JP5310997B2 - 細菌による汚染の汚染源特定方法 - Google Patents
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Description
(A)配列番号1の核酸配列またはこれと相補的な核酸配列に含まれる連続した20bp以上の核酸配列
(B)配列番号2の核酸配列またはこれと相補的な核酸配列に含まれる連続した20bp以上の核酸配列
(C)配列番号3の核酸配列またはこれと相補的な核酸配列に含まれる連続した20bp以上の核酸配列
(D)配列番号4の核酸配列またはこれと相補的な核酸配列に含まれる連続した20bp以上の核酸配列、および
(E)配列番号5の核酸配列またはこれと相補的な核酸配列に含まれる連続した20bp以上の核酸配列
〔2〕前記配列(A)および/または(B)が検出された場合に、前記試料中に、大腸菌群に属する細菌が存在すると判定する、上記〔1〕に記載の細菌を検出する方法。
〔3〕前記配列(C)が検出された場合に、前記試料中に、シトロバクター(Citrobacter)属に属する細菌および/またはエルウィニア(Erwinia)属に属する細菌が存在すると判定する、上記〔1〕に記載の細菌を検出する方法。
〔4〕前記配列(D)が検出された場合に、前記試料中に、ハフニア(Hafnia)属に属する細菌が存在すると判定する、上記〔1〕に記載の細菌を検出する方法。
〔5〕前記配列(E)が検出された場合に、前記試料中に、
クレブシエラ オキシトカ(Klebsiella oxytoca)に属する細菌、
エンテロバクター アエロゲネス(Enterobacter aerogenes)に属する細菌、および
ラウルテラ テリゲナ(Raoultella terrigena)属に属する細菌、のうちのいずれか1種または2種以上が存在すると判定する、上記〔1〕に記載の細菌を検出する方法。
〔6〕前記配列(A)および/または(B)が検出され、かつ、前記配列(C)、(D)および(E)のいずれも検出されない場合に、
前記配列(E)が検出された場合に、前記試料中に、
クレブシエラ オキシトカ(Klebsiella oxytoca)に属する細菌、
エンテロバクター アエロゲネス(Enterobacter aerogenes)に属する細菌、および
ラウルテラ テリゲナ(Raoultella terrigena)属に属する細菌、のうちのいずれか1種または2種以上が存在すると判定する、請求項1に記載の細菌を検出する方法。
のうちのいずれか1種または2種以上が存在すると判定する、上記〔1〕に記載の細菌を検出する方法。
〔7〕前記配列(A)および(B)からなる群より選ばれる1種または2種の核酸配列を、試料中から検出する第1の検出工程と、
前記配列(C)、(D)および(E)からなる群より選ばれる1種または2種以上の核酸配列を検出する、第2の検出工程を含む、
上記〔1〕に記載の細菌を検出する方法。
〔8〕前記第2の検出工程において、前記配列(C)、(D)および(E)の検出を行い、前記第2の検出工程の結果から、前記配列(C)が検出された場合に存在すると判定される細菌群と、前記配列(D)が検出された場合に存在すると判定される細菌群と、前記配列(E)が検出された場合に存在すると判定される細菌群と、これら以外の細菌群の4つのグループに大腸菌群を分類する工程を含む、上記〔7〕に記載の細菌を検出する方法。
〔9〕第1のプライマーが前記配列(A)または(B)のいずれか一方の配列を有する核酸であり、第2のプライマーがlacZ遺伝子をコードする核酸中に含まれる20bp以上、32bp以下の配列であって、前記第1のプライマーとは異なる配列を有する核酸である一対のプライマーセットを用いて、第1および第2のプライマーに挟まれる領域をポリメラーゼチェーンリアクションにより増幅し、増幅産物を検出して前記配列(A)または(B)を検出する、請求項1または2に記載の細菌を検出する方法。
〔10〕前記配列(A)を有する核酸および前記配列(B)を有する核酸を一対のプライマーセットとして配列(A)および(B)で挟まれる領域をポリメラーゼチェーンリアクションにより増幅し、増幅産物を検出して前記配列(A)および(B)を検出する、上記〔1〕または〔2〕に記載の細菌を検出する方法。
