JP7235064B2 - 測定方法及び測定システム - Google Patents

Description

本開示は、少なくとも２種類の微生物を測定する測定方法及び測定システムに関する。

従来、２種以上の遺伝子の有無を同時に検出する方法が知られている（例えば、特許文献１参照）。

特開２０１５－４２１５２号公報

微生物測定における利便性の向上が求められる。

本開示は、微生物測定における利便性を向上できる測定方法及び測定システムを提供することを目的とする。

幾つかの実施形態に係る測定方法は、検体試料に含まれる少なくとも２種類の微生物の存在量を定量的に測定する。前記測定方法は、前記検体試料の段階希釈及び分割を実行して第１試料を生成するステップと、前記第１試料に含まれる、前記微生物の核酸を増幅して第２試料を生成するステップと、前記各種類の微生物に対応づけられたプローブが固定されたスポットを備えるプローブアレイにおいて、前記第２試料のハイブリタイゼーションを実行するステップと、前記ハイブリタイゼーションを実行した前記スポットの発光に基づいて、前記微生物の種類を特定するとともに、前記微生物の存在量を最確数法によって定量的に測定するステップとを含む。このようにすることで、多種類の微生物が簡便に検出される。その結果、微生物測定における利便性が向上する。

一実施形態において、前記測定方法は、前記プローブアレイに固定されているプローブの種類に基づいて、前記第１試料に添加するプライマを設計するステップを更に含んでよい。このようにすることで、標的微生物が容易に変更され得る。その結果、微生物測定における利便性が向上する。

幾つかの実施形態に係る測定システムは、検体試料に含まれる少なくとも２種類の微生物の存在量を定量的に測定する。前記測定システムは、前処理装置と、測定装置とを備える。前記前処理装置は、前記検体試料の段階希釈及び分割を実行して第１試料を生成し、前記第１試料に含まれる、前記微生物の核酸を増幅して第２試料を生成し、前記各種類の微生物に固有の標的核酸の相補配列を有するプローブが固定されたスポットを備えるプローブアレイにおいて、前記第２試料のハイブリタイゼーションを実行する。前記測定装置は、前記ハイブリタイゼーションを実行した前記スポットの発光に基づいて、前記微生物の種類を特定するとともに、前記微生物の存在量を最確数法によって定量的に測定する。このようにすることで、多種類の微生物が簡便に検出される。その結果、微生物測定における利便性が向上する。

本開示に係る測定方法及び測定システムによれば、微生物測定における利便性が向上する。

比較例に係る、同時多種ＰＣＲ増幅法の前工程の手順を示すフローチャートである。 比較例に係る、検体試料中の標的核酸を定量的に測定する工程の手順を示すフローチャートである。 比較例に係る、定量マルチプレックス核酸増幅反応を行い検体試料中の標的核酸を定量するための測定工程の手順を示すフローチャートである。 比較例に係る、デジタルＰＣＲ増幅反応を実行して検体試料中の標的核酸を定量的に測定する工程の手順を示すフローチャートである。 一実施形態に係る測定方法において、検体試料中に存在する微生物を定量的に測定するための前工程の手順例を示すフローチャートである。 一実施形態に係る測定方法において、検体試料中に存在する微生物を定量的に測定する工程の手順例を示すフローチャートである。 一実施形態に係る測定システムに含まれる測定装置の構成例を示す模式図である。 プローブに標的核酸がハイブリタイゼーションされているプローブアレイの構成例を示す模式図である。 プローブアレイにおいて発光スポットと非発光スポットとが判別される構成例を示す模式図である。 一実施形態に係る測定システムに含まれる前処理装置の構成例を示す模式図である。

以下、本開示に係る実施形態が図面を参照して説明される。本開示の一実施形態に係る測定方法は、検体試料に含まれる少なくとも２種類の微生物の存在量を定量的に測定する方法である。

（比較例）
まず、本実施形態に係る測定方法に対する比較例が説明される。

＜コロニー係数法及びＭＰＮ（Most Probable Number）法＞
検体試料に含まれる標的微生物を定量的に測定できる方法の１つとして、コロニー計数法が採用され得る。コロニー計数法において、標的微生物が形成するコロニーが目視でカウントされる。コロニー計数法の利点は、微生物コロニーの識別及びカウントを目視で簡便に実行できる点にある。しかし、コロニー計数法において検出できる標的微生物は、コロニー形成能を有する微生物に限定される。また、検体試料に含まれる微生物数が少ない場合に、目視による測定結果が大きく変動するという課題がある。

また、他の方法として、最確数法が採用され得る。最確数法は、ＭＰＮ法とも称される。ＭＰＮ法は、検体試料に含まれる微生物数が少ない場合に用いられる。ＭＰＮ法は、複数に分割した検体試料の培養結果を統計的な確率論として算出した最確数表と照合することによって、検体試料に含まれる微生物量を推算する方法である。

コロニー計数法及びＭＰＮ法において、微生物を測定するために、微生物の増殖能を利用して微生物を可視化することが必要である。したがって、標的微生物の培養法が確立されていない場合、又は、標的微生物が培養できない微生物（ＶＢＮＣ：Viable But Non-Culturable）である場合において、コロニー計数法及びＭＰＮ法によって標的微生物を測定することは難しい。

また、環境から採取した検体試料に含まれる微生物は、環境ストレス等に起因して損傷していることがある。微生物の損傷によって、微生物の元来の増殖能の損失又は抑制が起こり得る。上述したように微生物の培養を必要とする方法で損傷した微生物の量の測定する場合、微生物数が過小評価されるおそれがある。

さらに、複数の標的微生物を測定するために培養する場合、標的微生物毎に適した培地を用いるために、標的微生物の種類の数だけ検体試料を分割する必要がある。その結果、標的微生物の種類が増加するほど測定作業が増加する。また、検体試料が少量である場合、分割することが難しくなる。

