CN101418340B

CN101418340B - B-raf激酶抑制剂易感性的诊断检测

Info

Publication number: CN101418340B
Application number: CN200810173745.2A
Authority: CN
Inventors: R·兰兰德; T·夏普; S·威尔; L·吴
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2007-09-11
Filing date: 2008-09-10
Publication date: 2014-05-07
Anticipated expiration: 2028-09-10
Also published as: PT2036990E; SI2036990T1; CA2639416C; EP2036990A1; JP2009077712A; EP2036990B1; DK2036990T3; ES2471097T3; PL2036990T3; JP6787651B2; HRP20140608T1; CA2639416A1; JP2015198659A; CN101418340A

Abstract

本发明涉及B-RAF激酶抑制剂易感性的诊断检测。本发明提供了检测BRAF中的突变的方法和试剂，以及选择可用B-Raf激酶抑制剂例如选择性的B-Raf激酶抑制剂进行治疗的患者的方法。

Description

B-RAF激酶抑制剂易感性的诊断检测

技术领域

本发明涉及检测BRAF中的突变的方法和试剂盒。

背景技术

BRAF基因编码B-Raf，一种丝氨酸/苏氨酸激酶，其用于耦联从激活RAS至下游MAPK激酶的信号传导(Wellbrocketal.，Cancer Res.64：2338-2342，2004)。B-Raf中的癌基因突变将导致激酶功能被获得(gain-of-kinase-function)，从而导致在典型生长因子缺乏情况下Raf-MEK-ERK途径的组成性激活。该组成性激活与转移性黑素瘤预后较差相关(Houbenetal.，2004，supra)。BRAF中的激活突变在多种恶性肿瘤中已有报道。例如，BRAF中的突变在多达70％的人黑素瘤病例中被发现。外显子15第600密码子核苷酸位置1799的单碱基突变(T>A)，导致缬氨酸至谷氨酸取代(V600E)，该取代在85％以上的具有B-Raf中的突变的黑素瘤中存在(Daviesetal.，Nature417：949-954，2002；Gamett andMarais，CancerCell6：313-319，2004；Gray-Schopfer et al.，Cancer Metastasis Rev.24：165-183，2005；Houben et al.，2004)。不太常见的是，V600E突变由核苷酸位置1799-1800的两碱基突变TG>AA产生(Houben et al.，J Carcinog，3：6，2004)。

许多激酶抑制剂是已知的，包括抑制B-Raf的那些抑制剂。这样的抑制剂包括PLX4032，其选择性抑制B-RafV600E激酶活性。本发明提供了鉴定V600E-阳性患者以选择用于采用B-Raf激酶抑制剂，例如PLX4032进行的治疗的方法。

发明内容

本发明提供了对可用B-Raf激酶抑制剂进行治疗的候选患者进行检测的方法和组合物。因此，一方面，本发明提供了鉴定癌细胞对B-Raf抑制剂敏感性的方法，该方法包括：(i)提供来自癌症患者的癌细胞的核酸样品；(ii)用扩增靶多核苷酸序列的引物对，对核酸样品中的靶多核苷酸序列进行扩增，其中所述靶多核苷酸序列包括BRAF中的V600E突变位点，并且所述扩增在标记的寡核苷酸探针存在下进行，其中所述标记的寡核苷酸探针包括SEQ IDNO：1所示序列的至少15个毗连的(contiguous)核苷酸，其检测BRAF中V600E突变位点上的突变序列的存在；以及(iii)检测BRAF中V600E突变是否存在；由此确定该癌症对B-Raf抑制剂的敏感性。在某些实施方式中，探针具有如SEQ IDNO：1所示的核苷酸序列。扩增可以在第二探针存在的情况下进行，所述第二探针检测在V600E突变位点的野生型序列的存在。在某些实施方式中，第二探针包括SEQ ID NO：2的至少15个核苷酸。在某些实施方式中，第二探针具有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。在某些实施方式中，探针可以用荧光标记予以标记。探针也可以用两种标记予以标记，其中一种标记为荧光染料，另一种标记则为淬灭部分。

在某些实施方式中，用于扩增反应的引物对的两个引物，都与BRAF的外显子15杂交。在某些实施方式中，用于扩增反应的引物对中的一个引物，包括SEQ ID NO：3所示核苷酸序列的至少15个毗连的核苷酸，例如引物对中的一个引物具有SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。在进一步的实施方式中，引物对中的一个引物包括SEQ ID NO：4所示核苷酸序列的至少15个毗连的核苷酸。例如，该引物可具有SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列。在进一步的实施方式中，用于扩增的引物对包括具有SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示核苷酸序列的引物。

在某些实施方式中，扩增反应步骤包括RT-PCR。

本方法可用于检测在B-Raf氨基酸位置600上具有突变，例如V600E突变的癌症。在某些实施方式中，癌症为黑素瘤。在其他实施方式中，癌症为结肠癌或甲状腺癌。在某些实施方式中，用于本发明方法以检测突变的核酸样品可获自皮肤活检。在其他实施方式中，样品获自结肠活检。样品也可获自石蜡-包埋组织。本发明方法可进一步包括记录这样的诊断：患者对B-Raf抑制剂敏感，例如突变体特异性B-Raf抑制剂如PLX4032。在某些实施方式中，本方法进一步包括对患者给予B-Raf抑制剂。B-Raf抑制剂可以是突变体特异性B-Raf抑制剂(mutant specific B-Rafinhibitor)，如PLX4032。

在另一方面，本发明提供了PLX4032治疗候选患者的鉴定方法，该方法包括：提供获自个体(subject)的样品；从样品中检测含BRAF V600E突变的生物分子，从而鉴定PLX4032治疗候选患者。在某些实施方式中，所述生物分子是核酸。在其他实施方式中，生物分子是多肽。多肽可以获自例如来自患者的含癌细胞的样品。在某些实施方式中，多肽可用免疫分析进行检测。该方法也包括将PLX4032给药至所述个体。

在另一方面，本发明提供了检测用B-Raf抑制剂治疗的候选患者的试剂盒，其中所述试剂盒包括第一等位基因特异性探针，其中所述第一探针检测BRAF中的V600E突变，并且其包含SEQ ID NO：1所示序列的至少15个毗连的核苷酸。在某些实施方式中，所述探针具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。本发明试剂盒可进一步包括第二等位基因特异性探针，其中所述第二探针检测野生型BRAF序列，并且其包含SEQ ID NO：2所示核苷酸序列的至少15个毗连的核苷酸。在某些实施方式中，第二探针具有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。

在进一步实施方式中，本发明试剂盒进一步包括扩增含V600E突变位点的BRAF靶区域的引物对。例如，引物对可以包括含有SEQ ID NO：3所示核苷酸序列至少15个毗连核苷酸的引物。在某些方面，引物具有SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。在其他实施方式中，引物对可以包括含有SEQ ID NO：3和SEQID NO：4所示核苷酸序列的至少15个毗连核苷酸的引物。在某些实施方式中，引物对包括具有SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示核苷酸序列的引物。

因此，在某些实施方式中，本发明的试剂盒包括：具有SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的探针；具有SEQ ID NO：2所示核苷酸序列的探针；具有SEQ IDNO：3所示核苷酸序列的引物；和具有SEQ ID NO：4所示核苷酸序列的引物。

附图说明

图1显示了B-RafV600E扩增子(SEQ ID NO：5)与染色体X相应区(SEQID NO：6)的比对。B-RafV600E引物位置以箭头显示。扩增子包括外显子15(大写字母)和内含子15(小写字母)的部分。垂直连接线表示BRAF和染色体X序列同一性的位置。密码子600被框起来；GTG对应缬氨酸(V)。探针结合区以阴影高亮显示；突变(MU)探针比野生型(WT)探针要长两个核苷酸(在高亮区的5’-CT)，两个探针都结合此处所示序列的互补序列。

图2显示了围绕编码子600(箭头)的B-Raf外显子15区(SEQ ID NO：7)与A-Raf(SEQ ID NO：8)和C-Raf(SEQ ID NO：9)同源区的比对。星号标示了相对B-Raf序列的氨基酸差异(例如，Mercer&Pritchard，Biochim BiophysActa1653：25-40，2003)。

图3显示了B-RafV600E扩增子(SEQ ID NO：5)与ARAF(编码A-Raf)(SEQ ID NO：11)和RAFl(编码C-Raf)(SEQ ID NO：10)基因相应序列的比对。小写核苷酸不同于BRAF序列。

具体实施方式

定义

在本申请上下文中，“V600E”是指BRAF中的突变(在核苷酸位置1799T>A的突变)，其在B-Raf氨基酸位置600导致谷氨酰胺取代缬氨酸。“V600E”在先前计数系统中，也称为“V599E”(1796T>A)(Kumar et al.，Clin.Cancer Res.9：3362-3368，2003)。

在本发明上下文中，“B-Raf激酶抑制剂”抑制B-Raf激酶的活性。这样的抑制剂也可抑制包括其他raf激酶在内的其他激酶的活性。

用在本文中的“突变体特异性B-Raf激酶抑制剂(mutant-specific B-Rafkinase inhibitor)”，是指对突变体B-Raf，例如与野生型B-Raf相比在氨基酸位置600有缬氨酸残基上的突变如V600E突变的突变体B-Raf，有选择性的B-Raf抑制剂。与野生型相比，这样的抑制剂对突变体B-Raf，例如具有V600E突变的B-Raf，有至少两倍、更通常至少三倍、或者更多倍数的抑制效能。例如，在某些实施方式中，“突变体特异性B-Raf抑制剂”对V600E B-Raf有约30nM的激酶抑制活性IC₅₀(生化分析)，而对野生型B-Raf的相应IC₅₀约为100nM。效能也可根据细胞分析的IC₅₀值进行比较，例如对生长抑制进行测量的细胞分析。本发明内容中的“突变体特异性B-Raf抑制剂”，也可抑制除B-Raf之外的激酶，例如其他的raf激酶。

