JPH05236998A - 核酸検出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】検出用の標識物質で標識した少なくとも１種の
ヌクレオチドおよび固相化用の物質で標識した別の少な
くとも１種のヌクレオチドを用いてＰＣＲを行ない、増
幅したタ−ゲットシ−クエンスにこれらのヌクレオチド
を取り込ませる。その後、取り込まれた固相化用標識で
タ−ゲットシ−クエンスを固相化して分離し、次いで検
出用標識の検出を行なう。固相化用の標識はプライマ−
に施すこともできる。また、増幅後、分子量、サイズま
たは電荷量の差異に基づいて分離するのであれば、固相
化用の標識を用いずに検出を行なうこともできる。 【効果】タ−ゲットシ−クエンスの増幅を短時間で容易
に行ない得るだけではなく、増幅したシ−クエンスの検
出も簡単な操作で短時間に行なうことができ、検出に要
する全体の時間を短縮できる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】この発明は、感染症、遺伝病の診
断等に用いることができる核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）
の検出方法、およびその方法を行なうための核酸検出用
キットに関する。

【０００２】

【従来の技術】従来、核酸をプロ−ブとして用いる核酸
検出方法が多くの分野で利用されている（Analytical B
iochemistory、 169、1-25、1988；Clinical Microbiol
ogy Reviews 、1988、82-101）。例えば、鎌型赤血球貧
血症のように、遺伝子と病気との関係が明らかな遺伝病
の診断において、上記核酸検出方法が利用されている
（Proc.Natl.Acad.Sci.USA、78、5081-5085 、1981）。
また、臨床診断、食品関連の検査、環境関連の検査など
の分野においては、感染、汚染等の原因となる細菌また
はウイルスを検出するために、上記方法が利用されてい
る。とりわけ、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス）のよう
な感染症に関連するウイルスの検出は重要であり、ろ過
ハイブリダイゼ−ション法（J.Inf.Diseases、155 、32
0-322 、1987）、サザ−ンブロット法（Science 、226
、1165-1171 、1984）、in situ ハイブリダイゼ−シ
ョン法（Proc.Natl.Acad.Sci.USA、83、772-776 、198
6）、ＰＣＲ法（polymerase chain reaction ；Natur
e、334 、440-444 、1988；U.S.Patent 4,683,202、Cet
us Corporation ）等において、核酸をプロ−ブとして
用いたウイルスの検出が行なわれている。なお、検出し
ようとするものが細菌である場合には、細菌のＤＮＡを
検出する方法の他に、細菌中に多量に存在するｍＲＮＡ
を検出する方法も用いられている（J.Clin.Microbiol、
23、481-484 、1986）。

【０００３】ところで、このような核酸検出を行なうた
めの試料は、通常微量しか得られないことが多い。この
ため、得られた試料をそのまま用いたのでは誤差が大き
く、事実上検出が不可能となることも多い。

【０００４】この問題点を解決するために様々な試みが
なされているが、その種類は大きく２つに分けることが
できる。第１の手法が、得られた試料はそのまま使用
し、高感度ラジオアイソト−プ等を用いる高感度分析技
術を駆使して検出感度を高めようとする方法である。そ
して、第２の手法が、タ−ゲットとなる核酸を増幅して
既存の技術で高感度の検出を行なおうとする方法であ
る。

【０００５】第１の手法は、ろ過ハイブリダイゼ−ショ
ン法、サザ−ンブロット法、サンドイッチハイブリダイ
ゼ−ション法（Gene、36、201-210 、1985；Clin.Che
m.、31、1438-1443 ）、液相ハイブリダイゼ−ション法
（Solution Hybridization；J.Clin.Microbiol. 、23、
481-484 、1986）、ホモジニアスアッセイ法（エネルギ
−転移法）、鎖置換法（Strand Displacement Assay ；
Clin.Chem.、32、1637-1641 ）等に応用されている。

【０００６】第２の手法の代表的なものが、ＰＣＲ法、
ＱＢシステム法等である。これらの方法は、まず、タ−
ゲットのＤＮＡまたはＲＮＡの配列の増幅を行なう。こ
の増幅に関しては、Clinical Microbiology Reviews 、
1989、217-226 に総説が掲載されている。また、ＰＣＲ
法におけるＤＮＡまたはＲＮＡの増幅は、前述のU.S.Pa
tent 4,683,202に記載されている。次に、増幅したタ−
ゲットＤＮＡまたはＲＮＡを、標識したプロ−ブを用い
て検出する。

【０００７】第２の手法を用いた核酸検出方法は多くの
分野で応用されており、例えば、ＨＩＶの研究（特開昭
63-294800 、Cetus Co. ）、遺伝病の研究（J.New Eng
l.J.Med. 、317 、985-990 （1987））、感染ウイルス
の検出に関する研究および癌遺伝子の研究（Nature、32
7 、293-297 （1987））において利用されている。

【０００８】特に、ＰＣＲ法は、タ−ゲットＤＮＡまた
はＲＮＡを大量に、かつ容易に増幅させることができる
ため、近年注目されている技法である。ＰＣＲ法の原理
は以下の通りである。まず、試料からＤＮＡまたはＲＮ
Ａを抽出し、二本鎖であるこのＤＮＡまたはＲＮＡを熱
処理して一本鎖に解離させる（工程１）。次に、２種の
プライマ−を添加し、通常50℃で一本鎖ＤＮＡまたはＲ
ＮＡとのアニ−リングを行なう（工程２）。ここで用い
られるプライマ−は、タ−ゲットＤＮＡまたはＲＮＡの
上流側の数十塩基と相補的な塩基配列を有するものであ
る。次いで、70℃まで昇温し、タ−ゲットシ−クエンス
に従って、プライマ−から下流側のＤＮＡまたはＲＮＡ
の合成を行なう（工程３）。このＤＮＡまたはＲＮＡの
際に用いられるポリメラ−ゼは、耐熱製のTaq ポリメラ
−ゼである。この工程により、元のＤＮＡまたはＲＮＡ
と同一の二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡが２本得られる。そ
の後、さらに90℃に昇温し、得られた二本鎖ＤＮＡまた
はＲＮＡを一本鎖に解離する（工程４）。上記工程１〜
４が１サイクルと呼ばれている。このサイクルをｎ回繰
り返すことにより、タ−ゲットシ−クエンスを２ⁿ 倍に
増幅することができる。例えば、サイクルを２回繰り返
すことにより配列は４倍に増幅され、25回繰り返した場
合には、Cetus 社の資料によると、10⁶ 倍に増幅され
る。

【０００９】このようにして増幅されたタ−ゲットシ−
クエンスは、例えば、ドットブロット法（Lancet ii 、
418-421 、1988）、またはオリゴマ−開裂検出法（Olig
omerCleavage Detection ；J.Virol. 61:1690-1694 ）
を用いて検出する。通常、ドットブロット法が多く用い
られるので、以下の操作はドットブロット法を用いて説
明する。まず、ＰＣＲによって増幅した、タ−ゲットシ
−クエンスを含む核酸溶液を熱処理し、二本鎖ＤＮＡま
たはＲＮＡを一本鎖に解離させる。次に、この一本鎖Ｄ
ＮＡまたはＲＮＡを含む溶液をナイロン等のメンブラン
にドット状に吸着させる。その後、メンブランに固定化
したＤＮＡまたはＲＮＡと、増幅した配列に対して特異
的に反応するプロ−ブとをハイブリダイズさせる。この
際用いられるプロ−ブは、放射性標識もしくは非放射性
標識で予め標識されている。また、この反応は、通常、
夜通し行なわれる。

【００１０】プロ−ブがＰ³²等の放射性物質で標識され
ている場合には、次に、放射線感光フィルムをハイブリ
ダイズを行なったメンブランに密着させる。露光時間
は、導入した放射性標識の量にもよるが、通常１ないし
５日である。このフィルムを現像すると、ポジティブサ
ンプルに密着した部分は黒いドットとなって現われ、色
の変化がないネガティブサンプルと区別することができ
る。