＜ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）法＞
他に、検体試料中の微生物数を分子生物学的手法によって定量的に測定する方法が採用され得る。具体的には、標的微生物に含まれる核酸等の生体分子を分子生物学的手法によって定量的に測定することによって、微生物数がカウントされ得る。分子生物学的手法として、例えば、ＭＰＮ－ＰＣＲ法、定量ＰＣＲ法（quantitative PCR：ｑＰＣＲ）、デジタルＰＣＲ法、又は、ＭＦｑＰＣＲ法（Micro-Fluidic qPCR）等が採用され得る。これらの方法は、ＰＣＲ法と総称される核酸増幅法を応用した方法である。ＰＣＲ法は、一対のプライマと呼ばれる標的核酸を増幅させるために必要な反応を開始するためのオリゴヌクレオチド（短鎖核酸）、鋳型核酸鎖を伸長させるのに必要なポリメラーゼと呼ばれる耐熱性酵素、又は、核酸鎖伸長の材料となるｄＮＴＰ（デオキシリボ核酸）の塩基類を必要とする。ＰＣＲ法において、標的核酸を増幅させるために標的核酸毎に特異性を有した一対のプライマが必要とされる。上述したＭＰＮ法と同様に、複数の種類の標的微生物を検出する場合、標的微生物毎にＰＣＲ反応を実施する必要がある。その結果、増幅させる核酸の種類の数が増加するほど、操作数及び測定コストが増大する。

また、プライマを相互に干渉することなく設計して一度の反応で複数の標的核酸を増幅させる手法として、同時多種ＰＣＲ増幅法（multiplex-PCR）が採用され得る。同時多種ＰＣＲ増幅法によって増幅した核酸の測定によって微生物数がカウントされ得る。

＜＜プライマセットの構築手順＞＞
図１に、ＭＰＮ－ＰＣＲ法をベースとして複数核酸を同時検出するための同時多種ＰＣＲ増幅法を実施するために必要となる前工程としてプライマセットを構築する手順が示される。まず、標的微生物が有している遺伝子又はその他の核酸の中から、標的微生物に特有の核酸が標的核酸として選定される（ステップＳ９０１）。次に、ステップＳ９０１の手順で選定された標的核酸の核酸配列が取得される（ステップＳ９０２）。標的核酸の核酸配列は、公開されている核酸配列データベース等に含まれる核酸配列から取得されてよいし、核酸シーケンス等の手法によって取得されてもよい。

次に、ステップＳ９０２の手順で取得された標的核酸配列に基づいて、標的核酸を増幅させるために必要なプライマ配列が設計される（ステップＳ９０３）。プライマ配列は、プライマ長がフォワードプライマとリバースプライマとでＴｍ値が同等になるように設計される。Ｔｍ値は、融解温度とも称され、プライマがターゲット配列と５０％の割合で２本鎖を形成する温度を表す。また、設計されたプライマによって標的核酸を効率的に増幅させることができるか確認するために、ＰＣＲ増幅反応が実行される。ＰＣＲ増幅反応は、公知の情報に基づいて反応に必要となる鋳型核酸、塩基類及び伸長酵素、並びに、酵素反応に必要となる塩類を添加した緩衝液中で実行される。また、ＰＣＲ増幅反応は、アニーリング、伸長、及び、熱変性解離の３つのステップで構成される、使用する酵素に適した温度サイクルで制御される。温度サイクルは、伸長と熱変性解離とを同一の温度で実行する２つのステップで構成されてもよい。

ＰＣＲ増幅反応に続いて、ゲル電気泳動等によってＰＣＲ増幅産物が生成されたか確認するために、確認項目が満たされたかが判定される（ステップＳ９０４）。確認項目として、増幅量、増幅長、非特異産物の増幅の有無、又は、プライマダイマの生成の有無等が挙げられる。確認項目が条件を満たさない場合、プライマの改良又は再設計が実行される。そして、改良又は再設計されたプライマが標的核酸を増幅させることができるか確認する。確認項目が条件を満たすように設計されたプライマが、個別単独プライマとして決定される。

また、複数の種類の核酸を同時に検出しようとする場合、各種類の核酸について個別単独プライマが構築される必要がある。全ての標的核酸について個別単独プライマを構築した後、各種類の核酸について構築した個別単独プライマを混合したプライマセットにおいてＰＣＲ増幅が実行される。そして、プライマセットによるＰＣＲ増幅でＰＣＲ増幅産物が生成されたか確認するために、確認項目が満たされたが判定される。プライマセットによるＰＣＲ増幅の確認項目は、個別単独プライマによるＰＣＲ増幅の確認項目と同じであってよい。

プライマセットにおけるＰＣＲ増幅で、例えば、非特異産物が生じること等によって確認項目が条件を満たさない場合（ステップＳ９０４：ＮＯ）、ステップＳ９０３の手順に戻って、個別単独プライマが再設計される。確認項目が条件を満たした場合（ステップＳ９０４：ＹＥＳ）、非特異産物が生じないプライマセットの構築が完了する（ステップＳ９０５）。微生物種が多くステップＳ９０４において確認項目の条件を満たすプライマ設計が不可能と判断した場合には、ステップＳ９０１の手順に戻ることもある。

＜＜標的核酸の定量的な測定＞＞
次に、前工程で構築されたプライマセットを用いて、核酸増幅反応を行い、検体試料中の標的核酸をＭＰＮ－ＰＣＲ法によって定量的に測定する工程の手順が図２に示される。

まず、検体試料を用いる最確数表に基づいて、ＰＣＲ増幅が確認できる範囲で、検体試料が適宜希釈される（ステップＳ９１１）。本例において、検体試料は、３段階に希釈される。つまり、検体試料は、３種類の濃度で希釈される。次に、同濃度に希釈した試料が最確数表に基づいて分割される（ステップＳ９１２）。本例において、希釈した試料は、３つに分割される。

次に、分割した試料にＰＣＲ増幅反応に必要となる耐熱性酵素、ヌクレオチド、及び、前工程で構築されたプライマセットを添加することによって反応液が調製される（ステップＳ９１３）。標的とする微生物の種類に応じて、鋳型となる標的核酸を抽出するステップが追加されてもよい。鋳型となる標的核酸を抽出するステップは、ステップＳ９１１又はＳ９１２の前に追加されてもよい。

