WO2013105774A1 - 절단 가능한 프로브를 이용한 ｃ－Ｍｅｔ 유전자 검출 방법 - Google Patents

절단 가능한 프로브를 이용한 ｃ－Ｍｅｔ 유전자 검출 방법 Download PDF

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WO2013105774A1
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김광우
김종원
남도현
기창석
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사회복지법인 삼성생명공익재단
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    • C12Q2600/158—Expression markers

Definitions

  • the present invention relates to a cancer diagnostic kit and a diagnostic method using the same, and a kit capable of detecting a gene in real time using a primer pair and a cleavable probe and a diagnostic method using the same.
  • c-Met is a receptor for hepatocyte growth factor (HGF), and HGF binds to the extracellular site of the c-Met receptor tyrosine kinase, resulting in division, movement, morphogenesis, and angiogenesis in various normal and tumor cells. It is a kind of cytokine that causes it.
  • c-Met is a representative receptor tyrosine kinase on the cell surface, which is itself a cancer-causing gene and sometimes, regardless of its ligand, HGF, such as cancer development, cancer metastasis, cancer cell migration, cancer cell invasion, and neovascularization It is a protein that has recently attracted attention as an anticancer target because it is involved in various mechanisms related to tumors.
  • c-Met is overexpressed in many types of cancer, and in particular, overexpression of c-Met is known to be associated with a poor cause of cancer in patients. Therefore, a primer set capable of specifically amplifying a gene on c-Met can be used to measure the progress of a patient's cancer from a clinical sample taken from the patient. In addition, the primer set may be used as important information in the decision to select a therapeutic agent or treatment for cancer. Accordingly, there is a need for the development of primers or probes that specifically bind to c-Met genes or mRNA, and diagnostic kits capable of confirming the degree of overexpression of c-Met genes or mRNA.
  • PCR polymerase chain reaction
  • the detection kit and diagnostic method using the probe of the present invention were developed.
  • One embodiment provides a kit for detecting a c-Met gene comprising a primer pair and a cleavable probe.
  • Another embodiment provides a method of detecting a c-Met gene using a kit for detecting a c-Met gene comprising a primer pair and a cleavable probe.
  • One aspect is that the expression level of the c-Met gene comprising a primer pair that specifically binds to the c-Met gene and a cleavable probe that specifically binds to the c-Met amplification product amplified by the primer pair. It provides a detection kit for detecting.
  • kits for detecting a c-Met gene comprising a primer consisting of a nucleic acid of SEQ ID NO: 1, a primer consisting of a nucleic acid of SEQ ID NO: 2, and a cleavable probe consisting of a nucleic acid of SEQ ID NO: 7.
  • kits for detecting a c-Met gene comprising a primer composed of a nucleic acid of SEQ ID NO: 3, a primer composed of a nucleic acid of SEQ ID NO: 4, and a cleavable probe composed of a nucleic acid of SEQ ID NO: 8.
  • kits for detecting a c-Met gene comprising a primer composed of a nucleic acid of SEQ ID NO: 5, a primer composed of a nucleic acid of SEQ ID NO: 6, and a cleavable probe composed of a nucleic acid of SEQ ID NO: 9.
  • c-Met gene means a gene encoding a receptor tyrosine kinase that binds to hepatocyte growth factor.
  • GenBank Aceession Number NM_000245 or GenBank Aceession Number NM_000236, which encodes a c-Met protein may be used.
  • the c-Met protein is overexpressed in many types of cancers.
  • the overexpression of c-Met is known to be associated with the poor prognosis of cancer in patients.
  • cancer that can be diagnosed by measuring the overexpression of the c-Met gene, which can cause overexpression of c-Met protein may include carcinoma, lymphoma, blastoma, sarcoma, and leukemia.
  • the cancer may be, for example, bladder cancer, breast cancer, cervical cancer, cholangiocarcinoma, colon cancer, endometrial cancer, esophageal cancer, stomach cancer, head and neck cancer, kidney cancer, liver cancer, lung cancer, nasopharyngeal cancer, ovarian cancer, pancreatic cancer, gallbladder cancer, prostate cancer , Thyroid cancer, osteosarcoma, rhabdomyosarcoma, synovial sarcoma, kaposi's sarcoma, leiomyosarcoma, malignant fibrous histiocytoma, fibrosarcoma, adult T-cell leukemia, lymphoma, multiple myeloma, glioblastoma / astrocytoma, melanoma, mesothelioma and Wilms' tumor Including but not limited to.
  • primer may be used interchangeably with “oligonucleotide” or “polynucleotide”.
  • the primers refer to oligonucleotides that serve as a starting point for starting DNA synthesis in a PCR reaction. Primers are generally 15 to 35 nucleotides and hybridize with regions complementary to the target sequence.
  • probe refers to an oligonucleotide that specifically binds to a target sequence and is intended to hybridize in a sequence-specific manner with complementary regions of specific nucleic acid sequences, such as, for example, target nucleic acid sequences. Polynucleotides comprising specific moieties designed. In one embodiment, the oligonucleotide probe ranges from 15 to 60 nucleotides. Preferably, the oligonucleotide probe ranges from 18 to 30 nucleotides.
  • cleavable probe means a probe consisting of two kinds of nucleic acid, for example, that some nucleotides in a DNA probe are RNA.
  • the cleavable probe may include a DNA of 1 to 10 substituted with RNA, a DNA of 2 to 8 may be substituted with RNA, and a DNA of 3 to 7 may be substituted with RNA, It is not limited to this.
