JP2021511056A - 不連続融解分析のための方法および組成物 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は一般に分子生物学の分野に関する。より詳細には、本発明は、生物学的サンプル中の核酸標的を同定および定量化するための方法に関する。
二重鎖核酸の融解分析は、アンプリコンの同一性を識別するために融解ピークまたはアニールピークを利用するが、融解ピークは、同じ温度付近で融解するアンプリコンまたは核酸二重鎖では、そのアンプリコンまたは核酸が明確に標識されていない限り、容易に区別できない。さらに、融解分析は一般に標的増幅後に行われ、この分析では、サンプルの温度をゆっくりと増減させ、複数の温度において画像を取得するために必要な時間のせいで、アッセイの所要時間が増す。
I. 本発明の態様
本開示は、増幅された標的が類似の融解ピークを有する場合でさえサンプル内の標的の存在または非存在を判定するための、迅速な融解分析を行うための方法を提供する。好ましい態様において、融解分析は、標的特異的プローブのTmよりも低いおよび標的特異的プローブのTmよりも高い不連続融解温度において行われ、標的特異的プローブのTmにおいて行われない。
本明細書で使用する「核酸」は、一本鎖または二本鎖の、DNAまたはRNAのいずれか、およびそれらの任意の化学修飾を意味する。修飾には、限定するものではないが、核酸リガンド塩基にまたは全体としての核酸リガンドに付加的な電荷、分極率、水素結合、静電相互作用、および流動性(fluxionality)を組み込む、他の化学基を提供するものが含まれる。このような修飾としては、限定するものではないが、2'位糖修飾、5位ピリミジン修飾、8位プリン修飾、環外アミンでの修飾、4-チオウリジンの置換、5-ブロモまたは5-ヨード-ウラシルの置換、主鎖修飾、メチル化、および普通ではない塩基対合の組み合わせ、例えばイソ塩基、が挙げられる。したがって、本明細書に記載の核酸は、標準塩基のアデニン(A)、シトシン(C)、グアニン(G)、チミン(T)、およびウラシル(U)だけでなく、非標準または非天然のヌクレオチドをも含む。水素結合性の塩基対を形成する非標準または非天然ヌクレオチドは、例えば、米国特許第5,432,272号、第5,965,364号、第6,001,983号、第6,037,120号、および第6,140,496号に記載されており、これらの全ては参照により本明細書に組み入れられる。「非標準ヌクレオチド」または「非天然ヌクレオチド」とは、オリゴヌクレオチドへの組み込みを受け易く、かつ塩基対を形成するために水素結合によって、または疎水性、エントロピーもしくはファンデルワールス相互作用によって相補的な非標準または非天然ヌクレオチドと塩基対合することができる、A、G、C、TまたはU以外の塩基を意味する。いくつかの例には、参照により本明細書に組み入れられる米国特許第6,037,120号に示されるような、iso-C/iso-G、K/X、K/P、H/J、およびM/Nの塩基対組み合わせが含まれる。
融解曲線(解離曲線)は、反応の温度が上昇するにつれて二本鎖DNAが一本鎖DNAに解離または「融解」する際に観察される蛍光の変化をグラフ化する。例えば、二本鎖DNAがインターカレート色素の存在下でゆっくりと加熱されると、融点 (Tm) に達し、色素が二重鎖から解離する時に、突然蛍光の低下が検出される。核酸のTmは、いくつかある要因の中でも特に長さ、GC含量、および塩基ミスマッチの存在によって影響を受けるため、異なる二重鎖核酸はそれらの異なる融解特性によって区別することができる。増幅後の融解曲線分析を用いて、プライマー二量体アーティファクトおよび非標的核酸と標的由来アンプリコンを区別して、反応特異性を確実にすることができる。さらに、反応産物、例えばプライマー二量体対アンプリコンの融解曲線分析による特性決定は、時間のかかるゲル電気泳動の必要性を低減する。リアルタイムPCRアッセイの特異性は、使用されるプライマーおよび反応条件によって決定される。しかしながら、うまく設計されたプライマーでさえ、プライマー二量体を形成するか、または非特異的な産物を増幅する可能性が常に存在する。またqRT-PCRを行う際に、RNAサンプルがゲノムDNAを含有する可能性もあり、ゲノムDNAもまた増幅され得る。qPCRまたはqRT-PCR反応産物の特異性は、融解曲線分析を使用して確認することができる。
所定のTmを有するプローブをDMAにおいて使用することで、所定の融解ピークよりも低いおよび高い温度間隔において蛍光を測定して、増幅後に標的の存在を解明することが可能になる。図2の左側パネルは、所定のTmを有する単一プローブの融解分析における、2つの蛍光画像(Xで示される温度で撮像される)のみの取得を図示する。画像取得がプローブの所定のTmにおいて行われないことに留意されたい。図2の右側パネルは、それぞれが、それぞれ特有の融解ピーク(Tm1= 65℃、Tm2= 75℃、およびTm3= 85℃)を有し、同じ蛍光チャネルにおいて検出可能である、3種のプローブを含有する反応混合物に関して、融解プロファイルを作成するために4つの画像のみが必要であることを図示する。第1画像は、PCR増幅において用いられるプライマーのアニーリング温度におけるか、またはそれよりもわずかに低い温度T1であって、増幅後に、それらの対応する標的に遭遇したすべてのプローブが、ハイブリダイズした二重鎖状態にある温度T1において取得される。第2画像は、Tm1プローブは変性するが、Tm > Tm1を有するプローブはハイブリダイズした状態のままである温度T2において取得される。第3画像は、Tm2とTm3の中間にある温度、T3において取得される。第4画像は、Tm3よりも高く、すべてのプローブが変性する変性温度T4において取得される。dPCR適用では、全4つの取得画像について、個々の区画における平均蛍光強度が測定される。