次に、反応液が添加された試料に対して、プライマに好適な条件下でＰＣＲ増幅反応が実行される（ステップＳ９１４）。ＰＣＲ増幅反応は、適切な温度サイクルで制御される。次に、増幅反応を実行した試料について、ＰＣＲ増幅産物が生成された試料の数をカウントする（ステップＳ９１５）。確認は、ゲル電気泳動等によって実行されてよい。次に、ＰＣＲ増幅産物の生成が確認された試料の数を最確数表と照合して、照合結果に基づいて、検体試料に含まれる微生物量が推定される（ステップＳ９１６）。

以上述べてきたように、ＭＰＮ－ＰＣＲ法に基づいて検体試料に含まれる微生物量が推定される。他に、ｑＰＣＲ法に基づいて、検体試料に含まれる微生物量が推定される。ｑＰＣＲ法に基づいて複数核酸が同時に定量的に測定される場合においても、ＭＰＮ－ＰＣＲ法と同様に、プライマセットが必要とされる。ただし、ｑＰＣＲ法で用いられるプライマセットは、ＭＰＮ－ＰＣＲ法で用いられるプライマセットよりも、厳密に非特異反応を生じないように構築される必要がある。また、インターカレータ（非特異的に２本鎖核酸を染色する蛍光試薬）又は蛍光核酸プローブ（ＴａｑＭａｎプローブとも称される。）を用いる定量核酸増幅反応において、少量の非特異増幅産物又はプライマダイマが生成され得る。これらの生成は、非特異的な蛍光量の増大を誘引し、標的核酸の推算に大きな影響を及ぼす。その結果、測定の不確かさが増大する。

＜＜マルチプレックス核酸増幅反応による標的核酸の測定＞＞
次に、定量マルチプレックス核酸増幅反応を行い検体試料中の標的核酸を定量するための測定工程における手順が図３に示される。

定量マルチプレックス増幅反応において、検体試料に増幅反応に必要となる反応液が添加される（ステップＳ９２１）。ステップＳ９２１の手順の前に、ＭＰＮ－ＰＣＲ法と同様に検体試料から標的とする核酸を抽出する工程が追加されてもよい。反応液として、図２のステップＳ９１３で用いられた反応液と同様の反応液が添加されるとする。さらに、定量増幅反応を実行するために、反応の進行をモニタリングするために必要となる試薬が追加される必要がある。モニタリングのための試薬として、インターカレータ又は蛍光核酸プローブ等の既知の方法で用いられる試薬が適用されてよい。

ステップＳ９２１の手順における検体試料に対する反応液及び試薬の添加の工程と並行して、標的核酸濃度を推算する際に必要となる検量線作成用の標準核酸試料に反応液が添加される（ステップＳ９２２）。本標準核酸試料は、検体試料と同様の操作で処理されるが、検体試料と別の反応系で反応させる必要がある。

ステップＳ９２１及びＳ９２２の手順で調製された反応液について、図２のステップＳ９１４の手順と同様に増幅反応が実行される（ステップＳ９２３）。定量増幅反応の実行に際して、１回の温度サイクルが終了する毎に蛍光強度を測定できる機器が用いられる必要がある。次に、ステップＳ９２３で実行した反応により得られた標準核酸の測定結果に基づいて、核酸濃度算定のための検量線が作成される（ステップＳ９２４）。また、検体試料の測定結果に基づいて、Ｃｑ値が算出される。Ｃｑ値は、ＰＣＲ増幅産物がある一定量（閾値）に達したときのサイクル数を表す。次に、ステップＳ９２４の手順で作成された検量線と算出されたＣｑ値とに基づいて、検体試料中に存在していた微生物量が算出される（ステップＳ９２５）。

＜＜デジタルＰＣＲ法における測定手順＞＞
デジタルＰＣＲ法をベースとして複数核酸を同時検出するための前工程において、ＭＰＮ－ＰＣＲ法と同様に、図１のステップＳ９０１～Ｓ９０５の手順を実行することによって個別単独プライマを構築することが必要となる。同時多種類増幅を実行するデジタルＰＣＲにおいても、定量核酸増幅法と同様に非特異産物の生成が測定結果に大きく影響するので、非特異産物の生成がないプライマセットが構築される必要がある。

図４に、デジタルＰＣＲ増幅反応を実行して検体試料中の標的核酸を定量的に測定する工程の手順が示される。まず、検体試料が調製される（ステップＳ９３１）。検体試料の調製は、図２のステップＳ９１１～Ｓ９１３の手順と同様の手順で実行される。

デジタルＰＣＲ法において、次に、ステップＳ９１３の手順で調製された反応液を用いたドロップレットが調製される（ステップＳ９３２）。ドロップレットは、水溶液である反応液を、水溶液と混合しないオイル等に分散して生成した微量液滴である。ドロップレットは、理論的に検体試料から抽出した核酸が１分子だけ含まれるように調製される。

次に、ドロップレットについて増幅反応が実行される（ステップＳ９３３）。増幅反応は、図２のステップＳ９１４の手順と同様の手順で実行される。デジタルＰＣＲにおいても、定量核酸増幅法と同様に反応の進行を確認するためのインターカレータ等の蛍光試薬が添加される。

次に、増幅反応後に各ドロップレットの蛍光量が測定される（ステップＳ９３４）。そして、蛍光量の測定結果に基づいて検体試料に含まれる微生物量が算出される（ステップＳ９３５）。蛍光量の増大が認められるドロップレットの数量は、検体試料に存在していた標的核酸の数量に等しくなることに基づいて、検体試料に含まれていた微生物量が算出される。なお、ドロップレットの数量がデジタルでカウント可能であることから、デジタルＰＣＲと称される。

＜比較例のまとめ＞
以上述べてきたように、検体試料に含まれる微生物量を定量的に測定する方法の比較例として、種々の方法が考えられる。各種の方法は、以下の問題点を有する。

コロニー計数法において、測定対象となる標的微生物が培養できるものに限定される。培養できない微生物はコロニーとして識別できないため適用外となる。標的微生物が検体試料中に少量存在する場合、測定精度が低い。試料全てをコロニー計数法に供することができない。よって、測定結果はサンプリング確率に依存する。不特定の標的微生物が測定対象となる。つまり、菌種の判別が同時に実行されない。ある特定の微生物種だけを特異的に培養することができる培地は限定される。よって、通常、培養スペクトルの広い培地を使用する必要がある。培養に基づく方法のため測定に要する時間が長い。例えば、増殖の遅い標的微生物の場合、測定に要する期間が２週間になることもある。培養速度は、温度、培地成分及び酸素供給等の培養条件に大きく依存する。よって、画一的な条件における培養が困難である。標的微生物毎に培養条件が変更される必要がある。

