JP2004135509A - 遺伝子発現解析法及び遺伝子発現解析用プローブキット - Google Patents
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Abstract
【課題】標的核酸の配列に関わらずユニバーサルに使用できる新規な遺伝子発現解析用キット、及びこれを利用した簡便な遺伝子発現解析法を提供すること。
【解決手段】標的遺伝子の塩基配列に対して非特異的な配列を有する第１の塩基配列及び第２の塩基配列について、前記第１の塩基配列よりも５’末端側に前記第２の塩基配列を結合させ、共に前記標的遺伝子に導入させた分析対象遺伝子に対し、前記標的遺伝子に特異的にハイブリダイズする塩基配列を含むプライマーと、前記第２の塩基配列と同一な塩基配列を含むプライマーと、前記第１の塩基配列と同一又は相補的な塩基配列を含むＴａｑＭａｎＴＭプローブを用いてリアルタイムＰＣＲ検出を行う。
【選択図】 図１
【解決手段】標的遺伝子の塩基配列に対して非特異的な配列を有する第１の塩基配列及び第２の塩基配列について、前記第１の塩基配列よりも５’末端側に前記第２の塩基配列を結合させ、共に前記標的遺伝子に導入させた分析対象遺伝子に対し、前記標的遺伝子に特異的にハイブリダイズする塩基配列を含むプライマーと、前記第２の塩基配列と同一な塩基配列を含むプライマーと、前記第１の塩基配列と同一又は相補的な塩基配列を含むＴａｑＭａｎＴＭプローブを用いてリアルタイムＰＣＲ検出を行う。
【選択図】 図１
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は蛍光エネルギートランスファーを利用した遺伝子発現解析用プローブキットに関する。より詳細には、標的遺伝子にその塩基配列に非依存的な配列を導入することにより、当該標的遺伝子の配列に関わらずユニバーサルに使用できる遺伝子発現解析用プローブキットとそれを利用した遺伝子発現解析法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、ＤＮＡやＲＮＡの定量には比較ＲＴ−ＰＣＲ法が用いられていた。比較ＲＴ−ＰＣＲ法では、まず標的遺伝子を含むサンプルをさまざまな濃度に希釈してスタンダードとなるサンプルを作製し、このスタンダードサンプルを増幅してＰＣＲ産物量を測定する。次に、ＰＣＲ産物量をサイクル数に対してプロットした検量線を作製し、得られた検量線から未知濃度の標的遺伝子量を求める。しかし、比較ＲＴ−ＰＣＲ法で検量線を作成するためには、全てのスタンダードサンプルが指数関数的に増幅している領域を求める必要があり、煩雑であるという欠点がある。また、ＰＣＲ産物量の測定には、蛍光検出と電気泳動とを組み合わせることが多く、電気泳動で増幅産物のサイズを確認してから、蛍光強度を測定して増幅産物の量を調べなければならないのが一般的である。
【０００３】
近年、ＰＣＲ産物量を電気泳動することなく、リアルタイムに蛍光検出できる複数の方法が報告された（例えば、特許文献１及び２、非特許文献１〜３参照）。これらの方法では、蛍光エネルギートランスファーを利用して、ＰＣＲ産物にハイブリダイズすることで蛍光が生じるよう工夫されたプローブ（例えば、ＴａｑＭａｎＴＭプローブＲ やモレキュラービーコン）が、リアルタイム検出のために用いられる。さらに検出に際しては、各サイクルごとにＰＣＲ産物量を測定できるため、ＰＣＲ産物が指数関数的に増幅している領域とプラトーに達している領域を簡単に求めることができる。それゆえ、比較ＲＴ−ＰＣＲ法における手間が改善され、効率的な発現遺伝子の比較法として急速に広まってきた。
【０００４】
しかし、蛍光エネルギートランスファーを利用したＰＣＲ産物検出法では、標的遺伝子を検出するためのプローブやプライマーを各標的遺伝子ごとに個別に設計しなければならない。しかも、これらのプローブは、通常のプライマーとは設計指針が異なること、また蛍光エネルギートランスファーを利用しているため高価であるという問題点がある。
【０００５】
これに対し、Ｗｈｉｔｃｏｍｂｅらは、標的遺伝子の配列によらずユニバーサルに使用できるＴａｑＭａｎＴＭプローブを用いたＰＣＲ産物の蛍光アッセイを報告している（例えば、非特許文献４参照）。このアッセイはゲノムＤＮＡを対象とし、１塩基多型のタイピングを目的としている。この方法では、鋳型非特異的なプローブ配列及びＴａｇ配列をゲノムＤＮＡに導入することにより、鋳型非特異的なＴａｑＭａｎＴＭプローブを用いたアッセイを可能にしている。しかしながら、この方法では導入用のプライマーペアに加えて、合成されたＤＮＡのＴａｇ配列にハイブリダイズし、該ＤＮＡを増幅するための別なプライマーペアの２種類のプライマーペアが用いられる。そのため、２とおりの温度サイクルを必要とし、しかも反応副産物の生成を回避することができない。また、１つの反応容器でリアルタイム検出を行う場合、２種のプローブの融解温度の違いから厳密な反応性をそろえることができないという問題点がある。これらの問題から、このアッセイは遺伝子発現の定量的分析には不都合である。
【０００６】
【特許文献１】
米国特許 第６，３９５，５１８号明細書
【特許文献２】
国際公開 第９７／４２３４５号パンフレット
【非特許文献１】
Ｎａｚａｒｅｎｋｏ Ａ．， ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｄ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， １９９７， ｖｏｌ．２５， Ｎｏ．１２， ｐ２５１６−２５２１
【非特許文献２】
Ｍｙａｋｉｓｈｅｖ Ｍ．Ｖ．， ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ２００１， Ｖｏｌ．１１， ｐ１６３−１６９
【非特許文献３】
Ｐａｍｅｌａ Ｍ．， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ＵＳＡ， Ａｕｇｕｓｔ １９９１， Ｖｏｌ．８８， ｐ７２７６−７２８０
【非特許文献４】
Ｗｈｉｔｃｏｍｂｅ Ｄ．， ｅｔ ａｌ．， Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， １９９８， Ｖｏｌ．４４， Ｎｏ．５， ｐ９１８−９２３
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、上記従来技術の問題点を解決し、標的遺伝子の配列に関わらずユニバーサルに使用できる新規な遺伝子発現解析用キット、及びこれを利用した簡便な遺伝子発現解析法を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決するために、本発明は、以下の遺伝子発現解析法を提供する。標的遺伝子の塩基配列に対して非特異的な配列を有する第１の塩基配列及び第２の塩基配列について、
前記第１の塩基配列よりも５’末端側に前記第２の塩基配列を結合させ、共に前記標的遺伝子に導入させた分析対象遺伝子に対し、
前記標的遺伝子に特異的にハイブリダイズする塩基配列を含むプライマー、
前記第２の塩基配列と同一な塩基配列を含むプライマー、
前記第１の塩基配列と同一又は相補的な塩基配列を含み、一方の末端を蛍光体で修飾され、もう一方の末端を消光体で修飾されたプローブ、及び
５’→３’エキソヌクレア−ゼ活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いて核酸増幅反応を行い、
前記核酸増幅反応の際に前記耐熱性ＤＮＡポリメラーゼにより前記第１の塩基配列に結合した前記プローブを分解し、
遊離した前記蛍光体の発する蛍光を検出することにより、前記核酸増幅反応の産物量を計測することを特徴とする遺伝子発現解析法。
【０００９】
ここで、標的遺伝子への第１の塩基配列と第２の塩基配列の導入は、３つの配列部分から構成される導入用プライマーを使用することによって行われる。該導入用プライマーは、前記標的遺伝子に特異的にハイブリダイズする配列を含む第３の塩基配列より５’末端側に前記第１の塩基配列を含み、かつ前記第１の塩基配列より５’末端側に前記第２の塩基配列を含む。ここで、第１の部分はＰＣＲ検出時に用いるプローブと同一の配列又は相補的な配列であり、第２の部分はＰＣＲ検出時に用いるリバース側プライマーと同一の配列である。第１、第２、第３の部分は連続していても良いし、それぞれの部分の間に連結部があっても良い。第３の配列は標的遺伝子の配列によって変化するが、第１及び第２の配列は標的遺伝子の配列に依存せず任意に設計することができる。
【００１０】
本発明の１つの実施態様として、ｍＲＮＡを対象とした発現解析の場合、まず上記３つの配列部分を有する導入用プライマーを逆転写用プライマーとして用いて、標的ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）からｃＤＮＡ第一鎖を合成する。このｃＤＮＡは、標的遺伝子に第１の塩基配列と第２の塩基配列が導入された分析対象遺伝子として機能する。次に、得られた分析対象遺伝子（ｃＤＮＡ）をテンプレートとして、導入用プライマーの第３の部分がハイブリダイズする位置よりも５’末端側で標的遺伝子とハイブリダイズするフォワード側プライマーと、第２の塩基配列と同一の配列からなるリバース側プライマーと、第１の塩基配列と同一の配列又は相補的な配列からなるＴａｑＭａｎＴＭプローブとを用いてリアルタイムＰＣＲ検出を行う。
【００１１】
なお、ＴａｑＭａｎＴＭプローブとは、プローブの５’末端が蛍光体で標識され、３’末端が該蛍光体の発する蛍光をエネルギートランスファーにより消光する物質（消光体）で標識されたＤＮＡプローブである。ＴａｑＭａｎＴＭプローブは、通常の状態では、５’末端と３’末端がそれぞれ蛍光体と消光体で標識されているため蛍光を発しない。しかし、ＰＣＲ実行時、前記プローブが標的配列にハイブリダイズし、逆側プライマーからの伸長反応がおこると、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性によりプローブが分解され、フリーな蛍光体が生じて蛍光を発する。
【００１２】
本発明の遺伝子発現解析法では、逆転写反応後の核酸増幅反応は、１組のプライマーを用いて、単一温度サイクルで行われる。ここで、「サイクル」とは、一般的なＰＣＲにおける１回の伸長鎖合成に至る過程をいい、具体的には、２本鎖核酸を解離させるステップ、プライマー及びプローブを分析対象遺伝子に結合させるステップ、そして伸長反応をさせるステップの３つのステップからなる。そのため、操作が簡便で、反応副産物の生成を心配する必要がない。
【００１３】
本発明の遺伝子発現解析法においては、２種以上のプローブを用いることにより、１つの標的遺伝子について、１つの容器を用いて、複数の検体由来の試料を同時に分析することができる。このような複数検体の同時解析においては、各プローブの反応性をそろえ、正確な発現解析を行うため、前記２種以上のプローブの融解温度は実質的に同じにすることが好ましい。
【００１４】
本発明はまた、遺伝子発現解析のためのキットを提供する。該キットは、標的遺伝子の塩基配列に対してそれぞれ非特異的な配列を有する、前記標的遺伝子に導入される第１の塩基配列、及び第１の塩基配列よりも５’末端側に位置する第２の塩基配列について、
前記第１の塩基配列と同一又は相補的な配列を含み、一方の末端を蛍光体で修飾され、もう一方の末端を消光体で修飾されたプローブ、及び
前記第２の塩基配列と同一の配列を含み、前記第１の塩基配列より５’末端側に結合するプライマーを含む。
【００１５】
複数検体の同時検出を目的とする場合、前記キットは２種以上のプローブを含み、これらプローブの融解温度は実質的に同じであることが望ましい。実質的に同じ融解温度を有する２種以上のプローブとしては、例えば、各々３乃至４塩基長の複数のモジュール配列からなり、各モジュール配列の両末端の塩基は同一であり、かつ各プローブがこの両末端の塩基が同一であるモジュール配列同士の順序を入れ替えて構成されたプローブを挙げることができる。
【００１６】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を図面に基づいて詳細に説明する。
１． 導入用プライマーの設計
