JPH0690760A - アミロイドペプチド前駆体のｒｎａ - Google Patents
アミロイドペプチド前駆体のｒｎａInfo
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- JPH0690760A JPH0690760A JP3069366A JP6936691A JPH0690760A JP H0690760 A JPH0690760 A JP H0690760A JP 3069366 A JP3069366 A JP 3069366A JP 6936691 A JP6936691 A JP 6936691A JP H0690760 A JPH0690760 A JP H0690760A
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4711—Alzheimer's disease; Amyloid plaque core protein
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- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【目的】 アルツハイマー病及びダウン症患者の脳由来
のヒト アミロイド ペプチド前駆体のＲＮＡの提供。 【構成】 上記ＲＮＡはマウスまたはラツト脳組織には
実質上存在しないがヒト脳組織には多量ある。そのＲＮ
Ａに相当するｃＤＮＡクローンから先に記載されたアミ
ロイドペプチド前駆体（ＡＰＰ７７０）のアミノ末端に
類似するが、ベータアミロイドペプチドまたは疎水性膜
貫通ドメイン(trnsmembrane spanning domain)を欠く３
６５アミノ酸のタンパク質の存在が考えられる。これら
の特徴からそのヒトＲＮＡがクニツツプロテアーゼイン
ヒビターを含む可溶性タンパク質をコードすることが示
唆される。
のヒト アミロイド ペプチド前駆体のＲＮＡの提供。 【構成】 上記ＲＮＡはマウスまたはラツト脳組織には
実質上存在しないがヒト脳組織には多量ある。そのＲＮ
Ａに相当するｃＤＮＡクローンから先に記載されたアミ
ロイドペプチド前駆体（ＡＰＰ７７０）のアミノ末端に
類似するが、ベータアミロイドペプチドまたは疎水性膜
貫通ドメイン(trnsmembrane spanning domain)を欠く３
６５アミノ酸のタンパク質の存在が考えられる。これら
の特徴からそのヒトＲＮＡがクニツツプロテアーゼイン
ヒビターを含む可溶性タンパク質をコードすることが示
唆される。
Description
【０００１】
【発明の背景】本発明はアルツハイマー病及びダウン症
患者の脳から単離した新規ヒトアミロイドペプチド前駆
体のＲＮＡに関する。
患者の脳から単離した新規ヒトアミロイドペプチド前駆
体のＲＮＡに関する。
【０００２】アルツハイマー病は通常中年から老人に見
られる記憶及び知的機能の進行的喪失を特徴とするヒト
中枢神経系の病変である。６５才以上の人口の１０％が
この病気にかかつており（ハーデイ、Ｊ．Ａ．(Hardy,
J.A.)ら、７ ニユーロバイオエイジンク（Neurobio Ag
ing)４８９（１９８６））、痴呆の第１原因であり米国
における志望の主原因である（カツツマン、Ｒ．（Katz
man, R.)、３３ アーカイブズ ニユーロル(Arch. Neu
rol.)２１７（１９７６））。
られる記憶及び知的機能の進行的喪失を特徴とするヒト
中枢神経系の病変である。６５才以上の人口の１０％が
この病気にかかつており（ハーデイ、Ｊ．Ａ．(Hardy,
J.A.)ら、７ ニユーロバイオエイジンク（Neurobio Ag
ing)４８９（１９８６））、痴呆の第１原因であり米国
における志望の主原因である（カツツマン、Ｒ．（Katz
man, R.)、３３ アーカイブズ ニユーロル(Arch. Neu
rol.)２１７（１９７６））。
【０００３】アルツハイマー病の原因は不明である。こ
の病気は世界的に見られ、栄養要因、伝染、毒、または
他の環境要因との明確な関係は何ら示唆されていない。
約４分の１の患者については患者家族員にその病歴が見
られる。このことはダウン症患者のほとんど全員が脳に
アルツハイマーの病変を起すという事実と合わせて、お
そらく２１番染色体上の常染色体優性素質として遺伝す
る遺伝的罹病性を示唆する（セント ジヨージ ハイス
ロツプ、Ｐ．Ｈ．（St. George-Hyslop, P.H.)ら、２３
５、サイエンス(Science)８８５（１９８７）、ウイン
ガーデン、Ｊ．Ｂ．(Wyngaarden, J.B.)及びスミス、
Ｌ．Ｈ(Smith, L.H.)編、セシル テキストブツク オ
ブ メデイシン(Cecil's Textbook of Medicine)、第１
８版、Ｗ．Ｂ．サウンダース(W．B．Saunders)、１９８
８、２０８９−９０ページの要約も参照）。しかし、一
卵性双子の病気の同調は５０％以下であり、かかる病状
が現われる場合、患者の徴候及び症候の始まりには数年
の開きがあることがあることから（同書）、他の影響が
重要であるに違いない。
の病気は世界的に見られ、栄養要因、伝染、毒、または
他の環境要因との明確な関係は何ら示唆されていない。
約４分の１の患者については患者家族員にその病歴が見
られる。このことはダウン症患者のほとんど全員が脳に
アルツハイマーの病変を起すという事実と合わせて、お
そらく２１番染色体上の常染色体優性素質として遺伝す
る遺伝的罹病性を示唆する（セント ジヨージ ハイス
ロツプ、Ｐ．Ｈ．（St. George-Hyslop, P.H.)ら、２３
５、サイエンス(Science)８８５（１９８７）、ウイン
ガーデン、Ｊ．Ｂ．(Wyngaarden, J.B.)及びスミス、
Ｌ．Ｈ(Smith, L.H.)編、セシル テキストブツク オ
ブ メデイシン(Cecil's Textbook of Medicine)、第１
８版、Ｗ．Ｂ．サウンダース(W．B．Saunders)、１９８
８、２０８９−９０ページの要約も参照）。しかし、一
卵性双子の病気の同調は５０％以下であり、かかる病状
が現われる場合、患者の徴候及び症候の始まりには数年
の開きがあることがあることから（同書）、他の影響が
重要であるに違いない。
【０００４】アルツハイマー病は連合野及び大脳皮質の
記憶領の選ばれた細胞に進行性の神経異変をある種の皮
質下核における同様の異常と併合して引き起す。神経損
失は特に海馬、扁桃及び前頭及び側頭の連合野の巨大錐
体細胞に起こる。組織病理学的には異変した神経細胞の
多くは変質した神経原線維タンパク質と関連する特異な
タンパク質構造を持つねじれのある細胞間線維の濃縮体
を含有し（セシル(Cecil's)、上述）、細胞間不溶性線
維タンパク質から成るアミロイド斑点及び大脳脈管アミ
ロイドが異常に多量に沈着する（ハーデイ(Hardy)ら、
上述及びウオング、Ｃ．（Wong, C.)ら、８２ プロシ
ーデイング ナチユラル アカデミツクサイエンス イ
ン Ｕ．Ｓ．Ａ．(Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A.)８７
２９（１９８２））。これらの所見はこの病気の特徴と
なつている。
記憶領の選ばれた細胞に進行性の神経異変をある種の皮
質下核における同様の異常と併合して引き起す。神経損
失は特に海馬、扁桃及び前頭及び側頭の連合野の巨大錐
体細胞に起こる。組織病理学的には異変した神経細胞の
多くは変質した神経原線維タンパク質と関連する特異な
タンパク質構造を持つねじれのある細胞間線維の濃縮体
を含有し（セシル(Cecil's)、上述）、細胞間不溶性線
維タンパク質から成るアミロイド斑点及び大脳脈管アミ
ロイドが異常に多量に沈着する（ハーデイ(Hardy)ら、
上述及びウオング、Ｃ．（Wong, C.)ら、８２ プロシ
ーデイング ナチユラル アカデミツクサイエンス イ
ン Ｕ．Ｓ．Ａ．(Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A.)８７
２９（１９８２））。これらの所見はこの病気の特徴と
なつている。
【０００５】アルツハイマー病の病理学的変化は単なる
老化を含む他の病気に見られるものとは異なり、質的と
言うより量的なものである。神経損失、斑点及び濃縮体
は通常少量ではあるが、多くの知性が正常な老人の脳に
見出される。しかし、患者の知性喪失の度合は皮質上の
神経斑点の頻度と関連しているようである（ロツク、
Ｍ．(Roch, M.)ら、２０９ ネイチヤー(Nature)１０９
（１９６６））。
老化を含む他の病気に見られるものとは異なり、質的と
言うより量的なものである。神経損失、斑点及び濃縮体
は通常少量ではあるが、多くの知性が正常な老人の脳に
見出される。しかし、患者の知性喪失の度合は皮質上の
神経斑点の頻度と関連しているようである（ロツク、
Ｍ．(Roch, M.)ら、２０９ ネイチヤー(Nature)１０９
（１９６６））。
【０００６】アルツハイマー病は通常潜行的に始まり、
異常行動の徴候は一様の臨床的な変化が診断される数年
前に見られる。診断は一般的には消去法的に個別に行わ
れる。心内性鬱病、薬物中毒、広汎性脈管病のいくつ
か、代謝欠損、慢性軟膜炎、ピツク病、または初期の広
汎性の一次的または転移性の脳腫瘍は誤診を招く。アル
ツハイマー病に対する特別な実験的決定要因はない（セ
シル(cecil's)上述２０９０ページ)。 イノシンジアルキルアミノアルコロ(inosine dialkylam
inoalcolo)誘導体は記憶及び学習事項の喪失にいくらか
の効果を持つことが示唆され（米国特許３,６４６,００
７号、ゴードン(Gordon))、神経伝達を選択的に促進し
増強するある種の薬物を投与することによつて症状を緩
和することが示唆されているが（米国特許４,４６９,７
０７号リンドバーグ(Lindberg)及びオエグレン(Oegre
n)、米国特許４,５１１,５７０号トウトル(Tuttle)、及
び米国特許４,７１１,８９１号アウフデンブリンケ(Auf
dembrinke)ら）、アルツハイマー病に対する治療は特に
ない。しかし、食事及び薬物いずれによつても変ること
がない知的痴呆化を遅らせることができない。病気の初
期及び中間期においては治療は通常、家族または社会的
機関が行う。患者が正に植物人間的になれば、後期にお
いてしばしば特殊施設に収容する必要がある。
異常行動の徴候は一様の臨床的な変化が診断される数年
前に見られる。診断は一般的には消去法的に個別に行わ
れる。心内性鬱病、薬物中毒、広汎性脈管病のいくつ
か、代謝欠損、慢性軟膜炎、ピツク病、または初期の広
汎性の一次的または転移性の脳腫瘍は誤診を招く。アル
ツハイマー病に対する特別な実験的決定要因はない（セ
シル(cecil's)上述２０９０ページ)。 イノシンジアルキルアミノアルコロ(inosine dialkylam
inoalcolo)誘導体は記憶及び学習事項の喪失にいくらか
の効果を持つことが示唆され（米国特許３,６４６,００
７号、ゴードン(Gordon))、神経伝達を選択的に促進し
増強するある種の薬物を投与することによつて症状を緩
和することが示唆されているが（米国特許４,４６９,７
０７号リンドバーグ(Lindberg)及びオエグレン(Oegre
n)、米国特許４,５１１,５７０号トウトル(Tuttle)、及
び米国特許４,７１１,８９１号アウフデンブリンケ(Auf
dembrinke)ら）、アルツハイマー病に対する治療は特に
ない。しかし、食事及び薬物いずれによつても変ること
がない知的痴呆化を遅らせることができない。病気の初
期及び中間期においては治療は通常、家族または社会的
機関が行う。患者が正に植物人間的になれば、後期にお
いてしばしば特殊施設に収容する必要がある。
【０００７】アルツハイマー病の悲劇は世界中の社会に
おいて老人人口の割合が増加するにつれより頻繁に起こ
る可能性があるため深刻化する。それゆえ、主な研究努
力は診断及び経済的援助と同様に処置及び治療に対して
向けられる。
おいて老人人口の割合が増加するにつれより頻繁に起こ
る可能性があるため深刻化する。それゆえ、主な研究努
力は診断及び経済的援助と同様に処置及び治療に対して
向けられる。
【０００８】近年この病気の生化学的根拠を明らかにす
る研究が始まっている。アルツハイマー病患者の脳アミ
ロイド斑点及び沈着物の主要構成成分として４２アミノ
酸のペプチドが単離された（グレンナー、Ｇ．Ｇ．(Gle
nner, G.G.)及びウオング、Ｃ(Wong, C.)、 １１２ バ
イオケミストリー バイオフイジクス リサーチ コミ
ニケーシヨン(Biochem. Biophys. Res. Commun.)１１３
１（１９８４）及びマスターズ、Ｃ．(Masters, C.)