ＭＰＮ法において、測定対象となる微生物が培養できるものに限定される。不特定の標的微生物が測定対象となる。培養に基づく方法のため測定に要する時間が長い。例えば、増殖の遅い標的微生物の場合、測定に要する期間が２週間になることもある。ＭＰＮ法は上述したコロニー計数法とほぼ同様の培養法に基づく。よって、ＭＰＮ法の問題点はコロニー計数法の問題点に準ずる。段階希釈が必要である。よって、培養本数が多くなる。その結果、手間及びコストが増大する。

ＭＰＮ－ＰＣＲ法（multi-MPN PCR法）において、段階希釈が必要とされる。よって、反応数が多くなる。その結果、手間及びコストが増大する。３段階希釈と３分割が最低減必要となる。よって、少なくとも９反応が実行される必要がある。標的微生物数が例えば５種類程度に限定される。電気泳動でＰＣＲ増幅反応を確認するために、ゲル濃度に基づいて増幅長が調整される必要がある。一方で、増幅長が大きく異なる場合、ＰＣＲ増幅効率が影響を受ける。よって、増幅長が近似していることが望ましい。これらの制限によって、同時に測定対象とすることができる標的微生物数が限定される。プライマセットを構築した後からの標的微生物の追加に要する手間が掛かる。追加する標的微生物に対して、個別単独プライマが構築される必要がある。そして、既に構築されているプライマセットに新たに追加する標的微生物について構築された個別単独プライマが追加される。新たな個別単独プライマが追加されたプライマセットについて、増幅反応の確認が実行される。この確認において不具合が生じた場合、個別単独プライマの構築からやり直す必要がある。標的微生物の増大に伴い、非特異産物の生成確率が増大する。よって、プライマセットの構築に多大な時間及び手間が必要となる。また、好適なプライマセットを構築できない事態が生じ得る。この場合、図１の手順の最初からやり直す必要が生じ得る。

ｑＰＣＲ法（real-time PCR法）において、標的微生物数は、蛍光波長に基づく制限で例えば６種類程度に限定される。反応サイクル毎に増幅が確認される必要がある。非特異ＰＣＲ増幅産物が生じないようにプライマを設計することが求められる。検量用標準サンプルが同時に反応に供される必要がある。これによって、反応数が多くなる。例えば、５菌種の場合、５つの検体試料と、５つの標準サンプルとのそれぞれを組み合わせた２５通りの反応が必要となる。プライマセットを構築した後で標的微生物を追加する場合、多大な手間及びコストが必要となる。

ｄｄＰＣＲ法（デジタルＰＣＲ法）において、標的微生物数が例えば４種類までに限定される。ドロップレットの作成を含む前処理工程が煩雑で手間が掛かる。非特異ＰＣＲ増幅産物が生じないようにプライマを設計することが求められる。プライマセットを構築した後で標的微生物を追加する場合、多大な手間及びコストが必要となる。測定装置の価格及びランニングコストが高い。

ＭＦｑＰＣＲ法において、標的微生物数が例えば１２種類までに限定される。測定装置の価格及びランニングコストが格段に高い。

以上述べてきたように、比較例に係る方法は、種々の問題点を有する。上述してきた問題点に鑑みて、以下、本開示に係る測定方法が説明される。

本開示の一実施形態に係る測定方法において、核酸増幅に必要となるプライマが容易に設計される。同時に多種類の微生物が定量的に測定される。１２種類より多い種類の標的微生物が同時に定量的に測定される。多種類の標的微生物を同時に定量的に測定する方法のコストが低減される。標的微生物数が増えた場合でも、検査コストが増大しない。無菌操作等の専門性を要求される作業を実行する必要がない。つまり、操作性に優れた検査手法が提供される。バイオプロセス又は生産工程管理にフィードバックが間に合う程度に短時間で測定結果を出力できる。培養できない微生物又は損傷を受けて増殖能が失われている微生物を定量的に測定できる。標的微生物の特定と、その定量的な測定とが同時に実行される。標的微生物の追加が容易に実行できる。

（測定方法の手順例）
本開示の一実施形態に係る測定方法は、図５及び図６に例示されるフローチャートの手順として実行される。まず、図５を参照して、検体試料中に存在する微生物を定量的に測定するための前工程が説明される。

前工程において、標的微生物を特定して測定するための核酸配列が選定され、取得される（ステップＳ１）。具体的には、標的とする全ての微生物種において各微生物を識別できる核酸種が選定される。標的とする核酸種として、一般的にゲノムＤＮＡが用いられる。しかし、標的とする核酸種は、遺伝子に限られず、標的とする微生物を識別できるものであればよく、各種のＲＮＡ又はミトコンドリアＤＮＡ等であってもよい。核酸種は、公知となっている情報から選定されてもよいし、独自に標的微生物の核酸配列を既存の核酸シーケンス法を用いて入手した核酸配列情報から選定されてもよい。また、核酸配列は、核酸配列データベース又は独自にシーケンスした標的核酸の核酸配列情報に基づいて取得されてよい。

次に、ステップＳ１の手順で選定され取得された核酸配列に基づいて、標的核酸を増幅させるためのプライマが設計される（ステップＳ２）。具体的には、各標的微生物を識別するための標的核酸配列に基づいて、ＰＣＲ増幅反応に用いるプライマが設計される。プライマは、ＰＣＲ増幅産物長が６０ｂｐから１ｋｂｐまでになるように設計されてよい。さらに、各プライマのアニーリング温度は、±５℃以内になるように設計されてよい。