図１は本発明の遺伝子発現解析法を模式的に示した図である。１は試料である標的ＲＮＡであり、２は導入用（逆転写用）プライマーである。導入用プライマー２は、標的ＲＮＡにハイブリダイズする配列部分３と、配列部分３より５’末端側に位置し、ＰＣＲ検出時に用いるプローブと同一の配列からなる配列部分４と、配列部分４より５’末端側に位置し、ＰＣＲ検出時に用いるリバース側プライマー１１と同一の配列からなる配列部分５から構成されている。
【００１７】
前記配列部分３、４、５は連続していても良いし、それぞれの部分の間に連結部があっても良い。配列部分３の長さは、特に限定されないが、好ましくは１８〜２５塩基長程度である。配列部分４の長さも、特に限定されないが、好ましくは１８〜３０塩基長程度である。配列部分５の長さも、特に限定されないが、好ましくは１８〜２５塩基長程度である。配列部分３は標的遺伝子の配列によって変化するが、配列部分４及び５は標的遺伝子の配列に依存せず任意に設計することができる。
【００１８】
２． 分析対象遺伝子の合成（ｃＤＮＡへの逆転写）
前記導入用プライマーを逆転写用プライマーとして用いて、標的遺伝子のｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成する。逆転写反応は、当該分野で公知の方法に従い、鋳型ＲＮＡを含む反応液に、前記プライマー、逆転写酵素、基質を加えて、３５〜４５℃で３０〜６０分程度インキュベートすればよい。この逆転写反応により、標的遺伝子に該遺伝子の配列に依存しない、第１の塩基配列４及び第２の塩基配列５が導入されたｃＤＮＡが分析対象遺伝子として合成される。
【００１９】
３． ＰＣＲプライマーとユニバーサルプローブの設計
次に、前項で合成した分析対象遺伝子（ｃＤＮＡ）に対して、該遺伝子を増幅するためのＰＣＲプライマーと、該遺伝子を検出するためのユニバーサルなプローブの設計について説明する。
【００２０】
図１に示すように、前記ＰＣＲプライマーとしては、分析対象遺伝子にハイブリダイズするフォワード側プライマー１０と、分析対象遺伝子に導入されている配列部分５と同一の配列を有するリバース側プライマー１１を用いる。
【００２１】
ＰＣＲ産物検出用プローブとしては、分析対象遺伝子に導入されている配列部分４と同一の配列を有するプローブ１２を用いる。プローブ１２は、図中にＲで記す蛍光体１３と図中にＱで記す消光体１４で標識されている。プローブ１２はインタクトな状態では、蛍光エネルギートランスファーにより蛍光体１３の蛍光は抑制されているが、ＰＣＲ反応の進行に伴い、該蛍光体を遊離させて発光する。なお、用いられる蛍光体としては、例えば、クマリン、フルオレセイン、テトラクロロフルオレセイン、ヘキサクロロフルオレセイン、ルシフェールイエロー（Ｌｕｃｉｆｅｒ ｙｅｌｌｏｗ）、ローダミン、ＢＯＤＩＰＹ、テトラメチルローダミン、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ７、イオシン、テキサスレッド、ＲＯＸ、ＦＡＭ、及びＶＩＣ等が挙げられる。また、消光体としては、４−（４’−ジメチルアミノフェニルアザ）−安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）、ＤＡＢＭＩ及びメチルレッド等を挙げることができる。蛍光体のうち、ある種の他の蛍光体に接触するとその蛍光を消光する機能を有するものは、消光体としても使用できる。
【００２２】
また、プローブ１２はフォワードプライマー１０あるいはリバース側プライマー１１よりも標的配列に対してより早くハイブリダイズできるようにＴｍ値が５〜１５℃、好ましくは１０℃程度高くなるように設計することが必要である。このＴｍ値の調整には、例えば、プローブのＴｍ値（融解温度）を向上させる物質；Ｔｍエンハンサーを用いる。該Ｔｍエンハンサーとしては、例えばＤＮＡ結合物質である、ＭＧＢ（マイナーグルーブバインダー）等を用いることができる。また、プローブ１２は耐熱性ＤＮＡポリメラーゼによって伸長しないように、その３’末端をリン酸化しておくことが必要である。
【００２３】
図２を用いて、逆転写用プライマー２、リバース側プライマー１１、プローブ１２の配列の関係についてさらに詳しく説明する。なお、図中、プローブ及びプライマーは左に５’末端、右に３’末端が位置するように記載されている。
【００２４】
図２（ａ）に示すように、逆転写用プライマー２は標的ＲＮＡにハイブリダイズする配列部分３と、プローブ１２と同一の配列からなる配列部分４と、リバース側プライマー１１と同一の配列からなる配列部分５から構成されている。３つの配列部分のうち、配列部分５が最も５’末端側に位置し、配列部分５よりも３’末端側に配列部分４が位置し、配列部分４よりも３’末端側に配列部分３が位置している。プローブ１２の５’末端は蛍光体１３で標識され、３’末端は消光体１４で標識されている。消光体１４にはＴｍ値エンハンサー１８が結合している。
【００２５】
また、図２（ｂ）に示すように、逆転写用プライマー１７が標的ＲＮＡにハイブリダイズする配列部分３と、プローブ１２と同一の配列からなる配列部分４と、リバース側プライマー１１と同一の配列からなる配列部分５の他に、各配列部分の間に連結部となる配列部分１６があっても良い。当該連結部の長さは特に限定されないが、通常１〜５塩基長程度であることが好ましい。
【００２６】
プローブ１２が蛍光を発するためには、リバース側プライマー１１とプローブ１２がＤＮＡ鎖にハイブリダイズした際、ＤＮＡポリメラーゼによってリバース側プライマー１１が伸長するとプローブ１２が加水分解するような位置関係にあることが必要である。リバース側プライマー１１と同一の配列からなる配列部分５よりも３’側にプローブ１２と同一の配列からなる配列部分４が位置していればよく、配列部分５の３’末端と配列部分４の５’末端が図２（ａ）に示すように接していても、図２（ｂ）に示すようにその他の塩基配列が間に入っていても良い。
【００２７】
プローブ１２の配列は標的ＲＮＡの配列と無関係に設計することができる。別の標的ＲＮＡを測定する場合でも逆転写用プライマー２の配列部分３と、フォワード側プライマー１０の配列を設計しなおすだけでよく、プローブ１２はユニバーサルなプローブ（ユニバーサルプローブ）として使用可能である。またリバース側プライマー１１も共通のプライマーとして使用することができる。
【００２８】
４． ＰＣＲ反応と発光
ＰＣＲ反応は、当該分野で公知の方法に従い、反応チューブに分析対象遺伝子（ｃＤＮＡ）、フォワード側プライマー、リバース側プライマー、プローブを入れ、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いて行われる。
【００２９】
図１に基づいてＰＣＲ反応と発光のプロセスを説明する。前記ＰＣＲ反応の初期段階において、フォワード側プライマー１０が第一鎖ｃＤＮＡ６にハイブリダイズして、伸長することにより第二鎖ｃＤＮＡ７が合成される。第二鎖ｃＤＮＡ７は、リバース側プライマー１１に相補的な配列と、プローブ１２に相補的な配列を有している。プローブ１２は、消光体１４にＴｍ値エンハンサー（ＤＮＡ結合性物質）を結合することでＴｍ値が向上し、プライマーよりも早く標的配列にハイブリダイズできる。したがって、第二鎖ｃＤＮＡ７に対しては、優先的にプローブ１２がハイブリダイズする。
【００３０】
さらに、フォワード側プライマー１０が第一鎖ｃＤＮＡ６に、リバース側プライマー１１が第二鎖ｃＤＮＡ７に対してそれぞれハイブリダイズして、伸長する。リバース側プライマー１１が伸長するとＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性により、第二鎖ｃＤＮＡ７にハイブリダイズしているプローブ１２は、５’末端側から加水分解される。加水分解の結果、プローブ１２から蛍光体１３が遊離し、フリーの蛍光体１５が生じて蛍光を発する。
【００３１】
図１にはプローブ１２が逆転写用プライマー２の配列部分４と同一の配列の場合を示したが、プローブ１２が、配列部分４と相補的な配列の場合も同様の検出が可能である。この場合には、プローブ１２は第一鎖ｃＤＮＡ６にハイブリダイズし、フォワード側プライマー１０の伸長によって加水分解を受ける。
【００３２】
上記のとおり、プローブ１２はＰＣＲ進行中に生じる第一鎖ｃＤＮＡ６もしくは第二鎖ｃＤＮＡ７にハイブリダイズし、フォワード側プライマー１０もしくはリバース側プライマー１１の伸長によって加水分解を受けて蛍光を発する。従って、ＰＣＲ増幅されるｃＤＮＡの量に応じて蛍光の発光量は増加する。つまり、試料中に含まれる標的ＲＮＡの量を測定することができる。なお、この際、［非特許文献４］に示した例と異なり、ＰＣＲが単一温度サイクルであるため、副産物生成を低減化させることができる。これにより、標的ＲＮＡの定量的な分析の精度を高めることができる。
【００３３】
５． 複数検体の同時解析
次に、２種以上のユニバーサルプローブを用いて、１つの標的遺伝子について、１つの容器を用いて、複数の検体由来の試料を同時に解析する（複数検体の同時解析）方法について説明する。
【００３４】
５．１ ２種以上のユニバーサルプローブの設計
図５は、複数検体を同時解析する場合に用いる２種のユニバーサルプローブ：プローブＡ（図５の３０）とプローブＢ（図５の４０）の構造を模式的に示したものである。
【００３５】
プローブＡの５’末端は図中Ｒ１で示される蛍光体３１で標識され、３’末端は、Ｒ１由来の蛍光を蛍光エネルギートランスファーによって消光する消光体３２で標識されている。プローブＢもプローブＡと同様に５’末端が図中Ｒ２で示される蛍光体４１で標識され、３’末端が蛍光を消光するための消光体３２で標識されている。必要に応じて、それぞれのプローブの消光体３２にはＤＮＡのマイナーグルーブ（副溝）に結合するＴｍ値エンハンサー３３を結合してもよい。
【００３６】
プローブＢの５’末端に標識されているＲ２は、Ｒ１とは異なる蛍光波長で発光する蛍光体を選択することが必要である。これにより、Ｒ１とＲ２との蛍光波長の違いから、プローブＡ由来の蛍光かプローブＢ由来の蛍光かを識別することができる。
【００３７】
さらに、プローブＡとプローブＢは、同じ反応特性でそれぞれの標的遺伝子にハイブリダイズするように設計することが必要である。図５に示すよう、プローブＡ及びプローブＢの配列を、３塩基乃至４塩基のモジュール配列３４〜３９から構成されるものとする。プローブを構成するモジュール配列の数は、特に限定されないが、一般的には５〜８程度であることが望ましい。前記各モジュール配列の両末端の塩基は同じ塩基種で構成される。また、プローブＢの配列は、プローブＡの配列と同じ両末端の塩基を有するモジュール同士の順番を入れ替えて構成されている。両末端の塩基種が同じモジュール同士の順番を入れ替えているため、モジュール同士の連結部分の塩基配列はプローブＡとプローブＢで同じである。また、プローブ配列を構成するモジュールはプローブＡとプローブＢで同じである。これにより、プローブＡとプローブＢの熱力学的性質が等価になり、それぞれのＴｍ値はｎｅａｒｅｓｔ ｎｅｉｇｈｂｏｒ法で計算すると同一の値となる。すなわち、プローブＡとプローブＢは全体の配列は異なるが、実質的に同じＴｍ値を有し、同一反応チューブで、同時に反応させても、それぞれの相補的な配列に対して同じ反応特性でハイブリダイズすることが可能となる。よって、定量分析に用いる場合に厳密な分析が可能となる。以上、２種類のプローブの設計について説明したが、３種以上の場合も同様にして設計することができる。
【００３８】
５．２ 分析対象遺伝子の合成（ｃＤＮＡへの逆転写）
図６に、プローブＡ及びプローブＢを用いて２種類の試料（試料▲１▼及び▲２▼）由来の標的遺伝子を一つの反応チューブでＰＣＲ増幅し、各試料由来の遺伝子発現を解析する方法の概略を示す。まず、試料▲１▼から抽出したＲＮＡからｃＤＮＡを調製する。５１は試料▲１▼から抽出したＲＮＡであり、５２は逆転写用プライマーである。逆転写用プライマー５２は、標的ＲＮＡにハイブリダイズする配列部分５３と、配列部分５３より５’末端側に位置し、ＰＣＲ検出時に用いるプローブと同一の配列からなる配列部分５４と、配列部分５４より５’末端側に位置し、ＰＣＲ検出時に用いるリバース側プライマー６６と同一の配列からなる配列部分５５から構成されている。このプライマーを用いて、前項４．と同様に逆転写反応を行い、配列部分５４と配列部分５５が導入された第一鎖ｃＤＮＡ５６を得る。
