JP2021518764A - サンプル内複数のターゲット核酸配列の検出のための方法及び装置 - Google Patents

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Abstract

本発明は、サイクル／信号変化値のデータセットを収得することによって、１つの検出チャンネルで複数のターゲット核酸配列を効率よく検出することができる。

Description

発明の詳細な説明
［技術分野］
関連出願に対する相互参照
本出願は２０１８年４月２０日付で大韓民国特許庁に提出された大韓民国特許出願第２０１８−００４６３７５号の優先権を主張し、その開示内容は本願に参照として含まれている。
技術分野
本発明は、信号変化値を使用したサンプル内複数のターゲット核酸配列の検出に関するものである。
［背景技術］
リアルタイムＰＣＲはサンプル内のターゲット核酸をリアルタイムに検出するためのＰＣＲ基盤技術である（Logan J et al., (2009). Real-Time PCR: Current Technology and Applications. Caister Academic Press）。ターゲット核酸分子を検出するために、リアルタイムＰＣＲはターゲット分子の量に比例して検出可能な蛍光信号を発生する信号発生組成物を使用する。蛍光信号の発生は二重鎖ＤＮＡの間にインターカレーティングされる時に信号を発生するインターカレーターまたは蛍光レポーター及びクエンチャー分子を有するオリゴヌクレオチドを使用して達成できる。ターゲット分子の量に比例する強度を有する蛍光信号が各増幅サイクルで検出され、増幅サイクルに対してプロッティングされて、増幅曲線（amplification curve）または増幅プロファイル曲線（amplification profile curve）が収得される。
ターゲット核酸配列の検出のために、リアルタイム方式によりターゲット増幅をモニタリングしながらターゲット核酸配列を検出するリアルタイム検出方法が広く使われている。リアルタイム検出方法は、一般的にターゲット核酸配列と特異的に混成化される標識されたプローブまたはプライマーを使用する。代案的な接近法として、ターゲット核酸配列の存在に依存的に形成される二合体を使用するリアルタイム検出方法が提案された。
前記記載された従来のリアルタイム検出技術は、ターゲット増幅と共に、またはターゲット増幅無しで信号増幅過程で選択された検出温度で蛍光標識から発生した信号を検出する。従来のリアルタイム検出技術によって単一反応チューブで単一類型の標識を使用して複数のターゲット核酸配列を検出する場合、前記ターゲット核酸配列に対して発生した信号は互いに区別されない。したがって、従来のリアルタイム検出技術は、一般的に複数のターゲット核酸配列を検出するために相異する類型の標識を使用する。Ｔｍ差を使用したメルティング分析は単一類型の標識にもかかわらず、複数のターゲット核酸配列を検出することができる。しかしながら、メルティング分析はリアルタイム技術より作業時間が長く、ターゲット配列の増加時、相異するＴｍ値を有するプローブの設計がより困難になる深刻な短所がある。また、メルティング分析はリアルタイム検出方法とは異なり、Ｃｔ値を提供しないので、定量適用に限界がある。
単一反応容器で同一の信号特性を有する標識及び単一類型の検出機を使用して複数のターゲット核酸配列を検出するために、メルティング分析に依存しない新たな方法または接近法が開発された。
国際出願公開第２０１５／１４７４１２号は相異する検出温度を用いてサンプル内複数のターゲット核酸配列を検出する方法を開示する。前記方法は検出しようとするターゲット核酸配列の数と同一の数の検出温度で信号を測定することを特徴とする。前記方法は１つのターゲット核酸配列当たり少ない数の検出温度を使用する長所があるが、検出温度要件を満たすために相対的に遠く分離された検出温度が選択されなければならない。
米国特許出願公開第２００５／００５３９５０号はターゲット核酸配列のアンプリコン及びインターカレーティング染料を使用してターゲット核酸配列を検出する方法を開示する。前記方法は検出のためにアンプリコンの間のＴｍ差を採択する。しかしながら、相異するターゲット核酸配列に対するアンプリコンのＴｍ値を調節することは困難である。また、前記アンプリコンは相対的に長いヌクレオチド長さを有しているので、検出温度での狭い温度変化により充分の信号変化を誘導することに限界がある。
米国特許第８，０３９，２１５号は、サイクルでメルティング分析を遂行し、各サイクルでターゲットのメルティングピークをプロッティングしてターゲットに対する増幅曲線を生成する方法を開示している。各サイクルでのメルティング分析は過程に時間がかかり過ぎる。
本明細書の全体に亘って多数の論文及び特許文献が参照され、その引用が標識されている。引用された論文及び特許文献の開示内容はその全体として本明細書に参照として挿入されて本発明が属する技術分野の水準及び本発明の内容がより明確に説明される。
［発明の内容］
本発明者らは単一反応容器で同一の信号特性を有する標識を使用して複数のターゲット核酸配列を検出するための新規な方法を開発するために例の研究した。その結果、本発明者らは２つの温度で標識されたオリゴヌクレオチドを含む二合体から収得された信号値により計算された信号変化値が複数のターゲット核酸配列の存在または不存在を決定できるようにすることを確認した。
したがって、本発明の目的は信号変化値を使用して複数のターゲット核酸配列を検出する方法を提供することにある。
本発明の更に他の目的は、プロセッサが信号変化値を使用して複数のターゲット核酸配列の存在を決定する方法を実行するように構成する命令を含むコンピュータ読取可能な格納媒体を提供することにある。
本発明の更に他の目的は、信号変化値を使用して複数のターゲット核酸配列を検出する装置を提供することにある。
本発明の更に他の目的は、信号変化値を使用してターゲット核酸配列を検出する方法を提供することにある。
本発明の更に他の目的は、プロセッサが信号変化値を使用してターゲット核酸配列の存在を決定する方法を遂行するように構成される命令を含むコンピュータ読取可能な格納媒体を提供することにある。
本発明の更に他の目的は、信号変化値を使用してターゲット核酸配列を検出する装置を提供することにある。
本発明の他の目的及び利点は、添付の請求範囲及び図面と共に以下の詳細な説明から明らかになる。
［発明の効果］
本発明の特徴及び利点を要約すると、次の通りである：
（ａ）本発明は、複数のターゲット核酸配列の各々に割り当てられた検出温度区間で相応するターゲット核酸配列に対するサイクル／信号変化値のデータセットを収得することによって、１つの検出チャンネルで複数のターゲット核酸配列を効率よく検出することができる。
（ｂ）本発明は、ターゲット核酸配列のアンプリコンからの信号発生よりは標識されたオリゴヌクレオチドを含む二合体からの信号発生を用いる。これらの二合体はアンプリコンより短い長さを有するので、相対的に小さな温度変化にも混成化または解離にさらに敏感である。また、標識されたオリゴヌクレオチドを含む二合体の使用は５℃以内間隔の基準温度でもターゲット核酸配列の存在を示す信号変化値を提供する。
（ｃ）本発明は標識されたオリゴヌクレオチドを含む複数の二合体を使用する。これら二合体は相異するＴｍ値を有するように精巧に設計されなければならない。一具現例で、媒介オリゴヌクレオチド−関与切断に依存的な方式の二合体の形成はターゲット核酸配列により影響を受けないので、二合体のＴｍ値を自由に調節することができる。したがって、媒介オリゴヌクレオチド−関与切断による二合体の形成は本発明の活用性を極大化することができる。
（ｄ）ターゲット核酸配列と混成化可能な従来の標識されたオリゴヌクレオチド、特に標識されたプローブは５′ヌクレアーゼ活性を有する核酸重合酵素が存在する時、反応の間切断され、二重鎖のターゲット核酸配列のうちのいずれか１つの鎖と競争して、信号変化値の減少をもたらすことができる。一具現例で、本発明に従う媒介オリゴヌクレオチド−関与切断に依存的な二合体形成は、このような信号変化値の減少を防止することができる。
（ｅ）本発明は、各々のターゲット核酸配列に対して２つの基準温度を使用する。前記２つの基準温度の間の間隔は相対的に狭く、例えば、５℃以内に設定できるので、本発明の方法は前記２つの基準温度での信号変化値に他のターゲット核酸配列に対する信号変化値が含まれる可能性を除去する。
（ｆ）本発明は、複数のターゲット核酸配列を１つの検出チャンネルを使用して単一反応容器で検出することができる。
（ｇ）本発明に使われた各々のターゲット核酸配列に対するサイクル／信号変化値のデータセットはノイズ信号減少、ウェル間または装備間の信号偏差の減少、またはベースライン補正を提供することができる。
（ｈ）ターゲット核酸配列に対する二合体の予想ｔｍ値に基づいた基準温度の決格納媒体。定は実際反応でＴｍ値の移動によって適合しないことがある。本発明は、各々のターゲット核酸配列に対する複数の検出温度から実際の反応を反映する基準温度を選択することができる。
［図面の簡単な説明］
［図１］本発明に従う複数のターゲット核酸配列の存在または不存在を決定する過程の一具現例を例示する流れ図である。
［図２］３個のターゲット核酸配列に対する３個の検出温度区間の一具現例を例示する。
［図３］３個のターゲット核酸配列の各々に対する２つの基準検出温度での信号値により計算された信号変化値の一具現例を例示する。
［図４］複数の検出温度から２つの基準温度を選択する一具現例を例示する。
［図５］複数の検出温度から２つの基準温度を選択する更に他の具現例を例示する。
［図６］変数分離法を例示する。
［図７］単一ターゲット核酸配列に対するサイクル／信号変化値のデータセットをプロッティングして収得された増幅曲線を示す。
［図８−図１２］多数のターゲット核酸配列に対するサイクル／信号変化値のデータセットをプロッティングして収得された増幅曲線を示す。
［発明の実施のための形態］
同一の信号特性（例えば、同一の波長帯）を有する信号を提供する標識を含む、相異するＴｍ値を有する二合体が単一反応容器に存在する場合、特定検出温度で検出された信号値は前記二合体から発生した信号の組合せを含むことができる。
ターゲット核酸配列に対する各々の二合体の場合、温度によって信号値の強さが変わる温度区間が存在し、これは各二合体のＴｍ値に依存する。ターゲット核酸配列からの信号強さは温度によって変わるが、他のターゲット核酸配列からの信号強さは変わらない温度区間内の温度での信号値は他のターゲット核酸配列からの信号を含むことができる。他のターゲット核酸配列が寄与する信号の強さは前記温度区間でほぼ一定である。前記温度区間内の２つの温度での信号値の信号変化値の計算は、前記計算の間、他のターゲット核酸配列により提供される信号値は除去しながらターゲット核酸配列により提供される信号−変化値のみを収得することができる。言い換えると、前記温度区間内の２つの温度の間の信号変化値は相応するターゲット核酸配列に対する二合体の量の変化により提供されることができ、これは相応するターゲット核酸配列の存在を示す。
本発明者らは標識されたオリゴヌクレオチドを含有する二合体、特に媒介オリゴヌクレオチド−関与切断に依存的な方式により形成される二合体の使用が二合体のＴｍ値の精巧な調節及び温度変化に対する二合体−解離または混成化敏感度の増加と共に、相対的に狭い間隔の温度の間、例えば２℃乃至５℃（特に、約２℃乃至４℃）間隔の温度での信号変化値によりターゲット核酸配列を検出できることを確認した。また、狭い間隔の温度の使用が偽陽性の危険を減少させながらより多い数の核酸配列を検出できるようにすることを確認した。延いては、本発明者らは二合体の予想Ｔｍ値が実際の反応環境でのＴｍ値と相異することがあるという問題を解決するために、各反応に対して信号変化値の計算に使われる基準温度を選択する方法を採択した。このような接近法はより正確で、信頼すべき結果、及び反応間の変化に対して、より寛大な結果を提供することができる。
＜I．２つの温度での信号変化値を使用したサンプル内複数のターゲット核酸配列の検出＞
本発明の一態様によれば、本発明は次の段階を含むサンプル内複数のターゲット核酸配列を検出するための方法を提供する：
単一反応容器で前記サンプルを前記複数のターゲット核酸配列を検出するための信号発生組成物と接触させるステップ；前記信号発生組成物は前記複数のターゲット核酸配列に対する複数の二合体を形成し、前記複数の二合体の各々は、各々の相応するターゲット核酸配列の存在を示す信号を提供し、前記複数の二合体は互いに相異するＴｍ値を有し；
（i）前記複数の二合体の形成及び（ii）前記形成された二合体の混成化（hybridization）または解離（dissociation）のために少なくとも２サイクルの間反応を実施するステップ；
前記反応の全ての、または一部のサイクルで前記複数のターゲット核酸配列に割り当てられた複数の検出温度区間の各々での少なくとも２つの検出温度で信号値を収得するステップ；前記複数の検出温度区間の各々は、各々の相応するターゲット核酸配列に対する二合体の量が変わる温度区間を含み；
前記複数の検出温度区間の各々での前記少なくとも２つの検出温度から選択された２つの基準温度の間の信号値の信号変化値を収得して、前記複数のターゲット核酸配列の各々に対するサイクル／信号変化値のデータセットを収得するステップ；及び
前記複数のターゲット核酸配列の各々に対する前記サイクル／信号変化値のデータセットによりサンプル内複数のターゲット核酸配列の存在または不存在を決定するステップ。
図１は、本発明の方法に対する順序図である。図１を参照して、本発明は次のように、より詳細に説明される。
［ステップ：サンプルを信号発生組成物と接触させるステップ（１１０）]
分析するサンプルを単一反応容器で複数のターゲット核酸配列を検出するための信号発生組成物と接触させる。
本願で使われた用語“信号発生組成物”は、ターゲット核酸配列の存在または不存在を示す信号を発生する組成物を称する。択一的に、本願に使われた用語“信号発生組成物”は、生物学的、生化学的、または化学的過程によりターゲット核酸配列の存在に依存的な方式により検出可能な信号を発生させることに使われる任意の物質を称する。特に、本願に使われた用語“信号発生組成物”は二合体の形成に依存的な方式により検出可能な信号を発生させることに使われる任意の物質を称する。
本発明の一具現例で、信号発生組成物は相応するターゲット核酸配列に対する二合体の形成に使われる物質を含む。
各々のターゲット核酸配列は相応する信号発生組成物により検出できる。第１信号発生組成物は第１ターゲット核酸配列の検出に使われる物質を示すことができ、第２信号発生組成物は第２ターゲット核酸配列の検出に使われる物質を示すことができる。
相応する信号発生組成物により形成される相応するターゲット核酸配列に対する二合体は相応するターゲット核酸配列の存在または不存在を示す信号を提供する。
本願に使われた用語“存在を示す信号”は異に示さない限り、“存在または不存在を示す信号”と相互交換的に使われることができる。
本願に使われた用語“信号発生組成物により発生する信号”は信号発生組成物により形成された二合体からの信号を称することができる。
ターゲット核酸配列に対する信号発生組成物は１つ以上のオリゴヌクレオチドを含むことができる。前記１つ以上のオリゴヌクレオチドは１つ以上の標識されたオリゴヌクレオチドを含むことができる。ターゲット核酸配列に対する信号発生組成物は二合体の形成に関与する１つ以上の標識されたオリゴヌクレオチドを含むことができる。
一具現例で、二合体のうちの１つ以上の鎖は標識されたオリゴヌクレオチドである。一具現例によれば、二合体は少なくともその１つの鎖上に少なくとも１つの標識を含む。
本願に使われた用語“検出オリゴヌクレオチド”は検出される信号の発生に関与するオリゴヌクレオチドである。一具現例によれば、検出オリゴヌクレオチドは実際の信号発生に関与するオリゴヌクレオチドを含む。一具現例によれば、検出オリゴヌクレオチドは少なくとも１つの標識を含む。一具現例によれば、二合体形成及び信号発生に関与する標識されたオリゴヌクレオチドは検出オリゴヌクレオチドである。
本発明の一具現例によれば、本発明の信号発生組成物は二合体の形成に依存的な方式により信号を発生させる。
二合体の形成に依存的に信号を発生させる多様な方法が知られており、本発明の信号発生組成物は前記方法を実施することに必要な物質を含有することができる。
信号発生組成物と関連して本願で使われた表現“二合体の形成に依存的な方式により信号を発生させる”ということは、検出される信号が２つの核酸分子の結合または解離に依存的に提供されることを称する。前記表現は信号がターゲット核酸配列の存在に依存的に形成される二合体（例えば、標識を有する検出オリゴヌクレオチド及び核酸配列）により提供されることを含む。また、前記表現は信号が二合体（例えば、標識を有する検出オリゴヌクレオチド及び核酸配列）の混成化の抑制により提供されることを含み、前記抑制は更に他の二合体の形成により引き起こされる。
本願に使われた用語“二合体の形成”は、反応の間二合体を構成する１つ以上の鎖の生成による二合体の形成だけでなく、混成化条件で反応前に存在する２つの鎖の混成化による二合体の形成を含む。
本発明の最も目立つ特徴の１つは、ターゲット核酸配列の増幅産物であるアンプリコンを使用する代わりに、標識されたオリゴヌクレオチドを含む二合体を採択することを特徴とする。
本発明は、ターゲット核酸配列のアンプリコンのＴｍ値でなく、標識されたオリゴヌクレオチドを含有する二合体のＴｍ値を使用する。
アンプリコンのＴｍ値を所望のＴｍ値に調節することは相対的に困難である。また、アンプリコンのＴｍ値は相対的に高い温度区間に属する可能性が高いので、複数のターゲット核酸配列の検出に利用可能な温度区間は制限される。延いては、ターゲット核酸配列のアンプリコンを標識するために使われるインターカレーティング染料が非特異的産物に混入されて誤った信号を引き起こされる。一具現例によれば、本発明はインターカレーティング染料を使用しない。
本発明の方法の信号発生組成物により形成される二合体は（i）ターゲット核酸配列及び標識されたオリゴヌクレオチドの間の混成化により形成された二合体、（ii）ターゲット核酸配列に相補的な混成化配列を含むオリゴヌクレオチド及び前記混成化配列の少なくとも一部に相補的な標識されたオリゴヌクレオチドの間の混成化により形成された二合体、または（iii）ターゲット核酸配列に混成化される媒介オリゴヌクレオチド−関与切断（mediation oligonucleotide-involving cleavage）に依存的な方式により形成される二合体でありえる。
特に、二合体はターゲット核酸配列及び前記ターゲット核酸配列と特異的に混成化される標識されたオリゴヌクレオチドの間で形成される。
ターゲット核酸配列と標識されたオリゴヌクレオチドの間の二合体の形成は、スコルピオン（Scorpion）方法（Whitcombe et al, Nature Biotechnology 17:804-807 (1999)）、サンライズ（Sunrise）（または、アンプリフルオル（Amplifluor））方法（Nazarenko et al, Nucleic Acids Research, 25(12):2516-2521 (1997) 、及び米国特許第６，１１７，６３５号）、ルクス（Lux）方法（米国特許第７，５３７，８８６号）、プレクサ（Plexor）方法（Sherrill C B, et al., Journal of the American Chemical Society, 126:4550-45569 (2004)）、分子ビーコン（Molecular Beacon）方法（Tyagi et al, Nature Biotechnology v.14 MARCH 1996）、ハイビーコン（Hy Beacon）方法（French DJ et al., Mol. Cell Probes, 15(6):363-374(2001)）、隣接混成化プローブ（adjacent hybridization probe）方法（Bernard, P.S. et al., Anal. Biochem., 273:221(1999)）及びＬＮＡ方法（米国特許第６，９７７，２９５号）を含む多様な方法により生成できる。
特に、二合体はターゲット核酸配列に相補的な混成化配列を含むオリゴヌクレオチド及び前記混成化配列の少なくとも一部に相補的な標識されたオリゴヌクレオチドの間の混成化により形成される。
二合体はターゲット核酸配列の不存在下に二合体を形成することができる。しかしながら、ターゲット核酸配列の存在は二合体の混成化を遮断するか、または二合体の１つ以上のオリゴヌクレオチドの切断を誘発して二合体の形成を防止することができる。したがって、二合体はターゲット核酸配列の存在または不存在を示す信号を提供することができる。
ターゲット核酸配列に相補的な混成化配列を含むオリゴヌクレオチドは標識を含むことができ、検出オリゴヌクレオチドとしての役割をすることができる。
ターゲット核酸配列に相補的な混成化配列を含むオリゴヌクレオチド及び前記混成化配列の少なくとも一部に相補的な標識されたオリゴヌクレオチドの間の二合体は文献［Li et al., Nucleic Acids Research, Vol. 30, No. 2, e5 (2002)］に開示された方法を含む多様な方法により生成できる。
特に、二合体は媒介オリゴヌクレオチド−関与切断に依存的な方式により形成される。
本願に使われた用語“媒介オリゴヌクレオチド”はターゲット核酸配列を含有しない二合体の生産を媒介するオリゴヌクレオチドである。
一具現例で、媒介オリゴヌクレオチドは、（i）ターゲット核酸配列に相補的な混成化ヌクレオチド配列を含むターゲッティング部位、及び（ii）ターゲット核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を含むタギング部位を含む。
一具現例によれば、媒介オリゴヌクレオチドは、（i）ターゲット核酸配列に相補的な混成化ヌクレオチド配列を含む３′−ターゲッティング部位及び（ii）ターゲット核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を含む５′−タギング部位を含む。
媒介オリゴヌクレオチドは多様な方式により断片を提供することに関与することができる。
本発明の一具現例で、媒介オリゴヌクレオチドはターゲット核酸配列に混成化され、断片の放出を誘導して、二合体の生産を媒介する。
一具現例で、媒介オリゴヌクレオチドはターゲット核酸配列に混成化され、媒介オリゴヌクレオチド−関与切断は断片を放出する。
一具現例で、媒介オリゴヌクレオチド−関与切断は媒介オリゴヌクレオチドの断片を放出する。特に、媒介オリゴヌクレオチドの断片は媒介オリゴヌクレオチドのタギング部位の少なくとも一部を含む。
一具現例で、媒介オリゴヌクレオチド−関与切断は媒介オリゴヌクレオチド−含有アンプリコンの断片を放出する。特に、媒介オリゴヌクレオチド−含有アンプリコンの断片は媒介オリゴヌクレオチドのタギング部位の少なくとも一部に相補的な配列を含む。
一具現例で、媒介オリゴヌクレオチド−含有アンプリコンはプライマーとして媒介オリゴヌクレオチドを使用してターゲット核酸配列を増幅させ、アンプリコンで媒介オリゴヌクレオチドに相補的な配列の一部を切断して断片を放出させることによって生成される。
一具現例で、プライマーとして媒介オリゴヌクレオチドを含むプライマー対はターゲット核酸配列を増幅させることに使われる。