次に、ステップＳ２の手順で設計されたプライマについて、標的核酸を増幅できることを確認するための確認項目が満たされるかが判定される（ステップＳ３）。具体的には、設計されたプライマによって標的核酸を効率的に増幅させることができるか確認するために、ＰＣＲ増幅反応が実行される。ＰＣＲ増幅反応は、公知の情報に基づいて反応に必要となる鋳型核酸、塩基類及び伸長酵素、並びに、酵素反応に必要となる塩類を添加した緩衝液中で実行される。また、ＰＣＲ増幅反応は、アニーリング、伸長、及び、熱変性解離の３つのステップで構成される、使用する酵素に適した温度サイクルで制御される。温度サイクルは、伸長と熱変性解離とを同一の温度で実行する２つのステップで構成されてもよい。ＰＣＲ増幅反応に続いて、ゲル電気泳動等によってＰＣＲ増幅産物が生成されたか確認される。確認項目として、増幅量、増幅長、非特異産物の増幅の有無、又は、プライマダイマの生成の有無等が挙げられる。確認項目が条件を満たさない場合、プライマの改良又は再設計が実行される。そして、改良又は再設計されたプライマが標的核酸を増幅させることができるかが確認される。

個別のプライマについて確認が実行される場合、確認項目が条件を満たすように設計されたプライマが、個別単独プライマとして決定される。さらに、複数の種類の核酸を同時に検出しようとする場合、各種類の核酸について個別単独プライマが構築された上で、各種類の核酸について構築した個別単独プライマを混合したプライマセットにおいて、確認項目が条件を満たすかが確認される。プライマセットによるＰＣＲ増幅の確認項目は、個別単独プライマによるＰＣＲ増幅の確認項目と同じであってよい。

プライマセットにおけるＰＣＲ増幅で、例えば、非特異産物が生じること等によって確認項目が条件を満たさない場合（ステップＳ３：ＮＯ）、ステップＳ２の手順に戻って、個別単独プライマが再設計又は改良される。具体的には、標的核酸の増幅が確認できない場合、又は、増幅性能が著しく低い場合において、確認項目が条件を満たさないと判定される。個別のプライマについて確認項目が条件を満たさない場合、条件を満たさないプライマが再設計又は改良される。各個別単独プライマについて確認項目が条件を満たした場合、各個別単独プライマを混合したプライマセットについて確認が実行される。プライマセットについて確認項目が条件を満たさない場合、各個別単独プライマの全部又は一部が再設計又は改良される。

確認項目が条件を満たした場合（ステップＳ２：ＹＥＳ）、非特異産物が生じないプライマセットの構築が完了する（ステップＳ４）。プライマセットは、１種類の標的核酸に対して１つのプライマが対応するように構築されてもよい。プライマセットは、複数種類の標的核酸に対して共通の１つのプライマが対応するように構築されてもよい。

ここで、比較例として説明したマルチプレックスＰＣＲが実行される場合、ステップＳ１～Ｓ４の手順で構築されたプライマセットに対して、同時多増幅反応を実行し、プライマダイマの生成と非特異産物の生成がないこと、又は、後工程に影響を及ぼさないことが確認される必要がある。

これに対して、本実施形態に係る方法において、増幅した核酸を識別するために核酸プローブアレイが用いられていることによって、マルチプレックスＰＣＲで必要とされる確認の手順が省略される。核酸プローブアレイは、一般的にＤＮＡアレイと称される核酸検出用の測定デバイスであり、固相上に標的核酸プローブと相補的な配列を有する標的核酸捕捉プローブを標的核酸毎に識別可能であるように配置した核酸測定用のデバイスである。固定する核酸プローブとして天然に存在するＤＮＡに相補的な核酸配列を有する人工的に合成されたＤＮＡが用いられる。本開示に係る測定方法において、ＤＮＡ以外にも、核酸プローブとして、人工的に作出されたＧＮＡ（Glycol Nucleic Acid）、ＬＮＡ（Locked Nucleic Acid）、ＢＮＡ（Bridged Nucleic Acid）、ＰＮＡ（Peptide Nucleic Acid）又はＴＮＡ（Threose Nucleic Acid）等が用いられてよい。

次に、図６を参照して、検体試料中に存在する微生物を定量的に測定する工程が説明される。

まず、測定対象となる検体試料が少なくとも３段階以上に段階希釈される（ステップＳ１１）。次に、段階希釈された検体試料が少なくとも３つ以上に分割される（ステップＳ１２）。次に、分割した試料に、ＰＣＲ増幅反応に必要となる核酸伸長酵素、４種の塩基、及び、図５のステップＳ１～Ｓ４の手順で構築されたプライマセット、並びに、緩衝剤を添加することによって、反応液が調製される（ステップＳ１３）。緩衝剤は、核酸伸長酵素の活性を高めることによって、反応液のｐＨを保持するように添加される。ステップＳ１３の手順において反応液が添加される前に、既存の微生物からの核酸抽出法を適用して鋳型となる核酸が抽出されてもよい。さらに、ステップＳ１１の手順の前に、核酸が抽出されてもよい。分割した試料又は反応液は、第１試料とも称される。

次に、ステップＳ１３の手順で調製された反応液がＰＣＲ増幅反応に供される（ステップＳ１４）。ＰＣＲ増幅反応が実行された後の反応液は、第２試料とも称される。ＰＣＲ増幅反応は、サーマルサイクラーを用いて実行されてよい。ＰＣＲ増幅反応は、フォワードプライマとリバースプライマとを１対１の割合で添加する一般的なＰＣＲ増幅反応として実行されてよい。また、ＰＣＲ増幅反応は、後述するステップＳ１５の手順において実行されるハイブリダイゼーション反応の効率を増大させる目的、又は、ハイブリダイゼーション反応の前に実行される１本鎖化工程を省略する目的で、非対称ＰＣＲ反応を適用してもよい。非対称ＰＣＲ反応は、フォワードプライマとリバースプライマとの比率を変える手法である。

上述してきた説明において、ＰＣＲ反応が核酸増幅手法の一例として用いられてきた。しかし、核酸増幅反応として、ＰＣＲ法に限定されず、ＮＡＴ（Nucleic acid Amplification Test）、ＴＲＣ（Transcription-Reverse transcription Concerted reaction）法、ＬＡＭＰ（Loop-Mediated Isothermal Amplification）法、ＲＣＡ（rolling circle amplification）法、ＳＤＡ（Strand Displacement Amplification）法、ＮＡＳＢＡ（(Nucleic Acid Sequence-Based Amplification)法、ＬＣＲ（Ligase Chain Reaction）法、ＴＭＡ（Transcription Mediated Amplification）法，ＳｍａｒｔＡｍｐ（Smart Amplification Process）法、又はＩＣＡＮ（Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids）法等の既知の核酸増幅手法が適用されてもよい。