【００３９】
第一鎖ｃＤＮＡ５６を調製した反応チューブとは別のチューブにて、試料▲２▼から抽出したＲＮＡからｃＤＮＡを合成する。７１は試料▲２▼から抽出したＲＮＡであり、７２は逆転写用プライマーである。逆転写用プライマー７２は、標的ＲＮＡにハイブリダイズする配列部分５３と、配列部分５３より５’末端側に位置し、ＰＣＲ検出時に用いるプローブと同一の配列からなる配列部分７４と、配列部分７４より５’末端側に位置し、ＰＣＲ検出時に用いるリバース側プライマー６６と同一の配列からなる配列部分５５から構成されている。試料▲２▼についても、同様に逆転写反応を行い、配列部分７４と配列部分５５が導入された第一鎖ｃＤＮＡ７６を得る。なお、逆転写用プライマー５２の配列部分５３と逆転写用プライマー７２の配列部分５３は、どちらも同じ標的ＲＮＡにハイブリダイズするため、同一の配列である。また、逆転写用プライマー５２の配列部分５５と逆転写用プライマー７２の配列部分５５も同一の配列である。逆転写用プライマー５２の配列部分５４と逆転写用プライマー７２の配列部分７４は、図５に示すプローブＡとプローブＢに相当し、同じＴｍ値を有する。
【００４０】
さらに、前項３．で説明したように、各プローブは標的配列に対してプライマーより早くハイブリダイズできるように設計されなければならない。すなわち、プローブ５７及びプローブ７７のＴｍ値はフォワード側プライマー６５あるいはリバース側プライマー６６のＴｍ値よりも５〜１５℃、好ましくは１０℃程度高くなるように設計される。このＴｍ値の調整には、例えば、プローブのＴｍ値（融解温度）を向上させる物質：Ｔｍ値エンハンサーを用いる。
【００４１】
５．３ 競合的ＰＣＲ
図６を用いて、競合的ＰＣＲ反応の概略を説明する。得られた第一鎖ｃＤＮＡ５６の一部と第一鎖ｃＤＮＡ７６の一部を反応チューブからとり、新しい反応チューブに等量混ぜ合わせたものをＰＣＲテンプレートとする。ＰＣＲプライマーとして、第一鎖ｃＤＮＡ５６及び第一鎖ｃＤＮＡ７６にハイブリダイズするフォワード側プライマー６５と、第一鎖ｃＤＮＡ５６及び第一鎖ｃＤＮＡ７６に導入されている配列部分５５と同一の配列を有するリバース側プライマー６６を用いる。
【００４２】
ＰＣＲ産物検出用のユニバーサルプローブとして第一鎖ｃＤＮＡ５６に導入されている配列部分５４と同一の配列を有するプローブ５７と、第一鎖ｃＤＮＡ７６に導入されている配列部分７４と同一の配列を有するプローブ７７を用いる。
【００４３】
プローブ５７は、図中Ｒ１で示される蛍光体５８と図中Ｑで示される消光体５９で標識されており、プローブ７７は、図中Ｒ２で示される蛍光体７８と図中Ｑ示される消光体７９で標識されている。消光体５９と７９は、それぞれ蛍光体５８と７８の蛍光を抑制する働きがあれば同一のものを用いてもよい。プローブ５７及びプローブ７７は、インタクトな状態では、蛍光エネルギートランスファー現象により蛍光体５８及び蛍光体７８の蛍光が抑制されている。
【００４４】
５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いてＰＣＲ増幅を行う。ＰＣＲの初期段階において、フォワード側プライマー６５が第一鎖ｃＤＮＡ５６にハイブリダイズして、伸長することにより第二鎖ｃＤＮＡ６０が合成される。また、第一鎖ｃＤＮＡ７６にハイブリダイズして、伸長することにより第二鎖ｃＤＮＡ８０が合成される。第二鎖ｃＤＮＡ６０は、リバース側プライマー６６に相補的な配列と、プローブ５７に相補的な配列を有しており、第二鎖ｃＤＮＡ８０はリバース側プライマー６６に相補的な配列と、プローブ７７に相補的な配列を有している。
【００４５】
ＰＣＲの進行に伴って第二鎖ｃＤＮＡ６０と第二鎖ｃＤＮＡ８０がそれぞれのテンプレートから増幅される。プローブ５７は第二鎖ｃＤＮＡ６０に、プローブ７７は第二鎖ｃＤＮＡ８０にそれぞれハイブリダイズする。第二鎖ｃＤＮＡ６０にハイブリダイズしたリバース側プライマー６６が伸長するとＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性により、第二鎖ｃＤＮＡ６０にハイブリダイズしているプローブ５７は、５’末端側から加水分解される。加水分解の結果、プローブ５７から蛍光体５８が遊離し、フリーな蛍光体６１が生じて蛍光が発光する。また、第二鎖ｃＤＮＡ８０にハイブリダイズしたリバース側プライマー６６が伸長するとＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性により、第二鎖ｃＤＮＡ８０にハイブリダイズしているプローブ７７は、５’末端側から加水分解される。加水分解の結果、プローブ７７から蛍光体７８が遊離し、フリーな蛍光体８１が生じて蛍光が発光する。
【００４６】
ＰＣＲによって生じるフリーな蛍光体６１及びフリーな蛍光体８１の量比は、ＰＣＲ実行前に反応チューブ内に存在するｃＤＮＡ５６とｃＤＮＡ７６の量比に依存するため、２つの蛍光体からの蛍光シグナル量を比較することでｃＤＮＡ５６とｃＤＮＡ７６の存在比を調べることができる。すなわち、複数の試料における同一遺伝子の発現量を簡便に比較することが可能である。
【００４７】
６．キット
上記のとおり、標的遺伝子にその配列とは無関係な第１の塩基配列と第２の塩基配列を導入することにより、どのような標的遺伝子に対してもユニバーサルに使用できるＴａｑＭａｎＴＭプローブ（ユニバーサルプローブ）を提供することが可能となる。別の標的遺伝子を検出する場合には、導入用（逆転写用）プライマーの標的遺伝子にハイブリダイズする部分の配列と、フォワード側プライマーの配列だけを変更すれば良い。さらに、前記プローブに加えて、リアルタイムＰＣＲ用のリバース側プライマーも、標的遺伝子の塩基配列とは無関係であるため、該標的遺伝子によらずユニバーサルに利用できる。
【００４８】
すなわち、本発明はこれらユニバーサルに利用できるプローブとプライマーを含む遺伝子発現解析用キットを提供する。キットは、１つの単一検体の解析用のものであってもよいし、複数検体の同時解析用のものであってもよい。該キットの必須構成要素である、ユニバーサルプローブとリバース側プライマーの特徴や構造は上記したとおりである。
【００４９】
本発明のキットは、必須構成要素である前記ユニバーサルプローブとプライマーのほか、遺伝子発現解析に必要な他の試薬等を含んでいてもよい。そのようなものとしては、例えば、融解温度調整剤（例えば、ベタイン、トリメチルアミンＮ−オキシド等）、酵素反応に好適な条件を与える緩衝液、合成反応生成物の検出のために必要な他の試薬類を挙げることができる。さらに、該キットは、１回の反応に必要な試薬を反応容器に分注した状態で供給するものであってもよい。
【００５０】
【実施例】
以下、本発明について実施例を用いてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【００５１】
〔実施例１〕ユニバーサルプローブを用いたＧＡＰＤＨの遺伝子発現解析
１．ユニバーサルプローブによるＧＡＰＤＨの発現解析
（１）試験方法
試料としてマウス肝臓から抽出したＲＮＡを用い、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）用の下記の逆転写用プライマーを用いて逆転写反応を行い、第一鎖ｃＤＮＡを作製した。なお、逆転写反応はインビトロジェン社のスーパースクリプトＩＩリバーストランスクリプターゼを用いて行った。
Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｐｒｉｍｅｒ：５’−ＴＡＣ ＧＡＣ ＴＣＡ ＣＴＣ ＴＡＣ ＧＣＣ ＣＡ ＣＣＣ ＴＴＣＴ ＣＡＣＴＧＴＴ ＣＴＣ ＴＣＡＴ ＧＧＡ ＴＧＣ ＡＧＧ ＧＡＴ ＧＡＴ ＧＴＴ Ｃ−３’（配列番号１）
逆転写反応は、２ ｐｍｏｌの逆転写用プライマーとマウス肝臓から抽出したトータルＲＮＡとスーパースクリプトＩＩリバーストランスクリプターゼを反応緩衝液に混ぜ合わせ、４２℃で５０分間保温することで行った。その後、反応液中に残存するＲＮＡを分解するために、リボヌクレアーゼＨを反応液に加えて３７℃で２０分間保温した。
【００５２】
ＰＣＲ産物の検出にはアプライドバイオシステムズ社のシーケンスディテクションシステム７９００を用いた。また、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ及び基質としてアプライドバイオシステムズ社のＴａｑＭａｎＴＭユニバーサルＰＣＲマスターミックスのキットを用いた。２０ μｌの反応溶液中に、先に合成した第一鎖ｃＤＮＡと、下記に示すフォワード側プライマーとリバース側プライマーをそれぞれ１５ ｐｍｏｌ、５’末端を蛍光体ＦＡＭ、３’末端を消光体ＮＦＱ及びＴｍ値エンハンサーＭＧＢで標識したプローブ５ ｐｍｏｌを混ぜ合わせ、９５℃に１０分間保温した後、９５℃ １５秒間、６０℃ １分間からなる温度サイクルを５０回繰り返す条件にてＰＣＲを行った。
Ｆｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒ： ５’−ＴＧＣ ＡＣＣ ＡＣＣ ＡＡＣ ＴＧＣ ＴＴＡ Ｇ−３’（配列番号２）
Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒ： ５’−ＴＡＣ ＧＡＣ ＴＣＡ ＣＴＣ ＴＡＣ ＧＣＣ ＧＡ−３’（配列番号３）
Ｐｒｏｂｅ： ５’−（ＦＡＭ）−ＣＣＣ ＴＴＣＴ ＣＡＣ ＴＧＴＴ ＣＴＣ ＴＣＡＴ−（ＮＦＱ）−（ＭＧＢ）−３’（配列番号４）
【００５３】
（２）結果
図３にＰＣＲの各サイクル毎に蛍光検出を行って得られた結果を示す。グラフの横軸はＰＣＲサイクル数、縦軸は蛍光強度（任意単位）をそれぞれ示している。グラフは種々の濃度の標的ＲＮＡを含む試料からの蛍光シグナルの変化を表している。正方形のドットが最も標的ＲＮＡの初期濃度が高く、以下ひし形、三角形と続き、丸のドットが最も標的ＲＮＡの初期濃度が低い。各ドットは１０倍希釈の系列を構成している。ＰＣＲ産物のリアルタイム検出では、ＰＣＲ産物由来の蛍光シグナル値がある閾値を越えたサイクルをＣＴサイクルと定義して、標的ＲＮＡの初期濃度を示す指標として用いる。図３から少なくとも１０８の濃度範囲で、標的ＲＮＡの初期濃度に応じて蛍光シグナル値の増加が検出され、結果としてＣＴサイクルが初期濃度と矛盾なく解析されていることが確認された。なお図３のグラフにおいて、プラスのドットは標的ＲＮＡを含まない試料からの蛍光シグナルの変化を示している。
【００５４】
２．Ｓｕｎｒｉｓｅ法との比較
（１）試験方法
次に、従来法であるＳｕｎｒｉｓｅプライマーを用いた発現解析法を本発明の方法と比較した。まず、１．と同様の方法で種々の濃度の標的ＲＮＡからＰＣＲを行い、蛍光シグナルの変化を計測した。次に、本発明で用いたＰＣＲのテンプレートと同じものを用い、配列番号２と同じ塩基配列を有するフォワード側プライマー、及び下記に示す５’末端を蛍光体ＦＡＭで標識し、２３塩基目のチミンをアミノ化して消光体（ＤＡＢＣＹＬ）を標識したリバース側Ｓｕｎｒｉｓｅプライマーをそれぞれ２０ ｐｍｏｌを用いてＰＣＲを行った。
Ｆｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒ： ５’−ＴＧＣ ＡＣＣ ＡＣＣ ＡＡＣ ＴＧＣ ＴＴＡ Ｇ−３’（配列番号２）
Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｓｕｎｒｉｓｅ Ｐｒｉｍｅｒ：５’−（ＦＡＭ）−ＡＧＣＧ ＡＴＧＣ ＡＣＣＣＴＣＡ ＧＣＡＴ ＣＧＣＴ＊ ＣＣＣ ＴＴＣＴ ＣＡＣ ＴＧＴＴ ＣＴＣ ＴＣＡＴ−３’（配列番号５）
上記（ＦＡＭ）は蛍光体ＦＡＭを示し、＊は消光体（ＤＡＢＣＹＬ）を示す。ＰＣＲ及び測定条件は１．と同様の条件で行った。
【００５５】
（２）結果
図４に、Ｓｕｎｒｉｓｅ法と本発明の方法によって得られる蛍光シグナル強度の変化を比較した結果を示す。図中、マウス肝臓由来のＧＡＰＤＨを本発明の方法で検出した場合の蛍光シグナルの変化は実線で、Ｓｕｎｒｉｓｅ法で検出した場合の蛍光シグナルの変化は破線で示されている。また横軸はＰＣＲサイクル数、縦軸は蛍光強度（任意単位）を示している。丸のドットの１００倍希釈が正方形のドット、さらに１００倍希釈したものがひし形のドットである。
