CN113930488A - 基于互补探针技术快速检测mthfr基因多态性的引物组、试剂盒、方法及应用 - Google Patents

基于互补探针技术快速检测mthfr基因多态性的引物组、试剂盒、方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种基于互补探针技术快速检测MTHFR基因多态性的引物组、试剂盒、方法及应用，适用于体外快速检测MTHFR基因c.677C>T多态性。方法包括以下步骤：(1)互补探针、荧光标记引物和通用下游引物的设计及合成；(2)获取待测样本的基因组DNA；(3)配制反应体系；(4)进行PCR反应；(5)基因型判定。本发明实现了在不需要双标荧光探针的前提下，仅一个反应即完成MTHFR基因c.677C>T多态性检测的目的。

Description

基于互补探针技术快速检测MTHFR基因多态性的引物组、试剂 盒、方法及应用
技术领域
本发明涉及一种检测MTHFR基因多态性的方法，具体涉及一种基于互补探针技术快速检测MTHFR基因多态性的引物组、试剂盒、方法及应用。
背景技术
人亚甲基四氢叶酸还原酶(Methylenetetrahydrofolate reductases，MTHFR)基因编码的蛋白在5，10-亚甲基四氢叶酸还原成5-甲基四氢叶酸的过程起关键催化作用。MTHFR基因存在广泛的基因多态性，c.677C>T是该基因在中国人群中最常见的单核苷酸多态性。c.677C>T多态性会导致MTHFR酶活性的改变，通过对MTHFR基因的c.677C>T多态性位点进行基因分型，可实现该酶活性的等效快速检测。
传统的单核苷酸多态性检测方法多为实验室常用技术，如DNA测序、限制性片段长度多态性及核酸杂交芯片等。尽管展现出很高的准确性，但缺陷依旧明显：其一，测序和芯片平台价格昂贵且操作程序复杂，需配备专业实验操作和分析人员，不适宜在基层医院或医学检验所开展；其二，属于“开管”检测，依赖于凝胶电泳平台，易产生假阳性的结果；其三，耗时较长，自取样到最终递呈检测报告，往往需要等待超过24小时，不适宜作为伴随检测技术；其四，不适合无创取样检测，如咽试纸取样仅能获得微量的DNA，多数情况下不能满足此类技术的“门槛”。
商品化的试剂盒多采用荧光定量-ARMS的方法检测MTHFR基因的c.677C>T多态性。该技术操作简便，灵敏度高，但仍有明显的不足之处。其一，双标荧光探针合成难度大、成本高；其二，部分的荧光定量-ARMS技术使用传统的Taqman双标荧光探针，需要同时设置两个反应才能完成该多态性位点的检测，其检测通量受到限制；其三，使用MGB荧光探针可实现该多态性的单反应检测，但该类探针的合成原料受专利限制，成本高且获取难度大。此外，使用MGB荧光探针进行多态性检测通常无法克服信噪比低的缺陷。
发明内容
为了克服传统检测方法的不足之处，本发明提出一种基于互补探针技术快速检测MTHFR基因多态性的引物组、试剂盒及方法，不仅大幅度降低了试剂成本，同时具有高通量和高特异性的特点，检测结果十分可靠。
为实现以上发明目的，本发明提供如下技术方案：
一种基于互补探针技术快速检测MTHFR基因多态性的引物组，其特殊之处在于：针对MTHFR基因的c.677C>T多态性位点设计，包括以下核苷酸序列的引物和探针：
通用下游引物：5’-GGGACGATGGGGCAAGTGATG-3’；
C荧光标记引物：
5’-荧光基团1-AGTGCTATCCGAGGGAAAAGGAGAAGGTGTCTGCGGGACC-3’
其中AGTGCTATCCGAGGGAA为互补探针结合序列；
AAGGAGAAGGTGTCTGCGGGACC为基础引物序列；
T荧光标记引物：
5’-荧光基团2-AGTGCTATCCGAGGGAAAAGGAGAAGGTGTCTGCGGGACT-3’
其中AGTGCTATCCGAGGGAA为互补探针结合序列；
AAGGAGAAGGTGTCTGCGGGACT为基础引物序列；
互补探针：5’-TTCCCTCGGATAGCACT-猝灭基团-3’。