次に、ステップＳ１４の手順で増幅された核酸と、核酸プローブアレイとの反応が実行される（ステップＳ１５）。核酸プローブアレイは、固相表面に測定対象となる微生物に固有の標的核酸の相補配列を有したプローブを固定したデバイスである。核酸プローブを固定する固相表面は、一般的に平板基板として構成されるが、これに限られない。固相表面は、固体であって各プローブを分離して識別できるように固定できるものであればよく、例えば粒子又は糸状のストリングス等であってよい。また、平板基板は、一般的にガラスで構成されるが、これに限られず、金属、合成樹脂、又は、濾紙等の紙状物質で構成されてもよい。ＰＣＲ法で核酸を増幅した場合、増幅産物は相補鎖と結合した二本鎖の状態で得られる。核酸プローブアレイは、複数のスポットを有する。各スポットに異なる種類の微生物の標的核酸の相補配列を有したプローブが固定されてもよい。スポットは、核酸プローブを固相表面上に脱離しないように保持するように構成される。また、各スポットは、各スポットに固定された異なる種類のプローブと識別可能であるように、互いに空間的に乖離した状態となるように構成される。

ステップＳ１５の手順において、増幅産物の二本鎖のうち一方の鎖と相補的な配列を有する核酸プローブと、二本鎖との再形成（ハイブリダイゼーション）が実行される。再形成（ハイブリタイゼーション）が実行されることによって、標的核酸が測定される。したがって、ステップＳ１５の手順における反応効率を増大させる目的で、ステップＳ１５の手順の前処理として、一本鎖化処理が実行されてもよい。一本鎖化処理として、加熱による処理、又は、ｐＨの調整による処理等が適用されてよい。

次に、ステップＳ１５の手順において再形成（ハイブリタイゼーション）が実行された試料が撮影され、撮影した画像が解析される（ステップＳ１６）。画像解析によって、ハイブリタイゼーション処理で核酸プローブと反応した核酸を含む試料の数がカウントされる。

一般的な核酸プローブアレイの検出は、蛍光測定によって実行される。蛍光測定による測定において、ステップＳ１３の手順で添加するＰＣＲ増幅反応用のプライマに蛍光標識が付されることが一般的である。本法において、蛍光色素が標識として付されてもよいがこれに限られない。ビオチン等の小分子がプライマに標識として付されてよい。この場合、ステップＳ１６の撮像の手順の前に、蛍光標識等を含む検出用ラベリング剤と反応させる手順が追加されることによって、検出用ラベリング剤の標識が検出されてもよい。また、上述してきたような標識の使用は、測定コスト又は操作手順を増大させる。そこで、標識を用いずに標的核酸を検出可能である核酸プローブアレイが用いられてもよい。

次に、ステップＳ１６の手順でカウントした試料数と、ステップＳ１１の手順で実行した段階希釈の希釈率と、ステップＳ１２の手順で分割した試料の数とを最確数表で照合することによって、検体試料に含まれていた微生物量が推定される（ステップＳ１７）。ステップＳ１６及びＳ１７の手順を実行することによって、ハイブリタイゼーションを実行したプローブが固定されているスポットの発光に基づいて、微生物の種類を特定するとともに、微生物の存在量を最確数法によって定量的に測定できる。

以上説明してきたように、本実施形態に係る測定方法を実行することによって、検体試料に含まれていた微生物量が測定される。本実施形態に係る測定方法によれば、同時に多種類の標的微生物量が測定される。本実施形態に係る測定方法において、標的とする核酸が増幅される。そして、その測定法が核酸プローブアレイに基づく。核酸プローブアレイを用いることによって、核酸増幅工程における非特異産物の生成に影響を受けることなく標的核酸を測定することが可能となる。その結果、核酸増幅の前工程におけるプライマ設計に掛かる労力を著しく低減させることが可能となる。また、測定法が核酸プローブアレイに基づくことから、同時に多種類の核酸を測定することが可能になる。その結果、同時に一反応において多種類の微生物量を測定することが可能となる。さらに、一反応で多種類の微生物量を測定することが可能となる結果、測定に掛かるコストを大幅に低減することが可能である。

比較例において、標的微生物数が増大するほど測定コストが増大する。しかし、本実施形態に係る測定方法において、標的微生物数が増大しても測定コストは増大しない。同様に、測定のためのプライマセットを構築した後で標的微生物を追加する必要が生じた場合においても、同一反応系に標的微生物を追加することが容易に実行できる。

本実施形態に係る測定方法において、標的微生物の培養をすることなく測定が可能である。その結果、培養法が確立されていない微生物が、前培養等の前処理を必要とせずに測定に供される。また、環境ストレス、加熱処理、薬剤による殺菌処理、又は、その他の殺菌若しくは滅菌処理によって損傷を受けたことによって、標的微生物の増殖に好適な条件下においても増殖しにくくなった損傷菌等が、前処理を必要とせずに測定に供される。さらに、本実施形態に係る測定方法が培養に依存しない方法であることによって、培養に要する時間が不要となる。その結果、例えば３０分から数時間以内に測定結果を得ることが可能となる。

標的微生物は、核酸を含有している微生物であればよく、例えば細菌、真菌若しくは古細菌、又は、ウイルス、原虫若しくは微少な昆虫であってもよい。さらに、細菌における芽胞、真菌における胞子、原虫におけるシスト、又は、昆虫における卵等のすぐに増殖を開始しないステージにいる微生物が測定対象とされる。

また、本実施形態に係る測定方法によれば、短時間で測定結果が得られることによって、生産工程又は処理工程等の連続して稼働しているプロセスへのフィードバックが可能となる。具体的には、例えば微生物発酵プロセスにおいて発酵に用いる以外の混入菌が存在することによって発酵効率が低減することが知られている。発酵は比較的早く反応が進行する。したがって、比較例に係る、培養法に基づく混入菌の検査を実行した場合、発酵プロセスが終了する前に混入菌の有無の検査結果が得られない。本実施形態に係る測定方法が実行されることによって、発酵工程が終了する前に混入菌の存在を確認することができるようになる。混入菌が存在した場合には，混入菌の抑制に効果的な薬剤を添加する等の対策を迅速に実行することが可能となる。その結果、発酵効率の低下を抑制することが可能になる。