术语“杂交”是指因互补碱基配对而由两个单链核酸形成双链结构。杂交可以在完全互补的核酸链之间形成，也可以在含少量错配区域的核酸链之间形成。在本文中，术语“基本上互补”是指除少量错配区域外互补的序列。典型地，对长度约15个核苷酸的序列，杂交区错配的核苷酸总数不超过3个核苷酸。仅允许完全互补的核酸链杂交的条件，被称为“严谨”或“序列特异性”的杂交条件。基本上互补核酸的稳定双链，可在严谨度更低的杂交条件下取得。核酸技术领域的技术人员，可以从经验上考虑多种可变因素，包括例如寡核苷酸的长度和碱基对浓度，离子强度，以及错配碱基对的存在频率，来确定双链的稳定性。例如，计算双链稳定性的计算机软件，可从National Biosciences，Inc.(Plymouth，Minn.)商业获得，例如OLIGO第5版；或者从DNA Software(AnnArbor，Michigan)商业获得，例如Visual OMP6。

允许寡核苷酸仅与完全互补靶序列杂交的严谨的序列特异性的杂交条件是本领域公知的(参见例如，常规参考内容提供在检测核酸序列多态性的部分)。严谨条件是序列依赖性的并且随着情况不同而不同。通常，严谨条件选择为在确定离子强度和pH值下，低于特定序列热熔点(thermal melting point)(Tm)约5℃。Tm是50％碱基对解离的温度(在所确定的离子强度和pH下)。对杂交条件的严谨程度进行放松，将允许容忍序列错配；容忍的错配程度，可通过适当调整杂交条件来调控。

术语“引物”是指在诱导与核酸链互补的引物延伸产物的合成的条件下，即，在合适的温度下、在合适的缓冲液中、在存在四种不同核苷三磷酸和聚合剂(即DNA聚合酶或逆转录酶)的情况下，作为DNA合成的引发位点的寡核苷酸。引物优选是单链的寡脱氧核糖核苷酸。引物包括完全或基本上与靶序列互补的“杂交区”，其长度优选大约15个至约35个核苷酸。引物寡核苷酸可以完全由杂交区组成，或者可以包括允许扩增产物检测、固定或操作、但不改变该引物作为DNA合成起始物质的能力的其他特征。例如，核酸序列尾可包括在杂交俘获寡核苷酸的引物的5’端。

用在本文中的“等位基因特异性”引物，是指这样的引物，其与靶序列杂交由此所述引物的3’端，通常为3’核苷酸与感兴趣的位点对准，例如核苷酸1799——BRAF密码子600的第二位置，在该感兴趣的位点，与野生型等位基因或者与突变型等位基因完全互补。在本文中，引物，对在3’端例如3’核苷酸或末端倒数第二个核苷酸，与其完全互补的等位基因具有“特异性”。通常，当引物3’端出现错配时，引物延伸被抑制。等位基因特异性引物，当杂交于完全互补的等位基因时，将以更大效率延伸。同样的引物，当杂交于其他等位基因时，由于杂交双链中引物3’端的错配，例如3’核苷酸或3’端倒数第二个核苷酸的错配，而不能很容易地延伸。因此，基于形成的不同延伸产物，使用等位基因特异性引物可区别等位基因。

术语“探针”是指在合适条件下，选择性杂交靶核酸的寡核苷酸。

“等位基因特异性”探针包含与靶序列完全或基本上互补的“杂交区”，其在感兴趣的位点处与靶序列完全互补，例如在BRAF密码子600的核苷酸位置1799处。因此，例如V600E等位基因特异性探针选择性检测V600E突变序列，而野生型BRAF等位基因特异性探针选择性检测野生型序列。在充分严谨的杂交条件下，用探针进行杂交分析，可选择性地检测包含感兴趣的位点的特定靶序列。探针杂交区，优选长度为约10个-约35个核苷酸，更优选长度为约15个-约35个核苷酸。使用本领域公知的、能影响杂交稳定性的修饰碱基或碱基类似物，可以实现使用更短或更长的具有可比较的稳定性的探针。探针寡核苷酸可以完全由杂交区组成，也可以包含允许探针的检测或固定、但不显著改变其杂交区杂交特性的其他特征。

术语“靶序列”或“靶区域”是指待分析并且包含感兴趣的多态性位点的核酸区域。

在本文中，术语“核酸”，“多核苷酸”和“寡核苷酸”是指引物，探针，和寡聚物片段。这些术语不受长度限制，通常为多脱氧核糖核苷酸(包含2-脱氧-D-核糖)，多核糖核苷酸(包含D-核糖)，以及嘌呤或嘧啶碱基或者修饰的嘌呤或嘧啶碱基的任何其他N-糖苷的线性聚合物。这些术语包括双链和单链DNA，以及双链和单链的RNA。本发明的寡核苷酸可用作引物和/或探针。

核酸，多核苷酸或寡核苷酸，可以包括磷酸二酯键或各种修饰的键，其包括但不限于磷酸三酯键，磷酸酰胺键，硅氧烷键(siloxane)，碳酸酯键，羧基甲基酯键，乙酰胺键，氨基甲酸键，硫醚键，桥接磷酸酰胺键，桥接亚甲基磷酸键，硫代磷酸酯键，甲基磷酸酯键，二硫代磷酸酯键(phosphorodithioate)，桥接硫代磷酸酯键，或者砜键，以及上述各种键的组合。

核酸，多核苷酸或寡核苷酸，可以包括五种生物形成碱基(腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和尿嘧啶)和/或除这五种生物形成碱基以外的其他碱基。这些碱基可用于多种目的，例如用于稳定或去稳定杂交；用于促进或抑制探针的降解；或者作为检测部分或淬灭部分的连接位点。例如，本发明的多核苷酸可以包含一种或多种修饰的、非标准的、或衍生化的碱基部分，包括但不限于，N6-甲基-腺嘌呤，N6-叔丁基-苯甲基-腺嘌呤，咪唑，取代的咪唑，5-氟尿嘧啶，5-溴尿嘧啶，5-氯尿嘧啶，5-碘尿嘧啶，次黄嘌呤，黄嘌呤，4-乙酰胞嘧啶，5-(羧基羟甲基)尿嘧啶，5-羧甲基氨基甲基-2-硫尿苷，5-羧甲基氨基甲基尿嘧啶，二氢尿嘧啶，β-D-半乳糖基Q核苷(beta-D-galactosylqueosine)，肌苷，N6-异戊烯基腺嘌呤，1-甲基鸟嘌呤，1-甲基肌苷，2，2-二甲基鸟嘌呤，2-甲基腺嘌呤，2-甲基鸟嘌呤，3-甲基胞嘧啶，5-甲基胞嘧啶，N6-甲基腺嘌呤，7-甲基鸟嘌呤，5-甲基氨甲基尿嘧啶，5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶，βD-甘露糖基Q核苷(beta-D mannosylqueosine)，5’-甲氧基羧甲基尿嘧啶，5-甲氧基尿嘧啶，2-甲基硫-N6-异戊烯基腺嘌呤，尿嘧啶-5-氧乙酸(v)，wybutoxosine，假尿嘧啶，Q核苷(queosine)，2-硫胞嘧啶，5-甲基-2-硫尿嘧啶，2-硫尿嘧啶，4-硫尿嘧啶，5-甲基尿嘧啶，尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯，3-(3-氨基-3-N-2-羧丙基)尿嘧啶，(acp3)w，2，6-二氨基嘌呤，以及5-丙炔基嘧啶。其他修饰的、非标准的、或衍生化的碱基部分的实例，可见于美国专利号6,001,611；5,955,589；5,844,106；5,789,562；5,750,343；5,728,525；和5,679,785。

此外，核酸，多核苷酸或寡核苷酸，可以包括一种或多种修饰的糖部分，包括但不限于阿拉伯糖，2-氟阿拉伯糖，木酮糖，和己糖。

介绍

本发明提供了在筛选癌症患者中应用的V600E诊断分析方法，所述癌症患者例如黑素癌患者、结肠癌患者、甲状腺癌患者、以及低级浆性卵巢癌患者，他们为B-Raf抑制剂，例如选择性的突变体B-Raf抑制剂，如PLX4032治疗的候选对象。因此，该诊断试验可根据患者对PLX4032治疗应答的概率来归类患者。

典型地，使用包括确定外显子15密码子600中核苷酸位置1799上的单碱基突变(T>A)是否存在的方法，对V600E突变(也称为V599E(1796T>A))进行检测。该突变也可由核苷酸位置1799-1800的两碱基突变TG>AA产生。两碱基突变也可由评估位点1799来检测。在某些实施方式中，核酸也可由位置1800上是否存在取代来评估。

其他的突变也可在密码子600处发生。这些突变包括V600K，V600D，和V600R。在某些实施方式中，检测V600E突变的探针，也可用于检测其他密码子600的突变，例如V600D，V600K和/或V600R。在某些实施方式中，探针也可对密码子601上的突变进行检测。

