KR101404682B1 - 절단 가능한 프로브를 이용한 ｃ―Ｍｅｔ 유전자 검출 방법 - Google Patents

절단 가능한 프로브를 이용한 ｃ―Ｍｅｔ 유전자 검출 방법 Download PDF

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Abstract

일 구체예는 일 양상은 c-Met 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍 및 상기 프라이머쌍에 의해 증폭되는 c-Met 증폭 산물의 내부에 특이적으로 결합하는 절단 가능한 프로브를 포함하는 c-Met 유전자의 발현량을 검출하는 검출용 키트를 제공하는 것이고, 다른 구체예는 일 구체예 따른 검출용 키트를 이용하여 시료에 있는 c-Met 유전자의 발현량을 측정하는 것이다. 구체예의 방법을 이용할 경우, 낮은 농도의 c-Met 유전자의 발현량도 효율적으로 검출하여 암 진단 및 예후 진단에 유용하게 이용할 수 있다.

Description

절단 가능한 프로브를 이용한 ｃ―Ｍｅｔ 유전자 검출 방법{Method for detection of c-Met gene using a cleavable probe}
본 발명은 암 진단 키트 및 이를 이용한 진단 방법에 관한 것으로, 프라이머쌍 및 절단 가능한 프로브를 이용하여 실시간으로 유전자를 검출할 수 있는 키트 및 이를 이용한 진단 방법에 관한 것이다.
c-Met은 간세포 성장 인자(hepatocyte growth factor, HGF)의 수용체이며, HGF는 c-Met 수용체 티로신 키나제의 세포외 부위에 결합하여 다양한 정상세포와 종양세포에서 분열, 운동, 형태발생, 혈관형성을 유발하는 사이토카인의 일종이다. c-Met은 세포 표면에 존재하는 대표적인 수용체 티로신 키나제(receptor tyrosine kinase)로 그 자체가 암유발 유전자이며 때로는 리간드인 HGF와 상관 없이도 암발생, 암전이, 암세포 이동, 암세포 침습, 신생혈관 생성 등과 같은 종양과 관련된 여러 가지 기작에 관여하기 때문에 최근 항암 타겟으로 주목받는 단백질이다(KR 10-2011-59261A).
또한, c-Met은 많은 종류의 암에서 과발현되고 있으며, 특히 c-Met의 과발현은 환자에서 암의 예후가 나쁜 원인과 관련되어 있는 경우가 대부분이라고 알려져 있다. 그러므로, c-Met에 유전자를 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머 세트는 환자에서 채취한 임상 시료로부터, 환자의 암 진행 정도를 측정하는데 사용될 수 있으며, 암의 치료제 또는 치료법을 선택하는 의사 결정에 있어서 중요한 정보로 활용될 수 있다. 따라서, c-Met에 특이적으로 결합하는 프라이머 및 그의 과발현 정도를 확인할 수 있는 진단용 키트의 개발이 요구되고 있다.
최근 유전자의 검출 및 증폭을 위해 PCR(polymerase chain reaction)이 이용되고 있다. PCR을 이용한, 고속 대량 PCR 스크리닝의 구현은 현대 생물학 및 의학의 혁신적인 변화를 야기하였다. 이러한 놀랄만한 분석기술에 의해서, 진단, 환경 모니터링, 혈액 테스트 및 유전자형 검사(genotyping) 등의 몇몇 연구 분야는 큰 영향을 받았다. 생물정보학(bioinformatics)의 등장과 함께, 과학자들은 유사 이래 매우 많은 양의 유전자 정보를 분석할 수 있게 되었다. 그럼에도, 보다 적은 양의 DNA를 검출하고, 실시간으로 증폭된 양을 확인하기 위하여 많은 연구가 진행되고 있다.
따라서, 이러한 PCR의 방법을 개선하여 암 진단에 보다 유용하게 이용될 수 있는 c-Met 유전자를 검출할 수 있는 방법을 연구한 결과 본 발명의 프로브를 이용한 검출 키트 및 진단 방법을 개발하였다.
