ES2471097T3 - Ensayo diagnóstico de sensibilidad a los inhibidores de la quinasa B-Raf - Google Patents

Abstract

Método para determinar la sensibilidad de las células de cáncer a un inhibidor de B-Raf quinasa, comprendiendo el método: - obtener una muestra de ácidos nucleicos a partir de células de cáncer de un paciente que presenta un cáncer, - amplificar una secuencia polinucleotídica diana en la muestra de ácidos nucleicos utilizando una pareja de cebadores que amplifica la secuencia polinucleotídica diana, en la que la secuencia polinucleotídica diana comprende un sitio de mutación V600E, V600E o V600K en BRAF y la amplificación se lleva a cabo en presencia de una sonda oligonucleótida marcada que comprende SEC ID nº 1, en la que 'n' es desoxiinosina y detecta la presencia de una secuencia mutada en el sitio de mutación V600E, V600D o V600K en BRAF, y - detectar la presencia o ausencia de una mutaciáon V600E, V600E o V600K en BRAF, determinando de esta manera la sensibilidad del cáncer al inhibidor de B-Raf.

Description

Ensayo diagnóstico de sensibilidad a los inhibidores de la quinasa B-Raf

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

El gen BRAF codifica B-Raf, una serina/treonina quinasa, que acopla la se�alizaci�n de RAS activado con las MAPK quinasas posteriores (Wellbrock et al., Cancer Res. 64:2338-2342, 2004). Las mutaciones oncog�nicas en B-Raf resultan en una ganancia de función de quinasa, de manera que la ruta de Raf-MEK-ERK resulta constitutivamente activa en ausencia de los factores de crecimiento t�picos. Esta activación constitutiva se correlaciona con un mal pronóstico en el melanoma metast�sico (Houben et al., supra, 2004). Se ha informado de mutaciones activadoras en BRAF en una diversidad de neoplasias. Por ejemplo, se encuentran presentes mutaciones en BRAF hasta en 70% de los casos de melanoma humano. Una mutación de una sola base (T>A) en la posición nucleot�dica 1.799 en el cod�n 600 del ex�n 15 conduce a una sustitución de valina por glutamato (V600E), que se encuentra presente en más de 85% de los melanomas con una mutación en B-Raf (Davies et al., Nature 417: 949-954, 2002; Garnett y Marais, Cancer Cell 6: 313-319, 2004; Gray-Schopfer et al., Cancer Metastasis Rev. 24:165-183, 2005; Houben et al., 2004). Menos comúnmente, V600E resulta de la mutación de dos bases TG>AA en las posiciones nucleot�dicas 1799-1800 (Houben et al., J. Carcinog. 3:6, 2004).

Se conocen varios inhibidores de quinasa, incluyendo los que inhiben B-Raf. Entre dichos inhibidores se incluyen PLX4032, que inhibe selectivamente la actividad de quinasa de B-Raf V600E. La presente invención proporciona métodos de identificación de los pacientes positivos para V600E con el fin de seleccionar el tratamiento con un inhibidor de B-Raf quinasa, por ejemplo PLX4032.

Langland et al., 2006 ("Development of a companion diagnostic test for inhibitors of V600E BRAF", URL: http://aacrmeetingabstracts.org/cgi/content/abstract/2006/2/A13) da a conocer un método para determinar la sensibilidad de las células de cáncer a PLX4032 basándose en la detección de la mutación BRAFV600E mediante PCR TaqMan en tiempo real. Sin embargo, no se dan a conocer secuencias de ningún cebador o sonda específico.

DESCRIPCI�N RESUMIDA DE LA INVENCIÓN

La invención proporciona métodos y kits para la detección de pacientes que son candidatos al tratamiento con un inhibidor de B-Raf quinasa. De esta manera, en un aspecto, la invención proporciona un método para determinar la sensibilidad de las células de cáncer a un inhibidor de B-Raf, comprendiendo el método: (i) proporcionar una muestra de ácidos nucleicos procedentes de células de cáncer de un paciente que presenta un cáncer, (ii) amplificar una secuencia polinucle�tida diana en la muestra de ácidos nucleicos utilizando una pareja de cebadores que amplifica la secuencia polinucleot�dica diana, en la que la secuencia polinucleot�dica diana comprende un sitio mutado V600E, V600D o V600K en BRAF y se lleva a cabo la amplificación en presencia de una sonda oligonucle�tida marcada que comprende la secuencia indicada en SEC ID n� 1, en la que "n" es desoxiinosina, y detecta la presencia de una secuencia mutada en el sitio mutado V600E en BRAF, e (iii) detectar la presencia o ausencia de un sitio mutado V600E, V600D o V600K en BRAF, determinando de esta manera la sensibilidad del cáncer al inhibidor de B-Raf. En algunas realizaciones, la sonda presenta la secuencia de nucle�tidas indicada en SEC ID n� 1. La amplificación puede llevarse a cabo en presencia de una segunda sonda que detecta la presencia de una secuencia de tipo salvaje en el sitio de mutación V600E. En algunas realizaciones, la segunda sonda comprende por lo menos 15 nucleótidos de SEC ID n� 2. En algunas realizaciones, la segunda sonda presenta la secuencia de nucleótidos indicada en SEC ID n� 2. En determinadas realizaciones, la sonda puede marcarse con un marcaje fluorescente. La sonda puede marcarse además con dos marcajes, en la que uno de los marcajes es un pigmento fluorescente y el otro marcaje es una fracción inhibidora.

En algunas realizaciones, ambos cebadores de la pareja de cebadores utilizada en la reacción de amplificación se hibridan con el ex�n 15 de BRAF. En algunas realizaciones, uno de los cebadores de la pareja de cebadores utilizada en las reacciones de amplificación comprende por lo menos 15 nucleótidos contiguos de la secuencia de nucle�tidas indicada en SEC ID n� 3, por ejemplo uno de los cebadores en la pareja de cebadores puede presentar la secuencia de nucleótidos indicada en SEC ID n� 3. En realizaciones adicionales, uno de los cebadores en las parejas de cebadores comprende por lo menos 15 nucleótidos contiguos de la secuencia de nucleótidos indicada en SEC ID n� 4. Por ejemplo, el cebador puede presentar la secuencia de nucleótidos indicada en SEC ID n� 4. En realizaciones adicionales, la pareja de cebadores utilizada para la amplificación comprende cebadores que presentan las secuencias de nucleótidos indicadas en SEC ID n� 3 y SEC ID n� 4.

En algunas realizaciones, la etapa de amplificar la reacción comprende una RT-PCR.

El método puede utilizarse para detectar c�nceres que presentan una mutación en la posición amino�cida 600 de B-Raf, por ejemplo una mutación V600E. En algunas realizaciones el cáncer es melanoma. En otras realizaciones, el

c�ncer es cáncer de colon o cáncer de tiroides. En algunas realizaciones, la muestra de ácidos nucleicos utilizada en los métodos de la invención para detectar la mutación puede proceder de una biopsia de la piel. En otras realizaciones la muestra es de una biopsia de colon. La muestra también puede proceder de tejido incluido en parafina. El método de la invención puede comprender además el registro de un diagnóstico de que el paciente es sensible a un inhibidor de B-Raf, tal como un inhibidor de B-Raf específico de mutante, por ejemplo PLX4032.

En algunas realizaciones de la invención, el método comprende además la administración de un inhibidor de B-Raf en el paciente. El inhibidor de B-Raf puede ser un inhibidor de B-Raf específico de mutante, tal como PLX4032.

En otro aspecto, la invención proporciona un método para identificar un candidato para el tratamiento con PLX4032, comprendiendo el método: obtener una muestra de un sujeto y detectar una molécula biológica que comprende una mutación V600E en BRAF a partir de la muestra, identificando de esta manera el candidato para el tratamiento con PLX4032. En algunas realizaciones la molécula biológica es un ácido nucleico. En otras realizaciones la molécula biológica es un polip�ptido. El polip�ptido puede obtenerse, por ejemplo, de una muestra que comprende células de cáncer del paciente. En algunas realizaciones, el polip�ptido puede detectarse utilizando un inmunoensayo. El método puede comprender además la administración de PLX4032 en el sujeto.

En otro aspecto, la invención proporciona un kit para detectar un paciente que es un candidato para el tratamiento con un inhibidor de B-Raf, en el que el kit comprende una primera sonda específica de alelo, en el que la primera sonda resulta adecuada para detectar una mutación V600E, V600D o V600K en BRAF y comprende la secuencia indicada en SEC ID n� 1. En algunas realizaciones, la sonda presenta la secuencia de nucleótidos indicada en SEC ID n� 1. Un kit de la invención puede comprender además una segunda sonda específica de alelo, en el que la segunda sonda detecta la secuencia de BRAF de tipo salvaje y comprende por lo menos 15 nucleótidos contiguos de la secuencia de nucleótidos indicada en SEC ID n� 2. En algunas realizaciones la segunda sonda presenta la secuencia de nucleótidos indicada en SEC ID n� 2.

En realizaciones adicionales, un kit de la invención comprende además una pareja de cebadores que amplifica una región diana de BRAF que comprende un sitio de mutación V600E. Por ejemplo, la pareja de cebadores puede comprender un cebador que comprende por lo menos 15 nucleótidos contiguos de la secuencia de nucleótidos indicada en SEC ID n� 3. En determinado aspecto, el cebador presenta la secuencia de nucleótidos inidcada en SEC ID n� 3. En otras realizaciones, la pareja de cebadores puede comprender cebadores que comprenden por lo menos 15 nucleótidos contiguos de la secuencia de nucleótidos indicada en SEC ID n� 3 y SEC ID n� 4. En algunas realizaciones, la pareja de cebadores comprende cebadores que presentan las secuencias de nucleótidos indicadas en SEC ID n� 3 y SEC ID n� 4.

De esta manera, en algunas realizaciones, un kit de la invención puede comprender: una sonda que presenta la secuencia de nucleótidos indicada en SEC ID n� 1; una sonda que presenta la secuencia de nucleótidos indicada en SEC ID n� 2; un cebador que presenta la secuencia de nucleótidos indicada en SEC ID n� 3, y un cebador que presenta la secuencia de nucleótidos indicada en SEC ID n� 4.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La figura 1 muestra una alineación de un amplic�n B-Raf V600E (SEC ID n� 5) con una región correspondiente del cromosoma X (SEC ID n� 6). Los sitios de cebador de B-Raf V600E se muestran con flechas. El amplic�n incluye partes del ex�n 15 (mayúscula) y del intr�n 15 (minúscula). Las líneas verticales indican las posiciones de identidad entre las secuencias de BRAF y del cromosoma X. El cod�n 600 se muestra en una caja; GTG corresponde a valina (V). La región de unión a la sonda se subraya mediante sombreado; la sonda mutante (MU) es más larga que la sonda de tipo salvaje (WT), por dos nucleótidos (5'-CT en la región subrayada) y ambas sondas se unen al complemento de la secuencia mostrada.

La figura 2 muestra una alineación de una región del ex�n 15 de B-Raf circundante al cod�n 600 (flecha) (SEC ID n� 7) con regiones homólogas de A-Raf (SEC ID n� 8) y C-Raf (SEC ID n� 9). Los asteriscos marcan las diferencias de amino�cidos respecto a la secuencia de B-Raf (por ejemplo Mercer y Pritchard, Biochim. Biophys. Acta 1653:25-40, 2003).

La figura 3 muestra una alineación de un amplic�n de B-Raf V600E (SEC ID n� 15) con las secuencias correspondeintes de los genes ARAF (codifica A-Raf) (SEC ID n� 11) y RAF1 (codifica C-Raf) (SEC ID n� 10). Los nucleótidos en minúscula difieren de la secuencia de BRAF.

DESCRIPCI�N DETALLADA DE LA INVENCIÓN

Definiciones

En el contexto de la presente solicitud, "V600E" se refiere a una mutación en BRAF (T>A en la posición nucleot�dica 1799) que resulta en la sustitución de una glutamina por una valina en la posición amino�cida 600 de B-Raf. "V600E" también se conoce como "V599E" (1976T>A) bajo un sistema de numeración anterior (Kumar et al., Clin. Cancer Res. 9:3362-3368, 2003).

En el contexto de la presente invención, un "inhibidor de B-Raf quinasa" inhibe la actividad de una B-Raf quinasa. Dicho inhibidor puede inhibir además la actividad de otras quinasas, incluyendo otras raf quinasas.