本発明で、媒介オリゴヌクレオチド自体の混成化は信号を発生させず、媒介オリゴヌクレオチド−関与切断により形成された断片は二合体の形成のための連続反応に関与する。
一具現例で、媒介オリゴヌクレオチド−関与切断に依存的な方式により形成される二合体は媒介オリゴヌクレオチド−関与切断により放出された断片の延長により形成された延長鎖の形成に依存的な方式で形成される二合体である。
一具現例で、媒介オリゴヌクレオチド−関与切断は断片を放出し、前記断片はキャプチャーオリゴヌクレオチドに特異的に混成化されてキャプチャーオリゴヌクレオチド上で延びて延長鎖を形成する。
一具現例で、キャプチャリングオリゴヌクレオチドは３′から５′方向に（i）媒介オリゴヌクレオチド−関与切断により放出された断片に相補的なヌクレオチド配列を含むキャプチャリング部位、及び（ii）延長反応のためのテンプレート配列を含むテンプレーティング部位を含む。
一具現例で、キャプチャリングオリゴヌクレオチドでの延長反応のためのテンプレート配列はターゲット核酸配列に非依存的に決定される。
一具現例で、キャプチャリングオリゴヌクレオチドでの延長反応のためのテンプレート配列は媒介オリゴヌクレオチドに非相補的である。
一具現例で、媒介オリゴヌクレオチド−関与切断に依存的な方式により形成される二合体は、媒介オリゴヌクレオチド−関与切断により放出された断片と対応（counterpart）オリゴヌクレオチドとの混成化により形成された二合体である。その場合、対応オリゴヌクレオチド上では延長反応がない。
一具現例で、対応オリゴヌクレオチドは断片の延長反応のための配列を有しない。この方法は延長反応により形成された二合体のＴｍ値を調節できない。一具現例によれば、媒介オリゴヌクレオチド−関与切断は断片を放出し、前記断片は対応オリゴヌクレオチドに特異的に混成化される。
媒介オリゴヌクレオチドは対応オリゴヌクレオチドと混成化されて二合体を形成することができる。しかしながら、媒介オリゴヌクレオチドの切断は相異する二合体、即ち、断片と対応オリゴヌクレオチドの間の二合体を提供する。標識システムは後者の二合体が二合体の混成化及び／又は解離によりターゲット核酸配列の存在または不存在を示す信号を発生するようにすることができるが、前者の二合体に対してはそうでない。
一具現例で、媒介オリゴヌクレオチド−関与切断に依存的な方式により形成される二合体は、（i）媒介オリゴヌクレオチドをターゲット核酸配列と混成化させるステップ、（ii）媒介オリゴヌクレオチドまたは媒介オリゴヌクレオチド−含有アンプリコンをヌクレアーゼにより切断させて断片を生成するステップ、（iii）前記断片を前記断片と混成化される５′−キャプチャリング部位を含むキャプチャリングオリゴヌクレオチドと混成化させるステップ、及び（iv）３′−テンプレーティング部位上でキャプチャリング部位と混成化された断片の延長反応を実施して延長鎖を形成するステップによる延長鎖の形成に依存的な方式により形成された二合体である。
一具現例で、媒介オリゴヌクレオチド−含有アンプリコンは、（i）ターゲット核酸配列をプライマーとして媒介オリゴヌクレオチドを含むプライマー対と混成化させるステップ、（ii）媒介オリゴヌクレオチド−含有アンプリコンを生成するステップ、及び（iii）媒介オリゴヌクレオチドに相補的な配列を含む鎖の一部を切断させるステップにより切断される。
特に、切断された部位は媒介オリゴヌクレオチドのタギング部位の少なくとも一部に相補的な配列を含み、前記タギング部位はターゲット核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を含む。
一具現例で、媒介オリゴヌクレオチド−関与切断に依存的な方式により形成される二合体は、（i）媒介オリゴヌクレオチドをターゲット核酸配列と混成化させるステップ、（ii）媒介オリゴヌクレオチドをヌクレアーゼにより切断させて断片を生成するステップ、及び（iii）前記断片を前記断片に相補的な配列を有する対応オリゴヌクレオチドと混成化させるステップにより形成された二合体である。
一具現例で、５′ヌクレアーゼまたは３′ヌクレアーゼが媒介オリゴヌクレオチドの切断に使われる。一具現例によれば、５′ヌクレアーゼ活性を有する核酸重合酵素または５′ヌクレアーゼが媒介オリゴヌクレオチドの切断に使われる。
一具現例によれば、制限酵素が媒介オリゴヌクレオチド−含有アンプリコンの切断に使われる。
延長鎖の形成に依存的な方式により形成される二合体は多様な類型の二合体を含む。延長鎖自体は二合体を形成して信号を発生させることができる。また、延長鎖の形成は他の二合体の形成を制御することができる。
延長鎖の形成に依存的な方式により形成される二合体は、（i）延長鎖及びキャプチャリングオリゴヌクレオチドの間の二合体、（ii）キャプチャリングオリゴヌクレオチド及びキャプチャリングオリゴヌクレオチド−混成化オリゴヌクレオチドの間の二合体、（iii）延長鎖−キャプチャリングオリゴヌクレオチド及び前記延長鎖−キャプチャリングオリゴヌクレオチドにキャプチャーされた延長鎖からの二重延長鎖の間の二合体、（iv）二重延長鎖及び前記二重延長鎖−混成化オリゴヌクレオチドの間の二合体、または（v）二重延長鎖−キャプチャリングオリゴヌクレオチド及び前記延長鎖−キャプチャリングオリゴヌクレオチドと混成化されるオリゴヌクレオチドの間の二合体でありえる。
一具現例で、媒介オリゴヌクレオチド−関与切断は断片を放出し、前記放出はキャプチャーオリゴヌクレオチドに特異的に混成化され、前記断片は延びて延長鎖を形成して、延長鎖とキャプチャーオリゴヌクレオチドの間に延長二合体を形成し、これはターゲット核酸配列の存在を示す信号を提供する。
一具現例で、前記断片の延長鎖に相補的な混成化ヌクレオチド配列を含む延長鎖−混成化オリゴヌクレオチドが使われる場合、延長鎖−混成化オリゴヌクレオチドと延長鎖の混成化はターゲット核酸配列の存在を示す信号を提供する異なる類型の二合体を形成する。
一具現例で、キャプチャーオリゴヌクレオチドに相補的な混成化ヌクレオチド配列を含むキャプチャリングオリゴヌクレオチド−混成化オリゴヌクレオチドが使われる場合、キャプチャリングオリゴヌクレオチド−混成化オリゴヌクレオチドとキャプチャーオリゴヌクレオチドの間の二合体の形成は、延長鎖とキャプチャリングオリゴヌクレオチドの間の二合体の形成により抑制されて、ターゲット核酸配列の存在を示す信号を提供する。
一具現例で、断片の延長鎖は延長鎖−キャプチャリングオリゴヌクレオチドに特異的に混成化され、延長鎖が延びて二重延長鎖を形成して、二重延長鎖と前記延長鎖−キャプチャリングオリゴヌクレオチドの間の二合体形成をもたらし、これはターゲット核酸配列の存在を示す信号を提供する。
一具現例で、二重延長鎖に相補的な混成化ヌクレオチド配列を含む二重延長鎖−混成化オリゴヌクレオチドが使われる場合、前記二重延長鎖−混成化オリゴヌクレオチドと前記二重延長鎖の混成化はターゲット核酸配列の存在を示す信号を提供する異なる類型の二合体を形成する。
一具現例で、延長鎖−キャプチャリングオリゴヌクレオチドに相補的な混成化ヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドが使われる場合、前記オリゴヌクレオチドと前記延長鎖−キャプチャリングオリゴヌクレオチドの間の混成化の形成は二重延長鎖と延長鎖−キャプチャリングオリゴヌクレオチドの間の二合体の形成により抑制されて、ターゲット核酸配列の存在を示す信号を提供する。
一具現例で、断片、延長鎖、キャプチャーオリゴヌクレオチド、延長鎖−混成化オリゴヌクレオチド、キャプチャリングオリゴヌクレオチド−混成化オリゴヌクレオチド、二重延長鎖、延長鎖−キャプチャリングオリゴヌクレオチド、二重延長鎖−混成化オリゴヌクレオチド、延長鎖−キャプチャリングオリゴヌクレオチドに相補的な混成化ヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド、またはこれらの組合せは検出オリゴヌクレオチドとして作用することができる。
特に、媒介オリゴヌクレオチドの切断を伴う、延長鎖の形成に依存的な方式により形成された二合体は、ＰＴＯＣＥ（PTO cleavage and extension）方法（ＷＯ２０１２／０９６５２３）、ＰＣＥ−ＳＨ（PTO Cleavage and Extension-Dependent Signaling oligonucleotide Hybridization）方法（ＷＯ２０１３／１１５４４２）、及びＰＣＥ−ＮＨ（PTO Cleavage and Extension-Dependent Non-Hybridization）方法（ＰＣＴ／ＫＲ２０１３／０１２３１２）、及びＰＴＯＣＥ−Ｅ（PTO Cleavage and Extension-dependent Extension）方法（ＷＯ２０１９／０６６４６１）を含む多様な方法により生成できる。
特に、媒介オリゴヌクレオチド−含有アンプリコンの切断を伴う、延長鎖の形成に依存的な方式で形成された二合体は、ＷＯ公開第２０１７／１８８６６９号に開示された方法を含む多様な方法により生成できる。
前記参考文献に開示された用語と関連して、オリゴヌクレオチドの相応する例は次の通りである：媒介オリゴヌクレオチドはＰＴＯ（Probing and Tagging oligonucleotide）に相応し、キャプチャーオリゴヌクレオチドはＣＴＯ（Capturing and Templating oligonucleotide）に相応し、延長鎖−混成化オリゴヌクレオチドはＳＯ（Signaling oligonucleotide）に相応し、キャプチャリングオリゴヌクレオチド−混成化オリゴヌクレオチドはＨＯ（Hybridization oligonucleotide）に相応し、二重延長鎖は第２延長鎖に相応し、延長鎖−キャプチャリングオリゴヌクレオチドは第２のＣＴＯに相応する。ＳＯ、ＨＯ、ＣＴＯ、延長鎖またはこれらの組合せは検出オリゴヌクレオチドとしての役割をすることができる。
媒介オリゴヌクレオチドの切断に依存的な方式により形成された二合体による信号は、媒介オリゴヌクレオチドの切断に依存的な方式により形成された二合体により他の二合体の形成を抑制することによって提供される信号を含む（例えば、ＰＣＥ−ＮＨ）。
例えば、媒介オリゴヌクレオチドの切断に依存的な方式により形成された二合体による信号がＰＴＯＣＥ方法により生成される場合、信号発生組成物はアップストリームオリゴヌクレオチド及びターゲット核酸配列に相補的な混成化ヌクレオチド配列を含むＰＴＯ（Probing and Tagging oligonucleotide）、ＣＴＯ（Capturing and Templatingオリゴヌクレオチド）、適合した標識及び５′ヌクレアーゼ活性を有するテンプレート−依存的核酸重合酵素を含む。ＰＴＯは、（i）前記ターゲット核酸配列に相補的な混成化ヌクレオチド配列を含む３′−ターゲッティング部位；及び（ii）前記ターゲット核酸配列に非−相補的なヌクレオチド配列を含む５′−タギング部位を含む。ＣＴＯは３′→５′方向に（i）前記ＰＴＯの５′−タギング部位または５′−タギング部位の一部に相補的なヌクレオチド配列を含むキャプチャリング部位、及び（ii）前記ＰＴＯの５′−タギング部位及び３′−ターゲッティング部位に非−相補的なヌクレオチド配列を含むテンプレーティング部位を含む。
ＰＴＯＣＥ方法による信号発生の具体的な例は、次のステップを含む：
（ａ）ターゲット核酸配列をアップストリームオリゴヌクレオチド及びＰＴＯと混成化させるステップ；（ｂ）ステップ（ａ）の結果をＰＴＯの切断のための条件下に５′ヌクレアーゼ活性を有する酵素と接触させるステップ；前記アップストリームオリゴヌクレオチドまたはその延長鎖は５′ヌクレアーゼ活性を有する酵素によりＰＴＯの切断を誘導して前記切断はＰＴＯの５′−タギング部位または５′−タギング部位の一部を含む断片を放出させ；（ｃ）前記ＰＴＯから放出された断片をＣＴＯと混成化させるステップ；前記ＰＴＯから放出された断片はＣＴＯのキャプチャリング部位に混成化され；及び（ｄ）ステップ（ｃ）の結果物及びテンプレート−依存的核酸重合酵素を使用して延長反応を実施するステップ；ＣＴＯのキャプチャリング部位に混成化された断片は延びて、延長二合体が形成され；前記延長二合体は（i）断片の配列及び／又は長さ、（ii）ＣＴＯの配列及び／又は長さ、または（iii）断片の配列及び／又は長さ、及びＣＴＯの配列及び／又は長さにより調節可能なＴｍ値を有し；前記延長二合体は（i）前記断片及び／又は前記ＣＴＯに連結された少なくとも１つの標識、（ii）延長反応の間、延長二合体に混入された標識、（iii）延長反応の間、延長二合体に混入された標識及び前記断片及び／又は前記ＣＴＯに連結された標識、または（iv）インターカレーティング標識によりターゲット信号を提供し；及び（ｅ）延長二合体が二重鎖形態を維持する予め決定された温度でターゲット信号を測定することによって延長二合体を検出するステップ；延長二合体の存在はターゲット核酸配列の存在を示す。この場合、前記方法は反復サイクルの間に変成を含んでステップ（ａ）−（ｅ）の全体または一部を繰り返すステップを追加で含む。
文句“反復サイクルの間に変成”で、用語“変成”は二重鎖核酸分子を単一鎖核酸分子に分離させることを意味する。
ＰＴＯＣＥ方法のステップ（ａ）で、ターゲット核酸配列の増幅のためのプライマーセットがアップストリームオリゴヌクレオチドの代りに使われることができる。この場合、前記方法は反復サイクルの間に変成を含んでステップ（ａ）−（ｅ）の全体または一部を繰り返すステップを追加で含む。
ＰＴＯＣＥ方法はＣＴＯと混成化されたＰＴＯ断片が延びて延長鎖を形成した後、前記延長鎖が検出される過程として分類できる。ＰＴＯＣＥ方法は延長鎖の形成が延長鎖とＣＴＯの間の二合体を使用して検出されることを特徴とする。
延長鎖の形成を検出する更に他の接近法がある。例えば、延長鎖の形成は延長鎖に特異的に混成化されたオリゴヌクレオチドを使用して検出できる（例えば、ＰＣＥ−ＳＨ方法）。この方法で、信号は（i）延長鎖に特異的に混成化されたオリゴヌクレオチドに連結された標識、（ii）延長鎖に特異的に混成化されたオリゴヌクレオチドに連結された標識及びＰＴＯ断片に連結された標識、（iii）延長鎖に特異的に混成化されたオリゴヌクレオチドに連結された標識及び延長反応間延長鎖に混入された標識、または（iv）延長鎖に特異的に混成化されたオリゴヌクレオチドに連結された標識及びインターカレーティング染料から提供できる。択一的に、信号は（i）延長鎖に連結された標識または（ii）インターカレーティング染料から提供できる。
択一的に、延長鎖の形成の検出はＣＴＯと前記ＣＴＯに特異的に混成化可能なオリゴヌクレオチドの間の混成化の抑制を検出する更に他の方法により実施される（例えば、ＰＣＥ−ＮＨ方法）。このような抑制はターゲット核酸配列の存在を示すことと見なされる。信号は（i）ＣＴＯに特異的に混成化可能なオリゴヌクレオチドに連結された標識、（ii）ＣＴＯに連結された標識、（iii）ＣＴＯと混成化可能なオリゴヌクレオチドに連結された標識及びＣＴＯに連結された標識、または（iv）インターカレーティング標識から提供できる。
一具現例で、ＣＴＯに特異的に混成化されるオリゴヌクレオチドはＰＴＯ断片と重畳配列を有する。
一具現例で、検出オリゴヌクレオチドは延長鎖に特異的に混成化可能なオリゴヌクレオチド（例えば、ＰＣＥ−ＳＨ方法）及びＣＴＯに特異的に混成化可能なオリゴヌクレオチド（例えば、ＰＣＥ−ＮＨ方法）を含む。一具現例で、検出オリゴヌクレオチドは反応の間、生産された延長鎖またはＣＴＯを含む。
ＰＴＯＣＥ基盤方法は、一般的にターゲット核酸配列の存在に依存的な延長鎖の形成を伴う。前記用語“ＰＴＯＣＥ基盤方法”はＰＴＯの切断及び延長を通じての延長鎖の形成を含む、信号を提供するための多様な方法を包括するために本願で使われる。
ＰＴＯＣＥ基盤方法による信号発生の例は、次のステップを含む：（ａ）ターゲット核酸配列をアップストリームオリゴヌクレオチド及びＰＴＯと混成化させるステップ；（ｂ）前記ＰＴＯの切断のための条件下で５′ヌクレアーゼ活性を有する酵素に前記ステップ（ａ）の結果を接触させるステップであって；前記アップストリームオリゴヌクレオチドまたはその延長鎖は前記５′ヌクレアーゼ活性を有する酵素による前記ＰＴＯの切断を誘導し、前記切断は前記ＰＴＯの５′−タギング部位または５′−タギング部位の一部を含む断片を放出し；（ｃ）前記ＰＴＯから放出された前記断片とＣＴＯを混成化させるステップであって；前記ＰＴＯから放出された前記断片は前記ＣＴＯのキャプチャリング部位に混成化され；（ｄ）ステップ（ｃ）の結果物及び鋳型−依存的核酸重合酵素を用いて延長反応を実施するステップであって；前記ＣＴＯの前記キャプチャリング部位に混成化された前記断片は延びて延長鎖を形成し、及び（ｅ）前記延長鎖の存在に依存的に発生する信号を検出して前記延長鎖の形成を検出するステップ。前記ステップ（ａ）で、前記アップストリームオリゴヌクレオチドの代りにターゲット核酸配列の増幅のためのプライマーセットが使われることができる。このような場合、前記方法は反復サイクルの間に変成を含んで前記ステップ（ａ）−（ｅ）の全体または一部を繰り返すステップを追加的に含む。
一具現例で、二合体形成により発生した信号は前記二合体の混成化（例えば、二合体自体の混成化、または延長鎖−混成化オリゴヌクレオチドの混成化）により誘導された信号または二合体形成によるキャプチャリングオリゴヌクレオチド−混成化オリゴヌクレオチドの混成化の抑制により誘導された信号を含む。
一具現例で、検出オリゴヌクレオチドは少なくとも１つのオリゴヌクレオチドから構成できる。一具現例で、検出オリゴヌクレオチドが複数のオリゴヌクレオチドから構成される場合、検出オリゴヌクレオチドは多様な方式により標識を有することができる。例えば、複数のオリゴヌクレオチドのうちの１つのオリゴヌクレオチドは少なくとも１つの標識を有することができるか、複数のオリゴヌクレオチド全ては少なくとも１つの標識を有することができるか、またはオリゴヌクレオチドの一部は少なくとも１つの標識を有し、他の一部は標識を有しないことがある。
断片と対応オリゴヌクレオチドの混成化により形成された二合体は米国公開第２０１８／００７３０５６号を含む多様な方法により生成できる。
一具現例で、二合体は同一の信号特性を有する標識を含む標識されたオリゴヌクレオチドを含む。本願に使われた用語“同一の信号特性を有する標識”は標識が同一または実質的に同一の信号特性（例えば、光学特性、放出波長、及び電気的信号）を有することを意味する。例えば、ＦＡＭ及びＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ ６１０は相異する信号特性（例えば、相異する放出波長範囲）を提供し、ＦＡＭ／Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８、ＨＥＸ／Ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ ５３２及びＴｅｘａｓ Ｒｅｄ／Ａｌｅｘａ ５９４は各々これらの実質的に同一の放出波長により同一の信号特性を有することと見なされる。
同一の信号特性を有する標識を含有する二合体からの信号は同一の検出機または同一の検出チャンネルにより検出できる。しかしながら、従来の技術によれば、どんな二合体が信号を提供するかが区別できない。
本願に使われた用語“検出機または検出チャンネルが同一の信号特性を有する”ということは、検出機が同一または実質的に同一の信号特性を検出できるということを意味する。
複数の二合体は互いに異なるＴｍ値を有する。本願に使われた用語“Ｔｍ”は二重鎖核酸分子の集団（population）の半分が単一鎖分子に解離されるメルティング温度を意味する。Ｔｍ値は混成化されたヌクレオチドの長さ及びＧ／Ｃ含有量により決定される。Ｔｍ値はWallace rule（R.B. Wallaceなど、Nucleic Acids Research, 6:3543-3547(1979)）及びnearest-neighbor方法（SantaLucia J. Jr.など、Biochemistry, 35:3555-3562(1996); Sugimoto N.など、Nucleic Acids Res., 24:4501-4505(1996)）のような従来方法により計算できる。
形成された二合体のＴｍ値は標準ターゲット核酸配列及び相応する信号発生組成物を使用して実験的に収得できる。サンプル内に形成された二合体の実際Ｔｍ値はサンプル分析の間測定できる。
本発明で有用な標識は本技術分野で知られた多様な標識を含む。例えば、本発明で有用な標識は単一標識、相互作用的二重標識、インターカレーティング染料及び挿入標識（incorporating label）を含む。例えば、本発明で有用な標識は蛍光標識、発光標識、化学発光標識、電気化学標識、及び金属標識を含む。
前記単一標識は、例えば、蛍光標識、発光標識、化学発光標識、電気化学標識、及び金属標識を含む。一具現例で、前記単一標識は二重鎖に存在するか、または単一鎖に存在するかによって相異する信号（例えば、相異する信号強さ）を提供する。一具現例で、前記単一標識は蛍光標識である。本発明で使われる単一蛍光標識の好ましい類型及び結合部位は、米国特許第７，５３７，８８６号及び第７，３４８，１４１号に開示されており、その教示事項はその全体として本明細書に参照として含まれる。例えば、前記単一蛍光標識はＪＯＥ、ＦＡＭ、ＴＡＭＲＡ、ＲＯＸ、及びフルオレセイン−基盤標識を含む。前記単一標識は多様な方法によりオリゴヌクレオチドに連結できる。例えば、前記標識は炭素原子を含むスペーサー（例えば、３−カーボンスペーサー、６−カーボンスペーサー、または１２−カーボンスペーサー）を通じてプローブに連結される。
前記相互作用的標識システムの代表的な例として、ＦＲＥＴ（fluorescence resonance energy transfer）標識システムは、蛍光レポーター分子（供与体分子）及びクエンチャー分子（受容体分子）を含む。ＦＲＥＴでエネルギー供与体は蛍光性であるが、エネルギー受容体は蛍光性または非−蛍光性でありえる。相互作用的標識システムの更に他の形態で、エネルギー供与体は非−蛍光性、例えば、発色団（chromophore）であり、エネルギー受容体は蛍光性である。相互作用的標識システムの更に他の形態で、エネルギー供与体は発光性（luminescent）、例えば、生物発光性、化学発光性、または電気化学発光性であり、受容体は蛍光性である。相互作用的標識システムは“接触−媒介クエンチング（oncontact-mediated quenching）”に基づいた二重標識を含む（Salvatoreなど、Nucleic Acids Research, 2002 (30) no.21 e122 and Johanssonなど、J. AM. CHEM. SOC 2002 (124) pp 6950-6956）。前記相互作用的標識システムは、最小２つの分子（例えば、染料）間の相互作用により信号変化を誘導するいかなる標識システムも含む。