【００５６】
希釈なし及び１００倍希釈の系列では、本発明の方法とＳｕｎｒｉｓｅ法のいずれも蛍光シグナル値が増加している。しかし、Ｓｕｎｒｉｓｅ法の場合は蛍光シグナル値が増加するＰＣＲサイクル数は本発明の方法に比べて１０サイクル以上遅く、蛍光シグナル値も小さい。また、１００２希釈の系列では、本発明の方法では蛍光シグナル値が増加しているのに対し、Ｓｕｎｒｉｓｅ法の場合は蛍光シグナル値があまり変化していない。以上の結果から、本発明の方法は、Ｓｕｎｒｉｓｅ法に比較して検出感度が高いことが確認された。
【００５７】
〔実施例２〕 複数検体の同時測定
次に、本発明の方法を用いて複数の試料由来の標的遺伝子を一つの反応チューブでＰＣＲ増幅し、検出した実施例を示す。
（１）試験方法
マウス肝臓より抽出したＲＮＡ及びマウス腎臓より抽出したＲＮＡをテンプレートとして、実施例１と同様にして逆転写反応を行い、それぞれＧＡＰＤＨの第一鎖ｃＤＮＡを作製した。マウス肝臓由来ＲＮＡの逆転写用プライマーは実施例１と同様のものを、マウス腎臓由来ＲＮＡの逆転写用プライマーは下記に示すもの（配列番号６）を用いた。
【００５８】
なお、マウス肝臓由来ＲＮＡとマウス腎臓由来ＲＮＡの各逆転写用プライマーは、それぞれ図６に従って設計されている。すなわち、標的ＲＮＡにハイブリダイズする配列部分５３と、ＰＣＲ検出時に用いるリバース側プライマー６６と同一の配列からなる配列部分５５は共通であるが、その間に位置するＰＣＲ検出時に用いるプローブと同一の配列からなる配列部分５４と配列部分７４（それぞれ、下線部分）は異なっている。
Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｐｒｉｍｅｒ（Ｌｉｖｅｒ）：５’−ＴＡＣ ＧＡＣ ＴＣＡ ＣＴＣ ＴＡＣ ＧＣＣ ＣＡ ＣＣＣＴＴＣＴ ＣＡＣ ＴＧＴＴ ＣＴＣ ＴＣＡＴ ＧＧＡ ＴＧＣ ＡＧＧ ＧＡＴ ＧＡＴ ＧＴＴ Ｃ−３’（配列番号１）
Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｐｒｉｍｅｒ（Ｋｉｄｎｙ）：５’−ＴＡＣ ＧＡＣ ＴＣＡ ＣＴＣ ＴＡＣ ＧＣＣ ＣＡ ＣＡＣＴＣＡＴ ＣＴＣ ＴＴＣＴ ＣＣＣ ＴＧＴＴ ＧＧＡ ＴＧＣ ＡＧＧ ＧＡＴ ＧＡＴ ＧＴＴ Ｃ−３’（配列番号６）
【００５９】
ＰＣＲ反応は、得られた各試料由来のｃＤＮＡの一部を反応チューブからとり、新しい反応チューブに等量混ぜ合わせたものをテンプレートとして、実施例１で用いたプライマー（配列番号２及び３）及び２種のプローブを用いて行った。
【００６０】
なお、肝臓由来ＧＡＰＤＨ検出用プローブ（プローブＡ）は実施例１で用いたプローブと同じもの（配列番号４）を、腎臓由来ＧＡＰＤＨ検出用プローブ（プローブＢ）は下記に示すもの（配列番号７）を用いた。
Ｐｒｏｂｅ Ａ：５’−（ＦＡＭ）−ＣＣＣ ＴＴＣＴ ＣＡＣ ＴＧＴＴ ＣＴＣ ＴＣＡＴ−（ＮＦＱ）−（ＭＧＢ）−３’（配列番号４）
Ｐｒｏｂｅ Ｂ：５’−（ＶＩＣ）−ＣＡＣ ＴＣＡＴ ＣＴＣ ＴＴＣＴ ＣＣＣ ＴＧＴＴ−（ＮＦＱ）−（ＭＧＢ）−３’（配列番号７）
各プローブは、図５及び図６に従って、実質的に同じ融解温度を有するように設計されている。プローブＡは５’末端を蛍光体ＦＡＭで、プローブＢは５’末端を蛍光体ＶＩＣで標識され、共に３’末端は消光体で標識されている。また、各消光体には、ＤＮＡのマイナーグルーブに結合するＴｍエンハンサーＭＧＢが結合されている。ＰＣＲ及び測定条件は１．と同様の条件で行った。
【００６１】
（２）結果
図７に、マウス肝臓由来の標的ＲＮＡを種々の濃度でテンプレートとして用い、２種のプローブで検出を行った実験の結果を示す。グラフの横軸はＰＣＲサイクル数を示し、縦軸は蛍光体の相対蛍光強度（任意単位）を示す。図７（ａ）は、マウス肝臓由来の標的ＲＮＡのＰＣＲ産物をプローブＡで、図７（ｂ）はプローブＢで検出した際の蛍光シグナル量の変化を示したグラフである。図７（ｂ）から明らかなように、試料はマウス腎臓由来の標的ＲＮＡを全く含んでいないため、プローブＢ由来の蛍光シグナルはＰＣＲサイクルにおいてほとんど増幅していない。
【００６２】
図８に、図７とは逆に、マウス腎臓由来の標的ＲＮＡを種々の濃度でテンプレートとして用い、２種のプローブで検出を行った実験の結果を示す。グラフの横軸はＰＣＲサイクル数を示し、縦軸は蛍光体の相対蛍光強度（任意単位）を示す。図８（ａ）はマウス腎臓由来の標的ＲＮＡのＰＣＲ産物をプローブＡで、図８（ｂ）はプローブＢで検出した際の蛍光シグナル量の変化を示したグラフである。図８（ａ）から明らかなように、試料はマウス肝臓由来の標的ＲＮＡを含んでいないため、プローブＡ由来の蛍光シグナルはＰＣＲサイクルにおいてほとんど増幅していない。以上の結果からプローブＡはマウス肝臓由来の標的ＲＮＡにのみ反応し、プローブＢはマウス腎臓由来の標的ＲＮＡにのみ反応することが確認された。
【００６３】
図９に、マウス肝臓由来の標的ＲＮＡとマウス腎臓由来の標的ＲＮＡをいろいろな濃度比で混ぜ合わせた溶液をテンプレートとして、同様にＰＣＲ増幅した結果を示す。プローブ由来の蛍光シグナルが閾値以上になったＰＣＲサイクルをＣＴ（スレッシュホールドサイクル）とすると、ＣＴはテンプレート量を反映した値となる（Ｄｉｅｔｅｒ Ｋ．， ｅｔ ａｌ．， Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ， １９９９ ｖｏｌ．２０， ｐ２９１−２９９ 参照）。プローブＡ由来のＣＴ値をＣＴＡとし、プローブＢ由来のＣＴ値をＣＴＢとする。ＣＴＡとＣＴＢの差はそれぞれのテンプレート量の相対量を示す。図９のグラフは、蛍光シグナル解析の結果得られたＣＴＡとＣＴＢの差をプロットしたものである。テンプレートの量比（テンプレートＡの量／テンプレートＢの量）が０．０１から１００の範囲では、ＣＴＡ−ＣＴＢの値はほぼ比例関係を示しているが、テンプレート量比が０．０１以下あるいは１００以上の場合は、グラフは近似直線から外れる。この結果から、テンプレート量比が１００倍以内あるいは１００分の１以内の場合には、ＣＴＡとＣＴＢの差から直接２種類のテンプレートの存在比を比較できることが確認された。
【００６４】
【発明の効果】
本発明によれば、遺伝子発現解析用のユニバーサルなプローブが提供される。該プローブは、標的遺伝子の塩基配列に応じてその都度高価なプローブを設計する必要がない。また、どのような標的遺伝子に対しても実質的に同じ条件でリアルタイムＰＣＲ検出を行うことができ、厳密な定量分析が可能である。さらに、ＰＣＲを単一温度サイクルで行うため、副産物生成が低減でき、高精度の定量分析を行うことができる。さらにまた、本発明のユニバーサルプローブ２種類を用いて、１つの反応容器で、競合ＰＣＲを行うことにより、複数検体を同時にリアルタイム検出することが可能になる。これにより、スタンダードを作成することなく、遺伝子発現量の相対比較が可能になる。
【００６５】
【配列表】
【００６６】
【配列表フリーテキスト】
配列番号１−人工配列の説明：マウス遺伝子ＧＡＰＤＨからｃＤＮＡを合成するための逆転写反応用プライマー
配列番号２−人工配列の説明：マウス遺伝子ＧＡＰＤＨを増幅するためのフォワードプライマー
配列番号３−人工配列の説明：マウス遺伝子ＧＡＰＤＨを増幅するためのリバースプライマー
配列番号４−人工配列の説明：マウス遺伝子ＧＡＰＤＨをリアルタイムＰＣＲによって検出するプローブ
配列番号５−人工配列の説明：マウス遺伝子ＧＡＰＤＨをリアルタイムＰＣＲによって検出するための蛍光標識されたリバースプライマー
配列番号６−人工配列の説明：マウス遺伝子ＧＡＰＤＨからｃＤＮＡを合成するための逆転写反応用プライマー
配列番号７−人工配列の説明：マウス遺伝子ＧＡＰＤＨをリアルタイムＰＣＲによって検出するプローブ
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明のユニバーサルプローブを用いたリアルタイムＰＣＲ検出の手順を示した図である。
【図２】図２は、本発明のユニバーサルプローブと、ＰＣＲリバースプライマーと逆転写反応用プライマーの配列の関係を示した図である。
【図３】図３は、本発明のユニバーサルプローブを用いたリアルタイムＰＣＲの検出結果であり、ＰＣＲサイクルに対する蛍光シグナルの変化を示したグラフである。図中、各ドットは１０倍希釈の系列を構成し、正方形のドットが最も標的ＲＮＡの初期濃度が高く、以下ひし形、三角形と続き、丸のドットが最も標的ＲＮＡの初期濃度が低い。
【図４】図４は、本発明のユニバーサルプローブを用いたリアルタイムＰＣＲの検出結果と、サンライズ法によるリアルタイムＰＣＲ結果を比較したグラフである。図中、丸のドットの１００倍希釈が正方形のドット、さらに１００倍希釈したものがひし形のドットである。
【図５】図５は、２種類のユニバーサルプローブの配列を模式的に示した図である。
【図６】図６は、２種類のユニバーサルプローブを用いたリアルタイムＰＣＲ検出の手順を示した図である。
【図７】図７は、マウス肝臓由来の標的ＲＮＡをテンプレートとした場合の、２種類のユニバーサルプローブを用いたリアルタイムＰＣＲの検出結果（図７（ａ）：プローブＡ、図７（ｂ）：プローブＢ）を示したグラフである。
【図８】図８は、マウス腎臓由来の標的ＲＮＡをテンプレートとした場合の、２種類のユニバーサルプローブを用いたリアルタイムＰＣＲの検出結果（図８（ａ）：プローブＡ、図８（ｂ）：プローブＢ）を示したグラフである。による検出結果を示す。
【図９】図９は、２種類のユニバーサルプローブを用いたリアルタイムＰＣＲの検出結果を示すグラフである。
【符号の説明】
１、５１、７１…試料ＲＮＡ
２、５２、７２…逆転写用プライマー
３、５３…標的遺伝子にハイブリダイズする配列部分
４、５４、７４…標的遺伝子に非特異的な第１の配列部分
５、５５…標的遺伝子に非特異的な第２の配列部分
６、５６、７６…第一鎖ｃＤＮＡ
７、６０、８０…第二鎖ｃＤＮＡ
１０、６５…フォワード側プライマー
１１、６６…リバース側プライマー
１２、５７、７７…プローブ
１３、５８、７８…蛍光体
１４、３２、５９、７９…消光体
１５、６１、８１…フリーな蛍光体
１６…連結部となる配列部分
１７…逆転写用プライマー
１８、３３…Ｔｍ値エンハンサー
２０、２１、９１、９２、９３、９４…ＰＣＲサイクルに対する蛍光強度の変化を示したグラフ
３０…プローブＡ
３１…蛍光体Ｒ１
３４、３５、３６、３７、３８、３９…モジュール配列
４０…プローブＢ
４１…蛍光体Ｒ２
１００…テンプレート量比に対するＣＴの差を示したグラフ
【発明の属する技術分野】
本発明は蛍光エネルギートランスファーを利用した遺伝子発現解析用プローブキットに関する。より詳細には、標的遺伝子にその塩基配列に非依存的な配列を導入することにより、当該標的遺伝子の配列に関わらずユニバーサルに使用できる遺伝子発現解析用プローブキットとそれを利用した遺伝子発現解析法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、ＤＮＡやＲＮＡの定量には比較ＲＴ−ＰＣＲ法が用いられていた。比較ＲＴ−ＰＣＲ法では、まず標的遺伝子を含むサンプルをさまざまな濃度に希釈してスタンダードとなるサンプルを作製し、このスタンダードサンプルを増幅してＰＣＲ産物量を測定する。次に、ＰＣＲ産物量をサイクル数に対してプロットした検量線を作製し、得られた検量線から未知濃度の標的遺伝子量を求める。しかし、比較ＲＴ−ＰＣＲ法で検量線を作成するためには、全てのスタンダードサンプルが指数関数的に増幅している領域を求める必要があり、煩雑であるという欠点がある。また、ＰＣＲ産物量の測定には、蛍光検出と電気泳動とを組み合わせることが多く、電気泳動で増幅産物のサイズを確認してから、蛍光強度を測定して増幅産物の量を調べなければならないのが一般的である。
【０００３】
近年、ＰＣＲ産物量を電気泳動することなく、リアルタイムに蛍光検出できる複数の方法が報告された（例えば、特許文献１及び２、非特許文献１〜３参照）。これらの方法では、蛍光エネルギートランスファーを利用して、ＰＣＲ産物にハイブリダイズすることで蛍光が生じるよう工夫されたプローブ（例えば、ＴａｑＭａｎＴＭプローブＲ やモレキュラービーコン）が、リアルタイム検出のために用いられる。さらに検出に際しては、各サイクルごとにＰＣＲ産物量を測定できるため、ＰＣＲ産物が指数関数的に増幅している領域とプラトーに達している領域を簡単に求めることができる。それゆえ、比較ＲＴ−ＰＣＲ法における手間が改善され、効率的な発現遺伝子の比較法として急速に広まってきた。