KR 10-2011-59261A 요약 및 배경 기술
일 구체예는 프라어머 쌍 및 절단 가능한 프로브를 포함하는 c-Met 유전자의 검출용 키트를 제공한다.
또 다른 구체예는 프라어머 쌍 및 절단 가능한 프로브를 포함하는 c-Met 유전자의 검출용 키트를 이용하여 c-Met 유전자를 검출하는 방법을 제공한다.
일 양상은 c-Met 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍 및 상기 프라이머쌍에 의해 증폭되는 c-Met 증폭 산물의 내부에 특이적으로 결합하는 절단 가능한 프로브를 포함하는 c-Met 유전자의 발현량을 검출하는 검출용 키트를 제공한다.
일 구체예는 서열번호 1의 핵산으로 구성된 프라이머, 서열번호 2의 핵산으로 구성된 프라이머 및 서열번호 7의 핵산으로 구성된 절단 가능한 프로브를 포함하는 c-Met 유전자의 검출용 키트를 제공한다.
또 다른 구체예는 서열번호 3의 핵산으로 구성된 프라이머, 서열번호 4의 핵산으로 구성된 프라이머 및 서열번호 8의 핵산으로 구성된 절단 가능한 프로브를 포함하는 c-Met 유전자 검출용 키트를 제공한다.
또 다른 구체예는 서열번호 5의 핵산으로 구성된 프라이머, 서열번호 6의 핵산으로 구성된 프라이머 및 서열번호 9의 핵산으로 구성된 절단 가능한 프로브를 포함하는 c-Met 유전자의 검출용 키트를 제공한다.
용어, "c-Met 유전자" 는 간세포 성장 인자와 결합하는 수용체 티로신 키나제를 암호화하는 유전자를 의미한다. 예를 들면, c-Met 단백질을 암호화하는 GenBank Aceession Number NM_000245 또는 GenBank Aceession Number NM_000236등이 해당될 수 있다.
c-Met 단백질은 많은 종류의 암에서 과발현되고 있으며, 특히 c-Met의 과발현은 환자에서 암의 예후가 나쁜 원인과 관련되어 있는 경우가 대부분이라고 알려져 있다. 상기 검출용 키트를 이용하여, c-Met 단백질의 과발현을 유발할 수 있는, c-Met 유전자의 과발현 측정을 통해 진단될 수 있는 암은, 암종, 림프종, 아세포종, 육종 및 백혈병을 포함할 수 있으며, 상기 암은 예를 들어, 방광암, 유방암, 자궁경부암, 담관암종, 대장암, 자궁내막암, 식도암, 위암, 두경부암, 신장암, 간암, 폐암, 비인두암, 난소암, 췌장암, 담낭암, 전립선암, 갑상선암, 골육종, 횡문근육종, 활막육종,카포시육종, 평활근육종, 악성 섬유성 조직구종, 섬유육종, 성인 T세포 백혈병, 림프종, 다발 골수종, 신경교아세포종/성상세포종, 흑색종, 중피종 및 윌름스 종양을 포함하나 이에 한정하지 않는다.
용어, "프라이머(primer)"는 "올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)" 또는 "폴리뉴클레오티드(polynucleotide)"와 혼용될 수 있다. 상기 프라이머는 PCR 반응에서 DNA 합성을 시작하기 위한 시작점으로서 작용하는 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 프라이머는 일반적으로 15 내지 35개의 뉴클레오티드이며, 상기 표적 서열에 상보적인 영역과 혼성화된다.
용어, "프로브(probe)"는 표적 서열에 특이적으로 결합하는 올리고뉴클레오티드를 의미하며, 예를 들어, 표적 핵산 서열과 같은 특이적인 핵산 서열의 상보적인 영역을 갖는 서열-특이적인 방법으로 혼성화되도록 고안된 특이적인 부분을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일 구체예에서, 상기 올리고뉴클레오티드 프로브는 15 내지 60개의 뉴클레오티드 범위이다. 바람직하게는, 상기 올리고뉴클레오티드 프로브는 18 내지 30개의 뉴클레오티드 범위이다.