本発明で有用なレポーター分子及びクエンチャー分子は当業界に知られたいかなる分子も含むことができる。その例は、次の通りである：Cy2TM (506), YO-PRO TM -1 (509), YOYO TM-1 (509), Calcein (517), FITC (518), FluorX TM (519), Alexa TM(520), Rhodamine 110 (520), Oregon Green TM 500 (522), Oregon GreenTM 488 (524), RiboGreen TM (525), Rhodamine Green TM(527), Rhodamine 123 (529), Magnesium Green TM (531), Calcium GreenTM (533), TO-PRO TM -1 (533), TOTO1 (533), JOE (548), BODIPY530/550 (550), Dil (565), BODIPY TMR (568), BODIPY558/568 (568), BODIPY564/570 (570), Cy3 TM (570), Alexa TM 546 (570), TRITC (572), Magnesium Orange TM (575), Phycoerythrin R&B (575), Rhodamine Phalloidin (575), Calcium Orange TM (576), Pyronin Y (580), Rhodamine B (580), TAMRA (582), Rhodamine Red TM (590), Cy3.5TM (596), ROX (608), Calcium Crimson TM (615), Alexa TM594 (615), Texas Red(615), Nile Red (628), YO-PRO TM -3 (631), YOYOTM -3 (631), R-phycocyanin (642), C-Phycocyanin (648), TO-PRO TM-3 (660), TOTO3 (660), DiD DilC(5) (665), Cy5 TM (670), Thiadicarbocyanine (671), Cy5.5 (694), HEX (556), TET (536), Biosearch Blue (447), CAL Fluor Gold 540 (544), CAL Fluor Orange 560 (559), CAL Fluor Red 590 (591), CAL Fluor Red 610 (610), CAL Fluor Red 635 (637), FAM (520), Fluorescein (520), Fluorescein-C3 (520), Pulsar 650 (566), Quasar 570 (667), Quasar 670 (705) and Quasar 705 (610) 。括弧の数字はナノミリメートル単位で表示した最大放出波長である。好ましくは、レポーター分子及びクエンチャー分子はＪＯＥ、ＦＡＭ、ＴＡＭＲＡ、ＲＯＸ、及びフルオレセイン−基盤標識を含む。
適合した蛍光分子及び適合したレポーター−クエンチャー対は次のように多様な文献に開示されている：Pesceなど、editors, Fluorescence Spectroscopy (Marcel Dekker, New York, 1971); Whiteなど、Fluorescence Analysis: A Practical Approach (Marcel Dekker, New York, 1970); Berlman, Handbook of Fluorescence Spectra of Aromatic Molecules, 2nd Edition (Academic Press, New York, 1971); Griffiths, Color AND Constitution of Organic Molecules (Academic Press, New York, 1976); Bishop, editor, Indicators (Pergamon Press, Oxford, 1972); Haugland, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (Molecular Probes, Eugene, 1992); Pringsheim, Fluorescence and Phosphorescence (Interscience Publishers, New York, 1949); Haugland, R. P., Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, 6th Edition (Molecular Probes, Eugene, Oreg., 1996）；米国特許第３，９９６，３４５号、及び第４，３５１，７６０号。
本発明で、広範囲波長または特定波長の蛍光をクエンチングすることができる非−蛍光クエンチャー分子（例えば、ブラッククエンチャーまたはダーククエンチャー）が利用できるということは注目に値する。
レポーター及びクエンチャー分子を含むシグナリングシステムで、前記レポーターはＦＲＥＴの供与体を含み、クエンチャーはＦＲＥＴの残りのパートナー（受容体）を含む。例えば、フルオレセイン染料（fluorescein dye）はレポーターに用いられ、ローダミン染料（rhodamine dye）はクエンチャーに用いられる。
前記相互作用的二重標識は、二合体のうちの一鎖に連結できる。前記相互作用的二重標識を含む鎖が単一鎖状態で存在する場合、前記鎖はヘアピンまたはランダムコイル構造を形成して相互作用的二重標識の間のクエンチングを誘導する。前記鎖が二合体を形成する場合、前記クエンチングは減る。択一的に、前記相互作用的二重標識が鎖上に近接するように位置したヌクレオチドに連結された場合、相互作用的二重標識の間のクエンチングが起こる。前記鎖が二合体を形成し、切断される場合、前記クエンチングは減る。
各々の相互作用的二重標識は二合体の２鎖の各々に連結できる。前記二合体の形成はクエンチングを誘導し、前記二合体の変成はアンクエンチングを誘導する。択一的に、２鎖のうちの１つが切断される場合、アンクエンチングが誘導できる。
挿入標識はプライマー延長の間、標識を挿入して信号を発生させる過程で使われることができる（例えば、Plexor方法、Sherrill C B,など、Journal of the American Chemical Society, 126:4550-45569 (2004)）。また、前記挿入標識はターゲット核酸配列に混成化された媒介オリゴヌクレオチドの切断に依存的な方式により形成された二合体による信号発生でも使われることができる。
前記挿入標識は、一般的にヌクレオチドに結合できる。また、非−自然塩基を有するニュークレオタイドが用いられることもできる。
本明細書で使われる用語“非−自然塩基（non-natural base）”は、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、及びウラシル（Ｕ）のような自然塩基の誘導体を意味し、これらは水素−結合塩基対を形成することができる。本明細書で使われる用語“非−自然塩基”は母化合物（mother compound）として自然塩基と相異する塩基対パターンを有する塩基を含み、例えば、米国特許第５，４３２，２７２号、第５，９６５，３６４号、第６，００１，９８３号、及び第６，０３７，１２０号に記載されている。非−自然塩基同士の間の塩基対は自然塩基のように２つまたは３個の水素結合を含む。また、非−自然塩基の間の塩基対は特異的方式でも形成される。非−自然塩基の特定の例は、塩基対組合せで次のような塩基を含む：ｉｓｏ−Ｃ／ｉｓｏ−Ｇ、ｉｓｏ−ｄＣ／ｉｓｏ−ｄＧ、Ｋ／Ｘ、Ｈ／Ｊ、及びＭ／Ｎ（参照米国特許第７，４２２，８５０号）。
ＰＴＯＣＥ方法により信号が発生する場合、前記延長反応の間挿入されたヌクレオチドは第１非−自然塩基を有することができ、前記ＣＴＯは第１非−自然塩基に特異的結合親和性がある第２非−自然塩基を有するヌクレオチドを有することができる。
本明細書で使われる用語“ターゲット核酸”、“ターゲット核酸配列”、または“ターゲット配列”は検出または定量しようとする核酸配列を意味する。前記ターゲット核酸配列は二重鎖だけでなく、単一鎖を含む。前記ターゲット核酸配列は反応で新しく生成された配列だけでなく、核酸サンプル内に初期に存在する配列を含む。
前記ターゲット核酸配列は全てのＤＮＡ（ｇＤＮＡ及びｃＤＮＡ）、ＲＮＡ分子及びこれらの混成化物（キメラ核酸）を含む。前記配列は二重−鎖または単一−鎖形態でありえる。出発物質として核酸が二重−鎖の場合、前記２鎖を単一−鎖または部分的単一−鎖形態に作ることが好ましい。鎖を分離するための知られた方法は、加熱、アルカリ、ホルムアミド、ウレア、及びグリコキサール処理、酵素的方法（例、ヘリカーゼ作用）及び結合蛋白質を含むが、これに限定されるのではない。例えば、鎖分離は８０℃−１０５℃範囲の温度で加熱して達成できる。このような処理を達成するための一般的な方法は、文献［Joseph Sambrook, など、Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001)］により提供される。
ｍＲＮＡを出発物質に用いる場合、アニーリングステップ実施の以前に逆転写ステップが必須であり、その詳細な内容は文献［Joseph Sambrook,など、Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001);及びNoonan, K. F.など、Nucleic Acids Res. 16:10366 (1988)］に開示されている。逆転写反応のために、ｍＲＮＡのポリＡテールに混成化可能なオリゴヌクレオチドｄＴプライマー、ランダムプライマー、またはターゲット−特異的プライマーが利用できる。
ターゲット核酸配列は全ての自然（naturally occurring）元核細胞核酸、真核細胞（例えば、原生動物と寄生動物、菌類、酵母、高等植物、下等動物、及び哺乳動物と人間を含む高等動物）核酸、ウイルス（例えば、ヘルペスウイルス、ＨＩＶ、インフルエンザーウイルス、エプスタイン−バーウイルス、肝炎ウイルス、ポリオビールスなど）核酸またはビロイド核酸を含む。また、前記核酸分子は再組合により生産された、または生産できるどんな核酸分子または化学的に合成された、または合成できるどんな核酸分子でありえる。したがって、前記核酸配列は自然で発見されるか、または発見されないことがある。前記ターゲット核酸配列は知られた、または知られていない配列を含むことができる。
本明細書で、用語“サンプル”は関心のある核酸を含有するか、または含有することと推定される任意の物質、またはその自体が核酸である任意の物質を称する。より具体的に、本願で使われた用語“サンプル”は生物学的サンプル（例えば、生物学的供給源からの細胞、組織、または流体）及び非生物学的サンプル（例えば、食品、水、及び土壌）を含む。生物学的サンプルは、ウイルス、細菌、組織、細胞、血液、血清、血漿、リンパ、牛乳、小便、糞便、眼球液、唾液、精液、脳抽出物、脊髄液（ＳＣＦ）、虫垂、脾臓、及び扁桃組織抽出物、羊水、及び腹水を含むが、これに制限されない。サンプルは効果的な増幅反応のために溶解及び加熱のような前処理を経ることができるか、または当業界に公知された核酸抽出過程を経ることができる（Sambrook, J. et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor (2001)参考）。核酸抽出過程はサンプルの類型によって変わることができる。また、抽出された核酸がＲＮＡの場合、これからｃＤＮＡを合成するために逆転写が追加で遂行される（前記参考）。
信号発生組成物はオリゴヌクレオチドの切断及び／又は核酸重合のための酵素、例えば５′−ヌクレアーゼ、３′−ヌクレアーゼ、ＦＥＮヌクレアーゼ、制限酵素、５′−ヌクレアーゼ活性を有する核酸重合酵素、３′−ヌクレアーゼ活性を有する核酸重合酵素を含むことができる。
相異するターゲットのための信号発生組成物は、核酸重合酵素のような共通成分を含むことができる。
同一の信号特性の標識を含む延長二合体により検出されるターゲット核酸配列の個数は単一反応容器で１、２、３、４、５、６、７、８、９、及び１０個超過のターゲット核酸配列を含む。
内部対照群は、本方法により検出される複数のターゲット核酸配列としてカウンティングできる。
異なる表現のない限り、本願に使われた用語“単一反応容器でサンプル内の複数のターゲット核酸配列を検出すること”で、“複数のターゲット核酸配列”は同一の信号特性を有する標識により検出されるターゲット核酸配列を称することができる。同一の反応容器に他のターゲット核酸配列が存在することができ、これは相異する信号特性を有する相異する標識により検出できる。
単一反応容器で、複数のターゲット核酸配列は相異する信号特性を有する少なくとも２種類の標識を使用して検出できる。相異する標識特性を有する各々の標識は各々１つ以上のターゲット核酸配列を検出することに使われることができる。一具現例で、同一の信号特性の標識を含有する二合体は互いに相異するＴｍを有する。相異する信号特性を有する標識からの信号は相異する検出機、例えば相異する検出チャンネルにより検出される。
例えば、一部のターゲット核酸配列に対する一部の二合体はＦＡＭと標識され、他のターゲット核酸配列に対する他の二合体はＣａｌ ｒｅｄ ６１０と標識される。２つの相異する放出光を検出するために２種類の検出機（即ち、２つの検出チャンネル）が使われる。少なくとも２、３、４、５、６、または７種類の標識が単一反応容器で使われることができる。
検出されるターゲット核酸配列の個数は単一反応容器で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、１８、２０、２５、及び３０個を超過するターゲット核酸配列を含む。
［ステップ：少なくとも２サイクルの間の反応（１２０）］
（i）複数の二合体の形成、及び（ii）形成された二合体の混成化または解離のための反応を少なくとも２サイクルの間実施する。ターゲット核酸配列の存在または不存在に依存的な方式により相応する二合体を提供するために信号発生組成物が反応に関与することができる。
一具現例で、反応は二合体の形成及び前記二合体から信号発生を許容する条件下に遂行される。このような条件は温度、塩濃度、及び溶液のｐＨを含む。
本発明の一具現例で、反応の間、ターゲット核酸配列に対する二合体の数は増加し、二合体の類型からの信号強さは増幅する。
二合体内の標識位置は相異する温度対信号パターンを提供することができる。例えば、二合体の１つの鎖に相互作用的な二重標識（蛍光レポーター分子及びクエンチャー分子）が連結されている場合、温度が増加するほど二合体の前記グループからの信号の強さは減少することができる。択一的に、蛍光レポーター分子及びクエンチャー分子のうちの１つが１つの鎖に連結されており、他の標識が二合体の他の鎖に連結されている場合、二合体の前記グループから信号強さは温度が増加するほど増加することができる。
本方法の反応は“信号発生過程”を称することができる。本願に使われた用語“信号発生過程”はサンプル内ターゲット核酸配列の存在または不存在に依存的な方式により信号を発生させることができる任意の過程を称する。
信号発生過程は信号変化を伴う。本願に使われた用語“信号”は測定可能なアウトプットを意味する。
信号発生反応の進行は信号を測定することによって評価される。信号値または信号変化はターゲット分析物の特性、具体的にターゲット分析物の存在または不存在を定性的にまたは定量的に指示する指示子の役割をする。前記信号変化は信号増加だけでなく、信号減少を含むことができる。
このような指示子の例は蛍光強さ、発光強さ、化学発光強さ、生発光強さ、燐光強さ、電荷移動、電圧、電流、電力、エネルギー、温度、粘性度、光スキャナー、放射能強さ、反射度、透光度、及び吸光度を含むが、これに限定されるのではない。最も頻繁に使われる指示子は蛍光強さ（fluorescence intensity）である。
本願に使われた用語“信号発生”は信号の発生または消滅及び信号の増加または減少を含む。特に、用語“信号発生”は信号の増加を意味する。
一具現例で、信号発生過程は信号の増幅過程である。
本願に使われた用語“増幅反応”は信号を増加または減少させる反応を意味する。
一具現例で、増幅反応は信号発生組成物を使用してターゲット核酸配列の存在に依存的に発生する信号の増加（または、増幅）を意味する。一具現例で、増幅反応は相応するターゲット核酸配列に対する二合体の数の増加による信号の増加（または、増幅）を意味する。増幅反応はターゲット核酸配列の増幅を伴うか、または伴わないことがある。より具体的に、本発明の増幅反応はターゲット核酸配列の増幅と共に実施される信号の増幅反応を意味する。
増幅反応を通じて収得されるデータセットは、増幅サイクルまたはサイクル番号を含む。
本願に使われた用語“サイクル”は、条件の変化を伴った複数の測定で条件の変化単位をいう。例えば、条件の変化は温度、反応時間、反応回数、濃度、ｐＨ及び／又は測定対象（例えば、ターゲット核酸分子）の複製回数の増加または減少を意味する。したがって、サイクルは時間（time）または過程（process）サイクル、単位運営（unit operation）サイクル及び再生産（reproductive）サイクルを称することができる。
更に他の例えば、核酸の等温増幅（isothermal amplification）が実施される場合、等温条件下に一定の間隔の時間で数回１つのサンプルの信号を測定する。この反応で、反応時間は条件の変化に該当し、反応時間単位は１つのサイクルに該当することができる。
具体的に、一連の反応を繰り返すか、または一定の時間間隔で反応を繰り返す場合、用語“サイクル”は反復の１つの単位を意味する。
例えば、重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ）で、１つのサイクルはターゲット核酸分子の変成（denaturation）、ターゲット核酸分子とプライマーの間のアニーリング及びプライマー延長を含む反応単位を称する。反応反復の増加が条件の変化に該当することができ、反復の単位がサイクルに該当することができる。
信号発生過程から収得されたデータセットは、サイクル番号及び信号値を含む複数のデータポイントを含む。
一具現例で、ターゲット核酸分子の存在を示す信号を増幅させるための増幅反応はターゲット核酸分子の増幅と同時に信号も増幅する方式により実施された（例えば、リアルタイムＰＣＲ方法）。択一的に、増幅反応はターゲット核酸分子は増幅されず、信号が増幅する方式により実施される。
本発明で、信号を発生する二合体の数はターゲット増幅と同時に増幅できる。択一的に、信号を発生する二合体の数はターゲットは増幅されず、増幅できる。
一具現例で、信号発生組成物は複数のターゲット核酸配列を増幅するための少なくとも１つのプライマー対を含み、二合体反応は複数のターゲット核酸配列の増幅を伴う。
ターゲット核酸配列は多様な方法により増幅できる。例えば、ＰＣＲ（polymerase chain反応）、ＬＣＲ（ligase chain反応、米国特許第４，６８３，１９５号及び第４，６８３，２０２号；PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Innis et al., eds, 1990)参考)、SDA(strand displacement amplification)(Walker, et al. Nucleic Acids Res. 20(7):1691-6 (1992); Walker PCR Methods Appl 3(1):1-6 (1993))、転写媒介増幅(transcription-mediated amplification)(Phyffer, et al., J. Clin. Microbiol. 34:834-841 (1996); Vuorinen, et al., J. Clin. Microbiol. 33:1856-1859 (1995))、NASBA(nucleic acid sequence-based amplification)(Compton, Nature 350(6313):91-2 (1991))、ローリングサークル増幅(rolling circle amplification, RCA) (Lisby, Mol. Biotechnol. 12(1):75-99 (1999); Hatch et al., Genet. Anal. 15(2):35-40 (1999))及びQ-betaレプリカーゼ(Q-Beta Replicase) (Lizardi et al., BiolTechnology 6:1197(1988)）を含むが、これに制限されない、ターゲット分析物の増幅のための多い方法が知られている。
一具現例で、増幅反応はターゲット分析物、具体的に、ターゲット核酸分子の増幅と同時に信号を増幅させることができる。一具現例で、増幅反応はＰＣＲまたはリアルタイムＰＣＲにより実施される。
本発明の一具現例で、ヌクレアーゼ活性（例えば、５′ヌクレアーゼ活性または３′ヌクレアーゼ活性）を有する核酸重合酵素がターゲット核酸配列の増幅に使われることができる。一具現例で、ヌクレアーゼ活性のない核酸重合酵素がターゲット核酸配列の増幅に使われることができる。
本発明で有用な核酸重合酵素はThermus aquaticus(Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis, Thermus antranikianii, Thermus caldophilus, Thermus chliarophilus, Thermus flavus, Thermus igniterrae, Thermus lacteus, Thermus oshimai, Thermus ruber, Thermus rubens, Thermus scotoductus, Thermus silvanus, Thermus species Z05, Thermus species sps 17, Thermus thermophilus, Thermotoga maritima, Thermotoga neapolitana, Thermosipho africanus, Thermococcus litoralis, Thermococcus barossi, Thermococcus gorgonarius, Thermotoga maritima, Thermotoga neapolitana, Thermosipho africanus, Pyrococcus woesei, Pyrococcus horikoshii, Pyrococcus abyssi, Pyrodictium occultum, Aquifex pyrophilus及びAquifex aeolieus を含む、多様なバクテリア種から得た熱安定性ＤＮＡ重合酵素である。特に、前記熱安定性ＤＮＡ重合酵素はＴａｑ重合酵素である。
一具現例で、ターゲット核酸配列の増幅は非対称ＰＣＲ（asymmetric PCR）により達成される。プライマーの割合はダウンストリームオリゴヌクレオチドの切断または混成化を考慮して選択できる。
一具現例で、反応は少なくとも２サイクル、少なくとも５サイクル、少なくとも１０サイクル、少なくとも２０サイクル、少なくとも３０サイクル、少なくとも４０サイクル、少なくとも４５サイクル、または少なくとも５０サイクルの間実施される。一具現例で、反応は最大１００サイクル以下、最大９０サイクル、最大８０サイクル、最大７０サイクル、または最大６０サイクルである。
［ステップ：信号値を収得するステップ（１３０）］
反応の全てのまたは一部のサイクルで複数のターゲット核酸配列に割り当てられた複数の検出温度区間の各々での少なくとも２つの検出温度で信号値を収得する。複数の検出温度区間の各々は、各々の相応するターゲット核酸配列に対する二合体の量が変わる温度区間を含む。