【００１１】また、プロ−ブが非放射性物質で標識され
ている場合には、例えば、アビジン- ビオチン反応を利
用してタ−ゲットシ−クエンスを検出することができ
る。この方法は、まず、予めプロ−ブをビオチンで標識
しておき、ＤＮＡまたはＲＮＡをメンブランに固定した
後、アルカリホスファタ−ゼ等の酵素で標識したアビジ
ンを加えて反応させる。次に、アビジンに標識した酵素
に対する基質を加える。これにより、ポジティブサンプ
ルは黒いドット状にメンブランが染まり、ネガティブサ
ンプルは色が変わらない。この反応に要する時間は、約
3ないし15時間である。

【００１２】このように、ＰＣＲ法を含む核酸の検出方
法は、タ−ゲットシ−クエンスを大幅に増幅し、従来の
検出法でより高感度の検出を行なうことを可能にする。
また、ＰＣＲ法によると、数時間でタ−ゲットシ−クエ
ンスを10⁶ 倍程度に増幅することができる。したがっ
て、10⁵ 個の細胞のうちの１個がエイズウイルスに感染
している状態、いわゆるサイレントエイズのステ−ジの
患者からのウイルスの検出にも十分対応することが可能
である。

【００１３】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、上記方
法はいずれも、ＰＣＲ法によるタ−ゲットシ−クエンス
の増幅までは短時間かつ容易に反応を進めることができ
るが、その後の増幅したタ−ゲットシ−クエンスの検出
に長時間を要する。また、操作も繁雑であり、熟練した
技術者が必要であった。

【００１４】したがって、この発明の目的は、検出に要
する全体の時間が短く、かつ操作が簡単な核酸の検出方
法を提供することにある。

【００１５】また、この発明の別の目的は、上記核酸検
出方法を行なうための核酸検出用キットを提供すること
にある。

【００１６】

【課題を解決するための手段】この発明による核酸の検
出方法は、生物学的試料中の核酸に含まれる少なくとも
１種のヌクレオチド配列の検出方法であって、（ａ）２
つの独立した相補鎖からなる少なくとも１種のヌクレオ
チド配列を有する生物学的試料を、２種のプライマ−を
用いて、各々のプライマ−がそれぞれのヌクレオチド配
列に結合してハイブリッドを形成するような条件下で処
理する工程と、（ｂ）前記ヌクレオチド配列をテンプレ
−ト鎖として用い、溶液からヌクレオチドを取り込むこ
とにより前記ハイブリッドのプライマ−鎖を伸長する工
程であって、伸長プライマ−鎖に取り込まれるヌクレオ
チドの複数が検出可能に修飾されたヌクレオチドおよび
分離可能に修飾されたヌクレオチドである工程と、
（ｃ）伸長プライマ−鎖をテンプレ−トから解離して一
本鎖を形成する工程と、（ｄ）工程（ｃ）において生じ
た一本鎖を、工程（ａ）と同じ条件下で、工程（ａ）で
用いたプライマ−で処理し、次いで工程（ｂ）と同じ条
件下でプライマ−鎖を伸長する工程と、（ｅ）リガンド
を固相化した固相支持体にプライマ−の伸長生成物を結
合させることにより、増幅した伸長生成物を目的とする
ヌクレオチド配列以外の配列から分離する工程であっ
て、前記リガンドは、伸長生成物に組み込まれた、分離
可能に修飾されたヌクレオチドと結合することが可能で
ある工程と、（ｆ）伸張生成物に組み込まれている検出
可能に修飾されているヌクレオチドの量を測定し、生物
学的試料中における目的とするヌクレオチド配列の検出
を行なう工程とを具備する方法である。

【００１７】また、この発明による他の核酸検出方法
は、生物学的試料中の核酸に含まれる少なくとも１種の
ヌクレオチド配列の検出方法であって、（ａ）２つの独
立した相補鎖からなる少なくとも１種のヌクレオチド配
列を有する生物学的試料を、２種のプライマ−を用い
て、各々のプライマ−がそれぞれのヌクレオチド配列に
結合してハイブリッドを形成するような条件下で処理す
る工程であって、前記プライマ−の５´末端が分離可能
に修飾されている工程と、（ｂ）前記ヌクレオチド配列
をテンプレ−ト鎖として用い、溶液からヌクレオチドを
取り込むことにより前記ハイブリッドのプライマ−鎖を
伸長する工程であって、伸長プライマ−鎖に取り込まれ
るヌクレオチドの複数が検出可能に修飾されたヌクレオ
チドである工程と、（ｃ）伸長プライマ−鎖をテンプレ
−トから解離して一本鎖を形成する工程と、（ｄ）工程
（ｃ）において生じた一本鎖を、工程（ａ）と同じ条件
下で、工程（ａ）で用いたプライマ−で処理し、次いで
工程（ｂ）と同じ条件下でプライマ−鎖を伸長する工程
と、（ｅ）リガンドを固相化した固相支持体にプライマ
−の伸長生成物を結合させることにより、増幅した伸長
生成物を目的とするヌクレオチド配列以外の配列から分
離する工程であって、前記リガンドは、伸長生成物に組
み込まれた、分離可能に修飾されたプライマ−と結合す
ることが可能である工程と、（ｆ）伸張生成物に組み込
まれている検出可能に修飾されているヌクレオチドの量
を測定し、生物学的試料中における目的とするヌクレオ
チド配列の検出を行なう工程とを具備する方法である。

【００１８】この発明によるさらに別の核酸検出方法
は、生物学的試料中の核酸に含まれる少なくとも１種の
ヌクレオチド配列の検出方法であって、（ａ）２つの独
立した相補鎖からなる少なくとも１種のヌクレオチド配
列を有する生物学的試料を、２種のプライマ−を用い
て、各々のプライマ−がそれぞれのヌクレオチド配列に
結合してハイブリッドを形成するような条件下で処理す
る工程であって、（ｂ）前記ヌクレオチド配列をテンプ
レ−ト鎖として用い、溶液からヌクレオチドを取り込む
ことにより前記ハイブリッドのプライマ−鎖を伸長する
工程であって、伸長プライマ−鎖に取り込まれるヌクレ
オチドの複数が検出可能に修飾されたヌクレオチドであ
る工程と、（ｃ）伸長プライマ−鎖をテンプレ−トから
解離して一本鎖を形成する工程と、（ｄ）工程（ｃ）に
おいて生じた一本鎖を、工程（ａ）と同じ条件下で、工
程（ａ）で用いたプライマ−で処理し、次いで工程
（ｂ）と同じ条件下でプライマ−鎖を伸長する工程と、
（ｅ）分子量、サイズ、または電荷量の差異に基づい
て、増幅した伸長生成物を目的とするヌクレオチド配列
以外の配列から分離する工程と、（ｆ）伸張生成物に組
み込まれている検出可能に修飾されているヌクレオチド
の量を測定し、生物学的試料中のヌクレオチド配列の検
出を行なう工程とを具備する方法である。

【００１９】また、この発明による核酸検出用キット
は、検出しようとする核酸の塩基配列と相補的な塩基配
列を有するプライマ−と、ヌクレオチドを含有し、この
ヌクレオチドの少なくとも１種が検出可能な標識物質で
標識され、他の少なくとも１種に固相化用の標識がなさ
れているヌクレオチド溶液と、Ｔａｑポリメラ−ゼと、
表面に標識ヌクレオチドと結合可能なリガンドが固相化
されたリガンド固相化チュ−ブとを具備することを特徴
とする。

【００２０】この発明による他の核酸検出用キットは、
検出しようとする核酸の塩基配列と相補的な塩基配列を
有するプライマ−と、ヌクレオチドを含有し、このヌク
レオチドの少なくとも１種が第１の蛍光物質で標識され
ているヌクレオチド溶液と、Ｔａｑポリメラ−ゼと、第
１の蛍光物質とは異なる第２の蛍光物質で標識されたプ
ロ−ブとを具備することを特徴とする。