〔11〕第1のプライマーが前記配列(C)、(D)または(E)の配列を有する核酸であり、第2のプライマーがlacZ遺伝子をコードする核酸中に含まれる20bp以上、32bp以下の配列であって、前記第1のプライマーとは異なる配列を有する核酸である一対のプライマーセットを用いて、第1および第2のプライマーに挟まれる領域をポリメラーゼチェーンリアクションにより増幅し、増幅産物を検出して、前記第1のプライマーに該当する前記配列(C)、(D)または(E)のいずれかの配列を検出する、上記〔1〕、〔3〕、〔4〕または〔5〕のいずれか一項に記載の細菌を検出する方法。
〔12〕前記第1の検出工程において、前記配列(A)を有する核酸および前記配列(B)を有する核酸を一対のプライマーセットとして前記プライマーセットが挟む領域をポリメラーゼチェーンリアクションにより増幅し、増幅産物を検出し、前記配列(A)および(B)を検出する、上記〔7〕または〔8〕に記載の細菌を検出する方法。
〔13〕前記第2の検出工程において、前記配列(A)を有する核酸および前記配列(C)を有する核酸を一対とするプライマーセット、または、前記配列(B)を有する核酸および前記配列(C)を有する核酸を一対とするプライマーセットを用いて、前記プライマーセットが挟む領域をポリメラーゼチェーンリアクションにより増幅し、増幅産物を検出し、前記配列(C)を検出する、上記〔7〕から〔10〕のいずれか一項に記載の細菌を検出する方法。
〔14〕前記第2の検出工程において、前記配列(A)を有する核酸と前記配列(D)を有する核酸とを一対とするプライマーセット、または、前記配列(B)を有する核酸および前記配列(D)を有する核酸を一対とするプライマーセットを用いて、プライマーセットが挟む領域をポリメラーゼチェーンリアクションにより増幅し、増幅産物を検出し、前記配列(D)を検出する、上記〔7〕から〔10〕のいずれか一項に記載の細菌を検出する方法。
〔15〕前記第2の検出工程において、前記配列(A)を有する核酸および前記配列(E)を有する核酸を一対とするプライマーセット、または、前記配列(B)を有する核酸および前記配列(E)を有する核酸を一対とするプライマーセットを用いて、それぞれのプライマーセットが挟む領域をポリメラーゼチェーンリアクションにより増幅し、増幅産物を検出し、前記配列(E)を検出する、上記〔7〕から〔10〕のいずれか一項に記載の細菌を検出する方法。
〔16〕前記第2の検出工程において、
前記配列(A)または(B)を有する核酸および前記配列(C)を有する核酸を一対とするプライマーセット、
前記配列(A)または(B)を有する核酸および前記配列(D)を有する核酸を一対とするプライマーセット、および
前記配列(A)または(B)を有する核酸および前記配列(E)を有する核酸を一対とするプライマーセットを用いて、それぞれのプライマーセットが挟む領域をポリメラーゼチェーンリアクションにより増幅し、それぞれの増幅産物を検出し、前記配列(C)、(D)および(E)を検出する、上記〔7〕から〔10〕のいずれか一項に記載の細菌を検出する方法。
〔17〕前記増幅産物の量を定量し、増産物の量から、試料中に含まれる大腸菌群に属する細菌の量を推定する、上記〔9〕から〔16〕のいずれか一項に記載の細菌を検出する方法。
〔18〕下記配列(A)から(E)からなる群より選ばれるいずれかの配列を有する核酸である、大腸菌群検出用プローブ。
(A)配列番号1の核酸配列またはこれと相補的な核酸配列に含まれる連続した20bp以上の核酸配列
(B)配列番号2の核酸配列またはこれと相補的な核酸配列に含まれる連続した20bp以上の核酸配列
(C)配列番号3の核酸配列またはこれと相補的な核酸配列に含まれる連続した20bp以上の核酸配列
(D)配列番号4の核酸配列またはこれと相補的な核酸配列に含まれる連続した20bp以上の核酸配列、および
(E)配列番号5の核酸配列またはこれと相補的な核酸配列に含まれる連続した20bp以上の核酸配列
〔19〕下記配列(A)を有する核酸および配列(B)を有する核酸を一対とする、ポリメラーゼチェーンリアクション用プライマーセット。
(A)配列番号1の核酸配列またはこれと相補的な核酸配列に含まれる連続した20bp以上の核酸配列
(B)配列番号2の核酸配列またはこれと相補的な核酸配列に含まれる連続した20bp以上の核酸配列
〔20〕前記配列(A)または(B)を有する核酸のいずれかの核酸と、
下記配列(C)、(D)および(E)からなる群より選ばれるいずれかの配列を有する核酸とを一対とする、ポリメラーゼチェーンリアクション用プライマーセット。
(C)配列番号3の核酸配列またはこれと相補的な核酸配列に含まれる連続した20bp以上の核酸配列
(D)配列番号4の核酸配列またはこれと相補的な核酸配列に含まれる連続した20bp以上の核酸配列、および