Un "inhibidor de B-Raf quinasa específico de mutante" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a un inhibidor de B-Raf que presenta selectividad para un B-Raf mutante, tal como B-Raf que presenta una mutación en el residuo de valina en la posición amino�cida 600, por ejemplo una mutación V600E, en comparación con B-Raf de tipo salvaje. Dicho inhibidor es por lo menos dos veces, más frecuentemente por lo menos tres veces, o más potente que un inhibidor de B-Raf mutante, por ejemplo un B-Raf con una mutación V600E, en comparación con el tipo salvaje. Por ejemplo, en algunas realizaciones, un "inhibidor de B-Raf específico de mutante" puede presentar una IC50 para la actividad de inhibición de quinasa (ensayo bioquímico) de aproximadamente 30 nM para B-Raf V600E, mientras que la IC50 correspondiente para B-Raf de tipo salvaje es de aproximadamente 100 nM. La potencia puede compararse también en términos de valores de IC50 para los ensayos celulares, por ejemplo ensayos celulares que miden la inhibición del crecimiento. Un "inhibidor de B-Raf específico de mutante" en el contexto de la presente invención también puede inhibir quinasas diferentes de B-Raf, por ejemplo otras raf quinasas.

El término "hibridación" se refiere a la formación de una estructura de dúplex con dos ácidos nucleicos de cadena sencilla en virtud del apareamiento de bases complementarias. La hibridación puede producirse entre cadenas de ácidos nucleicos exactamente complementarias o entre cadenas de ácidos nucleicos que contienen regiones menores de desapareamiento. Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "sustancialmente complementarias" se refiere a secuencias que son complementarias excepto por regiones menores de desapareamiento. Típicamente, el número total de nucleótidos desapareados en una región hibridante no es superior a 3 nucleótidos para secuencias de una longitud aproximada de 15 nucleótidos. Las condiciones bajo las que se hibridan únicamente cadenas de ácidos nucleicos exactamente complementarias se denominan condiciones de hibridación "restrictivas" o "específicas de secuencia". Los dúplex estables de ácidos nucleicos sustancialmente complementarios pueden conseguirse bajo condiciones de hibridación menos restrictivas. El experto en la materia de la tecnología de ácidos nucleicos podr� determinar la estabilidad de los dúplex empíricamente mediante la consideración de varias variables, incluyendo, por ejemplo, la longitud y concentración de pares de bases de los oligonucle�tidos, la fuerza iónica y la incidencia de pares de bases desapareados. Por ejemplo, el software inform�tico para calcular la estabilidad de los dúplex se encuentra disponible comercialmente de National Biosciences, Inc. (Plymouth, Minn.), por ejemplo OLIGO, versión 5, o de DNA Software (Ann Arbor, Michigan), por ejemplo Visual OMP 6.

Las condiciones de hibridación específicas de secuencia restrictivas, bajo las que un oligonucle�tido se hibridar� únicamente con la secuencia diana exactamente complementaria, son bien conocidas de la técnica (ver, por ejemplo, las referencias generales proporcionadas en la sección sobre detección de polimorfismos en secuencias de ácidos nucleicos). Las condiciones restrictivas son dependientes de la secuencia y ser�n diferentes en circunstancias diferentes. Generalmente, las condiciones restrictivas se selecciona que sean aproximadamente 5�C inferiores al punto de fusión térmica (Tm) de la secuencia específica a una fuerza iónica y pH definidos. La Tm es la temperatura (bajo una fuerza iónica y pH definidos) a la que el 50% de los pares de bases se han disociado. La relajación de la astringencia de las condiciones de hibridación permite la existencia de tolerancia de los desapareamientos de secuencia; el grado de desapareamiento tolerado puede controlarse mediante un ajuste adecuado de las condiciones de hibridación.

El término "cebador" se refiere a un oligonucl�otido que actúa como punto de inicio de la síntesis de ADN bajo condiciones en las que se induce la síntesis de un producto de extensión de cebador complementario a una cadena de ácido nucleico, es decir, en presencia de cuatro nucle�sido trifosfato diferentes y un agente para la polimerizaci�n (es decir, ADN polimerasa o transcriptasa inversa) en un tampón apropiado y a una temperatura adecuada. Un cebador es preferentemente un oligodesoxirribonucle�tido de cadena sencilla. El cebador incluye una "región hibridante" exacta o sustancialmente complementaria a la secuencia diana, preferentemente de una longitud de entre aproximadamente 15 y aproximadamente 35 nucleótidos. Un oligonucle�tido cebador puede consistir enteramente de la región hibridante o puede contener elementos adicionales que permitan la detección, inmovilización o manipulación del producto amplificado, pero que no alteren la capacidad del cebador de servir como reactivo de partida para la síntesis de ADN. Por ejemplo, puede incluirse una cola de secuencia de ácidos nucleicos en el extremo 5' del cebador que se hibride con un oligonucle�tido de captura.

Un cebador "específico de alelo", tal como se utiliza en la presente memoria, es un cebador que se hibrida con una secuencia diana de manera que el extremo 3', habitualmente el nucleótido 3', del cebador se alinee con un sitio de interés, por ejemplo el nucleótido 1799, que es la segunda posición dentro del cod�n 600 de BRAF, y es exactamente complementario al alelo de tipo salvaje o alelo mutante en la posición de interés. Tal como se utiliza en la presente memoria, el cebador es "específico para" el alelo respecto al que es exactamente complementario en el extremo 3', por ejemplo en el nucleótido 3' � penúltimo nucleótido. En general, la extensión del cebador resulta inhibida en el caso de que exista un desapareamiento en el extremo 3' del cebador. Un cebador específico de alelo, al hibridarse con el alelo exactamente complementario, es extensible con una eficiencia mayor. El mismo cebador, al hibridarse con el otro alelo, no es tan fácilmente extensible debido al desapareamiento en el extremo 3', por ejemplo el nucleótido 3' � penúltimo nucleótido en el extremo 3', del cebador en el dúplex de hibridación. De esta manera, la utilización de un cebador específico de alelo proporciona discriminación al�lica basada en la formación diferencial de un producto de extensión.

El término "sonda" se refiere a un oligonucle�tido que se hibrida selectivamente con un ácido nucleico diana bajo condiciones adecuadas.

Una sonda "específica de alelo" contiene una "región hibridante" exacta o sustancialmente complementaria a la secuencia diana, y es exactamente complementaria a la secuencia diana en el sitio de interés, por ejemplo el nucleótido 1.799 en el cod�n 600 de BRAF. De esta manera, por ejemplo, una sonda específica del alelo V600E detecta selectivamente una secuencia de mutación V600E, mientras que una sonda específica de alelo de BRAF de tipo salvaje detecta selectivamente la secuencia de tipo salvaje. Un ensayo de hibridación realizado utilizando la sonda bajo condiciones de hibridación suficientemente restrictivas permite la detección selectiva de una secuencia diana específica que comprende el sitio de interés. La región que se hibrida con la sonda preferentemente presenta una longitud de entre aproximadamente 10 y aproximadamente 35 nucleótidos, más preferentemente presenta una longitud de entre aproximadamente 15 y aproximadamente 35 nucleótidos. La utilización de bases modificadas o análogos de bases que afectan a la estabilidad de la hibridación, los cuales son bien conocidos de la técnica, puede permitir la utilización de sondas más cortas o más largas con una estabilidad comparable. Un oligonucle�tido sonda puede consistir enteramente de la región hibridante o puede contener elementos adicionales que permitan la detección o la inmovilización de la sonda, pero que no alteren significativamente las características de hibridación de la región hibridante.

La expresión "secuencia diana" o "región diana" se refiere a una región de un ácido nucleico que debe analizarse y que comprende el sitio polim�rfico de interés.

Tal como se utiliza en la presente memoria, las expresiones "ácido nucleico", "polinucle�tido" y "oligonucle�tido" se refieren a cebadores, sondas y fragmentos olig�meros. Las expresiones no se encuentran limitadas por la longitud y son genéricas de pol�meros ineales de polidesoxirribonucle�tidos (que continenen 2-desoxi-D-ribosa), polirribonucle�tidos (que contienen D-ribosa) y cualquier otro N-gluc�sido de una base purina o pirimidina, o de bases purina o pirimidina modificadas. Entre dichas expresiones se incluyen el ADN de doble cadena y de cadena sencilla, as� como el ARN de doble cadena y de cadena sencilla. Los oligonucle�tidos de la invención pueden utilizarse como cebadores y/o sondas.

Un ácido nucleico, polinucle�tido u oligonucle�tido puede comprender enlaces fosfodi�ster o enlaces modificados, incluyendo, aunque sin limitarse a ellos, enlaces fosfotri�ster, fosforamidato, siloxano, carbonato, carboximetil-éster, acetamidato, carbamato, tio�ter, fosforamidato como puente, metil�n-fosfonato como puente, fosforotioato, metilfosfonato, fosfoditioato, fosforotioato como puente, o sulfona, y combinaciones de dichos enlaces.

Un ácido nucleico, polinucle�tido u oligonucle�tido puede comprender las cinco bases biológicas (adenina, guanina, timina, citosina y uracilo) y/o bases diferentes de las cinco bases biológicas. Estas bases pueden servir a varios propósitos, por ejemplo a la estabilidad o desestabilizaci�n de la hibridación; a la estimulaci�n o inhibición de la degradación de sondas; o como puntos de unión para fracciones detectables o fracciones inhibidoras. Por ejemplo, un polinucle�tido de la invención puede contneer una o más fracciones de bases modificadas, no estándares o derivatizadas, incluyendo, aunque sin limitarse a ellas, N6-metil-adenina, N6-terc-butil-bencil-adenina, imidazol, imidazoles sustituidos, 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5-clorouracilo, 5-yodouracilo, hipoxantina, xantina, 4acetilcitosina, 5-(carboxihidroximetil)uracilo, 5-carboximetilaminometil-2-tiouridina, 5-carboximetilaminometil-uracilo, dihidrouracilo, beta-D-galactosil-queosina, inosina, N6-isopentenil-adenina, 1-metil-guanina, 1-metil-inosina, 2,2dimetilguanina, 2-metil-adenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina, 5-metil-citosina, N6-metil-adenina, 7-metil-guanina, 5-metilaminometil-uracilo, 5-metoxiaminometil-2-tiouracilo, beta-D-manosilcuosina, 5'-metoxicarboximetil-uracilo, 5metoxi-uracilo, 2-metiltio-N6-isopentenil-adenina, ácido uracil-5-oxiac�tico (v), wibutoxosina, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2-tiouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-metil-uracilo, metil-éster de ácido uracil-5oxiac�tico, 3-(3-amino-3-N-2-carboxipropil)uracilo, (acp3)w,2,6-di-aminopurina y 5-propinil-pirimidina. Pueden

encontrarse otros ejemplos de fracciones de bases modificadas, no estándares o derivatizadas en las patentes US n� 6.001.611, 5.955.589, 5.844.106, 5.789.562, 5.750.343, 5.728.525 y 5.679.785.

Adem�s, un ácido nucleico, polinucle�tido u oligonucle�tido puede comprender una o más fracciones sac�ridas modificadas, incluyendo, aunque sin limitarse a ellas, arabinosa, 2-fluoro-arabinosa, xilulosa y una hexosa.

Introducci�n

La invención proporciona un ensayo diagnóstico de V600E para la utilización en la selección de pacientes de cáncer, por ejemplo pacientes de cáncer de melanoma, pacientes de cáncer de colon, pacientes de cáncer del tiroides y pacientes con c�nceres ováricos serosos de grado bajo, los cuales son candidatos para el tratamiento con un inhibidor de B-Raf, tal como un inhibidor de B-Raf mutante selectivo, por ejemplo PLX4032. De esta manera, el ensayo diagnóstico puede utilizarse para clasificar los pacientes según su probabilidad de responder al tratamiento con PLX4032.

T�picamente, la mutación V600E (también conocida como V599E (1796T>A)) se detecta utilizando un método que comprende determinar la presencia de una mutación de una sola base (T>A) en la posición nucleot�dica 1.799 en el cod�n 600 del ex�n 15. Esta mutación también puede resultar de la mutación de dos bases TG>AA en las posiciones nucleot�dicas 1.799-1.800. La mutación de dos bases también puede detectarse mediante la evaluación de la posición 1.799. En algunas realizaciones también puede evaluarse un ácido nucleico para la presencia de una sustitución en la posición 1.800.

Otras mutaciones también pueden presentarse en el cod�n 600. Entre ellas se incluyen V600K, V600D y V600R. En algunas realizaciones, una sonda que detecta una mutación V600E también puede detectar otras mutaciones del cod�n 600, por ejemplo V600D, V600K y/o V600R. En algunas realizaciones, una sonda también puede detectar una mutación en el cod�n 601.

La presencia de una mutación V600E típicamente se determina mediante la evaluación del ácido nucleico, por ejemplo ADN gen�mico o ARNm, para la presencia de una sustitución de base en la posición 1.799. Se encuentra disponible una amplia diversidad de ensayos. En algunas realizaciones el ensayo es un ensayo de nucleasa 5'.

V600E también puede detectarse mediante la detección de la presencia de un B-Raf V600E mutante, por ejemplo utilizando un inmunoensayo.