【０００４】
しかし、蛍光エネルギートランスファーを利用したＰＣＲ産物検出法では、標的遺伝子を検出するためのプローブやプライマーを各標的遺伝子ごとに個別に設計しなければならない。しかも、これらのプローブは、通常のプライマーとは設計指針が異なること、また蛍光エネルギートランスファーを利用しているため高価であるという問題点がある。
【０００５】
これに対し、Ｗｈｉｔｃｏｍｂｅらは、標的遺伝子の配列によらずユニバーサルに使用できるＴａｑＭａｎＴＭプローブを用いたＰＣＲ産物の蛍光アッセイを報告している（例えば、非特許文献４参照）。このアッセイはゲノムＤＮＡを対象とし、１塩基多型のタイピングを目的としている。この方法では、鋳型非特異的なプローブ配列及びＴａｇ配列をゲノムＤＮＡに導入することにより、鋳型非特異的なＴａｑＭａｎＴＭプローブを用いたアッセイを可能にしている。しかしながら、この方法では導入用のプライマーペアに加えて、合成されたＤＮＡのＴａｇ配列にハイブリダイズし、該ＤＮＡを増幅するための別なプライマーペアの２種類のプライマーペアが用いられる。そのため、２とおりの温度サイクルを必要とし、しかも反応副産物の生成を回避することができない。また、１つの反応容器でリアルタイム検出を行う場合、２種のプローブの融解温度の違いから厳密な反応性をそろえることができないという問題点がある。これらの問題から、このアッセイは遺伝子発現の定量的分析には不都合である。
【０００６】
【特許文献１】
米国特許 第６，３９５，５１８号明細書
【特許文献２】
国際公開 第９７／４２３４５号パンフレット
【非特許文献１】
Ｎａｚａｒｅｎｋｏ Ａ．， ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｄ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， １９９７， ｖｏｌ．２５， Ｎｏ．１２， ｐ２５１６−２５２１
【非特許文献２】
Ｍｙａｋｉｓｈｅｖ Ｍ．Ｖ．， ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ２００１， Ｖｏｌ．１１， ｐ１６３−１６９
【非特許文献３】
Ｐａｍｅｌａ Ｍ．， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ＵＳＡ， Ａｕｇｕｓｔ １９９１， Ｖｏｌ．８８， ｐ７２７６−７２８０
【非特許文献４】
Ｗｈｉｔｃｏｍｂｅ Ｄ．， ｅｔ ａｌ．， Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， １９９８， Ｖｏｌ．４４， Ｎｏ．５， ｐ９１８−９２３
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、上記従来技術の問題点を解決し、標的遺伝子の配列に関わらずユニバーサルに使用できる新規な遺伝子発現解析用キット、及びこれを利用した簡便な遺伝子発現解析法を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決するために、本発明は、以下の遺伝子発現解析法を提供する。標的遺伝子の塩基配列に対して非特異的な配列を有する第１の塩基配列及び第２の塩基配列について、
前記第１の塩基配列よりも５’末端側に前記第２の塩基配列を結合させ、共に前記標的遺伝子に導入させた分析対象遺伝子に対し、
前記標的遺伝子に特異的にハイブリダイズする塩基配列を含むプライマー、
前記第２の塩基配列と同一な塩基配列を含むプライマー、
前記第１の塩基配列と同一又は相補的な塩基配列を含み、一方の末端を蛍光体で修飾され、もう一方の末端を消光体で修飾されたプローブ、及び
５’→３’エキソヌクレア−ゼ活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いて核酸増幅反応を行い、
前記核酸増幅反応の際に前記耐熱性ＤＮＡポリメラーゼにより前記第１の塩基配列に結合した前記プローブを分解し、
遊離した前記蛍光体の発する蛍光を検出することにより、前記核酸増幅反応の産物量を計測することを特徴とする遺伝子発現解析法。
【０００９】
ここで、標的遺伝子への第１の塩基配列と第２の塩基配列の導入は、３つの配列部分から構成される導入用プライマーを使用することによって行われる。該導入用プライマーは、前記標的遺伝子に特異的にハイブリダイズする配列を含む第３の塩基配列より５’末端側に前記第１の塩基配列を含み、かつ前記第１の塩基配列より５’末端側に前記第２の塩基配列を含む。ここで、第１の部分はＰＣＲ検出時に用いるプローブと同一の配列又は相補的な配列であり、第２の部分はＰＣＲ検出時に用いるリバース側プライマーと同一の配列である。第１、第２、第３の部分は連続していても良いし、それぞれの部分の間に連結部があっても良い。第３の配列は標的遺伝子の配列によって変化するが、第１及び第２の配列は標的遺伝子の配列に依存せず任意に設計することができる。
【００１０】
本発明の１つの実施態様として、ｍＲＮＡを対象とした発現解析の場合、まず上記３つの配列部分を有する導入用プライマーを逆転写用プライマーとして用いて、標的ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）からｃＤＮＡ第一鎖を合成する。このｃＤＮＡは、標的遺伝子に第１の塩基配列と第２の塩基配列が導入された分析対象遺伝子として機能する。次に、得られた分析対象遺伝子（ｃＤＮＡ）をテンプレートとして、導入用プライマーの第３の部分がハイブリダイズする位置よりも５’末端側で標的遺伝子とハイブリダイズするフォワード側プライマーと、第２の塩基配列と同一の配列からなるリバース側プライマーと、第１の塩基配列と同一の配列又は相補的な配列からなるＴａｑＭａｎＴＭプローブとを用いてリアルタイムＰＣＲ検出を行う。
【００１１】
なお、ＴａｑＭａｎＴＭプローブとは、プローブの５’末端が蛍光体で標識され、３’末端が該蛍光体の発する蛍光をエネルギートランスファーにより消光する物質（消光体）で標識されたＤＮＡプローブである。ＴａｑＭａｎＴＭプローブは、通常の状態では、５’末端と３’末端がそれぞれ蛍光体と消光体で標識されているため蛍光を発しない。しかし、ＰＣＲ実行時、前記プローブが標的配列にハイブリダイズし、逆側プライマーからの伸長反応がおこると、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性によりプローブが分解され、フリーな蛍光体が生じて蛍光を発する。
【００１２】
本発明の遺伝子発現解析法では、逆転写反応後の核酸増幅反応は、１組のプライマーを用いて、単一温度サイクルで行われる。ここで、「サイクル」とは、一般的なＰＣＲにおける１回の伸長鎖合成に至る過程をいい、具体的には、２本鎖核酸を解離させるステップ、プライマー及びプローブを分析対象遺伝子に結合させるステップ、そして伸長反応をさせるステップの３つのステップからなる。そのため、操作が簡便で、反応副産物の生成を心配する必要がない。
【００１３】
本発明の遺伝子発現解析法においては、２種以上のプローブを用いることにより、１つの標的遺伝子について、１つの容器を用いて、複数の検体由来の試料を同時に分析することができる。このような複数検体の同時解析においては、各プローブの反応性をそろえ、正確な発現解析を行うため、前記２種以上のプローブの融解温度は実質的に同じにすることが好ましい。
【００１４】
本発明はまた、遺伝子発現解析のためのキットを提供する。該キットは、標的遺伝子の塩基配列に対してそれぞれ非特異的な配列を有する、前記標的遺伝子に導入される第１の塩基配列、及び第１の塩基配列よりも５’末端側に位置する第２の塩基配列について、
前記第１の塩基配列と同一又は相補的な配列を含み、一方の末端を蛍光体で修飾され、もう一方の末端を消光体で修飾されたプローブ、及び
前記第２の塩基配列と同一の配列を含み、前記第１の塩基配列より５’末端側に結合するプライマーを含む。
【００１５】
複数検体の同時検出を目的とする場合、前記キットは２種以上のプローブを含み、これらプローブの融解温度は実質的に同じであることが望ましい。実質的に同じ融解温度を有する２種以上のプローブとしては、例えば、各々３乃至４塩基長の複数のモジュール配列からなり、各モジュール配列の両末端の塩基は同一であり、かつ各プローブがこの両末端の塩基が同一であるモジュール配列同士の順序を入れ替えて構成されたプローブを挙げることができる。
【００１６】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を図面に基づいて詳細に説明する。
１． 導入用プライマーの設計
図１は本発明の遺伝子発現解析法を模式的に示した図である。１は試料である標的ＲＮＡであり、２は導入用（逆転写用）プライマーである。導入用プライマー２は、標的ＲＮＡにハイブリダイズする配列部分３と、配列部分３より５’末端側に位置し、ＰＣＲ検出時に用いるプローブと同一の配列からなる配列部分４と、配列部分４より５’末端側に位置し、ＰＣＲ検出時に用いるリバース側プライマー１１と同一の配列からなる配列部分５から構成されている。
【００１７】
前記配列部分３、４、５は連続していても良いし、それぞれの部分の間に連結部があっても良い。配列部分３の長さは、特に限定されないが、好ましくは１８〜２５塩基長程度である。配列部分４の長さも、特に限定されないが、好ましくは１８〜３０塩基長程度である。配列部分５の長さも、特に限定されないが、好ましくは１８〜２５塩基長程度である。配列部分３は標的遺伝子の配列によって変化するが、配列部分４及び５は標的遺伝子の配列に依存せず任意に設計することができる。
【００１８】
２． 分析対象遺伝子の合成（ｃＤＮＡへの逆転写）
前記導入用プライマーを逆転写用プライマーとして用いて、標的遺伝子のｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成する。逆転写反応は、当該分野で公知の方法に従い、鋳型ＲＮＡを含む反応液に、前記プライマー、逆転写酵素、基質を加えて、３５〜４５℃で３０〜６０分程度インキュベートすればよい。この逆転写反応により、標的遺伝子に該遺伝子の配列に依存しない、第１の塩基配列４及び第２の塩基配列５が導入されたｃＤＮＡが分析対象遺伝子として合成される。
【００１９】
３． ＰＣＲプライマーとユニバーサルプローブの設計
次に、前項で合成した分析対象遺伝子（ｃＤＮＡ）に対して、該遺伝子を増幅するためのＰＣＲプライマーと、該遺伝子を検出するためのユニバーサルなプローブの設計について説明する。
【００２０】
図１に示すように、前記ＰＣＲプライマーとしては、分析対象遺伝子にハイブリダイズするフォワード側プライマー１０と、分析対象遺伝子に導入されている配列部分５と同一の配列を有するリバース側プライマー１１を用いる。
【００２１】
ＰＣＲ産物検出用プローブとしては、分析対象遺伝子に導入されている配列部分４と同一の配列を有するプローブ１２を用いる。プローブ１２は、図中にＲで記す蛍光体１３と図中にＱで記す消光体１４で標識されている。プローブ１２はインタクトな状態では、蛍光エネルギートランスファーにより蛍光体１３の蛍光は抑制されているが、ＰＣＲ反応の進行に伴い、該蛍光体を遊離させて発光する。なお、用いられる蛍光体としては、例えば、クマリン、フルオレセイン、テトラクロロフルオレセイン、ヘキサクロロフルオレセイン、ルシフェールイエロー（Ｌｕｃｉｆｅｒ ｙｅｌｌｏｗ）、ローダミン、ＢＯＤＩＰＹ、テトラメチルローダミン、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ７、イオシン、テキサスレッド、ＲＯＸ、ＦＡＭ、及びＶＩＣ等が挙げられる。また、消光体としては、４−（４’−ジメチルアミノフェニルアザ）−安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）、ＤＡＢＭＩ及びメチルレッド等を挙げることができる。蛍光体のうち、ある種の他の蛍光体に接触するとその蛍光を消光する機能を有するものは、消光体としても使用できる。