ら、８２ プロシーデイング ナシヨナル アカデミツ
ク サイエンス イン Ｕ．Ｓ．Ａ．(Proc. Nat. Aca
d. Sci. U.S.A.)４２４５（１９８５））。このペプチ
ドは配列決定され、一部β構造をなしており、それゆえ
ベータアミロイドペプチドまたはＢＡＰと呼ばれてい
る。ダウン症患者の脳由来のベータアミロイドペプチド
の単離物は類似しており、一致した２８アミノ酸のスト
レツチを持ち、このことは両方の病気で起こるアミロイ
ドシスは共通の機構であることを示している（タンツ
イ、Ｒ．(Tanzi, R.)ら、３３１ネイチヤー(Nature)５
２８（１９８８））。
る研究が始まっている。アルツハイマー病患者の脳アミ
ロイド斑点及び沈着物の主要構成成分として４２アミノ
酸のペプチドが単離された（グレンナー、Ｇ．Ｇ．(Gle
nner, G.G.)及びウオング、Ｃ(Wong, C.)、 １１２ バ
イオケミストリー バイオフイジクス リサーチ コミ
ニケーシヨン(Biochem. Biophys. Res. Commun.)１１３
１（１９８４）及びマスターズ、Ｃ．(Masters, C.)
ら、８２ プロシーデイング ナシヨナル アカデミツ
ク サイエンス イン Ｕ．Ｓ．Ａ．(Proc. Nat. Aca
d. Sci. U.S.A.)４２４５（１９８５））。このペプチ
ドは配列決定され、一部β構造をなしており、それゆえ
ベータアミロイドペプチドまたはＢＡＰと呼ばれてい
る。ダウン症患者の脳由来のベータアミロイドペプチド
の単離物は類似しており、一致した２８アミノ酸のスト
レツチを持ち、このことは両方の病気で起こるアミロイ
ドシスは共通の機構であることを示している（タンツ
イ、Ｒ．(Tanzi, R.)ら、３３１ネイチヤー(Nature)５
２８（１９８８））。
【０００９】分子遺伝学的研究（先ずｃＤＮＡのクロー
ニング、またイムノ染色）によつてベータアミロイドペ
プチドはＡＰＰと呼ばれるより大きいアミロイド前駆体
タンパク質から派生することが示されている。胎児脳の
ライブラリー及びアミノ酸配列から作成されたオリゴヌ
クレオチドプローブを用いて、前駆体タンパク質と推定
される６９５アミノ酸の読み取り枠を持つ全長にわたる
ｃＤＮＡクローンと思われるものを単離しＡＰＰ６９５
と名付けられた（カング、Ｊ．(Kang, J.)ら、３２５ネ
イチヤー(Nature)７３３（１９８７））。オープンリー
デイングフレームを持つ他のアミロイドペプチド前駆体
のｃＤＮＡが続けて他のライブラリーから単離された：
ＳＶ４０によつて形質転換された線維芽細胞のライブラ
リー及び前子骨髄白血病細胞ライン（ＨＬ６０）のライ
ブラリーの両者が７５１アミノ酸の推定前駆体（ＡＰＰ
７５１）（それぞれポンテ、Ｐ．(Ponte, P.)ら、３３
１ネイチヤー(Nature)５２５（１９８８）及びタンツイ
(Tanzi)、 上述）、及びヒト神経膠芽細胞ライブラリー
から７７０アミノ酸の推定前駆体（ＡＰＰ７７０）（カ
タグチ、Ｎ．(Kitaguchi, N.) ら、３３１ネイチヤー(N
ature)５３０（１９８８））。さらに最近、第４のタン
パク質前駆体、ＡＰＰ５６３が記載され、（デサウベー
ジ、Ｆ．(Desauvage, F.）、及びオクタブ、Ｊ．Ｎ．(O
ctave, J.N.)、２４５サイエンス(Science)６５１（１
９８９））、それは新規の２０アミノ酸の挿入によつて
置換されたＡＰＰ７５１のＢＡＰドメインを含む２０８
アミノ酸のカルボキシ末端を持っていた。これら一致は
しないが類似する前駆体はおそらく転写物のスプライシ
ングが異なるためであろう（タンツイ(Tanzi)及びポン
テ(Ponte)、上述、及びレメイレ、Ｈ．Ｇ．(Lemaire,
H.G.)ら、１７ヌクレイツクアシツドリサーチ(nucleic
Acid Res.)５１７（１９８９））。
ニング、またイムノ染色）によつてベータアミロイドペ
プチドはＡＰＰと呼ばれるより大きいアミロイド前駆体
タンパク質から派生することが示されている。胎児脳の
ライブラリー及びアミノ酸配列から作成されたオリゴヌ
クレオチドプローブを用いて、前駆体タンパク質と推定
される６９５アミノ酸の読み取り枠を持つ全長にわたる
ｃＤＮＡクローンと思われるものを単離しＡＰＰ６９５
と名付けられた（カング、Ｊ．(Kang, J.)ら、３２５ネ
イチヤー(Nature)７３３（１９８７））。オープンリー
デイングフレームを持つ他のアミロイドペプチド前駆体
のｃＤＮＡが続けて他のライブラリーから単離された：
ＳＶ４０によつて形質転換された線維芽細胞のライブラ
リー及び前子骨髄白血病細胞ライン（ＨＬ６０）のライ
ブラリーの両者が７５１アミノ酸の推定前駆体（ＡＰＰ
７５１）（それぞれポンテ、Ｐ．(Ponte, P.)ら、３３
１ネイチヤー(Nature)５２５（１９８８）及びタンツイ
(Tanzi)、 上述）、及びヒト神経膠芽細胞ライブラリー
から７７０アミノ酸の推定前駆体（ＡＰＰ７７０）（カ
タグチ、Ｎ．(Kitaguchi, N.) ら、３３１ネイチヤー(N
ature)５３０（１９８８））。さらに最近、第４のタン
パク質前駆体、ＡＰＰ５６３が記載され、（デサウベー
ジ、Ｆ．(Desauvage, F.）、及びオクタブ、Ｊ．Ｎ．(O
ctave, J.N.)、２４５サイエンス(Science)６５１（１
９８９））、それは新規の２０アミノ酸の挿入によつて
置換されたＡＰＰ７５１のＢＡＰドメインを含む２０８
アミノ酸のカルボキシ末端を持っていた。これら一致は
しないが類似する前駆体はおそらく転写物のスプライシ
ングが異なるためであろう（タンツイ(Tanzi)及びポン
テ(Ponte)、上述、及びレメイレ、Ｈ．Ｇ．(Lemaire,
H.G.)ら、１７ヌクレイツクアシツドリサーチ(nucleic
Acid Res.)５１７（１９８９））。
【００１０】アルツハイマー病患者におけるアミロイド
ペプチドの過剰生産は前駆体タンパク質をコードする遺
伝子内でフレームシフト変異によりペプチドの翻訳が繰
り返されることによつて起こることが示唆されている(D
Er. Pat. Ap. No.３４１,４９１スキヤンゴス(Scangos)
ら）。 この変異は上述のカンゲ(Kange)らが発表したｃ
ＤＮＡ配列のヌクレオチド１８９７と１９２１の間で起
きると考えられている。 アミロイド前駆体タンパク質
のＤＮＡのオープンリーデイングフレームにはベータア
ミロイドペプチドに加え他の機能因子がコードされてい
るようである。ＡＰＰ７５１及びＡＰＰ７７０の両者は
セリンプロテアーゼインヒビターのクニツツ(Kunitz)ド
メインと構造的及び機能的に類似性のある５６アミノ酸
のドメインを含んでいる。クニツツインヒビターはトリ
プシンのようなセリンプロテアーゼに特異的なポペプチ
ドインヒビターの一群である（ラスコウスキー、Ｍ．(L
askowski, M.)、及びカトー、Ｉ、(Kato, I.)４９ ア
ニユアル レケビユー オブ バイオケミストリー(An
n. Rev. Biochem.)５９３、６１０−６１３（１９８
０）の総説）。クニツツ型インヒビターの生理的機能は
分つていないが、このドメインの存在によつておそらく
セリンプロテアーゼによる分解から分子を保護し、アミ
ロイド前駆体タンパク質の代謝が変化することが示唆さ
れるている（タンツイ、ｒ．Ｅ．(Tanzi, r. E.)ら、上
述）。コンピユーターモデル及びin vitroの分析によつ
てＡＰＰドメインはまた構造膜貫通アンカードメイン(S
tructuraltransmembrane spanning anchor domain)を含
むことが強く示唆されている（セルコエ、Ｄ．Ｊ．(Sel
koe, D.J.）ら、８５ プロシーデイグ ナシヨナル
アカデミツク サイエンス Ｕ．Ｓ．Ａ．７３４１（１
９８８）及びデイルクス、Ｔ．(Dyrks, T.)ら、７ エ
ンボ（ＥＭＢＯ）９４９（１９８８））。
ペプチドの過剰生産は前駆体タンパク質をコードする遺
伝子内でフレームシフト変異によりペプチドの翻訳が繰
り返されることによつて起こることが示唆されている(D
Er. Pat. Ap. No.３４１,４９１スキヤンゴス(Scangos)
ら）。 この変異は上述のカンゲ(Kange)らが発表したｃ
ＤＮＡ配列のヌクレオチド１８９７と１９２１の間で起
きると考えられている。 アミロイド前駆体タンパク質
のＤＮＡのオープンリーデイングフレームにはベータア
ミロイドペプチドに加え他の機能因子がコードされてい
るようである。ＡＰＰ７５１及びＡＰＰ７７０の両者は
セリンプロテアーゼインヒビターのクニツツ(Kunitz)ド
メインと構造的及び機能的に類似性のある５６アミノ酸
のドメインを含んでいる。クニツツインヒビターはトリ
プシンのようなセリンプロテアーゼに特異的なポペプチ
ドインヒビターの一群である（ラスコウスキー、Ｍ．(L
askowski, M.)、及びカトー、Ｉ、(Kato, I.)４９ ア
ニユアル レケビユー オブ バイオケミストリー(An
n. Rev. Biochem.)５９３、６１０−６１３（１９８
０）の総説）。クニツツ型インヒビターの生理的機能は
分つていないが、このドメインの存在によつておそらく
セリンプロテアーゼによる分解から分子を保護し、アミ
ロイド前駆体タンパク質の代謝が変化することが示唆さ
れるている（タンツイ、ｒ．Ｅ．(Tanzi, r. E.)ら、上
述）。コンピユーターモデル及びin vitroの分析によつ
てＡＰＰドメインはまた構造膜貫通アンカードメイン(S
tructuraltransmembrane spanning anchor domain)を含
むことが強く示唆されている（セルコエ、Ｄ．Ｊ．(Sel
koe, D.J.）ら、８５ プロシーデイグ ナシヨナル
アカデミツク サイエンス Ｕ．Ｓ．Ａ．７３４１（１
９８８）及びデイルクス、Ｔ．(Dyrks, T.)ら、７ エ
ンボ（ＥＭＢＯ）９４９（１９８８））。
【００１１】脳組織におけるアミロイドペプチドの沈着
に至る生化学的過程に関する理解は他の知見によつて複
雑化している。アミロイド前駆体タンパク質のＲＮＡ及
びタンパク質はゲツ歯類に見られる（ノーザンブロツ
ト、ｃＤＮＡクローニング及びイムノ染色によつて示さ
れている）が、それらの脳にはアミロイド斑が見出され
ていない（カング、Ｊ．(Kang, J.)、及びミユラーヒ
ル、Ｂ．(Muller-Hill, B.)、 １７ ヌクレイツク ア
シツド リサーチ(Nucleic Acid Res.)２１３０（１９
８９）、ベンドツテイ、Ｃ．(Bendotti, C.)ら、８５
プロシーデイング ナシヨナル アカデミツク サイエ
ンス Ｕ．Ｓ．Ａ．(Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A.)３
６２８（１９８８）、及びカード、Ｊ．Ｐ．(Card, J.