【００２１】この発明による核酸検出方法においては、
少なくとも４種類のヌクレオシド三リン酸（ヌクレオチ
ド）、および２種のプライマ−を用いるポリメラ−ゼ・
チェイン・リアクション（ＰＣＲ）が行なわれる。ここ
で用いられるヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）は、Ｐ
ＣＲによるＤＮＡまたはＲＮＡ合成の際の原料となるも
のであり、デオキシアデノシン 5'-三リン酸（ｄＡＴ
Ｐ）、デオキシシチジン5'-三リン酸（ｄＣＴＰ）およ
びデオキシグアノシン 5'-三リン酸（ｄＧＴＰ）、デオ
キシチミジン 5'-三リン酸（ｄＴＴＰ）、デオキシウリ
ジン 5'-三リン酸（ｄＵＴＰ）が含まれる。これらの５
種類のｄＮＴＰのうち、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、およびｄ
ＧＴＰの３種類は必須であり、残りのｄＴＴＰおよびｄ
ＵＴＰのうちのいずれかが１種が必要である。また、こ
こで用いられるプライマ−は、試料中のタ−ゲットとな
るヌクレオチド配列に対して比較的短い（例えば、ヌク
レオチド10-100個）核酸配列を有しており、２種のプラ
イマ−がタ−ゲットシ−クエンスの異なる鎖にハイブリ
ダイズすることができるように、タ−ゲットとなるヌク
レオチド配列の末端配列の相補的核酸配列に対応してい
る。

【００２２】上記ＰＣＲは下記の手順に従って行なわれ
る。まず、試料から核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を抽出
し、熱処理して二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡを一本鎖にす
る（工程１）。次に、２種類のプライマ−、例えばプラ
イマ−Ａおよびプライマ−Ｂとタ−ゲットＤＮＡまたは
ＲＮＡとのアニ−リングを行なう（工程２）。このアニ
−リングは、通常30〜65℃で行なわれる。次いで、温度
を70〜75℃に上げ、Taq ポリメラ−ゼを用いて、プライ
マ−から下流側のＤＮＡの合成をタ−ゲットシ−クエン
スに従って行なう（工程３）。その後、温度をさらに90
〜98℃に上げて、合成された二本鎖ＤＮＡを一本鎖に解
離させる（工程４）。この後、上記工程２ないし４を繰
り返すことにより、タ−ゲットシ−クエンスの増幅を行
なう。このようにＰＣＲによって検出しようとする核酸
を増幅した後、核酸の検出を行なう。

【００２３】この発明の第１の核酸検出方法において
は、ＰＣＲに用いられるｄＮＴＰのうちのいずれか１種
が予め検出用標識剤で標識されており、かつ他の１種が
予め固相化用標識剤で標識されている。残りのｄＮＴＰ
は無標識である。

【００２４】この第１の核酸検出方法を図面を参照して
説明する。図１は、第１の核酸検出方法におけるＰＣＲ
の手順を説明する工程図である。この手順は、上記手順
と同一であり、二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ11の一本鎖Ｄ
ＮＡまたはＲＮＡ12への解離（工程１）、プライマ−13
のアニ−リング（工程２）、Taq ポリメラ−ゼによるＤ
ＮＡの伸長（工程３）および合成した二本鎖ＤＮＡの一
本鎖への解離（工程４）が含まれる。工程４により得ら
れた一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡは、再び工程２に戻り同
様の手順を繰り返す。図２は、ＰＣＲにより得られた一
本鎖ＤＮＡを模式的に示す図である。第１の方法におい
ては、ＰＣＲの原料となるｄＮＴＰのいずれか１種に検
出用の標識剤14が、また他の１種に固相化用の標識剤15
がそれぞれ標識されているので、合成されたＤＮＡ16
に、これらの標識剤14および15が取り込まれる。

【００２５】次に、ＰＣＲにより増幅された核酸のＢ／
Ｆ（ bound／free）分離を行なう。図３は、得られたＤ
ＮＡの固相化を模式的に示す図である。固相支持体17に
は、ｄＮＴＰに標識した固相化用標識剤15と特異的に反
応するリガンド18が予め固定されており、このリガンド
18と標識剤15との特異的な反応によりＤＮＡ16を固相支
持体17に固定する。物質18および標識剤15は、リガンド
- リセプタ−反応または抗原- 抗体反応に基づいて結合
するものが好ましく、例えば、ｄＮＴＰをビオチンで標
識し、固相支持体にアビジンを固定しておけばよい。Ｐ
ＣＲにより増幅されたＤＮＡを固相化した後、固相支持
体17を洗浄して未反応の核酸、ｄＮＴＰ等を除去する。

【００２６】最後に、図４に示すように、固相化された
ＤＮＡの検出を行なう。この検出は、ｄＮＴＰの１種に
標識した検出用標識剤14を検出することにより行なう。
この検出用標識剤14は、ＰＣＲにより増幅されたＤＮＡ
に取り込まれている。ここで行なわれる検出は、従来行
なわれている方法をそのまま用いることができる。例え
ば、ｄＮＴＰを酵素で標識しておき、伸長生成物を固相
支持体17に結合した後基質を添加して酵素活性を検出す
ればよい。また、別の方法としては、ｄＮＴＰをハプテ
ンで標識してｍｄＮＴＰとし、固相化されたＤＮＡ中の
ｍｄＮＴＰと標識抗ハプテン抗体とを反応させて抗体の
標識を検出すればよい。標識の検出方法は、抗ハプテン
抗体の標識の種類によって異なるが、酵素を標識剤とし
て使用した場合には、化学発光物質や通常のＥＩＡ測定
の際に使用される呈色基質を用いることができる。ま
た、標識剤が蛍光物質である場合には、適当な波長の光
を照射して蛍光を励起させることによって行なう。

【００２７】この第１の核酸検出方法は、検出しようと
する核酸の塩基配列と相補的な塩基配列を有するプライ
マ−と、ヌクレオシド三リン酸を含有し、該ヌクレオシ
ド三リン酸の少なくとも１種に検出用の標識がなされ、
かつ他の少なくとも１種に固相化用の標識がなされてい
るヌクレオシド三リン酸溶液と、Taq ポリメラ−ゼと、
標識ヌクレオチドと結合可能なリガンドが表面に固相化
されているリガンド固定化チュ−ブとを具備するキット
を用いることにより、より簡便に実施することが可能と
なる。

【００２８】この発明の第２の核酸検出方法において
は、ＰＣＲに用いられるｄＮＴＰのうちのいずれか１種
が検出用の標識剤で予め標識されており、かつプライマ
−の 5' 末端が固相化用の標識剤で予め標識されてい
る。残りのｄＮＴＰは無標識である。

【００２９】図５は、第２の核酸検出方法におけるＰＣ
Ｒの手順を示す工程図である。この手順は第１の方法と
同様であり、二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ21の一本鎖ＤＮ
ＡまたはＲＮＡ22への解離（工程１）、固相化用標識剤
25を標識したプライマ−23のアニ−リング（工程２）、
Taq ポリメラ−ゼによるＤＮＡの合成（工程３）および
合成した二本鎖ＤＮＡの一本鎖への解離（工程４）が含
まれる。工程４により得られた一本鎖ＤＮＡまたはＲＮ
Ａは、再び工程２に戻り同様の手順を繰り返す。これに
より、図６に示すように、検出用の標識剤24および固相
化用の標識剤25が取り込まれたＤＮＡが合成される。

【００３０】次に、合成されたＤＮＡのＢ／Ｆ分離を行
なう。この工程も第１の方法と同様にして行なうことが
できる。すなわち、固相支持体27に、プライマ−に標識
した固相化用標識剤25と特異的に反応する物質28を予め
固定しておき、この物質28と標識剤25とを結合させるこ
とによりＤＮＡ26を固相支持体27に固相化する。ここ
で、用いられる標識剤25および物質28はリガンド- リセ
プタ−反応に基づいて結合するものが好ましく、例え
ば、プライマ−23の 5' 末端をビオチンで標識し、固相
支持体27にアビジンを固定化しておけばよい。固相支持
体27にＤＮＡ26が固定された状態を、図７に模式的に示
す。ＰＣＲにより増幅されたＤＮＡを固相化した後、固
相支持体17を洗浄して未反応の核酸、ｄＮＴＰ等を除去
する。