V600E突变是否存在，典型地，通过评估核酸，例如基因组DNA或mRNA，在位置1799处是否存在碱基取代而确定。可以使用多种分析方法。在某些实施方案中，分析方法是5’核酸酶分析。

V600E也可通过检测突变的V600E B-Raf是否存在，例如使用免疫分析，来进行检测。

V600E存在，表示该患者为B-Raf抑制剂，例如突变体特异性B-Raf抑制剂的治疗候选对象。因此，本发明也包括已确定具有V600E突变的患者，用B-Raf抑制剂，例如突变体特异性B-Raf抑制剂如PLX4032治疗的方法。

生物样品

V600E突变可在多种癌症中检测到，包括黑素瘤；结肠直肠癌；甲状腺癌，例如乳突甲状腺癌；以及卵巢癌，例如低级浆性癌。在某些实施方式中，V600E突变可在肺癌，神经胶质瘤，前列腺癌，乳腺癌，肉瘤，肝癌，垂体癌，以及发生在大肠、胆管、眼睛、胰腺、胃、中枢神经系统、造血以及淋巴组织的癌中检测到。

V600E突变在患者的生物样品中检测。生物样品典型地包括癌细胞。例如，样品可以是诸如恶性黑素细胞瘤、结肠直肠瘤、或甲状腺瘤的肿瘤活检样品；或者可以是来自转移部位的组织样品。在其他的实施方式中，生物样品可以是血或另一种包括癌细胞的流体。在其他的实施方式中，生物样品可以包括循环(无细胞)的核酸。

突变通常在获自生物样品的核酸中进行检测。被评估突变是否存在的核酸，可以是RNA或DNA。在某些实施方式中，突变在基因组DNA中进行检测。

生物样品可用本领域多种方法中任意一种来获得。此外，生物样品可用固定试剂，例如甲醛处理，并用石蜡包埋、切片使用。可选地，可用新鲜或冷冻组织。在其他实施方式中，可用细针抽吸物。

核酸序列中的V600E突变的检测

评估核酸是否存在V600E突变的检测技术，涉及分子遗传学领域公知的操作步骤。而且，多种方法涉及核酸的扩增。在本领域中提供有进行这些方法的大量指导。示例性的参考文献包括操作手册例如PCR Technology：Principles and Applications forDNA Amplification(ed.H.A.Erlich，Freeman Press，NY，N.Y.，1992)；PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications(eds.Innis，et al.，Academic Press，San Diego，Calif.，1990)；Current Protocols in Molecular Biology，Ausubel，1994-1999，包括直至2004年4月的补充更新内容；Sambrook & Russell，Molecular cloning，A Laboratory Manual(3rd Ed，2001)。

虽然本方法通常利用PCR步骤，但其他扩增方法也可使用。合适的扩增方法包括，连接酶链反应(参见例如Wu&Wallace，Genomics4：560-569，1988)；链替换分析(参见例如Walkeretal.，Proc Natl.Acad.Sci.USA89：392-396，1992；U.S.Pat.No.5,455,166)；和多种基于转录的扩增系统，包括美国专利号5,437,990，5,409,818和5,399,491中记载的方法，转录扩增系统(TAS)(Kwohetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86：1173-1177，1989)以及自维持序列复制(self-sustained sequence replication)(3SR)(Guatelli et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA87：1874-1878，1990；WO92/08800)。备选地，可以使用扩增探针至可检测水平的方法，例如Qβ-复制酶扩增(Kramer&Lizardi，Nature339：401-402，1989；Lomeli et al.，Clin.Chem.35：1826-1831，1989)。例如，Abramson和Myers在Current Opinion in Biotechnology4：41-47，1993中，提供了现有已知扩增方法的综述。

典型地，V600E的检测通过在含寡核苷酸引物和/或探针的分析试验中，评估来自患者的核酸而进行。寡核苷酸可以用任何合适的方法制备，通常为化学合成。寡核苷酸可以使用商业可获得的试剂和仪器合成。可选地，寡核苷酸可通过商业来源购买。合成寡核苷酸的方法是本领域公知的(参见例如Narangetal.，Meth.Enzymol.68：90-99，1979；Brown et al.，Meth.Enzymol.68：109-151，1979；Beaucage et al.，Tetrahedron Lett.22：1859-1862，1981；以及美国专利号4,458,066中公开的固相支持法)。此外，对上述所记载的合成方法进行修饰，可用于理想地影响酶对合成的寡核苷酸的行为。例如，在寡核苷酸中整合入修饰的磷酸二酯键(例如硫代磷酸酯键，甲基磷酸酯键，磷酸酰胺键，或硼磷酸酯键)或除磷酸衍生物以外的其他键，可用于阻止所选位点处的裂解。此外，使用2’-氨基修饰的糖倾向于使所述寡核苷酸在与作为新核酸链合成模板的核酸相杂交时，有利于被替换而不是被酶切(In addition，the use of2’-amino modifiedsugars tends to favor displacement over digestion of the oligonucleotide whenhybridized to a nucleic acid that is also the template for synthesis of a new nucleic acidstrand.)。

在核酸水平上检测V600E突变的大多数分析方法需要采用下列几种常用方法中的一种：用等位基因特异性寡核苷酸的杂交，引物延伸，等位基因特异性连接，测序，或者电泳分离技术，例如单链构象多态(SSCP)及异源双链分析。示例性的分析方法包括5’核酸酶分析，模板指导的染料-终止子整合，分子信标等位基因特异性寡核苷酸分析，单碱基延伸分析，以及使用实时焦磷酸测序的突变分析。对扩增序列的分析可用多种技术进行，例如微芯片，荧光偏振分析，以及基质辅助激光脱附电离(MALDI)质谱。可用的其他两种方法为，基于Flap核酸酶侵袭裂解的分析法和利用扣锁探针(padlock probes)的分析方法。

确定V600E等位基因的存在与否，通常通过分析获自含待分析患者癌细胞的生物样本的核酸样品而进行。通常，核酸样品包括基因组DNA。基因组DNA通常获自肿瘤样本，但也可获自其他细胞或组织，例如获自转移部位或血液。

待分析的核酸样品也可以是RNA。例如，可以分析来自生物样本的mRNA，来确定V600E突变是否存在。核酸样品获自表达靶核酸的细胞，例如获自原发肿瘤或转移部位的组织。这样的分析可以通过例如使用病毒逆转录酶，先逆转录靶RNA然后扩增所获得的cDNA而进行；或者使用联合高温逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)而进行，该方法记载在美国专利号5,310,652；5,322,770；5,561,058；5,641,864；和5,693,517中。

上文简单介绍了分析核酸样品以检测核苷酸替换的常用方法。然而，本领域已知的任何方法，都可用于本发明以检测核苷酸替换是否存在。

等位基因特异性探针

等位基因特异性杂交依赖于区分差别至少一个碱基的两种DNA分子，这是通过将对某变异序列特异的寡核苷酸与获自扩增核酸样品的扩增产物进行杂交而进行的。等位基因特异性分析也可包括两种等位基因特异性寡核苷酸，例如针对第一种变体的等位基因特异性探针和针对第二种变体的等位基因特异性探针，其中相对于另一变体而言，所述探针可区分地与一种变体杂交。等位基因特异性杂交通常采用短的寡核苷酸，例如长度为15-35个核苷酸的寡核苷酸。设计这些探针的原则和指导可在本领域，例如本文所引用的参考文献中获得。杂交条件应该足够严谨，以使等位基因在杂交强度上有显著区别，杂交条件优选为基本二元反应，由此探针仅与等位基因其中之一杂交。某些探针被设计为与靶DNA片段进行杂交，以致感兴趣的位点即BRAF外显子15密码子600的核苷酸位置1799与探针的中心位置进行比对(例如在15碱基寡核苷酸中的第7位置；在16碱基寡核苷酸中的第8或第9位置)，但是该设计并不是必需的。

等位基因的数量和/或是否存在通过测量与样品杂交的等位基因特异性探针的数量来确定。典型地，寡核苷酸用某种标签，例如荧光标签进行标记。例如，在可导致优先杂交等位基因的杂交条件下，将对V600E核苷酸取代特异的等位基因特异性探针，与获自生物样品的核酸进行杂交。测定荧光强度以确定该特异性寡核苷酸是否已杂交。

在一个实施方式中，用与含V600E突变位点的突变(或野生型)BRAF序列完全互补的寡核苷酸探针，在序列特异性杂交条件下通过杂交来鉴定V600E位置出现的核苷酸。选择探针杂交序列和序列特异性杂交条件，以使突变位点的单个错配导致杂交双链体不稳定，足以使双链不能有效形成。因此，在序列特异性杂交条件下，仅在探针与完全互补的等位基因序列之间能形成稳定双链体。因此，与含突变位点的区域的等位基因序列完全互补的，长度约10个-约35个核苷酸的寡核苷酸，优选长度约15个-约35个核苷酸的寡核苷酸，在本发明的范围内。

