CN103966332A

CN103966332A - 一组检测ctg重复序列的引物及其检测试剂盒

Info

Publication number: CN103966332A
Application number: CN201410211499.0A
Authority: CN
Inventors: 兰小平; 安宇; 吴柏林
Original assignee: Fudan University
Current assignee: Fudan University
Priority date: 2014-05-19
Filing date: 2014-05-19
Publication date: 2014-08-06
Anticipated expiration: 2034-05-19
Also published as: CN103966332B

Abstract

本发明涉及基因诊断技术领域，具体涉及一组检测CTG重复序列的引物及其检测试剂盒。一组检测CTG重复序列的引物，所述引物为一组寡核苷酸引物，其核苷酸序列分别为：SEQID NO.1，SEQID NO.2，SEQID NO.3和SEQID NO.4所示。本发明所示引物组及其试剂盒能对高拷贝CTG重复序列进行精确定量分析，是DM1分子诊断中目前最简单、快速、准确的检测方法。只需要一次PCR实验就可以检测出DM1患者CTG重复数的变异情况；从DNA样本开始8小时就可以出结果；检测技术流程简单，容易实现标准化。

Description

一组检测CTG重复序列的引物及其检测试剂盒

技术领域

本发明涉及基因诊断技术领域，具体涉及一组检测CTG重复序列的引物及其检测试剂盒。

背景技术

20世纪80年代后期，James和Wis等发现了微卫星DNA序列，又称短串连重复序列(Short Tandem Repeats，STR)或者简单重复序列(Simple SequenceRepeats,SSR),其每一单元长度在1-6bp之间[E R Moxon,C Wills.DNAmicrosatellites:Agents of evolution Sci A m,1999,280,94-100]。若这些短串连重复序列在基因组中过量表达，极有可能影响正常基因的表达。例如三核苷酸重复序列，主要有(CGG)n、(CCG)n、(CTG)n、(CAG)n等，它们干扰正常基因的表达从而引发一些遗传性神经紊乱疾病。

强直性肌营养不良1型(Myotonic Dystrophy Type1,DM)，它是一种常染色体显性遗传疾病[M Wojciechowska,A Bacolla,J E Larson et al.J.Biol.Chem.,2005,280,941-965]。其主要临床症状有肌肉直、肌肉萎缩、心脏传导异常、前额早秃、胰岛素抵抗、面部形态改变、头颈部皮肤出现上皮瘤、先天性智力低下以及马蹄内翻足等。患者间的病情和症状变化较大，发病年龄跨度也很大。根据临床表现和发病年龄将DM1分为三种类型：最严重的形式为先天性(CDM)，病人出生时出现肌张力低，呼吸窘迫，吸吮差和畸形的容貌，运动和智力发育迟缓，婴儿期死亡率高；最轻的形式见于中老年，以白内障，额部秃发为主要症状，少数有肌肉受累表现；成人型为最典型的病例，一般发病年龄在10-30岁，有高度可变的表现，可有上述任何症状和特征性面容。位于19q13.3区的强直性肌营养不良蛋白激酶(DMPK)基因3'非翻译区(3′-UTR)CTG重复数的异常扩增是DM1的分子遗传学病因，这种CTG重复数的异常扩增也称之为“动态突变”。DMPK基因3′-UTR的CTG重复数在正常人群中一般为3～35，且遵循孟德尔遗传规律，在世代传递中很少发生序列变化。而当重复数目在50～80时，就会在世代交替中出现频繁的扩增现象，CTG重复数大量扩增，甚至达到数千。假如重复数超过80时，这一序列的不稳定性明显增加，导致更高频率的跳跃式扩增，扩增后的重复数达到120～1250左右。

目前，DM1的基因检测方法主要有以下几种：基因组DNA Southern blot方法、PCR结合Southern blot方法、TP-PCR、SP-PCR、RNA-FISH，上述这些检测方法均存在缺点，如基因组DNA Southern blot方法操作繁琐，DNA需要量大，一般实验室难于实现；TP-PCR对于较大重复数不能进行精确定量分析，只能得出半定量结果；SP-PCR和RNA-FISH方法操作难度大、过程繁琐，不适合常规基因诊断。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是解决现有DM1的基因检测方法的缺陷，设计出一种检测CTG重复序列的引物及其检测试剂盒，能够用一次PCR反应快速准确的完成DM1的基因检测。

为解决的上述技术问题，本发明一组检测CTG重复序列的引物，所述引物为一组寡核苷酸引物，其核苷酸序列分别为：SEQID NO.1，SEQID NO.2，SEQIDNO.3和SEQID NO.4所示。