La presencia de V600E indica que el paciente es un candidato para el tratamiento de un inhibidor de B-Raf, tal como un inhibidor de B-Raf específico de mutante. Por lo tanto, la invención comprende además un método en el que un paciente que se ha determinado que presenta una mutación V600E es tratado con un inhibidor de B-Raf, tal como un inhibidor de B-Raf específico de mutante, por ejemplo PLX4032.

Las muestras biológicas

La mutación V600E puede detectarse en diversos tipos de cáncer, incluyendo el melanoma, el cáncer colorrectal, el cáncer de tiroides, por ejemplo el cáncer de tiroides papilar, y el cáncer ovárico, por ejemplo el carcinoma seroso de grado bajo. En algunas realizaciones, las mutaciones V600E se detectan en cáncer de pulmón, gliomas, cáncer de pr�stata, cáncer de mama, sarcoma, cáncer de hígado, cáncer de pituitaria y c�nceres que se producen en el intestino grueso, tracto biliar, ojo, páncreas, estómago, sistema nervioso central, y tejido hematopoy�tico y linfoide.

Se detecta una mutación V600E en una muestra biológica de un paciente. La muestra biológica típicamente comprende una célula de cáncer. Por ejemplo, la muestra puede ser una biopsia tumoral, por ejemplo de un neoplasma melanoc�tico maligno, un tumor colorrectal o un tumor de tiroides, o de una muestra de tejido de un sitio metast�sico. En otras realizaciones, la muestra biológica puede ser sangre u otro líquido, en el que el líquido comprende una célula de cáncer. En otras realizaciones, la muestra biológica puede comprender ácidos nucleicos circulantes (sin células).

La mutación con frecuencia se detecta en ácidos nucleicos que se obtienen de la muestra biológica. El ácido nucleico que se evalúa para la presencia de una mutación puede ser ARN o ADN. En algunas realizaciones la mutación se detecta en ADN gen�mico.

Puede obtenerse una muestra biológica utilizando cualquiera de entre varios métodos de la técnica. Además, puede tratarse una muestra biológica con un fijador, tal como formaldeh�do, e incluirse en parafina y cortarse para la utilización. Alternativamente puede utilizarse tejido fresco o congelado. En otras realizaciones pueden utilizarse aspirados con aguja fina.

Detecci�n de una mutación V600E en una secuencia de ácidos nucleicos

Las técnicas de detección para evaluar los ácidos nucleicos para la presencia de una mutación V600E implican procedimientos bien conocidos en el campo de la genética molecular. Además, muchos de los métodos implican la amplificación de ácidos nucleicos. Se proporcionan en la técnica guías extensas para la realización de dichos procedimientos. Entre las referencias ejemplares se incluyen manuales tales como PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification (ed. H. A. Erlich, Freeman Press, NY, N.Y., 1992); PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (editores: Innis et al., Academic Press, San Diego, Calif., 1990); Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, 1994-1999, incluyendo las actualizaciones mediante suplementos hasta abril de 2004; Sambrook & Russell, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3a ed., 2001).

Aunque los métodos típicamente utilizan etapas de PCR, también pueden utilizarse otros protocolos de amplificación. Entre los métodos de amplificación adecuados se incluyen la reacción en cadena de la ligasa (ver, por ejemplo, Wu y Wallace, Genomics 4:560-569, 1988), el ensayo de desplazamiento de cadena (ver, por ejemplo, Walker et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:392-396, 1992; patente US n� 5.455.166) y varios sistemas de amplificación basados en la transcripción, incluyendo los métodos descritos en las patentes US n� 5.437.990,

5.409.818 y 5.399.491; el sistema de amplificación mediada por transcripción (SAT) (Kwoh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173-1177, 1989); y la replicaci�n de secuencias autosostenida (3SR) (Guatelli et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874-1878, 1990; documento n� WO 92/08800). Alternativamente, pueden utilizarse métodos que amplifican la sonda hasta niveles detectables, tales como la amplificación de Q-replicasa (Framer y Lizardi, Nature 339:401-402, 1989; Lomeli et al., Clin. Chem. 35:1826-1831, 1989). Se proporciona una revisión de los métodos de amplificación conocidos en, por ejemplo, Abramson y Myers, Current Opinion in Biotechnology 4:41-47, 1993. Típicamente, la detección de V600E se lleva a cabo mediante la evaluación de los ácidos nucleicos procedentes del paciente en un ensayo que comprende cebadores y/o sondas oligonucle�tidas. Los oligonucle�tidos pueden prepararse mediante cualquier método adecuado, habitualmente síntesis química. Los oligonucle�tidos pueden sintetizarse utilizando reactivos e instrumentos disponibles comercialmente. Alternativamente, pueden obtenerse de fuentes comerciales. Los métodos de síntesis de los oligonucle�tidos son bien conocidos de la técnica (ver, por ejemplo, Narang et al., Meth. Enzymol. 68:90-99, 1979; Brown et al., Meth. Enzymol. 68:109-151, 1979; Beaucage et al., Tetrahedron Lett. 22:1859-1862, 1981; y el método en soporte sólido de la patente US n� 4.458.066). Además, pueden utilizarse modificaciones de los métodos de síntesis anteriormente indicados a fin de modificar deseablemente el comportamiento enzim�tico con respecto a los oligonucle�tidos sintetizados. Por ejemplo, la incorporación de enlaces fosfodi�ster modificados (por ejemplo fosforotioato, metilfosfonatos, fosfoamidato o boranofosfato) o enlaces diferentes de un derivado de ácido fosforoso en un oligonucle�tido puede utilizarse para evitar el corte en un sitio seleccionado. Además, la utilización de azúcares modificados con 2'-amino tiende a favorecer el desplazamiento sobre la digestión del oligonucle�tido al hibridarse con un ácido nucleico que también es el molde para la síntesis de una nueva cadena de ácidos nucleicos.

La mayoría de ensayos para detectar una mutación V600E al nivel de los ácidos nucleicos comporta uno de entre varios protocolos generales: hibridación utilizando oligonucle�tidos específicos de alelo, extensión de cebadores, ligación específica de alelo, secuenciaci�n o técnicas de separación electrofor�tica, por ejemplo polimorfismo de conformación de cadena sencilla (PCCS) y análisis de heterod�plex. Entre los ensayos ejemplares se incluyen los ensayos de 5' nucleasa, la incorporación de pigmento terminador dirigida por el molde, ensayos de oligonucle�tidos específicos de alelo de baliza molecular, ensayos de extensión de bases únicas y análisis de mutaciones utilizando la secuenciaci�n de pirofosfato en tiempo real. El análisis de las secuencias amplificadas puede llevarse a cabo utilizando diversas tecnologías, tales como microchips, ensayos de polarización de fluorescencia y la espectrometr�a de masas con desorci�n/ionizaci�n mediante láser asistida por matriz (MALDI). Dos métodos adicionales que pueden utilizarse son ensayos basados en el corte invasivo con nucleasas Flap y metodolog�as que utilizan sondas candado.

La determinación de la presencia o ausencia de un alelo V600E se lleva a cabo generalmente mediante el análisis de una muestra de ácidos nucleicos que se obtienen de una muestra biológica que comprende células de cáncer de un paciente que debe analizarse. Con frecuencia, la muestra de ácidos nucleicos comprende ADN gen�mico. El ADN gen�mico típicamente se obtiene de muestras tumorales, aunque también puede obtenerse de otras células o tejidos, por ejemplo de un sitio metast�sico o de la sangre.

La muestra de ácidos nucleicos que debe analizarse también puede ser ARN. Por ejemplo, puede analizarse el ARNm de una muestra biológica con el fin de determinar la presencia o la ausencia de una mutación V600E. La muestra de ácidos nucleicos se obtiene de células en las que se expresa el ácido nucleico diana, por ejemplo un tumor primario o tejido de un sitio metast�sico. Dicho análisis puede llevarse a cabo en primer realizando una transcripción inversa del ARN diana utilizando, por ejemplo, una transcriptasa inversa v�rica, y después amplificando el ADNc resultante, o utilizando una reacción de transcripción inversa-polimerasa (RT-PCR) a alta temperatura, tal como se indica en las patentes US n� 5.310.652, n� 5.322.770, n� 5.561.058, n� 5.641.864 y n� 5.693.517.

Se describen brevemente metodolog�as utilizadas frecuentemente para el análisis de muestras de ácidos nucleicos para detectar sustituciones de nucleótidos. Sin embargo, puede utilizarse cualquier método conocido de la técnica en la invención con el fin de detectar la presencia de sustituciones de nucleótidos.

Sondas específicas de alelo

La hibridación específica de alelo se basa en distinguir entre dos moléculas de ADN que difieren en por lo menos una base mediante la hibridación de un oligonucle�tido que es específico para una de las secuencias variantes con un producto amplificado obtenido de la amplificación de la muestra de ácidos nucleicos. Un ensayo específico de alelo puede comprender además dos oligonucle�tidos específicos de alelo, por ejemplo una sonda específica de alelo para la primera variante y una sonda específica de alelo para la segunda variante, en las que las sondas se hibridan diferencialmente a una variante frente a la otra. La hibridación específica de alelo típicamente utiliza oligonucle�tidos cortos, por ejemplo de una longitud de entre 15 y 35 nucleótidos. Los principios y guías para diseñar dicha sonda se encuentran disponibles en la técnica, por ejemplo en las referencias citadas en la presente memoria. Las condiciones de hibridación deberían ser suficientemente restrictivas para que exista una diferencia significativa de intensidad de hibridación entre alelos, y preferentemente una respuesta esencialmente binaria, en la que una sonda se hibrida con únicamente uno de los alelos. Algunas sondas se diseñan para hibridarse con un segmento de ADN diana de manera que el sitio de interés, que es la posición nucleot�dica 1.799 en el cod�n 600 del ex�n 15 de BRAF, se alinea con una posición central (por ejemplo en un oligonucle�tido de 15 bases en la posición 7, en un oligonucle�tido de base 16 en la posición 8 � 9) de la sonda, aunque este diseño no resulta necesario.

La cantidad y/o presencia de un alelo se determina mediante la medición de la cantidad de sonda específica de alelo que se hibrida con la muestra. Típicamente, el oligonucle�tido se marca con un marcaje tal como un marcaje fluorescente. Por ejemplo, una sonda específica de alelo que es específica para una sustitución de nucleótido V600E se hibrida con ácidos nucleicos obtenidos de una muestra biológica bajo condiciones de hibridación que resultan en la hibridación preferente con un alelo. La intensidad de fluorescencia se mide para determinar si se ha hibridado un oligonucle�tido específico.

En una realización de la exposición, el nucleótido presente en la posición V600E se identifica mediante hibridación bajo condiciones de hibridación específicas de secuencia con una sonda oligonucle�tida exactamente complementaria a la secuencia mutante (o de tipo salvaje) de BRAF que comprende el sitio mutante V600E. La secuencia hibridante de sonda y las condiciones de hibridación específicas de secuencia se seleccionan de manera que un único desapareamiento en el sitio de la mutación desestabiliza el dúplex de hibridación suficientemente para que no se forme eficazmente. De esta manera, bajo condiciones de hibridación específicas de secuencia, sólo se formarán dúplex estables entre la sonda y la secuencia al�lica exactamente complementaria. De esta manera, los oligonucle�tidos de una longitud de entre aproximadamente 10 y aproximadamente 35 nucleótidos, preferentemente de entre aproximadamente 15 y aproximadamente 35 nucleótidos, que son exactamente complementarios a una secuencia al�lica en una región que comprende el sitio de mutación se encuentran comprendidos dentro del alcance de la invención.

En una realización alternativa de la invención, el nucleótido presente en el sitio de mutación se identifica mediante hibridación bajo condiciones de hibridación suficientemente restrictivas con un oligonucle�tido sustancialmente complementario al alelo mutante o de tipo salvaje en una región que comprende el sitio de mutación y exactamente complementario al alelo en el sitio de mutación. Debido a los desapareamientos que se producen en los sitios que no se encuentran mutados, existen desapareamientos en ambas secuencias al�licas, la diferencia en el número de desapareamientos en un dúplex formado con la secuencia al�lica diana y en un dúplex formado con la secuencia al�lica no diana correspondiente es la misma que cuando se utiliza un oligonucle�tido exactamente complementario a la secuencia del alelo diana. En esta realización, se relajan suficientemente las condiciones de hibridación para permitir la formación de dúplex estables con la secuencia diana, manteniendo simultáneamente una astringencia suficiente para impedir la formación de dúplex estables con secuencias no diana. Bajo estas condiciones de hibridación suficientemente específicas, sólo se formarán dúplex estables entre la sonda y la secuencia al�lica diana. De esta manera, los oligonucle�tidos de una longitud de entre aproximadamente 10 y aproximadamente 35 nucleótidos, preferentemente de entre aproximadamente 15 y aproximadamente 35 nucleótidos, que son sustancialmente complementarios a una secuencia al�lica en una región que comprende el sitio de mutación y son exactamente complementarios a la secuencia al�lica en el sitio de mutación se encuentran comprendidos dentro del alcance de la invención.

