방법을 제공한다.
본 발명의 유전자 검출 방법은 (a) 제 1 유전자에 대한 TaqMan 프로브 및 제 2 유전자에 대한 PNA 프로브를 이용하여 PCR을 수행하는 단계를 포함한다.
단계 (a)에서 사용되는 TaqMan 프로브는 가수분해(Hydrolysis) 프로브의 일종으로 5' 말단에는 형광물질인 리포터(FAM 등)가 결합되어 있고, 3' 말단에는 상쇄물질인 소광물질(quencher)이 결합된 형태이며, 상기 프로브는 PCR 과정 중 결합(Annealing)단계에서 타겟 핵산(target DNA)에 특이적으로 혼성(hybridize)되지만 소광물질(quencher)로 인하여형광의 발색이 억제된다. 그러나, 합성(Extension) 단계에서 핵산 중합효소(polymerase)의 엑소뉴클레아제(exonuclease)의 활성으로 핵산 주형(template)에 결합된 TaqMan 프로브가 가수분해되면서 소광물질(quencher)에 의해 상쇄되었던 리포터(FAM 등)가 유리되면서 형광이 발색된다.
일 구현예에서, TaqMan 프로브의 농도는 플라스미드 핵산(plasmid DNA)의 농도, 프라이머 및 유전자증폭기기(PCR 기기)의 종류에 따라 결정될 수 있으며, 바람직하게는 1 ~ 10 pmole/㎕로 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 단계 (a)에 사용되는 PNA(Peptide Nucleic Acid) 프로브는 생체 내에 존재하지 않는 순수 합성물질로 DNA 혹은 RNA와의 상보적 결합력이 탁월하다. 또한, 상기 프로브는 핵산 중합효소(polymerase)의 엑소뉴클레아제(exonuclease)의 활성과 상관없이 상보적인 유전자의 염기서열이 존재할 경우 혼성되어(hybridize) 형광신호를 보낸다는 특징이 있다.
일 구현예에서, PNA 프로브는 융해 온도(Tm) 값을 30 ~ 60 ℃의 범위, 바람직하게는 40 ~ 50 ℃의 범위로 설계될 수 있다. PNA 프로브의 융해 온도(Tm)는 TaqMan 프로브의 융해 온도(Tm)보다 낮게 설계할 수 있다.
일 구현예에서, PNA 프로브의 농도는 플라스미드 핵산(plasmid DNA)의 농도, 프라이머 및 유전자증폭기기(PCR 기기)의 종류에 따라 결정될 수 있으며, 바람직하게는 5 ~ 50 pmole/㎕로 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 구현예에서, PNA 프로브에 의해 검출될 제 2 유전자에 대한 프라이머의 비율은 정방향(forward) 프라이머와 역방향(reverse) 프라이머가 1:1인 것에 한정하지 않는 것을 제공한다. 일반적으로 PNA 프로브는 정방향(forward) 또는 역방향(reverse) 프라이머의 양이 더 많은 비대칭(asymmetric)으로 유전자 증폭을 진행하지만, 본 발명에서는 정방향(forward) 프라이머와 역방향(reverse) 프라이머의 양이 같은 경우에 표적 핵산의 검출이 용이하게 수행될 수 있다. 다만, 역방향(reverse) 프라이머의 양이 더 많은 경우에도 검출이 가능할 수 있다.
일 구현예에서, PCR 수행 조건은 95 ℃, 3분에 이어 95 ℃(30초)[변성 (Denaturation) 단계] → 55 ℃(30초)[결합(Annealing) 단계] → 72 ℃(30초)[합성(Extension) 단계]의 과정을 반복하여 수행될 수 있으며, 통상적으로 수행되는 반복 횟수로 수행될 수 있으며, 예를 들어, 25 ~ 50 사이클, 바람직하게는 30 ~ 40 사이클을 수행할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 유전자 검출 방법은 (b) 제 1 유전자의 검출을 증폭 신호(Amplification plot)에서 확인하고, 제 2 유전자의 검출을 융해 곡선 분석(Melting curve analysis)에서 확인하는 단계를 포함한다.