【００２２】
また、プローブ１２はフォワードプライマー１０あるいはリバース側プライマー１１よりも標的配列に対してより早くハイブリダイズできるようにＴｍ値が５〜１５℃、好ましくは１０℃程度高くなるように設計することが必要である。このＴｍ値の調整には、例えば、プローブのＴｍ値（融解温度）を向上させる物質；Ｔｍエンハンサーを用いる。該Ｔｍエンハンサーとしては、例えばＤＮＡ結合物質である、ＭＧＢ（マイナーグルーブバインダー）等を用いることができる。また、プローブ１２は耐熱性ＤＮＡポリメラーゼによって伸長しないように、その３’末端をリン酸化しておくことが必要である。
【００２３】
図２を用いて、逆転写用プライマー２、リバース側プライマー１１、プローブ１２の配列の関係についてさらに詳しく説明する。なお、図中、プローブ及びプライマーは左に５’末端、右に３’末端が位置するように記載されている。
【００２４】
図２（ａ）に示すように、逆転写用プライマー２は標的ＲＮＡにハイブリダイズする配列部分３と、プローブ１２と同一の配列からなる配列部分４と、リバース側プライマー１１と同一の配列からなる配列部分５から構成されている。３つの配列部分のうち、配列部分５が最も５’末端側に位置し、配列部分５よりも３’末端側に配列部分４が位置し、配列部分４よりも３’末端側に配列部分３が位置している。プローブ１２の５’末端は蛍光体１３で標識され、３’末端は消光体１４で標識されている。消光体１４にはＴｍ値エンハンサー１８が結合している。
【００２５】
また、図２（ｂ）に示すように、逆転写用プライマー１７が標的ＲＮＡにハイブリダイズする配列部分３と、プローブ１２と同一の配列からなる配列部分４と、リバース側プライマー１１と同一の配列からなる配列部分５の他に、各配列部分の間に連結部となる配列部分１６があっても良い。当該連結部の長さは特に限定されないが、通常１〜５塩基長程度であることが好ましい。
【００２６】
プローブ１２が蛍光を発するためには、リバース側プライマー１１とプローブ１２がＤＮＡ鎖にハイブリダイズした際、ＤＮＡポリメラーゼによってリバース側プライマー１１が伸長するとプローブ１２が加水分解するような位置関係にあることが必要である。リバース側プライマー１１と同一の配列からなる配列部分５よりも３’側にプローブ１２と同一の配列からなる配列部分４が位置していればよく、配列部分５の３’末端と配列部分４の５’末端が図２（ａ）に示すように接していても、図２（ｂ）に示すようにその他の塩基配列が間に入っていても良い。
【００２７】
プローブ１２の配列は標的ＲＮＡの配列と無関係に設計することができる。別の標的ＲＮＡを測定する場合でも逆転写用プライマー２の配列部分３と、フォワード側プライマー１０の配列を設計しなおすだけでよく、プローブ１２はユニバーサルなプローブ（ユニバーサルプローブ）として使用可能である。またリバース側プライマー１１も共通のプライマーとして使用することができる。
【００２８】
４． ＰＣＲ反応と発光
ＰＣＲ反応は、当該分野で公知の方法に従い、反応チューブに分析対象遺伝子（ｃＤＮＡ）、フォワード側プライマー、リバース側プライマー、プローブを入れ、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いて行われる。
【００２９】
図１に基づいてＰＣＲ反応と発光のプロセスを説明する。前記ＰＣＲ反応の初期段階において、フォワード側プライマー１０が第一鎖ｃＤＮＡ６にハイブリダイズして、伸長することにより第二鎖ｃＤＮＡ７が合成される。第二鎖ｃＤＮＡ７は、リバース側プライマー１１に相補的な配列と、プローブ１２に相補的な配列を有している。プローブ１２は、消光体１４にＴｍ値エンハンサー（ＤＮＡ結合性物質）を結合することでＴｍ値が向上し、プライマーよりも早く標的配列にハイブリダイズできる。したがって、第二鎖ｃＤＮＡ７に対しては、優先的にプローブ１２がハイブリダイズする。
【００３０】
さらに、フォワード側プライマー１０が第一鎖ｃＤＮＡ６に、リバース側プライマー１１が第二鎖ｃＤＮＡ７に対してそれぞれハイブリダイズして、伸長する。リバース側プライマー１１が伸長するとＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性により、第二鎖ｃＤＮＡ７にハイブリダイズしているプローブ１２は、５’末端側から加水分解される。加水分解の結果、プローブ１２から蛍光体１３が遊離し、フリーの蛍光体１５が生じて蛍光を発する。
【００３１】
図１にはプローブ１２が逆転写用プライマー２の配列部分４と同一の配列の場合を示したが、プローブ１２が、配列部分４と相補的な配列の場合も同様の検出が可能である。この場合には、プローブ１２は第一鎖ｃＤＮＡ６にハイブリダイズし、フォワード側プライマー１０の伸長によって加水分解を受ける。
【００３２】
上記のとおり、プローブ１２はＰＣＲ進行中に生じる第一鎖ｃＤＮＡ６もしくは第二鎖ｃＤＮＡ７にハイブリダイズし、フォワード側プライマー１０もしくはリバース側プライマー１１の伸長によって加水分解を受けて蛍光を発する。従って、ＰＣＲ増幅されるｃＤＮＡの量に応じて蛍光の発光量は増加する。つまり、試料中に含まれる標的ＲＮＡの量を測定することができる。なお、この際、［非特許文献４］に示した例と異なり、ＰＣＲが単一温度サイクルであるため、副産物生成を低減化させることができる。これにより、標的ＲＮＡの定量的な分析の精度を高めることができる。
【００３３】
５． 複数検体の同時解析
次に、２種以上のユニバーサルプローブを用いて、１つの標的遺伝子について、１つの容器を用いて、複数の検体由来の試料を同時に解析する（複数検体の同時解析）方法について説明する。
【００３４】
５．１ ２種以上のユニバーサルプローブの設計
図５は、複数検体を同時解析する場合に用いる２種のユニバーサルプローブ：プローブＡ（図５の３０）とプローブＢ（図５の４０）の構造を模式的に示したものである。
【００３５】
プローブＡの５’末端は図中Ｒ１で示される蛍光体３１で標識され、３’末端は、Ｒ１由来の蛍光を蛍光エネルギートランスファーによって消光する消光体３２で標識されている。プローブＢもプローブＡと同様に５’末端が図中Ｒ２で示される蛍光体４１で標識され、３’末端が蛍光を消光するための消光体３２で標識されている。必要に応じて、それぞれのプローブの消光体３２にはＤＮＡのマイナーグルーブ（副溝）に結合するＴｍ値エンハンサー３３を結合してもよい。
【００３６】
プローブＢの５’末端に標識されているＲ２は、Ｒ１とは異なる蛍光波長で発光する蛍光体を選択することが必要である。これにより、Ｒ１とＲ２との蛍光波長の違いから、プローブＡ由来の蛍光かプローブＢ由来の蛍光かを識別することができる。
【００３７】
さらに、プローブＡとプローブＢは、同じ反応特性でそれぞれの標的遺伝子にハイブリダイズするように設計することが必要である。図５に示すよう、プローブＡ及びプローブＢの配列を、３塩基乃至４塩基のモジュール配列３４〜３９から構成されるものとする。プローブを構成するモジュール配列の数は、特に限定されないが、一般的には５〜８程度であることが望ましい。前記各モジュール配列の両末端の塩基は同じ塩基種で構成される。また、プローブＢの配列は、プローブＡの配列と同じ両末端の塩基を有するモジュール同士の順番を入れ替えて構成されている。両末端の塩基種が同じモジュール同士の順番を入れ替えているため、モジュール同士の連結部分の塩基配列はプローブＡとプローブＢで同じである。また、プローブ配列を構成するモジュールはプローブＡとプローブＢで同じである。これにより、プローブＡとプローブＢの熱力学的性質が等価になり、それぞれのＴｍ値はｎｅａｒｅｓｔ ｎｅｉｇｈｂｏｒ法で計算すると同一の値となる。すなわち、プローブＡとプローブＢは全体の配列は異なるが、実質的に同じＴｍ値を有し、同一反応チューブで、同時に反応させても、それぞれの相補的な配列に対して同じ反応特性でハイブリダイズすることが可能となる。よって、定量分析に用いる場合に厳密な分析が可能となる。以上、２種類のプローブの設計について説明したが、３種以上の場合も同様にして設計することができる。
【００３８】
５．２ 分析対象遺伝子の合成（ｃＤＮＡへの逆転写）
図６に、プローブＡ及びプローブＢを用いて２種類の試料（試料▲１▼及び▲２▼）由来の標的遺伝子を一つの反応チューブでＰＣＲ増幅し、各試料由来の遺伝子発現を解析する方法の概略を示す。まず、試料▲１▼から抽出したＲＮＡからｃＤＮＡを調製する。５１は試料▲１▼から抽出したＲＮＡであり、５２は逆転写用プライマーである。逆転写用プライマー５２は、標的ＲＮＡにハイブリダイズする配列部分５３と、配列部分５３より５’末端側に位置し、ＰＣＲ検出時に用いるプローブと同一の配列からなる配列部分５４と、配列部分５４より５’末端側に位置し、ＰＣＲ検出時に用いるリバース側プライマー６６と同一の配列からなる配列部分５５から構成されている。このプライマーを用いて、前項４．と同様に逆転写反応を行い、配列部分５４と配列部分５５が導入された第一鎖ｃＤＮＡ５６を得る。
【００３９】
第一鎖ｃＤＮＡ５６を調製した反応チューブとは別のチューブにて、試料▲２▼から抽出したＲＮＡからｃＤＮＡを合成する。７１は試料▲２▼から抽出したＲＮＡであり、７２は逆転写用プライマーである。逆転写用プライマー７２は、標的ＲＮＡにハイブリダイズする配列部分５３と、配列部分５３より５’末端側に位置し、ＰＣＲ検出時に用いるプローブと同一の配列からなる配列部分７４と、配列部分７４より５’末端側に位置し、ＰＣＲ検出時に用いるリバース側プライマー６６と同一の配列からなる配列部分５５から構成されている。試料▲２▼についても、同様に逆転写反応を行い、配列部分７４と配列部分５５が導入された第一鎖ｃＤＮＡ７６を得る。なお、逆転写用プライマー５２の配列部分５３と逆転写用プライマー７２の配列部分５３は、どちらも同じ標的ＲＮＡにハイブリダイズするため、同一の配列である。また、逆転写用プライマー５２の配列部分５５と逆転写用プライマー７２の配列部分５５も同一の配列である。逆転写用プライマー５２の配列部分５４と逆転写用プライマー７２の配列部分７４は、図５に示すプローブＡとプローブＢに相当し、同じＴｍ値を有する。
【００４０】
さらに、前項３．で説明したように、各プローブは標的配列に対してプライマーより早くハイブリダイズできるように設計されなければならない。すなわち、プローブ５７及びプローブ７７のＴｍ値はフォワード側プライマー６５あるいはリバース側プライマー６６のＴｍ値よりも５〜１５℃、好ましくは１０℃程度高くなるように設計される。このＴｍ値の調整には、例えば、プローブのＴｍ値（融解温度）を向上させる物質：Ｔｍ値エンハンサーを用いる。
【００４１】
５．３ 競合的ＰＣＲ
図６を用いて、競合的ＰＣＲ反応の概略を説明する。得られた第一鎖ｃＤＮＡ５６の一部と第一鎖ｃＤＮＡ７６の一部を反応チューブからとり、新しい反応チューブに等量混ぜ合わせたものをＰＣＲテンプレートとする。ＰＣＲプライマーとして、第一鎖ｃＤＮＡ５６及び第一鎖ｃＤＮＡ７６にハイブリダイズするフォワード側プライマー６５と、第一鎖ｃＤＮＡ５６及び第一鎖ｃＤＮＡ７６に導入されている配列部分５５と同一の配列を有するリバース側プライマー６６を用いる。
【００４２】
ＰＣＲ産物検出用のユニバーサルプローブとして第一鎖ｃＤＮＡ５６に導入されている配列部分５４と同一の配列を有するプローブ５７と、第一鎖ｃＤＮＡ７６に導入されている配列部分７４と同一の配列を有するプローブ７７を用いる。
【００４３】
プローブ５７は、図中Ｒ１で示される蛍光体５８と図中Ｑで示される消光体５９で標識されており、プローブ７７は、図中Ｒ２で示される蛍光体７８と図中Ｑ示される消光体７９で標識されている。消光体５９と７９は、それぞれ蛍光体５８と７８の蛍光を抑制する働きがあれば同一のものを用いてもよい。プローブ５７及びプローブ７７は、インタクトな状態では、蛍光エネルギートランスファー現象により蛍光体５８及び蛍光体７８の蛍光が抑制されている。
【００４４】