(E)配列番号5の核酸配列またはこれと相補的な核酸配列に含まれる連続した20bp以上の核酸配列
本発明の大腸菌群に属する細菌を検出する方法(以下、本明細書において、「本発明の検出方法」という場合がある)では、大腸菌群に属する細菌を検出する。本発明においては、大腸菌群に属する細菌が保有するlacZ遺伝子をコードする核酸配列中に含まれる下記配列(A)から(E)からなる群より選ばれる1種または2種以上の核酸配列を、試料中から検出し、これらを指標として細菌を検出する。
(A)配列番号1の核酸配列またはこれと相補的な核酸配列に含まれる連続した20bp以上の核酸配列
(B)配列番号2の核酸配列またはこれと相補的な核酸配列に含まれる連続した20bp以上の核酸配列
(C)配列番号3の核酸配列またはこれと相補的な核酸配列に含まれる連続した20bp以上の核酸配列
(D)配列番号4の核酸配列またはこれと相補的な核酸配列に含まれる連続した20bp以上の核酸配列、および
(E)配列番号5の核酸配列またはこれと相補的な核酸配列に含まれる連続した20bp以上の核酸配列
Citrobacter braakii
Citrobacter freundii
Citrobacter koseri
Erwinia aphidicola
Hafnia alvei
Klebsiella oxytoca
Buttiauxella agrestis
Enterobacter aerogenes
Enterobacter amnigenus
Enterobacter cloacae subsp. cloacae
Enterobacter sakazakii
Escherichia coli
Escherichia vulneris
Klebsiella pneumoniae
Kluyvera cryocrescens
Kluyvera intermedia
Leclercia adecarboxylata
Raoultella terrigena
Raoultella ornithinolytica
Raoultella planticola
配列(A)または(B)を有する核酸および配列(C)を有する核酸を一対とするプライマーセット、
配列(A)または(B)を有する核酸および配列(D)を有する核酸を一対とするプライマーセット、および
配列(A)または(B)を有する核酸および配列(E)を有する核酸を一対とするプライマーセットをそれぞれ用いて、それぞれのプライマーセットが挟む領域をポリメラーゼチェーンリアクションにより増幅し、増幅産物を検出し、配列(C)、(D)および(E)を検出する形態が挙げられる。すなわち、PCRを利用する第10の実施形態においては、上記第6から第9の実施形態例における第2の検出工程を、それぞれすべて実施する。配列(C)、(D)および(E)のすべてについてPCRによる検出を行うことで、配列(C)、(D)および(E)に対応するそれぞれの細菌群をすべて検出することができる。また、第1の検出工程によって大腸菌群に属する細菌が存在するか否か判別できることから、第1の検出工程によって増幅産物が検出され、かつ、第2の検出工程によっては増幅産物が検出されない場合に、配列(C)、(D)および(E)以外の大腸菌群に属する細菌が存在することを確認し得る。配列(C)、(D)および(E)以外の大腸菌群に属する細菌としては、例えば、ブチオーキセラ(Buttiauxella)属に属する細菌、エンテロバクター アムニゲナス(Enterobacter amnigenus)に属する細菌、エンテロバクター クロアカ(Enterobacter cloacae)に属する細菌、エンテロバクター サカザキ(Enterobacter sakazaki)に属する細菌、エシェリキア(Esherichia)属に属する細菌、クレブシエラ ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)に属する細菌、クルイベラ(Kluyvera)属に属する細菌、レクレルシア(Leclercia)に属する細菌、ラウルテラ オルニチノリティカ(Raoultella ornithinolytica)に属する細菌、およびラウルテラ プランティコラ(Raoultella planticola)に属する細菌などが挙げられる。
本発明により、細菌の検出に有用な複数の核酸フラグメントが提供される。すなわち、本発明は、下記配列(A)から(E)の各核酸を提供する。これらの核酸は、
上記発明の検出方法の欄で説明したとおり、それぞれ大腸菌群検出用プローブ、プライマー等として利用し得る。
