CN102405295A - 扩增双链dna中的双链目的序列的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及具有高特异性的巢式PCR。本发明提供扩增目的序列1的方法，该方法可高效扩增单链目的序列，以及可显著抑制非特异性扩增。本发明的一实施方式中，在巢式PCR的第2阶段，混合与外侧正向引物(4of)互补、且不会为所述DNA聚合酶引发的DNA延伸反应提供起点的外侧正向封闭核酸(4ofb)。

Description

扩增双链DNA中的双链目的序列的方法
技术领域
本发明涉及具有高特异性的巢式PCR。
背景技术
图1所示的巢式聚合酶链反应(Nested Polymerase Chain Reaction，以下称之为“巢式PCR”)，为扩增由第1单链DNA6及第2单链DNA7构成的双链DNA中所含的双链目的序列的代表性方法。
以下，参照图1对巢式PCR进行简单说明。
第1单链DNA6由3′末端-第1非扩增序列6a-第2非扩增序列6b-单链目的序列1a-第3非扩增序列6c-第4非扩增序列6d-5′末端构成。第2单链DNA7由5′末端-第5非扩增序列7a-第6非扩增序列7b-互补单链目的序列1b-第7非扩增序列7c-第8非扩增序列7d-3′末端构成。
第5非扩增序列7a、第6非扩增序列7b、互补单链目的序列1b、第7非扩增序列7c、及第8非扩增序列7d分别与第1非扩增序列6a、第2非扩增序列6b、单链目的序列1a、第3非扩增序列6c、及第4非扩增序列6d互补。
双链目的序列由单链目的序列1a和互补性单链目的序列1b构成。
首先，混合DNA聚合酶、脱氧核糖核苷三磷酸、双链DNA(6/7)、外侧正向引物(4of)、及外侧反向引物(5or)来调制第1混合液。
外侧正向引物(4of)由具有5～40碱基的核酸构成，且与第2非扩增序列6b中所含3′末端的序列部分互补。外侧反向引物(5or)由具有5～40碱基的核酸构成，且与第7非扩增序列7c中所含3′末端的序列部分互补。因此，外侧正向引物(4of)及外侧反向引物(5or)分别结合在第2非扩增序列6b中所含3′末端的序列部分及第7非扩增序列7c中所含3′末端的序列部分。
其次，将该第1混合液在94℃～100℃加热1秒至100秒。随后，在50～70℃冷却1秒至100秒。并且，在70℃～80℃加热1秒至600秒。将这些步骤循环反复，扩增中间双链DNA。
中间双链DNA为由中间单链目的序列6m及互补性中间单链目的序列7m构成的双链DNA。中间单链目的序列及互补性中间单链目的序列分别由3′末端-第2非扩增序列6b-单链目的序列1a-第3非扩增序列6c-5′末端、及5′末端-第6非扩增序列7b-互补性单链目的序列1b-第7非扩增序列7c-3′末端构成。
将至此为止的过程称为“第1阶段的PCR”。
随后，进行第2阶段的PCR。
混合扩增的中间双链DNA、DNA聚合酶、脱氧核糖核苷三磷酸、内侧正向引物(4if)、及内侧反向引物(5ir)来调制第2混合液。
内侧正向引物(4if)由具有5～40碱基的核酸构成，且与单链目的序列(1a)中所含3′末端的序列部分互补。内侧反向引物(5ir)由具有5～40碱基的核酸构成，且与互补性单链目的序列1b中所含3′末端的序列部分互补。因此，内侧正向引物(4if)及内侧反向引物(5ir)分别结合在单链目的序列1a中所含3′末端的序列部分及互补性单链目的序列1b中所含3′末端的序列部分。
最后，将该第2混合液在94℃～100℃加热1秒至100秒。随后，在50～70℃冷却1秒至100秒。其次，在70℃～80℃加热1秒至600秒。将这些步骤循环反复，扩增上述双链目的序列。
专利文献1及非专利文献1-3为与本发明相关的文献。
专利文献1：国际公开WO96/17932号公报
非专利文献1：Genome Research，4，376-379(1995)
非专利文献2：Genome Research，2，60-65(1992)
非专利文献3：Phytopathology，86，493-497(1996)
在第1阶段的PCR之后，且在进行第2阶段的PCR之前，需要去除外侧引物4of/5or。其缘由在于，如果第2混合液中含有外侧引物4of/5or，如图2所示，在第2阶段的PCR中也会由外侧引物导致DNA的延伸反应。
即，如图2所示，在第2阶段的PCR之后，不仅得到所期望的目的双链DNA，还会得到不期望且不需要的扩增产物。该不期望且不需要的扩增产物可导致目的双链DNA扩增效率的显著降低、电泳解析DNA的难度加大、以及基因诊断的失误。
发明内容
本发明的目的为提供一种利用巢式PCR有效扩增目的序列(1)的方法，本发明的方法可抑制上述不期望且不需要的扩增产物的产生。
为解决上述课题，本发明提供以下所列的技术方案。
(方案1)一种扩增由第1单链DNA(6)及第2单链DNA(7)构成的双链DNA中的双链目的序列(1)的方法，其中，
所述双链目的序列(1)由单链目的序列(1a)及互补性单链目的序列(1b)构成，
所述第1单链DNA(6)由3′末端-第1非扩增序列(6a)-第2非扩增序列(6b)-所述单链目的序列(1a)-第3非扩增序列(6c)-第4非扩增序列(6d)-5′末端构成，
所述第2单链DNA(7)由5′末端-第5非扩增序列(7a)-第6非扩增序列(7b)-所述互补性单链目的序列(1b)-第7非扩增序列(7c)-第8非扩增序列(7d)-3′末端构成，
所述互补性单链目的序列(1b)、所述第5非扩增序列(7a)、第6非扩增序列(7b)、第7非扩增序列(7c)、及第8非扩增序列(7d)分别与所述单链目的序列(1a)、所述第1非扩增序列(6a)、所述第2非扩增序列(6b)、所述第3非扩增序列(6c)及所述第4非扩增序列(6d)互补；