P.)ら、１ ニユーロン(neuron)８３５（１９８
８））。また、単個細胞内に存在するアミロイド前駆体
タンパク質の多重型を含めて記載されたｃＤＮＡクロー
ンでは説明されていない付加的なＡＰＰ転写物が存在す
ると思われる（Ｈ１６０細胞及びヒト脳ＲＮＡのノーザ
ンブロツトに対するＡＰＰ ｃＤＮＡクローンのハイブ
リダイゼーシヨンによつて示されている、ドンネリー、
Ｒ．Ｊ．(Donnelly, R.J.)ら、９ニヤーロビオル エイ
ジング(Neurobiol. Aging)３３３（１９８８）、ビテツ
ク、Ｍ．Ｐ．(Vitek, M.P.)ら、モレキユラー ブレイ
ン リサーチ(Mol. Brain Res.)１２１（１９８８）、
及びザイン、Ｓ．Ｂ．(Zain, S.B.)ら、８５ プロシー
デイング ナシヨナル アカデミツク サイエンス
Ｕ．Ｓ．Ａ．(Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A.)９２９
（１９８８））。
に至る生化学的過程に関する理解は他の知見によつて複
雑化している。アミロイド前駆体タンパク質のＲＮＡ及
びタンパク質はゲツ歯類に見られる（ノーザンブロツ
ト、ｃＤＮＡクローニング及びイムノ染色によつて示さ
れている）が、それらの脳にはアミロイド斑が見出され
ていない（カング、Ｊ．(Kang, J.)、及びミユラーヒ
ル、Ｂ．(Muller-Hill, B.)、 １７ ヌクレイツク ア
シツド リサーチ(Nucleic Acid Res.)２１３０（１９
８９）、ベンドツテイ、Ｃ．(Bendotti, C.)ら、８５
プロシーデイング ナシヨナル アカデミツク サイエ
ンス Ｕ．Ｓ．Ａ．(Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A.)３
６２８（１９８８）、及びカード、Ｊ．Ｐ．(Card, J.
P.)ら、１ ニユーロン(neuron)８３５（１９８
８））。また、単個細胞内に存在するアミロイド前駆体
タンパク質の多重型を含めて記載されたｃＤＮＡクロー
ンでは説明されていない付加的なＡＰＰ転写物が存在す
ると思われる（Ｈ１６０細胞及びヒト脳ＲＮＡのノーザ
ンブロツトに対するＡＰＰ ｃＤＮＡクローンのハイブ
リダイゼーシヨンによつて示されている、ドンネリー、
Ｒ．Ｊ．(Donnelly, R.J.)ら、９ニヤーロビオル エイ
ジング(Neurobiol. Aging)３３３（１９８８）、ビテツ
ク、Ｍ．Ｐ．(Vitek, M.P.)ら、モレキユラー ブレイ
ン リサーチ(Mol. Brain Res.)１２１（１９８８）、
及びザイン、Ｓ．Ｂ．(Zain, S.B.)ら、８５ プロシー
デイング ナシヨナル アカデミツク サイエンス
Ｕ．Ｓ．Ａ．(Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A.)９２９
（１９８８））。
【００１２】
【発明の要約】本発明はアルツハイマー病患者のヒト脳
組織由来の特異的、新規アミロイドペプチド前駆体のＲ
ＮＡの発見に基づく。ＡＰＰ７７０で記載された部分と
一致する１１５及び８０５の間及び８１８及び１０９の
間の位置を除いて（番号は上述のキタグチ(Kitaguchi)
ら及びドンネリー(Donnelly)らによる）、本発明の新規
ＲＮＡからクローン化した相補的ＤＮＡのヌクレオチド
配列は最近記載されたＡＰＰ５６３のクローン(デサウ
ベージ(DeSauvage)及びオクダブ(octave)、上述）のユ
ニークな領域を含めていかなる既知の配列との実質的な
相同性を欠いている。
組織由来の特異的、新規アミロイドペプチド前駆体のＲ
ＮＡの発見に基づく。ＡＰＰ７７０で記載された部分と
一致する１１５及び８０５の間及び８１８及び１０９の
間の位置を除いて（番号は上述のキタグチ(Kitaguchi)
ら及びドンネリー(Donnelly)らによる）、本発明の新規
ＲＮＡからクローン化した相補的ＤＮＡのヌクレオチド
配列は最近記載されたＡＰＰ５６３のクローン(デサウ
ベージ(DeSauvage)及びオクダブ(octave)、上述）のユ
ニークな領域を含めていかなる既知の配列との実質的な
相同性を欠いている。
【００１３】量的に本発明の新規ＲＮＡはヒト脳におい
て主要なＡＰＰ ＲＮＡであり、ＡＰＰ７７０の４倍
量、ＡＰＰ７５１の少なくとも３１倍量であるが、ＡＰ
Ｐ６９５よりは少量でネズミ及びラツトの脳のＲＮＡに
は実質的に存在しない。
て主要なＡＰＰ ＲＮＡであり、ＡＰＰ７７０の４倍
量、ＡＰＰ７５１の少なくとも３１倍量であるが、ＡＰ
Ｐ６９５よりは少量でネズミ及びラツトの脳のＲＮＡに
は実質的に存在しない。
【００１４】新規ＡＰＰ ＲＮＡに相当する１.６キロ
塩基対(kb)のｃＤＮＡクローンにはＡＰＰ７７０のアミ
ノ末端に類似するがベータアミロイドペプチドドメイン
または疎水的膜貫通ドメイン(transmembrane spanning
domains)を欠く３６５アミノ酸のタンパク質の存在が考
えられる。これらの特徴は新規ＡＰＰ ＲＮＡはクニツ
ツプロテアーゼインヒビターと接触する可溶性タンパク
質をコードすることを示唆する。
塩基対(kb)のｃＤＮＡクローンにはＡＰＰ７７０のアミ
ノ末端に類似するがベータアミロイドペプチドドメイン
または疎水的膜貫通ドメイン(transmembrane spanning
domains)を欠く３６５アミノ酸のタンパク質の存在が考
えられる。これらの特徴は新規ＡＰＰ ＲＮＡはクニツ
ツプロテアーゼインヒビターと接触する可溶性タンパク
質をコードすることを示唆する。
【００１５】本発明はそれゆえ新規ヒトアミロイド前駆
体のＲＮＡのみならず、新規ＲＮＡを鋳型として用いて
作製した相補ＤＮＡも提供し、これは本発明の新規ＲＮ
ＡまたはｃＤＮＡで形質転換または感染された細胞によ
つて新規の精製単離されたアミロイドタンパク質前駆体
生成物を得ることを意味する。
体のＲＮＡのみならず、新規ＲＮＡを鋳型として用いて
作製した相補ＤＮＡも提供し、これは本発明の新規ＲＮ
ＡまたはｃＤＮＡで形質転換または感染された細胞によ
つて新規の精製単離されたアミロイドタンパク質前駆体
生成物を得ることを意味する。
【００１６】本発明はアルツハイマー病患者の脳組織か
ら単離した主要な種特異的ヒトアシロイドペプチド前駆
体のＲＮＡに関する。特に、本発明は５００アミノ酸以
下から成るタンパク質をコードする新規アミロイドペプ
チド前駆体のＲＮＡに関する。本発明の新規ＲＮＡに相
当する１.６ｋｂのＣＤＮＡクローンの配列からクニツ
ツプロテアーゼインヒビターから成り、ベータアミロイ
ドペプチド及び疎水性の膜貫通アンカー(transmembrane
spanning anchor)の両者を欠く可溶性タンパク質が考
えられる。
ら単離した主要な種特異的ヒトアシロイドペプチド前駆
体のＲＮＡに関する。特に、本発明は５００アミノ酸以
下から成るタンパク質をコードする新規アミロイドペプ
チド前駆体のＲＮＡに関する。本発明の新規ＲＮＡに相
当する１.６ｋｂのＣＤＮＡクローンの配列からクニツ
ツプロテアーゼインヒビターから成り、ベータアミロイ
ドペプチド及び疎水性の膜貫通アンカー(transmembrane
spanning anchor)の両者を欠く可溶性タンパク質が考
えられる。
【００１７】本発明の新規ＲＮＡは多くの個々の試験で
ヒトＲＮＡのすべての調製物中に観察されており、全ア
ミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）ＲＮＡの１８から
２４％であると考えられる。量的に、前述のＡＰＰ６９
５より少量であるがＡＰＰ７７０よりは多量である。本
発明の新規ＲＮＡはヒトにユニークであると思われ、ラ
ツト及びネズミの脳のＲＮＡ中には検出されない。さら
に、ゲツ歯類に存在する前述のＡＰＰ５６３及びＡＰＰ
７５１の両者はヒト成人の脳の皮質中には存在しないか
または非常に低レベルであると思われる。
ヒトＲＮＡのすべての調製物中に観察されており、全ア
ミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）ＲＮＡの１８から
２４％であると考えられる。量的に、前述のＡＰＰ６９
５より少量であるがＡＰＰ７７０よりは多量である。本
発明の新規ＲＮＡはヒトにユニークであると思われ、ラ
ツト及びネズミの脳のＲＮＡ中には検出されない。さら
に、ゲツ歯類に存在する前述のＡＰＰ５６３及びＡＰＰ
７５１の両者はヒト成人の脳の皮質中には存在しないか
または非常に低レベルであると思われる。
【００１８】本発明の新規ＲＮＡに対する相補ＤＮＡか
ら本発明のＲＮＡが約３６５アミノ酸から成るタンパク
質をコードしていると考えられる。従つてここでは本発
明の新規ＲＮＡはＡＰＰ３６５をコードすると言うこと
にする。
ら本発明のＲＮＡが約３６５アミノ酸から成るタンパク
質をコードしていると考えられる。従つてここでは本発
明の新規ＲＮＡはＡＰＰ３６５をコードすると言うこと
にする。
【００１９】本発明の新規ＲＮＡに対する相補的ＤＮＡ
のヌクレオチド配列は種々のデータバンク（ゲンバンク
(Gen Bank)（リリース５９.０、３／８９）及びゲンエ
ンブル（Gen EMBL)(リリース１８.０、２／８９）。デ
ータバンクはウイスコンシン大学の「ジエネテイクス
コンピユーター グループ(“Genetics Computer Grou
p")による配列解析ソフトウエアパツケージをデバレア
ウクス、J．(Devereaux,J)、ら１２ヌクレイツクアシツ
ドリサーチ(Nucleic Acids Res.)３８７（１９８６）に
記載されている方法に従つて検索した。）で、最近記載
されたＡＰＰ５６３のｃＤＮＡクローンのユニークな領
域を含むが、先に記載されているＡＰＰ７７０の１１５
と８０５の間の一致する位置、及び８１８と１０９０の
間（上述のキタグチ(Kitaguchi)ら及びドンネリー(Donn
elly)らの番号による）を除いて、既知のいかなる配列
との実質的な相同性を欠いている。本発明の新規ＲＮＡ
に対する相補ＤＮＡはＡＰＰ７７０のヌクレオチド配列
の１０９０の位置以降に始まる新しい「挿入」配列を含
み、８０５と８１８の間の位置に見出される１２塩基対
を欠いている。
のヌクレオチド配列は種々のデータバンク（ゲンバンク