용어, "절단 가능한 프로브"는 두 종류의 핵산으로 구성된 프로브를 의미하며, 예를 들어 DNA 프로브내의 일부 뉴클레오티드가 RNA인 것을 의미한다. 상기 절단 가능한 프로브는 프로브 내부에 1 내지 10의 DNA를 RNA로 치환된 것을 포함할 수 있으며, 2 내지 8의 DNA가 RNA로 치환될 수 있으며, 3 내지 7의 DNA가 RNA로 치환될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, RNA는 연속하여 프로브내에 위치할 수 있으나, 비 연속적으로 프로브내에 위치할 수 있다. 더욱 바람직하게는 서열목록 7 내지 9의로 프로브 중 어느 하나 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 상기 절단 가능한 프로브의 양 말단 또는 내부에 검출가능한 물질로 표지될 수 있다. PCR 반응시에 RNA-DNA 이중가닥의 RNA 서열 부분을 특이적으로 절단할 수 있는 RNase 효소를 포함한다. RNase에 의해, 절단된 후에 프로브의 단편들은 모두 반응 온도에서 표적 앰플리콘에서 해리되며, 반응용액으로 분산된다. 프로부 내부에 표지된 공여체 및 수용체가 분리될수록, 공여체에 의한 형광 방출은 모니터 될 수 있다.
용어, "표지(label)" 또는 "검출가능한 표지(detectable lebel)"는 공유 결합 또는 비공유 결합에 의해 프로브에 결합된 형광 색소 화합물을 의미하며, 형광 공여체 및 형광 수용체의 FRET(Forter Resonance Energy Transfer)쌍 일 수 있다.
용어, "형광 색소(fluorochrome)"는 방출되는 빛보다 더 짧은 파장의 빛에 의해 여기되어 빛을 방출하는 형광 화합물을 의미한다. 또한, 용어, "형광 공여체"는 본 발명에 개시된 어세이에서 측정되는 빛을 방출하는 형광 색소를 의미한다. 또한, 형광 공여체는 형광 수용체(acceptor)에 의해 흡수되는 빛을 제공할 수 있다. 또한, 용어, "형광 수용체"는 형광 공여체로부터 방출되는 에너지를 흡수하는 제2 형광 색소 또는 퀀칭 분자(quencher)를 의미한다. 제2 형광 색소는 형광 공여체로부터 방출되는 에너지를 흡수하며, 형광 공여체에 의해 방출되는 빛보다 더 긴 파장의 빛을 방출한다. 퀀칭 분자는 형광 공여체에 의해 방출된 에너지를 흡수한다.
어떠한 발광 분자, 바람직하게는 형광 색소 및/또는 형광 퀀쳐(quencher)라도 본 발명의 실시에 사용될 수 있다. 상기 발광 분자는 예를 들어, Alexa Fluor 350, Alexa Fluor 430, Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 532,Alexa Fluor 546, Alexa Fluor 568, Alexa Fluor 594, Alexa Fluor 633, Alexa Fluor 647, Alexa Fluor 660,Alexa Fluor 680, 7-디에틸아미노카우마린-3-카르복실산, 플루오레세인, Oregon Green 488, Oregon Green 514,테트라메틸로다민, 로다민 X, 텍사스 레드 염료, QSY 7, QSY33, Dabcyl, BODIPY FL, BODIPY 630/650, BODIPY6501665, BODIPY TMR-X, BODIPY TR-X, 디알킬아미노코우마린, Cy3(cyanine 3), Cy3.5, Cy5.5, Cy5, DTPA(Eu3+)-AMCA 및 TTHA(Eu3+)AMCA를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 바람직하게는 6-FAM 및 Iowa Black BQ의 FRET 쌍이 이용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 상기 c-Met 유전자 검출용 키트는 추가적으로 열안정 폴리머라제, RNase를 포함할 수 있으며, 키트에 포함하는 효소는 열안정성 폴리머라제 및 열안정성 RNase 일 수 있다.