  • RNA may be located in the probe continuously, but may be located in the probe non-continuously. More preferably, it may be any one of probes as SEQ ID NOS: 7 to 9, but is not limited thereto.
  • both ends or the inside of the cleavable probe may be labeled with a detectable substance. It includes an RNase enzyme that can specifically cleave the RNA sequence portion of the RNA-DNA double strand in a PCR reaction. By RNase, after cleavage, all of the fragments of the probe dissociate in the target amplicon at the reaction temperature and are dispersed in the reaction solution. As the labeled donor and receptor are separated inside the pro portion, the fluorescence emission by the donor can be monitored.
  • label or “detectable lebel” refers to a fluorescent dye compound bound to a probe by covalent or non-covalent bonds, and refers to FRET (Forter Resonance Energy Transfer) of fluorescent donors and fluorescent receptors. It can be a pair.
  • FRET Forward Resonance Energy Transfer
  • fluorescent refers to a fluorescent compound that is excited by light of a shorter wavelength than emitted light and emits light.
  • fluorescent donor means a fluorescent dye that emits light as measured in the assays disclosed herein.
  • the fluorescent donor can provide light absorbed by the fluorescent acceptor.
  • fluorescent receptor also refers to a second fluorescent dye or quencher that absorbs the energy emitted from the fluorescent donor. The second fluorescent dye absorbs energy emitted from the fluorescent donor and emits light of a longer wavelength than the light emitted by the fluorescent donor. The quenching molecule absorbs the energy released by the fluorescent donor.
  • any luminescent molecule preferably a fluorescent dye and / or fluorescent quencher, can be used in the practice of the present invention.
  • the light emitting molecule may be, for example, Alexa Fluor 350, Alexa Fluor 430, Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 532, Alexa Fluor 546, Alexa Fluor 568, Alexa Fluor 594, Alexa Fluor 633, Alexa Fluor 647, Alexa Fluor 660, Alexa Fluor 680, 7-diethylaminocowmarin-3-carboxylic acid, fluorescein, Oregon Green 488, Oregon Green 514, tetramethyltamine, rhodamine X, Texas red dye, QSY 7, QSY33, Dabcyl, BODIPY FL , BODIPY 630/650, BODIPY6501665, BODIPY TMR-X, BODIPY TR-X, dialkylaminocoumarin, Cy3 (cyanine 3), Cy3.5, Cy5.5, Cy5,
  • the c-Met gene detection kit may additionally include a thermostable polymerase, RNase, the enzyme included in the kit may be a thermostable polymerase and a thermostable RNase.
  • thermoostable refers to an enzyme that retains its biological activity at elevated temperatures (eg, 55 ° C. or higher), or maintains biological activity upon repeated cycles of heating and cooling. it means.
  • Thermostable polynucleotide polymerases can be used in particular in PCR amplification reactions.
  • the heat stable polymerase may be Taq polymerase. It may be any one Taq polymerase selected from the group consisting of AmpliTaq, AmpliTaq Stoffel fragment, SuperTaq, SuperTaq plus, LA Taq, LApro Taq, and EX Taq.
  • the term "RNase” refers to an enzyme that specifically cleaves RNA.
  • the RNA may be RNA forming a double strand, and the double strand may be a hybrid double strand in which RNA and DNA are combined.
  • the kit may be provided in the form of a kit including a packaging unit having one or more reaction reagents.
  • the kit may also include one or more of the following items: buffers, instructions, and positive or negative controls.
  • the kit may comprise containers of reaction reagents mixed in appropriate proportions to carry out the methods described herein.
  • the reaction reagent vessels preferably contain a unit quantity of reaction reagent so that the measuring step can be omitted when performing the method.
  • the kit reagent further comprises a reagent for extracting genomic DNA or RNA from a biological sample.
  • Kit reagents may also include reagents for application to reverse transcriptase-PCR analysis.
  • a first primer-probe set consisting of a primer consisting of a nucleic acid of SEQ ID NO: 1, a primer consisting of a nucleic acid of SEQ ID NO: 2, and a cleavable probe consisting of a nucleic acid of SEQ ID NO: 7, a primer consisting of a nucleic acid of SEQ ID NO: 3,
  • a second primer-probe set consisting of a primer consisting of a nucleic acid and a cleavable probe consisting of a nucleic acid of SEQ ID NO: 8 and a primer consisting of a nucleic acid of SEQ ID NO: 5, a primer consisting of a nucleic acid of SEQ ID NO: 6, and a cleavage consisting of a nucleic acid of SEQ ID NO: 9
  • the method may include obtaining DNA from a sample.
  • the sample may be taken from a cancer patient or a person for diagnosing cancer progression, or may be taken directly from a specific body part.
  • the DNA may be a genomic DNA (gDNA), a complementary DNA (cDNA), and a DNA fragment.
  • the method of obtaining the DNA may be extracted directly from the cell.
  • cDNA can be obtained through reverse transcription PCR after obtaining mRNA from cells.
  • a first primer-probe set consisting of a primer consisting of a nucleic acid of SEQ ID NO: 1, a primer consisting of a nucleic acid of SEQ ID NO: 2, and a cleavable probe consisting of a nucleic acid of SEQ ID NO: 7, a primer consisting of a nucleic acid of SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO:
  • a second primer-probe set consisting of a primer consisting of a nucleic acid of 4 and a cleavable probe consisting of a nucleic acid of SEQ ID NO: 8 and a primer consisting of a nucleic acid of SEQ ID NO: 5, a primer consisting of a nucleic acid of SEQ ID NO: 6, and a nucleic acid of SEQ ID NO: 9