(Gen Bank)（リリース５９.０、３／８９）及びゲンエ
ンブル（Gen EMBL)(リリース１８.０、２／８９）。デ
ータバンクはウイスコンシン大学の「ジエネテイクス
コンピユーター グループ(“Genetics Computer Grou
p")による配列解析ソフトウエアパツケージをデバレア
ウクス、J．(Devereaux,J)、ら１２ヌクレイツクアシツ
ドリサーチ(Nucleic Acids Res.)３８７（１９８６）に
記載されている方法に従つて検索した。）で、最近記載
されたＡＰＰ５６３のｃＤＮＡクローンのユニークな領
域を含むが、先に記載されているＡＰＰ７７０の１１５
と８０５の間の一致する位置、及び８１８と１０９０の
間（上述のキタグチ(Kitaguchi)ら及びドンネリー(Donn
elly)らの番号による）を除いて、既知のいかなる配列
との実質的な相同性を欠いている。本発明の新規ＲＮＡ
に対する相補ＤＮＡはＡＰＰ７７０のヌクレオチド配列
の１０９０の位置以降に始まる新しい「挿入」配列を含
み、８０５と８１８の間の位置に見出される１２塩基対
を欠いている。
【００２０】これは先に記載されているＡＰＰ７７０と
比較して本発明の新規ＲＮＡの構成及びヌクレオチド配
列が表わされている図４に図説されている。図は慣習的
に５’から３’の方向に置かれている。ヌクレオチドの
位置１から８６５はカング(Kang)(カング、J（Kang，
J.）ら、上述）の番号系に従つている。クニツツプロテ
アーゼインヒビター（ＰＩ、８６６−１０３３、及び
Ｃ、１０３４−１０９０の位置）ドメインは上述のキタ
グチ(Kitahuchi)ら及びドンネリー(Donnelly)らによつ
て記載されている。１２ヌクレオチドの欠失（８０６−
８１７の位置）及び新しいカルボキシ末端（１０９１−
１７６０の位置）が示されている。
比較して本発明の新規ＲＮＡの構成及びヌクレオチド配
列が表わされている図４に図説されている。図は慣習的
に５’から３’の方向に置かれている。ヌクレオチドの
位置１から８６５はカング(Kang)(カング、J（Kang，
J.）ら、上述）の番号系に従つている。クニツツプロテ
アーゼインヒビター（ＰＩ、８６６−１０３３、及び
Ｃ、１０３４−１０９０の位置）ドメインは上述のキタ
グチ(Kitahuchi)ら及びドンネリー(Donnelly)らによつ
て記載されている。１２ヌクレオチドの欠失（８０６−
８１７の位置）及び新しいカルボキシ末端（１０９１−
１７６０の位置）が示されている。
【００２１】カング（Kang、上述）の番号系に従う１１
５の位置から始まり１６３０の追加したヌクレオチドが
続く本発明のＲＮＡに対する相補ＤＮＡの完全ヌクレオ
チド配列は図５に与えられている。１２ヌクレオチドの
欠失はヌクレオチド８０５と８０６の間に垂直矢印で示
されている。二重下線の残基はクニツツプロテアーゼイ
ンヒビター領域を示し、一本下線の残基は新規カルボキ
シ末端を示す。
５の位置から始まり１６３０の追加したヌクレオチドが
続く本発明のＲＮＡに対する相補ＤＮＡの完全ヌクレオ
チド配列は図５に与えられている。１２ヌクレオチドの
欠失はヌクレオチド８０５と８０６の間に垂直矢印で示
されている。二重下線の残基はクニツツプロテアーゼイ
ンヒビター領域を示し、一本下線の残基は新規カルボキ
シ末端を示す。
【００２２】ｃＤＮＡから推定されるアミノ酸配列は本
発明の新規ＲＮＡがクニツツプロテアーゼインヒビター
に接触するＡＰＰタンパク質の可溶性の短縮型をコード
することを示唆する。可変アミノ酸配列の開始はグリシ
ン３９（Gly39)に相当し、スレオニン２７０（Ｔｈｒ
270）−セリン２７１（Ｓｅｒ271）−イソロイシン２７
２（Ｉｌｅ272）−アラニン２７３（Ａｌａ273）の残基
は存在しないのだが、これらの残基までＡＰＰ７７０に
全く一致するまで続く。この４残基の欠失に続き、新規
ＲＮＡではクニツツプロテアーゼインヒビタードメイン
及びＡＰＰ７７０に見出されるようにクニツツプロテア
ーゼインヒビタードメインへの１９アミノ酸のカルボキ
シ末端が続くが、ユニークな６アミノ酸残基で終結す
る。
発明の新規ＲＮＡがクニツツプロテアーゼインヒビター
に接触するＡＰＰタンパク質の可溶性の短縮型をコード
することを示唆する。可変アミノ酸配列の開始はグリシ
ン３９（Gly39)に相当し、スレオニン２７０（Ｔｈｒ
270）−セリン２７１（Ｓｅｒ271）−イソロイシン２７
２（Ｉｌｅ272）−アラニン２７３（Ａｌａ273）の残基
は存在しないのだが、これらの残基までＡＰＰ７７０に
全く一致するまで続く。この４残基の欠失に続き、新規
ＲＮＡではクニツツプロテアーゼインヒビタードメイン
及びＡＰＰ７７０に見出されるようにクニツツプロテア
ーゼインヒビタードメインへの１９アミノ酸のカルボキ
シ末端が続くが、ユニークな６アミノ酸残基で終結す
る。
【００２３】クニツツプロテアーゼインヒビタードメイ
ンが存在する一方、本発明の新規ＲＮＡは他のアミロイ
ド前駆体タンパク質に見出される長い疎水性膜貫通アン
カー(transmembrane-spanning anchor)またはベータア
ミロイドドメインを欠いている。本発明のＡＰＰ３６５
はアルツハイマー病の脳において正常な脳より４倍量見
出される免疫沈降性の３５キロダルトンのＡＰＰタンパ
ク質と関連する（コーレ、G.(Cole, G.)ら、１００ニユ
ーロサイエンスレターズ(Neurosci. Lett.)３４０（１
９８９））。
ンが存在する一方、本発明の新規ＲＮＡは他のアミロイ
ド前駆体タンパク質に見出される長い疎水性膜貫通アン
カー(transmembrane-spanning anchor)またはベータア
ミロイドドメインを欠いている。本発明のＡＰＰ３６５
はアルツハイマー病の脳において正常な脳より４倍量見
出される免疫沈降性の３５キロダルトンのＡＰＰタンパ
ク質と関連する（コーレ、G.(Cole, G.)ら、１００ニユ
ーロサイエンスレターズ(Neurosci. Lett.)３４０（１
９８９））。
【００２４】本発明の新規ＲＮＡは膜結合型ＡＰＰタン
パク質から加水分解によつて分泌または遊離してアルツ
ハイマー病のアミロイドシスにおけるある役割を担う可
溶性で分散可能なタンパク質わ提供する。それゆえ、本
発明はここで最初に明らかにされる種特異性アミロイド
ペプチド前駆体アミノ酸残基を全体的または部分的に複
製した配列を持つ可溶性ポリペプチドを提供する。これ
らの配列は天然に存在するアミロイドペプチド前駆体タ
ンパク質と一次、二次または三次構造及び立体的特徴及
び共通するため、天然に存在する生成物と共通する生物
学的活性及び／または免疫学的性質を持ち、そのためそ
れら及び／またはその抗体は診断、治療及び免疫学的方
法においてアミロイド前駆体タンパク質に替わる生物学
的活性性のまたは免疫学的な代替物として用いられる。
パク質から加水分解によつて分泌または遊離してアルツ
ハイマー病のアミロイドシスにおけるある役割を担う可
溶性で分散可能なタンパク質わ提供する。それゆえ、本
発明はここで最初に明らかにされる種特異性アミロイド
ペプチド前駆体アミノ酸残基を全体的または部分的に複
製した配列を持つ可溶性ポリペプチドを提供する。これ
らの配列は天然に存在するアミロイドペプチド前駆体タ
ンパク質と一次、二次または三次構造及び立体的特徴及
び共通するため、天然に存在する生成物と共通する生物
学的活性及び／または免疫学的性質を持ち、そのためそ
れら及び／またはその抗体は診断、治療及び免疫学的方
法においてアミロイド前駆体タンパク質に替わる生物学
的活性性のまたは免疫学的な代替物として用いられる。
【００２５】上述した通り、本発明は正しく推定したヒ
トポリペプチド配列のエクソンを明らかにしたクローン
化相補的ＤＮＡ配列を説明するものであり、ヒト起源の
主要なアミロイド前駆体タンパク質の一次構造的なコン
フオーメーシヨンを示す。またここで記載した相補的Ｄ
ＮＡに相同的または深く関連したＤＮＡ配列、すなわち
本発明のＲＮＡに相補的なＤＮＡに対して特に厳しい条
件下でハイブリダイズするＤＮＡ配列、及び本発明のＲ
ＮＡに相補的なＤＮＡにコードされるタンパク質を十分
に複製し該タンパク質の生物学的性質を持つようになる
タンパク質をコードするＤＮＡ配列も包含される。それ
ゆえ、本発明は限定はしないが、ヒト脳のアミロイド前
駆体タンパク質の可溶性クニツツプロテアーゼインヒビ
タードメインをコードするＲＮＡ及びＤＮＡ配列を含
む。
トポリペプチド配列のエクソンを明らかにしたクローン
化相補的ＤＮＡ配列を説明するものであり、ヒト起源の
主要なアミロイド前駆体タンパク質の一次構造的なコン
フオーメーシヨンを示す。またここで記載した相補的Ｄ
ＮＡに相同的または深く関連したＤＮＡ配列、すなわち
本発明のＲＮＡに相補的なＤＮＡに対して特に厳しい条
件下でハイブリダイズするＤＮＡ配列、及び本発明のＲ
ＮＡに相補的なＤＮＡにコードされるタンパク質を十分
に複製し該タンパク質の生物学的性質を持つようになる
タンパク質をコードするＤＮＡ配列も包含される。それ
ゆえ、本発明は限定はしないが、ヒト脳のアミロイド前
駆体タンパク質の可溶性クニツツプロテアーゼインヒビ
タードメインをコードするＲＮＡ及びＤＮＡ配列を含
む。
【００２６】ここでヒト起源の主要アミロイド前駆体タ
ンパク質のアミノ酸残基の配列及びそれに相当するクロ
ーン化相補的ＤＮＡが明らかにされるため本発明はまた
常法によつて本発明のＲＮＡ及びＤＮＡ配列を導入した
新規の生物学的機能を持つウイルス及び環状プラスミド
ＲＮＡ及びＤＮＡを提供する。微生物（例えば、細菌、
酵母及び動物細胞）宿主生物はそのようなベクターで安
定に形質転換または感染される。相応して本発明によつ
て外来のベクター由来のＤＮＡまたはＲＮＡ配列の大量
発現を容易にする条件下でそのような形質転換または感
染した微生物宿主の培養を特徴とする有用ポリペプチド
の生成方法及び生育培地、細胞破砕物または細胞膜画分
から所望のポリペプチドを単離する新規方法が提供され
る。そのような発現の例は実施例４で説明される。
ンパク質のアミノ酸残基の配列及びそれに相当するクロ
ーン化相補的ＤＮＡが明らかにされるため本発明はまた
常法によつて本発明のＲＮＡ及びＤＮＡ配列を導入した
新規の生物学的機能を持つウイルス及び環状プラスミド
ＲＮＡ及びＤＮＡを提供する。微生物（例えば、細菌、