용어, 효소에 적용되는 "열안정성(thermostable)"은 상승된 온도(예를 들어, 55 ℃ 이상)에서 생물학적 활성을 유지하거나, 또는 가열 및 냉각의 반복된 싸이클에 따라 생물학적 활성을 유지하는 효소를 의미한다. 열안정성 폴리뉴클레오티드 폴리머라제는 특별히 PCR 증폭 반응에서 사용될 수 있다. 일 구체예에서, 상기 열안정성 폴리머라제는 Taq 폴리머라제일 수 있다. AmpliTaq, AmpliTaq Stoffel fragment, SuperTaq, SuperTaq plus, LA Taq, LApro Taq, 및 EX Taq으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 Taq 폴리머라제일 수 있다. 또한, 용어, "RNase"는 RNA를 특이적으로 절단하는 효소를 의미한다. 이때 RNA는 이중가닥을 형성하는 RNA일 수 있으며, 이러한 이중가닥은 RNA와 DNA가 결합한 혼성 이중가닥일 수 있다.
또한, 상기 키트는 하나 이상의 반응 시약을 갖는 포장단위를 포함하는 키트 형태로 제공될 수 있다. 또한 상기 키트는 하나 이상의 하기의 품목을 포함할 수 있다: 완충액, 사용설명서, 및 양성 또는 음성 대조군. 키트는 본 명세서에 기술된 방법을 수행하기 위해 적절한 비율로 혼합된 반응 시약들의 용기들을 포함할 수 있다. 반응 시약 용기들은 바람직하게는 상기 방법을 수행할 때 측정하는 단계를 생략할 수 있도록 단위 수량의 반응 시약을 포함한다. 다른 구체예에서, 상기 키트 시약은 생물학적 시료로부터 게놈 DNA 또는 RNA을 추출하기 위한 시약을 더 포함한다. 또한, 키트 시약은 역전사 효소-PCR 분석에 적용하기 위한 시약을 포함할 수 있다.
또 다른 양상은 시료에서 DNA를 수득하는 단계; 서열번호 1의 핵산으로 구성된 프라이머, 서열번호 2의 핵산으로 구성된 프라이머 및 서열번호 7의 핵산으로 구성된 절단 가능한 프로브로 구성된 제1 프라이머-프로브 세트, 서열번호 3의 핵산으로 구성된 프라이머, 서열번호 4의 핵산으로 구성된 프라이머 및 서열번호 8의 핵산으로 구성된 절단 가능한 프로브로 구성된 제2 프라이머-프로브 세트 및 서열번호 5의 핵산으로 구성된 프라이머, 서열번호 6의 핵산으로 구성된 프라이머 및 서열번호 9의 핵산으로 구성된 절단 가능한 프로브로 구성된 제3 프라이머-프로브 세트로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 프라이머-프로브 세트를 시료와 혼합하는 단계; 상기 혼합된 시료에 폴리머라제, RNase 및 증폭 완충액을 혼합하여 증폭시키는 단계; 및 상기 프로브 상의 표지로부터 방출되는 신호의 증가를 검출하는 단계를 포함하는 c-Met 유전자를 검출하는 방법을 제공한다.
상기 c-Met 유전자를 검출하는 방법을 상세하게 설명하면 다음과 같다.
먼저, 시료에서 DNA를 수득하는 단계를 포함할 수 있다. 시료는 암환자 또는 암의 진행여부를 진단하기 위한 사람으로부터 채취될 수 있으며, 또한 특정 신체 부위에서 직접 채취될 수 있다.
이후, 서열번호 1의 핵산으로 구성된 프라이머, 서열번호 2의 핵산으로 구성된 프라이머 및 서열번호 7의 핵산으로 구성된 절단 가능한 프로브로 구성된 제1 프라이머-프로브 세트, 서열번호 3의 핵산으로 구성된 프라이머, 서열번호 4의 핵산으로 구성된 프라이머 및 서열번호 8의 핵산으로 구성된 절단 가능한 프로브로 구성된 제2 프라이머-프로브 세트 및 서열번호 5의 핵산으로 구성된 프라이머, 서열번호 6의 핵산으로 구성된 프라이머 및 서열번호 9의 핵산으로 구성된 절단 가능한 프로브로 구성된 제3 프라이머-프로브 세트로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나를 시료와 혼합하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 절단 가능한 프로브의 양 말단에 검출가능한 물질로 표지될 수 있으며, 형광 공여체 및 형광 수용체의 FRET(Forter Resonance Energy Transfer) 쌍으로 표지될 수 있다.