단계 (b)에서 2개 유전자는 PCR 결합(Extension) 단계에서 증폭 신호(Amplification plot)에서 증폭을 확인한 후 융해 곡선 분석(Melting curve analysis)으로 증폭을 확인하는 것일 수 있다. PCR 증폭 산물이 형광으로 검출 가능한 양에 도달한 때의 형광신호의 세기를 임계값(threshold)이라고 하며, 상기 증폭 신호(Amplification plot)에서 임계값에 대응되는 증폭 사이클의 횟수를 임계 사이클(threshold cycle; Ct) 값이라고 한다. 증폭 신호(Amplification plot) 또는 이로부터 얻어지는 Ct값으로 TaqMan 프로브로부터의 유전자를 검출하며, 또한 융해 곡선 분석(Melting curve analysis)을 통하여 PNA 프로브로부터의 유전자를 검출한다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이에 제한되는 것은 아니다.
<실시예>
1. 특이 PNA의 프로브 염기서열의 설계와 제작
PNA 프로브에 의한 증폭신호는 PCR 단계 중에서 결합(Annealing) 단계에서만 관찰할 수 있게 융해 온도(Tm) 값을 낮게 디자인하였으며, 표 1에 제작된 PNA 프로브와 사용한 프라이머 세트를 나타내었다. 융해 온도(Tm) 계산 값은 사용한 프로그램 종류에 따라서 차이가 있을 수 있다. PNA 프로브 시험에 이용된 증폭 대상 유전자는 시금치(spinicia)의 psbA였다.
TaqMan 프로브 시험에 이용한 PCR 프라이머와 프로브는 결핵균(Mycobacteria Tuberculosis)의 감염을 진단하기 위하여 개발된 제품에 이용된 염기서열로, 표 1에 나타내었으며 증폭 대상 유전자는 IS6110였다.
단일 형광 채널 실시간 PCR기기(ABI7500, Applied Biosystems, Foster. City, CA, 도 2 참조)를 사용하여 대상 유전자들을 증폭시켰으며, 통상적인 PCR 반응액 조성에 대하여 하기 표 2에 나타내었으며 프라이머와 프로브 농도는 각 시험에 맞추어 변경했다.
PNA 프로브용 TaqMan 프로브용
forward 프라이머 5'-AAT CTG TAA CCT TCA TTA GCA-3' 5'-CAA CCG GGA GCC CAG CCG CC-3'
reverse 프라이머 5'-CTG AGC ACA ACA TCC TTA-3' 5'-GGT CCT GCG GGC TTT GCC GC-3'
프로브 5' FAM-oo-GGT GCC ATT ATT CC-Lys Dabcyl 3' (Tm: 42 ℃) 5' FAM-ATC TGG CCA CCT CGA TGC CC-BHQ1 3' (Tm: 63 ℃)
PCR 반응에 필요한 구성 성분 사용량 (㎕)
2 × PCR premixture 10.0
forward PCR 프라이머 1.0
reverse PCR 프라이머 1.0
PCR 프로브 (10 pmole/㎕) 1.0
핵산 2.0
증류수 5.0
총 부피 20.0
2. 실시간 PCR을 통한 특이 PNA 프로브의 결합(Annealing) 단계에서의 적합성 평가
PCR 과정 중에서 결합(Annealing) 단계에서만 증폭 신호가 감지될 수 있도록특이 PNA 프로브의 융해 온도(Tm) 값을 낮게 설계하였으며, 이렇게 설계한 PNA 프로브가 제대로 설계되었고 PCR 과정에서 유전자 증폭 신호를 잘 감지하는지 확인하기 위한 테스트를 진행하였다.
일반적으로 PNA 프로브를 이용한 PCR은 정방향(forward) 및 역방향(reverse) 프라이머의 양을 비대칭(asymmetric)으로 사용하므로 비대칭 2가지 경우와 대칭 1가지 경우의 3가지 조건으로 시험을 수행하였다. 역방향(reverse) 프라이머의 양을 20:3으로 많게 넣은 경우, 정방향(forward) 및 역방향(reverse) 프라이머의 양을 동일하게 넣은 경우, 정방향(forward) 프라이머의 양을 20:3으로 많게 넣은 경우로 각각 PCR을 수행하였다. 상기 조건은 95 ℃, 3분에 이어 95 ℃(30초)[변성 (Denaturation) 단계] → 55 ℃(30초)[결합(Annealing) 단계] → 72 ℃(30초)[합성(Extension) 단계]의 과정을 35 사이클 반복하였고, 그 결과는 증폭 신호(Amplification plot)와 융해 곡선 분석(Melting curve analysis)으로 측정하였다.