酵母及び動物細胞）宿主生物はそのようなベクターで安
定に形質転換または感染される。相応して本発明によつ
て外来のベクター由来のＤＮＡまたはＲＮＡ配列の大量
発現を容易にする条件下でそのような形質転換または感
染した微生物宿主の培養を特徴とする有用ポリペプチド
の生成方法及び生育培地、細胞破砕物または細胞膜画分
から所望のポリペプチドを単離する新規方法が提供され
る。そのような発現の例は実施例４で説明される。
【００２７】本発明によつて提供される微生物的発現し
たポリペプチドの単離及び精製は一般的な方法によつ
て、例えば予備的なクロマトグラフによる分離及びモノ
クローナル及び／またはポリクローナル抗体調製物を含
む免疫学的な分離による。
たポリペプチドの単離及び精製は一般的な方法によつ
て、例えば予備的なクロマトグラフによる分離及びモノ
クローナル及び／またはポリクローナル抗体調製物を含
む免疫学的な分離による。
【００２８】本発明はアミロイド前駆体タンパク質３６
５及びその相同タンパク質をコードするＤＮＡ配列の全
体的及び／または部分的な作製法を提供し、選ばれた非
動物宿主での発現に好ましいコドンの導入、制限酵素の
切断部位の導入及び簡単に発現させるベクターの構築を
容易にする付加的な開始、終結および中間ＤＮＡ配列の
設置といつた有利な特徴も含む。相応して、本発明天然
存在型とは１つまたはそれ以上のアミノ酸残基の一致度
またはその位置が異り（すなわち、ＡＰＰ３６５に特異
的な残基のすべては持たない欠失類似物、及び／または
１つまたはそれ以上の残基がポリペプチドの終結または
中間部分に付加された置換類似物）、及び天然存在型の
性質といくらかまたは全く共通し、微生物発現するアミ
ロイドタンパク質前駆体のポリペブチド類似物または派
生物をコードするＤＮＡ配列の作製法（及びｃＤＮＡ及
びゲノムＤＮＡの部位特異的変異による開発法）を提供
する。
５及びその相同タンパク質をコードするＤＮＡ配列の全
体的及び／または部分的な作製法を提供し、選ばれた非
動物宿主での発現に好ましいコドンの導入、制限酵素の
切断部位の導入及び簡単に発現させるベクターの構築を
容易にする付加的な開始、終結および中間ＤＮＡ配列の
設置といつた有利な特徴も含む。相応して、本発明天然
存在型とは１つまたはそれ以上のアミノ酸残基の一致度
またはその位置が異り（すなわち、ＡＰＰ３６５に特異
的な残基のすべては持たない欠失類似物、及び／または
１つまたはそれ以上の残基がポリペプチドの終結または
中間部分に付加された置換類似物）、及び天然存在型の
性質といくらかまたは全く共通し、微生物発現するアミ
ロイドタンパク質前駆体のポリペブチド類似物または派
生物をコードするＤＮＡ配列の作製法（及びｃＤＮＡ及
びゲノムＤＮＡの部位特異的変異による開発法）を提供
する。
【００２９】本発明の新規ＲＮＡ配列はアミロイド前駆
体タンパク質３６５の少なくとも一部の一次構造を持
ち、そしてその生物学的性質のうちひとつまたはそれ以
上を持つポリペプチド生成物の原核または真核宿主細胞
における発現を保証するすべての配列をコードし、それ
は（ａ）図５で説明するＤＮＡ配列または相補鎖のＤＮ
Ａ配列、（ｂ）（ａ）で定義したＤＮＡ配列またはそれ
らの断片とハイブリダイゼーシヨンする(ここに記載し
たハイブリダイゼーシヨン条件下またはそれより厳しい
条件下)ＤＮＡ配列、及び（ｃ）遺伝子コードが変化し
ていない場合、上の（ａ）及び（ｂ）で定義したＤＮＡ
配列とハイブリダイゼーシヨンするＤＮＡ配列によつて
理解される。特にアミロイド前駆体タンパク質のＲＮ
Ａ、その断片、及びＲＮＡまたはＤＮＡ配列に非動物宿
主において転写またはメツセンジヤーＲＮＡのＲＮＡ複
製を容易にするコドンが導入された類似物をコードする
アミロイド前駆体タンパク質配列の遺伝子変異型をコー
ドするゲノムＤＮＡ配列によつて理解される。
体タンパク質３６５の少なくとも一部の一次構造を持
ち、そしてその生物学的性質のうちひとつまたはそれ以
上を持つポリペプチド生成物の原核または真核宿主細胞
における発現を保証するすべての配列をコードし、それ
は（ａ）図５で説明するＤＮＡ配列または相補鎖のＤＮ
Ａ配列、（ｂ）（ａ）で定義したＤＮＡ配列またはそれ
らの断片とハイブリダイゼーシヨンする(ここに記載し
たハイブリダイゼーシヨン条件下またはそれより厳しい
条件下)ＤＮＡ配列、及び（ｃ）遺伝子コードが変化し
ていない場合、上の（ａ）及び（ｂ）で定義したＤＮＡ
配列とハイブリダイゼーシヨンするＤＮＡ配列によつて
理解される。特にアミロイド前駆体タンパク質のＲＮ
Ａ、その断片、及びＲＮＡまたはＤＮＡ配列に非動物宿
主において転写またはメツセンジヤーＲＮＡのＲＮＡ複
製を容易にするコドンが導入された類似物をコードする
アミロイド前駆体タンパク質配列の遺伝子変異型をコー
ドするゲノムＤＮＡ配列によつて理解される。
【００３０】本発明のポリペプチド生成物は検出可能な
マーカー物質で共有結合によつて標識し（例えば125Ｉ
または蛍光抗体で放射標識）、組織切片または随液のよ
うな固体または液体サンプル中でヒトベータアミロイド
タンパク質前駆体タンパク質を検出及び定量するために
用いる試薬を提供する。本発明のＲＮＡまたはＤＮＡ生
成物はまた検出可能なまーかーで標識し、ベータアミロ
イドタンパク質の位置付け及び／または動物種染色体地
図上における関連遺伝子群の位置付けを行うためにＤＮ
Ａハイブリダイゼーシヨン法において用いる。それらは
また隣接遺伝子及びその病気を同定するために用いられ
る。
マーカー物質で共有結合によつて標識し（例えば125Ｉ
または蛍光抗体で放射標識）、組織切片または随液のよ
うな固体または液体サンプル中でヒトベータアミロイド
タンパク質前駆体タンパク質を検出及び定量するために
用いる試薬を提供する。本発明のＲＮＡまたはＤＮＡ生
成物はまた検出可能なまーかーで標識し、ベータアミロ
イドタンパク質の位置付け及び／または動物種染色体地
図上における関連遺伝子群の位置付けを行うためにＤＮ
Ａハイブリダイゼーシヨン法において用いる。それらは
また隣接遺伝子及びその病気を同定するために用いられ
る。
【００３１】それゆえ、本発明は診断（臨床化学と同よ
う組織病理学）及び研究、及び生化学を基礎とする処置
及び治療に用いられる。特に軸索突出(neurite outgrou
wth)の刺激に関する関連タンパク質のＫＰＩドメインの
細胞外作用に対するその役割が提唱されている（モナー
ド(Monard)、１９８８、ツーン(Zurn)、１９８８）。そ
れゆえ、本発明のＲＮＡ及びＤＮＡ配列によつてコード
されるタンパク質はまたin vivo及びin vitroにおける
神経生育を直接的または間接的に促進するために用いら
れる。それゆえ、ＡＰＰ−３６５タンパク質またはその
活性部分は神経細胞培養における補充物及びin vivo処
置及び神経組織の損傷に対する修復のための治療組成物
の活性成分として神経細胞の維持、生育及び修復のため
に用いられる。
う組織病理学）及び研究、及び生化学を基礎とする処置
及び治療に用いられる。特に軸索突出(neurite outgrou
wth)の刺激に関する関連タンパク質のＫＰＩドメインの
細胞外作用に対するその役割が提唱されている（モナー
ド(Monard)、１９８８、ツーン(Zurn)、１９８８）。そ
れゆえ、本発明のＲＮＡ及びＤＮＡ配列によつてコード
されるタンパク質はまたin vivo及びin vitroにおける
神経生育を直接的または間接的に促進するために用いら
れる。それゆえ、ＡＰＰ−３６５タンパク質またはその
活性部分は神経細胞培養における補充物及びin vivo処
置及び神経組織の損傷に対する修復のための治療組成物
の活性成分として神経細胞の維持、生育及び修復のため
に用いられる。
【００３２】以下の実施例は本発明及び用いた技術の特
徴を詳細に記載し説明するために示されるが、いかなる
意味においても制限するものではない。別に示さない限
り、すべての部数及びパーセンテージは重量であり、記
載した方法の特定の段階における重量に基づいている。
徴を詳細に記載し説明するために示されるが、いかなる
意味においても制限するものではない。別に示さない限
り、すべての部数及びパーセンテージは重量であり、記
載した方法の特定の段階における重量に基づいている。
【００３３】
【実施例１】Ｓ１ヌクレアーゼ保護方法 アスペリギルス オリザエ(Aspergillus oryzae)由来の
Ｓ１ヌクレアーゼは非常に特異的な一本鎖エンドヌクレ
アーゼである。Ｓ１ヌクレアーゼを適応するにあたつて
は（アウスベル、Ｆ．Ｍ．(Ausbel, F.M.)ら編、カレン
トブロトコールズ イン モレキユラー バイオロジー(Cu
rrent Protocols in Molecular Biology)、ジヨン ウ
イリー＆サンズ(John Wily & Sons)、ニユーヨーク(New
York）、３.１２.１から３.１２.３により完全に記載
されている）この酵素が平滑二本鎖末端を突出させるこ
となるＤＮＡ及びＲＮＡの突出一本鎖末端を刈り込む機
能を利用することによる。例えば、相補ＲＮＡ及びＤＮ
Ａのハイブリダイゼーシヨンした転写物はＳ１耐性であ
り、近傍の非相補的ドメインをＳ１消化した後、単離し
解析することができる。
Ｓ１ヌクレアーゼは非常に特異的な一本鎖エンドヌクレ
アーゼである。Ｓ１ヌクレアーゼを適応するにあたつて
は（アウスベル、Ｆ．Ｍ．(Ausbel, F.M.)ら編、カレン
トブロトコールズ イン モレキユラー バイオロジー(Cu
rrent Protocols in Molecular Biology)、ジヨン ウ
イリー＆サンズ(John Wily & Sons)、ニユーヨーク(New
York）、３.１２.１から３.１２.３により完全に記載
されている）この酵素が平滑二本鎖末端を突出させるこ
となるＤＮＡ及びＲＮＡの突出一本鎖末端を刈り込む機
能を利用することによる。例えば、相補ＲＮＡ及びＤＮ
Ａのハイブリダイゼーシヨンした転写物はＳ１耐性であ
り、近傍の非相補的ドメインをＳ１消化した後、単離し
解析することができる。
【００３４】本実施例は後者の技術を用いて数種のＡＰ
Ｐ転写物の性質と量について同時に特徴付けを行う。上
に引用したキタグチ(Kitaguchi)ら、及びドンネリー(Do