在一些实施例中，所述一组寡核苷酸引物中至少一个引物是经标记的引物。

在一些实施例中，所述标记为荧光标记，所示荧光标记为荧光素FL、N，N,N，N，-四甲基-6-羧基罗丹明、5-羧基荧光素、2,7-二甲氧基-4,5-二氯-6-羧基荧光素、6-羧基-X-罗丹明、CY3^TM、CY5^TM、四氯-荧光素、六氯-荧光素、NED^TM、6-FAM^TM、VIC^TM、PET^TM或LIZ^TM。

另一方面，本申请还公开了一种CTG重复序列的检测试剂盒，其包含一组寡核苷酸引物，其核苷酸序列分别为：SEQID NO.1，SEQID NO.2，SEQID NO.3和SEQID NO.4所示。

在一些实施例中，所述检测试剂盒包含正常人DNA对照品和DM症人DNA阳性对照品。

另一方面，本申请还公开了一种DM1的基因检测诊断方法，提取待检测个体的DNA样品；采用本发明所述检测试剂盒进行检测；计算待检测个体的CTG重复重复数。

本发明所示引物组及其试剂盒能对于高拷贝CTG重复序列进行精确定量分析，是DM1分子诊断中目前最简单、快速、准确的检测方法。只需要一次PCR实验就可以检测出DM1患者CTG重复数的变异情况；从DNA样本开始8小时就可以出结果；检测技术流程简单，容易实现标准化。

附图说明

图1一步TP-PCR检测方法示意图。

图2一步TP-PCR检测正常人的毛细电泳结果。

图3一步TP-PCR检测DM1患者与正常人毛细电泳比较结果。

图4检测结果验证的凝胶电泳和测序结果。

具体实施方式

在本说明书中所使用的多数词语具有本领域技术人员所理解的这些词的含义。在本说明书中明确定义的词语具有在本发明上下文中作为整体所提供的、并且如本领域技术人员所一般理解的含义。在词语或短语的本领域所理解的定义与该词语或短语的在本说明书中明确发明的定义有矛盾时，以说明书为准。本文所使用的标题仅仅为了方便，并且不理解为以任何方式限制。

如本文所使用的“DNA”指如本领域所理解的以其各种形式的脱氧核糖核酸，诸如基因组DNA、cDNA、分离的核酸分子、载体DNA以及染色体DNA。“核酸”是指任何形式的DNA或RNA(核糖核酸)。如本文所使用的术语“分离的核酸分子”是指已从其自然环境中移去的核酸分子(DNA或RNA)。分离的核酸分子的一些实例是在载体中含有的重组DNA分子、维持在异源宿主细胞中的重组DNA分子、部分或基本上纯化的核酸分子以及合成的DNA分子。“分离的”核酸可以没有这样的序列，即所述序列在该核酸衍生自其中的生物体的基因组DNA中天然地位于该核酸的侧翼(即，位于该核酸5’和3’端的序列)。此外，当通过重组技术产生时，“分离的”核酸分子(诸如cDNA分子)可以基本上没有其它细胞材料或培养基，或当化学合成时其基本上没有化学前体或其它化学物质。

“短串联重复”或“STR”基因座指含有短、重复序列元件的基因组DNA区域。所述重复的序列元件不限于但一般地为3至7个碱基对长度。每一序列元件在STR中至少重复一次，并且在本文中称为“重复单位”。术语STR还包括这样的基因组DNA区域，即其中超过一个重复单位串联地或具有中间碱基地重复，条件是至少一个序列串联地重复至少两次。

“多态性短串联重复基因座”指这样的STR基因座，其中在基因组DNA特定区域的重复序列元件数目(以及序列净长度)在等位基因间、以及在个体与个体之间不同。

如本文所使用的“等位基因阶梯”是指由扩增的来自基因座的等位基因组成的标准大小标记物。“等位基因”是指与DNA区段相关的遗传变异，即占据相同基因座的DNA序列的两个或多个备选形式之一。

“生物化学命名法”是指如在本文所使用的标准生物化学命名法，其中核苷酸碱基命名为腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、鸟嘌呤(G)和胞嘧啶(C)。相应的核苷酸例如为脱氧鸟苷-5，-三磷酸(dGTP)。

"DNA多态性”是指其中DNA序列中的两种或更多种不同核苷酸序列共存于同一杂种繁殖的群体中的情况。

“基因座”或“遗传基因座”是指染色体上的特定物理位置。基因座的等位基因位于同源染色体上的相同位置。

“基因座特异性引物”是指与所指明的基因座的部分或其互补链特异性杂交的引物，其至少用于该基因座的一个等位基因，并且在用于该扩增方法的条件下不与其它DNA序列有效地杂交。

“聚合酶链式反应”或“PCR”是指其中使用变性、与引物退火、以及用DNA聚合酶延伸的重复循环来约IO6倍或更多地扩增靶DNA序列拷贝数的技术。用于扩增核酸的PCR方法由美国专利号4,683,195和4,683,202所覆盖，其在此通过引用将其全文地并入本文，用于描述该方法。用于任意PCR的反应条件包括反应的化学成分以及它们的浓度、在反应循环中使用的温度、反应的循环数以及反应循环阶段的持续时间。