  • Both ends of the cleavable probe may be labeled with a detectable substance, and may be labeled with a FRET (Forter Resonance Energy Transfer) pair of a fluorescent donor and a fluorescent receptor.
  • FRET Forward Resonance Energy Transfer
  • the amplified by mixing the polymerase, RNase and amplification buffer to the mixed sample.
  • the polymerase and RNase have thermal stability, any kind of enzyme can be used.
  • buffers are compounds that are added to an amplification reaction to modify the stability, activity, and / or lifetime of one or more elements of the amplification reaction.
  • the buffer may be compatible with PCR amplification and RNase H cleavage activity.
  • buffers include HEPES (4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonic acid), MOPS (3- (N-morpholino) -propanesulfonic acid), buffers containing acetate or phosphate, and the like. Including but not limited to
  • PCR buffers may generally comprise up to about 70 mM KCl and about 1.5 mM or more MgCl 2 , about 50-200 uM of each dATP, dCTP, dGTP and dTTP.
  • the buffer may also include additives to optimize efficient reverse transcriptase-PCR or PCR reactions.
  • Additives are compounds added to modify the stability, activity and / or life of one or more elements of the composition.
  • additives that may be included in the amplification reaction are betaine, formamide, KCl, CaCl 2 , MgOAc, MgCl 2 , NaCl, NH 4 OAc, NaI, Na (CO 3 ) 2 , LiCl, MnOAc, NMP, trehalose, demi Ethyl sulfoxide (DMSO), glycerol, ethylene glycol, dithiothreitol (DTT), pyrophosphatase, inorganic pyrophosphatase (TAP), cations, and other compounds, proteins, or other compounds that can change the efficiency of amplification Co-factors include but are not limited to. Additives may optionally be added to enhance the selectivity of primer annealing.
  • the method may include detecting an increase in the signal emitted from the label on the probe.
  • the signal emitted can be fluorescence and the results of fluorescence emission can be detected using a suitable device such as the Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System or Biorad CFX96 real-time PCR thermocycler, but any device available in the art Can be used.
  • the method may include a reverse transcription PCR step of obtaining RNA from a sample and providing cDNA obtained by amplification with a reverse transcriptase enzyme as a DNA of the sample.
  • RNA may be obtained from a cancer patient or a person seeking medical care, and then amplified by reverse transcriptase to obtain cDNA.
  • reverse transcription to cDNA using a reverse transcriptase can be used in all methods that can be used in the art.
  • the reverse transcription PCR uses one of the template specific DNA primers to generate complementary DNA strands.
  • the product is then denatured in a PCR reaction and the second template specific primer is expanded to bind to the cDNA to form duplex DNA.
  • This product is amplified in the next step of temperature cycling. In order to maintain the highest sensitivity, it is important that the RNA is not degraded prior to the synthesis of cDNA.
  • the expression of very small amount of c-Met can be detected in real time, and thus, various cancers associated with over-expression of c-Met can be detected. Diagnosis and prognosis can be easily determined.
  • 1 is an experimental result of amplifying the c-MET target nucleotide sequence using the primer-probe set 1.
  • Figure 2 is an experimental result of amplifying the c-MET target nucleotide sequence using the primer-probe set 2.
  • Figure 3 is an experimental result of amplifying the c-MET target nucleotide sequence using the primer-probe set 3.
  • primers and probes for c-MET detection F: forward, R: reverse, IN: CataCleave: 3 sets in total RNA (synthesized by Integrated DNA Technologies, Inc.).
  • Table 1 set ID order SEQ ID NO: Combined position bp One F TCATGGGTCAATTCAGCGAAGTCCTCT SEQ ID NO: 1 Exon 3 27 IN TGGGACATC agag GGTCGCTTCA SEQ ID NO: 7 Exon 3-4 23 R TGGAGACACTGGATGGGAGTCCA SEQ ID NO: 2 Exon 4 23 2 F CTCCTGGGAATCTGCCTGCGA SEQ ID NO: 3 Exon 17 21 IN AAGGGTCT ccgc TGGTGGTC SEQ ID NO: 8 Exon 17 20 R TGCAGCCAAGTCTCTGTGGACAAAC SEQ ID NO: 4 Exon 18 25 3 F GGCAGTGCAGCATGTAGTGATTGG SEQ ID NO: 5 Exon 15 24 IN GCCCAGTAGCC ugau TGTGCATTTCA SEQ ID NO: 9 Exon 15 26 R TGATGATTCCCTCGGTCAGAAATTGGG SEQ ID NO: 6 Exon 17 27
  • 6-FAM was used as a fluorescent dye at the 5 'end of the DNA of the catacleave probe, which is a cleavable probe
  • Iowa Black RQ was used as the quencher at the 3' end.
  • the MET-1 gene was used for the first and second sets of positive reactions (SEQ ID NO: 10) and the MET-2 gene was used for the third set of positive reactions (SEQ ID NO: 11).
  • the polynucleotide encoding the gene sequence was inserted into the EcoR1 / BamH1 site of pGEM-3Z (promega) and used as a positive sample.
  • the primers, probes and amplification buffer (32 mM HEPES-KOH, pH 7.8, 100 mM potassium acetate, 4 mM magnesium acetate, 0.11% bovine serum albumin, 1% dimethylsulfoxide), dUTP / NTP mix (80 ⁇ M of dGTP, dCTP, dATP and 160 ⁇ M dUTP), 2.5 units of Thermus aquaticus DNA polymerase, 1 unit of Pyrococcus furiosis HII, and 0.1 units of uracil-N-glycosylase was performed in RABI7500 (applied biosystem) according to the following cycling protocol: Initial denaturation was carried out at 95 ° C. for 5 minutes; Denaturation at 95 ° C.
  • the primers and probes of one embodiment When the primers and probes of one embodiment are used, very low concentrations of the c-Met gene can be easily detected as compared with the conventional PCR. Therefore, when using the primer-probe set of one embodiment, it can be usefully used to easily determine the expression of c-Met after performing reverse transcription PCR.