도 3a 내지 도 3d에 나타난 바와 같이, 3가지 조건 중에서 역방향(reverse) 프라이머의 양을 더 많이 넣은 경우(A), 동일하게 넣은 경우(B)는 융해 곡선 분석(Melting curve analysis)에서 증폭을 확인했으나, 정방향(forward) 프라이머의 양을 많이 사용한 경우(C)는 융해 곡선 분석(Melting curve analysis)에서 증폭을 확인할 수 없었다(도 3a 내지 도 3d). 그 이유로는 PNA 프로브가 결합할 수 있는 핵산 가닥(DNA strand)이 제대로 증폭되지 않은 것으로 추정되었다. PCR 프라이머를 비대칭(asymmetry)하게 사용하는 경우에는 더 많은 양이 투입된 프라이머가 결합할 수 있는 핵산 가닥(DNA strand)이 더 많이 증폭될 수 밖에 없기 때문이다.
본 발명에서 설계된 특이 PNA 프로브 염기서열을 목적에 맞게 활용하기 위해서는 역방향(reverse) 프라이머를 많이 사용하거나, 정방향(forward) 프라이머와 역방향(reverse) 프라이머를 동일한 양을 사용해야 함을 확인하였다.
3. 실시간 PCR을 통한 특이 PNA 프로브의 합성(Extension)단계에서 적합성 테스트 수행
실시예 2와 동일한 조건에서, 설계한 PNA 프로브를 이용하여 PCR 합성(Extension)과정에서 유전자 증폭 신호가 감지되는지 여부를 확인하기 위한 테스트를 진행하였고, 그 결과를 도 4a 내지 도 4d에 나타내었다.
도 4a 내지 도 4d에 나타난 바와 같이, 합성(Extension) 단계에서 유전자 증폭 신호(Amplification plot)를 확인한 결과, 3가지 조건에서 증폭 신호(Amplification plot)가 검출되지 않았으나(도 4a), 융해 곡선 분석(Melting curve analysis)에서는 (A)와 (B)의 프라이머 조건에서 모두 증폭이 됨을 확인하였다(도 4b 내지 도 4d). 즉, 실제로 유전자가 증폭이 되었으나, 합성(Extension, 72 ℃)단계에서 PNA 프로브가 타겟 염기서열(target sequence)과 분리되기 때문에 형광이 검출되지 않았고, 융해 곡선 분석(Melting curve analysis)에서 유전자가 증폭되었기 때문에 형광이 검출되었다.
4. 실시간 PCR을 통한 TaqMan 프로브의 적합성 테스트 수행
결핵균 유전자인 IS6110에 대한 프라이머와 프로브를 이용하여 TaqMan 프로브가 PCR 과정에서 유전자 증폭 신호를 잘 감지하는지 확인하기 위한 테스트를 수행하였다. IS6110 유전자를 포함하는 3가지 농도(1 ng, 100 pg 및 10 pg)의 플라즈미드 핵산(plasmid DNA)을 이용하여 실시간 PCR을 수행하였고, PCR 증폭 여부를 합성(Extension, 72 ℃) 단계에서 확인하였으며 그 결과를 도 5a 및 도 5b에 나타내었다.
도 5a 및 도 5b에 나타난 바와 같이, 증폭 신호(Amplification plot)는 플라즈미드 핵산(plasmid DNA) 농도에 따라서 높은 농도에서 일찍 검출되고 낮은 농도에서 뒤에 검출되어 증폭 곡선의 양상을 나타냈으나(도 5a), 융해 곡선 분석(Melting curve analysis)을 통해서는 유전자가 증폭되었는지 확인할 수 없었다(도 5b).
5. psbA 유전자에 대한 대칭 프라이머를 사용시 특이 PNA 프로브의 IS6110 증폭신호에 대한 간섭 여부 확인
실시예 3에서 형광 검출을 합성(Extension)단계에 설정할 시 PNA 프로브에 의한 검출이 되지 않으나 융해곡선분석(Melting curve analysis)을 통하여 실질적으로 유전자의 증폭을 확인했으므로, 이로 인한 간섭현상의 유무를 확인하고자 했다. TaqMan 프로브와 설계한 특이 PNA 프로브를 혼합시켜 유전자를 동시에 증폭시킬 때, 특이 PNA 프로브에 의한 TaqMan 프로브의 간섭이 있는지 확인하였다.
3가지 농도(1 ng, 100 pg 및 10 pg)의 IS6110 유전자를 포함한 플라즈미드 핵산(plasmid DNA)과 9 pg의 psbA 플라즈미드 핵산(plasmid DNA)을 각각 혼합하여 PCR을 수행하였으며, 그 반응액의 조성은 하기 표 3과 같다. 또한, IS6110 유전자를 포함한 플라즈미드 핵산(plasmid DNA)만으로 PCR을 수행하였으며, 그 반응액의 조성은 하기 표 4와 같다.