所述方法包括以下的工序(A)及工序(B)：
混合DNA聚合酶、脱氧核糖核苷三磷酸、所述双链DNA(6/7)、及外侧正向引物(4of)、及外侧反向引物(5or)，利用聚合酶链反应扩增中间双链DNA的工序(A)，其中，
所述中间双链DNA由中间目的序列及互补性中间目的序列构成，
所述中间目的序列由3′末端-第2非扩增序列(6b)-所述单链目的序列(1a)-第3非扩增序列(6c)-5′末端构成，
所述互补性中间目的序列由5′末端-第6非扩增序列(7b)-所述互补性单链目的序列(1b)-第7非扩增序列(7c)-3′末端构成，
所述外侧正向引物(4of)与所述第2非扩增序列(6b)中所含3′末端侧的序列部分互补，
所述外侧反向引物(5or)与所述第7非扩增序列中所含3′末端侧的序列部分互补；以及
混合DNA聚合酶、脱氧核糖核苷三磷酸、所述中间双链DNA、内侧正向引物(4if)、内侧反向引物(5ir)、及外侧正向封闭核酸(4ofb)，利用聚合酶链反应来特异性扩增所述目的序列(1)的工序(B)，其中，
所述内侧正向引物(4if)与所述单链目的序列(1a)中所含3′末端侧的序列部分互补，
所述内侧反向引物(5ir)与所述互补性单链目的序列(1b)中所含3′末端侧的序列部分互补，
所述外侧正向封闭核酸(4ofb)与所述外侧正向引物(4of)互补，且不能成为所述DNA聚合酶引发的DNA延伸反应的起点。
(方案2)方案1中记载的方法，其中，
在所述工序(B)中还混合有外侧反向封闭核酸(5orb)，
所述外侧反向封闭核酸(5orb)与所述外侧反向引物(5or)互补，且不能成为所述DNA聚合酶引发的DNA延伸反应的起点。
(方案3)方案1中记载的方法，其中，
所述外侧正向封闭核酸(4ofb)，由位于3′末端的核苷酸中所含糖的3位OH基被氢、磷酸基、氨基、生物素基、巯基、或它们的衍生物置换或修饰的DNA构成。
(方案4)方案1中记载的方法，其中，
所述外侧正向封闭核酸(4ofb)，由位于3′末端的核苷酸中所含糖的3位OH基被氢、磷酸基、氨基、生物素基、巯基、或它们的衍生物置换或修饰的锁核酸(Locked Nucleic Acid)构成。
(方案5)方案1中记载的方法，其中，
所述外侧正向封闭核酸(4ofb)，由肽核酸(Peptide Nucleic Acid)构成。
(方案6)方案2中记载的方法，其中，
所述外侧反向封闭核酸(5orb)，由位于3′末端的核苷酸中所含糖的3位OH基被氢、磷酸基、氨基、生物素基、巯基、或它们的衍生物置换或修饰的DNA构成。
(方案7)方案2中记载的方法，其中，
所述外侧反向封闭核酸(5orb)，由位于3′末端的核苷酸中所含糖的3位OH基被氢、磷酸基、氨基、生物素基、巯基、或它们的衍生物置换或修饰的锁核酸构成。
(方案8)方案2中记载的方法，其中，
所述外侧反向封闭核酸(5orb)，由肽核酸构成。
(方案9)一种扩增由第1单链DNA(6)及第2单链DNA(7)构成的双链DNA中的双链目的序列(1)的方法，其中，
所述双链目的序列(1)由单链目的序列(1a)及互补性单链目的序列(1b)构成，
所述第1单链DNA(6)由3′末端-第1非扩增序列(6a)-第2非扩增序列(6b)-所述单链目的序列(1a)-第3非扩增序列(6c)-第4非扩增序列(6d)-5′末端构成，
所述第2单链DNA(7)由5′末端-第5非扩增序列(7a)-第6非扩增序列(7b)-所述互补性单链目的序列(1b)-第7非扩增序列(7c)-第8非扩增序列(7d)-3′末端构成，
所述互补性单链目的序列(1b)、所述第5非扩增序列(7a)、第6非扩增序列(7b)、第7非扩增序列(7c)、及第8非扩增序列(7d)分别与所述单链目的序列(1a)、所述第1非扩增序列(6a)、所述第2非扩增序列(6b)、所述第3非扩增序列(6c)及所述第4非扩增序列(6d)互补；
所述方法包括以下的工序(A)及工序(B)：
混合DNA聚合酶、脱氧核糖核苷三磷酸、所述双链DNA(6/7)、及外侧正向引物(4of)、及内侧反向引物(5ir)，利用聚合酶链反应扩增中间双链DNA的工序(A)，其中，
所述中间双链DNA由中间目的序列及互补性中间目的序列构成，
所述中间目的序列由3′末端-第2非扩增序列(6b)-所述单链目的序列(1a)-5′末端构成，
所述互补性中间目的序列由5′末端-第6非扩增序列(7b)-所述互补性单链目的序列(1b)-3′末端构成，
所述外侧正向引物(4of)与所述第2非扩增序列(6b)中所含3′末端侧的序列部分互补，
所述内侧反向引物(5ir)与所述互补性单链目的序列(1b)中所含3′末端侧的序列部分互补；以及
混合DNA聚合酶、脱氧核糖核苷三磷酸、所述中间双链DNA、内侧正向引物(4if)、及外侧正向封闭核酸(4ofb)，利用聚合酶链反应来特异性扩增所述目的序列(1)的工序(B)，其中，
所述内侧正向引物(4if)与所述单链目的序列(1a)中所含3′末端侧的序列部分互补，
所述外侧正向封闭核酸(4ofb)与所述外侧正向引物(4of)互补，且不能成为所述DNA聚合酶引发的DNA延伸反应的起点。
(方案10)方案9中记载的方法，其中，
所述外侧正向封闭核酸(4ofb)，由位于3′末端的核苷酸中所含糖的3位OH基被氢、磷酸基、氨基、生物素基、巯基、或它们的衍生物置换或修饰的DNA构成。
(方案11)方案9中记载的方法，其中，
所述外侧正向封闭核酸(4ofb)，由位于3′末端的核苷酸中所含糖的3位OH基被氢、磷酸基、氨基、生物素基、巯基、或它们的衍生物置换或修饰的锁核酸构成。
(方案12)方案9中记载的方法，其中，