反応の間、信号は複数の検出温度で測定できる。
１つのターゲット核酸配列の検出のために少なくとも２つの検出温度が使われる。
各々のターゲット核酸配列に対して、信号値が収得される少なくとも２つの検出温度は各々の検出温度区間から予め決定できる。
一例として、各々のターゲット核酸配列に対して少なくとも２つの検出温度を決定した後、組合せて全体反応のための全ての検出温度を最終的に決定することができる。更に他の例として、全体反応に対する全ての検出温度を決定した後、各々のターゲット核酸配列に対する少なくとも２つの検出温度に割り当てできる。
各々のターゲット核酸配列に対する検出温度区間は相応するターゲット核酸配列に対する少なくとも２つの検出温度が選択される温度区間でありえる。択一的に、検出温度区間は各々のターゲット核酸配列に割り当てられた少なくとも２つの検出温度により形成されるか、または位置した温度区間でありえる。
一具現例で、各々のターゲット核酸配列に割り当てられた検出温度区間は要件を満たさなければならない。
本発明の一具現例で、各々のターゲット核酸配列に対する少なくとも２つの検出温度はこれらが少なくとも検出温度に対する要件だけでなく、検出温度区間に対する要件を満たすように決定される。
各々のターゲット核酸配列に対する少なくとも２つの検出温度（または、各々のターゲット核酸配列に対する検出温度区間）は、各々のターゲット核酸配列から由来した二合体に対して、温度に従う信号値の変化を考慮して選択できる。
二合体の混成化／解離に影響を及ぼす温度は次の通り分類できる：（i）二合体が混成化された状態で存在する温度区間；（ii）二合体が混成化された状態から解離された状態に変化する温度区間（即ち、二合体の解離が発生するか、または二合体の混成化が発生する温度区間）；及び（iii）二合体が解離された状態に存在する温度区間。
前記温度区間での二合体状態はその確率的優勢を示そうとすることであり、絶対的にその状態に限定されるのではない。
複数の二合体が存在する場合、二合体が混成化された状態で解離された状態に変わる温度区間（即ち、解離が発生する温度区間）未満の任意の温度で大部分の二合体は混成化された状態で存在して、二合体の量に実質的な変化を起こさず；二合体が混成化された状態から解離された状態に変わる温度区間（即ち、解離が発生する温度区間）を超過する任意の温度で大部分の二合体は解離された状態で存在して、二合体の量に実質的な変化を起こさない。一方、二合体が混成化された状態から解離された状態に変わる温度区間（即ち、解離が発生する温度区間）の場合、より高い温度で多い解離が発生して、温度に従う二合体の量の変化を起こす。
本願に使われたように、用語“二合体の量が実質的に変わらない温度区間”は温度区間内の単位温度当たり二合体の量の変化が１０％、８％、６％、５％、４％、３％、２％、または１％以下である温度区間を称する。
本願に使われたように、用語“二合体の量”は二合体を構成する、互いに混成化された２つの鎖の量または個数を称する。
二合体が二合体の形成によって信号値を提供する場合、二合体は温度によって信号値の変化を示すメルティングカーブを提供することができる。
図２は、相異するＴｍ値を有する３個の二合体のメルティングカーブを示す。
図２で、前記二合体は温度が増加するほど信号が減少するパターンを示す。図２で、各々の二合体は２つの鎖が混成化された場合には信号を提供し、２つの鎖が解離された場合には信号を提供しないように標識を有する。例えば、二合体の各々はその１つの鎖に連結された相互作用的二重標識を有する。二合体の各々が２つの鎖が混成化された場合には信号を提供せず、２つの鎖が解離された場合には信号を提供するように標識を有する場合、温度が増加するほど信号が増加する。
本発明の一具現例で、検出温度区間（図２参照；第１検出温度区間、第２検出温度区間、または第３検出温度区間）は、各々の相応するターゲット核酸配列に対する二合体の量が変わる温度区間を含む。
一具現例で、各々の相応するターゲット核酸配列に対する少なくとも１つの検出温度は、各々の相応するターゲット核酸配列に対する二合体の量が変わる温度区間に属する。
二合体の解離が発生する温度区間の全部または一部は、各々の相応するターゲット核酸配列に対する二合体の量が変わる温度区間でありえる。
一具現例で、検出温度区間は相応するターゲット核酸配列に対する二合体の量が変わらない温度区間を追加的に含むことができる。例えば、検出温度区間は相応するターゲット核酸配列に対する二合体の大部分が混成化状態にいるか、または解離状態にいる温度区間である。一具現例で、相応するターゲット核酸配列に対する少なくとも１つの検出温度は、大部分の二合体が混成化状態にいるか、または解離状態にいる温度区間に属する。
一具現例で、検出温度区間は相応するターゲット核酸配列に対する二合体の量は変わるが、他のターゲット核酸配列に対する二合体の量は変わらない温度区間である。
図２は、３個のターゲット核酸配列に対する３個の検出温度区間を例示する。複数の検出温度区間の各々は複数のターゲット核酸配列の各々に対応する。例えば、第１検出温度区間は第１ターゲット核酸配列を検出するための温度区間であり、第２検出温度区間は第２ターゲット核酸配列を検出するための温度区間であり、第３検出温度区間は第３ターゲット核酸配列を検出するための温度区間である。
図２で、第１検出温度区間は第１ターゲット核酸配列に対する二合体の量が変わる区間であり、第２検出温度区間は第２ターゲット核酸配列に対する二合体の量が変わる区間であり、第３検出温度区間は第３ターゲット核酸配列に対する二合体の量が変わる区間である。特に、検出温度区間の各々は他のターゲット核酸配列に対する二合体の量は変わらない温度区間である。
本願に使われたように、表現“相応するターゲット核酸配列に対する二合体の量は変わるが、他のターゲット核酸配列に対する二合体の量は変わらない温度区間”は他のターゲット核酸配列に対する二合体の量が全く変わらない温度区間だけでなく、他のターゲット核酸配列に対する二合体の量がほとんど変わらない温度区間を含むことと意図される。一具現例で、複数の検出温度区間の各々は他のターゲット核酸配列に対する二合体により発生した信号の変化量対相応するターゲット核酸配列に対する二合体により発生した信号の変化量の割合が１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、２％、または１％以下である温度区間から選択される。
例えば、サンプル内に第１ターゲット核酸配列、第２ターゲット核酸配列、及び第３ターゲット核酸配列が存在する場合、第１検出温度区間は第１ターゲット核酸配列に対する信号は変わるが、第２ターゲット核酸配列及び第３ターゲット核酸配列に対する信号は実質的に変わらない温度区間である。第２検出温度区間は、第２ターゲット核酸配列に対する信号は変わるが、第１ターゲット核酸配列及び第３ターゲット核酸配列に対する信号は実質的に変わらない温度区間である。第３検出温度区間は第３ターゲット核酸配列に対する信号は変わるが、第１ターゲット核酸配列及び第２ターゲット核酸配列に対する信号は実質的に変わらない温度区間である。
一具現例によれば、ターゲット核酸配列に対する検出温度区間は他のターゲット核酸配列に対する二合体の量が変わる温度区間の制限された部分を含むことができる。例えば、重畳された温度区間で他のターゲット核酸配列に対する二合体により発生した信号の変化量は発生した信号の総変化量の２０％、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、または１％以下でありえる。例えば、ターゲット核酸配列に対する温度区間は、他のターゲット核酸配列に対する温度区間と１０℃、５℃、４℃、３℃、２．５℃、２℃、１．５℃、または１℃に重畳できる。
一具現例で、検出温度区間は相応するターゲット核酸配列に対する二合体の量が変わる温度区間を含み、他の二合体の量が変わる温度区間を含まないか、または一部含まない温度区間である。
一具現例で、ターゲット核酸配列の各々に対する検出温度区間は他のターゲット核酸配列に対する検出温度区間とオーバーラップしないように決定できる。
相異する二合体の間のＴｍ値の大きい差は検出温度区間が互いに重畳しないようにすることができる。相異する二合体の間のＴｍ値の差が小さな場合にも、検出温度区間の数または間隔を調節することによって、検出温度区間は互いに重畳しないことがある。
一具現例で、相応するターゲット核酸配列に対する検出温度区間は他のターゲット核酸配列に対する検出温度区間と重畳できる。特に、重畳する温度区間は１０℃、５℃、４℃、３℃、２．５℃、２℃、１．５℃、または１℃以下である。
一具現例によれば、複数のターゲット核酸配列の各々に対する二合体の量が変わらない温度区間が互いに重畳することを防止するがために複数の信号発生組成物は信号発生組成物により提供される二合体のＴｍが互いに十分に離隔するように設計される。複数のターゲット核酸配列の各々に対する二合体の量が変わる温度区間のうちの一部が互いに重畳する場合、検出温度区間はその重畳を最小化するように設定される。
一具現例で、検出温度区間の各々は相応するターゲット核酸配列に対する二合体の予想Ｔｍを含むように設定される。
一具現例で、ターゲット核酸配列の各々に対する検出温度区間は２０℃、１５℃、１０℃、６℃、５℃、４℃、または３℃以内である。
一具現例で、検出温度区間は最高検出温度と最低検出温度の間の区間として標識できる。
一具現例で、ターゲット核酸配列の各々に対する検出温度区間はＴｍ±１０℃、Ｔｍ±８℃、Ｔｍ±５℃、Ｔｍ±３℃、Ｔｍ±２℃内、Ｔｍ±１．５℃、またはＴｍ±１℃以内であり、ここでＴｍは相応する二合体のＴｍ値を示す。
各々のターゲット核酸配列に対して少なくとも２つの検出温度で信号値を収得する。
一具現例で、各々のターゲット核酸配列に対して割り当てられた検出温度区間内の２つの検出温度で信号値を収得する。
択一的な具現例で、各々のターゲット核酸配列に対して割り当てられた検出温度区間内の３個以上の検出温度で信号値を収得する。
本発明の特定具現例で、各々のターゲット核酸配列に対して割り当てられた検出温度区間内の３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、または１０個の検出温度で信号値を収得する。
一具現例で、各々のターゲット核酸配列に対して割り当てられた検出温度区間内の２つ以上、３個以上、５個以上、１０個以上、または１５個以上の検出温度で信号値を収得する。
一具現例で、各々のターゲット核酸配列に対して割り当てられた検出温度区間内の１００個以下、７０個以下、５０個以下、４０個以下、３０個以下、または２０個以下の検出温度で信号値を収得する。
一具現例で、各々のターゲット核酸配列に対する２つ以上の検出温度は相応する二合体が実質的に相異する信号値を提供する検出温度である。例えば、２つの検出温度を使用する場合、２つの検出温度は相応する二合体が前記２つの検出温度で相異する信号値を提供するように互いに離隔する。例えば、２つの検出温度は０．１℃、０．２℃、０．５℃、または１℃以下に離隔する。択一的に、２つの検出温度は二合体が混成化状態である温度区間から選択されないか、または２つの検出温度は二合体が解離された状態である温度区間から選択されない。
一具現例で、各々のターゲット核酸配列に対する少なくとも２つの検出温度は相応する二合体が実質的に相異する信号値を提供する検出温度である。
一具現例で、各々のターゲット核酸配列に対する少なくとも２つの検出温度は相応するターゲット核酸配列に対する二合体の量が変わる温度区間から選択された少なくとも２つの温度を含む。
図３は、相応する二合体の量が変わる温度区間から２つの検出温度を選択することを例示する。
一具現例で、各々のターゲット核酸配列に対する少なくとも２つの検出温度のうちの一部は相応するターゲット核酸配列に対する二合体の量が変わる温度区間から選択され、残りはターゲット核酸配列に対する二合体の量が変わらない温度区間から選択される。
一具現例で、各々のターゲット核酸配列に対する少なくとも２つの検出温度のうちの一部は二合体が混成化状態である温度区間から選択されることができ、他のものは二合体が解離された状態である温度区間から選択できる。
一具現例で、少なくとも２つの検出温度は各々の相応する核酸配列に対する二合体の予想Ｔｍ値が前記少なくとも２つの検出温度の最高検出温度及び最低検出温度の間に含まれるように選択される。
一具現例で、各々のターゲット核酸配列に対する検出温度の間隔は５℃、４℃、３℃、２．５℃、２℃、１．５℃、１℃、０．５℃、または０．１℃以下である。
一具現例で、少なくとも２つの検出温度は差が２０℃以下、１５℃以下、１０℃以下、８℃以下、７℃以下、６℃以下、５℃以下、４℃以下、または３℃以下である最高検出温度及び最低検出温度を含む。
一具現例で、各々のターゲット核酸配列に対する少なくとも２つの検出温度はＴｍ±１０℃、Ｔｍ±８℃、Ｔｍ±５℃、Ｔｍ±２℃、またはＴｍ±１．５℃以内であり、ここで、Ｔｍは相応する二合体のＴｍ値を示す。
一具現例で、相異するターゲット核酸配列に対する検出温度のうちの一部は重畳できる。特に、本方法により複数の検出温度のうち、２つを基準温度として選択する場合、検出温度の間に重畳が発生できる。
一具現例で、２つの相異するターゲット核酸配列に対する重畳する検出温度の個数は１つ、２つ、３個、４個、または５個でありえる。
一具現例で、各々のターゲット核酸配列に対する検出温度のうち、少なくとも２つは他のターゲット核酸配列に対する検出温度と重畳しない。
一具現例で、信号値は全てのまたは一部のサイクルから検出される。例えば、総４５サイクルが遂行される場合、信号値は１番目乃至４５番目のサイクルの全てのサイクルから検出できる。
一具現例で、信号値は奇数サイクルで収得できる。例えば、総４５サイクルが遂行される場合、信号値は１、３、５、７．．．４５番目のサイクルで検出できる。
一具現例で、信号値は偶数サイクルで収得できる。例えば、総４５サイクルが遂行される場合、信号値は２、４、６、８．．．４４番目のサイクルで検出できる。４５番目のサイクルが反応の最後のサイクルであることを考慮する時、信号値は４５番目のサイクルで追加で検出できる。
一具現例で、信号値はユーザにより指定された１つ以上のサイクルで収得できる。例えば、信号値が検出される１つ以上のサイクルは反応の１つ以上のサイクルを遂行する前に決定できる。例えば、１０乃至４５番目のサイクルのサイクルが指定されるか、１０乃至４０番目のサイクルのサイクルが指定できる。指定されたサイクルは連続または不連続的でありえ、一定の間隔であるか、または一定でない間隔でありえる。一具現例で、信号値は初期サイクルでは収得されないことがある。例えば、初期サイクルは１サイクル乃至５番目のサイクルでありえる。初期サイクルで低い強さの信号が検出されることはできるが、信号変化値は留意しないことと予想されるので、初期サイクルで不必要な検出は省略できる。このような初期サイクルで信号値の検出の省略は反応サイクルの全体時間を減らすことができる。
一具現例で、少なくとも２つの検出温度で収得された信号値は補間（interpolation）されて更に他の温度での予想信号値を生成することができる。補間により収得された予想信号値は“補間信号値”と称されることができ、相応する検出温度は“補間温度”または“補間検出温度”と称されることができる。
本発明の一具現例で、補間温度は検出温度の間の任意の温度である。
本発明の一具現例で、サイクルで収得された信号値を補間して更に他のサイクルでの予想信号値を生成することができる。補間により収得された予想信号値を有するサイクルは“補間サイクル”と称されることができる。
補間は線形補間法、二重線形補間法、放物線補間法、多項式補間法、またはスプライン補間法、特に、線形補間法により実施できる。
他に示さない限り、本願に使われた用語“検出温度”は補間により生成された検出温度だけでなく、信号が機器により測定された検出温度を含む。
他に示さない限り、本願に使われた用語“信号値”は補間により生成された信号値だけでなく、機器測定により収得された信号値を含む。
本発明の一具現例で、温度及びその信号値が少なくとも２つの検出温度から補間される場合、少なくとも２つの検出温度は補間された検出温度を含む。
本願に使われたように、用語“信号値”は一定のスケールで定量化された、信号発生反応、特に増幅反応のサイクルで実際的に測定された信号値またはその変形を称する。前記変形は実際的に測定された信号値の数学的に加工された信号値を含むことができる。実際的に測定された信号値（即ち、原始データセットの信号値）の数学的に加工された信号値の例は、非制限的に、測定された信号値のログ値または測定された信号値の導関数値（derivatives）を含むことができる。
［ステップ：サイクル／信号変化値のデータセットを収得するステップ（１４０）］
複数の検出温度区間の各々での少なくとも２つの検出温度から選択された２つの基準温度間の信号値の信号変化値を収得して、複数のターゲット核酸配列の各々に対するサイクル／信号変化値のデータセットを収得する。
（基準温度の選択）
基準温度は複数の検出温度区間の各々での少なくとも２つの検出温度から選択される。
少なくとも２つの検出温度から選択される基準温度は予め決定できる。択一的に、基準温度は検出温度で収得された信号値を分析することによって、少なくとも２つの検出温度から選択できる。
本願に使われたように、用語“基準温度の選択”は少なくとも２つの検出温度から予め決定された基準温度を選択することだけでなく、方法の実施で所定の基準に基づいて少なくとも２つの検出温度から基準温度を選択することを含む。
一具現例で、各々のターゲット核酸配列に対する検出温度区間内に２つの検出温度が存在する場合、前記２つの検出温度が基準温度として選択される。
一具現例で、各々のターゲット核酸配列に対する検出温度区間内に３個以上の検出温度が存在する場合、前記３個以上の検出温度のうち、２つが基準温度として選択される。
一具現例で、各々のターゲット核酸配列に対する検出温度区間内に３個以上の検出温度が存在する場合、最低検出温度及び最高検出温度が２つの基準温度として選択される。
一具現例で、２つの基準温度の間の任意の温度での信号値がまた基準温度を使用して信号変化値を生成することに使われることができる。
一具現例で、各々のターゲット核酸配列に対する検出温度区間で３個の検出温度が存在し、前記検出温度が補間検出温度を含む場合、基準温度は（i）前記検出温度、（ii）前記補間検出温度、または（iii）前記検出温度、及び補間検出温度から選択される。
本発明の一具現例で、複数のターゲット核酸配列に対する２つの基準温度は互いに重畳しない。即ち、複数のターゲット核酸配列に対する２つの基準温度は互いに重畳しないことがある。本発明の一具現例で、ターゲット核酸配列に対する２つの基準温度は他のターゲット核酸配列に対する他の基準温度と重畳しない。各々のターゲット核酸配列に対する２つの基準温度は互いに重畳しないように選択できるが、これらは相応するターゲット核酸配列の存在または不存在を決定するための信号変化値を収得することに使われるためである。
本発明の一具現例で、ターゲット核酸配列に対する２つの基準温度は他のターゲット核酸配列に対する２つの基準温度と相異する。
一具現例で、ターゲット核酸配列に対する２つの基準温度は相応するターゲット核酸配列に対する二合体の量が変わる温度区間に属する。
一具現例で、ターゲット核酸配列に対する２つの基準温度は一定の間隔で離隔するように選択される。例えば、２つの基準温度は５℃、４℃、３℃、２℃、または１℃に離隔する。
一具現例で、ターゲット核酸配列に対する２つの基準温度は二合体のＴｍ周囲で一定の間隔で離隔するように選択される。
一具現例で、ターゲット核酸配列に対する２つの基準温度は相応するターゲット核酸配列に対する二合体のＴｍ周囲で一定の間隔で離隔するように選択される。この場合、サイクル／信号変化値のデータセットに同一のしきい値を適用して収得されたＣｔ値が互いに比較できる。
一方、未知のサンプルを分析する場合、サンプルに含まれた成分または実験条件によって、サンプルでのターゲット核酸配列に対する二合体の実際反応Ｔｍ値は予想Ｔｍ値と相異することができる。この場合、予想Ｔｍを基準に、２つの基準温度を選択することは方法の不正確性を起こすことがある。本発明は各々のターゲット核酸配列に対して複数の検出温度で信号値を測定し、複数の検出温度から２つの適合した基準温度が選択できるようにする。
各々のターゲット核酸配列に対する複数の検出温度から２つの基準温度を選択することは多様な方法により実施できる。
一具現例で、少なくとも２つの検出温度は３個以上の個数であり；方法は少なくとも３個の検出温度での信号値を分析して２つの基準温度を選択するステップを追加で含む。
基準温度は複数の検出温度での信号値に基づいて選択できる。
一具現例で、少なくとも２つの検出温度は３個以上であり；信号変化値は２つの基準温度を選択するために、少なくとも３個の検出温度での信号値を使用して計算される。
一具現例で、少なくとも２つの検出温度は３個以上であり；信号変化値は前記少なくとも３個の検出温度での信号値を使用して計算され、２つの基準温度は前記計算された信号変化値のうち、最高信号変化値が前記２つの基準温度の間に含まれるように選択される。
一具現例で、信号変化値は相応する信号変化値を計算するために使われた検出温度の間の温度に割り当てられる。
一具現例で、最高信号変化値は最高信号変化値を計算するために使われた検出温度の間の温度に割り当てられる。
例えば、信号変化値は直ぐ隣接した検出温度の間の信号値を使用して計算され、２つの基準温度は前記計算された信号変化値のうち、最高信号変化値が前記２つの基準温度の間に含まれるように選択される。
図４は、本発明の一具現例に従う２つの基準温度を選択することを例示する。特に、図４は直ぐ隣接した検出温度の間の信号値から計算された信号変化値に基づいて２つの基準温度を選択する過程を図示する。
図４は、Ｔ２及びＴ４を基準温度として選択する例を図示する。
一例で、少なくとも１つのサイクルでの信号値が基準温度の選択に使われる。１−８０サイクル、１−５０サイクル、１−３０サイクル、５−８０サイクル、５−５０サイクル、及び５−３０サイクルでの信号値が基準温度の選択に使われる。
一例で、最終サイクルでの信号値が基準温度の選択に使われる。例えば、最終サイクルが４５番目のサイクルである場合、４５番目のサイクルで検出された信号値が基準温度を選択することに使われることができる。
一例で、末期（late）サイクルでの信号値が基準温度の選択に使われる。例えば、最終サイクルが４５番目のサイクルである場合、４１乃至４５番目のサイクル（５個のサイクル）で検出された信号値が基準温度を選択することに使われることができる。末期サイクルは最終サイクル（endcycle）または最終サイクルと隣接したサイクルから構成される。
図４は、１つのサイクルでの信号値に基づいて基準温度を選択することを例示する。末期サイクル（少なくとも２つのサイクル）での信号値に基づいて基準温度を選択する場合、末期サイクルで計算された信号変化値の平均に基づいて基準温度が選択できる。言い換えると、各サイクルで信号変化値を先に計算した後、同一の温度で信号変化値の平均を計算して平均信号変化値を生成する。平均信号変化値が生成されれば、平均信号変化値の大きさに基づいて基準温度を選択する。
更に他の例で、末期サイクルでの平均信号値から計算された平均信号変化値に基づいて基準温度が選択できる。末期サイクルで同一の温度での信号値の平均を計算して平均信号値を生成した後、前記平均信号値の変化値を計算して平均信号変化値を生成する。