在可选的实施方式中，在足够严谨的杂交条件下，用在包含突变位点的区域处，与突变型或野生型等位基因基本上互补并且在突变位点处与该等位基因完全互补的寡核苷酸，通过杂交来鉴定突变位点出现的核苷酸。因为在非突变位点中存在错配，在两种等位基因序列中都存在错配，所以此时，与靶等位基因序列形成的双链体和与相应非靶等位基因序列形成的双链体在错配数量上的差异，与使用与靶等位基因序列完全互补的寡核苷酸时的情况相同。在该实施方式中，杂交条件被放宽，足以允许与靶序列形成稳定的双链体，同时保持足够的严谨度以排除与非靶序列形成稳定双链体。在该足够严谨的杂交条件下，稳定的双链体将仅在探针与靶等位基因之间形成。因此，在包含突变位点的区域处，与等位基因序列基本上互补、并且在突变位点处与该等位基因序列完全互补的，长度约10个-约35个核苷酸的寡核苷酸，优选长度约15个-约35个核苷酸的寡核苷酸，在本发明的范围内。

在杂交条件优化被限制的试验模式下，使用基本上互补的寡核苷酸，而不是完全互补的寡核苷酸可能是令人期待的。例如，在多靶固定探针试验模式中，各靶的探针被固定于单一固相支持物。杂交通过将固相支持物与含靶DNA的溶液接触而同时展开。当所有杂交在相同的条件下进行时，杂交条件不能独立地对各每种探针进行优化。在该试验模式阻止调整杂交条件的情况下，在探针中引入错配可用于调整双链体的稳定性。引入的特定错配对双链体稳定性的效果是公知的，双链体的稳定性可如上所述的常规估算和经验确定。合适的杂交条件，取决于探针的实际大小和序列，可用本领域公知的以及本文提供的指导经验性选择。使用寡核苷酸探针检测序列的单碱基对差异，在例如Conneretal.，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.USA80：278-282和美国专利号5,468,613和5,604,099中有描述。

完全匹配与单碱基错配杂交双链体之间的稳定性改变比例，取决于杂交寡核苷酸的长度。形成双链的探针序列越短，错配存在导致不稳定的比例就越高。在实践中，长度约15个核苷酸到约35个核苷酸的寡核苷酸，是序列特异检测优选的。此外，由于杂交寡核苷酸末端因热能而经历连续随机的解离与退火，所以，在任一末端的错配所导致的杂交双链的不稳定性，要低于序列内部发生的错配。优选地，为区分靶序列的单碱基配对改变，应选择杂交靶序列以致突变位点形成于探针内部区域的探针序列。

选择与BRAF杂交的探针序列的上述标准，也适用于探针的杂交区，即涉及与靶序列杂交的探针部分。探针可结合有不显著改变探针杂交特性的额外核酸序列，例如用于固定探针的聚-T尾。本领域技术人员会意识到，为用于本发明方法，结合有与靶序列不互补由此不涉及杂交的额外核酸序列的探针，基本上等同于未结合额外序列的探针。

5’-核酸酶分析

在某些实施方式中，用″

″或″5’-核酸酶分析″评估核酸样品中是否存在V600E突变，该分析方法在美国专利号5,210,015；5,487,972；和5,804,375；和Holland et al.，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA88：7276-7280中有记载。在

Figure 2008101737452100002G2008101737452D0012075849QIETU

分析中，在扩增反应中存在有与扩增区杂交的标记的检测探针。探针被修饰，以阻止探针作为DNA合成的引物。用具有5’至3’外切核酸酶活性的DNA聚合酶进行扩增。在每个扩增合成步骤中，在延伸引物下游与靶核酸杂交的任一探针，都将被DNA聚合酶的5’至3’外切核酸酶活性降解。因此，新靶链的合成，也将导致探针的降解，由此，降解产物的累积提供了靶序列合成的检测手段。

在分析中使用的杂交探针，可以是在V600E突变位点处区分BRAF突变型和野生型等位基因的等位基因特异性探针。可选地，该方法可用等位基因特异性引物和结合扩增产物的标记探针进行。

适于检测降解产物的任何方法都可用于5’核酸酶分析。通常，检测探针用两种荧光染料标记，其中一种荧光染料能淬灭另一种荧光染料的荧光。染料附着于探针，优选一个附着在5’端而另一个附着在内部位点，使得当探针处于未杂交状态时发生淬灭，并且DNA聚合酶的5’到3’外切核酸酶活性对探针的切割发生在两种染料之间。扩增导致探针在染料间断裂，由此伴随产生淬灭消失以及来自初始淬灭的染料的可观察到的荧光增加。降解产物的积累通过检测反应荧光的增加来监测。美国专利号5,491,063和5,571,673记载了伴随扩增所发生探针降解的其他检测方法。

在一个实施方式中，用于评估患者样品中是否存在BRAF V600E突变的5’核酸酶分析，用下列引物或者与下列引物基本相同的序列进行：

TTS068-BRAF_F1：5’CCTCACAGTAAAAATAGGTGATTTTGGTCTE3’(E＝t-丁基苯甲基dA)(SEQ ID NO：25)

RL_BRAF_R5：5’TAGCCTCAATTCTTACCATCCACAAAA3’(SEQ IDNO：4)

与引物序列基本上相同的序列，包括与相同互补序列杂交的那些序列。因此，在某些实施方式中，用于本发明的引物序列包括TTS068-BRAF_F1或RL_BRAF_R5的至少15个毗连的核苷酸，有时至少16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，或26个毗连的核苷酸。在某些实施方式中，引物具有TTS068-BRAF_F1至少27，28，29，或30个毗连的核苷酸。在其他的实施方式中，用于本发明的引物与TTS068-BRAF_F1或RL_BRAF_R5具有至少80％的同一性，在某些实施方式中，具有至少85％的同一性，在其他实施方式中，具有至少90％或更高的同一性。在某些实施方式中，正向引物为TTS068-BRAF_F1，反向引物为允许区分X染色体假基因、但不与RL_BRAF_R5交叠或者与RL_BRAF_R5交叠少于10个碱基对的引物。在某些实施方式中，反向引物可以结合包括RL_BRAF_R5结合位点下游20个核苷酸或更少核苷酸的位点。例如，也可利用下列序列的反向引物：

5’AAATAGC CTC AAT TCT TAC CAT CCA CAAAA3’(SEQ ID NO：12)

5’TAG CCT CAA TTC TTA CCA TCC ACAAAA3’(SEQ ID NO：13)

5’TAG CCT CAA TTC TTA CCA TCC ACA AAE3’(SEQ ID NO：14)

5’AGG GCC AAA AAT TTA ATC AGT GGA AAA A3’(SEQ ID NO：15)

5’CAG TGG AAA AAT AGC CTC AAT TCT TAC CA3’(SEQ ID NO：16)

在某些实施方式中，正向引物可以结合包括BRAF_F1结合位点上游20个碱基的位点。在某些实施方式中，正向引物可以是：

5’TTTCTTCATGAAGACCTCACAGTAAAAATE3’(SEQ ID NO：17)；或

5’ATATATTTCTTCATGAAGACCTCACAGTAAE3’(SEQ ID NO：18)。

V600E突变在RNA为起始模板的情况下，也可被检测。这样的分析检测可以包括反向引物，例如含下列序列的引物：

5’ATG ACT TCT GGT GCC ATC CAC AA3’(SEQ ID NO：19)。

可使用的其他反向引物包括：

5’AAA AAT AGC CTC AAT TCT TAC CAT CCA CAA AA3’(SEQ ID NO：20)；

5’GCC ATC CAC AAA ATG GAT CCA GAC A3’(SEQ ID NO：21)；或者

5’CAA AAT GGA TCC AGA CAA CTG TTC AAA3’(SEQ ID NO：22)。

在本发明的一个实施方式中，用下列一个或两个等位基因特异性探针，进行5’核酸酶分析，所述探针用于检测突变型(TTS155-BRAF_MU)或野生型(TTS148-BRAF_WTs)序列：

TTS155-BRAF_MU5’QCTACAIAIFAAATCTCGATGGAGTGGGTCCCAP3’(SEQ ID NO：23)

TTS148-BRAF_WT5’QACAITGEAAATCTCGATGGAGTGGGTCCCAP3’(SEQ ID NO：24)

(E＝HEX报告染料，F＝FAM报告染料，I＝脱氧肌苷，Q＝BHQ2淬灭染料，P＝3’-磷酸)。将染料(F或E)插入dI和dA之间(TTS155-BRAF_MU)，或者dG和dA之间(TTS148-BRAF_WT)。

本领域可以理解，TTS155-BRAF_MU或TTS148-BRAF_WT探针也可以包括不同于上文所记载的修饰，例如特别的荧光染料，淬灭剂，和/或染料的位置。

在某些实施方式中，检测V600E的探针，例如TTS155-BRAF_MU，也可检测V600D(1799_1800TG>AT)和V600K(1798_1799GT>AA)。在某些实施方式中，检测V600E突变的探针，也检测K601E(1801A>G)和V600R(1798_1799GT>AG)。

在某些实施方式中，也可使用与探针序列基本上相同的序列。与探针序列基本上相同的序列，包括与所述探针的相同互补序列杂交的那些序列。因此，在某些实施方式中，用于本发明的探针序列包括TTS155-BRAF_MU或TTS148-BRAF_WT的至少15个毗连的核苷酸，有时至少16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，或30个毗连的核苷酸。在某些实施方式中，探针具有TTS155-BRAF_MU或TTS148-BRAF_WT的至少27，28，29，或30个毗连的核苷酸。在其他的实施方式中，用于本发明的探针与TTS155-BRAF_MU或TTS148-BRAF_WT具有至少80％的同一性，在某些实施方式中，具有至少85％的同一性，在其他实施方式中，具有至少90％或更高的同一性。