所述外侧正向封闭核酸(4ofb)，由肽核酸构成。
技术效果：通过以上技术方案，本发明提供扩增效率得以改善、且可显著抑制非特异性扩增的目的序列的扩增方法。
附图说明
图1是表示现有巢式PCR的图。
图2是表示在第2阶段的PCR中，外侧引物导致DNA延伸反应的现有巢式PCR问题点的图。
图3是表示本实施方式1所涉及的巢式PCR的图。
图4是表示在本实施方式1中，用封闭引物替代封闭核酸时的问题点的图。
图5是表示本实施方式2所涉及的巢式PCR的图。
图6是表示在比较例1a(图6(A))及实施例1(图6(B))中，谱1A的电泳结果的图。
图7是表示在比较例1a(图7(A))及实施例1(图7(B))中，谱1B的电泳结果的图。
图8是表示在比较例1a(图8(A))及实施例1(图8(B))中，谱1C的电泳结果的图。
图9是定量比较比较例1a及实施例1中的非特异性扩增的图。
图10是表示在比较例1b(图8(A))中，谱1A的电泳结果的图。
图11是表示在比较例2及实施例2中，谱2A的电泳结果的图。
图12是表示在比较例2及实施例2中，谱2B的电泳结果的图。
图13是表示在比较例2及实施例2中，谱2C的电泳结果的图。
图14是定量比较比较例2及实施例2中的非特异性扩增的图。
图15是表示在比较例3a(图15(A))及实施例3(图15(B))中，谱3A的电泳结果的图。
图16是表示在比较例3a(图16(A))及实施例3(图16(B))中，谱3B的电泳结果的图。
图17是表示在比较例3b中，谱3A的电泳结果的图。
具体实施方式
以下，参照图3说明本发明的实施方式。
(实施方式1)
本实施方式中，首先与图1同样，利用外侧引物进行第1阶段的PCR。第1阶段的PCR中，混合液里不含有内侧引物。
本实施方式如图3所示，以在第2阶段的PCR中采用外侧正向封闭核酸(4ofb)作为其特征。优选外侧正向封闭核酸(4ofb)及外侧反向封闭核酸(5orb)两者均被采用。
外侧正向封闭核酸(4ofb)及外侧反向封闭核酸(5orb)，分别具有与外侧正向引物(4of)及外侧反向引物(5or)互补的序列。并且，任一封闭核酸(4ofb/5orb)都不能为DNA聚合酶引发的延伸反应提供起点。优选封闭核酸(4ofb/5orb)为合成寡聚核酸。
作为封闭核酸(4ofb/5orb)的例子，可例举被修饰的DNA、被修饰的锁核酸(以下，称之为“LNA”，Locked Nucleic Acid)、及肽核酸(以下，称之为“PNA”)。
核酸为由糖、磷酸基、及碱基构成的多个核苷酸通过磷酸二酯键连接形成的生物高分子。位于被修饰的DNA及LNA的3′末端的核苷酸中所含糖的3位OH基被氢、磷酸基、氨基、生物素基、巯基、或它们的衍生物置换或修饰。LNA是人工开发出的核酸类似物。PNA不需要上述修饰。其原因在于，由(2-氨乙基)-甘氨酸键置换了糖-磷酸二酯键骨架。
在开始第2阶段的PCR之前，在混合液中添加内侧正向引物(4if)及内侧反向引物(5ir)。并且，在混合液中添加外侧正向封闭核酸(4ofb)。优选进一步添加外侧反向封闭核酸(5orb)。
添加封闭核酸(4ofb/5orb)时，外侧正向封闭核酸(4ofb)结合在外侧正向引物(4of)上，形成被称为引物二聚物的双链DNA结构。同样，外侧反向封闭核酸(5orb)结合在外侧反向引物(5or)上，形成双链DNA结构。这些双链DNA结构的形成可降低外侧正向引物(4of)及外侧反向引物(5or)的活性。进而，如图2所示，在第2阶段的PCR中抑制由外侧引物起始的DNA延伸反应。
外侧正向封闭核酸(4ofb)不可以是只与外侧正向引物(4of)互补的单纯引物。即，外侧正向封闭核酸(4ofb)不可以为DNA聚合酶引发的DNA延伸反应提供起点。参照图4，以下对其理由进行说明。
如图4所示，与图3同样，外侧正向封闭引物与外侧正向引物(4of)一起形成双链DNA结构。但是，第2单链DNA7具有与外侧正向封闭引物的互补序列相同或类似的序列部分7s时，外侧正向封闭引物也与该序列部分7s结合。并且，由外侧正向封闭引物开始DNA延伸反应。其结果生成如图2所示的不必要的扩增产物。同样，外侧反向封闭核酸(5orb)也不可以是只与外侧反向引物(5or)互补的单纯引物。这同样是由于第1单链DNA6具有与外侧反向封闭引物的互补序列相同或类似的序列部分6s时，外侧反向封闭引物结合在该序列部分6s，从而开始DNA延伸反应的缘故。第1单链DNA6及第2单链DNA7分别具有多个类似序列6s及多个类似序列7s时，将生成大量的所不期望的扩增产物。关于这一情况的详细，可参照实施例1和比较例1b、以及实施例3和比较例3b。
外侧正向封闭核酸(4ofb)优选具有比外侧正向引物(4of)的浓度高的浓度。更具体为，外侧正向封闭核酸(4ofb)优选具有外侧正向引物(4of)的5倍的浓度，更优选具有10倍的浓度。
外侧反向封闭核酸(5orb)也优选具有比外侧反向引物(5or)的浓度高的浓度。更具体为，外侧反向封闭核酸(5orb)优选具有外侧反向引物(5or)的5倍的浓度，更优选具有10倍的浓度。
与通常的PCR同样，在第1阶段的PCR及第2阶段的PCR中，根据需要还可混合具有pH缓冲作用的成分、如MgCl2那样的盐、如二硫苏糖醇(dithiothreitol)、牛血清白蛋白、及甘油那样的试剂。
(实施方式2)
对于本实施方式2，参照图5进行说明。本实施方式2与实施方式1的区别点在于，内侧反向引物(5ir)兼为外侧反向引物(5or)。
在本实施方式2中，首先与图1同样，也利用外侧引物进行第1阶段的PCR。与实施方式1不同，在实施方式2中的第1阶段的PCR，混合液含有内侧反向引物(5ir)。在第1阶段的PCR，产生由第2非扩增序列6b-单链目的序列1a构成的中间单链目的序列、及由第6非扩增序列7b-互补性单链目的序列1b构成的互补性中间单链目的序列。