nnely)らが記載したＡＰＰ770の相補ＤＮＡの３６６塩
基対のＤｄｅＩ−ＸｂｏＩ（７７４から１１３９の位
置）断片から得た均一に標識したアンチセンスリボプロ
ーブを常法（サンブルツク、Ｊ．(Sambrook, J.)、Ｅ．
Ｆ．，フリツシユ（E.F.，Fritsch)、 及びＴ．マニアテ
イス（Ｔ．マニアテイス）、モレキユラークローニング
(Molecular Cloning)：ラボラトリー マニユアル(A La
boratory Manual)、第２版、コールド スプリング ハ
ーバー ラボラトリー プレス(Cold Spring Harbor La
boratory Press)、１９８９年、１０.２９から１０.３
７）によつて「リボジエネシスII、イン ビトロトラン
スクリプシヨン バイオシステム(“Ribogenesis II, I
n Vitro Transcription Biosystem")キツト（インター
ナシヨナル バイオテクノロジーズ社、ニユーヘブン、
コネチカツト(internationalBiotechnologies, Inc., N
ew Haven, CT)を用いて調製する。本プローブはクニツ
ツプロテアーゼインヒビタードメイン（上に引用したタ
ンツイ(Tanzi)ら、キタグチ(Kitaguchi)ら、及びポテ(Po
nte)ら)をコードするエクリンのヌクレオチドを含むか
マタハそれに隣接するＡＰＰ ＲＮＡの内部の断片を正
確に測定することが可能である。
Ｐ転写物の性質と量について同時に特徴付けを行う。上
に引用したキタグチ(Kitaguchi)ら、及びドンネリー(Do
nnely)らが記載したＡＰＰ770の相補ＤＮＡの３６６塩
基対のＤｄｅＩ−ＸｂｏＩ（７７４から１１３９の位
置）断片から得た均一に標識したアンチセンスリボプロ
ーブを常法（サンブルツク、Ｊ．(Sambrook, J.)、Ｅ．
Ｆ．，フリツシユ（E.F.，Fritsch)、 及びＴ．マニアテ
イス（Ｔ．マニアテイス）、モレキユラークローニング
(Molecular Cloning)：ラボラトリー マニユアル(A La
boratory Manual)、第２版、コールド スプリング ハ
ーバー ラボラトリー プレス(Cold Spring Harbor La
boratory Press)、１９８９年、１０.２９から１０.３
７）によつて「リボジエネシスII、イン ビトロトラン
スクリプシヨン バイオシステム(“Ribogenesis II, I
n Vitro Transcription Biosystem")キツト（インター
ナシヨナル バイオテクノロジーズ社、ニユーヘブン、
コネチカツト(internationalBiotechnologies, Inc., N
ew Haven, CT)を用いて調製する。本プローブはクニツ
ツプロテアーゼインヒビタードメイン（上に引用したタ
ンツイ(Tanzi)ら、キタグチ(Kitaguchi)ら、及びポテ(Po
nte)ら)をコードするエクリンのヌクレオチドを含むか
マタハそれに隣接するＡＰＰ ＲＮＡの内部の断片を正
確に測定することが可能である。
【００３５】32Ｐで標識した４１０塩基のプローブは図
１のＡに図説してある。ｐＡＰＰ７７０−ＤＸは３６６
塩基のＤｄｅＩ−ＸｈｏＩ断片（ＡＰＰ７７０ｃＤＮＡ
クローン由来）をリボプローブベクターｐＩＢＩ３０
（インターナシヨナル バイオテクノロジーズ社、ニユ
ーヘブン、コネチカツト(International Biotechnologi
es, Inc., New Heven, CT))のＳｍａＩ−ＸｈｏＩ部位
に挿入して構築したプラスミドの一部分を表す。Ｔ3Ｒ
ＮＡポリメラーゼでＥｃｏＲＩ線状化鋳型を転写するこ
とによつて付随するベクター配列（斑点部）と同様にＡ
ＰＰ関連ＲＮＡのクニツツプロテアーゼインヒビター
（黒染り部）、Ｃ（垂直平行線部）及び隣接（白抜き
部）ドメインに相補する配列を含む４１０塩基のアンチ
センスリボプローブが生じる。リボプローブはＡＰＰ７
７０転写物に相補する全３７０塩基を含み、関連する配
列の長さは与えられている。
１のＡに図説してある。ｐＡＰＰ７７０−ＤＸは３６６
塩基のＤｄｅＩ−ＸｈｏＩ断片（ＡＰＰ７７０ｃＤＮＡ
クローン由来）をリボプローブベクターｐＩＢＩ３０
（インターナシヨナル バイオテクノロジーズ社、ニユ
ーヘブン、コネチカツト(International Biotechnologi
es, Inc., New Heven, CT))のＳｍａＩ−ＸｈｏＩ部位
に挿入して構築したプラスミドの一部分を表す。Ｔ3Ｒ
ＮＡポリメラーゼでＥｃｏＲＩ線状化鋳型を転写するこ
とによつて付随するベクター配列（斑点部）と同様にＡ
ＰＰ関連ＲＮＡのクニツツプロテアーゼインヒビター
（黒染り部）、Ｃ（垂直平行線部）及び隣接（白抜き
部）ドメインに相補する配列を含む４１０塩基のアンチ
センスリボプローブが生じる。リボプローブはＡＰＰ７
７０転写物に相補する全３７０塩基を含み、関連する配
列の長さは与えられている。
【００３６】標識リボプローブはヒト、ラツト、または
マウス脳のポリ−（Ａ＋）（クローテツク ラボラトリ
ーズ社、パロアルト、カリフオルニア(Colontech Labor
atories, Inc., Palo Alto, CA)より入手）またはＨＬ
６０のポリ−（Ａ＋）（フルヤ、Ｈ．(Furuya, H.)ら、
１５０ バイオケミストリー バイオフイジツクスリサ
ーチ コミユニケーシン(Biochem. Biophys. Res. Comm
un. ７５（１９８８）、マードツク、Ｇ．(Murdoch,
G.)ら、１６ヌクレイツク アシツド リサーチ(Nuclei
c Acids Res.)３５７（１９８８）、ポドリスニイ、
Ｍ．(Pldlisny, M.)ら、２３８ サイエンス(Science)
６６９（１９８７）、及びセント ジヨージ ハイスロ
ツプ、Ｐ．（St. George Hyslop, P)ら、上述に従つて
調製）に対してハイブリダイゼーシヨンする。リボプロ
ーブはまた全細胞脳組織またはＨＬ６０のＲＮＡ（チヤ
ーグウイン(Chirgwin)の方法(チオーグウイン(Chirgwi
n)ら、２４ バイオケミストリー(Biochem.)５２９４
（１９７９）、グアニジン イソチオシアネート(guani
dine isothiocyanate)による組織のホモジナイズ、カゼ
インクロライドのクツシヨンの上へのホモジエネートの
重層、及び超遠心分離によるＲＮＡの回収を含む）によ
つて調製）に対してハイブリダイゼーシヨンする。
マウス脳のポリ−（Ａ＋）（クローテツク ラボラトリ
ーズ社、パロアルト、カリフオルニア(Colontech Labor
atories, Inc., Palo Alto, CA)より入手）またはＨＬ
６０のポリ−（Ａ＋）（フルヤ、Ｈ．(Furuya, H.)ら、
１５０ バイオケミストリー バイオフイジツクスリサ
ーチ コミユニケーシン(Biochem. Biophys. Res. Comm
un. ７５（１９８８）、マードツク、Ｇ．(Murdoch,
G.)ら、１６ヌクレイツク アシツド リサーチ(Nuclei
c Acids Res.)３５７（１９８８）、ポドリスニイ、
Ｍ．(Pldlisny, M.)ら、２３８ サイエンス(Science)
６６９（１９８７）、及びセント ジヨージ ハイスロ
ツプ、Ｐ．（St. George Hyslop, P)ら、上述に従つて
調製）に対してハイブリダイゼーシヨンする。リボプロ
ーブはまた全細胞脳組織またはＨＬ６０のＲＮＡ（チヤ
ーグウイン(Chirgwin)の方法(チオーグウイン(Chirgwi
n)ら、２４ バイオケミストリー(Biochem.)５２９４
（１９７９）、グアニジン イソチオシアネート(guani
dine isothiocyanate)による組織のホモジナイズ、カゼ
インクロライドのクツシヨンの上へのホモジエネートの
重層、及び超遠心分離によるＲＮＡの回収を含む）によ
つて調製）に対してハイブリダイゼーシヨンする。
【００３７】ＲＮＡ（１０−１５μｇ）、過剰量の放射
標識したリボプローブ（３−５×１０5cpm）及び大腸菌
ｔ−ＲＮＡ担体（１００μｇ）を沈殿し、μＬのハイブ
リダイゼーシヨン緩衝液（８０％ホルムアミド、４０ｍ
Ｍ ＰＩＰＥＳ（ｐＨ６.４）、０.４Ｍ ＮａＣｌ、１
ｍＭ ＥＤＴＡ）に再懸濁し、８０℃で５分間加熱し４
４℃で１６時間アニーリングする。２８０ｍＭ ＮａＣ
ｌ、５０ｍＭ ＮａＯＡｃ（ｐＨ４.５）、４.５ｍＭ
ＺｎＳＯ4、及び加熱変性したサケ精子ＤＮＡ（４０μ
ｇ／ml)を含む０.３mlの衝撃液中でＳ１ヌクレアーゼ
（３００ユニツト、ベーリンガー モンハイム(Boehrin
ger-Mannfeim))を添加することによつてＲＮＡを３７℃
で１時間消化する。
標識したリボプローブ（３−５×１０5cpm）及び大腸菌
ｔ−ＲＮＡ担体（１００μｇ）を沈殿し、μＬのハイブ
リダイゼーシヨン緩衝液（８０％ホルムアミド、４０ｍ
Ｍ ＰＩＰＥＳ（ｐＨ６.４）、０.４Ｍ ＮａＣｌ、１
ｍＭ ＥＤＴＡ）に再懸濁し、８０℃で５分間加熱し４
４℃で１６時間アニーリングする。２８０ｍＭ ＮａＣ
ｌ、５０ｍＭ ＮａＯＡｃ（ｐＨ４.５）、４.５ｍＭ
ＺｎＳＯ4、及び加熱変性したサケ精子ＤＮＡ（４０μ
ｇ／ml)を含む０.３mlの衝撃液中でＳ１ヌクレアーゼ
（３００ユニツト、ベーリンガー モンハイム(Boehrin
ger-Mannfeim))を添加することによつてＲＮＡを３７℃
で１時間消化する。
【００３８】これによつて図１のＢに説明した保護断片
を生じる。放射標識したリボプローブにハイブリダイゼ
ーシヨンしたＡＰＰ ＲＮＡからそれぞれＡＰＰ７７
０、７５１及び６９５ＲＮＡの存在を示す長さ３７０、
２６１及び９３塩基のＳ１耐性プローブ断片が生じると
思われる。
を生じる。放射標識したリボプローブにハイブリダイゼ
ーシヨンしたＡＰＰ ＲＮＡからそれぞれＡＰＰ７７
０、７５１及び６９５ＲＮＡの存在を示す長さ３７０、
２６１及び９３塩基のＳ１耐性プローブ断片が生じると
思われる。
【００３９】消化は８０μｌの停止緩衝液（４Ｍ酢酸ア
ンモニウム、２０ｍＭ ＥＤＴＡ（Ｐｈ８.０）及び４
０μｇ／ml ｔ−ＲＮＡ）を添加して終結する。サンプ
ルをエタノールで沈殿し、沈殿物を８μｌのロード用緩
衝液（９５％ホルムアミド、２０ｍＭ ＥＤＴＡ、０.