用于检测BRAF中的V600E突变的5’核酸酶分析，可使用具有5’至3’外切核酸酶活性的任何聚合酶。因此，在某些实施方式中，具有5’-核酸酶活性的聚合酶为热稳定且具有热活性的(thermoactive)核酸聚合酶。这样的热稳定聚合酶包括但不限于，来自真细菌属——嗜热菌(Thermus)，热袍菌(Thermatoga)和高温套管菌(Thermosipho)的多个物种的聚合酶的天然和重组形式、以及它们的嵌合形式。例如，可用于本发明方法的嗜热菌属(Thermus)物种的聚合酶，包括水生嗜热菌(Thermus aquaticus)(Taq)DNA聚合酶，极端嗜热菌(Thermusthermophilus)(Tth)DNA聚合酶，嗜热菌物种Z05(Z05)DNA聚合酶，嗜热菌物种sps17株(sps17)，以及嗜热菌物种Z05(Thermus species Z05)(例如记载在美国专利号5,405,774；5,352,600；5,079,352；4,889,818；5,466,591；5,618,711；5,674,738；和5,795,762中)。可用于本发明方法的热袍菌属(Thermatoga)的聚合酶包括，例如海栖热袍菌(Thermatoga maritima)DNA聚合酶和新阿波罗热袍菌(Thermatoga neapolitana)DNA聚合酶，可用于本发明的高温套管菌属(Thermosipho)的聚合酶的实例为，非洲高温套管菌(Thermosipho africanus)DNA聚合酶。海栖热袍菌(Thermatoga maritima)和非洲高温套管菌(Thermosiphoafricanus)的DNA聚合酶序列，公开在国际专利公开WO92/06200中。新阿波罗热袍菌(Thermatoga neapolitana)的序列，也可见于国际专利公开号WO97/09451中。

在5’核酸酶分析中，扩增检测通常与扩增同时发生(即“实时”)。在某些实施方式中，扩增检测是定量的，并且扩增检测是实时的。在某些实施方式中，扩增检测是定性的(例如终点检测靶核酸是否存在)。在某些实施方式中，扩增检测在扩增之后进行。在某些实施方式中，扩增检测是定性的，并且扩增检测在扩增之后进行。

探针可用任意数量的标签进行标记，典型地是荧光标记。在某些实施方式中，荧光团部分选自由荧光素家族染料，多卤荧光素家族染料(polyhalofluorescein-family dyes)，六氯荧光素家族染料，香豆素家族染料，若丹明家族染料，花青素家族染料，嗪类家族染料(oxazine-family dyes)，噻嗪类家族染料(thiazine-family dyes)，方酸家族染料(squaraine-family dyes)，鳌合的镧系家族染料，偶氮家族染料，三苯甲烷家族染料，和BODIPY

家族染料组成的组。

分析通常包括用荧光标记和淬灭部分标记的探针。在某些实施方式中，淬灭部分选自由荧光素家族染料，多卤素荧光素家族染料，六氯荧光素家族染料，香豆素家族染料，若丹明家族染料，花青素家族染料，嗪类家族染料，噻嗪类家族染料，方酸家族染料，鳌合的镧系家族染料，BODIPY

Figure 2008101737452100002G2008101737452D0016080002QIETU

家族染料，偶氮家族染料，三苯甲烷家族染料，低荧光淬灭部分(即“低暗供体(dim donors)”)，和非荧光淬灭部分(例如包括Black Hole Quenchers^TM(BHQ)在内的所谓“黑暗淬灭剂”)组成的组。

在一个实施方式中，荧光团部分为荧光素家族染料，淬灭部分为花青素家族染料。在一个实施方式中，荧光团部分为荧光素家族染料，淬灭部分为六氯荧光素家族染料。在一个实施方式中，荧光团部分为六氯荧光素家族染料，淬灭部分为花青素家族染料。在一个实施方式中，淬灭剂为黑暗淬灭剂，例如BHQ-1，BHQ-2，或BHQ-3(Biosearch Technologies，Novato，CA)。在一个实施方式中，荧光团部分为荧光素家族染料或花青素家族染料，淬灭部分为黑暗淬灭剂。

固定支持相

在某些实施方式中，等位基因特异性杂交在使用固定靶或固定的探针的分析模式中进行。这样的模式是本领域已知的，包括例如美国专利号5,310,893；5,451,512；5,468,613；和5,604,099中记载的点印记模式(dot-blot formats)、逆相点印记分析模式(reverse dot blot assay formats)。

等位基因特异性引物

V600E突变的存在与否，可用等位基因特异性扩增或引物延伸方法进行检测。这些反应典型地涉及利用这样的引物，其被设计以通过在引物3’末端，例如在3’核苷酸或3’倒数第二个核苷酸上的错配，特异性靶向突变(或野生型)位点。当聚合酶缺乏纠错活性时，错配的存在影响聚合酶对引物的延伸能力。例如，为了使用基于等位基因特异性扩增或延伸的方法来检测V600E突变序列，可以设计出在BRAF密码子600核苷酸位置1799上与突变A等位基因互补的引物，以使3’末端核苷酸在该突变位点处杂交。突变等位基因的存在，可由引物启动延伸的能力来确定。如果3’末端错配，延伸将被阻止。因此，例如，如果引物在3’末端与突变等位基因的核苷酸匹配，则该引物可有效延伸。扩增也可用在1799位置对BRAF野生型序列特异的等位基因特异性引物进行。

典型地，引物在扩增反应中可与第二引物联用。第二引物在与突变位点不相关的位点处杂交。扩增从两个引物进行，导致可显示特定等位基因形式存在的可检测产物。基于等位基因特异性扩增或延伸的方法，记载在例如WO93/22456；美国专利号5,137,806；5,595,890；5,639,611；和美国专利号4,851,331中。

利用基于等位基因特异性扩增的基因分型，等位基因的鉴定仅需检测扩增的靶序列是否存在。扩增的靶序列的检测方法是本领域公知的。例如，记载的凝胶电泳和探针杂交分析经常用于检测核酸是否存在。

在可选的无探针(probe-less)方法中，扩增核酸的检测通过监测反应混合物中双链DNA的总量增加而进行，该方法记载在例如美国专利号5,994,056；和欧洲专利公开号487,218和512,334中。双链靶DNA的检测依赖于各种DNA结合染料例如SYBR Green当结合双链DNA时显示的荧光增加。

本领域技术人员可以理解，等位基因特异性扩增方法可以在利用多个等位基因特异性引物靶向特定等位基因的反应中进行。这样的多重应用的引物，通常利用可区分标记进行标记，或者进行选择以使等位基因产生的扩增产物可通过大小进行区分。因此，例如，单一样品中的野生型和突变型V600E等位基因可利用单扩增反应通过扩增产物凝胶分析进行鉴定。

等位基因特异性的寡核苷酸引物，可在杂交区与等位基因之一完全互补，或者可在除3’端的寡核苷酸位置有某些错配。例如，倒数第二个3’核苷酸可在等位基因特异性寡核苷酸中存在错配。在其他的实施方式中，错配可发生在两个等位基因序列的多个(非突变)位点上。

其他V600E BRAF核酸突变检测方法

V600E突变的存在(或缺乏)，也可通过直接测序检测。这样的方法包括基于双脱氧测序的方法，和诸如寡核苷酸长度产物的焦磷酸测序^TM方法。这样的方法通常利用扩增技术，例如PCR。另一种类似的测序方法不需要利用完整的PCR，而典型地仅利用与被测核苷酸互补的单个荧光标记双脱氧核糖核酸分子(ddNTP)进行的引物延伸。多态性位点的核苷酸可通过检测已被延伸了一个碱基并进行了荧光标记的引物来鉴定(例如，Kobayashi et al，Mol.Cell.Probes，9：175-182，1995)。

用扩增反应产生的扩增产物，也可以利用变性梯度凝胶电泳进行分析。不同的等位基因可以基于不同的序列依赖熔解特性和DNA在溶液中的电泳迁移来鉴定(参见例如，Erlich，ed.，PCR Technology，Principles and Applications for DNAAmplification，W.H.Freeman and Co，New York，1992，Chapter 7)。

在其他的实施方式中，靶序列的等位基因可用单链构象多态性分析进行区分，所述多态性分析是通过单链PCR产物的电泳迁移变化的差异来鉴定碱基的差异，其例如记载在Orita et al.，Proc.Nat.Acad.Sci.86，2766-2770(1989)中。扩增PCR产物，可以通过如上记载的方法产生并加热或者以其他方式变性，以形成单链扩增产物。单链核酸可以重折叠或者形成部分依赖碱基序列的二级结构。单链扩增产物的不同电泳迁移可能与靶区等位基因间的序列差异相关。

用以检测BRAF V600E突变是否存在的方法，通常利用标记的寡核苷酸，例如，如上所述的荧光标记。寡核苷酸可以通过整合入可利用分光光度、光化学、生物化学、免疫化学、或化学方法检测的标签进行标记。有用的标记包括荧光染料，放射性标记，例如³²P，电子致密试剂(electron-dense reagents)，酶，诸如过氧化物酶或碱性磷酸酶，生物素，或者可以获得抗血清或单克隆抗体的半抗原和蛋白。标记技术是本领域公知的(参见例如，Current Protocols inMolecular Biology，supra；Sambrook & Russell，supra)。