La utilización de oligonucle�tidos sustancialmente, y no exactamente, complementarios puede resultar deseable en formatos de ensayos en los que la optimización de las condiciones de hibridación se encuentra limitada. Por ejemplo, en un formato de ensayo de sonda inmovilizada multi-diana, las sondas para cada diana se inmovilizan sobre un único soporte sólido. Las hibridaciones se llevan a cabo simultáneamente mediante la puesta en contacto con el soporte sólido de una solución que contiene el ADN diana. Debido a que todas las hibridaciones se llevan a cabo bajo condiciones idénticas, las condiciones de hibridación no pueden optimizarse separadamente para cada

sonda. La incorporación de desapareamientos en una sonda puede utilizarse para ajustar la estabilidad de los dúplex en el caso de que el formato de ensayo impide ajustar las condiciones de hibridación. El efecto de un desapareamiento introducido particular sobre la estabilidad de los dúplex es bien conocido y la estabilidad de los dúplex puede determinarse rutinariamente tanto mediante estimación como empíricamente, tal como se ha indicado anteriormente. Pueden seleccionarse condiciones de hibridación adecuadas, que dependen del tamaño exacto y la secuencia de la sonda, de manera empírica utilizando la guía proporcionada en la presente memoria y bien conocida de la técnica. La utilización de sondas oligonucle�tidas para detectar diferencias de pares de bases únicas en la secuencia se describe en, por ejemplo, Conner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:278-282, 1983, y en las patentes US n� 5.468.613 y n� 5.604.099.

El cambio proporcional de estabilidad entre un dúplex de hibridación perfectamente apareado y con un desapareamiento de una única base depende de la longitud de los oligonucle�tidos hibridados. Los dúplex formados con secuencias de sondas más cortas se desestabilizan proporcionalmente más por la presencia de un desapareamiento. En la práctica, resultan preferentes para la detección específica de secuencia los oligonucle�tidos de una longitud comprendida entre aproximadamente 15 y aproximadamente 35 nucleótidos. Además, debido a que los extremos de un oligonucle�tido hibridado experimentan una disociaci�n aleatoria y rehibridaci�n continuas debido a la energía térmica, un desapareamiento en cualquiera de los extremos desestabiliza el dúplex de hibridación en menor medida que un desapareamiento interno. Preferentemente, para la discriminación de un único cambio de par de bases en la secuencia diana, se selecciona la secuencia de la sonda que se hibrida con la secuencia diana de manera que el sitio de la mutación se produce en la región interior de la sonda.

Los criterios anteriormente indicados para seleccionar una secuencia de sonda que se hibrida con BRAF se aplican a la región hibridante de la sonda, es decir, aquella parte de la sonda que participa en la hibridación con la secuencia diana. Puede unirse una sonda a una secuencia de ácidos nucleicos adicional, tal como una cola poli-T utilizada para inmovilizar la sonda, sin alterar significativamente las características de hibridación de la sonda. El experto en la materia reconocer� que para la utilización en los presentes métodos, una sonda unida a una secuencia de ácidos nucleicos adicional que no sea complementaria a la secuencia diana y que, de esta manera, no participe en la hibridación, es esencialmente equivalente a una sonda no unida.

Ensayo de 5'-nucleasa

En algunas realizaciones, las muestras de ácidos nucleicos se evalúan para la presencia de una mutación V600E utilizando un ensayo "TaqMan�" o "ensayo de 5'-nucleasa", tal como se indica en las patentes US n� 5.210.015, n�

5.487.972 y n� 5.804.375, y en Holland et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7276-7280, 1988. En el ensayo TaqMan�, las sondas de detección marcadas que se hibridan dentro de la región amplificada se encuentran presentes durante la reacción de amplificación. Las sondas se modifican de manera que eviten que las sondas actúen como cebadores para la síntesis de ADN. La amplificación se lleva a cabo utilizando una ADN polimerasa con actividad de exonucleasa 5' a 3'. Durante cada etapa de síntesis de la amplificación, cualquier sonda que se hibride con el ácido nucleico diana posteriormente al cebador que se est� extendiendo resulta degradado por la actividad de exonucleasa 5' a 3' de la ADN polimerasa. De esta manera, la síntesis de una nueva cadena diana también resulta en la degradación de una sonda y la acumulación de producto de degradación proporciona una medida de la síntesis de las secuencias diana.

La sonda de hibridación utilizada en el ensayo puede ser una sonda específica de alelo que discrimine entre los alelos mutantes y de tipo salvaje de BRAF en el sitio de mutación V600E. Alternativamente, el método puede llevarse a cabo utilizando un cebador específico de alelo y una sonda marcada que se una al producto amplificado.

Puede utilizarse cualquier método adecuado para la detección de producto de degradación en un ensayo de 5'nucleasa. Con frecuencia, la sonda de detección se marca con dos pigmentos fluorescentes, uno de los cuales es capaz de inhibir la fluorescencia del otro pigmento. Los pigmentos se unen a la sonda, preferentemente uno unido al extremo 5'-terminal y el otro se une a un sitio interno, de manera que la inhibición se produce cuando la sonda se encuentra en un estado no hibridado y de manera que el corte de la sonda por la actividad de exonucleasa 5' a 3' de la ADN polimerasa se produce entre los dos pigmentos. La amplificación resulta en el corte de la sonda entre los pigmentos con una eliminación concomitante de la inhibición y un incremento de la fluorescencia observable a partir del pigmento inicialmente inhibido. Se realiza un seguimiento de la acumulación de producto de degradación mediante la medición del incremento de la fluorescencia de la reacción. Las patentes US n� 5.491.063 y n�

5.571.673 describen métodos alternativos para detectar la degradación de la sonda que se produce concomitantemente con la amplificación.

En una realización, un ensayo de 5'-nucleasa para evaluar las muestras de paciente para la presencia de la mutación V600E en BRAF puede llevarse a cabo utilizando los cebadores siguientes, o secuencias que son sustancialmente idénticas a los cebadores:

TTS068-BRAF_F1: 5’ CCTCACAGTAAAAATAGGTGATTTTGGTCTE 3’ (E= t-butil-bencil-dA) (SEC ID n� 25)

RL_BRAF_R5: 5’TAGCCTCAATTCTTACCATCCACAAAA 3’ (SEC ID n� 4).

Entre las secuencias que son sustancialmente idénticas a las secuencias de cebador se incluyen aquéllas que se hibridan con la misma secuencia complementaria. De esta manera, en algunas realizaciones, las secuencias de cebador para la utilización en la invención comprenden por lo menos 15 nucleótidos contiguos, en ocasiones por lo menos 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 � 26 nucleótidos contiguos de TTS068-BRAF_F1 � RL_BRAF_R5. En algunas realizaciones, un cebador presenta por lo menos 27, 28, 29 � 30 nucleótidos contiguos de TTS068-BRAF_F1. En otras realizaciones, los cebadores para la utilización en la invención presentan una identidad de por lo menos 80%; en algunas realizaciones, una identidad de por lo menos 85%, y en otras realizaciones, una identidad de por lo menos 90% o superior respecto a TTS068-BRAF_F1 � RL_BRAF_R5. En algunas realizaciones, el cebador directo es TTS068-BRAF-F1 y el cebador inverso es un cebador que permite la discriminación del pseudog�n del cromosoma X, pero que no se solapa con RL_BRAF_R5 � que presenta un solapamiento de menos de 10 pares de bases con RL_BRAF_R5. En algunas realizaciones, el cebador inverso puede unirse a un sitio que incluye 20 nucleótidos o menos después del sitio de unión para RL_BRAF_R5. Por ejemplo, también pueden utilizarse cebadores inversos de las secuencias siguientes:

5’ A AAT AGC CTC AAT TCT TAC CAT CCA CAA AA 3’ (SEC ID n� 12) 5’ TAG CCT CAA TTC TTA CCA TCC ACA AAA 3’ (SEC ID n� 13) 5’ TAG CCT CAA TTC TTA CCA TCC ACA AAE 3’ (SEC ID n� 1) 5’ AGG GCC AAA AAT TTA ATC AGT GGA AAA A 3’ (SEC ID n� 15) 5’ CAG TGG AAA AAT AGC CTC AAT TCT TAC CA 3’ (SEC ID n� 16)

En algunas realizaciones, el cebador directo puede unirse a un sitio que incluye 20 bases situadas antes del sitio de unión de BRAF-F1. En algunas realizaciones, el cebador directo puede ser:

5’ TTTCTTCATGAAGACCTCACAGTAAAAATE 3’ (SEC ID n� 17), o

5’ ATATATTTCTTCATGAAGACCTCACAGTAAE 3’ (SEC ID n� 18).

Tambi�n puede detectarse una mutación V600E en el caso de que el molde inicial sea ARN. Dicho ensayo puede comprender un cebador inverso, por ejemplo un cebador que comprende una secuencia:

5’ ATG ACT TCT GGT GCC ATC CAC AA 3’ (SEC ID n� 19).

Entre otros cebadores inversos que pueden utilizarse se incluyen:

5’ AAA AAT AGC CTC AAT TCT TAC CAT CCA CAA AA 3’ (SEC ID n� 20),

5’ GCC ATC CAC AAA ATG GAT CCA GAC A3’ (SEC ID n� 21), o

5’ CAA AAT GGA TCC AGA CAA CTG TTC AAA 3’ (SEC ID n� 22).

En una realización de la invención, se lleva a cabo un ensayo de 5'-nucleasa utilizando una o las dos sondas específicas de alelo siguientes, que detectar una secuencia mutante (TTS 155-BRAF_MU) o de tipo salvaje (TTS148-BRAF_WTs):

TTS155-BRAF_MU 5’ QCTACAIAIFAAATCTCGATGGAGTGGGTCCCAP 3’ (SEC ID n� 23) TTS 148-BRAF_WT 5’ QACAITGEAAATCTCGATGGAGTGGGTCCCAP 3’ (SEC ID n� 24) (E = pigmento informador HEX, F= pigmento informador FAM, I = dexoxiinosina, Q = pigmento inhibidor BHQ2, P= 3’-fosfato). El pigmento (F o E) se inserta entre dI y dA (TTS155-BRAF_MU) o entre dG y dA (TTS148- BRAF_WT).

Tal como se entiende en la técnica, una sonda TTS155-BRAF_MU � TTS148-BRAF_WT también puede incluir modificaciones, por ejemplo el pigmento fluorescente particular, el inhibidor y/o las posiciones del pigmento, que son diferentes de las ilustradas anteriormente.

En algunas realizaciones, la sonda que detecta V600E, por ejemplo TTS155-BRAF_MU, también detecta V600D (1799_1800TG>AT) y V600K (1798_1799GT>AA). En algunas realizaciones, una sonda que detecta una mutación V600E también detecta K601E (1801A>G) y V600R (1798_1799GT>AG).

En algunas realizaciones de la invención, puede utilizarse una secuencia sustancialmente idéntica a una secuencia de sonda. Entre las secuencias que son sustancialmente idénticas a las secuencias de sonda se incluyen aquéllas que se hibridan con la misma secuencia complementaria que la sonda. De esta manera, en algunas realizaciones, las secuencias de sonda para la utilización en la invención comprenden por lo menos 15 nucleótidos contiguos, en ocasiones por lo menos 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 � 30 nucleótidos contiguos de TTS 155

BRAF_MU � TTS 148-BRAF_WT. En algunas realizaciones, un cebador presenta por lo menos 27, 28, 29 � 30 nucleótidos contiguos de TTS 155-BRAF_MU � TTS 148-BRAF_WT. En otras realizaciones, los cebadores para la utilización en la invención presentan una identidad de por lo menos 80%; en algunas realizaciones presentan una identidad de por lo menos 85% y en otras realizaciones, presentan una identidad de por lo menos 90% o superior a TTS155-BRAF_MU � TTS 148-BRAF_WT.