상기 조건은 95 ℃, 3분에 이어 95 ℃(30초)[변성 (Denaturation) 단계] → 55 ℃(30초)[결합(Annealing) 단계] → 72 ℃(30초)[합성(Extension) 단계]의 과정을→ 55 ℃(30초) → 72 ℃(30초)의 과정을 35 사이클 반복하였으며, 증폭신호 감지는 합성(Extension) 단계에서 실시하였다. 또한, psbA 유전자에 대한 정방향(forward) 및 역박향(reverse) 프라이머를 동일한 농도(10 pmole)로 사용하였다.
PCR 반응에 필요한 구성 성분 사용량 (㎕)
2 × PCR premixture 10.0
IS6110 forward 프라이머 1.0
IS6110 reverse 프라이머 1.0
IS6110 프로브 1.0
psbA forward 프라이머 1.0
psbA reverse 프라이머 1.0
psbA PNA 프로브 1.0
psbA 핵산 (9 pg/㎕) 2.0
IS6110 핵산 (3가지 농도) 2.0
총 부피 20.0
PCR 반응에 필요한 구성 성분 사용량 (㎕)
2 × PCR premixture 10.0
IS6110 forward 프라이머 1.0
IS6110 reverse 프라이머 1.0
IS6110 프로브 1.0
IS6110 핵산 (3가지 농도) 2.0
증류수 5.0
총 부피 20.0
그 결과, TaqMan 프로브만 사용한 PCR 반응에서 증폭 신호(Amplification plot)는 확인할 수 있었으나(도 6a), 융해 곡선 분석(Melting curve analysis)에서 검출을 확인할 수 없었다(도 6b). TaqMan 프로브와 PNA 프로브를 혼합하여 사용한 PCR 반응에서 증폭 신호(Amplification plot)는 TaqMan 프로브만 사용한 PCR 반응에서의 증폭신호와 차이가 없었다(도 6c 및 도 6e 참조). 또한, TaqMan 프로브와 PNA 프로브를 혼합하여 사용한 PCR 반응 결과에서만 융해 곡선 분석(Melting curve analysis)을 통해 PNA 프로브의 형광을 확인할 수 있었다(도 6d).
6. psbA 유전자에 대한 비대칭 프라이머를 사용시 특이 PNA 프로브의 IS6110 증폭신호에 대한 간섭 여부 확인
실시예 2 및 3에서 특이 PNA 프로브를 이용한 psbA 유전자의 PCR 반응에서 역방향(reverse) 프라이머의 농도를 높게 사용한 경우와 정방향(forward) 및 역방향(reverse) 프라이머의 농도를 동일하게 사용한 경우, 두 조건 모두에서 psbA 유전자가 검출되었다. 이를 토대로, 역방향(reverse) 프라이머의 농도를 높게 사용하고 IS6110 및 psbA 유전자를 혼합하여 PCR 반응을 수행할 시 2개의 유전자가 동시에 검출될 수 있는지 확인하였다.
실시예 5의 PCR 반응액 조성(표 3)에서 psbA 유전자에 대한 프라이머의 농도를 다르게 하여 PCR을 수행하였다. 3 pmole/㎕의 psbA 정방향(forward) 프라이머와 20 pmole/㎕의 psbA 역방향(reverse) 프라이머을 각각 1 ㎕씩 사용하였고, 그 결과를 도 7a 내지 도 7e에 나타내었다.
도 7a 내지 도 7e에 나타난 바와 같이, 2개의 유전자를 동시에 증폭시킨 반응에서 특이 PNA 프로브에 의한 융해 곡선 분석(Melting curve analysis)이 이루어지지 않았다(도 7d). 1개의 유전자를 증폭한 결과와 다르게 2개의 유전자를 동시에 증폭할 시 간섭을 받았을 것으로 추정되었다.
동일한 프라이머의 조건에서 psbA 유전자의 농도를 9 pg에서 0.9 ng으로 100배 높여서 PCR 반응을 수행하여 그 결과를 도 8a 내지 도 8e에 나타내었다. 도 8a 내지 도 8e에 나타난 바와 같이, psbA 유전자의 농도를 0.9 ng으로 사용한 경우에는 특이 PNA 프로브에 의해서 융해 곡선 분석(Melting curve analysis)에서 psbA 유전자를 검출할 수 있었다(도 8d).
통상적으로 PNA 프로브를 이용하여 PCR 반응을 수행하는 경우에 프라이머를 비대칭으로 사용하나, 본 발명과 같이 2개 및 2개 이상의 유전자의 증폭을 분석하는 경우에는 프라이머를 대칭으로 사용하는 것이 100배 적은 양의 핵산으로 검출할 수 있어, 더 나은 결과를 보이는 특이점을 나타내었다.