【００３１】最後に、図８に示すように、固相支持体27
に固定されたＤＮＡの検出を行なう。この検出は、第１
の方法と同様に、ＰＣＲによりＤＮＡに取り込まれた検
出用標識剤24を検出することにより行ない、第１の方法
と同様の方法を用いることができる。

【００３２】この発明による第３の核酸検出方法におい
ては、ＰＣＲに用いられるｄＮＴＰのうちの少なくとも
いずれか１種が検出用の標識剤で予め標識されており、
ＰＣＲによって増幅された核酸を分子量、サイズ、また
は電荷量の差異に基づいて分離する。

【００３３】この第３の方法において行なわれるＰＣＲ
は、上記第１および第２の方法において行なわれるＰＣ
Ｒと同様の手順で行なうことができる。

【００３４】ＰＣＲによって増幅されたＤＮＡの分離
は、分子量、サイズ、または電荷量の差異に基づいて行
なわれるものであればどのようなものでもよく、例え
ば、キャピラリ−電気泳動、およびアガロ−ス電気泳動
を挙げることができる。

【００３５】ＰＣＲによって増幅されたＤＮＡを分離し
た後、第１もしくは第２の方法と同様に、ｄＮＴＰの１
種に標識され、ＰＣＲによってＤＮＡに取り込まれた標
識剤を検出することによってＤＮＡの検出を行なう。こ
こで用いられる標識剤としては、ロ−ダミン、ＦＩＴＣ
のような蛍光物質が好ましい。

【００３６】この第３の方法においては、ＰＣＲの終了
後、増幅されたＤＮＡを分離する前に、さらに別の標識
剤で標識したプロ−ブを用いて、増幅されたＤＮＡとこ
のプロ−ブとのハイブリダイゼ−ションを行なうことが
できる。この場合、ＰＣＲに用いられるｄＮＴＰには蛍
光物質、例えばロ−ダミンが標識されており、プロ−ブ
には、ｄＮＴＰを標識する蛍光物質とは別の蛍光物質、
例えばＦＩＴＣが標識されていることが好ましい。これ
らの蛍光物質は、その蛍光波長が互いに異なるのであれ
ば、どのような組み合わせのものも使用することが可能
である。なかでも、１種類の励起光で異なる波長の蛍光
を発する蛍光物質の組み合わせが好ましい。そのような
組み合わせとしては、テキサス・レッド（ Texas Re
d^TM、MOLECULAR PROBES社製：励起光 488ｎｍ、蛍光 61
0ｎｍ）およびＦＩＴＣ（励起光 488ｎｍ、蛍光 520ｎ
ｍ）の組み合わせを挙げることができる。

【００３７】プロ−ブとＤＮＡとのハイブリダイゼ−シ
ョンが終了した後、キャピラリ−電気泳動によりＤＮＡ
を分離して、異なる波長バンドで２種類の標識剤の検出
を同時に行なう。そして、２種類の異なる波長バンドで
同時に検出された場合にのみ陽性であると判定する。こ
のような判定では、ＰＣＲで増幅されたＤＮＡをさらに
プライマ−にハイブリダイズさせているため、より高感
度の検出を行なうことが可能となる。

【００３８】この核酸検出方法は、検出しようとする核
酸の塩基配列と相補的な塩基配列を有するプライマ−
と、ヌクレオシド三リン酸を含有し、かつ該ヌクレオシ
ド三リン酸の少なくとも１種が第１の蛍光物質で標識さ
れているヌクレオシド三リン酸溶液と、Taq ポリメラ−
ゼと、第１の蛍光物質とは異なる第２の蛍光物質で標識
されたプロ−ブとを具備するキットを用いることによ
り、より簡便に実施することが可能になる。

【００３９】

【実施例】以下、この発明の実施例を説明する。

【００４０】実施例１ ２種類のプライマ−と２種類の標識したヌクレオチドを
用いるＰＣＲによるＤＮＡの増幅 検出用に標識した１種のヌクレオチド、固相化用に標識
した他の１種のヌクレオチドおよび何も標識していない
２種のヌクレオチドを用いて、ＰＣＲによりＤＮＡの増
殖を行なった。

【００４１】実験手順 増殖を行なうＤＮＡの試料としては、ヒト細胞株MOLT 4
から抽出したＤＮＡ、およびプラスミドｐＢＨ 10 から
抽出したプラスミドＤＮＡの混合溶液を用いた。MOLT 4
は、ヒト末梢血急性リンパ芽球白血病細胞（human peri
pheral blood acute lymphoblastic leukemia cell）で
あり、その寄託番号は ATCC CRL 1582である。また、プ
ラスミドｐＢＨ10には、ＨＩＶのＤＮＡ配列の約98％が
組み込まれている。

【００４２】２種のプライマ−、ｄＮＴＰ混合物（ヌク
レオチド混合物）、MOLT 4のＤＮＡ、プラスミドｐＢＨ
10のＤＮＡ、Taq ポリメラ−ゼ、および反応緩衝液を下
記表に示す割合で混合し、 1.5ｍｌのチュ−ブに入れて
ＰＣＲを行なった。これらの成分のうち、プライマ−は
SYNTHETIC GENETIC INC. から入手したものである。こ
のプライマ−は、それぞれ28塩基からなる２種類のプラ
イマ−であり、ＨＩＶのＧＡＧ領域に特異性を有する。
このプライマ−を用いてＰＣＲを行なうことにより、11
4 塩基対のＧＡＧ領域が増幅される。これらのプライマ
−の配列を図９に、またこれらのプライマ−により増幅
される領域を図10にそれぞれ示した。また、プライマ−
およびｄＮＴＰ混合物以外の成分は、全て、GenEAmp Ｐ
ＣＲ試薬キット（Cetus PE Corporation）のものを使用
した。

【００４３】なお、この実施例においては、検出に使用
するための標識ヌクレオチドとしてジゴキシゲニン-11-
ｄＵＴＰ（BOEHRINGER MANNHEIM 社製）を、また固相化
に使用するための標識ヌクレオチドとしてビオチン-7-
ｄＡＴＰ（BRL 社製）を使用した。

【００４４】 実験条件 ＰＣＲ反応溶液（全量 100μｌ） No. 2 3 4 5 6 7 dNTP混合物^** 200 200 200 200 200 200 （μＭ） プライマ−#1^* 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 （μＭ） プライマ−#2^* 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 （μＭ） MOLT4 ＤＮＡ 2 2 2 2 2 2 （μｇ） pBH10 ＤＮＡ 5×10⁶ 10⁶ 5×10⁵ 10⁵ 5×10⁴ 10⁴ （コピ−数） Taq ポリメラ−ゼ 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 （ユニット） No. 9 10 11 12 13 14 dNTP混合物^*** 200 200 200 200 200 200 （μＭ） プライマ−#1^* 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 （μＭ） プライマ−#2^* 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 （μＭ） MOLT4 ＤＮＡ 2 2 2 2 2 2 （μｇ） pBH10 ＤＮＡ 5×10⁶ 10⁶ 5×10⁵ 10⁵ 5×10⁴ 10⁴ （コピ−数） Taq ポリメラ−ゼ 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 （ユニット） プライマ−#1^* 、プライマ−#2^* ： SYNTHETIC GENETIC
INC. 製 ｄＮＴＰ混合物^**： ｄＣＴＰ： 200μＭ、ｄＧＴＰ： 200μＭ、ｄＡＴＰ：
180μＭ、ｄＴＴＰ： 180μＭ、ビオチン-7- ｄＡＴ
Ｐ：20μＭ ジゴキシゲニン-11-ｄＵＴＰ：20μＭ ｄＮＴＰ混合物^*** ： ｄＣＴＰ： 200μＭ、ｄＧＴＰ： 200μＭ、ｄＡＴＰ：
200μＭ、ｄＴＴＰ： 200μＭ ＰＣＲのサイクルは、PERKINE-ELMER CETUS 社の THERM
AL CYCLER を使用して、以下の設定で行なった。