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Abstract

일 구체예는 일 양상은 c-Met 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍 및 상기 프라이머쌍에 의해 증폭되는 c-Met 증폭 산물의 내부에 특이적으로 결합하는 절단 가능한 프로브를 포함하는 c-Met 유전자의 발현량을 검출하는 검출용 키트를 제공하는 것이고, 다른 구체예는 일 구체예 따른 검출용 키트를 이용하여 시료에 있는 c-Met 유전자의 발현량을 측정하는 것이다. 구체예의 방법을 이용할 경우, 낮은 농도의 c-Met 유전자의 발현량도 효율적으로 검출하여 암 진단 및 예후 진단에 유용하게 이용할 수 있다.

Description

절단 가능한 프로브를 이용한 ｃ－Ｍｅｔ 유전자 검출 방법
본 발명은 암 진단 키트 및 이를 이용한 진단 방법에 관한 것으로, 프라이머쌍 및 절단 가능한 프로브를 이용하여 실시간으로 유전자를 검출할 수 있는 키트 및 이를 이용한 진단 방법에 관한 것이다.
c-Met은 간세포 성장 인자(hepatocyte growth factor, HGF)의 수용체이며, HGF는 c-Met 수용체 티로신 키나제의 세포외 부위에 결합하여 다양한 정상세포와 종양세포에서 분열, 운동, 형태발생, 혈관형성을 유발하는 사이토카인의 일종이다. c-Met은 세포 표면에 존재하는 대표적인 수용체 티로신 키나제(receptor tyrosine kinase)로 그 자체가 암유발 유전자이며 때로는 리간드인 HGF와 상관 없이도 암발생, 암전이, 암세포 이동, 암세포 침습, 신생혈관 생성 등과 같은 종양과 관련된 여러 가지 기작에 관여하기 때문에 최근 항암 타겟으로 주목받는 단백질이다.
또한, c-Met은 많은 종류의 암에서 과발현되고 있으며, 특히 c-Met의 과발현은 환자에서 암의 예후가 나쁜 원인과 관련되어 있는 경우가 대부분이라고 알려져 있다. 그러므로, c-Met에 유전자를 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머 세트는 환자에서 채취한 임상 시료로부터, 환자의 암 진행 정도를 측정하는데 사용될 수 있다. 또한, 상기 프라이머 세트는 암의 치료제 또는 치료법을 선택하는 의사 결정에 있어서 중요한 정보로 활용될 수 있다. 따라서, c-Met의 유전자 또는 mRNA에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브, 및 c-Met의 유전자 또는 mRNA의 과발현 정도를 확인할 수 있는 진단용 키트의 개발이 요구되고 있다.
최근 유전자의 검출 및 증폭을 위해 PCR(polymerase chain reaction)이 이용되고 있다. PCR을 이용한, 고속 대량 PCR 스크리닝의 구현은 현대 생물학 및 의학의 혁신적인 변화를 야기하였다. 이러한 분석기술에 의해서, 진단, 환경 모니터링, 혈액 테스트 및 유전자형 검사(genotyping) 등의 몇몇 연구 분야는 큰 영향을 받았다. 생물정보학(bioinformatics)의 등장과 함께, 과학자들은 유사 이래 매우 많은 양의 유전자 정보를 분석할 수 있게 되었다. 그럼에도, 보다 적은 양의 DNA를 검출하고, 실시간으로 증폭된 양을 확인하기 위하여 많은 연구가 진행되고 있다.
따라서, 이러한 PCR의 방법을 개선하여 암 진단에 보다 유용하게 이용될 수 있는 c-Met 유전자를 검출할 수 있는 방법을 연구한 결과 본 발명의 프로브를 이용한 검출 키트 및 진단 방법을 개발하였다.
일 구체예는 프라어머 쌍 및 절단 가능한 프로브를 포함하는 c-Met 유전자의 검출용 키트를 제공한다.
또 다른 구체예는 프라어머 쌍 및 절단 가능한 프로브를 포함하는 c-Met 유전자의 검출용 키트를 이용하여 c-Met 유전자를 검출하는 방법을 제공한다.
일 양상은 c-Met 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍 및 상기 프라이머쌍에 의해 증폭되는 c-Met 증폭 산물의 내부에 특이적으로 결합하는 절단 가능한 프로브를 포함하는 c-Met 유전자의 발현량을 검출하는 검출용 키트를 제공한다.
일 구체예는 서열번호 1의 핵산으로 구성된 프라이머, 서열번호 2의 핵산으로 구성된 프라이머 및 서열번호 7의 핵산으로 구성된 절단 가능한 프로브를 포함하는 c-Met 유전자의 검출용 키트를 제공한다.
또 다른 구체예는 서열번호 3의 핵산으로 구성된 프라이머, 서열번호 4의 핵산으로 구성된 프라이머 및 서열번호 8의 핵산으로 구성된 절단 가능한 프로브를 포함하는 c-Met 유전자 검출용 키트를 제공한다.
또 다른 구체예는 서열번호 5의 핵산으로 구성된 프라이머, 서열번호 6의 핵산으로 구성된 프라이머 및 서열번호 9의 핵산으로 구성된 절단 가능한 프로브를 포함하는 c-Met 유전자의 검출용 키트를 제공한다.
용어, "c-Met 유전자" 는 간세포 성장 인자와 결합하는 수용체 티로신 키나제를 암호화하는 유전자를 의미한다. 예를 들면, c-Met 단백질을 암호화하는 GenBank Aceession Number NM_000245 또는 GenBank Aceession Number NM_000236등이 해당될 수 있다.
c-Met 단백질은 많은 종류의 암에서 과발현되고 있으며, 특히 c-Met의 과발현은 환자에서 암의 예후가 나쁜 원인과 관련되어 있는 경우가 대부분이라고 알려져 있다. 상기 검출용 키트를 이용하여, c-Met 단백질의 과발현을 유발할 수 있는, c-Met 유전자의 과발현 측정을 통해 진단될 수 있는 암은, 암종, 림프종, 아세포종, 육종 및 백혈병을 포함할 수 있으며, 상기 암은 예를 들어, 방광암, 유방암, 자궁경부암, 담관암종, 대장암, 자궁내막암, 식도암, 위암, 두경부암, 신장암, 간암, 폐암, 비인두암, 난소암, 췌장암, 담낭암, 전립선암, 갑상선암, 골육종, 횡문근육종, 활막육종,카포시육종, 평활근육종, 악성 섬유성 조직구종, 섬유육종, 성인 T세포 백혈병, 림프종, 다발 골수종, 신경교아세포종/성상세포종, 흑색종, 중피종 및 윌름스 종양을 포함하나 이에 한정하지 않는다.
용어, "프라이머(primer)"는 "올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)" 또는 "폴리뉴클레오티드(polynucleotide)"와 혼용될 수 있다. 상기 프라이머는 PCR 반응에서 DNA 합성을 시작하기 위한 시작점으로서 작용하는 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 프라이머는 일반적으로 15 내지 35개의 뉴클레오티드이며, 상기 표적 서열에 상보적인 영역과 혼성화된다.