이후, 상기 혼합된 시료에 폴리머라제, RNase 및 증폭 완충액을 혼합하여 증폭시키는 단계를 포함할 수 있다. 상기 폴리머라제 및 RNase는 열안정성을 갖는 것이면, 어떠한 종류의 효소라도 이용될 수 있다.
증폭 "완충액(buffer)"은 증폭 반응에 첨가되어 상기 증폭 반응을 조절함으로서 상기 증폭 반응의 하나 이상의 요소의 안정성, 활성, 및/또는 수명을 변형시키는 화합물이다. 상기 완충액은 PCR 증폭 및 RNase H절단 활성과 양립할 수 있다. 완충액의 예는, HEPES (4-(2-히드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산), MOPS(3-(N-모르폴리노)-프로판술폰산), 및 아세테이트 또는 포스페이트를 포함하는 완충액 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다,
PCR 완충액은 일반적으로 약 70 mM 이하의 KCl 및 약 1.5 mM 또는 그 이상의 MgCl2, 약 50-200 uM의 각각의 dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP를 포함할 수 있다. 또한 상기 완충액은 효율적인 역전사 효소-PCR 또는 PCR 반응을 최적화시키기 위해 첨가물이 포함될 수 있다.
첨가물은 상기 조성물의 하나 이상의 요소의 안정성, 활성 및/또는 수명을 변형시키기 위하여 첨가되는 화합물이다. 증폭 반응에 포함될 수 있는 첨가물의 예는 베타인, 포름아미드, KCl, CaCl2, MgOAc, MgCl2, NaCl, NH4OAc, NaI, Na(CO3)2, LiCl, MnOAc, NMP, 트레할로스, 데미에틸술폭시드(DMSO), 글리세롤, 에틸렌 글리콜, 디티오트레이톨(DTT), 피로포스파타제, 무기 피로포스파타제(inorganic pyrophosphatase, TAP), 양이온, 및 증폭의 효율을 변화시킬 수 있는 기타 화합물, 단백질, 또는 보조인자를 포함하나, 이에 한정하지 않는다. 첨가물은 프라이머 어닐링의 선택성을 향상시키기 위해 선택적으로 첨가될 수 있다.
이후, 상기 프로브 상의 표지로부터 방출되는 신호의 증가를 검출하는 단계를 포함할 수 있다. 방출되는 신호는 형광일 수 있으며, 형광 방출의 결과는 Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System 또는 Biorad CFX96 real-time PCR thermocycler와 같은 적절한 장치를 사용하여 검출할 수 있으나, 당업계에서 사용 가능한 모든 장치가 이용될 수 있다.
추가적으로, 시료에서 RNA를 수득하여, 역전사 효소로 증폭하여 얻은 cDNA를 시료의 DNA로 제공하는 단계인 역전사 PCR 단계를 포함할 수 있다. 암환자 또는 암에 대한 진료를 받고자 하는 사람으로부터 RNA를 수득한 뒤, 역전사 효소로 증폭하여 cDNA를 얻을 수 있다. 이때, 역전사 효소를 이용한 cDNA로의 역전사는 당업계에서 이용될 수 있는 모든 방법으로 이용될 수 있다.
상기 역전사 PCR은 주형 특이적인 DNA 프라이머의 하나를 사용하여 상보적인 DNA 가닥을 생성한다. 그후, PCR 반응에서 이 생성물은 변성되고, 제2 주형 특이적인 프라이머가 상기 cDNA에 결합하여, 듀플렉스 DNA를 형성하도록 확장된다. 이 생성물은 온도 싸이클링의 다음 단계에서 증폭된다. 가장 높은 민감성을 유지하기 위해, cDNA의 합성 전에 상기 RNA는 분해되지 않도록 하는 것이 중요하다.