dPCR増幅前および増幅後の両方で取得された画像を使用してデータ分析を最適化するための戦略もまた提供される。そのような戦略は、融解分析中に測定された蛍光強度を正規化するために、増幅前または増幅後に取得された画像を使用すること(実施例2を参照されたい)、ならびに増幅前および増幅後の画像を使用して、陽性シグナルおよび陰性シグナルをバックグラウンドと区別するためのバックグラウンド(陰性区画)閾値を確立すること(実施例3を参照されたい)を含む。さらなる態様(実施例4を参照されたい)は、温度プロファイルにわたる蛍光強度の温度依存的および光線量依存的変化を考慮するために、融解分析中に取得された画像を補正するための方法を提供する。例えば、FAMは光感受性が非常に高いことが公知であり、光曝露の増加により蛍光強度の減少を示し、FAMおよびHEXなどの多くの色素は、より高温で蛍光の減少を示す。
性としての区画分類の改善を提供し、これは定量化の改善をもたらす。融解分析のためにDNAインターカレート色素に依存する方法とは対照的に、本発明の方法は、アッセイ設計(例えば、プライマー領域、アンプリコン長、等)における適応性を維持しながら特異性を向上させるために、標的特異的プローブの融解分析を使用する。加えて、記載される方法は、標的核酸を検出および同定するために低分解能デジタル融解プロファイルの使用に依存し、これは、融解データの取得および分析を単純化し、最終的により迅速なデータ取得およびデータの分析をもたらす。
dPCRにおいて対照を利用するための戦略は、サンプル処理およびdPCRを単一の装置およびワークフローに組み入れるdPCRシステム(サンプル-回答型)、またはサンプル処理とdPCRワークフローとの間の分離を維持するシステムについて記載されている。記載されている方法はすべて、dPCRシステム、特に単一反応コンパートメントまたは区画中の複数の標的を同定するために融解分析を利用するdPCRシステムを用いる標的定量化において精度を最適化することを目的としている。本明細書に記載される方法は、装置性能を測定することができる参照データセットおよび基準を作成するために、較正色素、プローブ、および対照標的に依存する。これらの色素、プローブ、および標的での試験を、サンプル反応とは別々に、またはサンプル反応と同時に行って、サンプル処理、光学系、および温度制御を含むシステム性能を検証することができる。好ましい態様は、サンプル試験反応と同時に実行される対照反応、およびサンプル試験反応とは別々に実行される対照反応を含む。
以下の実施例は、本発明の好ましい態様を実証するために含められる。当業者には理解されるように、以下の実施例に開示された技術は、本発明の実施において良好に機能すると本発明者によって見出された技術を表しており、したがって、その好ましい実施形態を構成すると見なすことができる。しかし、当業者であれば、本開示に照らして、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、開示された特定の態様において多くの変更を行うことができ、依然として同様のまたは類似の結果を得ることができることを認識すべきである。
リアルタイムPCRでは、ROXなどの受動的参照色素を使用するウェル間の正規化により、光学系および反応体積の変動によって生じる変動性が最小限に抑えられる。同様の正規化スキームは、アレイベースのデジタルPCRにおいて有益であると考えられるが、単一の受動的参照色素に専念するチャネルを含めることは、最終的にシステムの多重化能力を制限することになる。記載される態様では、選択された蛍光チャネルにおける完全に変性したプローブが、各区画内の内部受動的参照色素として役立ち得る。一例では、すべてのプローブが変性し、したがって最大蛍光を示す温度(例えば、95℃)で、画像を取得する。この95℃の画像は、区画化後であるが、核酸増幅の前、または核酸増幅後の融解分析の過程で取得することができる。画像内で区画を同定し、区画当たりの平均ピクセル強度を決定する。様々な温度での融解系列で取得されたすべての区画平均強度は、融解分析中に測定された強度から95℃の平均強度を減算することにより、区画特異的な変動を考慮して、対応する95℃の区画平均強度に対して正規化することができる。
デジタルPCRを用いた正確な定量化のためには、陰性区画と陽性区画の正確な分類が必要である。既存のdPCR法は、区画を標的核酸について陽性または陰性として分類するために、エンドポイント画像化のみに依存する。本発明の方法では、区画化後であるが核酸増幅の前に、区画アレイの画像を取得する(図9A)。この段階では、各区画は理論的には、標的特異的プローブに由来する同じ均一な蛍光強度を有するはずである。しかしながら、実際には、異なる区画の平均強度値は、いくらかの分散または標準偏差を伴った平均値または予測値に関する分布に従う。コンパートメントの平均強度値は、前述されたように算出される。
核酸増幅後、特定の標的を同定するための融解分析は、55℃〜95℃の温度範囲にわたって行われる。いくつかの蛍光色素の蛍光強度は、この温度範囲内で可変的であることが示されている。加えて、FAM(フルオレセインの誘導体)などのいくつかの色素は、複数の画像取得の間に持続されるような繰り返しの光曝露の結果として光退色を示すことが公知である (Song et al., Photobleaching Kinetics of Fluorescein in Quantitative Fluorescence Microscopy, Biophysical Journal, 68, 2588-2600 (1995))。