本文所使用的“扩增”是指用酶增加特定核苷酸序列量的方法。这一扩增不限于但一般通过PCR完成。如本文所使用的，“变性”是指将两条互补核苷酸链从退火状态分开。可通过许多因素，诸如例如破坏碱基配对相互作用的缓冲液的离子强度、温度或化学物质来诱导变性。

如本文所使用的，“退火”是指核苷酸链之间的特定相互作用，其中所述链基本上基于如通过Watson-Crick碱基配对所确定的链之间的互补性彼此结合。对于发生退火，不需要100％的互补性。如本文所使用的，“延伸”是指在引物寡核苷酸与靶核酸退火之后的扩增循环，其中聚合酶应用靶核酸作为复制模板实现引物延伸为适当大小的片段。

“引物”是指单链寡核苷酸或DNA片段，其与基因座的DNA链以此种方式杂交从而使得该引物的3’端可作为应用DNA聚合酶聚合并延伸的位点。“引物对”是指两条引物，其包含在待扩增的DNA序列的一端与单链杂交的引物1，以及与该待扩增的DNA序列的互补链的另一端杂交的引物2。“引物位点”是指引物与之杂交的靶DNA的区域。本文所用的术语“扩增引物”和“寡核苷酸引物”可互换使用

“遗传标记”一般是具有用于分析(诸如DNA分型)的目的性状的基因组DNA等位基因，其中个体基于它们DNA中的变异而区别。多数DNA分型方法被设计以检测和分析群体中已知以至少两种不同形式或等位基因出现的一个或更多个DNA标记区域的长度和/或序列差异。此类变异称为“多态性”，并且其中发生了此类变异的DNA的任何区域称为“多态性基因座”。进行DNA分型的一种可能方法包括结合PCR扩增技术(KB Mullis，美国专利号4,683,202)和长度变异多态性的分析。传统上PCR仅能可靠地用于扩增相对小的DNA片段，即仅能扩增3000个碱基长度以下的DNA片段(M.Ponce和L.Micol(1992)，NAR20(3)：623；R.Decorte等(1990)，DNA CELL BIOL.9(6):461469)。短串联重复(STR)、微卫星和可变数目串联重复(VNTR)是长度变异多态性的一些实例。含有微卫星或VNTR的DNA片段通常太长而不能通过PCR可靠地扩增。相反，含有约3至7个核苷酸的重复单位的STR足够短以在PCR应用中用作遗传标记，因为可以设计扩增方案以产生比可能来自DNA的其它可变长度区域更小的产物。

寡核苷酸引物可包含腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤和胞嘧啶，以及尿嘧啶、核苷类似物(例如，但不限于次黄嘌呤核苷、锁定核酸(LNA)、非核苷酸连接子、肽核酸(PNA)和phosporamidites以及含有或与化学部分缀合的核苷，其中所述化学部分诸如放射性核素(例如，32P和35S)、荧光分子、小沟结合物(MGB)、或本领域公知的任何其它核苷缀合物。

一般地，可化学合成寡核苷酸引物。在PCR优化中引物设计和选择是常规步骤。本领域普通技术人员可容易地设计用于扩增目的靶基因座的特异引物，或从本文列出的参考文献中获得引物集。所有的这些引物都在本发明公开的范围之内。

引物浓度的优化可在确定最终引物序列之前或之后进行，但是最经常在引物选择之后进行。一般地，增加任何特定基因座的引物的浓度会增加为该基因座产生的产物量。然而，引物浓度优化也是反复的过程。总之，特定引物集浓度的线性增加并不必然地等于相应基因座扩增产物产量的线性增加。有关基因座特异性引物更详细的描述，参见MJ Simons美国专利号5192，659，其通过引用而全文并入本文。

在多重反应中基因座扩增产物平衡还可能受到扩增方案的许多参数的影响，例如，诸如模板(样品DNA)输入量、所使用的扩增循环数、热循环方案的退火温度以及在循环步骤的的末尾包括或不包括额外的延伸步骤。在所有等位基因和基因座中扩增产物产量的绝对均匀平衡尽管在理论上是期望的，但一般无法在实践中实现。

可使用与随后的DNA扩增相容的任何样品制备方法制备用于本发明公开的方法的基因组DNA样品。许多此类方法是本领域技术人员公知的。一些实例是通过苯酚抽提的DNA纯化(J.Sambrook等(1989)，MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor,N.Y.,pp.9.14-9.19)、以及通过盐沉淀(S.Miller等(1988)，NUCL.ACIDS RES.16：1215)或Chelex(PS Walsh等(1991)，BIOTECHNIQUES10:506-513；C.T.Comey等(1994)，J.FORENSIC Sci.39：1254)的部分纯化，以及应用未处理的血的材料(J.Burckhardt(1994)，PCRMETH0DS AND APPLICATIONS3:239-243；RBE McCabe(1991)，PCR METHODSAND APPLICATIONS1:99-106；BY Nordvag(1992)，BIOTECHNIQUES12:4pp:490-492)。