용어, "프로브(probe)"는 표적 서열에 특이적으로 결합하는 올리고뉴클레오티드를 의미하며, 예를 들어, 표적 핵산 서열과 같은 특이적인 핵산 서열의 상보적인 영역을 갖는 서열-특이적인 방법으로 혼성화되도록 고안된 특이적인 부분을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일 구체예에서, 상기 올리고뉴클레오티드 프로브는 15 내지 60개의 뉴클레오티드 범위이다. 바람직하게는, 상기 올리고뉴클레오티드 프로브는 18 내지 30개의 뉴클레오티드 범위이다.
용어, "절단 가능한 프로브"는 두 종류의 핵산으로 구성된 프로브를 의미하며, 예를 들어 DNA 프로브내의 일부 뉴클레오티드가 RNA인 것을 의미한다. 상기 절단 가능한 프로브는 프로브 내부에 1 내지 10의 DNA를 RNA로 치환된 것을 포함할 수 있으며, 2 내지 8의 DNA가 RNA로 치환될 수 있으며, 3 내지 7의 DNA가 RNA로 치환될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, RNA는 연속하여 프로브내에 위치할 수 있으나, 비 연속적으로 프로브내에 위치할 수 있다. 더욱 바람직하게는 서열목록 7 내지 9의로 프로브 중 어느 하나 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 상기 절단 가능한 프로브의 양 말단 또는 내부에 검출가능한 물질로 표지될 수 있다. PCR 반응시에 RNA-DNA 이중가닥의 RNA 서열 부분을 특이적으로 절단할 수 있는 RNase 효소를 포함한다. RNase에 의해, 절단된 후에 프로브의 단편들은 모두 반응 온도에서 표적 앰플리콘에서 해리되며, 반응용액으로 분산된다. 프로부 내부에 표지된 공여체 및 수용체가 분리될수록, 공여체에 의한 형광 방출은 모니터 될 수 있다.
용어, "표지(label)" 또는 "검출가능한 표지(detectable lebel)"는 공유 결합 또는 비공유 결합에 의해 프로브에 결합된 형광 색소 화합물을 의미하며, 형광 공여체 및 형광 수용체의 FRET(Forter Resonance Energy Transfer)쌍 일 수 있다.
용어, "형광 색소(fluorochrome)"는 방출되는 빛보다 더 짧은 파장의 빛에 의해 여기되어 빛을 방출하는 형광 화합물을 의미한다. 또한, 용어, "형광 공여체"는 본 발명에 개시된 어세이에서 측정되는 빛을 방출하는 형광 색소를 의미한다. 또한, 형광 공여체는 형광 수용체(acceptor)에 의해 흡수되는 빛을 제공할 수 있다. 또한, 용어, "형광 수용체"는 형광 공여체로부터 방출되는 에너지를 흡수하는 제2 형광 색소 또는 퀀칭 분자(quencher)를 의미한다. 제2 형광 색소는 형광 공여체로부터 방출되는 에너지를 흡수하며, 형광 공여체에 의해 방출되는 빛보다 더 긴 파장의 빛을 방출한다. 퀀칭 분자는 형광 공여체에 의해 방출된 에너지를 흡수한다.
어떠한 발광 분자, 바람직하게는 형광 색소 및/또는 형광 퀀쳐(quencher)라도 본 발명의 실시에 사용될 수 있다. 상기 발광 분자는 예를 들어, Alexa Fluor 350, Alexa Fluor 430, Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 532,Alexa Fluor 546, Alexa Fluor 568, Alexa Fluor 594, Alexa Fluor 633, Alexa Fluor 647, Alexa Fluor 660,Alexa Fluor 680, 7-디에틸아미노카우마린-3-카르복실산, 플루오레세인, Oregon Green 488, Oregon Green 514,테트라메틸로다민, 로다민 X, 텍사스 레드 염료, QSY 7, QSY33, Dabcyl, BODIPY FL, BODIPY 630/650, BODIPY6501665, BODIPY TMR-X, BODIPY TR-X, 디알킬아미노코우마린, Cy3(cyanine 3), Cy3.5, Cy5.5, Cy5, DTPA(Eu3+)-AMCA 및 TTHA(Eu3+)AMCA를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 바람직하게는 6-FAM 및 Iowa Black BQ의 FRET 쌍이 이용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 상기 c-Met 유전자 검출용 키트는 추가적으로 열안정 폴리머라제, RNase를 포함할 수 있으며, 키트에 포함하는 효소는 열안정성 폴리머라제 및 열안정성 RNase 일 수 있다.
용어, 효소에 적용되는 "열안정성(thermostable)"은 상승된 온도(예를 들어, 55 ℃ 이상)에서 생물학적 활성을 유지하거나, 또는 가열 및 냉각의 반복된 싸이클에 따라 생물학적 활성을 유지하는 효소를 의미한다. 열안정성 폴리뉴클레오티드 폴리머라제는 특별히 PCR 증폭 반응에서 사용될 수 있다. 일 구체예에서, 상기 열안정성 폴리머라제는 Taq 폴리머라제일 수 있다. AmpliTaq, AmpliTaq Stoffel fragment, SuperTaq, SuperTaq plus, LA Taq, LApro Taq, 및 EX Taq으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 Taq 폴리머라제일 수 있다. 또한, 용어, "RNase"는 RNA를 특이적으로 절단하는 효소를 의미한다. 이때 RNA는 이중가닥을 형성하는 RNA일 수 있으며, 이러한 이중가닥은 RNA와 DNA가 결합한 혼성 이중가닥일 수 있다.
또한, 상기 키트는 하나 이상의 반응 시약을 갖는 포장단위를 포함하는 키트 형태로 제공될 수 있다. 또한 상기 키트는 하나 이상의 하기의 품목을 포함할 수 있다: 완충액, 사용설명서, 및 양성 또는 음성 대조군. 키트는 본 명세서에 기술된 방법을 수행하기 위해 적절한 비율로 혼합된 반응 시약들의 용기들을 포함할 수 있다. 반응 시약 용기들은 바람직하게는 상기 방법을 수행할 때 측정하는 단계를 생략할 수 있도록 단위 수량의 반응 시약을 포함한다. 다른 구체예에서, 상기 키트 시약은 생물학적 시료로부터 게놈 DNA 또는 RNA을 추출하기 위한 시약을 더 포함한다. 또한, 키트 시약은 역전사 효소-PCR 분석에 적용하기 위한 시약을 포함할 수 있다.
또 다른 양상은 시료에서 DNA를 수득하는 단계; 서열번호 1의 핵산으로 구성된 프라이머, 서열번호 2의 핵산으로 구성된 프라이머 및 서열번호 7의 핵산으로 구성된 절단 가능한 프로브로 구성된 제1 프라이머-프로브 세트, 서열번호 3의 핵산으로 구성된 프라이머, 서열번호 4의 핵산으로 구성된 프라이머 및 서열번호 8의 핵산으로 구성된 절단 가능한 프로브로 구성된 제2 프라이머-프로브 세트 및 서열번호 5의 핵산으로 구성된 프라이머, 서열번호 6의 핵산으로 구성된 프라이머 및 서열번호 9의 핵산으로 구성된 절단 가능한 프로브로 구성된 제3 프라이머-프로브 세트로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 프라이머-프로브 세트를 시료와 혼합하는 단계; 상기 혼합된 시료에 폴리머라제, RNase 및 증폭 완충액을 혼합하여 증폭시키는 단계; 및 상기 프로브 상의 표지로부터 방출되는 신호의 증가를 검출하는 단계를 포함하는 c-Met 유전자를 검출하는 방법을 제공한다.