在第2阶段的PCR之前，混合外侧正向封闭核酸(4ofb)。但与实施方式1不同，不混合外侧反向封闭核酸(5orb)。在第2阶段的PCR，通过内侧正向引物(4if)及内侧反向引物(5ir)扩增出单链目的序列1a及互补性单链目的序列1b。
实施例
本实施例及比较例中所用的模板DNA是利用自动DNA提取装置QIAcube(株式会社QIAGEN制)，由人血液样品调制而成。
所有引物、及外侧正向封闭核酸及外侧反向封闭核酸均购自筑波oligoservice株式会社。
外侧正向封闭核酸及外侧反向封闭核酸均在其3′末端被磷酸基修饰。
dNTP购自Invitrogen株式会社。PCR后的电泳解析采用Bioanalyzer2100(Agilent公司制)。
以下的实施例1、比较例1a、及比较例1b中，目的序列为人ABO血型基因所含的DNA片段。
(比较例1a)
本比较例1a中，外侧正向引物的序列为5′-GCCAGCTCCATGTGGCCGCAC-3′(序列号1，以后称之为“ABO-OF”)。外侧反向引物的序列为5′-CCTGGGTCTCTACCCTCGGC-3′(序列号2，以后称之为“ABO-OR”)。这一引物对扩增具有AB型血型的人ABO血型基因所含的210bp的DNA片段。这一引物对还可扩增具有O型血型的人ABO血型基因所含的209bp的DNA片段。
内侧正向引物的序列为5′-TGCAGTAGGAAGGATGTCCTC-3′(序列号3，以后称之为“ABO-IF”)。内侧反向引物的序列为5′-TTCTTGATGGCAAACACAGTTAAC-3′(序列号4，以后称之为“ABO-IR”)。这一ABO-IF和ABO-IR引物对扩增存在于上述210bp的DNA片段内的140bp的DNA片段(血型为AB时。为O型时则为139bp的DNA片段)。用这些引物，进行了如下所示的巢式PCR。
第1阶段的PCR溶液的组成，如下所示。
1×TITANIUM Taq DNA聚合酶(Clonetech公司制)、
1×TITANIUM Taq PCR Buffer(Clonetech公司制)、
200M dNTP、
1MABO-OF、
1M ABO-OR、0.5ng/L
5ng/l基因组DNA(源于AB型受验者)
总容量：10L
PCR的温度(热循环)谱1A～C如表1所示。
[表1]
Figure BDA0000058477200000111
Figure BDA0000058477200000112
Figure BDA0000058477200000113
第二个阶段的PCR溶液是在第1阶段的PCR后的反应液中添加0.5L的20M ABO-IF及0.5L的20M ABO-IR调制而成。
图6(A)示出谱1A的电泳解析结果。图6(A)不仅示出了由ABO-IF和ABO-IR的组合得到的DNA片段(即，目的序列)，还示出了由ABO-OF和ABO-OR的组合得到的所不期望的DNA片段的检测结果。并且，图6(A)除了示出这些扩增产物的峰以外，还示出了表示非特异性的扩增产物的多个峰。由ABO-IF和ABO-IR的组合得到的DNA片段的浓度为62.5nM。
图7(A)示出谱1B的电泳解析结果。与图6(A)同样，图7(A)也示出了表示非特异性的扩增产物的多个峰。由ABO-IF和ABO-IR的组合得到的DNA片段的浓度为137.8nM。
图8(A)示出谱1C的电泳解析结果。与图6(A)同样，图8(A)也示出了表示非特异性的扩增产物的多个峰。由ABO-IF和ABO-IR的组合得到的DNA片段的浓度为157.0nM。
(实施例1)
本实施例1中采用了与比较例1a同样的外侧正向引物(ABO-OF)、外侧反向引物(ABO-OR)、内侧正向引物(ABO-IF)、内侧反向引物(ABO-IR)。利用这些引物，进行了如下所示的巢式PCR。
第1阶段的PCR溶液的组成，如下所示，与比较例1a完全相同。
1×TITANIUM Taq DNA聚合酶、
1×TITANIUM Taq PCR Buffer
200M dNTP
1MABO-OF
1MABO-OR
0.5ng/L基因组DNA
总容量：10L
温度(热循环)谱与比较例1a相同。
第二个阶段的PCR溶液是在第1阶段的PCR后的反应液中添加
0.5L的20M ABO-IF、
0.5L的20M ABO-IR、
1L的外侧正向封闭核酸、以及
1L的外侧反向封闭核酸
调制而成。
该外侧正向封闭核酸由5′-GTGCGGCCACATGGAGCTGGC-3′(序列号5)构成，并且是其3′末端被磷酸化修饰的浓度100M的寡聚DNA(以后，称之为“ABO-OF-Block”)。这一序列对于ABO-OF是互补性的。
该外侧反向封闭核酸由5′-GCCGAGGGTAGAGACCCAGG-3′(序列号6)构成，并且是其3′末端被磷酸化修饰的100M的寡聚DNA(以后，称之为“ABO-OR-Block”)。这一序列与ABO-OR具有互补性。
图6(B)示出谱1A的电泳解析结果。图6(B)中示出，虽检测到了由ABO-IF和ABO-IR的组合得到的DNA片段(即，目的序列)，但几乎检测不到由ABO-OF和ABO-OR的组合得到的DNA片段。并且，图6(B)几乎没有示出表示非特异性的扩增产物的峰。由ABO-IF和ABO-IR的组合得到的DNA片段的浓度为478.6nM。由图6(B)可知，由于第二个阶段的PCR溶液含有ABO-OF-Block及ABO-OR-Block，基于ABO-IF和ABO-IR的组合的PCR进行得极为有效，并且非特异性扩增得到了显著抑制。