当待应用本发明的方法进行分析的至少一个DNA样品是人类基因组DNA时，可从组织样品制备DNA，所述组织样品例如，诸如是血液、精液、阴道细胞、毛发、唾液、尿、骨、口腔样品、含有胎盘细胞或胎儿细胞的羊膜水、绒膜绒毛、和/或任意这些的混合物或其它组织的一种或更多种。

任选地，可在用于本发明公开的方法之前使用本领域技术人员公知的DNA定量的任何标准方法测量DNA浓度。此类定量方法例如包括如由J.Sambrook等(1989)描述的分光光度测量；或应用诸如由C.F.Brunk等(1979)，ANAL.BI0CHEM.92：497-500描述的测量技术的荧光测定方法。可通过比较DNA标准品与诸如由J.S.Waye等(1991)中描述的人特异性探针的杂交量测量DNA浓度。在扩增反应中使用太多的模板DNA可能产生可能不代表真实等位基因的扩增假象。

一旦制备了基因组DNA样品，可在本发明公开的多重扩增步骤中共扩增靶基因座。可以使用许多不同扩增方法中的任一种扩增该基因座，例如，诸如PCR(R.K.Saiki等(1985)，SCIENCE230:1350_1354)、基于转录的扩增(D.Y.Kwoh&T.J.Kwoh(1990),AMERICANB10TECHN0L0GY LABORATORY,1990年10月)以及链置换扩增(SDA)(GT Walker等(1992),PROC.NATL.ACAD.SCI.,USΑ.89:392-396)。

标准PCR的化学成分一般包括溶剂、DNA聚合酶、脱氧核糖核苷三磷酸(“dNTPs”)、寡核苷酸引物、二价金属离子、以及预期含有PCR扩增靶的DNA样品。一般可使用水作为PCR的溶剂，其一般包含缓冲剂和非缓冲盐诸如KC1。缓冲剂可以是本领域公知的任意缓冲剂，诸如，但不限于Tri s-HCl，并且可通过常规实验进行变化以最优化PCR结果。本领域普通技术人员能很容易地确定最佳的缓冲条件。可依赖于用于扩增的特定酶优化PCR缓冲液。

二价金属离子通常对于允许聚合酶有效工作是有利的。例如，镁离子是允许一些DNA聚合酶有效工作的一种离子。一般地，可将MgCl₂或MgSO₄加入到反应缓冲液中以提供最佳的镁离子浓度。最佳PCR扩增所需的镁离子浓度可能取决于所使用的特定引物集以及模板。通常经验地确定为达到最佳扩增所添加的镁盐量，并且是本领域的常规实践。一般地，对于最佳PCR的镁离子浓度可以在约1至约IOmM之间变化。在PCR中镁离子浓度的一般范围可以是约1.0至约4.0mM，在约2.5mM的中点周围变化。备选地，可使用二价离子锰，例如以二氧化锰(MnO₂)的形式，滴定至适于最佳聚合酶活性的浓度，这可通过本领域技术人员使用标准实验室方法而很容易地确定。

在扩增核酸分子中使用的构件模块dNTP—般可以以例如约40-200μM的脱氧腺苷三磷酸(“dATP”)、脱氧鸟苷三磷酸(“dGTP”)、脱氧胞苷三磷酸(“dCTP”)和脱氧胸苷三磷酸(“dTTP”)的每一种的浓度在标准PCR中提供。还可以使用其它dNTP，诸如脱氧尿苷三磷酸(“dUTP”)、dNTP类似物(例如，次黄嘌呤核苷)、以及缀合的dNTP，并且它们也由本文所使用的术语“dNTP”所包括。尽管使用约40-200μM浓度的每一种dNTP适于本发明公开的方法，但是超过约200μM每一dNTP的浓度将是有利的。因此，在这些公开的方法的一些实施方案中，每一dNTP的浓度一般至少约500μM并且可高达约2mM。在一些其它的实施方案中，每一dNTP的浓度为约0.5mM至约1mM。用于任意多重扩增的特定dNTP浓度可依据条件而变化，并且可通过本领域技术人员应用标准实验室方法经验地确定。