Claims (7)

  1. (a) 제 1 유전자에 대한 TaqMan 프로브 및 제 2 유전자에 대한 PNA 프로브를 이용하여 PCR을 수행하는 단계; 및
    (b) 제 1 유전자의 검출을 증폭 신호(Amplification plot)로 확인하고, 제 2 유전자의 검출을 융해 곡선 분석(Melting curve analysis)으로 확인하는 단계
    를 포함하는 단일 형광 채널 유전자증폭기기에서의 2개 유전자 검출 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 단계 (a)의 상기 TaqMan 프로브가 농도 1 내지 10 pmole/㎕로 사용되는 것을 특징으로 하는 검출 방법.
  3. 제 1항에 있어서, 단계 (a)의 상기 PNA 프로브는 융해 온도(Tm) 값이 30 내지 60 ℃인 것을 특징으로 하는 검출 방법.
  4. 제 1항에 있어서, 단계 (a)의 상기 PNA 프로브가 농도 5 내지 50 pmole/㎕로 사용되는 것을 특징으로 하는 검출 방법.
  5. 제 1항에 있어서, 단계 (a)의 제 2 유전자에 대한 프라이머의 비율이 정방향(forward) 프라이머와 역방향(reverse) 프라이머가 1:1인 것을 특징으로 하는 검출 방법.
  6. 제 1항에 있어서, 단계 (a)의 PCR이 95 ℃, 3분에 이어 95 ℃(30초)[변성 (Denaturation) 단계] → 55 ℃(30초)[결합(Annealing) 단계] → 72 ℃(30초)[합성(Extension) 단계]의 과정을 반복하는 것을 특징으로 하는 검출 방법.
  7. 제 1항에 있어서, 단계 (b)의 제 1 유전자가 PCR 합성(Extension) 단계에서 증폭 신호(Amplification plot)로 확인된 후 제 2 유전자가 융해 곡선 분석(Melting curve analysis)으로 확인되는 것을 특징으로 하는 검출 방법.
PCT/KR2019/004242 2018-05-03 2019-04-10 단일 형광 채널 유전자증폭기기를 이용한 다중 핵산 검출 방법 WO2019212158A1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201980000712.4A CN110691853B (zh) 2018-05-03 2019-04-10 利用单一荧光通道聚合酶链反应设备的多重核酸检测方法