Un ensayo de 5'-nucleasa para la detección de una mutación V600E en BRAF puede utilizar cualquier polimerasa que presente una actividad de exonucleasa 5' a 3'. De esta manera, en algunas realizaciones, las polimerasas con actividad de 5'-nucleasa son polimerasas de ácidos nucleicos termoestables y termoactivas. Entre dichas polimerasas termoestables se incluyen, aunque sin limitarse a ellas, formas nativas y recombinantes de polimerasas de una diversidad de especies de los géneros eubacterianos Thermus, Thermatoga y Thermosipho, as� como formas quiméricas de los mismos. Por ejemplo, entre las polimerasas de especies de Thermus que pueden utilizarse en los métodos de la invención se incluyen la ADN polimerasa de Thermus aquaticus (Taq), la ADN polimerasa de Thermus thermophilus (Tth), la ADN polimerasa de Thermus especie Z05 (Z05), Thermus especie sps17 (sps17) y Thermus especie Z05 (por ejemplo descrita en las patentes US n� 5.405.774, 5.352.600, 5.079.352, 4.889.818, 5.466.591, 5.618.711,5.674.738 y 5.795.762). Entre las polimerasas de Thermatoga que pueden utilizarse en los métodos de la invención se incluyen, por ejemplo, la ADN polimerasa de Thermatoga maritima y la ADN polimerasa de Thermatoga neapolitana, mientras que un ejemplo de una polimerasa de Thermosipho que puede utilizarse es la ADN polimerasa de Thermosipho africanus. Las secuencias de las ADN polimerasas de Thermatoga maritima y de Thermosipho africanus se encuentran publicadas en la solicitud de patente internacional n� WO 92/06200. La secuencia de Thermatoga neapolitana puede encontrarse en la publicación de patente internacional n� WO 97/09451.

En el ensayo de 5'-nucleasa, la detección de la amplificación típicamente es concurrente con la amplificación (es decir, "en tiempo real"). En algunas realizaciones, la detección de la amplificación es cuantitativa y la detección de la amplificación es en tiempo real. En algunas realizaciones, la detección de la amplificación es cualitativa (por ejemplo la detección final de la presencia o ausencia de un ácido nucleico diana). En algunas realizaciones la detección de la amplificación es posterior a la amplificación. En algunas realizaciones, la detección de la amplificación es cualitativa y la detección de la amplificación es posterior a la amplificación.

La sonda puede marcarse con cualquier número de marcajes, aunque típicamente se utiliza un marcaje fluorescente. En algunas realizaciones, la fracción fluor�foro se selecciona de entre el grupo que consiste de pigmentos de la familia de la fluoresce�na, pigmentos de la familia de la polihalofluoresce�na, pigmentos de la familia de la hexaclorofluoresce�na, pigmentos de la familia de la coumarina, pigmentos de la familia de la rodamina, pigmentos de la familia de la cianina, pigmentos de la familia de la oxazina, pigmentos de la familia de la tiazina, pigmentos de la familia de la escuara�na, pigmentos de la familia de los lant�nidos quelados, pigmentos de la familia azo, pigmentos de la familia del trifenilmetano y pigmentos de la familia de BODIPY�.

El ensayo con frecuencia comprende una sonda marcada con un marcaje fluorescente y una fracción inhibidora. En algunas realizaciones, la fracción inhibidora se selecciona de entre el grupo que consiste de pigmentos de la familia de la fluoresce�na, pigmentos de la familia de la polihalofluoresce�na, pigmentos de la familia de la hexaclorofluoresce�na, pigmentos de la familia de la coumarina, pigmentos de la familia de la rodamina, pigmentos de la familia de la cianina, pigmentos de la familia de la oxazina, pigmentos de la familia de la tiazina, pigmentos de la familia de la escuara�na, pigmentos de la familia de los lant�nidos quelados, pigmentos de la familia de BODIPY�, pigmentos de la familia de azo, pigmentos de la familia del trifenilmetano, fracciones inhibidoras de baja fluorescencia (es decir, "donadores débiles") y fracciones inhibidoras no fluorescentes (por ejemplo los denominados "inhibidores oscuros", incluyendo los Black Hole QuenchersTM (BHQ)).

En una realización, la fracción fluor�foro es un pigmento de la familia de la fluoresce�na y la fracción inhibidora es un pigmento de la familia de la cianina. En una realización, la fracción fluor�foro es un pigmento de la familia de la fluoresce�na y la fracción inhibidora es un pigmento de la familia de la hexaclorofluoresce�na. En una realización, la fracción fluor�foro es un pigmento de la familia de la hexaclorofluoresce�na y la fracción inhibidora es un pigmento de la familia de la cianina. En una realización, el inhibidor es un inhibidor oscuro, por ejemplo un BHQ-1, un BHQ-2 � un BHQ-3 (Biosearch Technologies, Novato, CA). En una realización, la fracción fluor�foro es un pigmento de la familia de la fluoresce�na o un pigmento de la familia de la cianina y la fracción inhibidora es un inhibidor oscuro.

Soportes inmovilizados

En algunas realizaciones, la hibridación específica de alelo se lleva a acbo en un formato de ensayo que utiliza una diana inmovilizada o una sonda inmovilizada. Dichos formatos son conocidos de la técnica e incluyen, por ejemplo, formatos de transferencia por puntos y formatos de ensayo de transferencia por puntos inversa, los cuales se describen en las patentes US n� 5.310.893, n� 5.451.512, n� 5.468.613 y n� 5.604.099.

Cebadores específicos de alelo

La presencia o la ausencia de una mutación V600E puede detectarse utilizando la amplificación específica de alelo

o los métodos de extensión de cebador. Estas reacciones típicamente implican la utilización de cebadores que est�n diseñados para que presenten como diana específica el sitio mutante (o de tipo salvaje) mediante un desapareamiento en el extremo 3' de un cebador, por ejemplo en el nucleótido 3' o en el penúltimo nucleótido 3'. La presencia de un desapareamiento afecta a la capacidad de una polimerasa de extender un cebador en el caso de que la polimerasa no presente actividad correctora de errores. Por ejemplo, para detectar una secuencia mutante V600E utilizando un método basado en la amplificación específica de alelo o basada en la extensión, un cebador complementario al alelo A mutante en la posición nucleot�dica 1.799 en el cod�n 600 de BRAF est� diseñado de manera que el nucleótido 3'-terminal se hibride en la posición mutante. La presencia del alelo mutante puede determinarse mediante la capacidad del cebador para iniciar la extensión. En el caso de que el extremo 3' terminal se encuentre desapareado queda impedida la extensión. De esta manera, por ejemplo en el caso de que un cebador sea complementario del nucleótido de alelo mutante en el extremo 3', el cebador resultar� extendido eficientemente. La amplificación también puede llevarse a cabo utilizando un cebador específico de alelo que sea específico de la secuencia de tipo salvaje de BRAF en la posición 1.799.

T�picamente, el cebador se utiliza conjuntamente con un segundo cebador en una reacción de amplificación. El segundo cebador se hibrida en un sitio no relacionado con la posición mutante. La amplificación se produce desde los dos cebadores, conduciendo a un producto detectable, lo que significa que se encuentra presente la forma al�lica particular. Los métodos de amplificación específica de alelo o basados en la extensión se describen en, por ejemplo, el documento n� WO 93/22456 y patentes US n� 5.137.806, n� 5.595.890, n� 5.639.611 y n� 4.851.331.

Mediante la utilización del genotipado basado en la amplificación específica de alelo, la identificación de los alelos requiere únicamente la detección de la presencia o ausencia de las secuencias diana amplificadas. Los métodos para la detección de secuencias diana amplificadas son bien conocidos de la técnica. Por ejemplo, la electroforesis en gel y los ensayos de hibridación de sondas se utilizan con frecuencia para detectar la presencia de ácidos nucleicos.

En un método alternativo sin sondas, el ácido nucleico amplificado se detecta mediante el seguimiento del incremento de la cantidad total de ADN de doble cadena en la mezcla de reacción y se describe en, por ejemplo, la patente US n� 5.994.056 y en las publicaciones de patente europea n� 487.218 y n� 512.334. La detección del ADN diana de doble cadena se basa en la fluorescencia incrementada que diversos pigmentos de unión a ADN, por ejemplo SYBR Green, muestran cuando se encuentran unidos a ADN de doble cadena.

Tal como apreciar� el experto en la materia, los métodos de amplificación específicos de alelo pueden llevarse a cabo en una reacción que utilice múltiples cebadores específicos de alelo con diana en alelos particulares. Los cebadores para dichas aplicaciones multiplex generalmente se marcan con marcajes distinguibles o se seleccionan de manera que los productos de amplificación producidos a partir de los alelos sean distinguibles según el tamaño. De esta manera, por ejemplo, pueden identificarse alelos tanto de tipo salvaje como mutantes V600E en una única muestra utilizando una única reacción de amplificación mediante análisis del gel del producto de amplificación.

Un cebador oligonucle�tido específico de alelo puede ser exactamente complementario a uno de los alelos en la región hibridante o puede presentar algunos desapareamientos en posiciones diferentes del extremo 3' del oligonucle�tido. Por ejemplo, el penúltimo nucleótido 3' puede presentar un desapareamiento en un oligonucle�tido específico de alelo. En otras realizaciones, pueden producirse desapareamientos en sitios (no mutantes) en ambas secuencias al�licas.

M�todos adicionales de detección de mutaciones de ácidos nucleicos V600E de BRAF

La presencia (o ausencia) de una mutación V600E también puede detectarse mediante secuenciaci�n directa. Entre los métodos se incluyen los métodos basados en la secuenciaci�n dideoxi y métodos tales como PyrosequencingTM de productos de longitud oligonucleot�dica. Dichos métodos con frecuencia utilizan técnicas de amplificación tales como la PCR. Otro método similar para la secuenciaci�n no requiere la utilización de una PCR completa, sino que típicamente utiliza únicamente la extensión de un cebador con una única molécula de ácido dideoxirribonucleico (ddNTP) marcado con fluorescencia que es complementaria al nucleótido que debe investigarse. El nucleótido en el sitio polim�rfico puede identificarse mediante la detección de un cebador que ha sido extendido por una base y se encuentra marcado fluorescentemente (por ejemplo Kobayashi et al., Mol. Cell. Probes 9:175-182, 1995).

Los productos de amplificación generados utilizando una reacción de amplificación también pueden analizarse mediante la utilización de la electroforesis en gel en gradiente desnaturalizante: pueden identificarse diferentes alelos basándose en las diferentes propiedades de fusión dependientes de la secuencia y en la migración

electrofor�tica del ADN en solución (ver, por ejemplo, Erlich, ed., PCR Technology, Principles and Applications for DNA Amplification, W.H. Freeman y Co., New York, 1992, capítulo 7).

En otras realizaciones, los alelos de secuencias diana pueden diferenciarse utilizando el análisis de polimorfismos de conformación de cadena sencilla, que identifica diferencias de bases a partir de la alteración de la migración electrofor�tica de productos de PCR de cadena sencilla, tal como se indica en, por ejemplo, Orita et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 86:2766-2770, 1989. Pueden generarse productos de PCR amplificados tal como se ha indicado anteriormente, y calentarse o desnaturalizarse de otro modo, para formar productos de amplificación de cadena sencilla. Los ácidos nucleicos de cadena sencilla pueden plegarse nuevamente o formar estructuras secundarias que son parcialmente dependientes de la secuencia de bases. Las diferentes movilidades electrofor�ticas de los productos de amplificación de cadena sencilla pueden relacionarse con las diferencias de secuencia entre alelos de las regiones diana.

Los métodos utilizados para detectar la presencia de una mutación V600E en BRAF típicamente utilizan oligonucle�tidos marcados, por ejemplo marcajes fluorescentes, tal como se ha indicado anteriormente. Los oligonucle�tidos pueden marcarse mediante la incorporación de un marcaje detectable por medios espectroscópicos, fotoqu�micos, bioquímicos, inmunoqu�micos o químicos. Entre los marcajes útiles se incluyen pigmentos fluorescentes, marcajes radioactivos, por ejemplo 32P, reactivos electrodensos, enzimas, tales como peroxidasa o fosfatasa alcalina, biotina, o haptenos y proteínas para los que se dispone de antisueros o anticuerpos monoclonales. Las técnicas de marcaje son bien conocidas de la técnica (ver, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology, supra: Sambrook y Russell, supra).

Detecci�n de variantes de proteínas

Una mutación V600E en B-Raf también puede detectarse mediante métodos que discriminan entre B-Raf de tipo salvaje y mutante. Con frecuencia estos métodos utilizan un anticuerpo específico para B-Raf mutante.

Puede encontrarse una vista general de la tecnología aplicable en Harlow & Lane, Antibodies: A Laboratory Manual (1988) y Harlow & Lane, Using Antibodies (1999). Los métodos para producir anticuerpos policlonales y monoclonales que reaccionan específicamente con una variante al�lica son conocidos por el experto en la materia (ver, por ejemplo, Coligan, Current Protocols in Immunology, 1991; Harlow y Lane, supra; Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (2a ed. 1986), y Kohler y Milstein, Nature 256:495-497, 1975). Entre dichas técnicas se incluyen la preparación de anticuerpos mediante la selección de anticuerpos a partir de bibliotecas de anticuerpos recombinantes en fagos o vectores similares, as� como la preparación de anticuerpos policlonales y monoclonales mediante la inmunizaci�n de conejos o ratones (ver, por ejemplo, Huse et al., Science 246:1275-1281, 1989; Ward et al., Nature 341:544-546, 1989).