増幅後、最初に、融解分析温度プロファイルの中で最も低い温度 (T1) で画像を取得する。蛍光の温度依存的および光線量依存的な減衰に関する補正を、実施例3に記載された方法のうちの1つを使用して、すべての画像に適用する必要がある。T1画像における平均または積分区画強度を、次いで、実施例1に記載されたように、温度サイクリング前もしくは後に得られたT4での画像または温度サイクリングの前にT1で得られた画像のいずれかによって正規化する。静的アレイdPCRの場合、補正および正規化は、画像全体にわたって、または個々の区画内の平均もしくは積分強度について、ピクセルごとに適用することができる。液滴dPCRの場合には、画像取得中に液滴が移動する場合、液滴ごとの区画蛍光の比を決定する前に、最初に2つの画像から液滴を同定し相関させる必要があると考えられる。その後の分析は、T1画像の補正および正規化によって決定された平均強度を使用して、または数式5に示されるような、補正および正規化されたT1画像とT4画像との間の差を使用して行うことができる。
一重連続分析
一重PCRを、本明細書において標的Bと称される標的に対して行い、74℃の予測Tmを有する、米国出願番号第14/822,288号に記載されているような切断可能なプローブを使用して検出した。PCRサンプルは、10mM ビス-トリスプロパン (pH 9.1)、0.3mg/mL BSA、100μM dNTP、90μM DTT、1μM Dabcyl-diGTP、10mM トリス塩基、2.5mM MgCl2、および50mM KClを含有する緩衝液中に調製した。反応物中に含めた酵素には、4XのTiTaq (Clontech) および16 mU/uLのHot Start RNase H2 (Takara) が含まれる。フォワードプライマーB(標的Bに対する)
は480nMの濃度で含め、リバースプライマーB
は120nMの濃度で含め、プローブB
は300nMの濃度で含めた。Ultramer B
は、907コピー/uLの予測濃度で含めた。アッセイが予測通りに行われたことを確実にするために、鋳型なしの対照反応物を含めたが、データは本明細書に含めていない。連続融解分析のために、製造業者の説明書に従って、QuantStudio 3D (QS3D) ローダーおよびv2デジタルPCRチップ(チップ当たり14.5μL)を使用してサンプルを複数の区画に区画化し、密封した。
連続融解一重PCRについて前述された通りに、サンプル反応物を調製し、デジタル化し、温度サイクリングを行った。融解画像を、プローブの予測Tmよりも低い温度 (T1 = 67℃) およびプローブの予測Tmよりも高い温度 (T2 = 78℃) で取得し、各区画の平均強度を各温度で測定した(図12A)。画像を、95℃で取得された画像に対して正規化し(図12C)、T2/T1の比を決定した(図B)。k-meansを用いて区画を分類し、標的濃度は1,050コピー/μLであると決定された。
多重連続融解分析
連続融解分析を用いて、サンプル中の複数の標的の存在を決定した。対応するプローブがそれぞれ63℃、74℃、および85℃のTmを有する3種の標的(A、B、およびC)を、各反応物中に含めた。サンプルおよび増幅緩衝液は、上記の通りに調製した。それぞれ標的AおよびCのためのフォワードプライマーAFおよびCF
、リバースプライマーARおよびCR
、ならびにプローブAPおよびCP
を、標的Bのための前述のプライマーおよびプローブと共に、標的Bについて記載されたのと同じ濃度で含めた。同様に、2種類のさらなる鋳型(AおよびC)を含めた
。標的Aは770コピー/μLの濃度で含め、標的Bは453コピー/μLの濃度で含め、標的Cは775コピー/μLの濃度で含めた。サンプルは、前述通りに区画化し、温度サイクリングを行い、融解させた。画像を同じカスタムソフトウェアを用いて分析し、融解温度の全範囲にわたって区画内の平均シグナル強度を決定した。図13A、C、E、およびGは、生データ (A)、95℃正規化データ、(C) 温度および蛍光減衰補正データ (E)、ならびに融解微分値 (G) の融解曲線を表す。
前述された通りに、サンプル反応物を調製し、デジタル化し、温度サイクリングを行った。融解画像を、T1 = 57℃、T2 = 69℃、T3 = 81℃、T4 = 93℃の4つの温度で取得し、4つの画像について各区画の平均強度を測定し(図14A)、95℃に対して正規化し(図14C)、ならびに温度依存性および光量依存性について補正した(図14E)。また、57℃の画像における全区画の1D振幅プロットも示し、これは、0、1、2、または全3種の標的を含む区画を分類するために使用することができる(図14B)。鋳型Aの濃度を決定するために、T2/T1の比を決定した(図14D)。k-meansを用いて区画を分類し、数式1を用いて標的濃度を決定した。鋳型Bについては、T3/T2の比を決定し、k-meansを用いて区画を分類し、数式1を利用した(図14F)。最後に、鋳型Cについては、T4/T3の比を決定し、k-meansを用いて区画を分類し、数式1を用いて鋳型濃度を決定した(図14G)。一重の場合に実証されたように、多重反応における不連続融解分析によって、連続融解分析で測定された濃度と実質的に同一の推定濃度が得られた。一重および多重の両方の、連続 対 不連続融解分析の、算出された標的濃度を表1に示す。
本実施例は、米国出願番号第14/823,288号に記載されているような、所定の融解プロファイルを有する標的特異的プローブ使用する、dPCR解析のための例示的なワークフローを提供する。そのようなプローブは、プローブが標的核酸と遭遇した結果として二重鎖立体構造にあるか、または一本鎖構造にあるかに基づいて、識別可能なシグナルを示す。これらのプローブに関して、最大蛍光は、プローブに結合されたフルオロフォアの結果として、標的核酸に遭遇する前の任意の温度において、または標的核酸に遭遇した後に二重鎖の所定のTmを上回る温度において、プローブに組み込まれたクエンチャーが、分子内二重鎖がこれらの温度で解離する際にフルオロフォアから分離される場合に、検出され得ることに留意されたい。このワークフローは、必ずしもこれらのプローブに限定されるものではなく、同様の標識付加スキームを有する他の種類のプローブにも適用することができる。
以下の参考文献は、本明細書に記載されたものに補足的な例示的手順または他の詳細を提供する程度に、参照により本明細書に具体的に組み入れられる。
公開出願WO 2015023616 (Yang et al.)