进一步地，上述C荧光标记引物中荧光基团1为FAM，HEX，ROX，TAMRA，Cy3或Cy5。
进一步地，上述T荧光标记引物中荧光基团2为FAM，HEX，ROX，TAMRA，Cy3或Cy5，且与荧光基团1不同。
进一步地，上述互补探针中猝灭基团为Dabcyl，Eclipse，BHQ1，BHQ2或BHQ3。
本发明还提供一种基于互补探针技术快速检测MTHFR基因多态性的试剂盒，其特殊之处在于：包括上述的基于互补探针技术快速检测MTHFR基因多态性的引物组。
进一步地，上述试剂盒还包括UNG酶(尿嘧啶-N-糖基化酶)、DNA聚合酶，dNTPs(脱氧核糖核苷三磷酸)、dUTP(脱氧尿苷三磷酸)以及PCR Buffer。
本发明还提供一种基于互补探针技术快速检测MTHFR基因多态性的方法，其特殊之处在于：使用上述的基于互补探针技术快速检测MTHFR基因多态性的试剂盒，包括以下步骤：
步骤1、获取待测样本的基因组DNA；
步骤2、配制反应体系；
在同一反应管中加入待测样本的基因组DNA、通用下游引物、C荧光标记引物、T荧光标记引物、互补探针、UNG酶(尿嘧啶-N-糖基化酶)、DNA聚合酶，dNTPs(脱氧核糖核苷三磷酸)、dUTP(脱氧尿苷三磷酸)以及PCR Buffer；
步骤3、PCR反应；
将配制好的反应体系在荧光实时定量PCR仪上进行反应；
步骤4、基因型判定；
PCR反应完成后进行待测样本MTHFR基因多态性的判定。
进一步地，步骤2中以单管反应体系20μL计，反应管中加入通用下游引物，250～550nM；C荧光标记引物，125～250nM；T荧光标记引物，125～250nM；互补探针，500～700nM；UNG酶，0.2～0.4U；DNA聚合酶，0.5～1U；dNTPs，各150～250μM；dUTP，400～500μM；10×PCRBuffer，2.0μL；基因组DNA，1-100ng，去离子水补足体积20μL。
进一步地，步骤3中PCR反应参数设置如下：50℃，3～5min；94～95℃，3～15min；94～95℃，5～25sec；60～62℃，15～30sec；50～53℃，15～30sec；35～40个循环；在50～53℃恒温过程中收集荧光。
本发明还提供上述的基于互补探针技术快速检测MTHFR基因多态性的引物组在检测人MTHFR基因多态性中的应用。
本发明与现有技术相比具有明显的优点和有益效果：
1、信噪比高；
本发明所设计的互补探针可有效猝灭游离的荧光标记引物，保证了检测信号的特异性。相较于MGB荧光探针体系，本发明有更高的信噪比。
2、普适性强；
本发明检测方法不涉及荧光探针的酶切或链置换反应，因此所有适合定量PCR的DNA聚合酶均适用于本体系，且无需添加其他特殊组分。同时，本技术体系适用于各种荧光定量PCR平台，不需要如芯片机等特殊的仪器设备，操作简单。
3、成本低；
基于本实验中荧光标记引物和互补探针的设计，本方法可很大程度上节省试剂成本，仅为传统检测体系成本的1/3～1/2。同时，对于内置多个荧光检测通道的仪器平台，可实现单管同时检测多个多态性位点。
4、结果分析简单，耗时短；
对每个样本只需观察其扩增信号便可完成多态性判定，可完全依靠仪器配套的软件同时分析大量样本。
附图说明
图1-1为本发明互补探针的序列结构示意图；
图1-2为本发明荧光标记引物的序列结构示意图；
图1-3为本发明互补探针和荧光标记引物工作原理示意图；
图2为本发明实验体系的设计原理示意图，其中2-1为检测MTHFR基因的c.677C>T多态性的实验体系组成，2-2为检测MTHFR基因的c.677C>T多态性的实验原理图；
图3-1为本发明应用于MTHFR基因的c.677C>T多态性检测1号样实验结果图；
图3-2为本发明应用于MTHFR基因的c.677C>T多态性检测2号样实验结果图；
图3-3为本发明应用于MTHFR基因的c.677C>T多态性检测3号样实验结果图。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合说明书附图对本发明的具体实施方式做详细的说明，显然所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明的保护的范围。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