信号変化値は２つの連続した検出温度での信号値から計算できる。１つのサイクルで５個の検出温度で信号値が収得されれば、前記値から４個の信号変化値が計算される。前記４個の信号変化値に相応する温度は２つの連続した検出温度の間の補間温度として見なされる。信号変化値は検出温度の差対応信号値の差により計算できる。
信号変化値が計算されれば、信号変化値の大きさに基づいて基準温度が選択できる。一例で、基準温度は最高信号変化値を含むように選択できる。基準温度は最高信号変化値と前記最高信号変化値に隣接した２つの信号変化値のうちの１つを含むように選択されることができ、最高信号変化値と２つの隣接した信号変化値のうち、任意の２つの信号変化値の間の差を計算して前記最高信号変化値に隣接した２つの信号変化値のうち、いずれか１つが基準温度として含まれる。
一具現例で、信号変化値は相応する信号変化値を計算することに使われた検出温度の間の温度に割り当てられ；信号変化値のうち、最高信号変化値が第１変化値として割り当てられ、最高信号変化値に隣接した２つの信号変化値のうち、高い信号変化値及び低い信号変化値が各々第２信号変化値及び第３信号変化値に割り当てられ；（i）第２信号変化値と第３信号変化値の間の差対（ii）第１信号変化値と第３信号変化値の間の差の割合がしきい値を超過する場合、最高信号変化値は第１信号変化値に対する温度と第２信号変化値に対する温度の間の中間温度に割り当てられ、中間温度から離れた２つの温度は２つの検出温度として選択される。
一具現例で、中間温度から同一の間隔で離れた２つの温度は両方向に２つの基準温度として選択される。
図４は、第２信号変化値と第３信号変化値の差対第１信号変化値と第３信号変化値の差の割合がしきい値０．４を超過する例を図示する。前記しきい値は０．２、０．３、０．４、０．５、または０．６以上の値に設定できる。
図４に示すように、前記割合がしきい値を超過するので、最高信号変化値は第１信号変化値に対する温度及び第２信号変化値に対する温度の間の中間温度に割り当てられ、前記中間温度から同一の間隔で離れた温度Ｔ２及びＴ４が両方向に２つの検出温度として選択される。
図５は、本発明の更に他の具現例によって基準温度を選択することを例示する。
一具現例で、信号変化値は相応する信号変化値を計算することに使われた検出温度の間の温度に割り当てられ；信号変化値のうち、最高信号変化値が第１変化値として割り当てられ、前記最高信号変化値に隣接した２つの信号変化値のうち、高い信号変化値及び低い信号変化値が各々第２信号変化値及び第３信号変化値に割り当てられ；（i）第１信号変化値と第３信号変化値の間の差対（iii）第２信号変化値と第３信号変化値の間の差の割合がしきい値未満の場合、最高信号変化値は第１信号変化値に対する温度に割り当てられ、第１信号変化値に対する温度から離れた２つの温度が２つの検出温度として選択される。
一具現例で、第１信号変化値に対する温度から同一の間隔で離れた２つの温度が両方向に２つの基準温度として選択される。
図５は、第２信号変化値と第３信号変化値の間の差対第１信号変化値と第３信号変化値の間の差の割合がしきい値０．４以下である例を図示する。図５に示すように、前記割合がしきい値を超過しないので、最高信号変化値は第１信号変化値に対する温度に割り当てられ、前記第１信号変化値に対する温度から同一の間隔で離れた２つの温度が選択される。この場合、Ｔ１及びＴ２の間及びＴ４及びＴ５の間の補間温度が選択された。
例えば、Ｔ２、Ｔ３、Ｔ４、及びＴ５が各々７０℃、７２℃、７４℃、及び７６℃であれば、Ｔ２及びＴ３の間の補間温度は７１℃であり、Ｔ３及びＴ４の間の補間温度は７３℃であり、Ｔ４及びＴ５の間の補間温度は７５℃である。したがって、基準温度は７１℃及び７５℃に選択される。
検出温度の間の信号変化値は多様な方式により計算できる。
一具現例で、２つの直ぐ隣接した検出温度の間の信号値の信号変化値は差し引き、割合、または変化率により計算できる。
相応するターゲット核酸配列に対する複数の検出温度での信号値を使用して基準温度を選択する更に他の方法は、複数の検出温度での信号値を用いて実際反応Ｔｍを決定するステップ、及び測定されたＴｍを含むようにターゲット核酸配列に対する基準温度を選択するステップを含む。
用語“実際反応Ｔｍ”は相応するターゲット核酸配列に対してサンプル分析の間形成される二合体が実際に示すＴｍ値を意味する。実際反応Ｔｍは、反応環境（例えば、温度、塩濃度、２価陽イオン濃度、オリゴ濃度、ｐＨなど）によって変わることがある。
用語“予想Ｔｍ”は、相応するターゲット核酸配列に対してサンプル分析の間形成される二合体が示すことと予想されるＴｍ値を意味する。“予想Ｔｍ”は、ターゲット核酸配列に対する標準を使用した実験を通じて収得できる。択一的に、予想Ｔｍは当業界に公知されたＴｍ分析プログラムを使用して収得することができる。
一具現例で、本発明は３個の検出温度での信号値を使用して相応するターゲット核酸配列に対する二合体の実際反応Ｔｍ値を計算するステップを追加で含む。
一具現例で、２つの基準温度は相応するターゲット核酸配列に対する二合体の実際反応Ｔｍ値が前記２つの基準温度の間に含まれるように選択される。
一具現例で、メルティング分析はターゲット核酸配列に対する実際反応Ｔｍを収得するための少なくともサイクルで実施できる。メルティング分析は、最終サイクルまたは中間サイクルで遂行できる。一具現例で、メルティング分析は一定の温度区間内で０．５℃以下の温度間隔で温度を増加または減少させて温度／信号値のデータを収得することによって実施される。
実際反応結果から適合した基準温度を選択する場合、予想Ｔｍ値によって二合体の量が変わることと予想される温度区間は二合体の量が実際に変わる温度区間と相異することがある。本願に使われたように、用語“基準温度が二合体の量が変わる温度区間に属する”ということは、基準温度が予想Ｔｍ値によって二合体の量が変わる温度区間に属することだけでなく、基準温度が二合体の量が実際に変わる温度区間に属することを含むことと意図される。
一具現例で、相応するターゲット核酸配列に対する基準温度は、各反応容器毎に選択できる。一具現例で、相異する反応容器で同一のターゲット核酸配列を検出する場合（特に、反応容器で同一の信号特性を有する１つの標識を使用する場合）、相応するターゲット核酸配列に対する基準温度は各反応容器毎に選択され、これらから相応するターゲット核酸配列に対する代表基準温度が決定され、全ての反応容器に適用される。一具現例で、相異する反応容器で同一のターゲット核酸配列を検出する場合、各々の反応容器から相応するターゲット核酸配列に対する基準温度を選択するための情報が収集され、前記情報から代表基準温度が決定され、全ての反応容器に適用される。
基準温度はターゲット核酸配列の存在を示す信号変化値が提供できる温度から選択される。
一具現例で、各々のターゲット核酸配列に対する２つの基準温度は、相応するターゲット核酸配列に対する二合体の量が変わる温度区間から選択される。更に他の具現例で、各々のターゲット核酸配列に対する２つの基準温度のうちの１つは相応するターゲット核酸配列に対する二合体の量が変わる温度区間から選択され、他の１つは相応するターゲット核酸配列に対する二合体の量が変わらない温度区間から選択される。一具現例で、各々のターゲット核酸配列に対する２つの検出温度のうちの１つは二合体が混成化された状態である温度区間から選択され、他の１つは二合体が解離された状態である温度区間から選択される。
本発明の一具現例で、各々のターゲット核酸配列に対する２つの基準温度は相応するターゲット核酸配列に対する二合体の量が変わる温度区間に属するが、他のターゲット核酸配列に対する二合体の量が実質的に変わらない温度区間に属しない温度から選択される。
一具現例で、各々のターゲット核酸配列に対する検出温度区間内の検出温度のうち、少なくとも２つの温度はその信号値がターゲット核酸配列の存在を示すことができる温度を含み、基準温度は前記少なくとも２つの温度から選択される。
一具現例で、２つの基準温度は５℃以内、４℃以内、３℃以内、２℃以内、または１℃以内で、互いに相異する。即ち、第１及び第２基準温度の間の差は５℃以内、４℃以内、３℃以内、２℃以内、または１℃以内である。
一具現例で、２つの基準温度は０．１℃以上、０．５℃以上、１℃以上、１．５℃以上、または２℃以上の温度差を有する。
一具現例で、２つの基準温度は１℃−５℃、１℃−４℃、１℃−３℃、２℃−５℃、２℃−４℃、または２℃−３℃、特に１℃−４℃、または２℃−４℃で、互いに相異する。
本発明者らは標識されたオリゴヌクレオチドを含む二合体を使用して、特に、媒介オリゴヌクレオチド−関与切断に依存的な方式により形成される二合体を使用してターゲット核酸配列を検出する場合、５℃以下の差を有する２つの基準温度の使用でもターゲット核酸配列が検出できることを確認した。また、ターゲット核酸配列の通常のアンプリコンより短い長さの二合体を使用して温度変化に一層敏感な方式により混成化を調節することができ、結局、小さな温度差でも検出可能な信号、即ち、有意味な信号変化値が提供できることを確認した。
基準温度は相応するターゲット核酸配列に対する二合体により発生した信号と比較して更に他のターゲット核酸配列に対する二合体から発生した信号の変化が非常に小さな温度区間を構成する。例えば、相応するターゲット核酸配列に対する二合体から発生した信号の変化と比較して更に他のターゲット核酸配列に対する二合体から発生した信号の変化は１０％以下、９％以下、８％以下、７％以下、６％以下、５％以下、４％以下、３％以下、２％以下、または１％以下でありえる。
（信号変化値の収得）
相応するターゲット核酸配列に対する信号変化値を２つの基準温度の間の信号値から収得する。
本願に使われたように、用語“２つの基準温度の間の信号値”は２つの基準温度での信号値だけでなく、これらの間の全てのまたは一部の温度での信号値も含むことと意図される。
例えば、相応するターゲット核酸配列に対する検出温度が６０℃、６１．５℃、６３℃、６４．５℃、及び６５℃であり、６１．５℃及び６４．５℃が２つの基準温度として選択される場合、“２つの温度間の信号値”は６１．５℃及び６４．５℃での信号値、６１．５℃、６３℃、及び６４．５℃での信号値、または６１．５℃及び６３℃での信号値を示すことができる。
一具現例で、信号変化値は２つの基準温度での２つの信号値を使用して収得される。
用語“２つの基準温度の間での信号値”は“２つの基準温度の間の任意の温度での信号値”と代替できる。
本発明の一具現例で、“２つの基準温度の間の信号値”はまた、存在する場合、１つ以上の補間温度での１つ以上の信号値を含む。
用語“２つの基準温度の間の信号値の信号変化値を収得すること”は２つの基準温度の間の全部または一部の信号値の信号変化値を定義された方式により収得することを意味する。
信号値から信号変化値を計算することは多様な方式により定義できる。一例で、信号変化値は２つの信号値の差し引き、割合、または変化率により収得できる。更に他の例で、信号変化値は基準温度の間の３個以上の信号値の差し引き、割合、または変化率により収得できる。具体的に、３個以上の信号値の差し引きは隣接した信号値の間に差し引きされた値を収得し、前記差し引きされた値から最高値、最低値、または平均を決定することによって達成できる。３個以上の信号値の割合は隣接した信号値の間の割合値を収得し、前記割合値から最高値、最低値、または平均を決定することによって達成できる。３個以上の信号値の変化率は３個以上の信号値の平均傾きを決定することによって達成できる。３個以上の信号値が存在する場合、３個以上の信号値の差し引き、割合、または変化率を計算するために多様な方法が使われることができる。
一具現例で、２つの基準温度での信号値から信号変化値を収得することは信号値の差による。
本発明の更に他の具現例で、２つの基準温度の間の信号値から信号変化値を収得することは温度変化値対比信号値の差による。温度変化値は、２つの基準温度の差でありえる。例えば、基準温度が６１℃及び６３℃であれば、温度変化値は２℃である。６１℃で６３０ＲＦＵ（relative fluorescent units）が検出され、６３℃で６００ＲＦＵが検出されれば、信号値の差は３０ＲＦＵである。この場合、信号変化値は３０ＲＦＵ／２℃=１５ＲＦＵ／℃である。
一具現例で、既存温度の間に３個以上の信号値が存在する場合、３個以上の信号値にフィッティングされる直線をプロッティングした後、前記直線の傾きを信号変化値として取ることができる。
各々のターゲット核酸配列に対する２つの基準温度が決定されれば、２つの基準温度での信号値及び補間サイクルでの信号値を使用して相応するターゲット核酸配列に対する信号変化値を収得して、サイクル／信号変化値のデータセットを収得する。
サイクル／信号変化値のデータセットはターゲット核酸配列毎に収得することができる。サイクル／信号変化値のデータセットは、信号値が測定されたサイクルと前記サイクルで基準温度の間の信号値から計算された信号変化値を含む。
サイクル／信号変化値のデータセットは、データ地点を含む。
本願で使われたように、用語“データ地点（data point）”はサイクル及び前記サイクルでの信号変化値を含む１つの座標値（a coordinate value）を意味する。用語“データ”は、データセットを構成する全ての情報を意味する。例えば、サイクル及び信号変化値の各々はデータである。
データ地点は２次元直交座標系で座標値として表示できる。前記座標値で、Ｘ−軸はサイクル番号を示し、Ｙ−軸は前記サイクル番号で計算された信号変化値を示す。
本願に使われたように、用語“データセット”はデータ地点の集合を意味する。
データセットはプロッティングされて増幅曲線を得ることができる。
一具現例で、信号発生反応により収得されるターゲット核酸配列に対するデータセットは、ターゲット核酸配列の存在または不存在を示すデータセットである。
［ステップ：複数のターゲット核酸配列の存在／不存在を決定するステップ（１５０）］
サンプル内の複数のターゲット核酸配列の各々の存在または不存在はサイクル／信号変化値のデータセットにより決定される。
サイクル／信号変化値のデータセットは、複数のターゲット核酸配列の各々に対して生成されるので、サイクル／信号変化値のデータセットは相応するターゲット核酸配列の存在または不存在を決定することに使われることができる。
一具現例で、ターゲット核酸配列の存在または不存在はサイクル／信号変化値のデータセットがしきい値を超過するかによって決定される。サイクル／信号変化値のデータセットがしきい値を超過すれば、サイクル／信号変化値のデータセットに相応するターゲット核酸配列がサンプル内に存在することと決定される。しきい値は８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０ＲＦＵ以上に設定できる。
一具現例で、ターゲット核酸配列の存在または不存在はサイクル／信号変化値のデータセットにフィッティングされた非線形関数を使用して実施される。一例で、非線形関数はシグモイド関数でありえる。
例えば、シグモイド関数は、数式１で表現できる。
Figure 2021518764
前記式で、ｆ（ｘ）はシグモイド関数であり；ａ１はサイクル／信号変化値のデータセットの最小値であり；ａ２、ａ３、及びａ４はサイクル／信号値のデータセットとのフィッティングを通じて決定される。
本発明の一具現例で、ターゲット核酸配列の存在または不存在はサイクル／信号変化値のデータセットにフィッティングされた非線形関数の最大傾き、最大値、またはフィッティング正確度を各々のしきい値と比較することによって決定される。非線形関数の最大傾き、最大値、及びフィッティング正確度の全てが各々のしきい値を超過する場合、ターゲット核酸配列が存在することと決定される。択一的に、非線形関数の最大傾き、最大値、またはフィッティング正確度のうち、いずれか１つがしきい値を超過すれば、ターゲット核酸配列が存在することと決定される。
例えば、最大傾きに対するしきい値は１５、２０、２５、３０、３５、４０などに設定できる。最大値に対するしきい値は８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０ＲＦＵ以下に設定できる。
フィッティング正確度は、（ａ）非線形関数がサイクル／信号変化値のデータセットをどれくらい近接して予測できるのか、即ちフィッティングの優秀度（goodness of fit）及び（ｂ）原因変数（explanatory variable）が反応変数（response variable）の予測にどれくらい有用であるかを示す値を包括する。
フィッティング正確度は非線形関数とサイクル／信号変化値のデータセットの間のマッチング程度を示すことができる。また、フィッティング正確度は非線形関数とサイクル／信号変化値のデータセットの間の差を示す。非線形関数とサイクル／信号変化値のデータセットの間のマッチが増加するほどフィッティング正確度は増加する。例えば、フィッティング正確度はＸ−自乗値（chi-square value）またはＲ−自乗値でありえる。
本発明の一具現例で、全てのまたは一部のサイクルの各々での信号値で構成されたサイクル／信号値のデータセットをサイクル／信号変化値のデータセットから復元し、これを使用してターゲット核酸配列の存在または不存在を決定する。サイクル／信号値のデータセットは各サイクルで信号値を検出して生成されたデータセットである。一般に、ターゲット核酸配列による二合体の量が最大である時の温度で信号値が検出されてサイクル／信号値のデータセットを生成する。二合体の量が最大である時の温度は、前記二合体による信号の強さが最大である時の温度でありえる。本発明によれば、サイクル／信号値のデータセットはサイクル／信号変化値のデータセットから由来できる。
サイクル／信号値のデータセットの復元
一具現例で、各々の相応するターゲット核酸配列に対するサイクル／信号変化値のデータセットから信号値が復元されてサイクル／信号値の復元されたデータセットを収得することができ、前記サイクル／信号値の復元されたデータセットを使用してサンプル内の複数のターゲット核酸配列の存在または不存在を決定する。
一具現例で、復元された信号値は各々の相応するターゲット核酸配列に対する二合体が最高信号値を生成する温度での信号値である。
一具現例で、サイクル／信号値データセットは下記の数式２を使用してサイクル／信号変化値から復元される。
Figure 2021518764
前記式で、ＦＤＴはユーザにより指定できる特定温度であり；ＦＣは最終サイクルを示し；ＳＣＴは信号変化値が検出される温度であり；ＢＳＶは背景信号値であり；ＳＶは信号値を示し；∂ＳＶ／∂Ｔは信号変化値を示す。
ＦＤＴは二合体からの信号が最大である時の温度でありえる。択一的に、ＦＤＴは検出温度区間内または検出温度区間外の特定温度でありえる。例えば、第１信号発生組成物により発生した二合体のＴｍ値が６５℃の場合、ＳＣＴは６５℃に設定され、ＦＤＴは６０℃に設定できる。
数式２は、変数分離法により下記の数式３乃至数式４に示すように由来できる。
変数分離法で、ＲＦＵ（Ｔ、Ｃ）はｆ（Ｔ）、ｇ（Ｃ）、及び“α”と表現できる。ＲＦＵ（Ｔ、Ｃ）は検出装置から測定された信号値を示す関数である。Ｔは温度を示し、Ｃはサイクルを示す。即ち、ＲＦＵ（Ｔ、Ｃ）は温度“Ｔ”とサイクル“Ｃ”の関数としての信号値を示す。ｆ（Ｔ）は温度“Ｔ”の関数としての信号値を示し、ｇ（Ｃ）はサイクル“Ｃ”の関数としての信号値を示す。“α”は背景信号を示す（図６参考）。
以下、６５℃でのサイクル／信号変化値データから６０℃でのサイクル／信号変化値を復元することに使われた数式２がどのように導出できるかを例示する。
数式３は、変数分離法によって６０℃及びサイクル“Ｃ”で収得されたサイクル／信号値データセットを示す。“α”は４５サイクル及び８５℃で測定された背景信号を示す。
Figure 2021518764
数式３で、ＲＦＵ（６０、Ｃ）は関数ｆ（Ｔ）と関数ｇ（Ｃ）の積で表現される。
数式４は、変数分離法によって６５℃及びサイクル“Ｃ”で収得されたサイクル／信号値データセットを示す。
関数ｇ（ｃ）は温度に独立的であるが、それはサイクル“Ｃ”のみの関数であるためである。両辺を温度“Ｔ”で微分することはＲＦＵ（６５、Ｃ）とｆ（６５）のような信号変化値により表現される関数ｇ（ｃ）を生成する。
Figure 2021518764
数式５は、数式３のｇ（Ｃ）に数式４のｇ（Ｃ）を代入して収得された数式を示す。
Figure 2021518764
数式６は、４５番目のサイクル及び６０℃で検出された信号値を示す。数式６は、ｆ（６０）に対して整理される。この例で、４５番目のサイクルは最終サイクルである。
Figure 2021518764
数式７は数式６を温度“Ｔ”で微分することによって収得された数式を示す。数式７は温度“Ｔ”に対してｆ（６５）の微分に対して整理される。
Figure 2021518764
数式８は、一部の項を数式６及び数式７での相応する項に代入することによって再表現された数式５を示す。
Figure 2021518764
数式８の値は各サイクルで６５℃での信号変化値を除いて、４５サイクルでの信号値及び信号変化値を検出することによって収得できる。したがって、数式８は数式９のように単純化できる。
Figure 2021518764
ＡとＢは４５番目のサイクルで信号値及び／又は信号変化値を検出することによって収得できるので、これらは定数で表現される。
結論的に、各サイクルで６０℃での信号値は、（i）６０℃及び４５番目のサイクルでの信号値；（ii）８５℃及び４５番目のサイクルでの信号値；（iii）６５℃及び各サイクルでの信号変化値；及び（iv）６５℃及び４５番目サイクルでの信号値を含む式により生成できる。
一般に、従来技術は６０℃で信号値を測定してデータセットを収得するので、生成されたデータセットはターゲット核酸配列の以外の核酸配列により発生した信号を含み、偽陽性をもたらすことができる。
これに反して、本発明は６５℃での信号変化値を使用してサイクル／信号値データセットを収得するので、ターゲット核酸配列の以外の核酸配列により発生した信号が６５℃で変わらない限り、生成されたデータセットはターゲット核酸配列の以外の核酸配列により発生した信号を含まない。したがって、本発明は従来技術と比較して偽陽性を格段に減少させる長所がある。
数式９を２つのターゲット核酸配列に適用すれば、第１ターゲット核酸配列に対する信号値は数式１０のように示すことができ、第２ターゲット核酸配列に対する信号値は数式１１のように示すことができる。
Figure 2021518764
Figure 2021518764
数式１０及び１１で、ＲＦＵ１は第１ターゲット核酸配列に対する信号値を示し、ＲＦＵ２は第２ターゲット核酸配列に対する信号値を示す。ＲＦＵ１（６０、Cycles）は第１ターゲット核酸配列が単独で存在する時、６０℃で検出された、サイクル及び前記サイクルでの信号値で構成されたサイクル／信号値データセットを示す。ＲＦＵ２（７２、Cycles）は、第２ターゲット核酸配列が単独で存在する時、７２℃で検出された、サイクル及び前記サイクルでの信号値で構成されたサイクル／信号値データセットを示す。
また、∂ＲＦＵ１（６５、Ｃ）／∂Ｔは第１ターゲット核酸配列が単独で存在する時、６５℃及びサイクルでの信号変化値を示す。∂ＲＦＵ（６５、Ｃ）／∂Ｔは、単一容器に第１ターゲット核酸配列及び第２ターゲット核酸配列が全て存在する時、６５℃及びサイクルでの信号変化値を示す。６５℃で第１ターゲット核酸配列に対する信号値は変わるが、第２ターゲット核酸配列に対する信号値は実質的に変わらないので、∂ＲＦＵ１（６５、Ｃ）／∂Ｔは∂ＲＦＵ（６５、Ｃ）／∂Ｔと同一のものと推定できる。