Velez, et al., Scientific Reports, 7 (2017): 42326,
Claims (100)
- 以下の段階を含む、反応混合物中の標識付加二重鎖核酸について融解分析を行う方法であって、標識付加二重鎖核酸は所定Tmを有する、前記方法:
(a) 標識付加二重鎖核酸の所定Tmよりも低い第1温度において、標識付加二重鎖核酸からの第1シグナルを測定する段階;
(b) 標識付加二重鎖核酸の所定Tmにおいてシグナルを測定せずに、該所定Tmよりも高い第2温度において、標識付加二重鎖核酸からの第2シグナルを測定する段階;および
(c) 第1シグナルと第2シグナルを比較し、第1シグナルと第2シグナルとの間に変化がある場合に、標識付加二重鎖核酸が反応混合物中での標的特異的プローブの標的配列への特異的ハイブリダイゼーションの結果であると判定する段階。 - 標的特異的プローブが、標的特異的プローブの標的配列への特異的ハイブリダイゼーションの際に切断される切断可能なプローブである、請求項1記載の方法。
- シグナルが、標識付加二重鎖核酸の所定Tmから2セルシウス度の範囲内では測定されない、請求項1または2記載の方法。
- シグナルが、標識付加二重鎖核酸の所定Tmから5セルシウス度の範囲内では測定されない、請求項1または2記載の方法。
- 第1温度と第2温度との差が2セルシウス度よりも大きい、請求項1または2記載の方法。
- 第1温度と第2温度との差が5セルシウス度よりも大きい、請求項1または2記載の方法。
- 第1温度と第2温度との差が8セルシウス度よりも大きい、請求項1または2記載の方法。
- 反応混合物中のすべての標識付加二重鎖核酸が変性する第3温度において第3シグナルを測定する段階、ならびに第1および第2シグナルを第3シグナルに対して正規化する段階をさらに含む、請求項1または2記載の方法。
- 反応混合物が、それぞれが特有の所定Tmを有する少なくとも2種類の異なる二重鎖核酸を含有し、それぞれの異なる二重鎖核酸が、同じシグナル発生標識を有する、請求項1記載の方法であって、以下の段階をさらに含む、前記方法:
(d) 標識付加二重鎖核酸の特有の所定Tmよりも低い温度および標識付加二重鎖核酸の特有の所定Tmよりも高い温度において、それぞれの異なる標識付加二重鎖核酸からのシグナルを測定する段階であって、
ここで、それぞれの異なる標識付加二重鎖核酸について、特有の所定Tmよりも低い温度で測定されたシグナルおよび特有の所定Tmよりも高い温度で測定されたシグナルにおける変化は、標識付加二重鎖核酸が標的特異的プローブのその標的への特異的ハイブリダイゼーションの結果であることを示す、
段階。 - シグナルが、n + 1種類以下の異なる温度において測定され、nは、反応混合物中の異なる標的特異的プローブの数である、請求項9記載の方法。
- 第1シグナルと第2シグナルとの間の変化が所定の閾値を超える、請求項1または2記載の方法。
- (a) 反応混合物中に標的核酸配列が存在する場合にそれに特異的にハイブリダイズし得る少なくとも1種の切断可能な標的特異的プローブに、ハイブリダイゼーション条件下でサンプルを接触させる段階、
(b) 標的核酸配列に特異的にハイブリダイズしたプローブを切断して、切断型プローブを形成させる段階;
(c) 切断型プローブを捕捉配列にハイブリダイズさせる条件を提供する段階;
(d) 切断型プローブを伸長させて、所定Tmおよびシグナル発生標識を有する二重鎖核酸を形成させる段階;
(e) 所定Tmにおいてシグナルを測定せずに、所定Tmよりも低い温度において第1シグナルを測定し、所定Tmよりも高い温度において第2シグナルを測定する段階、ならびに
(f) 第1シグナルと第2シグナルとの間の変化を検出することにより、標的核酸配列の存在を決定する段階
を含む、サンプル中の少なくとも1種の標的核酸配列の存在を決定するための方法。 - サンプルが、それぞれが異なる標的核酸配列に特異的である少なくとも2種類の異なる切断可能なプローブに接触され、その特異的標的核酸配列の存在下で、それぞれの異なる切断可能なプローブが、特有の所定Tmを有する二重鎖核酸を形成し、特有の所定Tmを有する二重鎖核酸がすべて、同じシグナル発生標識を有する、請求項12記載の方法であって、以下の段階をさらに含む、前記方法:
特有の所定Tmを有するそれぞれの二重鎖核酸について、所定Tmよりも低い温度において第1シグナルを測定し、所定Tmよりも高い温度において第2シグナルを測定する段階、ならびに
第1シグナルと第2シグナルとの間の変化を検出することにより、標的核酸配列の存在を決定する段階。 - シグナルが、n + 1種類以下の異なる温度において測定され、nは、反応混合物中の異なる切断可能なプローブの数である、請求項13記載の方法。
- 異なる二重鎖核酸の特有の所定Tmが少なくとも2セルシウス度異なる、請求項13記載の方法。
- 異なる二重鎖核酸の特有の所定Tmが少なくとも5セルシウス度異なる、請求項13記載の方法。
- 異なる二重鎖核酸の特有の所定Tmが少なくとも10セルシウス度異なる、請求項13記載の方法。
- 捕捉配列と切断型プローブが単分子である、請求項12記載の方法。
- 捕捉配列と切断型プローブが二分子である、請求項12記載の方法。
- 第1シグナルと第2シグナルとの間の比が所定の閾値を超える場合に、標的核酸が存在すると判定される、請求項12記載の方法。
- シグナルが、所定Tmから2セルシウス度の範囲内の温度では測定されない、請求項12記載の方法。
- シグナルが、所定Tmから5セルシウス度の範囲内の温度では測定されない、請求項12記載の方法。
- 少なくとも1種の切断可能なプローブが、レポーター-クエンチャー対の第1メンバーで標識され、少なくとも1種の切断可能なプローブは、その標的核酸配列にハイブリダイズした場合に第1立体構造をとる、請求項12記載の方法。
- 少なくとも1種の切断可能なプローブがその標的配列に特異的にハイブリダイズすると、切断部位においてプローブが切断され、切断型プローブが標的核酸配列から放出されて第2立体構造をとり、切断部位から鎖伸長が起こる、請求項23記載の方法。
- 鎖伸長が、レポーター-クエンチャー対の第1メンバーと相互作用するレポーター-クエンチャー対の第2メンバーを取り込むことを含む、請求項24記載の方法。