本发明将荧光标记引物和互补探针结合起来，并利用等位基因特异性扩增技术进行MTHFR基因的c.677C>T多态性检测，不仅大幅度节省了试剂成本，同时具有普适性强和信噪比高的有点，使检测结果更可靠。
请参阅图1-1所示，为本发明中互补探针的序列结构示意图。互补探针本质上是一段3’端修饰了猝灭基团的寡核苷酸序列，猝灭基团封闭了互补探针的3’端羟基，使其无法作为引物。
请参阅图1-2所示，为本发明中荧光标记引物的序列结构示意图。荧光标记引物的序列由两部分构成，即互补探针结合序列和基础引物序列。互补探针结合序列的5’端标记有特定的荧光基团，未与互补探针结合时可被激发出特定波长的发射光。基础引物序列设计为等位基因特异性引物，用于特异性扩增不同等位基因。
请参阅图1-3所示，为本发明中互补探针和荧光标记引物工作原理示意图。未进行PCR扩增时，互补探针与荧光标记引物的互补探针结合序列特异性结合，荧光基团和猝灭基团在空间上非常接近，发生荧光共振能力转移效应，后者被激发出的光波被前者猝灭，因此检测不到相应波长的荧光信号。PCR扩增顺利完成后，双链产物的形成阻碍了互补探针与互补探针结合序列的结合，荧光基团被激发出的光波不再被猝灭，此时可检测到荧光基团被激发出的发射光信号。因此，只有当PCR顺利进行后，才会检测到特异性的荧光信号。此外，为实现预期效果，互补探针与互补探针结合序列杂交的熔解温度值(Tm值)应高于引物与模板杂交的Tm值，且应低于双链PCR产物的Tm值，即Tm3>Tm1>Tm2。
图2为本发明中提供实验体系的设计原理示意图。
请参阅图2中2-1所示，为本发明中检测MTHFR基因的c.677C>T多态性的实验体系组成。在同一反应体系中，同时存在两条荧光标记引物。两条引物的互补探针结合序列部分完全一样，但基础引物序列的3’端碱基不同，分别为碱基C和碱基T，记作C荧光标记引物和T荧光标记引物。C荧光标记引物仅能特异性扩增MTHFR基因c.677位置碱基为C的序列，即C等位基因；T荧光标记引物仅能特异性扩增MTHFR基因c.677位置碱基为T的序列，即T等位基因。两条荧光标记引物的5’末端标记有不同的荧光基团，C荧光标记引物标记荧光基团1，T荧光标记引物标记荧光基团2，两个荧光基团均被同一种互补探针所猝灭。
请参阅图2中2-2所示，为本发明中检测MTHFR基因的c.677C>T多态性的实验原理图。当样本MTHFR基因的c.677C>T多态性位点的基因型为TT型，即体系中仅有T等位基因，这时只有T荧光标记引物可进行有效扩增，因此只能检测到荧光基团1的信号。同理，当样本MTHFR基因的c.677C>T多态性位点的基因型为CC型，只有C荧光标记引物可进行有效扩增，因此只能检测到荧光基团2的信号。若样本的基因型为CT型，两种荧光标记引物均可进行有效扩增，因此可同时检测到荧光基团1和荧光基团2的信号。
针对待测样本，本实施例检测MTHFR基因的c.677C>T多态性的方法，包括以下步骤：
(1)互补探针、荧光标记引物和通用下游引物的设计及合成；
通用下游引物(21nt):
5’-GGGACGATGGGGCAAGTGATG-3’
C荧光标记引物(40nt):
Figure BDA0003322143620000061
T荧光标记引物(40nt):
Figure BDA0003322143620000062
本实施例中C荧光标记引物中荧光基团1为FAM，在其他实施例中还可以为HEX，ROX，TAMRA，Cy3或Cy5；T荧光标记引物中荧光基团2为HEX，在其他实施例中还可以是FAM，ROX，TAMRA，Cy3或Cy5，与荧光基团1不同即可。
互补探针(17nt):
5’-TTCCCTCGGATAGCACT-BHQ1-3’；
本实施例中互补探针中猝灭基团为BHQ1，在其他实施例中还可以为Dabcyl，Eclipse，BHQ2或BHQ3。