蛋白变体的检测

B-RafV600E突变也可以通过区分野生型和突变型B-Raf的方法进行检测。通常，这些方法利用对突变B-Raf特异的抗体进行。

可应用技术的一般综述可见于Harlow & Lane，Antibodies：A LaboratoryManual(1988)和Harlow & Lane，Using Antibodies(1999)。制备与等位基因变体特异性反应的多克隆和单克隆抗体的方法是本领域技术人员已知的(参见例如，Coligan，Current Protocols in Immunology(1991)；Harlow & Lane，supra；Goding，Monoclonal Antibodies：Principles and Practice(2d ed 1986)；and Kohler &Milstein，Nature256：495-497(1975))。这样的技术包括，通过从噬菌体或类似载体的重组抗体文库中筛选抗体进行抗体制备，以及通过免疫兔或小鼠而对多克隆和单克隆抗体进行制备(参见例如Huse et al.，Science246：1275-1281(1989)；Ward et al.，Nature341：544-546(1989))。

突变B-Raf可用多种免疫分析方法进行检测。对免疫学和免疫分析方法的综述参见Basic and Clinical Immunology(Stites&Terr eds.，7th ed.1991)。而且，本发明的免疫分析可以几种构建方法中的任意一种进行，该构建方法在EnzymeImmunoassay(Maggio，ed.，1980)；和Harlow&Lane，supra中有详细综述。对常规免疫分析的综述，也可参见Methods in Cell Biology：Antibodies in CellBiology，volume37(Asai，ed.1993)；Basic and Clinical Immunology(Stites&Terr，eds.，7th ed.1991)。

通常使用的分析包括非竞争性分析例如三明治夹心分析和竞争性分析。典型地，可以使用诸如ELISA分析的分析。多肽变体的数量可通过进行定量分析来确定。

其他的检测技术，例如MALDI，可用于直接检测B-Raf中V600E是否存在。

分析样品获自来自患者的癌细胞，例如肿瘤组织。

治疗

突变检测方法可包括使用数据分析软件，所述软件基于B-RafV600E突变是否存在，来告知用户该患者是否应该用B-Raf抑制剂治疗，例如用突变体特异性的B-Raf抑制剂如PLX4032进行治疗。

被确定为氨基酸位置600突变存在、例如V600E突变存在的阳性患者，是用B-Raf激酶抑制剂治疗的候选对象，例如突变体特异性的B-Raf抑制剂如PLX4032。各种B-Raf激酶抑制剂，包括突变体特异性的B-Raf激酶抑制剂，已记载在例如WO2007/002325和WO2007/002433中。PLX4032在WO2007/002433和WO2007/002325中被称为“P-0956”。

B-Raf激酶抑制剂给药、例如突变体特异性的B-Raf激酶抑制剂给药的指导，可见于例如WO2007/002325和WO2007/002433中。合适的剂型部分依赖于其应用或给药途径，例如口腔给药，透皮给药，透粘膜给药，吸入给药，或注射给药(肠胃外给药)。这样的剂型应允许化合物到达靶细胞。其他因素是本领域公知的，包括考虑例如毒性和延缓化合物或组合物施加其效果的剂型。相关技术和制剂通常可见于The Science and Practice of Pharmacy，21^stedition，Lippincott，Williams and Wilkins，Philadelphia，PA，2005。

药物组合物可以包括载体或赋形剂。载体或赋形剂可被选择，用以辅助化合物的施用。载体的实例包括碳酸钙，磷酸钙，各种糖例如乳糖、葡萄糖、或蔗糖、或者多种淀粉、纤维素衍生物，明胶，植物油，聚乙二醇，以及生理上相容的溶剂。生理上相容的溶剂的实例包括注射用的无菌水溶液(WFI)，盐溶液，和葡萄糖溶液。

化合物可以通过不同途径给药，包括静脉内给药、腹膜内给药，皮下给药，肌内给药，口服给药，透粘膜给药，直肠给药，透皮给药，或吸入给药。在某些实施方式中，特异性B-Raf激酶抑制剂口服给药。对于口服给药，例如，化合物可制成常规的口服剂型，例如胶囊、片剂及液体制剂，如糖浆、酏剂、和浓缩的滴剂。

对于吸入剂，B-Raf抑制剂可制成干粉或合适的溶液、悬液、或气溶胶。粉剂和溶液可用本领域已知的合适添加剂制成。例如，粉剂可以包括合适的粉末基质，例如乳糖或淀粉，溶液可以包括丙二醇，无菌水，乙醇，氯化钠以及其他添加剂，例如酸、碱及缓冲盐。这样的溶液或悬液可通过喷射、泵入、喷雾器或雾化器等吸入给药。

可选地，B-Raf抑制剂可被注射(肠胃外给药)使用，例如肌内、静脉内、腹膜内、和/或皮下。对于注射而言，抑制剂可以在无菌液体溶液中制备，优选在生理相容的缓冲液或溶液中制备，例如盐溶液、Hank’s溶液、或Ringer’s溶液。此外，化合物可以制成固体形式，并在使用之前立即重新溶解或悬浮。也可以制成冷冻干燥形式。

给药也可以通过透粘膜、局部、或透皮方式进行。对于透粘膜、局部、或透皮给药而言，适合待渗透的屏障的渗透剂可用于制剂中。这样的渗透剂通常是本领域已知的，包括例如对透粘膜给药而言，胆汁盐和梭链孢酸(fusidic acid)衍生物。此外，去垢剂也可用于辅助渗透。透粘膜给药，例如可以通过鼻内喷射或栓剂(直肠或阴道)进行。本发明的局部组合物通过选择本领域已知的合适载体，优选制成油、乳膏剂、洗剂、软膏剂等等。合适的载体包括植物或矿物油，白矿脂(白软石蜡)，支链脂肪或油，动物脂肪，和高分子量醇。优选的载体为活性成分可溶于其中的载体。也可以包括乳化剂，稳定剂，湿润剂，和抗氧化剂，以及赋予颜色或香味的试剂，如果需要的话。局部应用的乳膏剂可以从矿物油、自乳化蜂蜡和水的混合物制备，其中在混合物中，将溶解于少量溶剂(例如油)的活性成分混入。此外，透皮方式给药可以包括透皮贴片或敷料，例如浸透活性成分以及任选地，本领域已知的一种或多种载体或稀释剂的绷带。如果以透皮递送系统形式给药，当然，剂量的给予在整个剂量方案中是连续性的而非间歇性的。

各种待给药化合物的量，可根据标准方法并考虑各种因素，例如化合物的IC₅₀，化合物的生物半衰期，个体的年龄、大小和体重，以及与个体相关的各种其他参数，来确定。这些及其他因素的重要性是本领域普通技术人员公知的。通常，剂量对待治疗个体来说在约0.01至50mg/kg之间，优选在0.1至20mg/kg之间。可以使用多剂量。

B-Raf抑制剂也可与其他癌症治疗法联合使用。

试剂盒

本发明也提供了包含对于实施本发明方法有用的成分的试剂盒。在某些实施方式中，试剂盒可以包含一种或多种对突变体或V600E等位基因特异的寡核苷酸探针。这样的试剂盒也可包含用于扩增涵盖V600E突变位点的BRAF座位区域的扩增引物。因此，在某些实施方式中，试剂盒可以包含用于扩增BRAF靶区域的引物组：

TTS068-BRAF_F1：5’CCTCACAGTAAAAATAGGTGATTTTGGTCTE3’(E＝t-丁基苯甲基dA)(SEQ ID NO：25)以及

RL_BRAF_R5：5’TAGCCTCAATTCTTACCATCCACAAAA3’(SEQ ID NO：4)。

试剂盒可以进一步包括探针，例如等位基因特异性探针。可用于本发明试剂盒的等位基因特异性探针的实例是：

TTS155-BRAF_MU5’QCTACAIAIFAAATCTCGATGGAGTGGGTCCCAP3’(SEQ ID NO：23)

TTS148-BRAF_WT5’QACAITGEAAATCTCGATGGAGTGGGTCCCAP3’(SEQ ID NO：24)。

试剂盒也可以包含与上述寡核苷酸基本上相同的引物和/或探针。在某些实施方式中，用于本发明的试剂盒包括含SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ IDNO：3，和/或SEQ ID NO：4核酸序列至少15个毗连核苷酸的一种或多种寡核苷酸。

试剂盒的其他任选成分包括用于确定核苷酸取代是否存在的其他试剂。例如，试剂盒可以包含聚合酶，用于扩增反应的底物核苷三磷酸和适宜的缓冲液，以及用于开展本发明方法的说明书(instructions)。其他的试剂盒成分可以包括DNA提取试剂和方案以及二价离子辅助因子。缓冲液可以包括例如UNG。在某些实施方式中，缓冲液可以包括适体。

试剂盒也可包括对照，例如V600E DNA对照。

实施例

B-RafV600E突变的检测

本实施例显示了基于实时PCR(聚合酶链反应)、用于测量基因组DNA中B-RafV600E突变(BRAF核苷酸1799T>A)的诊断测试，其中所述基因组DNA提取自福尔马林固定、石蜡包埋(FFPE)的癌肿瘤组织。在本实施例中，提取自FFPE组织的基因组DNA用TaqMan PCR分析进行检测。对PCR反应而言，超级混合物(Master Mix)是将TaqMan RNA反应混合物、引物-探针混合物和醋酸镁(Mg(OAc)₂)辅因子相组合而制备。用125ng的基因组DNA进行扩增。扩增产物用COBAS Taqman48分析仪进行检测。