상기 c-Met 유전자를 검출하는 방법을 상세하게 설명하면 다음과 같다.
먼저, 시료에서 DNA를 수득하는 단계를 포함할 수 있다. 시료는 암환자 또는 암의 진행여부를 진단하기 위한 사람으로부터 채취할 수 있으며, 또한 특정 신체 부위에서 직접 채취할 수 있다.
이때 상기 DNA는 gDNA(genomic DNA), cDNA(complementary DNA) 및 DNA 단편일 수 있다. 상기 DNA를 수득하는 방법은 세포로부터 직접 추출할 수도 있다. 또한, DNA의 발현량을 검출하기 위하여는 세포로부터 mRNA를 수득한 후 역전사 PCR을 통하여 cDNA를 수득할 수 있다.
이후, 서열번호 1의 핵산으로 구성된 프라이머, 서열번호 2의 핵산으로 구성된 프라이머 및 서열번호 7의 핵산으로 구성된 절단 가능한 프로브로 구성된 제1 프라이머-프로브 세트, 서열번호 3의 핵산으로 구성된 프라이머, 서열번호 4의 핵산으로 구성된 프라이머 및 서열번호 8의 핵산으로 구성된 절단 가능한 프로브로 구성된 제2 프라이머-프로브 세트 및 서열번호 5의 핵산으로 구성된 프라이머, 서열번호 6의 핵산으로 구성된 프라이머 및 서열번호 9의 핵산으로 구성된 절단 가능한 프로브로 구성된 제3 프라이머-프로브 세트로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나를 시료와 혼합하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 절단 가능한 프로브의 양 말단에 검출가능한 물질로 표지될 수 있으며, 형광 공여체 및 형광 수용체의 FRET(Forter Resonance Energy Transfer) 쌍으로 표지될 수 있다.
이후, 상기 혼합된 시료에 폴리머라제, RNase 및 증폭 완충액을 혼합하여 증폭시키는 단계를 포함할 수 있다. 상기 폴리머라제 및 RNase는 열안정성을 갖는 것이면, 어떠한 종류의 효소라도 이용될 수 있다.
증폭 "완충액(buffer)"은 증폭 반응에 첨가되어 상기 증폭 반응을 조절함으로서 상기 증폭 반응의 하나 이상의 요소의 안정성, 활성, 및/또는 수명을 변형시키는 화합물이다. 상기 완충액은 PCR 증폭 및 RNase H절단 활성과 양립할 수 있다. 완충액의 예는, HEPES (4-(2-히드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산), MOPS(3-(N-모르폴리노)-프로판술폰산), 및 아세테이트 또는 포스페이트를 포함하는 완충액 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다,
PCR 완충액은 일반적으로 약 70 mM 이하의 KCl 및 약 1.5 mM 또는 그 이상의 MgCl2, 약 50-200 uM의 각각의 dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP를 포함할 수 있다. 또한 상기 완충액은 효율적인 역전사 효소-PCR 또는 PCR 반응을 최적화시키기 위해 첨가물이 포함될 수 있다.
첨가물은 상기 조성물의 하나 이상의 요소의 안정성, 활성 및/또는 수명을 변형시키기 위하여 첨가되는 화합물이다. 증폭 반응에 포함될 수 있는 첨가물의 예는 베타인, 포름아미드, KCl, CaCl2, MgOAc, MgCl2, NaCl, NH4OAc, NaI, Na(CO3)2, LiCl, MnOAc, NMP, 트레할로스, 데미에틸술폭시드(DMSO), 글리세롤, 에틸렌 글리콜, 디티오트레이톨(DTT), 피로포스파타제, 무기 피로포스파타제(inorganic pyrophosphatase, TAP), 양이온, 및 증폭의 효율을 변화시킬 수 있는 기타 화합물, 단백질, 또는 보조인자를 포함하나, 이에 한정하지 않는다. 첨가물은 프라이머 어닐링의 선택성을 향상시키기 위해 선택적으로 첨가될 수 있다.
이후, 상기 프로브 상의 표지로부터 방출되는 신호의 증가를 검출하는 단계를 포함할 수 있다. 방출되는 신호는 형광일 수 있으며, 형광 방출의 결과는 Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System 또는 Biorad CFX96 real-time PCR thermocycler와 같은 적절한 장치를 사용하여 검출할 수 있으나, 당업계에서 사용 가능한 모든 장치가 이용될 수 있다.
추가적으로, 시료에서 RNA를 수득하여, 역전사 효소로 증폭하여 얻은 cDNA를 시료의 DNA로 제공하는 단계인 역전사 PCR 단계를 포함할 수 있다. 암환자 또는 암에 대한 진료를 받고자 하는 사람으로부터 RNA를 수득한 뒤, 역전사 효소로 증폭하여 cDNA를 얻을 수 있다. 이때, 역전사 효소를 이용한 cDNA로의 역전사는 당업계에서 이용될 수 있는 모든 방법으로 이용될 수 있다.
상기 역전사 PCR은 주형 특이적인 DNA 프라이머의 하나를 사용하여 상보적인 DNA 가닥을 생성한다. 그후, PCR 반응에서 이 생성물은 변성되고, 제2 주형 특이적인 프라이머가 상기 cDNA에 결합하여, 듀플렉스 DNA를 형성하도록 확장된다. 이 생성물은 온도 싸이클링의 다음 단계에서 증폭된다. 가장 높은 민감성을 유지하기 위해, cDNA의 합성 전에 상기 RNA는 분해되지 않도록 하는 것이 중요하다.
상기의 c-Met 유전자를 검출하는 방법을 이용하여, c-Met 유전자의 발현량을 확인하면, c-Met의 과발현과 관련된 암종, 림프종, 아세포종, 육종 또는 백혈병 등을 진단할 수 있다. 구체적으로 이러한 암은, 방광암, 유방암, 자궁경부암, 담관암종, 대장암, 자궁내막암, 식도암, 위암, 두경부암, 신장암, 간암, 폐암, 비인두암, 난소암, 췌장암, 담낭암, 전립선암, 갑상선암, 골육종, 횡문근육종, 활막육종, 카포시육종, 평활근육종, 악성 섬유성 조직구종, 섬유육종, 성인 T세포 백혈병, 림프종, 다발 골수종, 신경교아세포종/성상세포종, 흑색종, 중피종 및 윌름스 종양을 포함하나 이에 한정하지 않는다.
일 구체예에 따른 c-Met에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트 및 절단 가능한 프로브를 이용할 경우, 매우 소량의 c-Met의 발현도 실시간으로 검출할 수 있으므로, c-Met의 과발현과 관련된 여러가지 암의 진단 및 예후를 쉽게 판단할 수 있다.