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR10-2018-0051364 2018-05-03
KR1020180051364A KR101919896B1 (ko) 2018-05-03 2018-05-03 단일 형광 채널 유전자증폭기기를 이용한 다중 핵산 검출 방법

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2019212158A1 true WO2019212158A1 (ko) 2019-11-07

Family

ID=64561921

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/KR2019/004242 WO2019212158A1 (ko) 2018-05-03 2019-04-10 단일 형광 채널 유전자증폭기기를 이용한 다중 핵산 검출 방법

Country Status (3)

Country Link
KR (1) KR101919896B1 (ko)
CN (1) CN110691853B (ko)
WO (1) WO2019212158A1 (ko)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101919896B1 (ko) * 2018-05-03 2018-11-19 주식회사 유디피아 단일 형광 채널 유전자증폭기기를 이용한 다중 핵산 검출 방법

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014046688A1 (en) * 2012-09-21 2014-03-27 Qualcomm Incorporated Cyclic shift delay detection using a channel impulse response
KR20140046688A (ko) * 2012-10-10 2014-04-21 주식회사 파나진 리포터 및 소광자가 결합된 pna 프로브를 이용한 융해곡선 분석방법, 융해곡선 분석을 통한 염기다형성 분석방법 및 염기다형성 분석 키트.
WO2017099445A1 (ko) * 2015-12-11 2017-06-15 대한민국(관리부서:국립수산과학원) 어류 에드와드 감염증과 연쇄구균 감염증 원인세균의 판별 및 검출용 유전자 마커, 및 이를 이용한 원인세균의 판별 및 검출 방법
KR101845043B1 (ko) * 2015-01-30 2018-04-03 주식회사 시선바이오머티리얼스 PNA 프로브를 이용한 실시간 중합효소연쇄반응의 임계 사이클(Ct)에 따른 핵산 검출의 문제를 해결하는 방법
KR101919896B1 (ko) * 2018-05-03 2018-11-19 주식회사 유디피아 단일 형광 채널 유전자증폭기기를 이용한 다중 핵산 검출 방법

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK1715063T3 (da) * 2000-03-29 2011-05-16 Lgc Ltd Hydridiseringsbeacon og fremgangsmåde til hurtig sekvensdetektion og distinktion
US6887664B2 (en) * 2000-06-06 2005-05-03 Applera Corporation Asynchronous primed PCR
CN102171366B (zh) * 2008-07-31 2014-11-26 奥西泰克有限公司 多重扩增与检测
CN103540652B (zh) * 2012-07-17 2015-08-05 刘晓光 一种用于核酸实时检测的探针及其应用
US9641667B2 (en) 2012-12-14 2017-05-02 Nec Corporation Method of releasing a locked state of a terminal device using tapping
US9644458B2 (en) 2013-10-10 2017-05-09 Delta Screen & Filtration, Llc Screen communication sleeve assembly and method
KR101830700B1 (ko) * 2013-11-11 2018-02-21 주식회사 파나진 클램핑 프로브 및 검출 프로브를 이용한 다중 표적핵산 검출방법

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014046688A1 (en) * 2012-09-21 2014-03-27 Qualcomm Incorporated Cyclic shift delay detection using a channel impulse response
KR20140046688A (ko) * 2012-10-10 2014-04-21 주식회사 파나진 리포터 및 소광자가 결합된 pna 프로브를 이용한 융해곡선 분석방법, 융해곡선 분석을 통한 염기다형성 분석방법 및 염기다형성 분석 키트.
KR101845043B1 (ko) * 2015-01-30 2018-04-03 주식회사 시선바이오머티리얼스 PNA 프로브를 이용한 실시간 중합효소연쇄반응의 임계 사이클(Ct)에 따른 핵산 검출의 문제를 해결하는 방법
WO2017099445A1 (ko) * 2015-12-11 2017-06-15 대한민국(관리부서:국립수산과학원) 어류 에드와드 감염증과 연쇄구균 감염증 원인세균의 판별 및 검출용 유전자 마커, 및 이를 이용한 원인세균의 판별 및 검출 방법
KR101919896B1 (ko) * 2018-05-03 2018-11-19 주식회사 유디피아 단일 형광 채널 유전자증폭기기를 이용한 다중 핵산 검출 방법