∂ＲＦＵ２（７７、Ｃ）／∂Ｔは、第２ターゲット核酸配列が単独で存在する時、７７℃及びサイクルでの信号変化値を示す。∂ＲＦＵ（７７、Ｃ）／∂Ｔは単一容器で第１ターゲット核酸配列及び第２ターゲット核酸配列が全て存在する時、７７℃及びサイクルでの信号変化値を示す。第２ターゲット核酸配列に対する信号値は７７℃で変わるが、第１ターゲット核酸配列に対する信号値は実質的に変わらないので、∂ＲＦＵ２（７７、Ｃ）／∂Ｔは∂ＲＦＵ（７７、Ｃ）／∂Ｔと同一のものと推定できる。
したがって、第１ターゲット核酸配列に対するサイクル／信号値データセット及び第２ターゲット核酸配列に対するサイクル／信号値データセットは、数式１２のように単純化できる。
Figure 2021518764
数式１２で、Ｃ、Ｄ、Ｅは最終サイクルで検出された信号値及び／又は信号変化値から収得できるので、これらは定数で表現される。
結論的に、本発明は複数のターゲット核酸配列に対する温度区間が互いに重畳しないようにオリゴヌクレオチドを設計することによって、複数のターゲット核酸配列に対する信号変化値からサイクル／信号値データセットを復元することができ、各々の温度区間は相応するターゲット核酸配列に対する信号が変わる区間である。
前記例示したように、本発明は下記のステップを含む第２温度でのサイクル／信号変化値データセットから第１温度でのサイクル／信号値データセットを復元する方法を提供する：
（ａ）第２温度でサイクル／信号変化値データセットを収得するステップ；
（ｂ）下記値を収得するステップ：
（i）最終サイクル及び第１温度での信号値；
（ii）背景信号値；及び
（iii）最終サイクル及び第２温度での信号値；及び
（ｃ）ステップ（ｂ）で収得された値を第２温度でのサイクル／信号変化値データセットを第１温度でのサイクル／信号値データセットに変換できる数式に適用して、第１温度でのサイクル／信号値データセットを収得するステップ。
ステップ（ｃ）での数式は、係数（［最終サイクルでの信号値−背景信号値］／［最終サイクル及び第２温度での信号値］）を含むことができる。
ステップ（ｃ）での数式の例は非制限的に数式２を含む。
ターゲット検出のための相異する信号発生方法の組合せ
一具現例で、信号発生組成物は複数のターゲット核酸配列のうち、１つの存在に依存的な切断反応により検出可能な信号を発生するための標識されたオリゴヌクレオチドを含む組成物を含み、標識されたオリゴヌクレオチドは二合体反応でヌクレアーゼにより切断され、信号値の収得は複数のターゲット核酸配列のうち、他のターゲット核酸配列に対する全ての二合体が混成化または解離されて信号を発生しない温度で実施され；切断反応により検出可能な信号を発生するための標識されたオリゴヌクレオチドでの標識は二合体内の標識と同一の信号特性を有する。
前述した本方法はターゲット核酸配列に対する二合体を形成し、二合体から２つの相異する温度の間の信号変化値を収得することによって、関心ターゲット核酸配列の存在または不存在を決定する。
相異するターゲット核酸配列らに対する二合体は同一の信号特性を有する標識を含む。したがって、検出機により検出された信号はどんな二合体が信号を発生するかが区別できない。しかしながら、二合体は互いに相異するＴｍ値を有するので、二合体は相応するターゲット核酸配列の存在を示す信号変化値を提供することができる。
本方法で、複数のターゲット核酸配列のうちの１つは前記ターゲット核酸配列の存在に依存的な方式により標識されたオリゴヌクレオチドを切断し、１つの温度で前記切断により発生した信号を測定することによって検出できる。特に、切断により信号を発生するオリゴヌクレオチドに連結された標識は二合体に使われた標識と同一の信号特性を有することができる。
一具現例で、検出オリゴヌクレオチドの切断は信号変化を誘導するか、または検出される標識された断片を放出する。
信号が標識されたオリゴヌクレオチドの切断により発生する場合、前記切断により放出された標識からの信号は任意の温度で検出できる。したがって、検出オリゴヌクレオチドの切断により発生した信号が検出できる限り、任意の温度が選択できる。
一具現例で、標識されたオリゴヌクレオチドの切断により発生した信号は複数のターゲット核酸配列のうち、他のターゲット核酸配列に対する全ての二合体が混成化または解離されて信号を発生させない温度で検出される。
例えば、単一鎖に解離された二合体が信号を発生しないように二合体が標識される場合、標識されたオリゴヌクレオチドの切断により発生する信号は形成されることと予想された全ての二合体が十分に解離される温度で検出される。
例えば、混成化された二合体が信号を発生しないように二合体が標識される場合、標識されたオリゴヌクレオチドの切断により発生する信号は形成されることと予想された全ての二合体が十分に混成化される温度で検出される。
標識されたオリゴヌクレオチドの切断により発生した放出された標識からの信号の強さは温度によって変わることがある。このような現象は二合体の形成によるターゲット核酸配列の存在の決定で偽陽性結果を引き起こすことができる。本発明は、信号変化値を計算するために選択された２つの基準温度の間に５℃以下、４℃以下、３℃以下、または２℃以下の間隔を適用して、このような誤った結果の可能性を減らすことができる。
一具現例で、少なくとも２つのターゲット核酸配列は二合体の形成により信号を発生させることによって検出され、１つのターゲット核酸配列は標識されたオリゴヌクレオチドの切断により信号を発生させることによって検出される。一具現例によれば、ターゲット核酸配列のうち、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個は二合体の形成により信号を発生させることによって検出され、１つのターゲット核酸配列は標識されたオリゴヌクレオチドの切断により信号を発生させることによって検出される。
一具現例で、信号発生組成物は複数のターゲット核酸配列のうちの１つの存在に依存的な切断反応により検出可能な信号を発生するための標識されたオリゴヌクレオチドを含む組成物を含み、前記標識されたオリゴヌクレオチドは反応でヌクレアーゼにより切断される。
特に、標識されたオリゴヌクレオチドをターゲット核酸配列と混成化した後、前記標識されたオリゴヌクレオチドを切断することによって信号を発生させる信号発生組成物が使われることができる。
検出オリゴヌクレオチドとターゲット核酸配列との混成化後、検出オリゴヌクレオチドの切断による信号はＴａｑＭａｎプローブ方法（米国特許第５，２１０，０１５号及び米国特許第５，５３８，８４８号）を含む多様な方法により発生することができる。
ＴａｑＭａｎ方法により信号が発生する場合、信号発生組成物はターゲット核酸配列の増幅のためのプライマーセット、適合した標識（例えば、相互作用二重標識）を有するＴａｑＭａｎプローブ及び５′ヌクレアーゼ活性を有する重合酵素を含む。ターゲット核酸配列と混成化されたＴａｑＭａｎプローブはターゲット増幅の間切断されてターゲット核酸配列の存在を示す信号を発生する。
ＴａｑＭａｎプローブ方法により信号を発生する具体的な例は、（ａ）プライマーセット及び適合した標識（例えば、相互作用二重標識）を有するＴａｑＭａｎプローブをターゲット核酸配列と混成化させるステップ；（ｂ）ステップ（ａ）の結果物及び５′−ヌクレアーゼ活性を有する核酸重合酵素を使用してターゲット核酸配列を増幅させるステップであって、前記ＴａｑＭａｎプローブは切断されて標識を放出し；及び（ｃ）放出された標識から信号発生を検出するステップを含む。
特に、媒介オリゴヌクレオチド−関与切断に依存的な方式により検出オリゴヌクレオチドの切断により信号を発生させる信号発生組成物が使われることができる。
一具現例で、媒介オリゴヌクレオチド−関与切断が断片を放出させる場合、前記断片は検出オリゴヌクレオチドと特異的に混成化され、前記断片は検出オリゴヌクレオチドの切断を誘導する。
一具現例で、媒介オリゴヌクレオチド−関与切断が断片を放出させる場合、前記断片は延長されて、キャプチャーオリゴヌクレオチドに相補的な混成化ヌクレオチド配列を含む標識されたオリゴヌクレオチドを切断する。
媒介オリゴヌクレオチド−関与切断に依存的な方式の検出オリゴヌクレオチドの切断による信号はInvader分析（米国特許第５，６９１，１４２号）、ＰＣＥＣ（PTO Cleavage and Extension-Dependent Cleavage)(WO 2012/134195）、ＰＥＣ−ＳＣ（PTO Cleavage and Extension-dependent Signaling オリゴヌクレオチドCleavage）（ＷＯ２０１３／１５７８２１）、及び米国特許第７，３０９，５７３号に記載された方法を含む多様な方法により発生することができる。特に、米国特許第７，３０９，５７３号に記載された方法は切断による信号発生を使用するＰＴＯＣＥ基盤の方法のうちの１つと見なされることができ、前記方法で、延長鎖の形成は延長鎖の形成によりＣＴＯと特異的に混成化されたオリゴヌクレオチドの切断を検出することによって検出できる。Invader分析は、媒介オリゴヌクレオチドの切断により断片を形成し、断片の延長無しで連続的な切断反応を誘導する。
一具現例で、（i）ターゲット核酸配列に対して、標識されたオリゴヌクレオチドの切断に依存的な方式により信号を発生させる信号発生組成物（例えば、ＴａｑＭａｎ方法）及び（ii）更に他のターゲット核酸配列に対して、媒介オリゴヌクレオチド−関与切断、特に媒介オリゴヌクレオチドの切断に依存的な方式により形成される二合体により信号を提供する信号発生組成物の組合せは予期しない結果を誘導することができる。
検出オリゴヌクレオチドの切断を使用する方法は、一般的に検出オリゴヌクレオチドの切断のために５′ヌクレアーゼ活性を有する酵素（特に、Ｔａｑ重合酵素）を使用する。検出プローブの直接的な混成化により信号を発生する従来の方法（例えば、分子ビーコン方法、混成化プローブ方法、またはHybeacon方法）で、検出プローブは５′ヌクレアーゼ活性を有する酵素（特に、Ｔａｑ重合酵素）により切断される可能性が非常に高い。検出プローブの切断は検出プローブの消耗によって敏感度の減少を引き起こすことができるか（例えば、混成化プローブ方法）、または切断−依存的信号発生方法（例えば、分子ビーコン方法）で偽陽性信号を引き起こすことができる。標識されたプライマー方法（例えば、Sunrise方法またはScorpion方法）はプローブ方法として切断から問題を経ないが、これらは検出温度を調節するためにアンプリコン自体のＴｍ値が制御されなければならないという短所がある。対照的に、媒介オリゴヌクレオチドの切断ステップを含む方法はターゲット核酸配列に特異的に混成化する媒介オリゴヌクレオチドの切断を用いるので、これらは５′ヌクレアーゼ活性を有する酵素（特に、Ｔａｑ重合酵素）により影響を受けない。また、媒介オリゴヌクレオチドの切断ステップを含む方法、特にＰＴＯＣＥ基盤方法は形成された二合体のＴｍ値を容易に調節して検出温度の簡便に選択することができる。
＜II．信号変化値を使用したサンプル内ターゲット核酸配列の検出＞
本発明の更に他の態様で、下記のステップを含むサンプル内ターゲット核酸配列を検出する方法を提供する：
反応容器で前記サンプルを前記ターゲット核酸配列を検出するための信号発生組成物と接触させるステップ；前記信号発生組成物は前記ターゲット核酸配列に対する二合体を形成し、前記二合体はターゲット核酸配列の存在または不存在を示す信号を提供し；
（i）前記二合体の形成及び（ii）前記形成された二合体の混成化及び／又は解離のために少なくとも２つのサイクルの間反応を実施するステップ；
前記反応の全てのまたは一部のサイクルで前記ターゲット核酸配列に割り当てられた検出温度区間で少なくとも２つの検出温度で信号値を収得するステップ；前記検出温度区間は二合体の量が変わる温度区間を含み；
前記検出温度で少なくとも２つの検出温度から選択された２つの基準温度間の信号値の信号変化値を収得して、前記ターゲット核酸配列に対するサイクル／信号変化値のデータセットを収得するステップ；及び
前記ターゲット核酸配列に対するサイクル／信号変化値のデータセットによりサンプル内ターゲット核酸配列の存在または不存在を決定するステップ。
本発明は原理的に前述した本発明の第１態様に従うので、これらの間の共通した説明は本明細書の複雑性を引き起こす過度な重畳を避けるために省略する。
一具現例で、信号発生組成物は相応するターゲット核酸配列の存在を示す信号を提供する二合体の形成のためのオリゴヌクレオチドを含み、前記オリゴヌクレオチドは標識されたオリゴヌクレオチドを含み、前記二合体は標識されたオリゴヌクレオチドを含み、形成された二合体の混成化及び／又は解離は検出可能な信号を提供する。
一具現例で、二合体は（i）ターゲット核酸配列と標識されたオリゴヌクレオチドの間の混成化により形成された二合体、（ii）ターゲット核酸配列に相補的な混成化配列を含むオリゴヌクレオチドと前記混成化配列の少なくとも一部に相補的な標識されたオリゴヌクレオチドの間の混成化により形成された二合体、または（iii）媒介オリゴヌクレオチド−関与切断に依存的な方式により形成された二合体（前記媒介オリゴヌクレオチドはターゲット核酸配列に混成化される）である。
一具現例で、媒介オリゴヌクレオチド−関与切断に依存的な方式により形成される二合体は、媒介オリゴヌクレオチド−関与切断により放出される断片の延長により形成された延長鎖の形成に依存的な方式により形成される二合体である。
一具現例で、媒介オリゴヌクレオチド−関与切断に依存的な方式により形成される二合体は、媒介オリゴヌクレオチド−関与切断により放出された断片と対応オリゴヌクレオチドとの混成化により形成された二合体である。
一具現例で、温度及びその信号値が少なくとも２つの検出温度から補間される場合、前記少なくとも２つの検出温度は補間検出温度を含む。
一具現例で、少なくとも２つの検出温度は２−１０個である。
一具現例で、２つの基準温度は５℃以下、４℃以下、３℃以下、２℃以下、または１℃以下で、互いに相異する。
一具現例で、少なくとも２つの検出温度は３個以上であり；方法は少なくとも３個の検出温度での信号値を分析して少なくとも２つの基準温度を選択するステップを追加で含む。
一具現例で、サンプルは追加のターゲット核酸配列を含み、信号発生組成物は追加のターゲット核酸配列の存在に依存的な切断反応により検出可能な信号を発生するための標識されたオリゴヌクレオチドを含む組成物を追加で含み、標識されたオリゴヌクレオチドは二合体反応でヌクレアーゼにより切断され、信号値の収得は他のターゲット核酸配列に対する二合体が混成化または解離されて信号を発生しない温度で実施され、切断反応により検出可能な信号を発生するための標識されたオリゴヌクレオチドでの標識は二合体内の標識と同一の信号特性を有する。
＜III．２つの基準温度での信号変化値によりターゲット核酸配列を検出するための格納媒体及び装置＞
下記に記載された本発明の格納媒体、装置、及びコンピュータプログラムは、本発明の方法をコンピュータで実施するためのものであるので、これらの間に共通した説明は、本発明の複雑性を誘導する過度な重畳を避けるために省略する。
本発明の更に他の態様で、プロセッサがサンプル内の複数のターゲット核酸配列を検出するための方法を実行するように構成するための指示を含む読取可能な格納媒体が提供され、方法は下記のステップを含む：
信号値を受信するステップ；前記信号値は下記ステップにより収得され：（i）単一反応容器でサンプルを複数のターゲット核酸配列を検出するための信号発生組成物と接触させるステップ；前記信号発生組成物は前記複数のターゲット核酸配列に対する複数の二合体を形成し、前記複数の二合体の各々は各々の相応するターゲット核酸配列の存在または不存在を示す信号を提供し、前記複数の二合体は互いに相異するＴｍ値を有し；（ii）前記複数の二合体の形成及び前記形成された二合体の混成化（hybridization）または解離（dissociation）のために少なくとも２サイクルの間反応を実施するステップ；及び（iii）前記反応の全てのまたは一部のサイクルで前記複数のターゲット核酸配列に割り当てられた複数の検出温度区間の各々での少なくとも２つの検出温度で信号値を収得するステップ；前記複数の検出温度区間の各々は、各々の相応するターゲット核酸配列に対する二合体の量が変わる温度区間を含み；
前記複数の検出温度区間の各々での前記少なくとも２つの検出温度から選択された２つの基準温度の間の信号値の信号変化値を収得して、前記複数のターゲット核酸配列の各々に対するサイクル／信号変化値のデータセットを収得するステップ；及び
前記複数のターゲット核酸配列の各々に対する前記サイクル／信号変化値のデータセットによりサンプル内複数のターゲット核酸配列の存在または不存在を決定するステップ。
本発明の更に他の態様で、プロセッサが以下を含む方法を実行するように構成するための指示を含むコンピュータ読取可能な格納媒体が提供される：
信号値を受信するステップ；前記信号値は下記のステップにより収得され：（i）反応容器でサンプルをターゲット核酸配列を検出するための信号発生組成物と接触させるステップ；前記信号発生組成物は前記ターゲット核酸配列に対する二合体を形成し、前記二合体はターゲット核酸配列の存在または不存在を示す信号を提供し；（ii）（i）二合体の形成及び（ii）前記形成された二合体の混成化及び／又は解離のために少なくとも２つのサイクルの間反応を実施するステップ；及び（iii）前記反応の全てのまたは一部のサイクルでターゲット核酸配列に対して割り当てられた検出温度区間での少なくとも２つの検出温度で信号値を収得するステップ；前記検出温度区間は二合体の量が変わる温度区間を含み；
前記検出温度区間での前記少なくとも２つの検出温度から選択された２つの基準温度の間の信号値の信号変化値を収得してターゲット核酸配列に対するサイクル／信号変化値のデータセットを収得するステップ；及び
ターゲット核酸配列に対するサイクル／信号変化値のデータセットによりサンプル内ターゲット核酸配列の存在または不存在を決定するステップ。
本発明の更に他の態様で、プロセッサが前記記載された方法を実行するように構成するためのコンピュータ読取可能な格納媒体上に格納されたコンピュータプログラムが提供される。
前記記載された本方法はプロセッサ、例えば独立型コンピュータ（stand alone computer）、ネットワーク付着コンピュータ、またはリアルタイムＰＣＲ装置のようなデータ収得装置で実行される。
コンピュータ読取可能な格納媒体の類型はＣＤ−Ｒ、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ、フラッシュメモリ、フロッピーディスク、ハードドライブ、ポータブルＨＤＤ、ＵＳＢ、マグネチックテープ、ＭＩＮＩＤＩＳＣ、不揮発性メモリカード、ＥＥＰＲＯＭ、光学ディスク、光学格納媒体、ＲＡＭ、ＲＯＭ、システムメモリ、及びウェブサーバのような多様な格納媒体を含む。一具現例で、コンピュータ読取可能な格納媒体は不揮発性コンピュータ読取可能な格納媒体である。
信号と関連したデータ（例えば、強さ、増幅サイクル番号、及び検出温度）はいくつのメカニズムを通じて受信できる。例えば、データはＰＣＲデータ収集装置にあるプロセッサにより獲得できる。データはデータが収集されながらリアルタイムにプロセッサに提供できるか、またはデータはメモリユニットまたはバッファに格納され、実験完了後、プロセッサに提供できる。類似するには、データセットは、前記収集装置とのネットワーク連結（例えば、ＬＡＮ、ＶＰＮ、インターネット、及びイントラネット）または直接連結（例えば、ＵＳＢまたは他の直接有線連結または無線連結）を通じてデスクトップコンピュータシステムのような別途のシステムに提供できるか、またはＣＤ、ＤＶＤ、フロッピーディスク、ポータブルＨＤＤなどのポータブル媒体上で独立型コンピュータシステムに提供できる。類似するように、データセットは、ノートブックまたはデスクトップコンピュータシステムのようなクライアントに対するネットワーク連結（例えば、ＬＡＮ、ＶＰＮ、インターネット、イントラネット、及び無線通信ネットワーク）を通じてサーバーシステムに提供できる。
本発明を実行するプロセッサを具現する指示はロジックシステムに含まれることができる。前記指示は、ポータブルＨＤＤ、ＵＳＢ、フロッピーディスク、ＣＤ、及びＤＶＤのような任意のソフトウェア格納媒体に提供できるが、ダウンロードされることができ、メモリモジュール（例えば、ハードドライブまたはローカルまたは付着ＲＡＭまたはＲＯＭのような他のメモリ）に格納できる。本発明を実行するコンピュータコードは、Ｃ、Ｃ＋＋、Java、Visual Basic、VBScript、JavaScript、Perl、及びＸＭＬのような多様なコーディング言語で実行できる。また、多様な言語及びプロトコルは本発明でデータと命令の外部及び内部格納と伝達に利用できる。
本発明の更に他の態様で、（ａ）コンピュータプロセッサ及び（ｂ）コンピュータプロセッサに連結されたコンピュータ読取可能な格納媒体を含むサンプル内ターゲット核酸配列を検出するための装置が提供される。
一具現例で、装置はサンプル及び信号発生組成物を収容する反応容器、前記反応容器の温度を調節する温度調節手段及び／又はサイクル番号で信号を検出する検出機を追加で含む。
コンピュータプロセッサは、単一プロセッサがいくつの実行をするよう構築できる。択一的に、プロセッサユニットは多数個のプロセッサが各々いくつの実行をするよう構築できる。一具現例で、プロセッサはターゲット核酸配列の検出のための従来の装置（例えば、リアルタイムＰＣＲ装置）にソフトウェアをインストールして具現できる。
分析システムは増幅装置及び分析装置を含む。分析システムはサンプル内ターゲット核酸配列の存在または不存在を決定し、ユーザに結果を表示することができる。サンプル内ターゲット核酸配列の存在は陽性と表現され、不存在は陰性と表現できる。
増幅装置は核酸増幅反応、酵素反応、または微生物成長などを遂行する装置である。例えば、増幅装置が核酸増幅反応を実施する場合、増幅装置はサンプルの温度を増加または減少させる動作を繰り返して遂行することができる。増幅装置は各サイクル毎にサンプルから発生する信号を測定してデータセットを収得することができる。
増幅装置は分析装置とケーブルに連結されるか、または無線で連結できる。増幅装置は収得されたデータセットを有線または無線連結を通じて分析装置に転送する。
分析装置は増幅装置からデータセットを収得する。分析装置はデータセットを分析してサンプル内ターゲット核酸配列が存在するか、または不存在するかを決定する。即ち、分析装置はサンプルに対して陽性または陰性を決定する。
分析装置はディスプレイ装置を含む。ディスプレイ装置はデータセットを表示するか、またはデータセットをフローティングデートセットをグラフで表示することができる。ディスプレイ装置は、シグモイド関数、ステップ関数などを表示することができる。また、ディスプレイ装置はターゲット分析物が存在するか、または不存在するかを表示することができ、各サンプル毎に検出結果を表示することができる。
分析装置は格納媒体に含まれたデータセットを読み取ることができる。格納媒体はデータセットを格納するか、または分析装置で使われるプログラムなどを格納することができる。格納媒体はＣＤまたはＵＳＢなどでありえる。
分析装置はコンピュータ、スマートフォン、タブレット、またはウェアラブルデバイスでありえる。分析装置は、プロセッサ、メモリ、及びディスプレイ装置を含む。
発明を実施するための具体的な内容
本発明は実施例により一層詳細に説明される。これら実施例はより具体的に例示するためのものであり、添付した請求範囲に提示された本発明の範囲が実施例により制限されないということは当業者に自明である。
＜実施例＞
＜実施例１：ターゲット核酸配列の検出（単一ターゲット）＞