(A)配列番号1の核酸配列またはこれと相補的な核酸配列に含まれる連続した20bp以上の核酸配列
(B)配列番号2の核酸配列またはこれと相補的な核酸配列に含まれる連続した20bp以上の核酸配列
(C)配列番号3の核酸配列またはこれと相補的な核酸配列に含まれる連続した20bp以上の核酸配列
(D)配列番号4の核酸配列またはこれと相補的な核酸配列に含まれる連続した20bp以上の核酸配列、および
(E)配列番号5の核酸配列またはこれと相補的な核酸配列に含まれる連続した20bp以上の核酸配列
次に、本発明の検出方法を、食品工場における検査に適用した実施形態の一例を、図4および図5を参照しつつ説明する。
(1)実験に供した標準菌株
下記表5に示す代表的な大腸菌群の標準菌株11属21種38株を試験に供した。
Luria−Bertani(LB)液体培地にて37℃一晩振とう培養した菌液を1.5 ml分取し、ISOPLANTキット(ニッポンジーン社製)を用いてゲノムDNAを抽出した。
まず、全ての大腸菌群株を増幅することが可能なプライマーの設計を試みた。lacZ遺伝子のうち、保存性が高い場所を複数選び、その中から、最も多くの大腸菌群株でPCR増幅に成功したプライマーを選抜することにした。lacZ遺伝子におけるPCR増幅領域は以下のようにして決定した。大腸菌群に属する細菌でゲノム配列がインターネット上で公開されているもののうち、シトロバクター コセリ(Citrobacter koseri)、エシェリヒア コリ(Escherichia coli)、エンテロバクター サカザキ(Enterobacter sakazakii)、クレブシエラ ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)、エンテロバクター クロアカ(Enterobacter cloacae)から各々のlacZ遺伝子配列を取得した。それらの配列(配列番号6:C.koseri:3078bp、配列番号8:E.coli:3075bp、配列番号10:E.sakazakii:3132bp、配列番号12:K.pneumoniae:3108bp、配列番号14:E.cloacae:3087bp)について、Clustal W プログラムを用いてマルチプルアラインメントを行った。
R=(AまたはG)、Y=(CまたはT)、M=(AまたはC)、K=(GまたはT)、S=(GまたはC)、W=(AまたはT)、H=(A,CまたはT)、B=(G,TまたはC)、V=(G,CまたはA)、D=(G,AまたはT)、N=(A,C,GまたはT)
(1)PCRプライマーの合成
過去の文献にて、lacZ遺伝子のPCRによる増幅が報告されている(非特許文献1:Letters in Applied Microbiology 19:44−46,1994;非特許文献2:Applied and Environmental Microbiology 57:2429−2432,1991)。そのプライマーを合成した。
上記調製例1および2で調製されたプライマーセットI〜IIIを用いて、PCRを行い、大腸菌群に由来する遺伝子の増幅を以下のようにして検出した。
(1)プライマーIおよびIIを用いたPCRの反応条件
PCR反応は総量を50μlとし、1×amplification buffer、0.2mM dNTP mixture、2.5U ExTaq DNA polymerase(タカラバイオ社製)、0.5μM Forward/Reverse各プライマー、0.5μlの鋳型DNAを含む反応液で行った。増幅反応は、Master gradient(エッペンドルフ社製)にて以下のプロトコルにて行った。反応液は、鋳型DNAの二本鎖解離のため94℃で5分間加熱した後、94℃で1分間、55℃で1分30秒間、72℃で1分間の反応を1サイクルとしてこれを30サイクル繰り返し、72℃で5分間反応させ、PCR反応を行った。
プライマーセットIIIによるPCR反応は、発表された文献(非特許文献1および2)の記載に従って、以下のプロトコルにて行った。反応液は、鋳型DNAの二本鎖解離のため94℃で5分間加熱した後、94℃で1分間、60℃で1分間、72℃で1分間の反応を1サイクルとしてこれを25サイクル繰り返し、72℃で5分間反応させ、PCR反応を行った。
プライマーI〜IIIをそれぞれ用いてPCRを行い、核酸の増幅産物が得られたか否かについての結果を、表5に示す。表5において、PCRによって増幅が確認された菌株を○として示し、増幅が確認されなかった菌株を×として示した。