La proteína B-Raf mutante puede detectarse mediante una diversidad de métodos de inmunoensayo. Para una revisión de los procedimientos inmunol�gicos y de inmunoensayo, ver Basic and Clinical Immunology (Stites y Terr, editores, 7a ed., 1991). Además, los inmunoensayos de la presente invención pueden llevarse a cabo en cualquiera de entre varias configuraciones, las cuales se revisan extensamente en Enzyme Immunoassay (Maggio, ed., 1980) y en Harlow y Lane, supra. Para una revisión de los inmunoensayos generales, ver también Methods in Cell Biology: Antibodies in Cell Biology, volumen 37 (Asai, ed., 1993); Basic and Clinical Immunology (Stites y Terr, eds., 7a ed., 1991).

Entre los ensayos utilizados comúnmente se incluyen ensayos no competitivos, por ejemplo ensayos de tipo s�ndwich y ensayos competitivos. Típicamente puede utilizarse un ensayo tal como un ensayo ELISA. La cantidad del polip�ptido variante puede determinarse llevando a cabo análisis cuantitativos.

Pueden utilizarse otras técnicas de detección, por ejemplo MALDI, para detectar directamente la presencia de V600E en B-Raf.

Se obtiene una muestra para el análisis de las células de cáncer, por ejemplo de tejido tumoral, procedente del paciente.

Tratamiento

El método de detección de mutaciones dado a conocer en la presente memoria puede incluir la utilización de software de análisis de datos que informar� al usuario de si el paciente debería ser tratado o no con un inhibidor de B-Raf, tal como un inhibidor de B-Raf específico de mutación, por ejemplo PLX4032, basándose en la presencia o ausencia, respectivamente, de la mutación V600E de B-Raf.

Un paciente que se ha determinado que es positivo para la presencia de una mutación en la posición amino�cida 600, por ejemplo una mutación V600E, es un candidato para el tratamiento con un inhibidor de B-Raf quinasa, por ejemplo un inhibidor de B-Raf quinasa específico de mutante tal como PLX4032. Se describen diversos inhibidores de B-Raf quinasa, incluyendo los inhibidores de B-Raf quinasa específicos de mutante, en, por ejemplo, los documentos n� WO 2007/002325 y n� WO 2007/002433. PLX4032 se denomina en los documentos n� WO 2007/002433 y n� WO 2007/002325, "P-0956".

Puede encontrarse una guía para la administración de los inhibidores de B-Raf quinasa, por ejemplo de un inhibidor de B-Raf quinasa específico de mutante, en, por ejemplo, los documentos n� WO 2007/002325 y n� WO 2007/002433. Las formas de dosificación adecuadas dependerán en parte de la utilización o vía de administración, por ejemplo oral, transd�rmica, transmucosal, por inhalaci�n o mediante inyección (parenteral). Dichas formas de dosificación deberían permitir que el compuesto alcance las células diana. Otros factores son bien conocidos de la técnica, y entre ellos se incluyen consideraciones tales como la toxicidad y formas de dosificación que retrasan que el compuesto o la composición ejerza sus efectos. Las técnicas y formulaciones generalmente pueden encontrarse en The Science and Practice of Pharmacy, 21a edición, Lippincott, Williams and Wilkins, Philadelphia, PA, 2005.

Las composiciones farmacéuticas pueden incluir portadores o excipientes. Los portadores o excipientes pueden seleccionarse para facilitar la administración del compuesto. Entre los ejemplos de portadores se incluyen carbonato de calcio, fosfato de calcio, diversos azúcares, tales como lactosa, glucosa o sacarosa, o tipos de almidón, derivados de celulosa, gelatina, aceites vegetales, polietilenglicoles y solventes fisiológicamente compatibles. Entre los ejemplos de solventes fisiológicamente compatibles se incluyen soluciones estériles de agua para inyección (API), solución salina y dextrosa.

Los compuestos pueden administrarse por diferentes vías, incluyendo las vías intravenosa, intraperitoneal, subcutánea, intramuscular, oral, transmucosal, rectal, transd�rmica o por inhalaci�n. En algunas realizaciones, el inhibidor de B-Raf quinasa específico se administra por vía oral. Para la administración oral, por ejemplo, los compuestos pueden formularse en formas de dosificación oral convencionales, tales como cápsulas, tabletas y preparaciones líquidas, tales como jarabes, elixires y gotas concentradas.

Para los inhalantes, los inhibidores de B-Raf pueden formularse en forma de polvos secos o en una solución, suspensión o aerosol adecuado. Los polvos y soluciones pueden formularse con aditivos adecuados conocidos de la técnica. Por ejemplo, los polvos pueden incluir una base de polvos adecuada, tal como lactosa o almidón, y las soluciones pueden comprender propilenglicol, agua estéril, etanol, cloruro sádico y otros aditivos, tales como ácidos, �lcalis y sales tamponadoras. Dichas soluciones o suspensiones pueden administrarse mediante la inhalaci�n mediante spray, bomba, atomizador o nebulizador, y similar.

Alternativamente, los inhibidores de B-Raf pueden inyectarse (administración parenteral), por ejemplo por vía intramuscular, intravenosa, intraperitoneal y/o subcutánea. Para la inyección, los inhibidores se formulan en soluciones líquidas estériles, preferentemente en tampones o soluciones fisiológicamente compatibles, tales como solución salina, solución de Hank o solución de Ringer. Además, los compuestos pueden formularse en forma sólida y redisolverse o suspenderse inmediatamente antes de la utilización. También pueden producirse formas liofilizadas.

La administración también puede ser por medios transmucosales, t�picos o transd�rmicos. Para la administración transmucosal, típica o transd�rmica, en la formulación se utilizan agentes penetrantes apropiados a la barrera. Dichos agentes penetrates son generalmente conocidos de la técnica y entre ellos se incluyen, por ejemplo para la administración transmucosal, sales biliares y derivados del ácido fus�dico. Además, pueden utilizarse detergentes para facilitar la permeaci�n. La administración transmucosal puede realizarse, por ejemplo, mediante sprays nasales

o supositorios (rectales o vaginales). Las composiciones típicas de la presente invención se formulan preferentemente como aceites, cremas, lociones, pomadas y similares mediante la selección de portadores apropiados conocidos de la técnica. Entre los portadores adecuados se incluyen aceites vegetales o minerales, petrolato blanco (parafina blanca blanca), grasas o aceites de cadena ramificada, grasas animales y alcohol de alto peso molecular. Los portadores preferentes son aquellos en los que el ingrediente activo es soluble. Los emulsionantes, estabilizadores, humectantes y antioxidantes también pueden incluirse como agentes que proporcionen color o fragancia, si se desea. Las cremas para la aplicación típica pueden formularse a partir de una mezcla de aceite mineral, cera de abeja autoemulsionante y agua en la que se mezcla el ingrediente activo, disuelto en una cantidad reducida de solvente (por ejemplo un aceite). Adicionalmente, la administración por vía transd�rmica puede comprender un parche o vendaje transd�rmico, tal como una venda impregnada con un ingrediente activo y opcionalmente uno o más portadores o diluyentes conocidos de la técnica. Para la administración en forma de un sistema de administración transd�rmica, la administración de la dosis evidentemente ser� continua y no intermitente durante el régimen de dosificación.

Las cantidades de los diversos compuestos que deben administrarse pueden determinarse mediante procedimientos estándares, considerando factores tales como la IC50 del compuesto, el tiempo de vida biológica medio del

compuesto, la edad, tamaño y peso del sujeto y diversos otros parámetros asociados al mismo. La importancia de estos factores y de otros factores es bien conocida por el experto ordinario en la materia. Generalmente una dosis ser� de entre aproximadamente 0,01 y 50 mg/kg, preferentemente de entre 0,1 y 20 mg/kg del sujeto bajo tratamiento. Pueden utilizarse dosis múltiples.

Tambi�n pueden utilizarse inhibidores de B-Raf conjuntamente con otras terapias para el cáncer.

Kits

La invención proporciona además kits que comprenden componentes útiles para la puesta en práctica de los métodos, que comprenden una sonda específica de alelo que comprende SEC ID n� 1, en la que 'n' es desoxiinosina. En algunas realizaciones, el kit puede comprender una o más sondas oligonucle�tidas que son específicas para el mutante o alelo V600E. Dicho kit puede contener además cebadores de amplificación para amplificar una región del locus BRAF que comprende el sitio de mutación V600E. De esta manera, en algunas realizaciones, un kit de comprende el juego de cebadores siguiente:

TTS068-BRAF_F1: 5’ CCTCACAGTAAAAATAGGTGATTTTGGTCTE 3’ (E= t-butilbencil-dA) (SEC ID n� 25) y

RL_BRAF_R5: 5’ TAGCCTCAATTCTTACCATCCACAAAA 3’ (SEC ID n� 4),

que amplifica una región diana de BRAF. El kit puede comprender además sondas, tales como sondas específicas de alelo. Son ejemplos de sondas específicas d ealelo que pueden utilizarse en un kit de la invención los siguientes:

TTS155-BRAF_MU 5’ QCTACAIAIFAAATCTCGATGGAGTGGGTCCCAP 3’ (SEC ID n� 23)

TTS 148-BRAF_WT 5’ QACAITGEAAATCTCGATGGAGTGGGTCCCAP 3’ (SEC ID n� 24).

Un kit puede comprender además cebadores y/o sondas que son sustancialmente idénticas a los oligonucle�tidos indicados. En algunas realizaciones, un kit para la utilización en la invención comprende uno o más oligonucle�tidos que comprenden por lo menos 15 nucleótidos contiguos de la secuencia de ácidos nucleicos de SEC ID n� 2, SEC ID n� 3 y/o SEC ID n� 4.

Entre otros componentes opcionales de los kits se incluyen reactivos adicionales para determinar la presencia de sustituciones de nucleótidos. Por ejemplo, un kit puede contener una polimerasa, sustratos nucle�sidos trifosfato y tampones apropiados para las reacciones de amplificación, e instrucciones para llevar a cabo el presente método. Entre otros componentes de un kit pueden incluirse reactivos y protocolo de extracción de ADN y cofactor i�n divalente. El tampón puede incluir, por ejemplo, UNG. En algunas realizaciones, el tampón puede incluir apt�mero.

Un kit puede incluir además controles, tales como controles de ADN V600E.

Ejemplos

Detecci�n de la mutación V600E de B-Raf

El presente ejemplo muestra un ensayo diagnóstico basado en una PCR (reacción en cadena de la polimerasa) en tiempo real para la medición de la mutación V600E de B-Raf (BRAF nucleótido 1.799 T>A) en ADN gen�mico extraído de tejidos tumorales de cáncer fijado con formalina e incluido en parafina (FFPE). En el presente ejemplo, el ADN gen�mico extraído del tejido FFPE se sometió a ensao mediante análisis de PCR TaqMan. Para la reacción de PCR, se prepar� una mezcla maestra mediante la combinación de mezcla de reacción de ARN TaqMan, mezcla de cebadores-sondas y cofactor acetato de magnesio (Mg(OAc)2). La amplificación se llev� a cabo utilizando 125 ng de ADN gen�mico. Se detectaron los productos de amplificación utilizando un analizador COBAS TaqMan 48.

Se amplificó la región gen�mica que contenía el sitio V600E de B-Raf (BRAF 1.799 T>A) en el ex�n 15, produciendo un ADN de doble cadena de 116 pares de bases (amplic�n). La reacción de amplificación se llev� a cabo durante 55 ciclos. El sistema de amplificación y detección medía, en tiempo real, las cantidades de productos de PCR generadas en cada ciclo de amplificación mediante la medición de la señal fluorescente resultante del corte de las sondas específicas de diana. Las sondas específicas de diana de B-Raf de tipo salvaje (WT, V600) y de la mutación V600E de B-Raf se marcaron, cada una, con un pigmento informador diferente. La medición de la fluorescencia a longitudes de onda específicas emitida por dichos pigmentos informadores durante cada ciclo de amplificación permitió identificar los amplicones B-Raf WT y V600E en un único tubo de reacción. Tras alcanzar la señal fluorescente de cada pigmento informador un nivel umbral predefinido, se calcularon los valores de ciclo umbral (Ct) para el alelo WT y el alelo con mutación V600E en la reacción multiplex.

Se diseñaron cebadores de BRAF para amplificar una región del ex�n 15 de BRAF de 115 pares de bases (pb). Utilizando la herramienta BLAT de búsqueda en el genoma de UCSC (http://www.genome.ucsc.edu/cgi

bin/hgBlat?command=start) en el genoma humano, ensamblaje de marzo de 2006, el ex�n 15 de BRAF presentaba una homología de 93,4% con la secuencia del cromosoma X (chrX) chrX:74721094-74721213, un pseudog�n aparente. Se utilizó un cebador inverso que incluía una parte del intr�n 15 de BRAF para amplificar específicamente la secuencia de BRAF deseada. Tal como se muestra en la figura 1, el cebador inverso presentaba una homología de únicamente 55,6% (15 de 27 nucleótidos) con la secuencia del cromosoma X. Las sondas en la mezcla de cebadores-sondas de BRAF eran complementarias a la cadena de amplic�n resultante de la extensión de dicho cebador inverso, garantizando adicionalmente que el resultado de ensayo era específico de la secuencia de BRAF.