도 1은 프라이머-프로브 세트 1을 이용하여 c-MET 타겟 염기 서열을 증폭한 실험 결과이다.
도 2는 프라이머-프로브 세트 2를 이용하여 c-MET 타겟 염기 서열을 증폭한 실험 결과이다.
도 3는 프라이머-프로브 세트 3을 이용하여 c-MET 타겟 염기 서열을 증폭한 실험 결과이다.
이하 하나 이상의 구체예를 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. c-Met 탐지용 프라이머 세트 및 프로브의 제작
c-MET 탐지용 프라이머와 프로브 (F: forward, R:reverse, IN:CataCleave): 총 3세트 (소문자로 표기된 서열은 RNA임)를 제작하였다(Integrated DNA Technologies, Inc에서 합성).
표 1
세트 ID 서열 서열번호 결합 위치 bp
1 F TCATGGGTCAATTCAGCGAAGTCCTCT 서열번호1 Exon 3 27
IN TGGGACATCagagGGTCGCTTCA 서열번호7 Exon 3-4 23
R TGGAGACACTGGATGGGAGTCCA 서열번호2 Exon 4 23
2 F CTCCTGGGAATCTGCCTGCGA 서열번호3 Exon 17 21
IN AAGGGTCTccgcTGGTGGTC 서열번호8 Exon 17 20
R TGCAGCCAAGTCTCTGTGGACAAAC 서열번호4 Exon 18 25
3 F GGCAGTGCAGCATGTAGTGATTGG 서열번호5 Exon 15 24
IN GCCCAGTAGCCugauTGTGCATTTCA 서열번호9 Exon 15 26
R TGATGATTCCCTCGGTCAGAAATTGGG 서열번호6 Exon 17 27
또한, 절단 가능한 프로브인 catacleave 프로브의 DNA의 양말단인 5' 말단에는 형광 염료로서, 6-FAM을 이용하였고, 3' 말단에는 퀀쳐로서 Iowa Black RQ를 이용하여 표지하였다.
실시예 2. 시료의 채취
제1세트 및 제2세트의 양성반응을 위하여는 MET-1 유전자를 사용하였고(서열번호 10), 제3세트의 양성반응을 위하여는 MET-2 유전자를 사용하였다(서열번호 11). 상기 유전자 서열를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 pGEM-3Z(프로메가)의 EcoR1/BamH1 사이트에 삽입하여 양성 샘플로 이용하였다.
실시예 3. c-Met 탐지용 프라이머 세트 및 프로브를 이용한 c-Met 유전자의 검출
상기 프라이머, 프로브 및 증폭 완충액(32 mM HEPES-KOH, pH 7.8, 100 mM 포타슘 아세테이트, 4 mM 마그네슘 아세테이트, 0.11 % 우혈청 알부민, 1% 디메틸술폭시드), dUTP/NTP 믹스 (80 μM의 dGTP, dCTP, dATP 및 160 μM dUTP), 2.5 유니트의 테르무스 아쿠아티쿠스(Thermus aquaticus) DNA 폴리머라제, 1 유니트의 피로코쿠스 푸리오시스(Pyrococcus furiosis) HII, 및 0.1 유니트의 우라실-N-글리코실라제를 이용하여 하기 싸이클링 프로토콜에 따라 RABI7500(applied biosystem)에서 수행하였다: 초기 변성은 95 ℃에서 5분간 실시; 95℃에서 10초간 변성, 이후, 65℃에서 10초간 어닐링, 72℃에서 40초로 50회의 증폭; 72 ℃에서 5분간 최종 연장. FAM 방출은 65℃ 단계에서 모니터 되었다(도 1 내지 3 참조).
일 구체예의 프라이머 및 프로브를 이용할 경우 통상의 PCR로 수행하는 경우에 비하여 매우 낮은 농도의 c-Met 유전자도 용이하게 검출할 수 있다. 따라서, 일 구체예의 프라이머-프로브 세트를 이용할 경우, 역전사 PCR을 수행한 후 c-Met의 발현 여부를 용이하게 판단하는데 유용하게 사용될 수 있다.
SEQ ID No. 1:
TCATGGGTCAATTCAGCGAAGTCCTCT
SEQ ID No. 2:
tggagacactggatgggagtcca
SEQ ID No. 3:
ctcctgggaatctgcctgcga
SEQ ID No. 4:
tgcagccaagtctctgtggacaaac
SEQ ID No. 5:
ggcagtgcagcatgtagtgattgg
SEQ ID No. 6:
tgatgattccctcggtcagaaattggg
SEQ ID No. 7:
tgggacatcagagggtcgcttca
SEQ ID No. 8:
aagggtctccgctggtggtc
SEQ ID No. 9:
gcccagtagccugautgtgcatttca
SEQ ID No. 10:
agagtttacc acagctttgc agcgcgttga cttattcatg ggtcaattca gcgaagtcct
cttaacatct atatccacct tcattaaagg agacctcacc atagctaatc ttgggacatc
agagggtcgc ttcatgcagg ttgtggtttc tcgatcagga ccatcaaccc ctcatgtgaa
ttttctcctg gactcccatc cagtgtctcc agaagtgatt gtggagcata cattaaacca
aaatggctac acactggtta tcactgggaa gaagatcacg aagatcccat tgaatggctt
gggctgcaga catttccagt cctgcagtca atgcctctct gccccaccct ttgttcagtg
tggctggtgc cacgacaaat gtgtgcgatc ggaggaatgc ctgagcggga catggactca
acagatctgt ctgcctgcaa tctacaaggt tttcccaaat agtgcacccc ttgaaggagg
gacaaggctg accatatgtg gctgggactt tggatttcgg
SEQ ID No. 11:
ctcagtgctc taaatccaga gctggtccag gcagtgcagc atgtagtgat tgggcccagt
agcctgattg tgcatttcaa tgaagtcata ggaagagggc attttggttg tgtatatcat
gggactttgt tggacaatga tggcaagaaa attcactgtg ctgtgaaatc cttgaacaga
atcactgaca taggagaagt ttcccaattt ctgaccgagg gaatcatcat gaaagatttt
agtcatccca atgtcctctc gctcctggga atctgcctgc gaagtgaagg gtctccgctg
gtggtcctac catacatgaa acatggagat cttcgaaatt tcattcgaaa tgagactcat
aatccaactg taaaagatct tattggcttt ggtcttcaag tagccaaagg catgaaatat
ttgcaagca aaaagtttgt ccacagagac ttggctgcaa g