【００４５】第１サイクル：94℃、 1分 第２サイクル：94℃、 1分 55℃ 1分 72℃ 1分 この第２サイクルを30回繰り返した。

【００４６】結 果 ＰＣＲ終了後、各試料 5μｌづつを、 3％アガロ−スゲ
ルを用いた電気泳動にかけた（Molecular Cloning 6-2
：Colc.Spring Harbor Laboratory Press 1989参
照）。電気泳動終了後、エチジウムブロマイドを用いて
ＤＮＡを染色し（Molecular Cloning 6-14参照）、得ら
れたパタ−ンをFCR-10カメラ（5-5330 FOTODYNE Incorp
orated）で撮影した。得られた写真を図11に示す。図11
に示されるように、14の試料は２列に配置され、上列左
から右へ #1 ないし #7 の試料が、また下列左から右へ
#8 ないし #14の試料がそれぞれ順に並べられている。

【００４７】この実施例の全工程の所用時間は 7.5時間
であった。

【００４８】図11において、#1および#8には、分子量マ
−カ−であるφX 174 Hae III フラグメントを使用し
た。このφX 174 Hae III フラグメントは、プラスミド
φX 174 を制限酵素 HaeIII で切断したものであり、BR
L 社より入手した（Cat.No.5611SA ）。#2ないし#7およ
び#9ないし #14には、上述の試料を使用した。

【００４９】サイズマ−カ−により、増幅されたシ−ク
エンスのサイズは 114bpであることが確認された。

【００５０】図11から明らかなように、#2ないし#7およ
び#9ないし#14 の各試料が形成したバンドの間に大きな
相違はなく、またサイズが全て 114 bp である。したが
って、Taq ポリメラ−ゼがタ−ゲットシ−クエンスに従
ってＤＮＡの合成を行なう際に、標識した２種類のヌク
レオチド（ジゴキシゲニン-11-ｄＵＴＰおよびビオチン
-7- ｄＡＴＰ）を、無標識のヌクレオチドと同様に取り
込んでいることが確認された。

【００５１】実施例２ 増幅したＤＮＡのイムノアッセイ法による検出 実施例１において増幅したＤＮＡを、ＤＮＡ中に取り込
まれたビオチンを利用して予めアビジンを導入した固相
支持体に固相化した後、ＤＮＡの検出を行なった。ＤＮ
Ａの検出は、増幅されたＤＮＡに取り込まれたジゴキシ
ゲニンの量を測定することにより行なった。

【００５２】実験手順 Ａ．ストレプトアビジンの固相化 １）ストレプトアビジン（Boehringer Mannheim 社、Ca
t.No.973 190）を、固相化緩衝液（50ｍＭ炭酸緩衝液 p
H 9.5 ）に10μｇ／ｍｌとなるように溶解する。

【００５３】２）ＮＵＮＣプレ−ト（マイクロウェル
モデルＦ-16 ）の各ウェルに上記溶液を 100μｌ分注
し、 4℃で一晩保存する。

【００５４】３）プレ−トをＰＢＳ（リン酸緩衝生理食
塩水）で洗浄し、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）の 1％
ＰＢＳ溶液 250ｍｌを分注し37℃で 1時間保存する。

【００５５】４）プレ−トをＰＢＳ（0.01％ Tween 20
）で洗浄する。 Ｂ．ＰＣＲによって増幅されたＤＮＡのエタノ−ル処理 ＰＣＲによって増幅されたＤＮＡをエタノ−ル処理して
未反応のヌクレオチドを除去する。

【００５６】１）ＰＣＲにより得られたＤＮＡ溶液 100
μｌに 3Ｍ酢酸ナトリウムを添加する。

【００５７】２）次に、エタノ−ル 250μｌを添加して
-70℃で15分間保存する。

【００５８】３） 15 分間遠心して沈殿したＤＮＡを70
％エタノ−ルで洗浄し、ＴＥ緩衝液（10ｍＭトリス、 1
ｍＭ ＥＤＴＡ、pH 8.0）に溶解する。 Ｃ．イムノアッセイ Ａにおいて調製したストレプトアビジン固相化ＮＵＮＣ
プレ−トを使用し、Ｂにおいてエタノ−ル処理したＤＮ
Ａを試料としてアッセイを行なう。

【００５９】１）Ｂにおいてエタノ−ル処理したＤＮＡ
を、ＴＥ緩衝液で10倍希釈する。

【００６０】２）Ａにおいて調製したストレプトアビジ
ン固相化ＮＵＮＣプレ−トに、上記希釈ＤＮＡ溶液 100
μｌを分注し、37℃で 1時間インキュベ−トする。

【００６１】３）20％ Tween 20 を含有するＴＥＳ´緩
衝液（10ｍＭトリス、 150ｍＭ ＮａＣｌ、pH 7.6）で
ＮＵＮＣプレ−トのウェルを洗浄し、 1％ＢＳＡを含む
ＴＥＳ´緩衝液で 1／5000希釈した抗ジゴキシゲニン(F
ab)-アルカリホスフェ−ト（Boehringer Mannheim 社）
の溶液 100μｌを分注して37℃で30分間インキュベ−ト
する。

【００６２】４）20％ Tween 20 を含有するＴＥＳ´緩
衝液（10ｍＭトリス、 150ｍＮａＣｌ、pH 7.6）でＮＵ
ＮＣプレ−トのウェルを洗浄した後、各ウェルに基質で
あるp-ＮＰＰ（p-ニトロフェニルホスフェ−ト：Phosph
ate Substrate System for ELISA、Kirkegard ＆ Perry
Laboratories Inc.） 100μｌを分注し、25℃で 1時間
インキュベ−トする。

【００６３】５）インキュベ−ト後、マイクロプレ−ト
リアクタ− モデル EL311（Microplate Reactor Model
EL311、Bio-Tek Instruments Inc.）を用いて、波長40
5 ｎｍにおける吸光度を測定する。

【００６４】 実験条件 ＰＣＲの反応溶液（全容量 100μｌ） Ｎｏ． 1 2 3 4 dNTP混合物^**（μＭ） 200 200 200 0 dNTP混合物^*** （μＭ） 0 0 0 200 プライマ−#1^* （μＭ） 1.0 1.0 1.0 1.0 プライマ−#2^* （μＭ） 1.0 1.0 1.0 1.0 MOLT4 ＤＮＡ（μｇ） 2 2 2 2 pBH10 ＤＮＡ（コピ−数） 10⁶ 10⁴ 0 10⁶ Taq ポリメラ−ゼ（ユニット） 2.5 2.5 2.5 2.5 プライマ−#1^* 、プライマ−#2^* ： SYNTHETIC GENETIC
INC. 製 ｄＮＴＰ混合物^**： ｄＣＴＰ： 200μＭ、ｄＧＴＰ： 200μＭ、ｄＡＴＰ：
180μＭ、ｄＴＴＰ： 180μＭ、ビオチン-7- ｄＡＴ
Ｐ：20μＭ ジゴキシゲニン-11-ｄＵＴＰ：20μＭ ｄＮＴＰ混合物^*** ： ｄＣＴＰ： 200μＭ、ｄＧＴＰ： 200μＭ、ｄＡＴＰ：
200μＭ、ｄＴＴＰ： 200μＭ ＰＣＲのサイクルは、THERMAL CYCLER（Perkine-Elmer
Cetus ）を使用して、以下の設定で行なった。