５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いてＰＣＲ増幅を行う。ＰＣＲの初期段階において、フォワード側プライマー６５が第一鎖ｃＤＮＡ５６にハイブリダイズして、伸長することにより第二鎖ｃＤＮＡ６０が合成される。また、第一鎖ｃＤＮＡ７６にハイブリダイズして、伸長することにより第二鎖ｃＤＮＡ８０が合成される。第二鎖ｃＤＮＡ６０は、リバース側プライマー６６に相補的な配列と、プローブ５７に相補的な配列を有しており、第二鎖ｃＤＮＡ８０はリバース側プライマー６６に相補的な配列と、プローブ７７に相補的な配列を有している。
【００４５】
ＰＣＲの進行に伴って第二鎖ｃＤＮＡ６０と第二鎖ｃＤＮＡ８０がそれぞれのテンプレートから増幅される。プローブ５７は第二鎖ｃＤＮＡ６０に、プローブ７７は第二鎖ｃＤＮＡ８０にそれぞれハイブリダイズする。第二鎖ｃＤＮＡ６０にハイブリダイズしたリバース側プライマー６６が伸長するとＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性により、第二鎖ｃＤＮＡ６０にハイブリダイズしているプローブ５７は、５’末端側から加水分解される。加水分解の結果、プローブ５７から蛍光体５８が遊離し、フリーな蛍光体６１が生じて蛍光が発光する。また、第二鎖ｃＤＮＡ８０にハイブリダイズしたリバース側プライマー６６が伸長するとＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性により、第二鎖ｃＤＮＡ８０にハイブリダイズしているプローブ７７は、５’末端側から加水分解される。加水分解の結果、プローブ７７から蛍光体７８が遊離し、フリーな蛍光体８１が生じて蛍光が発光する。
【００４６】
ＰＣＲによって生じるフリーな蛍光体６１及びフリーな蛍光体８１の量比は、ＰＣＲ実行前に反応チューブ内に存在するｃＤＮＡ５６とｃＤＮＡ７６の量比に依存するため、２つの蛍光体からの蛍光シグナル量を比較することでｃＤＮＡ５６とｃＤＮＡ７６の存在比を調べることができる。すなわち、複数の試料における同一遺伝子の発現量を簡便に比較することが可能である。
【００４７】
６．キット
上記のとおり、標的遺伝子にその配列とは無関係な第１の塩基配列と第２の塩基配列を導入することにより、どのような標的遺伝子に対してもユニバーサルに使用できるＴａｑＭａｎＴＭプローブ（ユニバーサルプローブ）を提供することが可能となる。別の標的遺伝子を検出する場合には、導入用（逆転写用）プライマーの標的遺伝子にハイブリダイズする部分の配列と、フォワード側プライマーの配列だけを変更すれば良い。さらに、前記プローブに加えて、リアルタイムＰＣＲ用のリバース側プライマーも、標的遺伝子の塩基配列とは無関係であるため、該標的遺伝子によらずユニバーサルに利用できる。
【００４８】
すなわち、本発明はこれらユニバーサルに利用できるプローブとプライマーを含む遺伝子発現解析用キットを提供する。キットは、１つの単一検体の解析用のものであってもよいし、複数検体の同時解析用のものであってもよい。該キットの必須構成要素である、ユニバーサルプローブとリバース側プライマーの特徴や構造は上記したとおりである。
【００４９】
本発明のキットは、必須構成要素である前記ユニバーサルプローブとプライマーのほか、遺伝子発現解析に必要な他の試薬等を含んでいてもよい。そのようなものとしては、例えば、融解温度調整剤（例えば、ベタイン、トリメチルアミンＮ−オキシド等）、酵素反応に好適な条件を与える緩衝液、合成反応生成物の検出のために必要な他の試薬類を挙げることができる。さらに、該キットは、１回の反応に必要な試薬を反応容器に分注した状態で供給するものであってもよい。
【００５０】
【実施例】
以下、本発明について実施例を用いてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【００５１】
〔実施例１〕ユニバーサルプローブを用いたＧＡＰＤＨの遺伝子発現解析
１．ユニバーサルプローブによるＧＡＰＤＨの発現解析
（１）試験方法
試料としてマウス肝臓から抽出したＲＮＡを用い、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）用の下記の逆転写用プライマーを用いて逆転写反応を行い、第一鎖ｃＤＮＡを作製した。なお、逆転写反応はインビトロジェン社のスーパースクリプトＩＩリバーストランスクリプターゼを用いて行った。
Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｐｒｉｍｅｒ：５’−ＴＡＣ ＧＡＣ ＴＣＡ ＣＴＣ ＴＡＣ ＧＣＣ ＣＡ ＣＣＣ ＴＴＣＴ ＣＡＣＴＧＴＴ ＣＴＣ ＴＣＡＴ ＧＧＡ ＴＧＣ ＡＧＧ ＧＡＴ ＧＡＴ ＧＴＴ Ｃ−３’（配列番号１）
逆転写反応は、２ ｐｍｏｌの逆転写用プライマーとマウス肝臓から抽出したトータルＲＮＡとスーパースクリプトＩＩリバーストランスクリプターゼを反応緩衝液に混ぜ合わせ、４２℃で５０分間保温することで行った。その後、反応液中に残存するＲＮＡを分解するために、リボヌクレアーゼＨを反応液に加えて３７℃で２０分間保温した。
【００５２】
ＰＣＲ産物の検出にはアプライドバイオシステムズ社のシーケンスディテクションシステム７９００を用いた。また、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ及び基質としてアプライドバイオシステムズ社のＴａｑＭａｎＴＭユニバーサルＰＣＲマスターミックスのキットを用いた。２０ μｌの反応溶液中に、先に合成した第一鎖ｃＤＮＡと、下記に示すフォワード側プライマーとリバース側プライマーをそれぞれ１５ ｐｍｏｌ、５’末端を蛍光体ＦＡＭ、３’末端を消光体ＮＦＱ及びＴｍ値エンハンサーＭＧＢで標識したプローブ５ ｐｍｏｌを混ぜ合わせ、９５℃に１０分間保温した後、９５℃ １５秒間、６０℃ １分間からなる温度サイクルを５０回繰り返す条件にてＰＣＲを行った。
Ｆｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒ： ５’−ＴＧＣ ＡＣＣ ＡＣＣ ＡＡＣ ＴＧＣ ＴＴＡ Ｇ−３’（配列番号２）
Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒ： ５’−ＴＡＣ ＧＡＣ ＴＣＡ ＣＴＣ ＴＡＣ ＧＣＣ ＧＡ−３’（配列番号３）
Ｐｒｏｂｅ： ５’−（ＦＡＭ）−ＣＣＣ ＴＴＣＴ ＣＡＣ ＴＧＴＴ ＣＴＣ ＴＣＡＴ−（ＮＦＱ）−（ＭＧＢ）−３’（配列番号４）
【００５３】
（２）結果
図３にＰＣＲの各サイクル毎に蛍光検出を行って得られた結果を示す。グラフの横軸はＰＣＲサイクル数、縦軸は蛍光強度（任意単位）をそれぞれ示している。グラフは種々の濃度の標的ＲＮＡを含む試料からの蛍光シグナルの変化を表している。正方形のドットが最も標的ＲＮＡの初期濃度が高く、以下ひし形、三角形と続き、丸のドットが最も標的ＲＮＡの初期濃度が低い。各ドットは１０倍希釈の系列を構成している。ＰＣＲ産物のリアルタイム検出では、ＰＣＲ産物由来の蛍光シグナル値がある閾値を越えたサイクルをＣＴサイクルと定義して、標的ＲＮＡの初期濃度を示す指標として用いる。図３から少なくとも１０８の濃度範囲で、標的ＲＮＡの初期濃度に応じて蛍光シグナル値の増加が検出され、結果としてＣＴサイクルが初期濃度と矛盾なく解析されていることが確認された。なお図３のグラフにおいて、プラスのドットは標的ＲＮＡを含まない試料からの蛍光シグナルの変化を示している。
【００５４】
２．Ｓｕｎｒｉｓｅ法との比較
（１）試験方法
次に、従来法であるＳｕｎｒｉｓｅプライマーを用いた発現解析法を本発明の方法と比較した。まず、１．と同様の方法で種々の濃度の標的ＲＮＡからＰＣＲを行い、蛍光シグナルの変化を計測した。次に、本発明で用いたＰＣＲのテンプレートと同じものを用い、配列番号２と同じ塩基配列を有するフォワード側プライマー、及び下記に示す５’末端を蛍光体ＦＡＭで標識し、２３塩基目のチミンをアミノ化して消光体（ＤＡＢＣＹＬ）を標識したリバース側Ｓｕｎｒｉｓｅプライマーをそれぞれ２０ ｐｍｏｌを用いてＰＣＲを行った。
Ｆｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒ： ５’−ＴＧＣ ＡＣＣ ＡＣＣ ＡＡＣ ＴＧＣ ＴＴＡ Ｇ−３’（配列番号２）
Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｓｕｎｒｉｓｅ Ｐｒｉｍｅｒ：５’−（ＦＡＭ）−ＡＧＣＧ ＡＴＧＣ ＡＣＣＣＴＣＡ ＧＣＡＴ ＣＧＣＴ＊ ＣＣＣ ＴＴＣＴ ＣＡＣ ＴＧＴＴ ＣＴＣ ＴＣＡＴ−３’（配列番号５）
上記（ＦＡＭ）は蛍光体ＦＡＭを示し、＊は消光体（ＤＡＢＣＹＬ）を示す。ＰＣＲ及び測定条件は１．と同様の条件で行った。
【００５５】
（２）結果
図４に、Ｓｕｎｒｉｓｅ法と本発明の方法によって得られる蛍光シグナル強度の変化を比較した結果を示す。図中、マウス肝臓由来のＧＡＰＤＨを本発明の方法で検出した場合の蛍光シグナルの変化は実線で、Ｓｕｎｒｉｓｅ法で検出した場合の蛍光シグナルの変化は破線で示されている。また横軸はＰＣＲサイクル数、縦軸は蛍光強度（任意単位）を示している。丸のドットの１００倍希釈が正方形のドット、さらに１００倍希釈したものがひし形のドットである。
【００５６】
希釈なし及び１００倍希釈の系列では、本発明の方法とＳｕｎｒｉｓｅ法のいずれも蛍光シグナル値が増加している。しかし、Ｓｕｎｒｉｓｅ法の場合は蛍光シグナル値が増加するＰＣＲサイクル数は本発明の方法に比べて１０サイクル以上遅く、蛍光シグナル値も小さい。また、１００２希釈の系列では、本発明の方法では蛍光シグナル値が増加しているのに対し、Ｓｕｎｒｉｓｅ法の場合は蛍光シグナル値があまり変化していない。以上の結果から、本発明の方法は、Ｓｕｎｒｉｓｅ法に比較して検出感度が高いことが確認された。
【００５７】
〔実施例２〕 複数検体の同時測定
次に、本発明の方法を用いて複数の試料由来の標的遺伝子を一つの反応チューブでＰＣＲ増幅し、検出した実施例を示す。
（１）試験方法
マウス肝臓より抽出したＲＮＡ及びマウス腎臓より抽出したＲＮＡをテンプレートとして、実施例１と同様にして逆転写反応を行い、それぞれＧＡＰＤＨの第一鎖ｃＤＮＡを作製した。マウス肝臓由来ＲＮＡの逆転写用プライマーは実施例１と同様のものを、マウス腎臓由来ＲＮＡの逆転写用プライマーは下記に示すもの（配列番号６）を用いた。
【００５８】
なお、マウス肝臓由来ＲＮＡとマウス腎臓由来ＲＮＡの各逆転写用プライマーは、それぞれ図６に従って設計されている。すなわち、標的ＲＮＡにハイブリダイズする配列部分５３と、ＰＣＲ検出時に用いるリバース側プライマー６６と同一の配列からなる配列部分５５は共通であるが、その間に位置するＰＣＲ検出時に用いるプローブと同一の配列からなる配列部分５４と配列部分７４（それぞれ、下線部分）は異なっている。
Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｐｒｉｍｅｒ（Ｌｉｖｅｒ）：５’−ＴＡＣ ＧＡＣ ＴＣＡ ＣＴＣ ＴＡＣ ＧＣＣ ＣＡ ＣＣＣＴＴＣＴ ＣＡＣ ＴＧＴＴ ＣＴＣ ＴＣＡＴ ＧＧＡ ＴＧＣ ＡＧＧ ＧＡＴ ＧＡＴ ＧＴＴ Ｃ−３’（配列番号１）
Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｐｒｉｍｅｒ（Ｋｉｄｎｙ）：５’−ＴＡＣ ＧＡＣ ＴＣＡ ＣＴＣ ＴＡＣ ＧＣＣ ＣＡ ＣＡＣＴＣＡＴ ＣＴＣ ＴＴＣＴ ＣＣＣ ＴＧＴＴ ＧＧＡ ＴＧＣ ＡＧＧ ＧＡＴ ＧＡＴ ＧＴＴ Ｃ−３’（配列番号６）
【００５９】
ＰＣＲ反応は、得られた各試料由来のｃＤＮＡの一部を反応チューブからとり、新しい反応チューブに等量混ぜ合わせたものをテンプレートとして、実施例１で用いたプライマー（配列番号２及び３）及び２種のプローブを用いて行った。
【００６０】
なお、肝臓由来ＧＡＰＤＨ検出用プローブ（プローブＡ）は実施例１で用いたプローブと同じもの（配列番号４）を、腎臓由来ＧＡＰＤＨ検出用プローブ（プローブＢ）は下記に示すもの（配列番号７）を用いた。
Ｐｒｏｂｅ Ａ：５’−（ＦＡＭ）−ＣＣＣ ＴＴＣＴ ＣＡＣ ＴＧＴＴ ＣＴＣ ＴＣＡＴ−（ＮＦＱ）−（ＭＧＢ）−３’（配列番号４）
Ｐｒｏｂｅ Ｂ：５’−（ＶＩＣ）−ＣＡＣ ＴＣＡＴ ＣＴＣ ＴＴＣＴ ＣＣＣ ＴＧＴＴ−（ＮＦＱ）−（ＭＧＢ）−３’（配列番号７）