０５％ブロモフエノールブルー及び０.０５％キシレン
シアノールＦＦ）に再懸濁する。サンプルは高い分解能
の６％ポリアクリルアミド−８Ｍ尿素の配列決定用ゲル
電気泳動によつて分画する。Ｓ１保護バンドはオートラ
ジオグラフイ（コダツク ＸＡＲフイルム）によつて視
覚化する。
ンモニウム、２０ｍＭ ＥＤＴＡ（Ｐｈ８.０）及び４
０μｇ／ml ｔ−ＲＮＡ）を添加して終結する。サンプ
ルをエタノールで沈殿し、沈殿物を８μｌのロード用緩
衝液（９５％ホルムアミド、２０ｍＭ ＥＤＴＡ、０.
０５％ブロモフエノールブルー及び０.０５％キシレン
シアノールＦＦ）に再懸濁する。サンプルは高い分解能
の６％ポリアクリルアミド−８Ｍ尿素の配列決定用ゲル
電気泳動によつて分画する。Ｓ１保護バンドはオートラ
ジオグラフイ（コダツク ＸＡＲフイルム）によつて視
覚化する。
【００４０】オートラジオグラフは図２（上）に示す。
サンプルはヒト脳側頭皮質由来の全ＲＮＡ（第２及び３
レーン）、ヒト前骨髄白血病（ＨＬ６０）細胞ポリ−
（Ａ＋）ＲＮＡ（第４レーン）、及びそれぞれ第５から
クレーンにはヒト、マウス、及びラツト脳ポリ−（Ａ
＋）ＲＮＡを含む。ＡＰＰ７７０、ＡＰＰ６９５及び新
規ＡＰＰ３６５に相当するバンドは第２から３レーンに
見られる。第４から７レーンにはＡＰＰ７５１ＲＮＡが
見られる。マーカー（第１レーン）は32Ｐ標識したφＸ
１７４由来のＨａｅIII制限断片である。（本糸におい
ては、標識リボプローブ由来の保護ＲＮＡ断片は標識Ｄ
ＮＡマーカーより速く移動する）。
サンプルはヒト脳側頭皮質由来の全ＲＮＡ（第２及び３
レーン）、ヒト前骨髄白血病（ＨＬ６０）細胞ポリ−
（Ａ＋）ＲＮＡ（第４レーン）、及びそれぞれ第５から
クレーンにはヒト、マウス、及びラツト脳ポリ−（Ａ
＋）ＲＮＡを含む。ＡＰＰ７７０、ＡＰＰ６９５及び新
規ＡＰＰ３６５に相当するバンドは第２から３レーンに
見られる。第４から７レーンにはＡＰＰ７５１ＲＮＡが
見られる。マーカー（第１レーン）は32Ｐ標識したφＸ
１７４由来のＨａｅIII制限断片である。（本糸におい
ては、標識リボプローブ由来の保護ＲＮＡ断片は標識Ｄ
ＮＡマーカーより速く移動する）。
【００４１】本方法のラツト及びマウス脳ＲＮＡのＳｌ
保護によつてＡＰＰ６９５、７５１及び７７０のＲＮＡ
のｃＤＮＡクローンの配列に基づいて、その長さがそれ
ぞれ９３、２６１及び３７０ヌクレオチドであるプロー
ブ断片を表す３つのバンドが得られる。ヒト脳ＲＮＡは
ほとんど一致するバンドパターンを生じるが、ＡＰＰ７
５１領域のバンドはゲツ歯類で対応するものより遅く移
動する（１図のＤ）。前骨髄白血病細胞ライン、ＨＬ６
０由来のヒトＲＮＡではＡＰＰ６９５はほとんど検出不
可能、ＡＰＰ７７０は存在、及びＡＰＰ７５１は二重バ
ンドというパターンを与える（１図のＤ、第４レー
ン）。この二重バンドの下はゲツ歯類脳ＡＰＰ７５１Ｒ
ＮＡ（１図のＤ、第６及び７レーン）及び先にＨＬ６０
ｃＤＮＡライブラリーから単離されたＡＰＰ７５１クロ
ーン（ドンネリー(Donnelly)ら、上に引用）を用いて保
護した標識断片と同様に移動する。二重バンドの上のバ
ンドはヒト脳ＲＮＡによつて保護されたゆつくり移動す
る断片と同様に移動する（図２、第５レーン）。本発明
の新規ＲＮＡを表す上のバンドは多数の個体由来のヒト
脳ＲＮＡ、２２個の調製物中２２個に見られた。
保護によつてＡＰＰ６９５、７５１及び７７０のＲＮＡ
のｃＤＮＡクローンの配列に基づいて、その長さがそれ
ぞれ９３、２６１及び３７０ヌクレオチドであるプロー
ブ断片を表す３つのバンドが得られる。ヒト脳ＲＮＡは
ほとんど一致するバンドパターンを生じるが、ＡＰＰ７
５１領域のバンドはゲツ歯類で対応するものより遅く移
動する（１図のＤ）。前骨髄白血病細胞ライン、ＨＬ６
０由来のヒトＲＮＡではＡＰＰ６９５はほとんど検出不
可能、ＡＰＰ７７０は存在、及びＡＰＰ７５１は二重バ
ンドというパターンを与える（１図のＤ、第４レー
ン）。この二重バンドの下はゲツ歯類脳ＡＰＰ７５１Ｒ
ＮＡ（１図のＤ、第６及び７レーン）及び先にＨＬ６０
ｃＤＮＡライブラリーから単離されたＡＰＰ７５１クロ
ーン（ドンネリー(Donnelly)ら、上に引用）を用いて保
護した標識断片と同様に移動する。二重バンドの上のバ
ンドはヒト脳ＲＮＡによつて保護されたゆつくり移動す
る断片と同様に移動する（図２、第５レーン）。本発明
の新規ＲＮＡを表す上のバンドは多数の個体由来のヒト
脳ＲＮＡ、２２個の調製物中２２個に見られた。
【００４２】
【実施例２】Ｓ１ オートラジオグラムの定量 実施例１のＳ１解析に供した複製ＲＮＡサンプルのオー
トラジオグラムはモデル３００Ａコンピユーテイングデ
ンシトメータ(Model ３００Ａ Computing Densitomete
r)（モレキユラーデイアンミクス、サニーベール、カリ
フオルニア(Molecular Dyanmics, Sunnyvale,(A))を用
いたデンシトメトリーによつて定量分析する。ＡＰＰ７
７０、７５１さらに５６３、６９５及び新規ＲＮＡを表
すバンドはバツクグラウンド消去後一本化する。それぞ
れのＡＰＰ ＲＮＡの比はそれぞれのサンプル中のＡＰ
Ｐ７７０ＲＮＡの量を１.０に設定することによる。値
は２回測定の±標準偏差を表す。
トラジオグラムはモデル３００Ａコンピユーテイングデ
ンシトメータ(Model ３００Ａ Computing Densitomete
r)（モレキユラーデイアンミクス、サニーベール、カリ
フオルニア(Molecular Dyanmics, Sunnyvale,(A))を用
いたデンシトメトリーによつて定量分析する。ＡＰＰ７
７０、７５１さらに５６３、６９５及び新規ＲＮＡを表
すバンドはバツクグラウンド消去後一本化する。それぞ
れのＡＰＰ ＲＮＡの比はそれぞれのサンプル中のＡＰ
Ｐ７７０ＲＮＡの量を１.０に設定することによる。値
は２回測定の±標準偏差を表す。
【００４３】本方法を用いて、以下に示す培養ヒト前骨
髄白血病（ＨＬ６０）細胞及びヒト、マウス及びラツト
の脳由来の組織で発現したＡＰＰ ＲＮＡの量比が得ら
れる。
髄白血病（ＨＬ６０）細胞及びヒト、マウス及びラツト
の脳由来の組織で発現したＡＰＰ ＲＮＡの量比が得ら
れる。
【００４４】
【表１】
【００４５】
【実施例３】詳細な特徴 実施例１で記載したＡＰＰ７５１二重バンドの上の方の
バンドを生じるＳ１保護１５を施した新規ＲＮＡを詳細
に特徴付けるため、ＨＬ６０ｃＤＮＡライブラリーを再
スクリーニングし、クニツツプロテアーゼインヒビター
に特異的なオリゴヌクレオチドにハイブリダイゼーシヨ
ンするクローンを単離する（デービス、Ｌ．Ｇ．(Davi
s, L.G.)、 デイブナー、Ｍ．Ｄ．(Dibner, M.D.)、 及び
バテリー、Ｊ．Ｆ．(Battery, J.F.)、ベイシツク メ
ソツドイン モレキユラー バイオロジー(Basic Metho
ds in Molecular Biology)、エルゼビア(Elsevier)、ニ
ユーヨーク(New York)、１９８６年６７−７８ページに
記載され、ドンネリー(Donnelly)ら、上に引用した３３
４ページに要約されている標準的な技術による）。元の
ＡＰＰ７５１及びＡＰＰｃＤＮＡ単離物を含む候補のク
ローン由来のラムダＤＮＡを実施例１に概説した通りに
Ｓ１保護解析に供する。
バンドを生じるＳ１保護１５を施した新規ＲＮＡを詳細
に特徴付けるため、ＨＬ６０ｃＤＮＡライブラリーを再
スクリーニングし、クニツツプロテアーゼインヒビター
に特異的なオリゴヌクレオチドにハイブリダイゼーシヨ
ンするクローンを単離する（デービス、Ｌ．Ｇ．(Davi
s, L.G.)、 デイブナー、Ｍ．Ｄ．(Dibner, M.D.)、 及び
バテリー、Ｊ．Ｆ．(Battery, J.F.)、ベイシツク メ
ソツドイン モレキユラー バイオロジー(Basic Metho
ds in Molecular Biology)、エルゼビア(Elsevier)、ニ
ユーヨーク(New York)、１９８６年６７−７８ページに
記載され、ドンネリー(Donnelly)ら、上に引用した３３
４ページに要約されている標準的な技術による）。元の
ＡＰＰ７５１及びＡＰＰｃＤＮＡ単離物を含む候補のク
ローン由来のラムダＤＮＡを実施例１に概説した通りに
Ｓ１保護解析に供する。
【００４６】結果を図２（下）に示す。３種の長さが異
なる標識リボプローブ断片を保護する。多くの候補はＡ
ＰＰ７５１及び７７０型であるが、３つのクローンは新
規バンドの位置に移動する保護断片である。代表的なラ