(2)获取待测样本的基因组DNA；
(3)配制反应体系
在同一反应管中加入待测样本的基因组DNA、通用下游引物、C荧光标记引物、T荧光标记引物、互补探针、UNG酶(尿嘧啶-N-糖基化酶)、DNA聚合酶，dNTPs(脱氧核糖核苷三磷酸)、dUTP(脱氧尿苷三磷酸)以及PCR Buffer。
上述反应体系中通用下游引物、C荧光标记引物、T荧光标记引物、互补探针、UNG酶(尿嘧啶-N-糖基化酶)、DNA聚合酶，dNTPs(脱氧核糖核苷三磷酸)、dUTP(脱氧尿苷三磷酸)以及PCR Buffer可位于同一试剂盒中。
以单管反应体系20μL计，反应管中加入通用下游引物，250nM；C荧光标记引物，125nM；T荧光标记引物，125nM；互补探针，500nM；UNG酶，0.25U；DNA聚合酶，0.5U；dNTPs，各200μM；dUTP，400μM；10×PCR Buffer，2.0μL；基因组DNA，10ng，去离子水补足体积20μL。
(4)PCR反应
将配制好的反应体系在荧光实时定量PCR仪上进行反应，反应参数设置如下：50℃，3min；95℃，10min；95℃，10sec；60℃，20sec；52℃，30sec；35个循环。在52℃恒温过程中收集荧光。
(5)基因型判定
PCR反应完成后进行待测样本MTHFR基因多态性判定。
以下是采用本发明所提供的技术方案对3例已知基因型的样本进行MTHFR基因的c.677C>T多态性检测的示例，以进一步体现本发明的技术效果。其中1号样本的基因型为CC，2号样本的基因型为TT，3号样本的基因型为CT，3例样本均通过双脱氧测序进行基因型判定。
C荧光标记引物的标记的荧光基团为FAM，T荧光标记引物标记的荧光基团为VIC，互补探针标记的猝灭基团为BHQ1。扩增体系统一为20μL，每个样本单独配置反应体系。各体系中均加入通用下游引物250nM，C荧光标记引物，125nM；T荧光标记引物，125nM；互补探针，500nM；UNG酶(菲鹏生物股份有限公司)，0.25U；HiTaq HS DNA聚合酶(菲鹏生物股份有限公司)，0.5U；dNTPs，各200μM；dUTP，400μM；10×PCR Buffer(菲鹏生物股份有限公司)，2.0μL；基因组DNA，10ng，去离子水补足体积20μL。将配制好的体系置于StepOnePlusTM荧光实时定量PCR仪。反应参数设置如下：50℃，3min；95℃，10min；95℃，10sec；60℃，20sec；52℃，30sec，收集荧光；共进行35个循环。反应完成后，根据仪器软件提供结果判定样本的基因型。实验结果如图3-1、图3-2及图3-3所示。
请参阅图3-1所示，1号样本仅有FAM通道检测到荧光信号，证实只有C特异性引物得到扩增，表明该样本c.677C>T多态性位点对应的基因型为CC型，与预期结果完全相符；
请参阅图3-2所示，2号样本仅有VIC通道检测到荧光信号，证实只有T特异性引物得到扩增，表明该样本c.677C>T多态性对应位点的基因型为TT型，与预期结果完全相符；
请参阅图3-3所示，3号样本在FAM和VIC通道同时检测到荧光信号，证实C特异性引物和T特异性引物均得到扩增，表明该样本c.677C>T多态性位点对应的基因型为CT型，与预期结果完全相符。
以上实施例不应视为对本发明保护范围的限制，本发明在模板的准备和实时荧光PCR的环节确定了最佳的实施方式和参数，但本领域技术人员基于本发明技术思想和设计的引物体系，按照常规的操作方式(如试剂配比、扩增过程参数等)足以快速检测MTHFR基因的c.677C>T多态性，较之于现有技术有显著进步。
Figure IDA0003322143680000011

Claims (10)

1.一种基于互补探针技术快速检测MTHFR基因多态性的引物组，其特征在于：针对MTHFR基因的c.677C>T多态性位点设计，包括以下核苷酸序列的引物和探针：
通用下游引物：5’-GGGACGATGGGGCAAGTGATG-3’；
C荧光标记引物：5’-荧光基团1-AGTGCTATCCGAGGGAAAAGGAGAAGGTGTCTGCGGGACC-3’