Claims (9)

  1. 서열번호 1의 핵산으로 구성된 프라이머, 서열번호 2의 핵산으로 구성된 프라이머 및 서열번호 7의 핵산으로 구성된 절단 가능한 프로브를 포함하는 c-Met 유전자 검출용 키트.
  2. 서열번호 3의 핵산으로 구성된 프라이머, 서열번호 4의 핵산으로 구성된 프라이머 및 서열번호 8의 핵산으로 구성된 절단 가능한 프로브를 포함하는 c-Met 유전자 검출용 키트.
  3. 서열번호 5의 핵산으로 구성된 프라이머, 서열번호 6의 핵산으로 구성된 프라이머 및 서열번호 9의 핵산으로 구성된 절단 가능한 프로브를 포함하는 c-Met 유전자 검출용 키트.
  4. 제1항 내지 제3항의 어느 한 항에 있어서, 열안정 폴리머라제 및 RNase를 추가로 포함하는 c-Met 유전자 검출용 키트.
  5. 제1항 내지 제3항의 어느 한 항에 있어서, 상기 절단 가능한 프로브는 프로브 내부에 1 내지 10의 DNA가 RNA로 치환된 것인 c-Met 유전자 검출용 키트.
  6. 제1항 내지 제3항의 어느 한 항에 있어서, 상기 절단 가능한 프로브는 프로브 내부에 3 내지 7의 DNA가 RNA로 치환된 것인 c-Met 유전자 검출용 키트.
  7. 제5항에 있어서, 상기 절단 가능한 프로브는 서로 다른 DNA 부분의 양 말단에 검출가능한 물질로 표지된 것인 c-Met 유전자 검출용 키트.
  8. 제7항에 있어서, 상기 검출가능한 표지는 FRET 쌍으로 표지된 것인 c-Met 유전자 검출용 키트.
  9. 시료에서 DNA를 수득하는 단계;
    서열번호 1의 핵산으로 구성된 프라이머, 서열번호 2의 핵산으로 구성된 프라이머 및 서열번호 7의 핵산으로 구성된 절단 가능한 프로브로 구성된 제1 프라이머-프로브 세트, 서열번호 3의 핵산으로 구성된 프라이머, 서열번호 4의 핵산으로 구성된 프라이머 및 서열번호 8의 핵산으로 구성된 절단 가능한 프로브로 구성된 제2 프라이머-프로브 세트 및 서열번호 5의 핵산으로 구성된 프라이머, 서열번호 6의 핵산으로 구성된 프라이머 및 서열번호 9의 핵산으로 구성된 절단 가능한 프로브로 구성된 제3 프라이머-프로브 세트로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나를 시료와 혼합하는 단계;
    상기 혼합된 시료에 폴리머라제, RNase 및 증폭 완충액을 혼합하여 증폭시키는 단계; 및
    상기 프로브 상의 표지로부터 방출되는 신호 증가를 검출하는 단계를 포함하는 c-Met 유전자를 검출하는 방법.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015065008A1 (ko) * 2013-10-28 2015-05-07 서울대학교산학협력단 섬유묶음 절단물을 이용한 다중 바이오어세이 플랫폼

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104946634A (zh) * 2015-06-04 2015-09-30 陕西师范大学 一种双标记荧光激活型探针及其检测dna的方法
CN112852929A (zh) * 2021-02-08 2021-05-28 广州普世利华科技有限公司 用于检测dna的组合产品
CN117187395A (zh) * 2023-11-06 2023-12-08 神州医疗科技股份有限公司 一种met基因扩增定量检测的引物探针组、试剂盒和系统

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20050050390A (ko) * 2003-11-25 2005-05-31 한면기 핵산과 단백질의 신규한 실시간 탐지방법
KR20080004514A (ko) * 2005-03-25 2008-01-09 제넨테크, 인크. 폐암에서의 ｃ-ｍｅｔ 돌연변이

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2011188855A (ja) * 2010-03-11 2011-09-29 Samsung Techwin Co Ltd 切断可能なキメラプローブを使用したサルモネラのリアルタイム検出方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20050050390A (ko) * 2003-11-25 2005-05-31 한면기 핵산과 단백질의 신규한 실시간 탐지방법
KR20080004514A (ko) * 2005-03-25 2008-01-09 제넨테크, 인크. 폐암에서의 ｃ-ｍｅｔ 돌연변이

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DATABASE GENEBANK 18 December 2011 (2011-12-18), "Homo sapiens met proto-oncogene (hepatocyte growth factor receptor) (MET), transcript variant 1, mRNA", accession no. 01127500.1 *
HARVEY, J. J. ET AL.: "Characterization and applications of CataCleave probe in real-time detection assays", ANAL. BIOCHEM., vol. 333, no. 2, 15 October 2004 (2004-10-15), pages 246 - 255 *
TAKEUCHI H. ET AL.: "c-MET expression level in primary colon cancer: a predictor of tumor invasion and lymph node metastases", CLIN, CANCER RES., vol. 9, no. 4, April 2003 (2003-04-01), pages 1480 - 1488 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015065008A1 (ko) * 2013-10-28 2015-05-07 서울대학교산학협력단 섬유묶음 절단물을 이용한 다중 바이오어세이 플랫폼

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