プライマーセットIによるPCR反応(図1−2から図1−3におけるRGN1を増幅)を行った。その結果、表5に示すとおり、プライマーセットIでは、38株全て(100%)で核酸の増幅が確認された。この結果から、プライマーセットIによるPCRによって、微生物が含まれる試料中から大腸菌群の検出を行うことができることが分かった。また、試料の調製からPCRによる結果の確認まで要した時間はおよそ3時間程度であった。
プライマーセットIIによるPCR反応(図1−4におけるRGN2を増幅)を38菌株について行った。表5に示すように、プライマーセットIIでは、27株(71%)で核酸の増幅が確認された。プライマーセットIIは、プライマーセットIと同様に、大腸菌群において保存性が高い領域をベースに設計されたが、プライマーセットIのように、表4に示す大腸菌群のすべてについて検出することはできなかった。
プライマーセットIIIによるPCR反応を38菌株について行ったところ、表4に示すように、10株(26%)について増幅が確認されたのみであった。過去の文献でも、試験した菌株のうち約70%の菌株でしかPCR反応で増幅が確認されず、新たなプライマーの設計の必要性が主張されている(非特許文献1および2)。本試験結果もこれを追認する結果となった。
(1)種特異的なPCRプライマーの設計
次に、種特異的なプライマーの設計を試みた。表5に示す菌株のうち、代表的な菌株のRGN1について核酸配列を確認した(約520bp)。その核酸配列の比較から、種内では保存されているが、種間では変化に富んでいる領域を探した。図2−1(配列番号21−25)は、シトロバクター(Citrobacter)属に属する5菌株における領域RGN1のアライメントを示す。図2−2(配列番号26−27)は、ハフニア(Hafnia)属に属する2菌株における領域RGN1のアライメントを示す。図2−3(配列番号28−32)には、クレブシエラ(Klebsiella)属に属する5菌株における領域RGN1のアライメントを示す。図2−1に示される通り、領域rf6は、シトロバクター属に属する菌株において保存性が高い領域である。また、図2−2に示される通り、領域rf7は、ハフニア属に属する菌株において保存性の高い領域である。図2−3示される通り、領域rf8はクレブシエラ属に属する菌株において保存性の高い領域である。
(1)種特異的PCRの反応条件
上記プライマーセットIVからVIをそれぞれ用いて、PCR反応を行った。PCR反応のための溶液として、上記と同様に、反応溶液総量を50μlとし、1×amplification buffer、0.2mM dNTP mixture、2.5U ExTaq DNA polymerase(タカラバイオ社製)、0.5μMを含む溶液Aを調製した。また、フォワードプライマーとしては1Fを用い、リバースプライマーとしてはAR、BR、CRのいずれかを用い、0.5μlの鋳型DNAを上記溶液Aに添加した反応液でPCRを行った。増幅反応はMaster gradient(エッペンドルフ社製)にて、添付の説明書を参照し、下記のプロトコルにて行った。反応液は、鋳型DNAの二本鎖解離のため94℃で5分間加熱した後、94℃で1分間、60℃で1分間、72℃で15秒間の反応を1サイクルとしてこれを30サイクル繰り返し、72℃で5分間反応させ、PCR反応を行った。
各プライマーセットによるPCR反応の結果を表9に示す。表9中、PCRにて増幅が確認された菌株を○として、増幅が確認されなかった菌株を×として示した。プライマーセットIVでのみ、PCRによる増幅が確認された菌株はシトロバクター(Citorbacter)属の6株とエルウィニア アフィディコラ(Erwinia aphidicola)1株であり、そのほかの菌株では増幅は確認されなかった。プライマーセットVでのみ、PCRによる増幅が確認された菌株は、ハフニア アルベイ(Hafnia alvei)の2株であり、そのほかの菌株では増幅は確認されなかった。プライマーセットVIでのみ、PCRによる増幅が確認された菌株は、クレブシエラ オキシトカ(Klebsiella oxytoca)6株と、エンテロバクター アエロゲネシス(Enterobacter aerogenes)2株、ラウルテラ テリゲナ(Raoultella terrigena)1株であり、そのほかの菌株では増幅は確認されなかった。全てのプライマーセットでPCRによる増幅が確認されなかった菌株は20種類であった。試料の調製からPCRによる結果の確認まで要した時間はおよそ3時間程度であった。