图9对非特异性扩增的抑制情况进行了定量示出。这些是对电泳解析检测出的所有非特异性扩增产物扩增时生成的焦磷酸(pyrophosphoric acid)浓度进行计算后得出的柱形图。
在DNA延伸反应中，众所周知每进行一碱基的延伸反应就生成一分子的焦磷酸。因此，求出非特异性扩增出的各DNA片段的长度(bp)×浓度(nM)，通过将这些全部加起来，即可求出所有非特异性扩增产物扩增时生成的焦磷酸浓度。各DNA片段的长度及浓度可通过Bioanalyzer2100求得。
与图6(A)所示的巢式PCR的结果相比较，图6(B)所示的巢式PCR可抑制约45％的非特异性扩增，这一结果由图9(1)及图9(2)示出。通过测定反应后的溶液中含有的焦磷酸的浓度，可测得DNA扩增的浓度。由非特异性的扩增产生的焦磷酸将导致大的噪音(noise)。而封闭核酸的添加，可削减由非特异性的扩增产生的焦磷酸导致的噪音。
图7(B)示出谱1B的电泳解析结果。与图6(B)同样，虽检测到了目的序列，但包括由ABO-OF和ABO-OR的组合得到的DNA片段在内，图7(B)中几乎没有示出表示非特异性的扩增产物的峰。由ABO-IF和ABO-IR的组合得到的DNA片段的浓度为516.5nM。
与图7(A)所示的巢式PCR的结果相比较，图7(B)所示的巢式PCR可抑制约66％的非特异性扩增，这一结果在图9(3)及图9(4)中示出。
图8(B)示出谱1C的电泳解析结果。与图6(B)同样，虽检测到了目的序列，但包括由ABO-OF和ABO-OR的组合得到的DNA片段在内，图8(B)中几乎没有示出表示非特异性的扩增产物的峰。由ABO-IF和ABO-IR的组合得到的DNA片段的浓度为375.2nM。
与图8(A)所示的巢式PCR的结果相比较，图8(B)所示的巢式PCR可抑制约61％的非特异性扩增，这一结果由图9(5)及图9(6)示出。
实施例1及比较例1a的结果说明，封闭核酸的添加显著提高了单链目的序列的扩增效率，并且可大大抑制非特异性扩增。
为了进行确认，本发明人在第1阶段的PCR之后只添加ABO-OF-Block来进行了实验。其结果显示，此时虽达不到ABO-OF-Block及ABO-OR-Block两者同时添加时的效果，但与ABO-OF-Block及ABO-OR-Block均不添加时相比，目的序列的扩增效率也得到了提高，且非特异性扩增得到了抑制。
(比较例1b)
在比较例1b中，如图4所示，采用了3′末端没有被磷酸化修饰的ABO-OF-Block(图4中的“外侧正向引物”)及3′末端没有被磷酸化修饰的ABO-OR-Block(图4中的“外侧反向引物”)。这一比较例中采用谱1A。
图10示出其电泳结果。图10中的由ABO-IF和ABO-IR的组合得到的DNA片段浓度明显低于图6(B)中的相应浓度。并且，图10中的非特异性扩增的抑制效果也明显低于图6(B)中的相应抑制效果。
由以上结果可知，3′末端没有被磷酸化修饰的封闭引物难以对非特异性扩增产生充分的抑制效果。
以下的实施例2及比较例2对应于图5。在以下的实施例2及比较例2中，目的序列为人ALDH2基因含有的DNA片段。
(比较例2)
本比较例2中，外侧正向引物的序列为5′-CAAATTACAGGGTCAACTGCT-3′(序列号7，以后称之为“ALDH2-OF”)。外侧反向引物的序列为5′-GGCAGGTCCTGAACCTC-3′(序列号8，以后称之为“ALDH2-OR”)。这一引物对扩增人ALDH2基因所含的251bp的DNA片段。
内侧正向引物的序列为5′-GTACGGGCTGCAGGCATACAC-3′(序列号9，以后称之为“ALDH2-IF”)。内侧反向引物的序列与ALDH2-OR相同。ALDH2-IF及ALDH2-OR的引物对可扩增存在于上述251bp的DNA片段内的160bp的DNA片段。用这些引物，进行了如下所示的巢式PCR。
第1阶段的PCR溶液的组成，如下所示。
0.05U/L TaKaRa LA Taq HS(宝生物株式会社制)、
1×LA PCR BufferII(Mg2+plus)(宝生物株式会社制)、
200M dNTP、
1MALDH2-OF、
1M ALDH2-OR、
0.83ng/L基因组DNA
总容量：10L
PCR的温度(热循环)谱2A～C如表2所示。
[表2]
Figure BDA0000058477200000151
Figure BDA0000058477200000152
Figure BDA0000058477200000161
Figure BDA0000058477200000162
第二个阶段的PCR溶液是在第1阶段的PCR后的反应液中添加1L的10MALDH2-IF调制而成。
图11(A)示出谱2A的电泳解析结果。图11(A)不仅示出了由ALDH2-IF和ALDH2-IR的组合得到的DNA片段(即，目的序列)，还示出由ALDH2-OF和ALDH2-OR的组合得到的DNA片段的检测结果。并且，图11(A)示出了表示非特异性的扩增产物的多个峰。由ALDH2-IF和ALDH2-IR的组合得到的DNA片段的浓度为10.7nM。
图12(A)示出谱2B的电泳解析结果。与图11(A)同样，图12(A)也示出了表示非特异性的扩增产物的多个峰。由ALDH2-IF和ALDH2-IR的组合得到的DNA片段的浓度为13.6nM。
图13(A)示出谱2C的电泳解析结果。与图11(A)同样，图13(A)也示出了表示非特异性的扩增产物的多个峰。由ALDH2-IF和ALDH2-IR的组合得到的DNA片段的浓度为9.9nM。
(实施例2)
实施例2中采用了在第1阶段的PCR后的反应液中添加
1L的10M ALDH2-IF、及
1L的外侧正向封闭核酸