＜小括＞
以下、本実施形態に係る測定方法の利点がまとめて説明される。

＜＜測定法が核酸プローブアレイに基づくこと＞＞
本実施形態に係る測定方法において、核酸プローブアレイを検出法として適用するため、同時に多種類の微生物を標的とすることができる。１種から数百種までの標的を同時に測定することが可能となる。通常ＰＣＲ法に基づく測定法においては、同時に多種類の標的を測定する場合、核酸増幅の前工程で用いるプライマの設計について、ダイマの生成抑制又は非特異産物の生成抑制について厳密な設計が必要となる。そのため、同時に測定できる種類は、現実的に数種類程度に止まる。本実施形態に係る測定方法によれば、測定法が核酸プローブアレイに基づくことによって、ダイマおよび非特異増幅産物の生成の影響を排除することが可能である。これによって、同時多種の核酸を増幅する工程におけるプライマの設計について、個別の標的微生物の対象核酸が増幅されることを確認すればよい。その結果、プライマの設計に要する手間と時間を著しく低減することが可能となる。

また、比較例に係る方法において、標的微生物数の増大に比例して検査に要するコストが増大する。本実施形態に係る測定方法において、標的微生物に対するプライマおよび検出用の核酸プローブは標的微生物毎に必要となる。一方で、これらの使用量は極微量である。その結果、標的微生物数の増加に対して、検査に要するコストは大きく増えない。

また、比較例に係る方法が培養又はＰＣＲ反応に基づく測定法である場合、測定前に標的微生物を限定して測定する必要があった。この場合、想定外の微生物又は未知（未同定）の微生物を測定対象とすることができなかった。本実施形態に係る測定方法において、数多くの微生物を同時に測定可能であることによって、あらかじめ広範囲の標的微生物を対象とすることができる。その結果、微生物の検出の見落としを低減することができる。また、検出用の核酸プローブの設計において、検査対象スペクトルが広いプローブを設計することも可能である。例えば、細菌に存在する共通領域に対してプローブを設計することによって、特定の細菌を測定対象とするだけではなく、細菌を網羅的に測定対象とすることができる。これによって、想定外の細菌又は未知の細菌であっても検知することが可能となる。

＜＜同時多種に対応できること＞＞
本実施形態に係る測定方法において、Multiplex-PCR法の適用によって、同時多種の標的微生物を測定対象とすることができる。

＜＜培養が不要であること＞＞
本実施形態に係る測定方法において、培養が不要であることによって、例えば３０分から数時間以内の短時間で検査が可能である。短時間で測定可能であることによって、バイオプロセス等における生産工程又は処理工程に測定結果をフィードバックすることが可能になる。また、培養法が確立していない微生物、又は、ＶＢＮＣを測定対象とすることができる。また、測定前に標的微生物を限定する必要がなくなる。その結果、広範囲の微生物を測定対象とすることができる。また、無菌操作などの専門スキルを有さない作業者でも測定することが可能となる。

＜＜核酸増幅に基づく方法であること＞＞
本実施形態に係る測定方法において、ＰＣＲ法などの核酸増幅法を適用することによって、標的核酸を増大させた後に測定することができる。その結果、測定感度が高い。

＜＜応用分野＞＞
本実施形態に係る測定方法によれば、最確数法に基づく核酸測定によって、検体試料中に存在する微生物が定量的に測定される。測定が核酸を対象とすることによって、測定対象は、微生物に限定されない。核酸を含有しているものであれば測定することが可能となる。例えば、ある種の細胞内で発現している遺伝子の定量評価、リキッドバイオプシーの核酸バイオマーカーの定量測定、食品偽装の検査、又は、遺伝子組換えの産物の混入チェックにも応用されることが可能になる。食品偽装の検査は、例えば、牛肉と称して販売されている精肉への他の種の精肉の混入チェック、又は、特定のコメの品種への他の品種又はくず米の混入チェックを含む。混入チェックは、混入の割合の検査を含む。食品偽装の検査は、ハラル認証の検査も含む。本実施形態に係る測定方法は、上述の例に限られず、標的核酸を定量的に測定することが求められる分野で採用され得る。

また、一実施形態に係る測定方法は、１２種類より多い種類の微生物の存在量を同時に定量的に測定するステップを更に含んでよい。このようにすることで、測定回数が低減される。その結果、微生物測定における利便性が向上する。

また、一実施形態に係る測定方法は、プローブアレイに固定されているプローブの種類に基づいて、第１試料に添加するプライマを設計するステップを更に含んでよい。このようにすることで、標的微生物が容易に変更され得る。その結果、微生物測定における利便性が向上する。

（測定システム１の構成例）
本実施形態に係る測定方法は、種々の形態で実施され得る。測定方法のうち、図６のステップＳ１６の試料の撮影及び画像解析の手順と、ステップＳ１７の微生物量の推定の手順とは、図７、図８及び図９に例示する測定システム１によって実施されてよい。

図７に例示されるように、一実施形態に係る測定システム１は、測定装置１０と、プローブアレイ２０とを備える。プローブアレイ２０は、複数のスポット３０を有する。

プローブアレイ２０は、図８に例示されるように、固相表面に測定対象となる標的核酸４２の相補配列を有したプローブ４０を固定したデバイスである。各スポット３０にプローブ４０が固定されている。プローブ４０は、各スポット３０において異なる種類の標的核酸４２がハイブリタイゼーションされるように固定されてよい。プローブ４０は、複数のスポット３０において同じ種類の標的核酸４２がハイブリタイゼーションされるように固定されてよい。

本実施形態において、蛍光標識４４が付された標的核酸４２がプローブ４０とハイブリタイゼーションされるとする。蛍光標識４４が付された標的核酸４２とプローブ４０とがハイブリタイゼーションされている場合、そのプローブ４０が固定されているスポット３０から発光が検出される。発光が検出されるスポット３０は、発光スポット３２とも称される。プローブ４０に標的核酸４２がハイブリタイゼーションされていない場合、そのプローブ４０が固定されているスポット３０から発光は検出されない。発光が検出されないスポット３０は、非発光スポット３４とも称される。