実施例１はターゲット核酸配列に対する二合体の予想Ｔｍ値に基づいて２つの検出温度を決定し、これを基準温度として使用した本発明の一具現例を例示した。
（信号発生組成物の製造）
クラミジアトラコマティスセロバルスエル（Chlamydia trachomatis serovars L (CT)）を検出するために、４個のサンプルの各々をＡｌｌｐｌｅｘＴＭ ＳＴＩ−ＧＵキット（株式会社シージェン、カタログ番号ＳＤ９８０２Ｘ）に含まれた信号発生組成物（即ち、オリゴヌクレオチド混合物及び酵素マスター混合物）と混合した。
信号発生組成物はＰＴＯＣＥ方法によりターゲット核酸配列に対する検出可能な信号を提供する二合体を形成するための組成物を含有する。サンプル内にターゲット核酸配列が存在する場合、前記ターゲット核酸配列に特異的に混成化する媒介オリゴヌクレオチド（即ち、ＰＴＯ）が５′ヌクレアーゼ活性を有する重合酵素により切断され、切断断片がキャプチャーオリゴヌクレオチド（即ち、ＣＴＯ）に混成化されて延長され、これにより検出可能な信号を提供する延長二合体を形成する。
ＣＴの存在下に前記延長二合体の予想Ｔｍは６４．５℃である。ＣＴＯのテンプレーティング部位はＣａｌ Ｒｅｄ ６１０及びＢＨＱ２の二重標識を有する。前記４個のサンプルは各々１０６コピー／反応、１０４コピー／反応、１０３コピー／反応、及び１０２コピー／反応の量でＣＴ配列がクローニングされたｐＤＮＡを含有する。リアルタイムＰＣＲ増幅のための反応混合物をＡｌｌｐｌｅｘＴＭ ＳＴＩ−ＧＵキットで製造した：５μlの４Ｘ ＧＵ ＭＯＭ、５μlのＥＭ１、５μlのＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ水、及び５μlのｐＤＮＡサンプルを含有する２０μlの最終体積の反応混合物。ＭＯＭはオリゴヌクレオチド混合物であり、ＥＭ１はＴａｑ重合酵素である。
（反応及び信号値の収得）
リアルタイムＰＣＲ増幅反応をＣＦＸ９６（ｖｅｒ．１．６、Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｉｎｃ．）で４個の反応混合物を使用して遂行した。前記増幅反応の温度及び時間プロファイルが表１に要約されている。
Figure 2021518764
サイクル１−５（ステップ３−６）での時間は初期反応の活性化のためにサイクル６の以後の他のサイクルの時間より長く設定された。サイクル１−５で信号値を検出し、ＲＦＵ０に加工した。サイクル６−４５（ステップ７−１１）での信号値を６３℃及び６６℃で検出した。信号値をＣａｌ Ｒｅｄ ６１０チャンネルで測定した。
（信号変化値の収得）
サイクル６−４５の各々で６３℃での信号値から６６℃での信号値を差し引いて信号変化値を収得した。
（サイクル／信号変化値のデータセットの収得）
サイクル６−４５での信号変化値を使用して、サイクル／信号変化値のデータセットを収得し、サイクル対信号変化値にプロッティングした。
（ターゲット核酸配列の存在または不存在の決定）
サイクル／信号変化値のデータセットをシグモイド関数でフィッティングし、前記フィッティングされたデータセットにしきい値（ＲＦＵ１１０）を適用してターゲット核酸配列の存在または不存在を決定した。
図７は、４個のサンプルに対してサイクル／信号変化値のデータセットをプロッティングすることによって収得された増幅曲線を示す。点線は各サイクルで計算された信号変化値を示し、実線は数式１のシグモイド関数を使用したシグモイドフィッティング値を示す：ＲＦＵ、シグモイド関数の最大信号値；ｄｆ、シグモイド関数の最大傾き；ａ４、シグモイド関数の形態；及びＣｔ、シグモイド関数がしきい値と交差するサイクル。
ＣＴ ｐＤＮＡの量が１０６コピー／反応である場合、Ｒ２、最大信号値（ＲＦＵ）、ｄｆ、ａ４、及びＣｔは、各々０．９９７７３、６０１．４４６４８、７０．３０５６、０．２０４８４、及び１７．４２７２と分析された。ＣＴ ｐＤＮＡの量が１０４コピー／反応の場合、Ｒ２、最大信号値（ＲＦＵ）、ｄｆ、ａ４、及びＣｔは、各々０．９９９８２、６９６．３８３５１、８４．５６９、０．２１０５９、及び２３．５２４５と分析された。ＣＴ ｐＤＮＡの量が１０３コピー／反応の場合、Ｒ２、最大信号値（ＲＦＵ）、ｄｆ、ａ４、及びＣｔは、各々０．９９９３３、５７６．４３２６３、６９．６７６９、０．２０９５５、及び２７．３３８９と分析された。ＣＴ ｐＤＮＡの量が１０２コピー／反応の場合、Ｒ２、最大信号値（ＲＦＵ）、ｄｆ、ａ４、及びＣｔは、各々０．９９９４６、３５４．５７６８６、４７．３９、０．２２６８３、及び３１．２９５と分析された。
その結果、４個のサンプルはしきい値ＲＦＵ１１０を超過するシグモイドフィッティングされた曲線の最大値を有していることと分析されており、したがってＣＴに対して陽性であると分析された。また、ターゲット核酸配列の量が減少することによって、Ｃｔ値は増加したことと測定された（１７．４２７２、２３．５２４５、２７．３３８９、及び３１．２９５）。
これら結果は、本発明が各増幅サイクルでの信号変化値から収得されたサイクル／信号変化値のデータセットにより正確で、かつ信頼すべき方式によりターゲット核酸配列の存在または不存在を決定することができることを立証する。
＜実施例２：ターゲット核酸配列の検出（多数のターゲット）＞
実施例２はターゲット核酸配列に対する二合体の予想Ｔｍ値に基づいて２つの検出温度を決定し、これを基準温度として使用した本発明の一具現例を例示した。
（信号発生組成物の製造）
クラミジアトラコマティスセロバルスエル（Chlamydia trachomatis serovars L (CT)）及びトレポネーマパリダム（Treponema pallidum (TP)）を検出するために、４個のサンプルの各々をＡｌｌｐｌｅｘＴＭ ＳＴＩ−ＧＵキット（株式会社シージェン、カタログ番号ＳＤ９８０２Ｘ）に含まれた信号発生組成物と混合した。
ＣＴの存在下に延長二合体の予想Ｔｍは６４．５℃である。ＣＴに対するＣＴＯのテンプレーティング部位はＣａｌ Ｒｅｄ ６１０及びＢＨＱ２の二重標識を有する。ＴＰの存在下に延長二合体の予想Ｔｍは７６℃である。ＴＰに対するＣＴＯのテンプレーティング部位はＣａｌ Ｒｅｄ ６１０及びＢＨＱ２の二重標識を有する。
前記５個のサンプルを表２のようにＣＴ及びＴＰのｐＤＮＡ分子を含有するように製造した。
Figure 2021518764
リアルタイムＰＣＲ増幅のための反応混合物をＡｌｌｐｌｅｘＴＭ ＳＴＩ−ＧＵキットで製造した：５μlの４Ｘ ＧＵ ＭＯＭ、５μlのＥＭ１、５μlのＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ水、及び５μlのｐＤＮＡサンプルを含有する２０μlの最終体積の反応混合物。
（反応及び信号値の収得）
リアルタイムＰＣＲ増幅反応をＣＦＸ９６（ｖｅｒ． １．６、Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｉｎｃ．）で５個の反応混合物を使用して遂行した。前記増幅反応の温度及び時間プロファイルが表３に要約されている。
Figure 2021518764
サイクル１−５（ステップ３−６）での時間は初期反応の活性化のためにサイクル６の以後の他のサイクルの時間より長く設定された。サイクル１−５で信号値を検出し、ＲＦＵ０に加工した。サイクル６−４５（ステップ７−１１）での信号値を検出温度で検出した。ＣＴ検出の場合、信号値を６３℃及び６６℃で測定し、ＴＰ検出の場合、信号値を７４．５℃及び７７．５℃で測定した。
（信号変化値の収得）
サイクル６−４５の各々での信号値の差により信号変化値を収得した。ＣＴの検出のための信号変化値は６３℃での信号値から６６℃での信号値を差し引いて収得し、ＴＰの検出のための信号変化値は７４．５℃での信号値から７７．５℃での信号値を差し引いて収得した。
（サイクル／信号変化値のデータセットの収得）
サイクル６−４５での信号変化値を使用して、サイクル／信号変化値のデータセットを収得し、サイクル対信号変化値にプロッティングした。
（ターゲット核酸配列の存在または不存在の決定）
サイクル／信号変化値のデータセットをシグモイド関数にフィッティングし、前記フィッティングされたデータセットにしきい値（ＲＦＵ１１０）を適用してターゲット核酸配列の存在または不存在を決定した。
図８−図１２は、５個のサンプルに対するサイクル／信号変化値のデータセットをプロッティングすることによって収得された増幅曲線を示す。点線は各サイクルで計算された信号変化値を示し、実線は数式１のシグモイド関数を使用したシグモイドフィッティング値を示す：図８−図１２で、左側曲線はＣＴに対する増幅曲線を示し、右側曲線はＴＰに対する増幅曲線を示す。
５個のサンプルはしきい値ＲＦＵ１１０を超過するシグモイドフィッティングされた曲線の最大値を有しているので、ＣＴ及びＴＰに対して陽性であると分析された。これらの結果は多数のターゲット核酸配列が存在する場合、本発明が各増幅サイクルでの信号変化値から収得されたサイクル／信号変化値のデータセットにより同時に、そして正確な方式により多数のターゲット核酸配列の存在または不存在を決定できることを立証する。
また、前記５個のサンプルでターゲット核酸配列の量が減少することによって、Ｃｔ値は増加することが測定された。図８−図１０で、ＣＴ１０４コピー／反応の存在下にＴＰ ｐＤＮＡの量が減少することによって（１０４コピー／反応、１０３コピー／反応、及び１０２コピー／反応）、Ｃｔ値が増加することと分析されており（２６．１３９３、２９．４０４３、及び３４．０２９２）；図８、図１１、及び図１２で、ＴＰ１０４コピー／反応の存在下にＣＴ ｐＤＮＡの量が減少することによって（１０４コピー／反応、１０３コピー／反応、及び１０２コピー／反応）、Ｃｔ値が増加することと分析された（２４．１８１６、２７．９３２３、及び３２．２０６８）。
結果的に、本発明者らは本発明が各増幅サイクルでの信号変化値から収得されたサイクル／信号変化値のデータセットにより単一反応容器で多数のターゲット核酸配列の存在または不存在を同時に、そして信頼性あるように決定できることを確認した。
＜実施例３：３個以上の検出温度から選択された基準温度を使用したターゲット核酸配列の検出＞
実施例１−２で、２つの検出温度はターゲット核酸配列に対する二合体の予想Ｔｍ値に基づいて決定され、これを基準温度として使用した。実施例３は各々のターゲット核酸配列に対して少なくとも３個の検出温度を決定して信号値を収得した後、前記信号値を考慮して前記少なくとも３個の検出温度のうち、２つの検出温度を選択した本発明の一具現例を例示した。
（信号発生組成物の製造）
ＨＢＢ（ヘモグロビンベータ）遺伝子、ＨＰＶ（ヒトパピローマウイルス）類型３５及びＨＰＶ類型１８を検出するために、１６個のサンプルの各々をＡｎｙｐｌｅｘＴＭ ＨＰＶ ＨＲキット（株式会社シージェン、カタログ番号ＨＰ７Ｅ００Ｘ）に含まれた信号発生組成物と混合した。
信号発生組成物はＰＴＯＣＥ方法によりターゲット核酸配列に対する検出可能な信号を提供する二合体を形成するための組成物を含有する。サンプル内にターゲット核酸配列が存在する場合、前記ターゲット核酸配列に特異的に混成化する媒介オリゴヌクレオチド（即ち、ＰＴＯ）が５′ヌクレアーゼ活性を有する重合酵素により切断され、切断断片がキャプチャーオリゴヌクレオチド（即ち、ＣＴＯ）に混成化されて延長され、これにより検出可能な信号を提供する延長二合体を形成する。
ＨＢＢ遺伝子の存在下に前記延長二合体の予想Ｔｍは６３℃である。ＨＢＢ遺伝子に対するＣＴＯのテンプレーティング部位はQ６７０及びＢＨＱ２の二重標識を有する。ＨＰＶ類型３５の存在下に前記延長二合体の予想Ｔｍは７０．５℃である。ＨＰＶ類型３５に対するＣＴＯのテンプレーティング部位はＱ６７０及びＢＨＱ２の二重標識を有する。ＨＰＶ類型１８の存在下に前記延長二合体の予想Ｔｍは７６．５℃である。ＨＰＶ類型１８に対するＣＴＯのテンプレーティング部位はＱ６７０及びＢＨＱ２の二重標識を有する。
１６個のサンプルを５０コピー／反応の量でＨＢＢ遺伝子、ＨＰＶ類型３５配列、またはＨＰＶ類型１８配列がクローニングされたｐＤＮＡを使用して表４のように製造した。
Figure 2021518764
リアルタイムＰＣＲ増幅のための反応混合物をＡｎｙｐｌｅｘＩＩＴＭ ＨＰＶ ＨＲキットで製造した：５μlの４Ｘ ＨＰＶ ＨＲ ＴＯＭ、５μlのＥＭ１、５μlのＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ水、及び５μlのｐＤＮＡサンプルを含有する２０μlの最終体積の反応混合物。ＴＯＭはオリゴヌクレオチド混合物であり、ＥＭ１はＴａｑ重合酵素である。
（反応）
リアルタイムＰＣＲ増幅反応をＣＦＸ９６（ｖｅｒ． １．６、Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｉｎｃ．）で１６個の反応混合物を使用して遂行し、信号を１つのチャンネル（Ｑ６７０チャンネル）で検出した。前記増幅反応の温度及び時間プロファイルが表５に要約されている。
Figure 2021518764
前記増幅反応を５０サイクルの間遂行した。ステップ２−４は奇数サイクルに該当し、ステップ５−２１は偶数サイクルに該当する。信号値を偶数サイクルのみで測定した。
（検出温度で信号値の収得）
各ターゲット核酸配列に対して、相応するターゲット核酸配列に対する二合体の予想Ｔｍ値を含む検出温度区間で６個の検出温度を設定した。ＨＢＢ遺伝子の場合、検出温度は６０℃、６１．５℃、６３℃、６４．５℃、６６℃、及び６７．５℃に設定され；ＨＰＶ類型３５配列の場合、検出温度は６６℃、６７．５℃、６９℃、７０．５℃、７２℃、及び７３．５℃に設定されており；ＨＰＶ類型１８配列の場合、検出温度は７３．５℃、７５℃、７６．５℃、７８℃、７９．５℃、及び８１℃に設定された。検出温度は１．５℃の間隔で設定された。
奇数サイクルでの信号値を偶数サイクルでの信号値の補間により近似化した。本実施例で、偶数の隣接したサイクルでの信号値の平均値を奇数サイクルでの信号値として決定した。
検出温度の間の温度及び検出温度の間の温度での信号値を検出温度及び検出温度での信号値の補間により近似化した。本実施例で、隣接した検出温度での信号値の平均値を隣接した検出温度の平均温度での信号値として決定した。
（基準温度の選択）
ターゲット核酸配列に対する基準温度を次のように選択した：
基準温度の選択のために、サイクル４６−５０での信号値を使用した。ＨＢＢ遺伝子に対して各サイクルで６個の検出温度で測定された信号値を使用して５個の信号変化値を計算した。前記信号変化値は隣接した検出温度での信号値の差し引きにより計算されており、これを隣接した検出温度の補間温度（即ち、２つの隣接検出温度の平均温度）に割り当てた。サイクル４６−５０での同一の検出温度での信号変化値の平均値を計算して相応する検出温度での平均信号変化値を生成した。最高平均信号変化値を第１平均信号変化値に割り当てて、最高平均信号変化値に対する隣接した平均信号値のうち、高い平均信号変化値を第２平均信号値に割り当てて、他の平均信号変化値を第３平均信号変化値に割り当てた。（第２平均信号変化値と第３平均信号変化値との間の差）対（第１平均信号変化値と第３平均信号変化値との間の差）の割合を計算した。前記割合がしきい値０．４を超過する場合、最高平均信号変化値を第１平均信号変化値に対する温度及び第２平均信号変化値に対する温度の間の中間温度に割り当てて、前記中間温度から同一の間隔（例えば、１．５℃）で離れた２つの温度を両方向に２つの基準温度として選択する。前記割合がしきい値０．４以下の場合、第１平均信号変化値を最高平均信号変化値に最終決定し、第１平均信号変化値に相応する補間温度から同一の間隔（例えば、１．５℃）で離れた２つの温度を両方向に２つの基準温度として選択する。
ＨＢＢ遺伝子と同一の方式によりサイクル４６−５０で６個の検出温度での信号値を使用してＨＰＶ類型３５及びＨＰＶ類型１８の検出のための２つの基準温度を選択した。
表６は、ＨＢＢ遺伝子の検出のための信号変化値を計算することに使われた、各サンプルに対する２つの基準温度を示す。
Figure 2021518764
本発明者らはＨＢＢ遺伝子に対する二合体の予想Ｔｍ（６３℃）に基づいてＨＢＢ遺伝子に対する２つの検出温度が６１．５℃及び６４．５℃であると予想した。サンプルＢ３、Ｂ４、及びＣ４で、２つの検出温度は予想Ｔｍに基づいて予想された２つの検出温度と同一であった。サンプルＡ３、Ａ４、Ｃ３、Ｄ３、及びＤで、選択された２つの検出温度は６２．２５℃及び６５．２５℃であった。隣接した検出温度での信号値の補間により６２．２５℃及び６５．２５℃での信号値を収得した。
表７は、ＨＰＶ類型３５配列の検出のための信号変化値を計算することに使われた、各サンプルに対する２つの基準温度を示す。
Figure 2021518764
本発明者らはＨＰＶ類型３５配列に対する二合体の予想Ｔｍ（７０．５℃）に基づいてＨＰＶ類型３５配列に対する２つの検出温度が６９℃及び７２℃であると予想した。全てのサンプルで、２つの検出温度は６９．７５℃及び７２．７５℃として選択された。隣接した検出温度での信号値の補間により６９．７５℃及び７２．７５℃での信号値を収得した。
表８は、ＨＰＶ類型１８配列の検出のための信号変化値を計算することに使われた、各サンプルに対する２つの基準温度を示す。
Figure 2021518764
本発明者らはＨＰＶ類型１８配列に対する二合体の予想Ｔｍ（７６．５℃）に基づいてＨＰＶ類型１８配列に対する２つの検出温度が７５℃及び７８℃であると予想した。全てのサンプルで、２つの検出温度は７５．７５℃及び７８．７５℃として選択された。隣接した検出温度での信号値の補間により７５．７５℃及び７８．７５℃での信号値を収得した。
（サイクル／信号変化値のデータセットの収得）
前記選択された２つの基準温度での信号値の差し引きにより各サンプル及びターゲット核酸配列に対する信号変化値を計算した。
（ターゲット核酸配列の存在または不存在の決定）
サイクル／信号変化値のデータセットをシグモイド関数にフィッティングし、前記フィッティングされたデータセットにしきい値（ＲＦＵ５０）を適用してターゲット核酸配列の存在または不存在を決定した。
表９−表１１は、サンプルでのターゲット核酸配列のＣｔ値を示す。
Figure 2021518764
Figure 2021518764
Figure 2021518764
前記結果は、基準温度が少なくとも３個の検出温度での信号値を考慮して少なくとも３個の検出温度から選択されることができ、ターゲット核酸配列の存在または不存在が増幅サイクルで前記選択された基準温度の間の信号変化値により決定できることを立証する。
ターゲット核酸配列に対する二合体の予想または計算されたＴｍ値は、サンプル、反応温度、塩濃度、２価陽イオン濃度、オリゴヌクレオチド濃度、及びｐＨのような反応条件下の実際反応Ｔｍ値と相異する。したがって、ターゲット核酸配列に対する二合体の実際反応Ｔｍ値は反応間偏差を有する。検出温度の信号値を考慮して決定された基準温度を使用する本発明は、実際反応Ｔｍ値に適合した基準温度を選択するという点でターゲット核酸配列を正確に検出することに非常に有利である。
＜実施例４：３個以上の検出温度から選択された基準温度を使用したターゲット核酸配列の検出＞
３個超過の検出温度から選択された基準温度を使用した本発明の更に他の具現例を実施例３で使われたことと相異するターゲット核酸配列及び相異するレポーター標識を含む二合体で例示した。
（信号発生組成物の製造）
ＨＰＶ（ヒトパピローマウイルス）類型３３、ＨＰＶ類型３９、及びＨＰＶ類型５２を検出するために１６個のサンプルの各々を信号発生組成物と混合した。前記信号発生組成物はＰＴＯＣＥ方法によりターゲット核酸配列に対する検出可能な信号を提供する二合体を形成するための組成物を含有する。
ＨＰＶ類型３３の存在下に延長二合体の予想Ｔｍは６３℃である。ＨＰＶ類型３３に対するＣＴＯのテンプレーティング部位はＣａｌ ｒｅｄ ６１０及びＢＨＱ２の二重標識を有する。ＨＰＶ類型３９の存在下に延長二合体の予想Ｔｍは７０℃である。ＨＰＶ類型３９に対するＣＴＯのテンプレーティング部位はＣａｌ ｒｅｄ ６１０及びＢＨＱ２の二重標識を有する。ＨＰＶ類型５２の存在下に延長二合体の予想Ｔｍは７６℃である。ＨＰＶ類型５２に対するＣＴＯのテンプレーティング部位はＣａｌ ｒｅｄ ６１０及びＢＨＱ２の二重標識を有する。
１６個のサンプルを５０コピー／反応の量でＨＰＶ類型３３配列、ＨＰＶ類型３９配列、またはＨＰＶ類型５２配列がクローニングされたｐＤＮＡを使用して表１２のように製造した。
Figure 2021518764
本実施例に使われたアップストリームプライマー、ダウンストリームプライマー、ＰＴＯ、及びＣＴＯの配列は、次の通りである：
Figure 2021518764
リアルタイムＰＣＲ増幅のための反応混合物は２０μlの最終体積で、サンプル、ＨＰＶ類型３３ターゲット検出のためのオリゴヌクレオチド［６ｐｍｏｌｅの正方向プライマー（配列番号：１）、６ｐｍｏｌｅの逆方向プライマー（配列番号：２）、３ｐｍｏｌｅのＰＴＯ（配列番号：３）、１ｐｍｏｌｅのＣＴＯ（配列番号：４）］、ＨＰＶ類型３９ターゲット検出のためのオリゴヌクレオチド［４ｐｍｏｌｅの正方向プライマー（配列番号：５）及び４ｐｍｏｌｅの逆方向プライマー（配列番号：６）、３ｐｍｏｌｅのＰＴＯ（配列番号：７）、１ｐｍｏｌｅのＣＴＯ（配列番号：８）］、ＨＰＶ類型５２ターゲット検出のためのオリゴヌクレオチド［３ｐｍｏｌｅの正方向プライマー（配列番号：９）及び３ｐｍｏｌｅの逆方向プライマー（配列番号：１０）、２ｐｍｏｌｅのＰＴＯ（配列番号６：１１）、１ｐｍｏｌｅのＣＴＯ（配列番号：１２）］、及び１０μlのＥＭ４（Ｔａｑ重合酵素）を含有するように製造した。
（反応）
リアルタイムＰＣＲ増幅反応をＣＦＸ９６（Ｖｅｒ．１．６、Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｉｎｃ．）で１６個の反応混合物を使用して実施し、信号を１つのチャンネル（Ｃａｌ ｒｅｄ ６１０チャンネル）で検出した。増幅反応の温度及び時間プロファイルは実施例３でのプロファイルと同一である。
（検出温度で信号値の収得）
各ターゲット核酸配列に対して、相応するターゲット核酸配列に対する二合体の予想Ｔｍ値を含む検出温度区間で６個の検出温度を設定した。ＨＰＶ類型３３遺伝子の場合、検出温度を６０℃、６１．５℃、６３℃、６４．５℃、６６℃、及び６７．５℃に設定し；ＨＰＶ類型３９配列の場合、検出温度を６６℃、６７．５℃、６９℃、７０．５℃、７２℃、及び７３．５℃に設定し；ＨＰＶ類型５２配列の場合、検出温度を７３．５℃、７５℃、７６．５℃、７８℃、７９．５℃、及び８１℃に設定した。検出温度を１．５℃の間隔で設定した。
奇数サイクルでの信号値を偶数サイクルでの信号値の補間により近似化した。本実施例で、隣接した偶数サイクルでの信号値の平均値を奇数サイクルでの信号値として決定した。
検出温度の間の温度及び前記検出温度の間の温度での信号値を検出温度及び検出温度での信号値の補間により近似化した。本実施例で、隣接した検出温度での信号値の平均値を隣接した検出温度の平均温度での信号値として決定した。
（基準温度の選択）
ターゲット核酸配列に対する基準温度を実施例３に記載されたように選択した。
表１３は、ＨＰＶ類型３３の検出のための信号変化値を計算することに使われた、各サンプルに対する２つの基準温度を示す。
Figure 2021518764