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
FU, G.: "Multiplex detection and detection genotyping in a single fluores cence channel", PLOS ONE, vol. 7, no. 1, 2012, pages e30340, XP055184730 *

Also Published As

Publication number Publication date
KR101919896B1 (ko) 2018-11-19
CN110691853B (zh) 2022-11-29
CN110691853A (zh) 2020-01-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US9290803B2 (en) DNA methylation analysis by digital bisulfite genomic sequencing and digital methylight
CN104937108B (zh) 利用pH敏感染料的扩增反应产物的检测
WO2018066910A1 (ko) 메틸화 dna 다중 검출방법
CA2537810A1 (en) Nucleic acid detection assay
WO2005075673A2 (en) Detection, identification and differentiation of proteus species using the spacer region
WO2014193198A1 (ko) 바이오 물질의 실시간 정량 및 정성 분석 방법
WO2020213800A1 (ko) 짧은 rna-primed 제노 센서 모듈 증폭 기반 짧은 rna 탐지 기법
WO2016190585A1 (ko) 표적핵산 검출방법 및 키트
WO2022010238A1 (ko) 특정 인공 뉴클레오타이드 서열을 이용한 위양성 판단용 조성물 및 이를 이용한 위양성 판단 방법
WO2019212158A1 (ko) 단일 형광 채널 유전자증폭기기를 이용한 다중 핵산 검출 방법
WO2021182850A1 (ko) Mirna 동시 다중 검출 방법 및 이를 이용한 mirna 검출용 키트
WO2021154042A2 (ko) 결핵균 및 비결핵항산균을 동시에 감별하여 검출할 수 있는 고감도 다중 등온증폭반응용 프라이머 세트
WO2013162109A1 (ko) B형 간염 바이러스를 검출하기 위한 중합효소연쇄반응의 프라이머, 프로브, 및 이를 이용한 검출키트 및 방법
WO2013122319A1 (ko) 리가제 반응과 절단효소 증폭반응을 이용한 표적 유전자 또는 이의 돌연변이 검출방법
WO2018194437A2 (ko) 표적 점 돌연변이 유전자 검출을 위한 핵산 분자 템플레이트 및 이를 이용한 유전자 검사방법
WO2021075912A1 (ko) 결핵균 및 비결핵항산균을 동시에 감별하여 검출할 수 있는 고감도 다중 등온증폭반응용 프라이머 세트
WO2012099397A2 (ko) 실시간 중합효소 연쇄반응을 이용한 표적 유전자의 단일 염기 다형성 판별 방법 및 이를 이용한 표적 유전자의 단일 염기 다형성 판별 키트
WO2013105774A1 (ko) 절단 가능한 프로브를 이용한 ｃ－Ｍｅｔ 유전자 검출 방법
EP1802771A1 (en) Detection, identification and differentiation of serratia species using the spacer region
US8691508B2 (en) Concurrent analysis of multiple patient samples using solid phase addressable multiplex test with high signal-to-noise ratio
WO2022177367A1 (ko) 등온증폭 및 형광 링 패턴에 기반한 표적 핵산의 다중 검출용 조성물 및 이를 이용한 검출방법
CN112041460A (zh) 用于胎儿核酸分析的分子靶标
WO2018048021A1 (ko) Pna 프로브 및 융해곡선분석을 이용한 미토콘드리아 dna의 snp 분석방법
WO2012070863A2 (ko) 핵산효소-분자비콘을 이용한 핵산의 검출방법
CN111100924A (zh) 一种用于检测fmr1基因cgg重复数的质控品及其应用和含有该质控品的试剂盒

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 19796452

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 19796452

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1