【００６５】第１サイクル：94℃、1 分 第２サイクル：94℃、1 分 55℃ 1 分 72℃ 1 分 この第２サイクルを30回繰り返した。

【００６６】結 果 波長 405ｎｍにおける吸光度の測定結果は以下の通りで
あった。

【００６７】Ｎｏ． Ａ（405nm ） ＃１ 2.583 ＃２ 1.004 ＃３ 0.103 ＃４ 0.053 上記結果より明らかなように、#1および#2においては、
ｐＢＨ10 ＤＮＡのコピ−数に応じて吸光度が増加して
いる（#1のコピ−数は10⁶ 個、#2のコピ−数は10⁴ 個で
ある）。これに対して、ｐＢＨ10 ＤＡＮのコピ−を含
まない#3の試料、および無標識のヌクレオチドを使用し
た#4の試料の吸光度は、バックグランドのレベルであっ
た。

【００６８】なお、この実施例の全工程の所用時間は 2
8 時間であった。

【００６９】実施例３ 増幅したＤＮＡのアガロ−スゲルを用いた分画 実施例１において増幅したＤＮＡを、アガロ−スゲル
（バイオゲルＡ-15 #151-1050 ： BIO-RAD社）を用いて
分画した。これにより、増幅したシ−クエンスのバンド
のみを分画した。

【００７０】実験手順 Ａ．ＰＣＲによる増幅 実施例１と同様の方法で、目的のＤＮＡの増幅を行な
う。 Ｂ．アガロ−スゲルカラムの作成 Current Protocols in Molecular Biology 3-4-8（ Joh
n Wiley ＆ Sons NewYork 1988 ）の方法に従って、図1
2に示すカラムを作製する。図に示すように、このカラ
ムは、パストゥ−ルピペット51にガラスウ−ル52および
カラム樹脂53を充填したものである。次に、Ａで増幅し
たＤＮＡ試料をカラムに通して分画し、ミクロ遠心管54
に取る。各々 100μｌのフラクション#1−#17 を採取す
る。Ｃ．アガロ−ス電気泳動を用いる、各フラクション
中に含まれるＤＮＡの確認各フラクションについて、Mo
lecular Cloning 6-2 （Cold Spring Harbor Laborator
y Press 1989）の方法に従って電気泳動を行なう。次
に、エチジウムブロマイドでＤＮＡを染色し（Molecula
r Cloning 6-14）、得られたパタ−ンをFCR-10カメラ
（5-5330、FOTODYNE Incorporated ）を用いて撮影す
る。

【００７１】実験条件 ＰＣＲの反応溶液（全容量 100μｌ） Ｎｏ． 1 dNTP混合物^**（μＭ） 200 プライマ−#1^* （μＭ） 1.0 プライマ−#2^* （μＭ） 1.0 MOLT4 ＤＮＡ（μｇ） 2 pBH10 ＤＮＡ（コピ−数） 10⁶ Taq ポリメラ−ゼ（ユニット） 2.5 プライマ−#1^* 、プライマ−#2^* ： SYNTHETIC GENETIC
INC. 製 ｄＮＴＰ混合物^**： ｄＣＴＰ： 200μＭ、ｄＧＴＰ： 200μＭ、ｄＡＴＰ：
180μＭ、ｄＴＴＰ： 180μＭ、ビオチン-7- ｄＡＴ
Ｐ：20μＭ ジゴキシゲニン-11-ｄＵＴＰ：20μＭＰＣＲのサイクル
は、THERMAL CYCLER（Perkine-Elmer Cetus ）を使用し
て、以下の設定で行なった。

【００７２】第１サイクル：94℃、 1分 第２サイクル：94℃、 1分 55℃ 1分 72℃ 1分 この第２サイクルを30回繰り返した。

【００７３】結 果 得られた電気泳動パタ−ンの写真を図13に示す。図に示
すように、20個の試料は２列に配置されており、上列左
から右へ #1 ないし #10の試料が、また下列左から右へ
#11ないし #20の試料がそれぞれ順に並べられている。

【００７４】図中、それぞれの試料 No.は次のフラクシ
ョンを示す。

【００７５】 試料 No. フラクション No. ＃１、＃11 分子サイズ標準（φX174RF DNA／ Hae III：BRL ） ＃２ ＰＣＲ反応後のサンプル（分画を行なっていない） ＃３ フラクション＃１ ＃４ フラクション＃２ ＃５ フラクション＃３ ＃６ フラクション＃４ ＃７ フラクション＃５ ＃８ フラクション＃６ ＃９ フラクション＃７ ＃10 フラクション＃８ ＃12 フラクション＃９ ＃13 フラクション＃10 ＃14 フラクション＃11 ＃15 フラクション＃12 ＃16 フラクション＃13 ＃17 フラクション＃14 ＃18 フラクション＃15 ＃19 フラクション＃16 ＃20 フラクション＃17 ＰＣＲの後の分画を行なわないままの試料 #2 では、増
幅されたシ−クエンスのバンドと、ウェル近くの MOLT
4 のバンドが見出される。増幅されたシ−クエンスのサ
イズは、サイズマ−カ−により 114塩基対であると確認
された。増幅されたシ−クエンスは、フラクション #9
に分画された。

【００７６】この実施例の全工程の所用時間は 8時間45
分であった。

【００７７】この実施例においては増幅したＤＮＡのフ
ラクションをアガロ−スゲル電気泳動によって行なって
いるが、アガロ−スゲル電気泳動の代わりにキャピラリ
−電気泳動を用いることにより、より短時間（30分以
内）で測定を行なうことができ、しかも増幅されたＤＮ
Ａの分子量の測定が可能となる。

【００７８】なお、この実施例の方法においては、ＰＣ
Ｒに用いられるヌクレオチドに対する固相化用の標識は
なくてもよい。

【００７９】実施例４ 増幅したＤＮＡの、化学発光を利用するイムノアッセイ
法による検出 ＰＣＲの後、得られた試料をアガロ−スゲル（バイオゲ
ルＡ-15 #151-1050 ：BIO-RAD 社）を用いて分画し、増
幅されたＤＮＡを、実施例２のＡと同様の方法で作製し
たストレプトアビジン固相化ＮＵＮＣイムノテストチュ
−ブ（Cat.No.444474 ）に固相化した。ＤＮＡの検出
は、増幅されたＤＮＡに取り込まれたジゴキシゲニンと
酵素標識した抗ジゴキシゲニン抗体とを反応させ、基質
として化学発光試薬を用いてジゴキシゲニンの量を測定
することにより行なった。なお、基質として、通常の吸
光度測定に使用される pＮＮＰを用いた比較試験も行な
った。

【００８０】実験手順 Ａ．ストレプトアビジンの固相化 １）ストレプトアビジン（Boehringer Mannheim 社、 C
at.No.973 190 ）を、固相化緩衝液（50ｍＭ炭酸緩衝液
pH 9.5 ）に 10 μｇ／ｍｌとなるように溶解する。

【００８１】２）ＮＵＮＣイムノテストチュ−ブ（Cat.
No.444474 ）に上記溶液を 100μｌ分注し、 4℃で一晩
保存する。

【００８２】３）テストチュ−ブをＰＢＳで洗浄し、Ｂ
ＳＡの 1％ＴＢＳ´溶液（10ｍＭトリス pH 8.0 、 150
ｍＭ ＮａＣｌ）250 ｍｌを分注し37℃で 1時間保存す
る。

【００８３】４）テストチュ−ブをＴＢＳ´0.01％ Twe
en 20 で洗浄する。 Ｂ．ＰＣＲによって増幅されたＤＮＡのアガロ−スゲル
分画 アガロ−スゲルを用いて、ＰＣＲによって増幅されたＤ
ＮＡからの未反応のヌクレオチドの除去と、ＤＮＡの分
画処理を行なった。

【００８４】実施例３と同様に、Current Protocols in
Molecular Biology 3-4-8（ JhonWiley ＆ Sons New Y
ork 1988 ）に従ってカラムを作製した（図12）。次い
で、実施例１と同様の方法で増幅したＤＮＡ試料をカラ
ムに通して分画し、各々 100μｌのフラクション#1−#1
7 を採取する。#7のフラクションを試料として以下のイ
ムノアッセイを行なう。 Ｃ．イムノアッセイ Ａにおいて調製したストレプトアビジン固相化ＮＵＮＣ
イムノテストチュ−ブを使用し、Ｂにおいて採取した #
7 のフラクションを試料としてアッセイを行なう。