在PCR中使核苷酸三磷酸聚合为扩增产物的酶可以是任意DNA聚合酶。DNA聚合酶可以是例如本领域公知的任何耐热聚合酶。可用于本领域公开的一些聚合酶的实例是来自诸如源于水生栖热菌、嗜热栖热菌、海栖热袍菌、敏捷气热菌、风产液菌、闪烁古生球菌、热坚芽孢杆菌、生氢氧化碳嗜热菌、热自养甲烷杆菌ΔH、詹氏甲烷球菌、炽热甲烷嗜热菌、冰岛热棒菌、Pyrococcusendeavori、激烈热球菌、Pyrococcus horihoshii、Pyrococcus profundus、伍斯氏火球菌、隐蔽热网菌、嗜酸热硫化叶菌、硫磺矿硫化叶菌、热硫化氢热厌氧杆菌、速生热球菌、Thermococcus fumicolans、Thermococcusgorgonarius、Thermococcus kodakaraensis K0D1、Thermococcus litoralis、Thermococcus peptonophilus、90N-7热球菌、TY热球菌、斯氏热球菌、Thermococcus zilligii、嗜酸热原体、Thermusbrokianus、Thermuscaldophilus GK24、黄栖热菌、红色栖热菌或它们的突变体通过几种可能方法的任一种获得该酶；例如从来源细菌分离、通过重组DNA技术产生或购自商业途径。此类可商购的DNA聚合酶的一些实例包括AmpliTaq Gold？DNA聚合酶；DNA聚合酶；DNA聚合酶Stoffel片段；rTthDNA聚合酶；以及rTth DNA聚合酶。

PCR的其它已知成分可在本教导的范围内使用。此类组分的一些实例包括山梨醇、去垢剂(例如Triton X-100、Nonidet P-40(NP-40)、Tween-20)和破坏核苷酸对错配的试剂，例如，诸如二甲亚砜(DMSO)和氯化四甲铵(TMAC)以及尿嘧啶N-转葡糖基酶，或预防PCR的扩增子污染和/或在PCR步骤开始之前的PCR温育或预备期间产生不想要的产物的其它试剂。

PCR循环温度、循环数和它们的持续时间可以改变以优化特定的反应，这是常规实验内容。本领域普通技术人员将认识到以下是作为确定PCR各种参数的指引，并且也将认识到一个或更多个条件的变化在本发明的范围内。为PCR的三个阶段确定了温度和循环时间：变性、退火和延伸。一轮变性、退火和延伸称为一个“循环”。通常在足够高以允许DNA链分离、而又没高到破坏聚合酶活性的温度下进行变性。一般地，可在反应中使用耐热性聚合酶，其在升高的温度下不会变性而是保留了一定水平的活性。然而，如果在PCR的每一变性步骤之后补充它们的话，也可以使用热不稳定聚合酶。一般地，可在高于约90℃并低于约100℃进行变性。在一些实施方案中，可在约94-95℃进行变性。DNA变性一般地可进行至少约1至约30秒。在一些实施方案中，变性可进行约1至约15秒。在其它实施方案中，变性可进行达约1分钟或更久。除了DNA变性，对于某些聚合酶，诸如在变性温度下温育还可以活化该酶。因此，当使用这些聚合酶时，允许PCR的第一个变性步骤比随后的变性步骤更长是有利的。

在退火期间，寡核苷酸引物与靶DNA在它们的互补区域退火，并且一旦DNA聚合酶与引物-模板双链体结合，则通过DNA聚合酶大大地延伸。在常规PCR中，退火温度一般地可在或低于最不稳定的引物-模板双链体的解链点(Tm)，其中Tm可通过本领域技术人员公知的几种理论方法的任一种估计。

一般，在标准PCR中，退火温度可以是比最不稳定的引物-模板双链体的估计Tm低约5-10℃。退火时间可以是约30秒至约2分钟。退火期之后一般是延伸期。延伸可进行足够的时间量以允许聚合酶完成引物延伸至合适大小的扩增产物。

PCR的循环数(一个循环包括变性、退火和延伸)决定扩增的程度和随后的扩增产物量。PCR导致DNA分子的指数扩增。因此，理论上，在PCR的每一循环之后，产物的数量是前一个循环中存在的产物的两倍，直到PCR试剂耗竭并达到了不再产生其它扩增产物的平台期。一般地，可进行约20-30个循环的PCR，以达到这一平台期。更一般地，可进行约25-30个循环，尽管循环数没有特别地限制。

对于一些实施方案，在PCR最后一个循环的最后阶段之后在某些温度温育该反应是有利的。在一些实施方案中，可选择延长的延伸期。在其它实施方案中，可选择在低温(例如，约4℃)温育。

可使用各种方法评估从多重反应中获得的扩增产物混合物中扩增的STR基因座产物，包括例如，检测荧光标记的产物、检测放射性同位素标记的产物、扩增产物的银染、或使用DNA插入剂染料(诸如溴化乙锭(EtBr)和SYBR绿花菁染料)以显现双链扩增产物。适于与用于本发明的引物附着的荧光标记有很多，可商业获得，并且是本领域公知的。对于荧光分析，可以使用至少一个荧光标记的引物扩增每一基因座。