Se sintetizaron cebadores en un sintetizador de ADN ABI 394 (Applied Biosystems Inc., Foster City, CA) utilizando fosforamiditas desoxinucle�tido estándares, dicianoimidazol (DCI) como activador y ciclos de síntesis estándares (con modificaciones menores) en la orientación 3' a 5' convencional en una fase sólida de soporte de vidrio de poro controlado (VPC). Se introdujo el 3'-t-butil-bencil-dA como nucle�sido modificado, como parte del VPC (Roche Applied Sciences, Penzberg, Alemania) utilizado como el soporte sólido para la síntesis de ADN. Tras la adición de la última base, se elimin� el grupo protector 5'-dimetoxitritilo (DMT) en el sintetizador y el oligonucle�tido se desprotegi� con hidróxido am�nico a 55�C durante 16 horas. El oligonucle�tido en bruto se evapor� para eliminar el amonio y se purificó utilizando una columna de cromatograf�a líquida a alta presión (HPLC) de intercambio ani�nico fuerte Mono-Q HR 16/10 (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) con un gradiente lineal de cloruro sádico a pH elevado. Las fracciones se analizaron utilizando una columna de intercambio iónico DNAPac PA100 (Dionex Inc., Sunnyvale, CA) y se agruparon utilizando un criterio de pureza mínima de >90%. Las fracciones agrupadas se desalaron y se formularon en Tris 10 mM, pH 8,0. Se sintetizaron los cebadores siguientes para la reacción de PCR:

TTS068-BRAF_F1: 5’ CCTCACAGTAAAAATAGGTGATTTTGGTCTE 3’ (E= t-butilbencil-dA) (SEC ID n� 25) y

RL_BRAF_R5: 5’TAGCCTCAATTCTTACCATCCACAAAA 3’ (SEC ID n� 4).

Se sintetizaron sondas TaqMan en un sintetizador de ADN ABI 394 (Applied Biosystems Inc.) utilizando fosforamiditas desoxinucle�tido ultrasuaves (Pierce Biotechnology, Milwaukee, WI), DCI como activador y ciclos de síntesis estándares (con modificaciones menores) en la orientación 3' a 5' convencional en una fase sólida de soporte de VPC. Se incorpor� marcaje fluorescente, cx-FAM (6-carboxifluoresce�na, Biogenex Inc.) o cx-HEX (6carboxihexaclorofluoresce�na (Biogenex Inc., San Ramon, CA) e inhibidor Black Hole (BHQ-2) (Biosearch Inc., Novato, CA) utilizando reactivos fosforamidita y ciclos de acoplamiento de 10 minutos. Se introdujo el 3'-fosfato mediante VPC bloqueante de la extensión de 3' (Clontech Inc., Mountain View, CA). Tras la síntesis, se elimin� el grupo protector DMT en el sintetizador y el oligonucle�tido se desprotegi� con hidróxido am�nico a temperatura ambiente durante 16 horas. El oligonucle�tido en bruto se purificó utilizando una columna HPLC de intercambio ani�nico fuerte Mono-Q HR 16/10 (Amersham Biosciences) con un gradiente lineal de cloruro sádico. Las fracciones se analizaron utilizando una columna de intercambio iónico DNAPac PA100 (Dionex Inc., Sunnyvale, CA) y se agruparon utilizando un criterio de pureza mínima de >90%. Las fracciones agrupadas se desalaron y se formularon en tampón de almacenamiento de sondas que comprendía tricina 80 mM, pH 8,2, acetato pot�sico 240 mM, EDTA 0,1 mM y azida sádica al 0,09%. Las sondas Taqman� eran:

V600E (TTS155-BRAF_MU): 5’ QCTACAIAIFAAATCTCGATGGAGTGGGTCCCAP 3’ (SEC ID n� 23) de tipo salvaje (TTS148-BRAF_WT): 5’ QACAITGEAAATCTCGATGGAGTGGGTCCCAP 3’ (SEC ID n� 24) (E = pigmento informador HEX, F= pigmento informador FAM, I = deoxiinosina, Q = pigmento inhibidor BHQ2, P= 3’-fosfato).

La reacción de amplificación incluía además AmpErase (uracil-N-glucosilasa, UNG) y desoxiuridina trifosfato (dUTP). AmpErase reconoce y cataliza la destrucción de las cadenas de ADN que contienen desoxiuridina pero no ADN que contiene timidina. La desoxiuridina no se encuentra presente en el ADN naturalmente, pero se encuentra presente siempre en el amplic�n debido a la utilización de desoxiuridina fosfato en lugar de timidina fosfato como uno de los dNTP en la mezcla de reactivos de reacción de PCR. La incorporación de UNG en la mezcla de reacción minimiza la contaminación cruzada de los amplicones. AmpErase no degradar� el amplic�n diana, sondas y kits de ensayo.

Detecci�n de productos de PCR

La mezcla de cebador-sonda de BRAF utilizada en el presente análisis contenía dos sondas fluorescentes de marcaje dual que eran específicas para las secuencias de nucleótidos codificantes de B-Raf WT o V600E, respectivamente, permitiendo la detección en tiempo real de la acumulación de productos de PCR específicos mediante la liberación de señal fluorescente durante el procedimiento de amplificación. Las sondas B-Raf WT y V600E se marcaron con diferentes pigmentos informadores fluorescentes y el mismo pigmento inhibidor. En el caso de que las sondas se encuentren intactas, la fluorescencia del pigmento informador resulta suprimida por el pigmento inhibidor debido a la transferencia de energía de tipo F�rster. Durante la PCR, cada sonda se hibrida de una manera dependiente de la secuencia con su secuencia diana y resulta cortada por la actividad de 5'-nucleasa de la ADN polimerasa Z05, separando los dos pigmentos. Tras separar los pigmentos informador ei nhibidor, resulta detectable la fluorescencia del pigmento informador. En cada ciclo de PCR se genera más amplic�n, increment�ndose efectivamente la señal acumulada del pigmento informador. Se realizó un seguimiento independiente de la amplificación de las secuencias de B-Raf WT y V600E mediante la medición de cada sonda en

5 su intervalo de longitudes de onda de emisión específico correspondiente durante cada ciclo.

Cada muestra de ADN gen�mico se amplificó en una reacción de 100 ml que comprendía 50 ml de una mezcla maestra de trabajo que se prepar� mediante la adición de 17 ml de mezcla de cebador-sonda y 13 ml de cofactor Mg(OAc)2 25 mM a 20 ml de mezcla de reacción de ARN TaqMan por cada muestra. Se a�adi� una muestra de

10 ADN gen�mico (125 ng) a un volumen de 50 ml a la mezcla maestra de trabajo. Se amplificó cada muestra por duplicado. Las reacciones de amplificación se llevaron a cabo bajo las condiciones mostradas en la Tabla 1. Cada operación incluía una reacción de control positivo para V600E y una reacción de control positivo de tipo salvaje, as� como una reacción de control negativo.

15 Tabla 1: Perfil de ciclado térmico

Etapa

Descripción Temperatura Tiempo Número de ciclos

1

Descontaminación de UNG 50�C 5 min. 1X

2

Desnaturalización preciclado 95� 1 min. 1X

3

Desnaturalización 1 95�C 15 s 2X

Hibridaci�n/Extensión 1

61�C 30 s

4

Desnaturalización 2 92�C 15 s 53X

Hibridaci�n/Extensión 2

61�C 30 s

5

Mantenimiento post-ciclado 40�C 2 min. 1X

An�lisis de los datos

Se calcularon los valores de Ct para B-Raf V600E (canal 1) y WT (canal 2) con el software AmpliLink 3.1 en la

20 estación de trabajo analizador COBAS TaqMan 48. Los valores de Ct de las reacciones de control negativo y positivo se utilizaron para determinar si una operación era válida. La Tabla 2 lista los valores de Ct aceptables para cada reacción de control.

Tabla 2: Valores de Ct aceptables para las reacciones de control

a.

b. Canal 1 c. (sonda FAM, V600E)* d. Canal 2 e. (sonda HEX, WT)*

f. Negativo

g. Ct = -1 h. Ct = -1

i. Control positivo n� 1 (pl�smido V600E)

j. Ct entre 29 y 33 k. C =-1

1. Control positivo n� 2 (pl�smido WT)

m. Ct = -1 n. Ct entre 28 y 32

* Un valor de Ct de -1 indica que no se detectaba amplificación significativa.

25 Para las operaciones válidas, se evalu� el valor de Ct para cada muestra frente a los intervalos aceptables para cada canal que había sido definido mediante estudios de rendimiento analítico. La Tabla 3 proporciona un ejemplo de cómo cada pareja de valores de Ct se traduce en un resultado de estado de mutación V600E de B-Raf.

30 Tabla 3: Tabla de valores de Ct para asignar el estado de V600E.

o. Canal 1 p. (sonda FAM, V600E)*

q. condicional r. Canal 2 s. (sonda HEX, WT)* t. estado de V600E

u. Ct = -1

v. y w. Ct x. Negativo

y. 15 Ct 50

z. y aa. 15 Ct 40 bb. Positivo

cc. Ct <15 or >50

dd. o ee. Ct <15 or >40 ff. Indeterminado

* Un valor de Ct de -1 indica que no se detectaba amplificación significativa. Clave: E = pigmento informador HEX, F= pigmento informador FAM, I = dexoxiinosina, Q = pigmento inhibidor BHQ2, P= 3’-fosfato

Se evaluaron las muestras siguientes. Los resultados de la PCR TaqMan� se validaron mediante secuenciaci�n. Tabla 4. Características de las muestras clónicas

ID de muestra

Diagnóstico % tumores

M1

ETAPA DE CRECIMIENTO VERTICAL DE MELANOMA PRIMARIO 60

M2

MELANOMA 95

M3

ETAPA DE CRECIMIENTO VERTICAL DE MELANOMA PRIMARIO 75

M4

MELANOMA, 50

M5

ETAPA DE CRECIMIENTO VERTICAL DE MELANOMA PRIMARIO 85

M6

ETAPA DE CRECIMIENTO VERTICAL DE MELANOMA PRIMARIO 90

M7

MELANOMA 90

M8

ETAPA DE CRECIMIENTO VERTICAL DE MELANOMA PRIMARIO 90

M9

ETAPA DE CRECIMIENTO VERTICAL DE MELANOMA PRIMARIO 90

M10

ETAPA DE CRECIMIENTO RADIAL DE MELANOMA PRIMARIO 95

RM1 RM2

Melanoma metast�sico (LN) Melanoma metast�sico (LN) 10 45

RM3

Melanoma metast�sico (LN) 30

RM4 RM5

Melanoma metast�sico (LN) Melanoma metast�sico (LN) 10 50

RM6

Melanoma metast�sico (LN) 30

RM7

Melanoma metast�sico (LN) 50

RM8 RM9

Melanoma metast�sico (LN) Melanoma metast�sico (LN) 40 40

RM10

Melanoma metast�sico (LN)? 10

RM11

Melanoma metast�sico (LN) 75

RM12

Melanoma metast�sico (LN) 55

RM13

Melanoma metast�sico (LN) 30

RM14

Melanoma metast�sico 50

RM15

Melanoma metast�sico (LN) 80

RM16

Melanoma metast�sico (LN) 45

RM17

Melanoma metast�sico (LN) 50

RM18

Melanoma metast�sico (LN) 50

RM19

Melanoma metast�sico (LN) 50

RM20

Melanoma metast�sico (LN) 35

Se extrajo ADN de treinta especímenes FFPE de melanoma (Tabla 4). Las muestras resultantes contenían una mezcla de ADN procedente tanto de células tumorales como células normales. Los resultados de detección de mutación del ensayo TaqMan� en comparación con la pirosecuenciaci�n y la secuenciaci�n GS20 se muestran en la Tabla 5.