【００８５】１）Ｂにおいて採取した #7 の分画を、Ｔ
ＢＳ´緩衝液で10倍希釈する。

【００８６】２）Ａにおいて作製したストレプトアビジ
ン固相化ＮＵＮＣイムノテストチュ−ブに、上記希釈Ｄ
ＮＡ溶液 100μｌを分注し、37℃で 1時間インキュベ−
トする。

【００８７】３）20％ Tween 20 を含有するＴＥＳ´緩
衝液（10ｍＭトリス、 150ｍＭ ＮａＣｌ、pH 7.6）で
ＮＵＮＣチュ−ブを 3回洗浄し、ＢＳＡの 1％ＴＥＳ´
緩衝溶液で 1／5000希釈した抗ジゴキシゲニン(Fab)-ア
ルカリホスフェ−ト（Boehringer Mannheim 社）の溶液
100μｌを分注して37℃で30分間インキュベ−トする。

【００８８】４）20％ Tween 20 を含有するＴＥＳ´緩
衝液（10ｍＭトリス、 150ｍＭ ＮａＣｌ、pH 7.6）で
ＮＵＮＣチュ−ブを洗浄した後、基質である化学発光試
薬Lumi-Phos ^TM 530（Lumigen inc.） 100μｌを分注
し、シンチレ−ションカウンタ− WALLAC 1410（PHARMA
CIA ）を用いて化学発光を測定する。

【００８９】５）４）における化学発光試薬の代わり
に、p-ＮＰＰ（Phosphate SubstrateSystem for ELIS
A、Kirkegard ＆ Perry Laboratories Inc.）100 ｍｌ
を分注して25℃で18時間インキュベ−トした後、マイク
ロプレ−トリアクタ−・モデル EL311（Bio-Tek Instru
ments Inc.）を使用して波長 405ｎｍにおける吸光度を
測定する。 Ｄ．化学発光試薬を用いた測定 上述のように、この実施例においては、ＤＮＡ検出の際
に基質として Lumi-Phos^TM 530（Lumigen Inc.）を使用
している。Lumigen Inc.によると、この試薬からの発光
はルミノメ−タ−を用いて測定するものとされている
（Clinical Chemistry、35、1863（1989）、Lumigen In
formation ）。しかしながら、この実施例において、本
発明者らは、この試薬からの発光をシンチレ−ションカ
ウンタ− WALLAC 1410（PHARMACIA ）を用いてカウント
することにより測定した。

【００９０】この実施例において用いた Lumi-Phos^TM 5
30は、酵素の無い状態であっても、自然発光であると考
えられる1000 cpm程度の発光がある。したがって、この
試薬系はバックグランドが高く、このため測定の際の S
／N 比が著しく悪化する問題点が指摘されている。とこ
ろで、 Lumi-Phos^TM 530の主成分である Lumigen^TM PPD
は、アルカリホスファタ−ゼによって不安定な状態に移
行し、発光する（Clinical Chemistry 35 、1863（198
9））。この光のエネルギ−は、さらに、発光系のエン
ハンサ−であるコ- ミセル化フルオレッサ−（co-micel
lized fluorescer）に移行し、 400倍の強度の光を発光
する。したがって、化学発光において、どのエネルギ−
の光がどの程度の強度を有しているかを分析することに
より、化学発光試薬そのものが発する光とエンヘンサ−
により増幅された光とを区別することが可能になるもの
と考えられる。

【００９１】一方、シンチレ−ションカウンタ−は、本
来、放射性同位体から発生するβ線を測定するものであ
り、β線をシンチレ−タ−で可視光に変換してその光子
数をフォトマルで測定する。放射性同位体から発生する
β線には、そのエネルギ−が核種によって異なるという
特性があるので、ある特定のエネルギ−を有する光子の
みを選択して取り出すことができれば、複数の核種を同
時に測定することが可能になる。本発明者らが用いたシ
ンチレ−ションカウンタ− WALLAC 1410は、ウインドウ
を設けることにより、特定のエネルギ−を有する光子の
みを取り出すことを可能にしている。

【００９２】本発明者らは、このシンチレ−ションカウ
ンタ− WALLAC 1410を用いて、 Lumi-Phos^TM 530から発
生される光子のエネルギ−を測定した。その結果、酵素
の存在下で発生する光と酵素のない状態で発生する自然
発光とでは、光子のエネルギ−が有するエネルギ−準位
に明らかな相違があることが判明した。したがって、酵
素の存在下で発生する光子が有するエネルギ−で測定す
ることにより、バックグランドの値をほぼ０とし、 S／
N 比を飛躍的に向上させることが可能であることが確か
められた。このような知験の下に、本発明者らは、 WAL
LAC 1410のウインドウをチャンネル 250-1000 に設定
し、化学発光試薬そのものが発する低エネルギ−の光を
カットして、より高いエネルギ−の光を真のアルカリホ
スファタ−ゼによる発光として測定した。

【００９３】 実験条件 ＰＣＲの反応溶液（全容量 100μｌ） Ｎｏ． 1 2 3 4 dNTP混合物^**（μＭ） 200 200 200 200 プライマ−#1^* （μＭ） 1.0 1.0 1.0 1.0 プライマ−#2^* （μＭ） 1.0 1.0 1.0 1.0 MOLT4 ＤＮＡ（μｇ） 2 2 2 2 pBH10 ＤＮＡ（コピ−数） 10⁶ 10⁴ 10² 0 Taq ポリメラ−ゼ（ユニット） 2.5 2.5 2.5 2.5 プライマ−#1^* 、プライマ−#2^* ： SYNTHETIC GENETIC
INC. 製 ｄＮＴＰ混合物^**： ｄＣＴＰ： 200μＭ、ｄＧＴＰ： 200μＭ、ｄＡＴＰ：
180μＭ、ｄＴＴＰ： 180μＭ、ビオチン-7- ｄＡＴ
Ｐ：20μＭ ジゴキシゲニン-11-ｄＵＴＰ：20μＭ ＰＣＲのサイクルは、ハイブリッド・サ−マル・リアク
タ− モデルHB-TR1（tional Labnet Co. ）を使用し
て、以下の設定で行なった。

【００９４】第１サイクル： 94℃ ２分 第２サイクル： 94℃ １分 55℃ １分 72℃ １分 この第２サイクルを 30 回繰り返した。

【００９５】結 果 シンチレ−ションカウンタ−で測定した結果を図14に示
す。この図において、縦軸は 1分当りのカウント数（ C
PM）、横軸は時間を表わす。

【００９６】図14より明らかなように、カウント数は化
学発光物質を添加した後約 1.5時間でほぼプラト−に達
する。この時点でのそれぞれの試料のカウント数は、以
下の通りである。

【００９７】 試 料 ＣＰＭ MOLT 4＋10⁶ コピ− 3.0×10⁷ MOLT 4＋10⁴ コピ− 4.6×10⁶ MOLT 4＋10² コピ− 2.7×10³ MOLT 4 0.9×10 同じ試料を、カロリメトリ法に用いられる呈色試薬を用
いて測定した場合には、次のような結果が得られた。

【００９８】 試 料 吸光度（Ａ₄₀₅ ） MOLT 4＋10⁶ コピ− ＞ 2.5 MOLT 4＋10⁴ コピ− 1.005 MOLT 4＋10² コピ− 0.603 MOLT 4 0.056 このように、この実施例の方法によると、ＤＮＡの増幅
を行なわないものとＤＮＡを10⁶ 倍に増幅したものとで
は、カウント数の比が10⁶ オ−ダ−にもなる。すなわ
ち、10⁶ という高い S／N 比が得られる。

【００９９】これに対して、従来のカロリメトリ法によ
り得られた結果は、 S／N 比がわずかに10² のオ−ダ−
でしかない。また、酵素と反応させるために18時間とい
う長い時間インキュベ−ションしなければならない。