的PCR溶液。
该外侧正向封闭核酸由5′-AGCAGTTGACCCTGTAATTTG-3′(序列号10)构成，并且是其3′末端被磷酸化修饰的浓度100M的寡聚DNA(以后，称之为“ALDH2-OF-Block”)。这一序列与ALDH2-OF具有互补性。
图11(B)示出谱2A的电泳解析结果。图11(B)的结果说明，虽可检测到由ALDH2-IF和ALDH2-IR的组合得到的DNA片段(即，目的序列)，但几乎检测不到由ALDH2-OF和ALDH2-OR的组合得到的DNA片段。并且，图11(B)几乎没有示出表示非特异性的扩增产物的峰。由ALDH2-IF和ALDH2-IR的组合得到的DNA片段的浓度为58.6nM。由图11(B)可知，由于第二个阶段的PCR溶液含有ALDH2-OF-Block及ALDH2-OR-Block，基于ALDH2-IF和ALDH2-IR的组合的PCR进行得极为有效，并且非特异性的扩增得到了显著抑制。
图14与图9同样，定量示出了对非特异性扩增的抑制情况。与图11(A)所示的巢式PCR的结果相比较，图11(B)所示的巢式PCR可抑制约95％的非特异性扩增，这一结果在图14(1)及图14(2)中示出。
图12(B)示出谱2B的电泳解析结果。与图11(B)同样，虽检测到了目的序列，但包括由ALDH2-OF和ALDH2-OR的组合得到的DNA片段在内，图12(B)中几乎没有示出表示非特异性的扩增产物的峰。由ALDH2-IF和ALDH2-IR的组合得到的DNA片段的浓度为58.6nM。
与图12(A)所示的巢式PCR的结果相比较，图12(B)所示的巢式PCR可抑制约87％的非特异性扩增，这一结果由图14(3)及图14(4)示出。
图13(B)示出谱2C的电泳解析结果。与图11(B)同样，虽检测到了目的序列，但包括由ALDH2-OF和ALDH2-OR的组合得到的DNA片段在内，图13(B)中几乎没有示出表示非特异性的扩增产物的峰。由ALDH2-IF和ALDH2-IR的组合得到的DNA片段的浓度为53.5nM。
与图13(A)所示的巢式PCR的结果相比较，图13(B)所示的巢式PCR可抑制约81％的非特异性扩增，这一结果由图14(5)及图14(6)示出。
实施例2及比较例2的结果说明，封闭核酸的添加显著提高了目的序列的扩增效率，并且可抑制非特异性扩增。
以下的实施例3、比较例3a、及比较例3b对应于图3。在以下的实施例3、比较例3a、及比较例3b中，目的序列为人肌养蛋白(dystrophin)基因所含的DNA片段。
(比较例3a)
本比较例3a中，外侧正向引物的序列为5′-GATGGCAAAAGTGTTGAGAAAAAGTC-3′(序列号11，以后称之为“DYSTRO-OF”)。外侧反向引物的序列为5′-TTCTACCACATCCCATTTTCTTCCA-3′(序列号12，以后称之为“DYSTRO-OR”)。这一引物对可扩增人肌养蛋白基因含有的459bp的DNA片段。
内侧正向引物的序列为5′-AGGCTTGAAAGGGCAAGTAGAAGT-3′(序列号13，以后称之为“DYSTRO-IF”)。内侧反向引物的序列为5′-GCTGATCTGCTGGCATCTTGC-3′(序列号14，以后称之为“DYSTRO-IR”)。这一DYSTRO-IF和DYSTRO-IR引物对可扩增存在于上述459bp的DNA片段内的147bp的DNA片段。用这些引物，进行了如下所示的巢式PCR。
第1阶段的PCR溶液的组成，如下所示。
1×TITANIUM Taq DNA聚合酶(Clonetech公司制)、
1×TITANIUM Taq PCR Buffer(Clonetech公司制)、
200M dNTP、
1M DYSTRO-OF、
1M DYSTRO-OR、
0.5ng/L基因组DNA、
总容量：10L
PCR的温度(热循环)谱3A～B如表3所示。
[表3]
Figure BDA0000058477200000191
Figure BDA0000058477200000192
第二个阶段的PCR溶液是在上述第1阶段的PCR后的反应液中添加0.5L的20M DYSTRO-IF及0.5L的20M DYSTRO-IR调制而成。
图15(A)示出谱3A的电泳解析结果。图15(A)不仅示出了由DYSTRO-IF和DYSTRO-IR的组合得到的DNA片段(即，目的序列)，还示出了由DYSTRO-OF和DYSTRO-OR的组合得到的DNA片段的检测结果。并且，图15(A)除了示出这些扩增产物的峰以外，还示出了表示非特异性的扩增产物的多个峰。由DYSTRO-IF和DYSTRO-IR的组合得到的DNA片段的浓度为294.5nM。
图16(A)示出谱3B的电泳解析结果。与图15(A)同样，图16(A)也示出了表示非特异性的扩增产物的多个峰。由DYSTRO-IF和DYSTRO-IR的组合得到的DNA片段的浓度为196.1nM。
(实施例3)
本实施例3中采用了与比较例3a同样的外侧正向引物(DYSTRO-OF)、外侧反向引物(DYSTRO-OR)、内侧正向引物(DYSTRO-IF)、及内侧反向引物(DYSTRO-IR)。利用这些引物，进行了如下所示的巢式PCR。
第1阶段的PCR溶液的组成及温度(热循环)谱3A、3B与比较例3a完全相同。
第二个阶段的PCR溶液是在第1阶段的PCR后的反应液中添加
0.5L的20M DYSTRO-IF、
0.5L的20M DYSTRO-IR、
1L的外侧正向封闭核酸、以及
1L的外侧反向封闭核酸
调制而成。
该外侧正向封闭核酸由5′-GACTTTTTCTCAACACTTTTGCCATC-3′(序列号15)构成，并且是其3′末端被磷酸化修饰的100M的寡聚DNA(以后，称之为“DYSTRO-OF-Block”)。这一序列对于DYSTRO-OF是互补性的。