Claims (10)
- 大腸菌群に属する細菌による汚染の汚染源を特定する方法であって、
試料を採取する工程と、当該試料中に含まれる所定の核酸を検出する第1および第2の検出工程とを含み、
大腸菌群に属する細菌が有するlacZ遺伝子をコードする核酸配列中に含まれる下記配列(A)から(E):
(A)配列番号1の核酸配列またはこれと相補的な核酸配列に含まれる連続した20bp以上の核酸配列
(B)配列番号2の核酸配列またはこれと相補的な核酸配列に含まれる連続した20bp以上の核酸配列
(C)配列番号3の核酸配列またはこれと相補的な核酸配列に含まれる連続した20bp以上の核酸配列
(D)配列番号4の核酸配列またはこれと相補的な核酸配列に含まれる連続した20bp以上の核酸配列、または
(E)配列番号5の核酸配列またはこれと相補的な核酸配列に含まれる連続した20bp以上の核酸配列
で示される配列を有する核酸のうち、
第1の検出工程で、配列(A)を有する核酸および配列(B)を有する核酸からなる群より選ばれる1種または2種の核酸を検出し、当該試料中における、大腸菌群に属する細菌の量を推定し、
第2の検出工程で、配列(C)を有する核酸、配列(D)を有する核酸、および配列(E)を有する核酸からなる群より選ばれる1種または2種以上の核酸を検出し、当該試料中における、配列(C)、(D)、または(E)に特異的に対応する細菌の量を推定し、
配列(C)が検出された場合、シトロバクター(Citrobacter)属に属する細菌および/またはエルウィニア(Erwinia)属に属する細菌が存在すると判定し、
配列(D)が検出された場合、ハフニア(Hafnia)属に属する細菌が存在すると判定し、
配列(E)が検出された場合、クレブシエラ オキシトカ(Klebsiella oxytoca)に属する細菌、エンテロバクター アエロゲネス(Enterobacter aerogenes)に属する細菌、およびラウルテラ テリゲナ(Raoultella terrigena)属に属する細菌のうちのいずれか1種または2種以上が存在すると判定し、
前記配列(A)および/または(B)が検出され、かつ、前記配列(C)、(D)および(E)のいずれも検出されない場合、ブチオーキセラ(Buttiauxella)属に属する細菌、エンテロバクター アムニゲナス(Enterobacter amnigenus)に属する細菌、エンテロバクター クロアカ(Enterobacter cloacae)に属する細菌、エンテロバクター サカザキ(Enterobacter sakazaki)に属する細菌、エシェリキア(Esherichia)属に属する細菌、クレブシエラ ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)に属する細菌、クルイベラ(Kluyvera)属に属する細菌、レクレルシア(Leclercia)に属する細菌、ラウルテラ オルニチノリティカ(Raoultella ornithinolytica)に属する細菌、およびラウルテラ プランティコラ(Raoultella planticola)に属する細菌のうちのいずれか1種または2種以上が存在すると判定し、
第1および第2の検出工程により推定された細菌の量と種類から、当該試料における大腸菌群の構成相を求め、汚染源となり得る箇所特有の大腸菌群の構成相と対比することにより、当該試料の汚染源を特定する、細菌による汚染の汚染源特定方法。 - 前記第1の検出工程において、
第1のプライマーが前記配列(A)または(B)のいずれか一方の配列を有する核酸であり、第2のプライマーがlacZ遺伝子をコードする核酸中に含まれる20bp以上、32bp以下の配列であって、前記第1のプライマーとは異なる配列を有する核酸である一対のプライマーセットを用いて、第1および第2のプライマーに挟まれる領域をポリメラーゼチェーンリアクションにより増幅し、増副産物の量から、当該試料中における、大腸菌群に属する細菌の量を推定する、請求項1に記載の汚染源特定方法。 - 前記第1の検出工程において、
前記配列(A)を有する核酸および前記配列(B)を有する核酸を一対のプライマーセットとして配列(A)および(B)で挟まれる領域をポリメラーゼチェーンリアクションにより増幅し、増幅産物の量から、当該試料中に含まれる大腸菌群に属する細菌の量を推定する、請求項1に記載の汚染源特定方法。 - 前記第2の検出工程において、