- 第1立体構造が直鎖状立体構造であり、第2立体構造がヘアピン立体構造である、請求項24記載の方法。
- (a) 標識付加二重鎖核酸が第1立体構造にある第1温度において、標識付加二重鎖核酸からの第1シグナルを測定する段階;
(b) 標識付加二重鎖核酸が第2立体構造にある第2温度において、標識付加二重鎖核酸からの第2シグナルを測定する段階であって、シグナルは第1温度と第2温度の中間にある温度において測定されない、段階;および
(c) 第1シグナルと第2シグナルを比較することにより、標識付加二重鎖核酸が標的特異的プローブの標的配列への特異的ハイブリダイゼーションの結果であるかどうかを判定する段階であって、第1シグナルと第2シグナルとの間の変化は、標識付加二重鎖核酸が標的特異的プローブの標的配列への特異的ハイブリダイゼーションの結果であることを示す、段階
を含む、反応混合物中の標識付加二重鎖核酸の融解分析を行う方法。 - 反応混合物が、少なくとも2種類の異なる標識付加二重鎖核酸を含有し、それぞれの異なる標識付加二重鎖核酸が、特有の温度において第2立体構造をとることができ、それぞれの異なる標識付加核酸が、同じシグナル発生標識を有する、請求項27記載の方法であって、以下の段階をさらに含む、前記方法:
それぞれの標識付加二重鎖核酸について、標識付加二重鎖核酸が主に第1立体構造にある温度において第1シグナルを測定する段階、および標識付加二重鎖核酸が主に第2立体構造にある温度において第2シグナルを測定する段階、ならびに第1シグナルと第2シグナルを比較する段階。 - シグナルが、n + 1種類以下の異なる温度において測定され、nは、反応混合物中の異なる二重鎖核酸の数である、請求項28記載の方法。
- 第1立体構造がヘアピン立体構造であり、第2立体構造が直鎖状立体構造である、請求項27記載の方法。
- 標的特異的プローブが、レポーター-クエンチャー対の第1メンバーで標識された切断可能なプローブである、請求項27記載の方法。
- 標的特異的プローブがその標的配列に特異的にハイブリダイズすると、切断部位においてプローブが切断されて切断型プローブを形成し、該切断型プローブが標的核酸配列から放出されてヘアピンプローブを形成し、該切断部位から鎖伸長が起こる、請求項31記載の方法。
- 鎖伸長が、レポーター-クエンチャー対の第1メンバーと相互作用するレポーター-クエンチャー対の第2メンバーを取り込んで、シグナルの変化を生じることを含む、請求項32記載の方法。
- (a) 標的核酸配列が存在する場合にそれに特異的にハイブリダイズし得る少なくとも1種の切断可能なプローブに、サンプルを接触させる段階であって、切断可能なプローブはシグナル発生標識を含む、段階;
(b) 標的核酸配列に特異的にハイブリダイズしたプローブを切断して、切断型プローブを形成させる段階;
(c) 切断型プローブと相補的である配列を含む捕捉配列に切断型プローブをハイブリダイズさせる条件を提供する段階;
(d) 捕捉配列を鋳型として用いて切断型プローブを伸長させて、所定Tmを有する二本鎖プローブを形成させる段階;
(e) 所定Tmにおいてシグナルを測定せずに、所定Tmよりも低い第1温度においてシグナル発生標識からの第1シグナルを測定し、所定Tmよりも高い第2温度において第2シグナルを測定する段階、ならびに
(f) 第1温度と第2温度において測定されたシグナルの変化を検出することにより、標的核酸配列の存在を決定する段階
を含む、サンプル中の少なくとも1種の標的核酸配列の存在または非存在を検出するための方法。 - それぞれが異なる標的核酸に特異的であり、かつそれぞれがその各々の標的核酸の存在下で、特有の所定Tmを有する二本鎖プローブを形成し得る、2種類またはそれ以上の異なる切断可能なプローブに、サンプルを接触させ、それぞれの異なる二本鎖プローブが、同じレポーター-クエンチャー対を含む、請求項34記載の方法であって、以下の段階をさらに含む、前記方法:
それぞれの異なる二本鎖プローブについて、所定Tmよりも低い第1温度において第1シグナルを測定し、所定Tmよりも高い第2温度において第2シグナルを測定する段階、ならびにそれぞれの異なる二本鎖プローブについて測定された第1シグナルと第2シグナルを比較する段階。 - 捕捉配列と切断型プローブが単分子である、請求項34記載の方法。
- 捕捉配列と切断型プローブが二分子である、請求項34記載の方法。
- 単一の反応コンパートメント中で、2種類またはそれ以上の異なる切断可能なプローブにサンプルを接触させる、請求項35記載の方法。
- シグナルが、n + 1種類以下の異なる温度において測定され、nは、反応コンパートメント中の異なる切断可能なプローブの数である、請求項38記載の方法。
- 異なる二本鎖プローブの特有の所定Tmが少なくとも2セルシウス度異なる、請求項35記載の方法。
- 異なる二本鎖プローブの特有の所定Tmが少なくとも5セルシウス度異なる、請求項35記載の方法。
- 異なる二本鎖プローブの特有の所定Tmが少なくとも8セルシウス度異なる、請求項35記載の方法。
- 第1シグナルと第2シグナルとの間の比が所定の閾値を超える場合に、標的核酸が存在すると判定される、請求項34記載の方法。
- シグナルが、所定Tmから2セルシウス度の範囲内の温度では測定されない、請求項34記載の方法。
- シグナルが、所定Tmから5セルシウス度の範囲内の温度では測定されない、請求項34記載の方法。
- シグナル発生標識が、レポーター-クエンチャー対の第1メンバーであり、二本鎖プローブが、レポーター-クエンチャー対の第1メンバーと相互作用するレポーター-クエンチャー対の第2メンバーを含む、請求項34記載の方法。
- 切断可能なプローブが、シグナル発生標識が付着している第1非天然ヌクレオチドを含み、二重鎖核酸が、第1非天然ヌクレオチドにハイブリダイズする第2非天然ヌクレオチドを含み、レポーター-クエンチャー対の第2メンバーが、第2非天然ヌクレオチドに付着している、請求項46記載の方法。
- レポーター-クエンチャー対の第1メンバーが、蛍光実体であり、レポーター-クエンチャー対の第2メンバーが、蛍光実体の蛍光を消光するクエンチャーである、請求項46および47のいずれか一項記載の方法。