各プローブは、図５及び図６に従って、実質的に同じ融解温度を有するように設計されている。プローブＡは５’末端を蛍光体ＦＡＭで、プローブＢは５’末端を蛍光体ＶＩＣで標識され、共に３’末端は消光体で標識されている。また、各消光体には、ＤＮＡのマイナーグルーブに結合するＴｍエンハンサーＭＧＢが結合されている。ＰＣＲ及び測定条件は１．と同様の条件で行った。
【００６１】
（２）結果
図７に、マウス肝臓由来の標的ＲＮＡを種々の濃度でテンプレートとして用い、２種のプローブで検出を行った実験の結果を示す。グラフの横軸はＰＣＲサイクル数を示し、縦軸は蛍光体の相対蛍光強度（任意単位）を示す。図７（ａ）は、マウス肝臓由来の標的ＲＮＡのＰＣＲ産物をプローブＡで、図７（ｂ）はプローブＢで検出した際の蛍光シグナル量の変化を示したグラフである。図７（ｂ）から明らかなように、試料はマウス腎臓由来の標的ＲＮＡを全く含んでいないため、プローブＢ由来の蛍光シグナルはＰＣＲサイクルにおいてほとんど増幅していない。
【００６２】
図８に、図７とは逆に、マウス腎臓由来の標的ＲＮＡを種々の濃度でテンプレートとして用い、２種のプローブで検出を行った実験の結果を示す。グラフの横軸はＰＣＲサイクル数を示し、縦軸は蛍光体の相対蛍光強度（任意単位）を示す。図８（ａ）はマウス腎臓由来の標的ＲＮＡのＰＣＲ産物をプローブＡで、図８（ｂ）はプローブＢで検出した際の蛍光シグナル量の変化を示したグラフである。図８（ａ）から明らかなように、試料はマウス肝臓由来の標的ＲＮＡを含んでいないため、プローブＡ由来の蛍光シグナルはＰＣＲサイクルにおいてほとんど増幅していない。以上の結果からプローブＡはマウス肝臓由来の標的ＲＮＡにのみ反応し、プローブＢはマウス腎臓由来の標的ＲＮＡにのみ反応することが確認された。
【００６３】
図９に、マウス肝臓由来の標的ＲＮＡとマウス腎臓由来の標的ＲＮＡをいろいろな濃度比で混ぜ合わせた溶液をテンプレートとして、同様にＰＣＲ増幅した結果を示す。プローブ由来の蛍光シグナルが閾値以上になったＰＣＲサイクルをＣＴ（スレッシュホールドサイクル）とすると、ＣＴはテンプレート量を反映した値となる（Ｄｉｅｔｅｒ Ｋ．， ｅｔ ａｌ．， Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ， １９９９ ｖｏｌ．２０， ｐ２９１−２９９ 参照）。プローブＡ由来のＣＴ値をＣＴＡとし、プローブＢ由来のＣＴ値をＣＴＢとする。ＣＴＡとＣＴＢの差はそれぞれのテンプレート量の相対量を示す。図９のグラフは、蛍光シグナル解析の結果得られたＣＴＡとＣＴＢの差をプロットしたものである。テンプレートの量比（テンプレートＡの量／テンプレートＢの量）が０．０１から１００の範囲では、ＣＴＡ−ＣＴＢの値はほぼ比例関係を示しているが、テンプレート量比が０．０１以下あるいは１００以上の場合は、グラフは近似直線から外れる。この結果から、テンプレート量比が１００倍以内あるいは１００分の１以内の場合には、ＣＴＡとＣＴＢの差から直接２種類のテンプレートの存在比を比較できることが確認された。
【００６４】
【発明の効果】
本発明によれば、遺伝子発現解析用のユニバーサルなプローブが提供される。該プローブは、標的遺伝子の塩基配列に応じてその都度高価なプローブを設計する必要がない。また、どのような標的遺伝子に対しても実質的に同じ条件でリアルタイムＰＣＲ検出を行うことができ、厳密な定量分析が可能である。さらに、ＰＣＲを単一温度サイクルで行うため、副産物生成が低減でき、高精度の定量分析を行うことができる。さらにまた、本発明のユニバーサルプローブ２種類を用いて、１つの反応容器で、競合ＰＣＲを行うことにより、複数検体を同時にリアルタイム検出することが可能になる。これにより、スタンダードを作成することなく、遺伝子発現量の相対比較が可能になる。
【００６５】
【配列表】
【配列表フリーテキスト】
配列番号１−人工配列の説明：マウス遺伝子ＧＡＰＤＨからｃＤＮＡを合成するための逆転写反応用プライマー
配列番号２−人工配列の説明：マウス遺伝子ＧＡＰＤＨを増幅するためのフォワードプライマー
配列番号３−人工配列の説明：マウス遺伝子ＧＡＰＤＨを増幅するためのリバースプライマー
配列番号４−人工配列の説明：マウス遺伝子ＧＡＰＤＨをリアルタイムＰＣＲによって検出するプローブ
配列番号５−人工配列の説明：マウス遺伝子ＧＡＰＤＨをリアルタイムＰＣＲによって検出するための蛍光標識されたリバースプライマー
配列番号６−人工配列の説明：マウス遺伝子ＧＡＰＤＨからｃＤＮＡを合成するための逆転写反応用プライマー
配列番号７−人工配列の説明：マウス遺伝子ＧＡＰＤＨをリアルタイムＰＣＲによって検出するプローブ
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明のユニバーサルプローブを用いたリアルタイムＰＣＲ検出の手順を示した図である。
【図２】図２は、本発明のユニバーサルプローブと、ＰＣＲリバースプライマーと逆転写反応用プライマーの配列の関係を示した図である。
【図３】図３は、本発明のユニバーサルプローブを用いたリアルタイムＰＣＲの検出結果であり、ＰＣＲサイクルに対する蛍光シグナルの変化を示したグラフである。図中、各ドットは１０倍希釈の系列を構成し、正方形のドットが最も標的ＲＮＡの初期濃度が高く、以下ひし形、三角形と続き、丸のドットが最も標的ＲＮＡの初期濃度が低い。
【図４】図４は、本発明のユニバーサルプローブを用いたリアルタイムＰＣＲの検出結果と、サンライズ法によるリアルタイムＰＣＲ結果を比較したグラフである。図中、丸のドットの１００倍希釈が正方形のドット、さらに１００倍希釈したものがひし形のドットである。
【図５】図５は、２種類のユニバーサルプローブの配列を模式的に示した図である。
【図６】図６は、２種類のユニバーサルプローブを用いたリアルタイムＰＣＲ検出の手順を示した図である。
【図７】図７は、マウス肝臓由来の標的ＲＮＡをテンプレートとした場合の、２種類のユニバーサルプローブを用いたリアルタイムＰＣＲの検出結果（図７（ａ）：プローブＡ、図７（ｂ）：プローブＢ）を示したグラフである。
【図８】図８は、マウス腎臓由来の標的ＲＮＡをテンプレートとした場合の、２種類のユニバーサルプローブを用いたリアルタイムＰＣＲの検出結果（図８（ａ）：プローブＡ、図８（ｂ）：プローブＢ）を示したグラフである。による検出結果を示す。
【図９】図９は、２種類のユニバーサルプローブを用いたリアルタイムＰＣＲの検出結果を示すグラフである。
【符号の説明】
１、５１、７１…試料ＲＮＡ
２、５２、７２…逆転写用プライマー
３、５３…標的遺伝子にハイブリダイズする配列部分
４、５４、７４…標的遺伝子に非特異的な第１の配列部分
５、５５…標的遺伝子に非特異的な第２の配列部分
６、５６、７６…第一鎖ｃＤＮＡ
７、６０、８０…第二鎖ｃＤＮＡ
１０、６５…フォワード側プライマー
１１、６６…リバース側プライマー
１２、５７、７７…プローブ
１３、５８、７８…蛍光体
１４、３２、５９、７９…消光体
１５、６１、８１…フリーな蛍光体
１６…連結部となる配列部分
１７…逆転写用プライマー
１８、３３…Ｔｍ値エンハンサー
２０、２１、９１、９２、９３、９４…ＰＣＲサイクルに対する蛍光強度の変化を示したグラフ
３０…プローブＡ
３１…蛍光体Ｒ１
３４、３５、３６、３７、３８、３９…モジュール配列
４０…プローブＢ
４１…蛍光体Ｒ２
１００…テンプレート量比に対するＣＴの差を示したグラフ
Claims (10)
- 標的遺伝子の塩基配列に対して非特異的な配列を有する第１の塩基配列及び第２の塩基配列について、
前記第１の塩基配列よりも５’末端側に前記第２の塩基配列を結合させ、共に前記標的遺伝子に導入させた分析対象遺伝子に対し、
前記標的遺伝子に特異的にハイブリダイズする塩基配列を含むプライマー、
前記第２の塩基配列と同一な塩基配列を含むプライマー、
前記第１の塩基配列と同一又は相補的な塩基配列を含み、一方の末端を蛍光体で修飾され、もう一方の末端を消光体で修飾されたプローブ、及び
５’→３’エキソヌクレア−ゼ活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いて核酸増幅反応を行い、
前記核酸増幅反応の際に前記耐熱性ＤＮＡポリメラーゼにより前記第１の塩基配列に結合した前記プローブを分解し、
遊離した前記蛍光体が発する蛍光を検出することにより、前記核酸増幅反応の産物量を計測することを特徴とする遺伝子発現解析法。 - 前記分析対象遺伝子が、前記標的遺伝子に特異的にハイブリダイズする配列を含む第３の塩基配列より５’末端側に前記第１の塩基配列を含み、かつ前記第１の塩基配列より５’末端側に前記第２の塩基配列を含む導入用プライマーを用いることにより、前記標的遺伝子に前記第１の塩基配列と第２の塩基配列を導入して合成されたものであることを特徴とする、請求項１に記載の遺伝子発現解析法。
- 前記分析対象遺伝子が、前記標的遺伝子に特異的にハイブリダイズする配列を含む第３の塩基配列より５’末端側に前記第１の塩基配列を含み、かつ前記第１の塩基配列より５’末端側に前記第２の塩基配列を含む導入用プライマーを用いて、前記標的遺伝子のｍＲＮＡに対して逆転写反応を行うことにより、前記第１の塩基配列と第２の塩基配列を導入したｃＤＮＡであることを特徴とする、請求項１又は２に記載の遺伝子発現解析法。
- 前記核酸増幅反応が、１組のプライマーを用いて、単一温度サイクルで行われることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の遺伝子発現解析法。
- 請求項１〜４のいずれか１項に記載の遺伝子発現解析方法において、２種以上のプローブを用いることにより、１つの標的遺伝子について、１つの容器を用いて、複数の検体由来の試料を同時に分析することを特徴とする、遺伝子発現解析法。
- 前記２種以上のプローブの融解温度が実質的に同じであることを特徴とする、請求項５に記載の遺伝子発現解析方法。
- 標的遺伝子の塩基配列に対してそれぞれ非特異的な配列を有する、前記標的遺伝子に導入される第１の塩基配列、及び第１の塩基配列よりも５’末端側に位置する第２の塩基配列について、
前記第１の塩基配列と同一又は相補的な配列を含み、一方の末端を蛍光体で修飾され、もう一方の末端を消光体で修飾されたプローブ、及び
前記第２の塩基配列と同一の配列を含み、前記第１の塩基配列より５’末端側に結合するプライマーを含むことを特徴とする、遺伝子発現解析用キット。 - 実質的に同じ融解温度を有する２種以上のプローブを含むことを特徴とする、請求項７記載のキット。
- 前記２種以上のプローブが、それぞれ３乃至４塩基長の複数のモジュール配列からなり、各モジュール配列の両末端の塩基は同一であり、かつ各プローブがこの両末端の塩基が同一であるモジュール配列同士の順序を入れ替えて構成されたものであることを特徴とする、請求項８記載のキット
- 請求項１〜６のいずれか１項に記載の遺伝子発現解析法に用いられるものである、請求項７〜９のいずれか１項に記載のキット。
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008500034A (ja) * | 2004-05-26 | 2008-01-10 | ステンマン，ヤコブ | 小さな生物学的サンプルにおけるｍＲＮＡ発現レベルの定量及び／又は比較評価を行うための方法 |
| US8008045B2 (en) | 2004-05-19 | 2011-08-30 | Hitachi High-Technologies Corporation | Primers for isothermal amplification of hepatitis C virus |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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2003
- 2003-08-29 US US10/650,726 patent/US20040091921A1/en not_active Abandoned
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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