当在多重反应中使用引物的荧光标记时，通常可使用至少不同的标记来标记不同的引物。当使用标记物评估多重反应产物时，用于制备标记物的引物可以用与在该反应中扩增目的基因座的引物不同的标记来进行标记。由于自动荧光成像和分析的出现，可以达到多重扩增产物的更快的检测和分析。

在本发明公开的一些实施方案中，可以使用荧光团来标记STR基因座扩增中的至少一种引物，例如，通过共价结合至引物，因此产生荧光标记的引物。在一些实施方案中，可以使用不同的荧光团标记多重中用于不同靶基因座的引物，每一荧光团产生取决于该荧光团的发射波长的不同的着色产物。可在同一多重反应中使用这些不同地标记的引物，并且随后一起分析它们各自的扩增产物。可标记扩增特定基因座的引物对的正向或反向引物之一，尽管更通常标记正向引物。

以下是本领域公知的并且适于在本发明公开中使用的可能的荧光团的一些实例。该实例意在示例性并且不意味着是穷举的。一些可能的荧光团包括：荧光素(FL)，其在492nm处最大吸收并且在520nm处最大地发射；N，N,N，N，-四甲基_6_羧基罗丹明(TAMRA^TM)，其在555nm处最大吸收并且在580nm处最大地发射；5-羧基荧光素(5-FAM^TM)，其在495nm处最大吸收并且在525nm处最大地发射；2，7-二甲氧基-4，5-二氯_6_羧基荧光素(JOE^TM)，其在525nm处最大吸收并且在555nm处最大地发射；6-羧基-X-罗丹明(R0X^TM)，其在585nm处最大吸收并且在605nm处最大地发射；CY3^TM，其在552nm处最大吸收并且在570nm处最大地发射；CY5^TM，其在643nm处最大吸收并且在667nm处最大地发射；四氯-荧光素(TET^TM)，其在521nm处最大吸收并且在536nm处最大地发射；以及六氯-荧光素(HEX^TM)，其在535nm处最大吸收并且在556nm处最大地发射；NED^TM，其在546nm处最大吸收并且在575nm处最大地发射；6-FAM^TM，其在约520nm处最大地发射；VIC^TM，其在约550nm处最大地发射；PET^TM其在约590nm处最大地发射；以及LIZ^TM，其在约650nm处最大地发射。参见SRCoticone等，美国专利号6，780,588；IDENTMLER^TM PCR扩增试剂盒用户手册，PP.1-3,Applied Biosystems(2001)。注意到上面列举的发射和/或吸收波长是典型的并且仅可用于一般地指引作用；对于不同的应用和在不同的条件下真实的峰波长可能不同。

在筛选或非筛选介质上分析PCR产物。在本发明的一些实施方案中，例如，可通过电泳分析PCR产物；例如毛细管电泳，如在H.Wenz等(1998),GENOMERES.8:69-80；(还参见E.Buel等(1998)，J.FORENSIC SCI.43:⑴，第164-170页)中所描述的那样；或平板凝胶电泳，如在M.Christensen等(1999)，SCAND.J.CLIN.LAB.INVEST.59(3)：167-177中所描述；或变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(例如，参见J.Sambrook等(1989)，MOLECULAR CLONING:ALAB0RATORY MANUAL,SECOND EDITION,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor，N.Y.,第13.45-13.57页)。电泳中DNA片段的分离主要基于不同的片段大小。还可通过色谱法分析扩增产物，例如通过空间排阻色谱法(SEC)。

一旦分离了扩增的等位基因，则然后可显现并分析例如在凝胶或毛细管中的这些等位基因以及其它DNA(例如，DNA大小标记物或等位基因阶梯)。可应用本领域公知的许多技术中的任一种完成DNA的显现，例如诸如，银染或通过应用报告物，诸如如本文描述的放射性同位素和荧光染料，或化学发光剂以及与可检测底物联合的酶。通常，多重基因座的检测方法可通过荧光。例如参见JW Schumm等，PROCEEDINGS FROM THE EIGHTH INTERNATIONALSYMPOSIUM ONHUMAN IDENTIFICATION,1998Promega Corporation出版，第78-84页；Ε.Buel等(1998)，同上。当在多重反应中使用荧光标记的引物检测每一基因座时，可在扩增之后应用荧光测定检测仪检测标记的产物。参见上面的荧光染料的描述。

可通过与电泳中的大小标准品(诸如已知大小的DNA标记物)相比较而确定DNA样品中在每一基因座上存在的等位基因大小。用于评估含有两个或更多个多态性STR基因座的多重扩增的标记物还可包含基因座特异性等位基因阶梯或用于每一进行评估的基因座的等位基因阶梯的组合。例如参见C.Puers等(1993)，AM.J.HUM.GENET.53:953-958；C.Puers等(1994)，GENOMICS23:260_264。还参见美国专利号5,99,666；5,674,686；5,783,406，用于描述适于在检测STR基因座中使用的一些等位基因阶梯，以及其中公开的梯构建的一些方法。在构建了单个基因座的等位基因阶梯后，可在与扩增产物相同的时间电泳该梯。每一等位基因阶梯与来自相应基因座的等位基因共迁移。