第1のプライマーが前記配列(C)、(D)または(E)の配列を有する核酸であり、第2のプライマーがlacZ遺伝子をコードする核酸中に含まれる20bp以上、32bp以下の配列であって、前記第1のプライマーとは異なる配列を有する核酸である一対のプライマーセットを用いて、第1および第2のプライマーに挟まれる領域をポリメラーゼチェーンリアクションにより増幅し、増幅産物の量から、当該試料中における、配列(C)、(D)、または(E)に特異的に対応する細菌の量を推定する、請求項1から3のいずれか一項に記載の汚染源特定方法。 - 前記第2の検出工程において、
前記配列(A)を有する核酸および前記配列(C)を有する核酸を一対とするプライマーセット、または、前記配列(B)を有する核酸および前記配列(C)を有する核酸を一対とするプライマーセットを用いて、前記プライマーセットが挟む領域をポリメラーゼチェーンリアクションにより増幅し、増幅産物の量から、当該試料中における、配列(C)に特異的に対応する細菌の量を推定する、請求項1から4いずれか一項に記載の汚染源特定方法。 - 前記第2の検出工程において、
前記配列(A)を有する核酸と前記配列(D)を有する核酸とを一対とするプライマーセット、または、前記配列(B)を有する核酸および前記配列(D)を有する核酸を一対とするプライマーセットを用いて、プライマーセットが挟む領域をポリメラーゼチェーンリアクションにより増幅し、増幅産物の量から、当該試料中における、配列(D)に特異的に対応する細菌の量を推定する、請求項1から5のいずれか一項に記載の汚染源特定方法。 - 前記第2の検出工程において、
前記配列(A)を有する核酸および前記配列(E)を有する核酸を一対とするプライマーセット、または、前記配列(B)を有する核酸および前記配列(E)を有する核酸を一対とするプライマーセットを用いて、それぞれのプライマーセットが挟む領域をポリメラーゼチェーンリアクションにより増幅し、増幅産物の量から、当該試料中における、配列(E)に特異的に対応する細菌の量を推定する、請求項1から6のいずれか一項に記載の汚染源特定方法。 - 前記第2の検出工程において、
前記配列(A)または(B)を有する核酸および前記配列(C)を有する核酸を一対とするプライマーセット、
前記配列(A)または(B)を有する核酸および前記配列(D)を有する核酸を一対とするプライマーセット、および
前記配列(A)または(B)を有する核酸および前記配列(E)を有する核酸を一対とするプライマーセットを用いて、それぞれのプライマーセットが挟む領域をポリメラーゼチェーンリアクションにより増幅し、それぞれの増幅産物の量から、当該試料中における、配列(C)、(D)、または(E)に特異的に対応する細菌の量を推定する、請求項1から7のいずれか一項に記載の汚染源特定方法。 - 下記配列(A)を有する核酸フラグメント、下記配列(B)を有する核酸フラグメント、下記配列(C)を有する核酸フラグメント、下記配列(D)を有する核酸フラグメント、及び下記配列(E)を有する核酸フラグメントを含む、細菌による汚染の汚染源特定するためのプローブセット。
(A)配列番号1の核酸配列またはこれと相補的な核酸配列に含まれる連続した20bp以上の核酸配列
(B)配列番号2の核酸配列またはこれと相補的な核酸配列に含まれる連続した20bp以上の核酸配列
(C)配列番号3の核酸配列またはこれと相補的な核酸配列に含まれる連続した20bp以上の核酸配列
(D)配列番号4の核酸配列またはこれと相補的な核酸配列に含まれる連続した20bp以上の核酸配列、および
(E)配列番号5の核酸配列またはこれと相補的な核酸配列に含まれる連続した20bp以上の核酸配列 - 下記配列(A)または(B)を有する核酸のいずれかの核酸と、
下記配列(C)、(D)および(E)からなる群より選ばれるいずれかの配列を有する核酸とを一対とする、細菌による汚染の汚染源特定するための、ポリメラーゼチェーンリアクション用プライマーセット。
(A)配列番号1の核酸配列またはこれと相補的な核酸配列に含まれる連続した20bp以上の核酸配列
(B)配列番号2の核酸配列またはこれと相補的な核酸配列に含まれる連続した20bp以上の核酸配列
(C)配列番号3の核酸配列またはこれと相補的な核酸配列に含まれる連続した20bp以上の核酸配列
(D)配列番号4の核酸配列またはこれと相補的な核酸配列に含まれる連続した20bp以上の核酸配列、および
(E)配列番号5の核酸配列またはこれと相補的な核酸配列に含まれる連続した20bp以上の核酸配列
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