该外侧反向封闭核酸由5′-TGGAAGAAAATGGGATGTGGTAGAA-3′(序列号16)构成，并且是其3′末端被磷酸化修饰的100M的寡聚DNA(以后，称之为“DYSTRO-OR-Block”)。这一序列与DYSTRO-OR具有互补性。
图15(B)示出谱3A的电泳解析结果。由图15(B)可知，基于DYSTRO-OF和DYSTRO-OR的组合的扩增产物浓度、基于DYSTRO-OF和DYSTRO-IR的组合的扩增产物浓度、以及基于DYSTRO-IF和DYSTRO-OR的组合的扩增产物浓度均在检测界限以下。
由DYSTRO-IF和DYSTRO-IR的组合得到的DNA片段的浓度为593.2nM。由图15(B)可知，由于第二个阶段的PCR溶液含有DYSTRO-OF-Block及DYSTRO-OR-Block，基于DYSTRO-IF和DYSTRO-IR的组合的PCR进行得极为有效，并且非特异性的扩增得到了显著抑制。
图16(B)示出谱3B的电泳解析结果。由图16(B)可知，基于DYSTRO-OF和DYSTRO-OR的组合的扩增产物浓度、基于DYSTRO-OF和DYSTRO-IR的组合的扩增产物浓度、以及基于DYSTRO-IF和DYSTRO-OR的组合的扩增产物浓度均在检测界限以下。
由DYSTRO-IF和DYSTRO-IR的组合得到的DNA片段的浓度为571.6nM。由图16(B)可知，由于第二个阶段的PCR溶液含有DYSTRO-OF-Block及DYSTRO-OR-Block，基于DYSTRO-IF和DYSTRO-IR的组合的PCR进行得极为有效，并且非特异性的扩增得到了显著抑制。
(比较例3b)
在比较例3b中，如图4所示，采用了3′末端没有被磷酸化修饰的DYSTRO-OF-Block(图4中的“外侧正向引物”)及3′末端没有被磷酸化修饰的DYSTRO-OR-Block(图4中的“外侧反向引物”)。这一比较例中采用谱3A。
图17示出其电泳结果。图17中的由DYSTRO-IF和DYSTRO-IR的组合得到的DNA片段浓度明显低于图15(B)及图16(B)的相应浓度。并且，图17中的非特异性扩增的抑制效果也明显低于图15(B)及图16(B)的相应抑制效果。
由以上结果可知，3′末端没有被磷酸化修饰的封闭引物难以对非特异性扩增产生充分的抑制效果。
工业实用性
本发明提供一种扩增目的序列的方法，该方法可高效扩增目的序列，并对非特异性扩增显示出显著的抑制效果。
附图标记说明
1：目的序列；1a：单链目的序列；1b：互补性单链目的序列；4of：外侧正向引物；4ofb：外侧正向封闭核酸；4if：内侧正向引物；5or：外侧反向引物；5ir：内侧反向引物；5orb：外侧反向封闭核酸；6：第1单链DNA；6a：第1非扩增序列；6b：第2非扩增序列；6c：第3非扩增序列；6d：第4非扩增序列；6m：中间单链目的序列；6s：与外侧反向封闭引物互补性的序列相同或类似的序列部分；7：第2单链DNA；7a：第5非扩增序列；7b：第6非扩增序列；7c：第7非扩增序列；7d：第8非扩增序列；7m：互补性中间单链目的序列；7s：与外侧正向封闭引物互补性的序列相同或类似的序列部分。
序列表文字说明
序列号1：用于扩增ABO血型基因的外侧正向引物；
序列号2：用于扩增ABO血型基因的外侧反向引物；
序列号3：用于扩增ABO血型基因的内侧正向引物；
序列号4：用于扩增ABO血型基因的内侧反向引物；
序列号5：用于扩增ABO血型基因的外侧正向引物的封闭核酸(DNA)；
序列号6：用于扩增ABO血型基因的外侧反向引物的封闭核酸(DNA)；
序列号7：用于扩增ALDH2基因的外侧正向引物；
序列号8：用于扩增ALDH2基因的外侧反向引物或内侧反向引物；
序列号9：用于扩增ALDH2基因的内侧正向引物；
序列号10：用于扩增ALDH2基因的外侧正向引物的封闭核酸(DNA)；
序列号11：用于扩增人肌养蛋白基因的外侧正向引物；
序列号12：用于扩增人肌养蛋白基因的外侧反向引物；
序列号13：用于扩增人肌养蛋白基因的内侧正向引物；
序列号14：用于扩增人肌养蛋白基因的内侧反向引物；
序列号15：用于扩增人肌养蛋白基因的外侧正向引物的封闭核酸(DNA)；
序列号16：用于扩增人肌养蛋白基因的外侧反向引物的封闭核酸(DNA)。
Figure IDA0000058477250000011
Figure IDA0000058477250000021
Figure IDA0000058477250000031
Figure IDA0000058477250000041
Figure IDA0000058477250000051

Claims (12)

1.一种扩增由第1单链DNA(6)及第2单链DNA(7)构成的双链DNA中的双链目的序列(1)的方法，其中，
所述双链目的序列(1)由单链目的序列(1a)及互补性单链目的序列(1b)构成，
所述第1单链DNA(6)由3′末端-第1非扩增序列(6a)-第2非扩增序列(6b)-所述单链目的序列(1a)-第3非扩增序列(6c)-第4非扩增序列(6d)-5′末端构成，
所述第2单链DNA(7)由5′末端-第5非扩增序列(7a)-第6非扩增序列(7b)-所述互补性单链目的序列(1b)-第7非扩增序列(7c)-第8非扩增序列(7d)-3′末端构成，
所述互补性单链目的序列(1b)、所述第5非扩增序列(7a)、第6非扩增序列(7b)、第7非扩增序列(7c)、及第8非扩增序列(7d)分别与所述单链目的序列(1a)、所述第1非扩增序列(6a)、所述第2非扩增序列(6b)、所述第3非扩增序列(6c)及所述第4非扩增序列(6d)互补；