还可使用内部泳道标准品来评估本发明的多重反应的产物，所述内部泳道标准品即配置以进行电泳的特定类型的大小标记物，例如作为扩增产物在相同的毛细管中。该内部泳道标准品可包含一系列的已知长度片段。还可用荧光染料标记该内部泳道标准品，其中所述荧光染料可与在扩增反应中的其它染料相区分。该泳道标准品可与经扩增的样品或大小标准品/等位基因阶梯混合，并且与任一进行电泳以比较在凝胶电泳不同泳道中或在毛细管电泳不同毛细管中的迁移。内部泳道标准品迁移的不同可用于指示分离介质性能的不同。这一不同的定量以及与等位基因阶梯的关联可提供在不同泳道或毛细管中电泳的扩增产物的校准，并且校正未知样品中等位基因的大小确定。

当使用荧光染料标记扩增产物时，可使用荧光检测仪器分析经电泳并分离的产物，所述仪器例如诸如是ABI310或3130x1遗传分析仪，或ABI377DNA测序仪(Applied Biosystems,Foster City,Calif.)；或HitachiII荧光扫描仪(Hitachi Software Engineering America,Ltd.,South San Francisco,Calif)。在本发明的各实施方案中，可通过与诸如ABI3130x1遗传分析仪(Applied Biosystems)的电泳设备联合的毛细管凝胶电泳方案分析PCR产物，并且可进行经电泳的扩增产物的等位基因分析，例如使用来自Applied Biosystems的ID Software v3.2。在其它实施方案中，可在例如约4.5％，29∶1的丙烯酰胺：双丙烯酰胺,8M尿素凝胶中电泳分离扩增产物，其中所述凝胶如为ABI377自动荧光DNA测序仪所制备的那样。

本发明的发明还涉及使用上述方法的试剂盒。在一些实施方案中，基础试剂盒可包括容器，其具有一个或更多个特异性引物。试剂盒还可任选地包含使用说明书。试剂盒还可包含其它任选的试剂盒成分，例如诸如以下中的一种或更多种：针对每一个特定基因座的等位基因阶梯、用于扩增的足量的酶、促进扩增的扩增缓冲剂、促进酶活性的二价阳离子溶液、在扩增期间用于链延伸的dNTP、用于制备用于电泳的扩增材料的上样溶液、作为模板对照的基因组DNA、保证材料如预期的那样在分离介质中迁移的大小标记物、以及教导用户以及限制使用中的误差的方案和手册。各试剂在试剂盒中的量也可以依据许多因素而不同，诸如该方法的最佳敏感性。提供用于手工应用的测试试剂盒或用自动化检测仪或分析仪的测试试剂盒在这些发明的范围之内。

以下结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例1、一步TP-PCR检测方法的建立

1.样本及方法

1.1样本来源

本实验中一步TP-PCR检测方法的建立采用8个已知DMPK基因型的样本，其中3个为DM1患者样本，其余5个为正常人样本。并过对1124个正常中国人样本和一个含有29个成员的DM1家系样本的检测对该方法进行了验证。

1.2一步TP-PCR实验设计

1.2.1引物设计

(1)引物设计方式见图1A

(2)引物序列：

DMPK-P4CAG(R):GGG CGT TCG TAA GGG TTG GC CAG CAG CAG CAG CAG

DMPK-P1(F):FAM-CGAACGGGGCTCGAAGGGTC

DMPK-P2(R)：AGTTTGCCCATCCACGTCAGG

DMPK-P3R:GGG CGT TCG TAA GGG TTG GC

TP-PCR引物筛选比较结果

1.2.2PCR实验体系及条件

(1)PCR实验体系

10μL的PCR扩增体系包括：2μL GC-Rich PCR buffer,0.05μLFastStart Taq DNA Polymerase(Roch),0.2μL primers mix,0.08μLDMPK-P4CAG(R),3μL10mM/L的dNTP，2.67μL of water,and2μL10ng/μl的DNA template.primers mix由10uM的P1F、P3R和P2R按7：5：2的比例混合而成。

(2)PCR扩增条件

CTG重复数目的计算

对于CTG重复数目在100个以内样本，其准确数目可以根据引物P1(F)/P2(R)产生片段的分子量减去98bp除以3得到，即图1中(predominantpeak-98)/3。同样可以通过计数毛细管电泳图上由引物P1F/P4CAG/P3R组成的TP-PCR扩增所产生的具有3碱基间隔的小峰的数目直接得到(图1，A:检测DMPK基因3'-UTR区CTG重复序列的引物定位。B和C：在使用AppliedBiosystems3130DNA分析仪毛细管电泳后插图电泳的。峰1和2表示通过引物P1F和P2R得到两个杂合子等位基因，其他峰代表带有与不同数量的CTG重复序列连续3BP-梯峰)，两种方法得到的结果可以相互验证，使结果更加准确。