- 第1および第2非天然ヌクレオチドが、iso-Cおよびiso-Gのうちの1つである、請求項47記載の方法。
- (a) 少なくとも第1、第2、および第3標識付加二重鎖核酸を提供する段階であって、
ここで、第1、第2、および第3標識付加二重鎖核酸のそれぞれは特有の所定Tmを有し、
第2標識付加二重鎖核酸の特有の所定Tmは、第1標識付加二重鎖核酸の特有の所定Tmよりも高く、
第3標識付加二重鎖核酸の特有の所定Tmは、第2標識付加二重鎖核酸の特有の所定Tmよりも高く、
ここで、第1、第2、および第3標識付加二重鎖核酸は同じ標識で標識付加されている、
段階;
(b) 第1標識付加二重鎖核酸の特有の所定Tmよりも低い第1温度において、第1、第2、および第3標識付加二重鎖核酸からの第1シグナルを検出する段階;
(c) 第1標識付加二重鎖核酸の特有の所定Tmと第2標識付加二重鎖核酸の特有の所定Tmとの間の第2温度において、第1、第2、および第3標識付加二重鎖核酸からの第2シグナルを検出する段階;
(d) 第2標識付加二重鎖核酸の特有の所定Tmと第3標識付加二重鎖核酸の特有の所定Tmとの間の第3温度において、第1、第2、および第3標識付加二重鎖核酸からの第3シグナルを検出する段階;
(e) 第3標識付加二重鎖核酸の特有の所定Tmよりも高い第4温度において、第1、第2、および第3標識付加二重鎖核酸からの第4シグナルを検出する段階;ならびに
(f) 第1、第2、第3、および第4シグナルを比較することにより、第1、第2、および第3標識付加二重鎖核酸のうちの1つまたは複数が標的特異的プローブの切断の結果であるかどうかを判定する段階であって、
ここで、第1シグナルと第2シグナルとの間の変化は、第1標識付加二重鎖核酸が第1標的特異的プローブの切断の結果であることを示し、第2シグナルと第3シグナルとの間の変化は、第2標識付加二重鎖核酸が第2標的特異的プローブの切断の結果であることを示し、第3シグナルと第4シグナルとの間の変化は、第3標識付加二重鎖核酸が第3標的特異的プローブの切断の結果であることを示す、
段階
を含む、複数の標識付加核酸二重鎖について融解分析を行う方法。 - シグナルが、第1、第2、および第3標識付加二重鎖核酸の特有の所定Tmにおいて検出されない、請求項50記載の方法。
- 第1温度と第2温度との間の差が2セルシウス度よりも大きく、第2温度と第3温度との間の差が2セルシウス度よりも大きく、第3温度と第4温度との間の差が2セルシウス度よりも大きい、請求項50記載の方法。
- 反応混合物中のすべての二重鎖核酸が変性する第3温度において第3シグナルを測定する段階、ならびに第1および第2シグナルを第3シグナルに対して正規化する段階をさらに含む、請求項12、27、または34記載の方法。
- 前記段階がdPCR反応における複数の区画において行われる、請求項1、12、27、34、または50記載の方法。
- 第1および第2シグナルが、第1および第2シグナルから第3シグナルを減算することにより、第3シグナルに対して正規化される、請求項8または53記載の方法。
- 第1および第2シグナルが、第1および第2シグナルを第3シグナルで割ることにより、第3シグナルに対して正規化される、請求項8または53記載の方法。
- 前記段階がdPCR反応における複数の区画にわたって行われる、請求項12または34記載の方法であって、以下の段階をさらに含む、前記方法:
切断の前に、複数の区画における切断可能なプローブの標識からのシグナルを測定する段階、および、切断の前に測定されたシグナルを用いて、標的核酸を含む区画と標的核酸を含まない区画を区別するための閾値を設定する段階。 - 前記段階がdPCR反応における複数の区画にわたって行われる、請求項12または34記載の方法であって、以下の段階をさらに含む、前記方法:
切断の前に、ある範囲の温度において複数のシグナルを測定する段階、ならびに、測定されたシグナルを用いて、融解分析中に測定されたシグナルにおける光および温度依存的変化を補正する段階。 - 前記段階がdPCR反応における複数の区画にわたって行われる、請求項1、12、27、または34記載の方法であって、以下の段階をさらに含む、前記方法:
標的核酸の存在を決定する段階の前に、第1シグナルと第2シグナルとの間に変化がない区画を標的陰性区画として同定する段階、ならびに、標的陰性区画から測定されたシグナルを用いて、各区画において測定された第1および第2シグナルにおける光および温度依存的変化を正規化する段階。 - (a) サンプルとシグナル発生標的特異的プローブとを含む反応混合物を提供する段階であって、標的特異的プローブは、第1一本鎖立体構造にある場合に第1シグナルを生じる、段階;
(b) 反応混合物中の標的特異的プローブからの第1シグナルを測定する段階;
(c) 標的核酸が存在する場合にそれに標的特異的プローブがハイブリダイズして第2立体構造をとるための条件を提供する段階であって、第2立体構造が、所定Tmを有しかつ所定Tmよりも低い温度において第2シグナルを生じ得る二重鎖核酸である、段階;
(d) 所定Tmにおいてシグナルを測定せずに、所定Tmよりも低い温度において二重鎖核酸からの第2シグナルを測定する段階;
(e) 第1シグナルと第2シグナルとの間に差がある場合に、標的核酸の存在を決定する段階
を含む、サンプル中の標的核酸の存在を決定するための方法。 - 標的特異的プローブが、標的核酸へのハイブリダイゼーションの際に切断されて切断型プローブを形成する、切断可能なプローブである、請求項60記載の方法。
- 切断型プローブが、捕捉配列に結合し、伸長されて二重鎖核酸を形成する、請求項61記載の方法。
- 第1および第2シグナルが蛍光シグナルである、請求項60記載の方法。
- 第1シグナルが、標的特異的プローブの標的核酸へのハイブリダイゼーションの前に検出される、請求項60記載の方法。
- 第1シグナルが、標的特異的プローブが第1立体構造にある条件下で、切断および伸長の後に検出される、請求項62記載の方法。
- 切断可能なプローブが、レポーター-クエンチャー対の第1メンバーで標識された第1非天然ヌクレオチドを含み、二重鎖核酸が、第1非天然ヌクレオチドと塩基対合することができかつレポーター-クエンチャー対の第2メンバーで標識された第2非天然ヌクレオチドを含む、請求項61記載の方法。