本発明者らはＨＰＶ類型３３に対する二合体の予想Ｔｍ（６３℃）に基づいてＨＰＶ類型３３に対する２つの検出温度が６１．５℃及び６４．５℃であると予想した。サンプルＡ３、Ｂ３、Ｃ３、Ｄ３、Ａ４、及びＢ４で、選択された２つの検出温度は６２．２５℃及び６５．２５℃であった。サンプルＣ４及びＤ４で、選択された２つの検出温度は６３℃及び６６℃であった。隣接した検出温度での信号値の補間により６２．２５℃及び６５．２５℃での信号値を収得した。
表１４は、ＨＰＶ類型３９配列の検出のための信号変化値を計算することに使われた、各サンプルに対する２つの基準温度を示す。
Figure 2021518764
本発明者らはＨＰＶ類型３９配列に対する二合体の予想Ｔｍ（７０℃）に基づいてＨＰＶ類型３９配列に対する２つの検出温度が６９℃及び７２℃であると予想した。全てのサンプルで、２つの検出温度は６９℃及び７２℃として選択された。表１５は、ＨＰＶ類型５２配列の検出のための信号変化値を計算することに使われた、各サンプルに対する２つの基準温度を示す。
Figure 2021518764
本発明者らはＨＰＶ類型５２配列に対する二合体の予想Ｔｍ（７６℃）に基づいてＨＰＶ類型５２に対する２つの検出温度が７５℃及び７８℃であると予想した。全てのサンプルで、２つの検出温度が７５．７５℃及び７８．７５℃として選択された。隣接した検出温度での信号値の補間により７５．７５℃及び７８．７５℃での信号値を収得した。
（サイクル／信号変化値のデータセットの収得）
前記選択された２つの基準温度での信号値の差し引きにより各サンプル及びターゲット核酸配列に対する信号変化値を計算した。
（ターゲット核酸配列の存在または不存在の決定）
サイクル／信号変化値のデータセットをシグモイド関数でフィッティングし、前記フィッティングされたデータセットにしきい値（ＲＦＵ５０）を適用して１６個のサンプルでターゲット核酸配列の存在または不存在を決定した。
表１６−表１８は、サンプルでのターゲット核酸配列のＣｔ値を示す。
Figure 2021518764
Figure 2021518764
Figure 2021518764
前記結果は、基準温度が少なくとも３個の検出温度での信号値を考慮して少なくとも３個の検出温度から選択されることができ、ターゲット核酸配列の存在または不存在が増幅サイクルで選択された基準温度の間の信号変化値により決定できることを立証する。
以上、本発明の特定の部分を詳細に記述したところ、当業界の通常の知識を有する者に当たって、このような具体的な技術は単に好ましい具現例であり、これに本発明の範囲が制限されるのではないことは明白である。したがって、本発明の実質的な範囲は添付した請求項とその等価物により定義されるということができる。
本発明に従う複数のターゲット核酸配列の存在または不存在を決定する過程の一具現例を例示する流れ図である。
３個のターゲット核酸配列に対する３個の検出温度区間の一具現例を例示する。
３個のターゲット核酸配列の各々に対する２つの基準検出温度での信号値により計算された信号変化値の一具現例を例示する。
複数の検出温度から２つの基準温度を選択する一具現例を例示する。
複数の検出温度から２つの基準温度を選択する更に他の具現例を例示する。
変数分離法を例示する。
単一ターゲット核酸配列に対するサイクル／信号変化値のデータセットをプロッティングして収得された増幅曲線を示す。
多数のターゲット核酸配列に対するサイクル／信号変化値のデータセットをプロッティングして収得された増幅曲線を示す。
多数のターゲット核酸配列に対するサイクル／信号変化値のデータセットをプロッティングして収得された増幅曲線を示す。
多数のターゲット核酸配列に対するサイクル／信号変化値のデータセットをプロッティングして収得された増幅曲線を示す。
多数のターゲット核酸配列に対するサイクル／信号変化値のデータセットをプロッティングして収得された増幅曲線を示す。
多数のターゲット核酸配列に対するサイクル／信号変化値のデータセットをプロッティングして収得された増幅曲線を示す。

Claims (45)

  1. 次のステップを含むサンプル内複数のターゲット核酸配列を検出するための方法：
    単一反応容器で前記サンプルを前記複数のターゲット核酸配列を検出するための信号発生組成物と接触させるステップ；前記信号発生組成物は前記複数のターゲット核酸配列に対する複数の二合体を形成し、前記複数の二合体の各々は、各々の相応するターゲット核酸配列の存在または不存在を示す信号を提供し、前記複数の二合体は互いに相異するＴｍ値を有し；
    （i）前記複数の二合体の形成及び（ii）前記形成された二合体の混成化（hybridization）または解離（dissociation）のために少なくとも２サイクルの間反応を実施するステップ；
    前記反応の全てのまたは一部のサイクルで前記複数のターゲット核酸配列に割り当てられた複数の検出温度区間の各々での少なくとも２つの検出温度で信号値を収得するステップ；前記複数の検出温度区間の各々は、各々の相応するターゲット核酸配列に対する二合体の量が変わる温度区間を含み；
    前記複数の検出温度区間の各々での前記少なくとも２つの検出温度から選択された２つの基準温度の間の信号値の信号変化値を収得して、前記複数のターゲット核酸配列の各々に対するサイクル／信号変化値のデータセットを収得するステップ；及び
    前記複数のターゲット核酸配列の各々に対する前記サイクル／信号変化値のデータセットによりサンプル内複数のターゲット核酸配列の存在または不存在を決定するステップ。
  2. 前記信号発生組成物は各々の相応するターゲット核酸配列の存在を示す信号を提供する複数の二合体の形成のための標識されたオリゴヌクレオチドを含み、前記形成された二合体は前記標識されたオリゴヌクレオチドを含み、前記形成された二合体の混成化及び／又は解離は検出可能な信号を提供することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  3. 前記二合体は同一の信号特性を有する標識を含む標識されたオリゴヌクレオチドを含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  4. 前記複数の二合体は（i）ターゲット核酸配列及び標識されたオリゴヌクレオチドの間の混成化により形成された二合体、（ii）ターゲット核酸配列に相補的な混成化配列を含むオリゴヌクレオチド、及び前記混成化配列の少なくとも一部に相補的な標識されたオリゴヌクレオチドの間の混成化により形成された二合体、または（iii）ターゲット核酸配列に混成化される媒介オリゴヌクレオチド−関与切断（mediation oligonucleotide-involving cleavage）に依存的な方式により形成される二合体であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  5. 前記媒介オリゴヌクレオチド−関与切断に依存的な方式により形成される二合体は媒介オリゴヌクレオチド−関与切断により放出された断片の延長により形成された延長鎖の形成に依存的な方式により形成される二合体であることを特徴とする、請求項４に記載の方法。
  6. 前記媒介オリゴヌクレオチド−関与切断に依存的な方式により形成される二合体は、媒介オリゴヌクレオチド−関与切断により放出された断片と対応（counterpart）オリゴヌクレオチドとの混成化により形成された二合体であることを特徴とする、請求項４に記載の方法。
  7. 前記媒介オリゴヌクレオチド−関与切断に依存的な方式により形成される二合体は、（i）媒介オリゴヌクレオチドをターゲット核酸配列と混成化させるステップ、（ii）媒介オリゴヌクレオチドまたは媒介オリゴヌクレオチド−含有アンプリコンをヌクレアーゼにより切断させて断片を生成するステップ、（iii）前記断片を前記断片と混成化される５′−キャプチャリング部位を含むキャプチャリングオリゴヌクレオチドと混成化させるステップ、及び（iv）３′−テンプレーティング部位上でキャプチャリング部位と混成化された断片の延長反応を実施して延長鎖を形成するステップによる延長鎖の形成に依存的な方式により形成された二合体であることを特徴とする、請求項４に記載の方法。
  8. 前記媒介オリゴヌクレオチド−含有アンプリコンは媒介オリゴヌクレオチドをプライマーとして使用してターゲット核酸配列を増幅させ、アンプリコで媒介オリゴヌクレオチドに相補的な配列の一部を切断して断片を放出させることによって生成されることを特徴とする、請求項７に記載の方法。
  9. 前記媒介オリゴヌクレオチド−関与切断に依存的な方式により形成される二合体は、（i）媒介オリゴヌクレオチドをターゲット核酸配列と混成化させるステップ、（ii）媒介オリゴヌクレオチドをヌクレアーゼにより切断させて断片を生成するステップ、及び（iii）前記断片を前記断片に相補的な配列を有する対応オリゴヌクレオチドと混成化させるステップにより形成された二合体であることを特徴とする、請求項４に記載の方法。
  10. 前記二合体はその少なくとも１つの鎖に少なくとも１つの標識を含むことを特徴とする、請求項４に記載の方法。
  11. 前記延長鎖の形成に依存的な方式により形成された二合体は、（i）延長鎖及びキャプチャリングオリゴヌクレオチドの間の二合体、（ii）キャプチャリングオリゴヌクレオチド及びキャプチャリングオリゴヌクレオチド−混成化オリゴヌクレオチドの間の二合体、（iii）延長鎖−キャプチャリングオリゴヌクレオチド及び前記延長鎖−キャプチャリングオリゴヌクレオチドにキャプチャーされた延長鎖からの二重延長鎖の間の二合体、（iv）二重延長鎖及び前記二重延長鎖−混成化オリゴヌクレオチドの間の二合体、または（v）二重延長鎖−キャプチャリングオリゴヌクレオチド及び前記延長鎖−キャプチャリングオリゴヌクレオチドと混成化されるオリゴヌクレオチドの間の二合体であることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
  12. 前記信号発生組成物は前記複数のターゲット核酸配列を増幅するための少なくとも１つのプライマー対を含み、二合体反応は複数のターゲット核酸配列の増幅を伴うことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  13. 温度及びその信号値が少なくとも２つの検出温度から補間される場合、前記少なくとも２つの検出温度は補間検出温度を含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  14. 前記少なくとも２つの検出温度は２−１０個であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  15. 前記少なくとも２つの検出温度は差が１０℃以下である最高検出温度と最低検出温度を含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  16. 前記少なくとも２つの検出温度は、各々の相応するターゲット核酸配列に対する二合体の予想Ｔｍ値が前記少なくとも２つの検出温度のうち、最高検出温度及び最低検出温度の間に含まれるように選択されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  17. 前記少なくとも２つの検出温度が２つの検出温度である場合、前記２つの検出温度は前記２つの基準温度として選択されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  18. 前記２つの基準温度は前記少なくとも２つの検出温度のうち、最高検出温度及び最低検出温度として選択されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  19. 前記２つの基準温度は６℃以下で、互いに相異することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  20. 前記信号変化値は、前記２つの基準温度の間の全てのまたは一部の信号値を使用して計算されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  21. 前記信号変化値は、前記２つの基準温度での２つの信号値を使用して収得されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  22. 前記少なくとも２つの検出温度は３個以上であり、前記方法は２つの基準温度を選択するために少なくとも３個以上の検出温度での信号値を分析することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  23. 前記少なくとも２つの検出温度は３個以上であり、信号変化値は２つの基準温度を選択するために少なくとも３個の検出温度での信号値を使用して計算されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  24. 前記少なくとも２つの検出温度は３個以上であり、信号変化値は前記少なくとも３個の検出温度での信号値を使用して計算され、２つの基準温度は前記計算された信号変化値のうち、最高信号変化値が前記２つの基準温度の間に含まれるように選択されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  25. 前記最高信号変化値は、最高信号変化値を計算するために使われた検出温度の間の温度に割り当てられることを特徴とする、請求項２４に記載の方法。
  26. 前記少なくとも２つの検出温度は３個以上であり、信号変化値は直ぐ隣接した検出温度の間の信号値を使用して計算され、２つの基準温度は前記計算された信号変化値のうち、最高信号変化値が前記２つの基準温度の間に含まれるように選択されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  27. 前記最高信号変化値は、前記最高信号変化値を計算することに使われた検出温度の間の温度に割り当てられることを特徴とする、請求項２６に記載の方法。
  28. 前記信号変化値は相応する信号変化値を計算することに使われた検出温度の間の温度に割り当てられ；前記信号変化値のうち、最高信号変化値が第１変化値として割り当てられ、最高信号変化値に隣接した２つの信号変化値のうち、高い信号変化値及び低い信号変化値が各々第２信号変化値及び第３信号変化値に割り当てられ；（i）第２信号変化値と第３信号変化値の間の差対（ii）第１信号変化値と第３信号変化値の間の差の割合がしきい値を超過する場合、最高信号変化値は第１信号変化値に対する温度と第２信号変化値に対する温度の間の中間温度に割り当てられ、中間温度から同一の間隔で離れた２つの温度が両方向に２つの基準温度として選択されることを特徴とする、請求項２６に記載の方法。
  29. 前記信号変化値は相応する信号変化値を計算することに使われた検出温度の間の温度に割り当てられ；前記信号変化値のうち、最高信号変化値が第１変化値として割り当てられ、最高信号変化値に隣接した２つの信号変化値のうち、高い信号変化値及び低い信号変化値が各々第２信号変化値及び第３信号変化値に割り当てられ；（i）第２信号変化値と第３信号変化値の間の差対（ii）第１信号変化値と第３信号変化値の間の差の割合がしきい値未満の場合、最高信号変化値は第１信号変化値に対する温度に割り当てられ、前記第１信号変化値に対する温度から同一の間隔で離れた２つの温度が両方向に２つの基準温度として選択されることを特徴とする、請求項２６に記載の方法。
  30. 前記方法は３個の検出温度での信号値を使用して各々の相応するターゲット核酸配列に対する二合体の実際反応Ｔｍ値を計算するステップを追加で含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  31. 前記２つの基準温度は各々の相応するターゲット核酸配列に対する二合体の実際反応Ｔｍ値が２つの基準温度の間に含まれるように選択されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  32. 前記信号変化値は、信号値の差し引き、割合、または変化率により収得されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  33. 前記複数のターゲット核酸配列に対する２つの基準検出温度は互いに重畳しないことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  34. 前記２つの基準温度は単一反応容器及び相異する反応容器で同一のターゲット核酸配列に対する信号変化値を分析することによって選択されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  35. 前記複数のターゲット核酸配列の存在または不存在は、サイクル／信号変化値のデータセットにしきい値を適用することによって決定されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  36. 前記複数のターゲット核酸配列の存在または不存在は、サイクル／信号変化値のデータセットにフィッティングされた非線形関数を使用して決定されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  37. 前記信号発生組成物は、前記複数のターゲット核酸配列のうちの１つの存在に依存的な切断反応により検出可能な信号を提供する標識されたオリゴヌクレオチドを含み；前記標識されたオリゴヌクレオチドは二合体反応でヌクレアーゼにより切断され、前記信号値の収得は前記複数のターゲット核酸配列のうち、他のターゲット核酸配列に対する全ての二合体が混成化または解離されて信号を提供しない温度で遂行され、切断反応により検出可能な信号を発生するための標識されたオリゴヌクレオチドでの標識は二合体野に誓意標識と同一の信号特性を有することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  38. 前記方法は相応するターゲット核酸配列に対するサイクル／信号変化値のデータセットから信号値を復元してサイクル／信号値の復元されたデータセットを収得するステップを追加で含み、サンプル内の複数のターゲット核酸配列の存在または不存在の決定は、前記サイクル／信号値の復元されたデータセットを使用して遂行されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  39. 前記復元された信号値は、各々の相応するターゲット核酸配列に対する二合体が最高信号値を生成する温度での信号値であることを特徴とする、請求項３８に記載の方法。
  40. プロセッサが次のステップを含む方法を実行するように構成するための指示を含む読取可能な格納媒体：
    信号値を受信するステップ；前記の信号値は下記のステップにより収得され：（i）単一反応容器でサンプルを複数のターゲット核酸配列を検出するための信号発生組成物と接触させるステップ；前記信号発生組成物は前記複数のターゲット核酸配列に対する複数の二合体を形成し、前記複数の二合体の各々は、各々の相応するターゲット核酸配列の存在または不存在を示す信号を提供し、前記複数の二合体は互いに相異するＴｍ値を有し；（ii）前記複数の二合体の形成及び前記形成された二合体の混成化（hybridization）または解離（dissociation）のために少なくとも２サイクルの間反応を実施するステップ；及び（iii）前記反応の全てのまたは一部のサイクルで前記複数のターゲット核酸配列に割り当てられた複数の検出温度区間の各々での少なくとも２つの検出温度で信号値を収得するステップ；前記複数の検出温度区間の各々は、各々の相応するターゲット核酸配列に対する二合体の量が変わる温度区間を含み；
    前記複数の検出温度区間の各々での前記少なくとも２つの検出温度から選択された２つの基準温度の間の信号値の信号変化値を収得して、前記複数のターゲット核酸配列の各々に対するサイクル／信号変化値のデータセットを収得するステップ；及び
    前記複数のターゲット核酸配列の各々に対する前記サイクル／信号変化値のデータセットによりサンプル内複数のターゲット核酸配列の存在または不存在を決定するステップ。
  41. 前記請求項４０のコンピュータ読取可能な格納媒体を含む、サンプル内複数のターゲット核酸配列を検出するための装置。
  42. 下記のステップを含むサンプル内ターゲット核酸配列を検出する方法：
    反応容器で前記サンプルを前記ターゲット核酸配列を検出するための信号発生組成物と接触させるステップ；前記信号発生組成物は前記ターゲット核酸配列に対する二合体を形成し、前記二合体はターゲット核酸配列の存在または不存在を示す信号を提供し；
    （i）前記二合体の形成及び（ii）前記形成された二合体の混成化及び／又は解離のために、少なくとも２つのサイクルの間反応を実施するステップ；
    前記反応の全てのまたは一部のサイクルで前記ターゲット核酸配列に割り当てられた検出温度区間で少なくとも２つの検出温度で信号値を収得するステップ；前記検出温度区間は二合体の量が変わる温度区間を含み；
    前記検出温度で少なくとも２つの検出温度から選択された２つの基準温度の間の信号値の信号変化値を収得して、前記ターゲット核酸配列に対するサイクル／信号変化値のデータセットを収得するステップ；及び
    前記ターゲット核酸配列に対するサイクル／信号変化値のデータセットによりサンプル内ターゲット核酸配列の存在または不存在を決定するステップ。
  43. 前記サンプルは追加のターゲット核酸配列を含み、信号発生組成物は追加のターゲット核酸配列の存在に依存的な切断反応により検出可能な信号を発生するための標識されたオリゴヌクレオチドを含む組成物を含み、前記標識されたオリゴヌクレオチドは二合体反応でヌクレアーゼにより切断され、信号値の収得は他のターゲット核酸配列に対する二合体が混成化または解離されて信号を発生しない温度で遂行され、切断反応に検出可能な信号を発生するための標識されたオリゴヌクレオチドでの標識は二合体内の標識と同一の信号特性を有することを特徴とする、請求項４２に記載の方法。
  44. プロセッサが次を含む方法を実行するように構成する命令を含むコンピュータ読取可能な格納媒体：
    信号値を受信するステップ；前記信号値は下記のステップにより収得され：（i）反応容器でサンプルをターゲット核酸配列を検出するための信号発生組成物と接触させるステップ；前記信号発生組成物は前記ターゲット核酸配列に対する二合体を形成し、前記二合体はターゲット核酸配列の存在または不存在を示す信号を提供し；（ii）（i）二合体の形成及び（ii）前記形成された二合体の混成化及び／又は解離のために少なくとも２つのサイクルの間反応を実施するステップ；及び（iii）前記反応の全てのまたは一部のサイクルでターゲット核酸配列に対して割り当てられた検出温度区間での少なくとも２つの検出温度で信号値を収得するステップ；前記検出温度区間は二合体の量が変わる温度区間を含み；
    前記検出温度区間での前記少なくとも２つの検出温度から選択された２つの基準温度の間の信号値の信号変化値を収得してターゲット核酸配列に対するサイクル／信号変化値のデータセットを収得するステップ；及び
    ターゲット核酸配列に対するサイクル／信号変化値のデータセットによりサンプル内ターゲット核酸配列の存在または不存在を決定するステップ。
  45. 請求項４４のコンピュータ読取可能な格納媒体を含む、サンプル内ターゲット核酸配列を検出するための装置。
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