プローブアレイ２０の発光スポット３２を励起して蛍光を検出することによって、図９に例示されるように、発光スポット３２と非発光スポット３４とが判別され得る。各スポット３０の判別は、図７に示されるように、プローブアレイ２０が測定装置１０に挿入されることによって実行され得る。

測定システム１は、図７、図８及び図９に例示される測定システム１で実行される測定方法の前処理として、標的核酸４２がプローブ４０にハイブリタイゼーションされたプローブアレイ２０を準備する工程を実行する構成を更に備えてよい。具体的に、測定システム１は、図１０に例示されるように、試料供給部５１と、希釈部５２と、反応液調製部５３と、増幅部５４と、反応部５５とを有する前処理装置５０を更に備えてもよい。

試料供給部５１と希釈部５２とは、流路を介して接続されている。試料供給部５１は、検体試料を希釈部５２に供給する。希釈部５２は、あらかじめ希釈用の溶液を内部に格納しており、試料供給部５１から供給された検体試料と希釈用の溶液とを内部で混合することによって、検体試料を希釈する。つまり、希釈部５２によって、図６のフローチャートのステップＳ１１の手順が実行され得る。希釈した検体試料は、希釈試料とも称される。

希釈部５２と反応液調製部５３とは、流路を介して接続されている。希釈部５２は、希釈試料を反応液調製部５３に供給する。反応液調製部５３は、あらかじめ反応用の溶液を内部に格納しており、希釈部５２から供給された希釈試料と反応用の溶液とを内部で混合することによって、反応液を調製する。つまり、反応液調製部５３によって、図６のフローチャートのステップＳ１３の手順が実行され得る。

前処理装置５０は、希釈部５２と反応液調製部５３とを接続する流路に、希釈試料を分割する分割部５６を更に備えてもよい。つまり、図６のフローチャートのステップＳ１２の手順として示される希釈試料の分割の手順は、分割部５６によって実行されてよい。希釈試料の分割の手順は、反応液調製部５３によって実行されてもよい。

増幅部５４は、反応液調製部５３で調製された反応液をＰＣＲ増幅に供する。つまり、増幅部５４によって、図６のフローチャートのステップＳ１４の手順が実行され得る。

反応部５５は、増幅部５４でＰＣＲ増幅した反応液をプローブアレイ２０との反応に供する。つまり、反応部５５によって、図６のフローチャートのステップＳ１５の手順が実行され得る。反応部５５は、プローブアレイ２０を内部に取り込んだり排出したりする機構を有してよい。反応部５５は、プローブアレイ２０が設置されている部分にＰＣＲ増幅した反応液を流し込む流路を有してもよい。

以上述べてきた前処理装置５０によって、標的核酸４２がプローブ４０とハイブリタイゼーションされたプローブアレイ２０を準備する前工程が実行され得る。測定システム１は、前処理装置５０によって準備されたプローブアレイ２０に基づいて検体試料に含まれる微生物を測定してよい。

前処理装置５０は、各構成部の温度を制御してもよい。前処理装置５０は、例えばヒータを更に備えてもよい。

前処理装置５０の各構成部を接続する流路は、シリコーン等の変形可能な材料を含んで構成されてもよい。このようにすることで、流路を狭めたり広げたりすることによって送液する構成が実現され得る。

前処理装置５０の各構成部は、マイクロ流体デバイスによって構成されてもよい。

反応部５５は、ハイブリダイゼーション反応後に未反応の反応液をプローブアレイ２０のスポット３０から除去するために反応液を排出する機構を有してもよい。プローブアレイ２０自身が反応液を排出する機構を有してもよい。反応部５５は、プローブアレイ２０を任意のプローブアレイ２０に置換する機構を有してもよい。

本開示は、上述した実施形態で特定された構成に限定されず、特許請求の範囲に記載した開示の要旨を逸脱しない範囲内で種々の変形が可能である。例えば、各ステップに含まれる機能等は、論理的に矛盾しないように再構成可能である。また、複数のステップを１つに組み合わせたり、１つのステップを分割したりすることが可能である。

１ 測定システム
１０ 測定装置
２０ プローブアレイ
３０ スポット（３２：発光スポット、３４：非発光スポット）
４０ プローブ
４２ 標的核酸
４４ 蛍光標識
５０ 前処理装置（５１：試料供給部、５２：希釈部、５３：反応液調製部、５４：増幅部、５５：反応部、５６：分割部）

Claims (3)

1. 検体試料に含まれる少なくとも２種類の微生物の存在量を定量的に測定する測定方法であって、
   前記検体試料の段階希釈及び分割を実行して第１試料を生成するステップと、
   前記第１試料に含まれる、前記微生物の核酸を増幅して第２試料を生成するステップと、
   前記各種類の微生物に固有の標的核酸の相補配列を有するプローブが固定されたスポットを備えるプローブアレイにおいて、前記第２試料のハイブリタイゼーションを実行するステップと、
   前記ハイブリタイゼーションを実行した前記スポットの発光に基づいて、前記微生物の種類を特定するとともに、前記微生物の存在量を最確数法によって定量的に測定するステップと
   を含む測定方法。
2. 前記プローブアレイに固定されているプローブの種類に基づいて、前記第１試料に添加するプライマを設計するステップを更に含む、請求項１に記載の測定方法。
3. 検体試料に含まれる少なくとも２種類の微生物の存在量を定量的に測定する測定システムであって、
   前処理装置と、測定装置とを備え、
   前記前処理装置は、
   前記検体試料の段階希釈及び分割を実行して第１試料を生成し、
   前記第１試料に含まれる、前記微生物の核酸を増幅して第２試料を生成し、
   前記各種類の微生物に固有の標的核酸の相補配列を有するプローブが固定されたスポットを備えるプローブアレイにおいて、前記第２試料のハイブリタイゼーションを実行し、
   前記測定装置は、前記ハイブリタイゼーションを実行した前記スポットの発光に基づいて、前記微生物の種類を特定するとともに、前記微生物の存在量を最確数法によって定量的に測定する、測定システム。

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