- 第1および第2非天然ヌクレオチドが、iso-Cおよびiso-Gのうちの1つである、請求項66記載の方法。
- 標的特異的プローブが、捕捉配列への結合前にフルオロフォアで標識され、クエンチャーが、フルオロフォアの消光をもたらす位置において二重鎖核酸中に取り込まれる、請求項62記載の方法。
- 反応混合物が、段階 (b) の後に標的核酸の増幅のための条件に供される、請求項60記載の方法。
- 捕捉配列と切断型プローブが単分子であり、ハイブリダイズしてヘアピンプローブを形成する、請求項62記載の方法。
- 捕捉配列と切断型プローブが二分子である、請求項62記載の方法。
- (a) サンプルと、反応混合物中に標的核酸配列が存在する場合にそれに特異的にハイブリダイズし得る少なくとも1種の標識付加された切断可能な標的特異的プローブとを含む反応混合物を提供する段階であって、標識がレポーター-クエンチャー対の第1メンバーである、段階;
(b) 反応混合物中の標識付加標的特異的プローブからの第1シグナルを測定する段階;
(c) 反応混合物中に標的核酸配列が存在する場合にそれに標識付加切断可能標的特異的プローブをハイブリダイズさせる条件を提供する段階;
(d) 標的核酸配列に特異的にハイブリダイズしたプローブを切断して、切断型プローブを形成させる段階;
(e) 切断型プローブを捕捉配列にハイブリダイズさせる条件を提供する段階;
(f) 切断型プローブを伸長させて、レポーター-クエンチャー対の第2メンバーと所定Tmとを有する二重鎖核酸を形成させる段階;
(g) 所定Tmよりも低い温度において第2シグナルを測定する段階;ならびに
(h) 第1シグナルと第2シグナルとの間に所定の閾値を超える差がある場合に、標的核酸の存在を検出する段階
を含む、サンプル中の標的核酸の存在を検出するための方法。 - 捕捉配列と切断型プローブが単分子であり、ハイブリダイズしてヘアピンプローブを形成する、請求項72記載の方法。
- 捕捉配列と切断型プローブが二分子である、請求項72記載の方法。
- 標的特異的プローブが、レポーター-クエンチャー対の第1メンバーが付着している第1非天然ヌクレオチドを含み、二重鎖核酸が、レポーター-クエンチャー対の第2メンバーが付着している第2非天然ヌクレオチドを含み、第1非天然ヌクレオチドと第2非天然ヌクレオチドが互いに塩基対合し得る、請求項72記載の方法。
- 第1および第2非天然ヌクレオチドが、isoCおよびisoGの一方または他方である、請求項75記載の方法。
- レポーター-クエンチャー対の第1メンバーがフルオロフォアであり、レポーター-クエンチャー対の第2メンバーがクエンチャーである、請求項72記載の方法。
- (a) サンプルとシグナル発生標的特異的プローブとを含む反応混合物を提供する段階であって、標的特異的プローブは、第1一本鎖立体構造にある場合に第1シグナルを生じる、段階;
(b) 反応混合物中の標的特異的プローブからの第1シグナルを測定する段階;
(c) 反応混合物を標的核酸の増幅のための条件に供する段階であって、増幅中に、標的特異的プローブは修飾されて、所定Tmを有しかつ所定Tmよりも低い温度において第2シグナルを生じ得る二重鎖核酸を含む修飾型標的特異的プローブを形成する、段階;
(d) 所定Tmにおいてシグナルを測定せずに、所定Tmよりも低い温度において第2シグナルを測定する段階;
(e) 第1シグナルと第2シグナルとの間に所定の閾値を超える差がある場合に、標的核酸の存在を決定する段階
を含む、サンプル中の標的核酸の存在を決定するための方法。 - 標的特異的プローブが、標的核酸へのハイブリダイゼーションの際に切断され、捕捉配列に結合しかつ伸長されて二重鎖核酸を形成する切断型プローブを形成することによって、修飾される、請求項78記載の方法。
- 第1および第2シグナルが蛍光シグナルである、請求項78記載の方法。
- 第1シグナルが、標的特異的プローブの標的核酸へのハイブリダイゼーションの前に検出される、請求項79記載の方法。
- 第1シグナルが、修飾型標的特異的プローブが一本鎖立体構造にある条件下で、切断および伸長の後に検出される、請求項79記載の方法。
- 標的特異的プローブが、レポーター-クエンチャー対の第1メンバーで標識された第1非天然ヌクレオチドを含み、修飾型標的特異的プローブが、第1非天然ヌクレオチドと塩基対合することができかつレポーター-クエンチャー対の第2メンバーで標識された第2非天然ヌクレオチドを含む、請求項78記載の方法。
- 第1および第2非天然ヌクレオチドが、iso-Cおよびiso-Gのうちの1つである、請求項83記載の方法。
- 標的特異的プローブが、捕捉配列への結合前にフルオロフォアで標識され、クエンチャーが、フルオロフォアの消光をもたらす位置において伸長中に二重鎖核酸中に取り込まれる、請求項79記載の方法。
- (a) 第1および第2蛍光シグナル発生標的特異的プローブと第1および第2標的核酸を含有する可能性のあるサンプルとを含む増幅反応混合物を形成する段階;
(b) 各区画が平均して0個または1個の第1および/または第2標的核酸を含むように、反応混合物を区画化する段階;
(c) 予め選択された温度T1、T2、およびT3において、区画の少なくとも1つのサブセットの画像から第1、第2、および第3セットの蛍光強度値を取得し、区画の該サブセット中の各区画について、予め選択された温度T1における第1蛍光強度値、予め選択された温度T2における第2蛍光強度値、および予め選択された温度T3における第3蛍光強度値を決定する段階;
(d) 第1および第2標的核酸を増幅するための、ならびにその標的核酸の存在下で第1シグナル発生プローブを修飾して第1所定Tmを有する第1二重鎖核酸を形成するための、ならびにその標的核酸の存在下で第2シグナル発生プローブを修飾して第2所定Tmを有する第2二重鎖核酸を形成するための条件に、増幅反応混合物を含む区画を供する段階;
(e) 第1所定Tmよりも低い温度T1において、区画の該サブセットの画像から第4セットの蛍光強度値を取得し、各区画について第4強度値を算出する段階;