상기의 c-Met 유전자를 검출하는 방법을 이용하여, c-Met 유전자의 발현량을 확인하면, c-Met의 과발현과 관련된 암종, 림프종, 아세포종, 육종 또는 백혈병 등을 진단할 수 있다. 구체적으로 이러한 암은, 방광암, 유방암, 자궁경부암, 담관암종, 대장암, 자궁내막암, 식도암, 위암, 두경부암, 신장암, 간암, 폐암, 비인두암, 난소암, 췌장암, 담낭암, 전립선암, 갑상선암, 골육종, 횡문근육종, 활막육종, 카포시육종, 평활근육종, 악성 섬유성 조직구종, 섬유육종, 성인 T세포 백혈병, 림프종, 다발 골수종, 신경교아세포종/성상세포종, 흑색종, 중피종 및 윌름스 종양을 포함하나 이에 한정하지 않는다.
일 구체예에 따른 c-Met에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트 및 절단 가능한 프로브를 이용할 경우, 매우 소량의 c-Met의 발현도 실시간으로 검출할 수 있으므로, c-Met의 과발현과 관련된 여러가지 암의 진단 및 예후를 쉽게 판단할 수 있다.
도 1은 프라이머 세트 1을 이용하여 c-MET 타겟 염기 서열을 증폭한 실험 결과이다.
도 2는 프라이머 세트 2를 이용하여 c-MET 타겟 염기 서열을 증폭한 실험 결과이다.
도 3는 프라이머 세트 3을 이용하여 c-MET 타겟 염기 서열을 증폭한 실험 결과이다.
이하 하나 이상의 구체예를 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: c- Met 탐지용 프라이머 세트 및 프로브의 제작
c-MET 탐지용 프라이머와 프로브 (F: forward, R:reverse, IN:CataCleave): 총 3세트 (소문자로 표기된 서열은 RNA임)를 제작하였다(Integrated DNA Technologies, Inc에서 합성).
세트 ID 서열 서열번호 결합 위치 bp
1 F TCATGGGTCAATTCAGCGAAGTCCTCT 서열번호1 Exon 3 27
IN TGGGACATCagagGGTCGCTTCA 서열번호7 Exon 3-4 23
R TGGAGACACTGGATGGGAGTCCA 서열번호2 Exon 4 23
2 F CTCCTGGGAATCTGCCTGCGA 서열번호3 Exon 17 21
IN AAGGGTCTccgcTGGTGGTC 서열번호8 Exon 17 20
R TGCAGCCAAGTCTCTGTGGACAAAC 서열번호4 Exon 18 25
3 F GGCAGTGCAGCATGTAGTGATTGG 서열번호5 Exon 15 24
IN GCCCAGTAGCCugauTGTGCATTTCA 서열번호9 Exon 15 26
R TGATGATTCCCTCGGTCAGAAATTGGG 서열번호6 Exon 17 27
또한, 절단 가능한 프로브인 catacleave 프로브의 DNA의 양말단인 5' 말단에는 형광 염료로서, 6-FAM을 이용하였고, 3' 말단에는 퀀쳐로서 Iowa Black RQ를 이용하여 표지하였다.
실시예 2: 시료의 채취
제1세트 및 제2세트의 양성반응을 위하여는 MET-1 유전자를 사용하였고(서열번호 10), 제3세트의 양성반응을 위하여는 MET-2 유전자를 사용하였다(서열번호 11). 상기 유전자 서열를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 pGEM-3Z(프로메가)의 EcoR1/BamH1 사이트에 삽입하여 양성 샘플로 이용하였다.