其中AGTGCTATCCGAGGGAA为互补探针结合序列；
AAGGAGAAGGTGTCTGCGGGACC为基础引物序列；
T荧光标记引物：5’-荧光基团2-AGTGCTATCCGAGGGAAAAGGAGAAGGTGTCTGCGGGACT-3’
其中AGTGCTATCCGAGGGAA为互补探针结合序列；
AAGGAGAAGGTGTCTGCGGGACT为基础引物序列；
互补探针：5’-TTCCCTCGGATAGCACT-猝灭基团-3’。
2.根据权利要求1所述的基于互补探针技术快速检测MTHFR基因多态性的引物组，其特征在于：所述C荧光标记引物中荧光基团1为FAM，HEX，ROX，TAMRA，Cy3或Cy5。
3.根据权利要求2所述的基于互补探针技术快速检测MTHFR基因多态性的引物组，其特征在于：所述T荧光标记引物中荧光基团2为FAM，HEX，ROX，TAMRA，Cy3或Cy5，且与荧光基团1不同。
4.根据权利要求3所述的基于互补探针技术快速检测MTHFR基因多态性的引物组，其特征在于：所述互补探针中猝灭基团为Dabcyl，Eclipse，BHQ1，BHQ2或BHQ3。
5.一种基于互补探针技术快速检测MTHFR基因多态性的试剂盒，其特征在于：包括权利要求1-4任一所述的基于互补探针技术快速检测MTHFR基因多态性的引物组。
6.根据权利要求5所述的基于互补探针技术快速检测MTHFR基因多态性的试剂盒，其特征在于：还包括UNG酶(尿嘧啶-N-糖基化酶)、DNA聚合酶，dNTPs(脱氧核糖核苷三磷酸)、dUTP(脱氧尿苷三磷酸)以及PCR Buffer。
7.一种基于互补探针技术快速检测MTHFR基因多态性的方法，其特征在于：使用权利要求5或6所述的基于互补探针技术快速检测MTHFR基因多态性的试剂盒，包括以下步骤：
步骤1、获取待测样本的基因组DNA；
步骤2、配制反应体系；
在同一反应管中加入待测样本的基因组DNA、通用下游引物、C荧光标记引物、T荧光标记引物、互补探针、UNG酶(尿嘧啶-N-糖基化酶)、DNA聚合酶，dNTPs(脱氧核糖核苷三磷酸)、dUTP(脱氧尿苷三磷酸)以及PCR Buffer；
步骤3、PCR反应；
将配制好的反应体系在荧光实时定量PCR仪上进行反应；
步骤4、基因型判定；
PCR反应完成后进行待测样本MTHFR基因多态性的判定。
8.根据权利要求7所述的基于互补探针技术快速检测MTHFR基因多态性的方法，其特征在于：步骤2中以单管反应体系20μL计，反应管中加入通用下游引物，250～550nM；C荧光标记引物，125～250nM；T荧光标记引物，125～250nM；互补探针，500～700nM；UNG酶，0.2～0.4U；DNA聚合酶，0.5～1U；dNTPs，各150～250μM；dUTP，400～500μM；10×PCR Buffer，2.0μL；基因组DNA，1-100ng，去离子水补足体积20μL。
9.根据权利要求8所述的基于互补探针技术快速检测MTHFR基因多态性的方法，其特征在于，步骤3中PCR反应参数设置如下：50℃，3～5min；94～95℃，3～15min；94～95℃，5～25sec；60～62℃，15～30sec；50～53℃，15～30sec；35～40个循环；在50～53℃恒温过程中收集荧光。
10.权利要求1-4任一所述的基于互补探针技术快速检测MTHFR基因多态性的引物组在检测人MTHFR基因多态性中的应用。
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Title
PHILIPPE GOYETTE等: "Human methylenetetrahydrofolate reductase: isolation of eDNA, mapping and mutation identification", NATURE GENETICS *

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