所述方法包括以下的工序A及工序B：
混合DNA聚合酶、脱氧核糖核苷三磷酸、所述双链DNA(6、7)、及外侧正向引物(4of)、及外侧反向引物(5or)，利用聚合酶链反应扩增中间双链DNA的工序A，其中，
所述中间双链DNA由中间目的序列及互补性中间目的序列构成，
所述中间目的序列由3′末端-第2非扩增序列(6b)-所述单链目的序列(1a)-第3非扩增序列(6c)-5′末端构成，
所述互补性中间目的序列由5′末端-第6非扩增序列(7b)-所述互补性单链目的序列(1b)-第7非扩增序列(7c)-3′末端构成，
所述外侧正向引物(4of)与所述第2非扩增序列(6b)中所含3′末端侧的序列部分互补，
所述外侧反向引物(5or)与所述第7非扩增序列中所含3′末端侧的序列部分互补；以及
混合DNA聚合酶、脱氧核糖核苷三磷酸、所述中间双链DNA、内侧正向引物(4if)、内侧反向引物(5ir)、及外侧正向封闭核酸(4ofb)，利用聚合酶链反应来特异性扩增所述目的序列1的工序B，其中，
所述内侧正向引物(4if)与所述单链目的序列(1a)中所含3′末端侧的序列部分互补，
所述内侧反向引物(5ir)与所述互补性单链目的序列(1b)中所含3′末端侧的序列部分互补，
所述外侧正向封闭核酸(4ofb)与所述外侧正向引物(4of)互补，且不能成为所述DNA聚合酶引发的DNA延伸反应的起点。
2.如权利要求1所述的方法，其中，
在所述工序B中还混合有外侧反向封闭核酸(5orb)，
所述外侧反向封闭核酸(5orb)与所述外侧反向引物(5or)互补，且不能成为所述DNA聚合酶引发的DNA延伸反应的起点。
3.如权利要求1所述的方法，其中，
所述外侧正向封闭核酸(4ofb)，由位于3′末端的核苷酸中所含糖的3位OH基被氢、磷酸基、氨基、生物素基、巯基、或它们的衍生物置换或修饰的DNA构成。
4.如权利要求1所述的方法，其中，
所述外侧正向封闭核酸(4ofb)，由位于3′末端的核苷酸中所含糖的3位OH基被氢、磷酸基、氨基、生物素基、巯基、或它们的衍生物置换或修饰的锁核酸构成。
5.如权利要求1所述的方法，其中，
所述外侧正向封闭核酸(4ofb)，由肽核酸构成。
6.如权利要求2所述的方法，其中，
所述外侧反向封闭核酸(5orb)，由位于3′末端的核苷酸中所含糖的3位OH基被氢、磷酸基、氨基、生物素基、巯基、或它们的衍生物置换或修饰的DNA构成。
7.如权利要求2所述的方法，其中，
所述外侧反向封闭核酸(5orb)，由位于3′末端的核苷酸中所含糖的3位OH基被氢、磷酸基、氨基、生物素基、巯基、或它们的衍生物置换或修饰的锁核酸构成。
8.如权利要求2所述的方法，其中，
所述外侧反向封闭核酸(5orb)，由肽核酸构成。
9.一种扩增由第1单链DNA(6)及第2单链DNA(7)构成的双链DNA中的双链目的序列(1)的方法，其中，
所述双链目的序列(1)由单链目的序列(1a)及互补性单链目的序列(1b)构成，
所述第1单链DNA(6)由3′末端-第1非扩增序列(6a)-第2非扩增序列(6b)-所述单链目的序列(1a)-第3非扩增序列(6c)-第4非扩增序列(6d)-5′末端构成，
所述第2单链DNA(7)由5′末端-第5非扩增序列(7a)-第6非扩增序列(7b)-所述互补性单链目的序列(1b)-第7非扩增序列(7c)-第8非扩增序列(7d)-3′末端构成，
所述互补性单链目的序列(1b)、所述第5非扩增序列(7a)、第6非扩增序列(7b)、第7非扩增序列(7c)、及第8非扩增序列(7d)分别与所述单链目的序列(1a)、所述第1非扩增序列(6a)、所述第2非扩增序列(6b)、所述第3非扩增序列(6c)及所述第4非扩增序列(6d)互补；
所述方法包括以下的工序A及工序B：
混合DNA聚合酶、脱氧核糖核苷三磷酸、所述双链DNA(6、7)、及外侧正向引物(4of)、及内侧反向引物(5ir)，利用聚合酶链反应扩增中间双链DNA的工序A，其中，
所述中间双链DNA由中间目的序列及互补性中间目的序列构成，
所述中间目的序列由3′末端-第2非扩增序列(6b)-所述单链目的序列(1a)-5′末端构成，
所述互补性中间目的序列由5′末端-第6非扩增序列(7b)-所述互补性单链目的序列(1b)-3′末端构成，
所述外侧正向引物(4of)与所述第2非扩增序列(6b)中所含3′末端侧的序列部分互补，
所述内侧反向引物(5ir)与所述互补性单链目的序列(1b)中所含3′末端侧的序列部分互补；以及
混合DNA聚合酶、脱氧核糖核苷三磷酸、所述中间双链DNA、内侧正向引物(4if)、及外侧正向封闭核酸(4ofb)，利用聚合酶链反应来特异性扩增所述目的序列1的工序B，其中，
所述内侧正向引物(4if)与所述单链目的序列(1a)中所含3′末端侧的序列部分互补，
所述外侧正向封闭核酸(4ofb)与所述外侧正向引物(4of)互补，且不能成为所述DNA聚合酶引发的DNA延伸反应的起点。
10.如权利要求9所述的方法，其中，
所述外侧正向封闭核酸(4ofb)，由位于3′末端的核苷酸中所含糖的3位OH基被氢、磷酸基、氨基、生物素基、巯基、或它们的衍生物置换或修饰的DNA构成。
11.如权利要求9所述的方法，其中，
所述外侧正向封闭核酸(4ofb)，由位于3′末端的核苷酸中所含糖的3位OH基被氢、磷酸基、氨基、生物素基、巯基、或它们的衍生物置换或修饰的锁核酸构成。
12.如权利要求9所述的方法，其中，
所述外侧正向封闭核酸(4ofb)，由肽核酸构成。
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