【０１００】

【発明の効果】以上のように、この発明による核酸検出
方法は、タ−ゲットシ−クエンスを短時間でかつ容易に
増幅し、増幅したシ−クエンスも簡単な操作で短時間に
検出することが可能である。すなわち、この発明の方法
によると、検出に要する全体の時間を短くすることが可
能である。

【図面の簡単な説明】

【図１】この発明による核酸検出方法の第１の態様にお
ける、ＰＣＲの原理を説明する図。

【図２】図１に示すＰＣＲによって増幅されたＤＮＡを
模式的に示す図。

【図３】図２に示すＤＮＡの固相化を模式的に示す図。

【図４】固相化されたＤＮＡの検出を模式的に示す図。

【図５】この発明による核酸検出方法の第２の態様にお
ける、ＰＣＲの原理を説明する図。

【図６】図５に示すＰＣＲによって増幅されたＤＮＡを
模式的に示す図。

【図７】図６に示すＤＮＡの固相化を模式的に示す図。

【図８】固相化されたＤＮＡの検出を模式的に示す図。

【図９】この発明の実施例において用いた、ＨＩＶのＧ
ＡＧ領域に特異性を有するプライマ−の塩基配列を示す
図。

【図１０】図９に示されるプライマ−によって増幅され
る、ＨＩＶ遺伝子の領域を示す図。

【図１１】この発明の実施例において、ＰＣＲによって
増幅されたＤＮＡに標識ヌクレオチドが取り込まれたこ
とを示す電気泳動パタ−ンの写真。

【図１２】この発明の実施例において用いられるアガロ
−スゲルカラムの概略を示す図。

【図１３】この発明の実施例において得られた、ゲルろ
過後の試料の電気泳動パタ−ンを示す写真。

【図１４】この発明の実施例における、コピ−数の異な
る試料に対する化学発光を利用したイムノアッセイの結
果を示すグラフである。

【符号の説明】

11、21…二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ、12、22…一本鎖Ｄ
ＮＡまたはＲＮＡ、13、23…プライマ−、14、24…検出
用標識剤、15、25…固相化用標識剤、17、27…固相化
剤、18、28…リガンド、51…パストゥ−ルピペット、52
…ガラスウ−ル、53…カラム樹脂

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 生物学的試料中の核酸に含まれる少なく
   とも１種のヌクレオチド配列の検出方法であって、 （ａ）２つの独立した相補鎖からなる少なくとも１種の
   ヌクレオチド配列を有する生物学的試料を、２種のプラ
   イマ−を用いて、各々のプライマ−がそれぞれのヌクレ
   オチド配列に結合してハイブリッドを形成するような条
   件下で処理する工程と、 （ｂ）前記ヌクレオチド配列をテンプレ−ト鎖として用
   い、溶液からヌクレオチドを取り込むことにより前記ハ
   イブリッドのプライマ−鎖を伸長する工程であって、伸
   長プライマ−鎖に取り込まれるヌクレオチドの複数が検
   出可能に修飾されたヌクレオチドおよび分離可能に修飾
   されたヌクレオチドである工程と、 （ｃ）伸長プライマ−鎖をテンプレ−トから解離して一
   本鎖を形成する工程と、 （ｄ）工程（ｃ）において生じた一本鎖を、工程（ａ）
   と同じ条件下で、工程（ａ）で用いたプライマ−で処理
   し、次いで工程（ｂ）と同じ条件下でプライマ−鎖を伸
   長する工程と、 （ｅ）リガンドを固相化した固相支持体にプライマ−の
   伸長生成物を結合させることにより、増幅した伸長生成
   物を目的とするヌクレオチド配列以外の配列から分離す
   る工程であって、前記リガンドは、伸長生成物に組み込
   まれた、分離可能に修飾されたヌクレオチドと結合する
   ことが可能である工程と、 （ｆ）伸張生成物に組み込まれている検出可能に修飾さ
   れているヌクレオチドの量を測定し、生物学的試料中に
   おける目的とするヌクレオチド配列の検出を行なう工程
   とを具備する方法。
2. 【請求項２】 生物学的試料中の核酸に含まれる少なく
   とも１種のヌクレオチド配列の検出方法であって、 （ａ）２つの独立した相補鎖からなる少なくとも１種の
   ヌクレオチド配列を有する生物学的試料を、２種のプラ
   イマ−を用いて、各々のプライマ−がそれぞれのヌクレ
   オチド配列に結合してハイブリッドを形成するような条
   件下で処理する工程であって、前記プライマ−の５´末
   端が分離可能に修飾されている工程と、 （ｂ）前記ヌクレオチド配列をテンプレ−ト鎖として用
   い、溶液からヌクレオチドを取り込むことにより前記ハ
   イブリッドのプライマ−鎖を伸長する工程であって、伸
   長プライマ−鎖に取り込まれるヌクレオチドの複数が検
   出可能に修飾されたヌクレオチドである工程と、 （ｃ）伸長プライマ−鎖をテンプレ−トから解離して一
   本鎖を形成する工程と、 （ｄ）工程（ｃ）において生じた一本鎖を、工程（ａ）
   と同じ条件下で、工程（ａ）で用いたプライマ−で処理
   し、次いで工程（ｂ）と同じ条件下でプライマ−鎖を伸
   長する工程と、 （ｅ）リガンドを固相化した固相支持体にプライマ−の
   伸長生成物を結合させることにより、増幅した伸長生成
   物を目的とするヌクレオチド配列以外の配列から分離す
   る工程であって、前記リガンドは、伸長生成物に組み込
   まれた、分離可能に修飾されたプライマ−と結合するこ
   とが可能である工程と、 （ｆ）伸張生成物に組み込まれている検出可能に修飾さ
   れているヌクレオチドの量を測定し、生物学的試料中に
   おける目的とするヌクレオチド配列の検出を行なう工程
   とを具備する方法。
3. 【請求項３】 生物学的試料中の核酸に含まれる少なく
   とも１種のヌクレオチド配列の検出方法であって、 （ａ）２つの独立した相補鎖からなる少なくとも１種の
   ヌクレオチド配列を有する生物学的試料を、２種のプラ
   イマ−を用いて、各々のプライマ−がそれぞれのヌクレ
   オチド配列に結合してハイブリッドを形成するような条
   件下で処理する工程であって、 （ｂ）前記ヌクレオチド配列をテンプレ−ト鎖として用
   い、溶液からヌクレオチドを取り込むことにより前記ハ
   イブリッドのプライマ−鎖を伸長する工程であって、伸
   長プライマ−鎖に取り込まれるヌクレオチドの複数が検
   出可能に修飾されたヌクレオチドである工程と、 （ｃ）伸長プライマ−鎖をテンプレ−トから解離して一
   本鎖を形成する工程と、 （ｄ）工程（ｃ）において生じた一本鎖を、工程（ａ）
   と同じ条件下で、工程（ａ）で用いたプライマ−で処理
   し、次いで工程（ｂ）と同じ条件下でプライマ−鎖を伸
   長する工程と、 （ｅ）分子量、サイズ、または電荷量の差異に基づい
   て、増幅した伸長生成物を目的とするヌクレオチド配列
   以外の配列から分離する工程と、 （ｆ）伸張生成物に組み込まれている検出可能に修飾さ
   れているヌクレオチドの量を測定し、生物学的試料中の
   ヌクレオチド配列の検出を行なう工程とを具備する方
   法。
4. 【請求項４】 前記検出可能に修飾されたヌクレオチド
   が蛍光物質で標識されたヌクレオチドであり、前記プラ
   イマ−がいずれもヌクレオチドの標識に用いられる蛍光
   物質とは異なる蛍光物質で標識されており、工程（ｅ）
   における増幅された伸長生成物の分離がキャピラリ−電
   気泳動により行なわれ、かつ検出可能に修飾されたヌク
   レオチドの量の測定が前記２種の蛍光標識を異なる波長
   領域で同時に測定することにより行なわれる請求項３記
   載の方法。