실시예 3: c- Met 탐지용 프라이머 세트 및 프로브를 이용한 c- Met 유전자의 검출
상기 프라이머, 프로브 및 증폭 완충액(32 mM HEPES-KOH, pH 7.8, 100 mM 포타슘 아세테이트, 4 mM 마그네슘 아세테이트, 0.11 % 우혈청 알부민, 1% 디메틸술폭시드), dUTP/NTP 믹스 (80 μM의 dGTP, dCTP, dATP 및 160 μM dUTP), 2.5 유니트의 테르무스 아쿠아티쿠스(Thermus aquaticus) DNA 폴리머라제, 1 유니트의 피로코쿠스 푸리오시스(Pyrococcus furiosis) HII, 및 0.1 유니트의 우라실-N-글리코실라제를 이용하여 하기 싸이클링 프로토콜에 따라 RABI7500(applied biosystem)에서 수행하였다: 초기 변성은 95 ℃에서 5분간 실시; 95℃에서 10초간 변성, 이후, 65℃에서 10초간 어닐링, 72℃에서 40초로 50회의 증폭; 72 ℃에서 5분간 최종 연장. FAM 방출은 65℃ 단계에서 모니터 되었다(도 1 내지 3 참조).
서열목록 전자파일 첨부

Claims (11)

  1. 서열번호 5의 핵산으로 구성된 프라이머, 서열번호 6의 핵산으로 구성된 프라이머 및 서열번호 9의 핵산으로 구성된 절단 가능한 프로브를 포함하는 c-Met 유전자 검출용 키트.
  2. 제1항에 있어서, 서열번호 1의 핵산으로 구성된 프라이머, 서열번호 2의 핵산으로 구성된 프라이머 및 서열번호 7의 핵산으로 구성된 절단 가능한 프로브를 더 포함하는 c-Met 유전자 검출용 키트.
  3. 제1항에 있어서, 서열번호 3의 핵산으로 구성된 프라이머, 서열번호 4의 핵산으로 구성된 프라이머 및 서열번호 8의 핵산으로 구성된 절단 가능한 프로브를 더 포함하는 c-Met 유전자 검출용 키트.
  4. 제1항 내지 제3항의 어느 한 항에 있어서, 열안정 폴리머라제 및 RNase를 추가로 포함하는 c-Met 유전자 검출용 키트.
  5. 제1항 내지 제3항의 어느 한 항에 있어서, 상기 절단 가능한 프로브는 프로브 내부에 1 내지 10의 DNA가 RNA로 치환된 것인 c-Met 유전자 검출용 키트.
  6. 제1항 내지 제3항의 어느 한 항에 있어서, 상기 절단 가능한 프로브는 프로브 내부에 3 내지 7의 DNA가 RNA로 치환된 것인 c-Met 유전자 검출용 키트.
  7. 제5항에 있어서, 상기 절단 가능한 프로브는 서로 다른 DNA 부분의 양 말단에 검출가능한 물질로 표지된 것인 c-Met 유전자 검출용 키트.
  8. 제7항에 있어서, 상기 검출가능한 표지는 FRET 쌍으로 표지된 것인 c-Met 유전자 검출용 키트.
  9. 시료에서 DNA를 수득하는 단계;
    서열번호 5의 핵산으로 구성된 프라이머, 서열번호 6의 핵산으로 구성된 프라이머 및 서열번호 9의 핵산으로 구성된 절단 가능한 프로브로 구성된 프라이머-프로브 세트를 시료와 혼합하는 단계;
    상기 혼합된 시료에 폴리머라제, RNase 및 증폭 완충액을 혼합하여 증폭시키는 단계; 및
    상기 프로브 상의 표지로부터 방출되는 신호 증가를 검출하는 단계를 포함하는 c-Met 유전자를 검출하는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 혼합하는 단계는 서열번호 1의 핵산으로 구성된 프라이머, 서열번호 2의 핵산으로 구성된 프라이머 및 서열번호 7의 핵산으로 구성된 절단 가능한 프라이머-프로브 세트를 시료와 혼합하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  11. 제9항에 있어서, 상기 혼합하는 단계는 서열번호 3의 핵산으로 구성된 프라이머, 서열번호 4의 핵산으로 구성된 프라이머 및 서열번호 8의 핵산으로 구성된 절단 가능한 프라이머-프로브 세트를 시료와 혼합하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
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