Tabla 5 Estado de V600E determiando mediante tres métodos independientes

ID de muestra

TaqMan� Pirosecuenciaci�n Secuenciaci�n GS20

M1

negativo negativo negativo

M2

negativo negativo negativo

M3

negativo fallo negativo

M4

positivo positivo positivo

M5

positivo positivo positivo

M6

positivo positivo positivo

M7

positivo positivo positivo

M8

negativo negativo negativo

M9

negativo negativo negativo

M10

negativo negativo negativo

RM1

negativo fallo negativo

RM2

negativo negativo negativo

RM3

positivo negativo positivo

RM4

negativo negativo negativo

RM5

positivo positivo positivo

RM6

positivo negativo positivo

RM7

negativo negativo negativo

RM8

positivo negativo positivo

RM9

negativo negativo negativo

RM10RM11

negativo negativo negativo negativo negativo negativo

RM12

negativo negativo* negativo

RM13

negativo negativo* negativo

RM14

positivo positivo* positivo

RM15

positivo positivo positivo

RM16

positivo positivo positivo

RM17

positivo negativo* positivo

RM18

negativo negativo negativo

RM19

negativo negativo negativo

RM20

negativo negativo negativo

* Interpretación manual.

Las muestras M3 y RM1 no consiguieron amplificarse mediante pirosecuenciaci�n, ni siquiera tras una segunda extracción; ambas muestras se denominaron V600E-negativas (WT) según los métodos TaqMan� y GS20. Cuatro muestras requirieron una interpretación manual en la pirosecuenciaci�n: para RM17, el resultado de la 5 pirosecuenciaci�n fue V600E-negativo, mientras que los resultados de tanto TaqMan� como GS20 indicaron que la muestra era V600E-positiva; en los tres casos restantes, los tres métodos proporcionaron resultados concordantes. Tres muestras adicionales (RM3,RM6 y RM8) resultaron V600E-negativas según la pirosecuenciaci�n, mientras que resultaron V600E-positivas según los métodos TaqMan� y GS20. Estos resultados son consistentes con un rendimiento insuficiente de ADN que contiene mutación de RM3, RM6, RM8 y RM17 para la detección de mutación

10 mediante pirosecuenciaci�n. La muestra RM8 era V600E-positiva en 4% de las 4.300 lecturas de secuenciaci�n GS20 (�2000 en cada dirección), el porcentaje más bajo de BRAF mutado observado entre todas las muestras V600E-positivas.

Debido a la mayor sensibilidad de la secuenciaci�n GS20 en comparación con la pirosecuenciaci�n, se utilizó el

15 método GS20 como el método de referencia para el ensayo TaqMan�. El nivel de concordancia entre el ensayo COBAS TaqMan� de B-Raf V600E y la secuenciaci�n GS20 fue de 12/12=100% para las muestras V600E-positivas y 18/18=100% para las muestras V600E-negativas (WT).

Secuencias ejemplares:

SEC ID n� 1 BRAF_MU (I = dexoxiinosina P= 3’-fosfato)

5’ CTACAIAIAAATCTCGATGGAGTGGGTCCCAP 3’

SEC ID n� 2 BRAF_WT (I = dexoxiinosina P= 3’-fosfato) 25 5’ ACAITGAAATCTCGATGGAGTGGGTCCCAP 3’

SEC ID n� 3 BRAF_F1:

5’ CCTCACAGTAAAAATAGGTGATTTTGGTCT 3’

30 SEQ ID NO:4 BRAF_R5: 5’ TAGCCTCAATTCTTACCATCCACAAAA 3’

LISTADO DE SECUENCIAS

<110>

Roche Diagnostics GmbH

F.

Hoffmann-La Roche AG

<120> ENSAYO DIAGNÓSTICO DE SENSIBILIDAD A LOS INHIBIDORES DE B-RAF QUINASA 40 <130> 24003 EP-HS

<140> Todavía no asignado

<141> Todavía no asignado

45 <150> US 60/993,391

<151> 2007-09-11

<160> 24

50 <170> FastSEQ para Windows Versión 4.0

<210> 1

<211> 31

<212>

ADN

<212>

ADN

<213> Secuencia artificial

5

<220> <223> sonda BRAF_MU sintética <221> base modificada <222> (6)...(6) <223> n= desoxiinosina

10

<221> base modificada <222> (8)...(8) <223> n= desoxiinosina

15

<221> base modificada <222> (31)...(31) <223> a = a con 3’-fosfato

20 25

<400> 1 ctacananaa atctcgatgg agtgggtccc a 31 <210> 2 <211> 29 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> sonda BRAF_WT sintética

30

<221> base modificada <222> (4)...(4) <223> n = desoxiinosina

35

<221> base modificada <222> (29)...(29) <223> a = a con 3'-fosfato

<400> 2 acantgaaat ctcgatggag tgggtccca 29

40

<210> 3 <211> 30 <212> ADN <213> Secuencia artificial

45

<220> <223> cebador BRAF_F1 sintético

50 55

<400> 3 cctcacagta aaaataggtg attttggtct 30 <210> 4 <211> 27 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> cebador BRAF_R5 sintético

60

<400> 4 tagcctcaat tcttaccatc cacaaaa 27

<210> 5 <211> 116

20

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> secuencia de amplic�n B-Raf V600E sintético

<400> 5

<210> 6

<211> 116

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<223> secuencia de cromosoma X de Homo sapiens correspondiente de B-Raf

<400> 6

<210> 7

<211> 40 25 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> región del ex�n 15 de B-Raf circundante al cod�n 600

<400> 7

35 <210> 8

<211> 40

<212> PRT

<213> Homo sapiens

40 <220>

<223> región A-Raf

<400> 8

<210> 9

<211> 40

<212> PRT 50 <213> Homo sapiens

<220>

<223> región C-Raf

<400> 9

<210> 10

<211> 116 10 <212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<223> RAF1, codifica C-Raf

<400> 10

20 <210> 11

<211> 116

<212> ADN

<213> Homo sapiens

25 <220>

<223> ARAF, codifica A-Raf

<400> 11

<210> 12

<211> 30

<212> ADN 35 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> cebador inverso BRAF sintético

40 <400> 12 aaatagcctc aattcttacc atccacaaaa 30

<210> 13

<211> 27 45 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<220> 50 <223> cebador inverso BRAF sintético

<400> 13 tagcctcaat tcttaccatc cacaaaa 27

55 <210> 14

<211> 26 <212> ADN <213> Secuencia artificial

5

<220> <223> cebador inverso BRAF sintético

10

<221> base modificada <222> (26)...(26) <223> a = a con 6-carboxihexaclorofluoresce�na (HEX)

<400> 14 tagcctcaat tcttaccatc cacaaa 26

15

<210> 15 <211> 28 <212> ADN <213> Secuencia artificial

20

<220> <223> cebador inverso BRAF sintético

25 30

<400> 15 agggccaaaa atttaatcag tggaaaaa 28 <210> 16 <211> 29 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> cebador inverso BRAF sintético

35

<400> 16 cagtggaaaa atagcctcaa ttcttacca 29

40

<210> 17 <211> 29 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> cebador directo BRAF sintético

45

<221> base modificada <222> (29)...(29) <223> t = t con 6-carboxihexaclorofluoresce�na (HEX)

50

<400> 17 tttcttcatg aagacctcac agtaaaaat 29

55

<210> 18 <211> 30 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> cebador directo BRAF sintético

60

<221> base modificada <222> (30)...(30) <223> a = a con 6-carboxihexaclorofluoresce�na (HEX)

<400> 18 atatatttct tcatgaagac ctcacagtaa 30

<210> 19 5 <211> 23

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> 10 <223> cebador inverso BRAF sintético

<400> 19 atgacttctg gtgccatcca caa 23

15 <210> 20

<211> 32

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

20 <220>

<223> cebador inverso BRAF sintético

<400> 20 aaaaatagcc tcaattctta ccatccacaa aa 32

<210> 21

<211> 25

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> cebador inverso BRAF sintético

<400> 21 35 gccatccaca aaatggatcc agaca 25

<210> 22

<211> 27

<212> ADN 40 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> cebador inverso BRAF sintético

45 <400> 22 caaaatggat ccagacaact gttcaaa 27

<210> 23

<211> 24 50 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> sonda TTS155-BRAF_MU sintética

<221> base modificada

<222> (1)...(1)

<223> n = desoxiinosina unida a 3’ del esqueleto desoxirribosa fosfato modificado con FAM unido al 3' del oligonucle�tido 5’CTACAIA3’, en el que 5’ C es modificado por el inhibidor BHQ2 e I = desoxiinosina

<221> base modificada

<222> (24)...(24)

<223> a = a con 3'-fosfato

<400> 23 naaatctcga tggagtgggt ccca 24

<210> 24

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> sonda TTS148-BRAF_WT sintética

<221>

base modificada 15 <222> (1)...(1)

<223> n = g unida a 3’ del esqueleto desoxirribosa fosfato modificado con HEX unido al 3' del oligonucle�tido 5’ACAIT3’, en el que 5’ A es modificado por el inhibidor BHQ2 e I = desoxiinosina

<221>

base modificada 20 <222> (24)...(24)

<223> a = a con 3'-fosfato

<400> 24 naaatctcga tggagtgggt ccca 24

<210> 25

<211> 30

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> cebador TTS068-BRAF_F1 sintético

<221> base modificada 35 <222> (30)...(30)

<223> t = t con t-butil-bencil-dA

<400> 30 cctcacagta aaaataggtg attttggtct 30

Claims (13)

1. REIVINDICACIONES

   1. Método para determinar la sensibilidad de las células de cáncer a un inhibidor de B-Raf quinasa, comprendiendo el método:

   -

   obtener una muestra de ácidos nucleicos a partir de células de cáncer de un paciente que presenta un cáncer,

   -

   amplificar una secuencia polinucleot�dica diana en la muestra de ácidos nucleicos utilizando una pareja de cebadores que amplifica la secuencia polinucleot�dica diana, en la que la secuencia polinucleot�dica diana comprende un sitio de mutación V600E, V600E o V600K en BRAF y la amplificación se lleva a cabo en

   10 presencia de una sonda oligonucle�tida marcada que comprende SEC ID n� 1, en la que 'n' es desoxiinosina y detecta la presencia de una secuencia mutada en el sitio de mutación V600E, V600D o V600K en BRAF, y - detectar la presencia o ausencia de una mutaci�on V600E, V600E o V600K en BRAF, determinando de esta manera la sensibilidad del cáncer al inhibidor de B-Raf.

   15 2. Método según la reivindicación 1, en el que la amplificación se lleva a cabo en presencia de una segunda sonda que detecta la presencia de una secuencia de tipo salvaje en el sitio de mutación V600E, V600D o V600K.

2. 3.

   M�todo según la reivindicación 2, en el que la segunda sonda comprende por lo menos 15 nucleótidos contiguos de la secuencia de nucleótidos indicada en SEC ID n� 2.

3. 4.

   M�todo según la reivindicación 1, en el que uno de los cebadores en la pareja de cebadores comprende por lo menos 15 nucleótidos contiguos de la secuencia de nucleótidos indicada en SEC ID n� 3.

4. 5.

   M�todo según la reivindicación 1, en el que uno de los cebadores en la pareja de cebadores comprende por 25 lo menos 15 nucleótidos contiguos de la secuencia de nucleótidos indicada en SEC ID n� 4.

5. 6. Método según la reivindicación 1, en el que la etapa de amplificar la reacción comprende una RT-PCR.

6. 7.

   M�todo según la reivindicación 1, en el que el inhibidor de B-Raf quinasa es un inhibidor de B-Raf quinasa 30 específico de mutante.

7. 8.

   M�todo según la reivindicación 1, en el que el inhibidor de B-Raf quinasa es PLX4032.

8. 9.

   Kit para detectar un paciente que es un candidato para el tratamiento con un inhibidor de B-Raf, en el que

   35 el kit comprende una primera sonda específica de alelo, en el que la primera sonda resulta adecuada para detectar una mutación V600E, V600D o V600K en BRAF y que comprende la secuencia indicada en SEC ID n� 1, en la que 'n' es desoxiinosina.
9. 10. Kit según la reivindicación 9, que comprende además una segunda sonda específica de alelo, en el que la

   40 segunda sonda detecta la secuencia de BRAF de tipo savlaje y comprende por lo menos 15 nucleótidos contiguos de la secuencia de nucleótidos indicada en SEC ID n� 2.
10. 11. Kit según la reivindicación 9, que comprende además una pareja de cebadores que amplifica una región diana de BRAF que comprende un sitio de mutación V600E, V600D o V600K.
11. 12. Kit según la reivindicación 11, en el que la pareja de cebadores comprende un cebador que comprende por lo menos 15 nucleótidos contiguos de la secuencia de nucleótidos indicada en SEC ID n� 3.
12. 13. Kit según la reivindicación 11, en el que la pareja de cebadores comprende cebadores que presentan las 50 secuencias indicadas en SEC ID n� 3 y SEC ID n� 4.
13. 14. Kit según la reivindicación 9, en el que la primera sonda presenta la secuencia de nucleótidos indicada en SEC ID n� y el kit comprende además una segunda sonda que presenta la secuencia de nucleótidos indicada en SEC ID n� 2 y una pareja de cebadores comprende cebadores que presentan las secuencias de nucleótidos

    55 indicadas en SEC ID n� 3 y SEC ID n� 4.