将含外显子15中的B-RafV600E位点(BRAF1799T>A)的基因组区扩增，产生116个碱基对的双链DNA(扩增子)。扩增反应进行55个循环。扩增和检测系统通过测量来自靶特异性探针断裂所产生的荧光信号，来实时测量在每轮扩增循环中所产生的PCR产物的量。靶特异性的B-Raf野生型(WT；V600)和B-Raf V600E突变探针分别用不同的报告染料标记。波长特异性地测量每一个扩增循环期间这些报告染料发出的荧光，可允许鉴定单个反应管中的B-RafWT和V600E扩增子。一旦来自各报告染料的荧光信号达到预定阈值水平，则可对多重反应中的WT和V600E突变等位基因计算阈循环(cycle-to-threshold)(Ct)值。

BRAF引物被设计，用以扩增115个碱基对(bp)的BRAF外显子15区。采用the Human Genome March2006Assembly上的UCSC基因组浏览器BLAT工具(http://www.genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat？command＝start)，BRAF外显子15与明显的假基因染色体X(chrX)序列chrX：74721094-74721213具有93.4％的同源性。含BRAF内含子15的一部分的反向引物用于特异性地扩增所期望的BRAF序列。如图1所示，反向引物与染色体X序列仅具有55.6％(27个核苷酸中有15个)的同源性。BRAF引物-探针混合物中的探针，与该反向引物延伸所产生的扩增子链互补，从而进一步确保检测结果对BRAF序列的特异性。

引物用标准的脱氧核苷酸磷酰胺化物、二氰基咪唑(DCI)作为激活剂、并用标准合成循环(有较少修饰)、在常规3’至5’方向在固相控制孔玻璃(CPG)支持物上，于ABI394DNA合成仪(Applied Biosystems Inc.，Foster City，CA)上合成。将3’-t-丁基苯甲基dA作为修饰核苷导入，作为用作DNA合成固相支持物的CPG(Roche Applied Sciences，Penzberg，Germany)的一部分。在最后一个碱基增加后，将5’-二甲氧基三苯甲基(DMT)保护基团从合成仪中去除，寡核苷酸在55℃下用氨水去保护16小时。将粗制的寡核苷酸挥发以除去氨水，并在高pH、线性梯度氯化钠下，用Mono-Q HR16/10强阴离子交换高压液相色谱(HPLC)柱(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)纯化。级分用DNAPacPA100(Dionex Inc.，Sunnyvale，CA)离子交换柱分析，以>90％的最低纯度标准收集。将所收集的级分去盐，配制于10mM Tris，pH8.0中。下列引物被合成用于PCR反应：

TTS068-BRAF_F1：5’CCTCACAGTAAAAATAGGTGATTTTGGTCTE3’(E＝t-丁基苯甲基脱氧腺嘌呤)(SEQ ID NO：25)和

RL_BRAF_R5：5’TAGCCTCAATTCTTACCATCCACAAAA3’(SEQ ID NO：4)。

TaqMan探针使用超柔(ultramild)脱氧核苷酸磷酰胺化物(PierceBiotechnology，Milwaukee，WI)、DCI作为激活剂、标准合成循环(带有较少修饰)、在常规3’至5’方向在固相CPG支持物上，于ABI394DNA合成仪(Applied Biosystems Inc.)上合成。用磷酰胺试剂、以10分钟偶联循环，将荧光标记cx-FAM(6-羧基荧光素，Biogenex Inc.)或cx-HEX(6-羧基六氯荧光素)(Biogenex Inc.，San Ramon，CA)，与Black Hole Quencher(BHQ-2)(BiosearchInc.，Novato，CA)淬灭剂整入。借助3’-延伸阻断CPG(3’-Extension Blocker CPG)(Clontech Inc.，Mountain View，CA)，导入3’-磷酸。合成反应之后，将DMT保护基团从合成仪中去除，寡核苷酸在室温下用氨水去保护16小时。将粗制的寡核苷酸在线性梯度氯化钠下，用Mono-Q HR16/10强阴离子交换HPLC柱(Amersham Biosciences)纯化。级分用DNAPac PA100(Dionex Inc.，Sunnyvale，CA)离子交换柱分析，以最低>90％的纯度标准收集。将所收集的级分去盐，配制于含80mMN-Tricine，pH8.2，240mM醋酸钾，0，1mMEDTA和0.09％叠氮化钠的探针贮存缓冲液中。

探针为：

V600E(TTS155-BRAF_MU)：5’

QCTACAIAIFAAATCTCGATGGAGTGGGTCCCAP3’(SEQ ID NO：23)野生型(TTS148-BRAF_WT)：5’

QACAITGEAAATCTCGATGGAGTGGGTCCCAP3’(SEQ ID NO：24)(E＝HEX报告染料，F＝FAM报告染料，I＝脱氧肌苷，Q＝BHQ2淬灭染料，P＝3’-磷酸)。

扩增反应也包括AmpErase(尿嘧啶-N-糖基酶，UNG)和脱氧尿苷三磷酸(dUTP)。AmpErase识别并催化破坏含脱氧尿苷的DNA链，而不催化破坏含胸苷的DNA链。脱氧尿苷在天然发生的DNA中并不存在，但由于在PCR反应混合试剂中，用脱氧尿苷三磷酸作为dNTPs之一替代胸苷三磷酸，所以在扩增子中总是存在。在反应混合物中整合入UNG，使扩增子传递(amplicon carryover)所致污染最小化。AmpErase将不会降解靶扩增子，如果是探针与检测试剂盒。PCR产物的检测

用在该分析中的BRAF引物-探针混合物包含分别对编码B-Raf WT或V600E的核苷酸序列特异的两种双标记的荧光探针，使得能够在扩增过程中通过荧光信号释放，而实时检测特定PCR产物的积累。B-RafWT和V600E探针用不同的荧光报告染料与相同的淬灭染料进行标记。当探针完好无损时，报告染料的荧光由于

型能量转移而被淬灭染料抑制。在PCR期间，各探针以序列依赖方式与其靶序列杂交，并被Z05DNA聚合酶的5’-核酸酶活性所裂解，由此两染料被分离。一旦报告和淬灭染料被分离，来自报告染料的荧光就可检测到。随着各轮PCR循环产生更多扩增子，来自报告染料的积累信号会有效增加。在每轮循环期间，在相应特定发射波长范围测量各探针，独立地监测B-RafWT和V600E序列的扩增。

将各基因组DNA样品在含50μL工作超级混合物的100μL反应液中扩增，对于每样品，所述超级混合物是将17μL引物-探针混合物和13μL25mMMg(OAc)₂辅助因子加入至20μLTaqMan RNA反应混合物而制备的。将基因组DNA样品(125ng)以50μL体积加至工作超级混合物。各样品进行双份扩增。扩增反应在表1所示条件下进行。每轮包括V600E阳性对照反应，野生型阳性对照反应，以及阴性对照反应。

表1：热循环情况

数据分析

B-Raf V600E(通道1)和WT(通道2)的Ct值，在COBAS TaqMan48Analyzer工作站上通过AmpliLink3.1软件计算。来自阴性和阳性对照反应的Ct值用于确定运行是否有效(valid)。表2列出了各对照反应的可接受Ct值。

表2：对照反应的可接受Ct值

a.	b.通道1c.(FAM，V600E探针)^*	d.通道2e.(HEX，WT探针)^*
			f.阴性	g.Ct＝-1	h.Ct＝-1
i.阳性对照#1(V600E质粒)	j.Ct在29至33之间	k Ct＝-1
			1.阳性对照#2(WT质粒)	m.Ct＝-1	n.Ct在28至32之间

^*Ct值为-1表示检测不到显著扩增。

对有效运行而言，各样品的Ct值对照分析表现研究(analytical performancestudies)所定义的各通道的可接受范围来评估。表3提供了每对Ct值怎样转化为B-RafV600E-突变状态指令(call)的实例。

表3：分配V600E状态的Ct值表

o.通道1p.(FAM，V600E探针)^*	q.条件	r.通道2s.(HEX，WT探针)^*	tV600E状态
				u.Ct＝-1	v.与	w.Ct	x.阴性
y.15≤Ct≤50	z.与	aa.15≤Ct≤40	bb.阳性
				cc.Ct<15或>50	dd.或	ee.Ct<15或>40	ff.不能确定

^*Ct值为-1表示检测不到显著扩增。

关键词：E＝HEX报告染料，F＝FAM报告染料，I＝脱氧肌苷，Q＝BHQ2淬灭染料，P＝3’-磷酸

对下列样品进行评估。PCR结果通过测序验证。

表4.临床样品特征

样品ID	诊断情况	％肿瘤
			M1	原发黑素瘤垂直生长期(PRIMARY MELANOMAVERTICAL GROWTH PHASE)	60
M2	黑素瘤	95
			M3	原发黑素瘤垂直生长期	75
M4	黑素瘤	50
			M5	原发黑素瘤垂直生长期	85
M6	原发黑素瘤垂直生长期	90
			M7	黑素瘤	90
M8	原发黑素瘤垂直牛长期	90
			M9	原发黑素瘤垂直生长期	90
M10	原发黑素瘤辐射状生长期	95
			RM1	转移性黑素瘤(LN)	10
RM2	转移性黑素瘤(LN)	45
			RM3	转移性黑素瘤(LN)	30