(f) 第1所定Tmよりも高いが、第2所定Tmよりも低い温度T2において、区画の該サブセットの画像から第5セットの蛍光強度値を取得し、各区画について第5強度値を算出する段階;
(g) 第2所定Tmよりも高い温度T3において、区画の該サブセットの画像から第6セットの蛍光強度値を取得し、各区画について第6強度値を算出する段階;
(h) 各区画について、第4強度値を第1強度値で割って、T1に関連する第7強度値を得る段階;
(i) 各区画について、第5強度値を第2強度値で割って、T2に関連する第8強度値を得る段階;
(j) 各区画について、第6強度値を第3強度値で割って、T3に関連する第9強度値を得る段階;
(k) 各区画について、第8強度値と第7強度値との間の変化を検出して、第1標的核酸の存在を決定する段階;ならびに
(l) 各区画について、第9平均強度値と第8平均強度値との間の変化を検出して、第2標的核酸の存在を決定する段階
を含む、サンプル中の第1および第2標的核酸の存在を検出する方法。 - 第1および第2蛍光シグナル発生プローブが、同じシグナル発生標識を有する、請求項86記載の方法。
- シグナル発生標識がレポーター-クエンチャー対の第1メンバーであり、第1および第2二重鎖核酸がレポーター-クエンチャー対の第2メンバーを含む、請求項87記載の方法。
- 第1および第2シグナル発生プローブが、レポーター-クエンチャー対の第1メンバーが付着している第1非天然ヌクレオチドを含み、第1および第2二重鎖核酸が、レポーター-クエンチャー対の第2メンバーが付着している第2非天然ヌクレオチドを含み、第1非天然ヌクレオチドと第2非天然ヌクレオチドが互いに塩基対合し得る、請求項88記載の方法。
- 非天然ヌクレオチドがiso-Cまたはiso-Gのうちの1つである、請求項89記載の方法。
- 第1および第2シグナル発生プローブが、増幅中に切断される切断可能なプローブである、請求項86記載の方法。
- 第8強度値と第7強度値との間の変化が所定の閾値を超え、第9強度値と第8強度値との間の変化が所定の閾値を超える、請求項86記載の方法。
- (a) 蛍光シグナル発生標的特異的プローブと標的核酸を含有するサンプルとを含む増幅反応混合物を形成する段階;
(b) 各区画が平均して0個または1個の標的核酸を含むように、反応混合物を区画化する段階;
(c) 予め選択された温度T1およびT2において、区画の少なくとも1つのサブセットの画像から第1および第2セットの蛍光強度値を取得し、区画の該サブセット中の各区画について、予め選択された温度T1における第1蛍光強度値および予め選択された温度T2における第2蛍光強度値を決定する段階;
(d) 標的核酸を増幅するための、およびその標的核酸の存在下でシグナル発生プローブを修飾して所定Tmを有する二重鎖核酸を形成するための条件に、増幅反応混合物を含む区画を供する段階;
(e) 所定Tmよりも低い温度T1において、区画の該サブセットの画像から第3セットの蛍光強度値を取得し、各区画について第3強度値を算出する段階;
(f) 所定Tmよりも高い温度T2において、区画の該サブセットの画像から第4セットの蛍光強度値を取得し、各区画について第4強度値を算出する段階;
(g) 各区画について、第3強度値を第1強度値で割って、T1に関連する第5強度値を得る段階;
(h) 各区画について、第4強度値を第2強度値で割って、T2に関連する第6強度値を得る段階;
(i) 各区画について、第6強度値と第5強度値との間の変化を検出して、標的核酸の存在を決定する段階
を含む、サンプル中の標的核酸の存在を検出する方法。 - 標的核酸が第1標的核酸であり、シグナル発生標的特異的プローブが第1蛍光シグナル発生標的特異的プローブであり、所定Tmが第1所定Tmである、請求項93記載の方法であって、
第2標的核酸の存在を検出する段階であって、反応混合物が第2蛍光シグナル発生標的特異的プローブをさらに含む、段階
をさらに含み、
(j) 段階 (b) において、各区画が平均して0個または1個の第1および/または第2標的核酸を含むように、反応混合物を区画化する段階;
(k) 段階 (c) において、予め選択された温度T3において、区画の少なくとも1つのサブセットの画像から第5セットの蛍光強度値を取得し、区画の該サブセット中の各区画について、予め選択された温度T3における第7蛍光強度値を決定する段階;
(l) 段階 (d) において、標的核酸を増幅するための、およびその標的核酸の存在下で第2シグナル発生プローブを修飾して第2所定Tmを有する第2二重鎖核酸を形成するための条件に、増幅反応混合物を含む区画を供する段階;
(m) 第2所定Tmよりも高い温度T3において、区画の該サブセットの画像から第6セットの蛍光強度値を取得し、各区画について第8強度値を算出する段階;
(n) 各区画について、第8強度値を第7強度値で割って、T3に関連する第9強度値を得る段階;
(o) 各区画について、第9強度値と第6強度値との間の変化を検出して、第2標的核酸の存在を決定する段階
をさらに含む、前記方法。 - 第6強度値と第5強度値との間の変化および第9強度値と第6強度値との間の変化が、所定の閾値を超える、請求項93または94記載の方法。
- 第1および第2蛍光シグナル発生プローブが、同じシグナル発生標識を有する、請求項94記載の方法。
- シグナル発生標識がレポーター-クエンチャー対の第1メンバーであり、第1および第2二重鎖核酸がレポーター-クエンチャー対の第2メンバーを含む、請求項94記載の方法。
- 第1および第2シグナル発生プローブが、レポーター-クエンチャー対の第1メンバーが付着している第1非天然ヌクレオチドを含み、第1および第2二重鎖核酸が、レポーター-クエンチャー対の第2メンバーが付着している第2非天然ヌクレオチドを含み、第1非天然ヌクレオチドと第2非天然ヌクレオチドが互いに塩基対合し得る、請求項94記載の方法。
- 非天然ヌクレオチドがiso-Cまたはiso-Gのうちの1つである、請求項98記載の方法。
- 第1および第2シグナル発生プローブが、増幅中に切断される切断可能なプローブである、請求項94記載の方法。
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