2.实验结果

通过8个已知基因型样本初步建立了一步TP-PCR检测方法，8个已知基因型样本的一步法TP-PCR检测结果分别为13CTG/20CTG、5CTG/12CTG、13CTG/13CTG、5CTG/5CTG、5CTG/27CTG、15CTG/60CTG、5CTG/70CTG和13CTG/>240CTG(图2，A-D:13/20,5/12,13/13and5/5CTG重复基因型的4个正常对照的电泳结果。CTG重复数按下列公式计算:CTG重复数＝(peak1或peak2－98数量)/3or n＝f+4(f:TP-PCR-P1F/P4CAG/P3R片段大小))，这一结果同时得到了普通PCR和测序的验证(图3，A和B：2个分别包含60和70CTG重复的适度扩大CTG重复样品的电泳结果；C：正常对照组的电泳结果；D：包括240多个CTG重复等位基因且一个特定的峰值出现在终端位置的全突变样本的电泳结果和图4,A：在3.0％琼脂糖凝胶样品的电泳结果。M：DNA MARK；C：正常对照；P：病人；C1，C2，P1和P2：呈现2条带对应于正常或含有少量CTG2带重复(<100)的杂合子；C3，C4和P3：呈现1条带对应正常纯合子或含有高量CTG重复序列(>100)的杂合子1频带。B和C：正常杂合子和纯合子样品的测序分析的代表性的图像)。

实施例2、一步TP-PCR的进一步验证

正常人样本的检测

采用实施例1建立的一步TP-PCR检测法对1124个正常中国人样本的DMPK基因3`-UTR区的CTG重复数进行了检测。并且抽取10％的样本进行了测序验证。一步TP-PCR检测法没有出现检测失败的样本，而且结果与测序法得到的结果完全一致。

DM1家系样本的检测

采用一步TP-PCR法对一个含有29个成员的疑似DM1家系样本进行了检测，结果表明29个成员中有13人携带超过240CTG重复的等位基因，其余成员CTG重复数都在正常范围。这一结果与临床表型诊断和家系分析结果完全一致。

本发明的范围不受所述具体实施方案的限制，所述实施方案只作为阐明本发明各个方面的单个例子，本发明范围内还包括功能等同的方法和组分。实际上，除了本文所述的内容外，本领域技术人员参照上文的描述和附图可以容易地掌握对本发明的多种改进。所述改进也落入所附权利要求书的范围之内。上文提及的每篇参考文献皆全文列入本文作为参考。

Claims

1.一组检测CTG重复序列的引物，所述引物为一组寡核苷酸引物，其核苷酸序列分别为：SEQID NO.1，SEQID NO.2，SEQID NO.3和SEQID NO.4所示。

2.权利要求1所述引物，其特征在于所述一组寡核苷酸引物中至少一个引物是经标记的引物。

3.权利要求2所述引物，其特征在于所述标记为荧光标记。

4.如权利要求3所述引物，其特征在于所示荧光标记为荧光素FL、N，N,N，N，-四甲基-6-羧基罗丹明、5-羧基荧光素、2,7-二甲氧基-4,5-二氯-6-羧基荧光素、6-羧基-X-罗丹明、CY3^TM、CY5^TM、四氯-荧光素、六氯-荧光素、NED^TM、6-FAM^TM、VIC^TM、PET^TM或LIZ^TM。

5.如权利要求2所述引物，其特征在于所述经标记的引物，其核苷酸序列：SEQID NO.2所示。

6.一种CTG重复序列的检测试剂盒，其特征在于其包含一组寡核苷酸引物，其核苷酸序列分别为：SEQID NO.1，SEQID NO.2，SEQID NO.3和SEQIDNO.4所示。

7.如权利要求6所述检测试剂盒，其特征在于所述一组寡核苷酸引物中至少一个引物是经标记的引物。

8.如权利要求7所述检测试剂盒，其特征在于所述标记为荧光标记。

9.如权利要求8所述检测试剂盒，其特征在于所示荧光标记为荧光素FL、N，N,N，N，-四甲基-6-羧基罗丹明、5-羧基荧光素、2,7-二甲氧基-4,5-二氯-6-羧基荧光素、6-羧基-X-罗丹明、CY3^TM、CY5^TM、四氯-荧光素、六氯-荧光素、NED^TM、6-FAM^TM、VIC^TM、PET^TM或LIZ^TM。

10.如权利要求6所述检测试剂盒，其特征在于所述检测试剂盒包含正常人DNA对照品和DM1病人DNA阳性对照品。