RM4	转移性黑素瘤(LN)	10
			RM5	转移性黑素瘤(LN)	50
RM6	转移性黑素瘤(LN)	30
			RM7	转移性黑素瘤(LN)	50
RM8	转移性黑素瘤(LN)	40
			RM9	转移性黑素瘤(LN)	40
RM10	转移性黑素瘤(LN)？	10
			RM11	转移性黑素瘤(LN)	75
RM12	转移性黑素瘤(LN)	55
			RM13	转移性黑素瘤(LN)	30
RM14	转移性黑素瘤	50
			RM15	转移性黑素瘤(LN)	80
RM16	转移性黑素瘤(LN)	45
			RM17	转移性黑素瘤(LN)	50
RM18	转移性黑素瘤(LN)	50
			RM19	转移性黑素瘤(LN)	50
RM20	转移性黑素瘤(LN)	35

DNA抽提自三十种FFPE黑素瘤样本(表4)。所得样本含有肿瘤和正常细胞的DNA的混合物。

分析与焦磷酸测序和GS20测序相比较的突变检测结果示于表5。

表5三种独立方法确定的V600E状态

^*人工解读

样品M3和RM1用焦磷酸测序扩增失败，甚至第二次抽提之后也是；该两种样品被和GS20方法认定为V600E-阴性(WT)。四种样品需要对焦磷酸测序指令进行人工解读：RM17，焦磷酸测序指令为V600E-阴性，而和GS20结果显示该样品为V600E-阳性；在剩下的三个实例中，三种方法得到的结果一致。被焦磷酸测序认定为V600E-阴性的另外三种样品(RM3，RM6，RM8)被和GS20方法都认定为V600E-阳性。这些结果与焦磷酸测序突变检测中来自RM3，RM6，RM8和RM17的含突变的DNA产量不够充足相一致。样品RM8在4％的4300GS20测序读数中(～2000各方向)显示为V600E-阳性，其是所有V600E-阳性样品中所观察到突变BRAF的最低百分数。

由于GS20测序与焦磷酸测序相比有更高的敏感性，所以GS20方法被用作测试的参考方法。COBAS B-Raf V600E检测和GS20测序之间的一致性水平为：对于V600E-阳性12/12＝100％，对于V600E-阴性(WT)18/18＝100％。

示例性序列：

SEQ ID NO：1BRAF_MU(I＝脱氧肌苷P＝3’-磷酸)

5’CTACAIAIAAATCTCGATGGAGTGGGTCCCAP3’

SEQ ID NO：2BRAF_WT(I＝脱氧肌苷P＝3’-磷酸)

5’ACAITGAAATCTCGATGGAGTGGGTCCCAP3’

SEQ ID NO：3BRAF_F1：

5’CCTCACAGTAAAAATAGGTGATTTTGGTCT3’

SEQ ID NO：4BRAF_R5：

5’TAGCCTCAATTCTTACCATCCACAAAA3’

虽然上述发明为达到清楚理解的目的，以说明和举例方式在某些细节上进行了描述，但是对本领域普通技术人员来说，根据本发明的教导，显而易见的，可以在不脱离所附权利要求的精神或范围的情况下，对其作出某些改变和修饰。

序列表

<110>F.Hoffmann-La Roche AG

<120>B-RAF激酶抑制剂易感性的诊断检测

<130>24003-HS

<140>还未指定

<141>还未指定

<150>US60/993,391

<151>2007-09-11

<160>24

<170>FastSEQ for Windows Version4.0

<210>1

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的BRAF_MU探针

<221>修饰的碱基

<222>(6)...(6)

<223>n＝脱氧次黄嘌呤核苷

<221>修饰的碱基

<222>(8)...(8)

<223>n＝脱氧次黄嘌呤核苷

<221>修饰的碱基

<222>(31)...(31)

<223>a＝带3’-磷酸的a

<400>1

<210>2

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的BRAF_WT探针

<221>修饰的碱基

<222>(4)...(4)

<223>n＝脱氧次黄嘌呤核苷

<221>修饰的碱基

<222>(29)...(29)

<223>a＝带3’-磷酸的a

<400>2

<210>3

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的BRAF_F1引物

<400>3

<210>4

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的BRAF_R5引物

<400>4

<210>5

<211>116

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的B-Raf V600E扩增子序列

<400>5

<210>6

<211>116

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<220>

<223>B-Raf的智人染色体X相应序列

<400>6

<210>7

<211>40

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<220>

<223>围绕密码子600的B-Raf外显子15区

<400>7

<210>8

<211>40

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<220>

<223>A-Raf 区

<400>8

<210>9

<211>40

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<220>

<223>C-Raf区

<400>9

<210>10

<211>116

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<220>

<223>RAF1；编码C-Raf

<400>10

<210>11

<211>116

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<220>

<223>ARAF；编码A-Raf

<400>11

<210>12

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的BRaf反向引物

<400>12

<210>13

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的BRaf反向引物

<400>13

<210>14

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的BRaf反向引物

<221>修饰的碱基

<222>(26)...(26)

<223>a＝带6-羧基六氯荧光素(HEX)的a

<400>14

<210>15

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的BRaf反向引物

<400>15

<210>16

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的BRaf反向引物

<400>16

<210>17

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的BRaf正向引物

<221>修饰的碱基

<222>(29)...(29)

<223>t＝带6-羧基六氯荧光素(HEX)的t

<400>17

<210>18

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的BRaf正向引物

<221>修饰的碱基

<222>(30)...(30)

<223>a＝带6-羧基六氯荧光素(HEX)的a

<400>18

<210>19

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的BRaf反向引物

<400>19

<210>20

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的BRaf反向引物

<400>20

<210>21

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的BRaf反向引物

<400>21

<210>22

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的BRaf反向引物

<400>22

<210>23

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的TTS155-BRAF_MU探针

<221>修饰的碱基

<222>(1)...(1)

<223>n＝连接于脱氧核糖磷酸骨架3’端的脱氧肌苷，

其中所述磷酸骨架被连接于寡核苷酸5’CTACAIA3’的3’端的FAM所修饰，在该寡核苷酸中，5’C被BHQ2淬灭基团修饰，I＝脱氧肌苷

<221>修饰的碱基

<222>(24)...(24)

<223>a＝带3’磷酸的a

<400>23

<210>24

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的TTS148-BRAF_WT探针

<221>修饰的碱基

<222>(1)...(1)

<223>n＝连接于脱氧核糖磷酸骨架3’端的g，

其中所述磷酸骨架被连接于寡核苷酸5’ACAIT3’的3’端的HEX所修饰，在该寡核苷酸中，5’A被BHQ2淬灭基团修饰，

I＝脱氧肌苷

<221>修饰的碱基

<222>(24)...(24)

<223>a＝带3’-磷酸的a

<400>24

<210>25

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的TTS068-BRAF_F1引物

<221>修饰的碱基

<222>(30)...(30)

<223>t＝具有t-丁基苯甲基dA的t

<400>30

Claims

1.由SEQ ID NO：1所示序列的至少26个毗连的核苷酸组成的寡核苷酸探针在制备用于确定癌细胞对B-Raf激酶抑制剂敏感性的方法中的试剂盒中的用途，该方法包括：

-提供来自癌症患者癌细胞的核酸样品；

-用扩增靶多核苷酸序列的引物对，扩增核酸样品中的靶多核苷酸序列，其中靶多核苷酸序列包括BRAF中的V600E突变位点，并且扩增在标记寡核苷酸探针的存在下进行，其中所述探针包含SEQ ID NO：1所示序列的至少26个毗连的核苷酸，其可检测BRAF中V600E突变位点上的突变序列的存在；以及

-检测BRAF中V600E突变是否存在；由此确定所述癌症对B-Raf抑制剂的敏感性。

2.权利要求1的用途，其中扩增是在可检测V600E突变位点上野生型序列存在的第二探针存在的情况下进行。

3.权利要求2的用途，其中第二探针包括SEQ ID NO：2所示核苷酸序列的至少27个毗连的核苷酸。

4.权利要求1的用途，其中引物对中的引物之—包括SEQ ID NO：3所示核苷酸序列的至少15个毗连的核苷酸。

5.权利要求1的用途，其中引物对中的引物之—包括SEQ ID NO：4所示核苷酸序列的至少15个毗连的核苷酸。

6.权利要求1的用途，其中扩增反应步骤包括RT-PCR。

7.权利要求1的用途，其中B-Raf激酶抑制剂为突变体特异性B-Raf激酶抑制剂。

8.权利要求1的用途，其中B-Raf激酶抑制剂为PLX4032。

9.鉴定B-Raf激酶抑制剂治疗的候选患者的试剂盒，其中该试剂盒包括第一等位基因特异性探针，其中所述第一探针可检测BRAF中的V600E突变且由SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的至少26个毗连的核苷酸组成。

10.权利要求9的试剂盒，其进一步包括第二等位基因特异性探针，其中所述第二探针检测野生型BRAF序列，且包括SEQ ID NO：2所示核苷酸序列的至少27个毗连的核苷酸。

11.权利要求9的试剂盒，其进一步包括扩增包含V600E突变位点的BRAF靶区域的引物对。

12.权利要求11的试剂盒，其中引物对包括包含SEQ ID NO：3所示核苷酸序列的至少15个毗连核苷酸的引物。

13.权利要求11的试剂盒，其中引物对包括具有SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示序列的引物。

14.权利要求9的试剂盒，其中第一探针具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，并且该试剂盒进一步包括具有SEQ ID NO：2所示核苷酸序列的第二探针，以及包括具有SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示核苷酸序列的引物的引物对。