ムダｃＤＮＡクローン単離物はＡＰＰ７７０（第６及び
７クレーン）、ＡＰＰ７５１（第３及び５レーン）、及
び新規ＲＮＡ（第４レーン）と思われる断片の長さを持
つバンドで示される。ＡＰＰ７７０（第７レーン）及び
７５１（第５レーン）ｃＤＮＡ単離物は先にサブクロー
ン化及び配列決定されている（同書）。Ｓ１処理してい
ないリボプローブ（１及び２）及びマーカー（第１レー
ン）も示されている。
なる標識リボプローブ断片を保護する。多くの候補はＡ
ＰＰ７５１及び７７０型であるが、３つのクローンは新
規バンドの位置に移動する保護断片である。代表的なラ
ムダｃＤＮＡクローン単離物はＡＰＰ７７０（第６及び
７クレーン）、ＡＰＰ７５１（第３及び５レーン）、及
び新規ＲＮＡ（第４レーン）と思われる断片の長さを持
つバンドで示される。ＡＰＰ７７０（第７レーン）及び
７５１（第５レーン）ｃＤＮＡ単離物は先にサブクロー
ン化及び配列決定されている（同書）。Ｓ１処理してい
ないリボプローブ（１及び２）及びマーカー（第１レー
ン）も示されている。
【００４７】それぞれの新規ラムダクローンは１.６kb
のＥｃｏＲＩ断片を含むことが見出された。サブクロー
ン化し、アルカリ変性及びマルチオリゴヌクレオチドプ
ライマーを用いて行なった配列解析によつてその断片は
同一であることが見出された（アウスベル(Ausubel)
ら、上述に記載）。
のＥｃｏＲＩ断片を含むことが見出された。サブクロー
ン化し、アルカリ変性及びマルチオリゴヌクレオチドプ
ライマーを用いて行なった配列解析によつてその断片は
同一であることが見出された（アウスベル(Ausubel)
ら、上述に記載）。
【００４８】
【実施例４】タンパク質の発現 本発明のアミロイドペブチド前駆体をコードするｃＤＮ
ＡクローンはＨＢ１０１細菌内のプラスミドとしてブダ
ペスト条約(Budapest Treaty)の条件に準じ１９９０年
１月２２日アメリカン タイプ カルチヤー コレクシ
ヨン（Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．）、１２３０１パークローン
ドライブ、ロツクビレ、メリーランド(Parklawn Drive,
Rockville, Maryland)２０８５２に寄託した。ここで
はｐＣＬＬ３６５と呼ぶ本プラスミドのＡ．Ｔ．Ｃ．
Ｃ．登録番号は６８２０７である。ＤＮＡ及びクローン
は本出願が米国特許として請求発布された後米国におい
て公的に及び他の法的に認められた基準に従つて入手で
きる。
ＡクローンはＨＢ１０１細菌内のプラスミドとしてブダ
ペスト条約(Budapest Treaty)の条件に準じ１９９０年
１月２２日アメリカン タイプ カルチヤー コレクシ
ヨン（Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．）、１２３０１パークローン
ドライブ、ロツクビレ、メリーランド(Parklawn Drive,
Rockville, Maryland)２０８５２に寄託した。ここで
はｐＣＬＬ３６５と呼ぶ本プラスミドのＡ．Ｔ．Ｃ．
Ｃ．登録番号は６８２０７である。ＤＮＡ及びクローン
は本出願が米国特許として請求発布された後米国におい
て公的に及び他の法的に認められた基準に従つて入手で
きる。
【００４９】ｐＣＬＬは本発明の新規アミロイドタンパ
ク質を発現するために用いられる。そのためにはｐＣＬ
Ｌ３６５のｃＤＮＡ挿入物を適当な制限酵素で除去し、
プラスミドｐＥＴ−３ａ（ローゼンバーグ、Ａ．Ｈ．(R
osenberg, A.H.)ら、５６ ジーン(Gene)１２５（１９８
７））に導入する。ｐＥＴ−３ａのＮｄｅＩ部位をタン
パク質のアミノ末端に用い、ＢａｍＨＩ部位をタンパク
質のカルボキシ末端に用いる。ＡＰＰ３６５ｃＤＮＡを
含むキメラル ｐＥＴ−３ａをＢＬ−２１、ＬｙｓＳ細
菌（シユテユデイア、Ｆ．Ｗ．(Studier, F.W.)及びモ
フアト、Ｂ．Ａ．(Moffatt, B.A.)、 １８９ ジヤーナ
ル オブ モレキユラー バイオロジー(J. Mol. Bio
l.)１１３（１９８６））に形質転換した後、タンパク
質の発現をラクトースまたはイソプロピルチオガラクト
ピラノシド(isopropylthiogalactopyranoside)を添加す
ることによつて誘導する。全細菌を溶菌し、ＡＰＰタン
パク質を従来のタンパク質精製方法に従つて精製する。
ク質を発現するために用いられる。そのためにはｐＣＬ
Ｌ３６５のｃＤＮＡ挿入物を適当な制限酵素で除去し、
プラスミドｐＥＴ−３ａ（ローゼンバーグ、Ａ．Ｈ．(R
osenberg, A.H.)ら、５６ ジーン(Gene)１２５（１９８
７））に導入する。ｐＥＴ−３ａのＮｄｅＩ部位をタン
パク質のアミノ末端に用い、ＢａｍＨＩ部位をタンパク
質のカルボキシ末端に用いる。ＡＰＰ３６５ｃＤＮＡを
含むキメラル ｐＥＴ−３ａをＢＬ−２１、ＬｙｓＳ細
菌（シユテユデイア、Ｆ．Ｗ．(Studier, F.W.)及びモ
フアト、Ｂ．Ａ．(Moffatt, B.A.)、 １８９ ジヤーナ
ル オブ モレキユラー バイオロジー(J. Mol. Bio
l.)１１３（１９８６））に形質転換した後、タンパク
質の発現をラクトースまたはイソプロピルチオガラクト
ピラノシド(isopropylthiogalactopyranoside)を添加す
ることによつて誘導する。全細菌を溶菌し、ＡＰＰタン
パク質を従来のタンパク質精製方法に従つて精製する。
【００５０】前述の詳細な記載及び実施例はさらに図を
用いて説明及び例証される。図１はヒト前骨髄白血病
（ＨＬ６０）細胞及びヒト、マウス及びラツト脳におけ
るＡＰＰ転写物のＳ１ヌクレアーゼ保護（実施例１）解
析について図説する。（Ａ）は（Ｂ）及び（Ｃ）のＳ１
保護法において表わされ、図２のＳ１解析において用い
られる４１０塩基の32Ｐ標識したリボプローブの構築を
表わす。ｐＡＰＰ７７０−ＤＸは３６６塩基のＤｄｅＩ
−ＸｈｏＩ断片（ＡＰＰ７７０ｃＤＮＡクローン由来）
をリボプローブベクターｐＩＢＩ３０のＳｍａＩ−Ｘｈ
ｏＩ部位に挿入することによつて構築したプラスミドの
一部分を示す。Ｔ3ＲＮＡポリメラーゼでＥｃｏＲＩ線
状化鋳型を転写することによつて、付随するベクター配
列（斑点部）と同様にＡＰＰ関連ＲＮＡのクニツツプロ
テアーゼインヒビター（黒染り部）、Ｃ（垂直平行線
部）及び隣接（白抜き部）ドメインを相補する配列を含
む４１０塩基のアンチセンスリボプローブを生じる。リ
ボプローブはＡＰＰ７７０転写物を相補する全３７０塩
基を含み、関連する配列の長さは与えられている。
用いて説明及び例証される。図１はヒト前骨髄白血病
（ＨＬ６０）細胞及びヒト、マウス及びラツト脳におけ
るＡＰＰ転写物のＳ１ヌクレアーゼ保護（実施例１）解
析について図説する。（Ａ）は（Ｂ）及び（Ｃ）のＳ１
保護法において表わされ、図２のＳ１解析において用い
られる４１０塩基の32Ｐ標識したリボプローブの構築を
表わす。ｐＡＰＰ７７０−ＤＸは３６６塩基のＤｄｅＩ
−ＸｈｏＩ断片（ＡＰＰ７７０ｃＤＮＡクローン由来）
をリボプローブベクターｐＩＢＩ３０のＳｍａＩ−Ｘｈ
ｏＩ部位に挿入することによつて構築したプラスミドの
一部分を示す。Ｔ3ＲＮＡポリメラーゼでＥｃｏＲＩ線
状化鋳型を転写することによつて、付随するベクター配
列（斑点部）と同様にＡＰＰ関連ＲＮＡのクニツツプロ
テアーゼインヒビター（黒染り部）、Ｃ（垂直平行線
部）及び隣接（白抜き部）ドメインを相補する配列を含
む４１０塩基のアンチセンスリボプローブを生じる。リ
ボプローブはＡＰＰ７７０転写物を相補する全３７０塩
基を含み、関連する配列の長さは与えられている。
【００５１】図１の（Ｂ）は図１の（Ａ）に記載された
リボプローブを用いたＡＰＰ ＲＮＡに対する予想され
るＳ１保護機構を図説する。放射標識したリボプローブ
にハイブリダイゼーシヨンするＡＰＰ ＲＮＡからそれ
ぞれＡＰＰ７７０、７５１及び６９５ＲＮＡの存在を示
す３７０、２６１及び９３塩基の長さを持つＳ１耐性プ
ローブ断片を生じると思われる。
リボプローブを用いたＡＰＰ ＲＮＡに対する予想され
るＳ１保護機構を図説する。放射標識したリボプローブ
にハイブリダイゼーシヨンするＡＰＰ ＲＮＡからそれ
ぞれＡＰＰ７７０、７５１及び６９５ＲＮＡの存在を示
す３７０、２６１及び９３塩基の長さを持つＳ１耐性プ
ローブ断片を生じると思われる。
【００５２】図１の（Ｃ）は（Ａ）に記載されたリボプ
ローブを用いた本発明の新規ＲＮＡに対する推定Ｓ１機
構を示す。図２の変ったＳ１パターン及びそのｃＤＮＡ
クローンから検出される新規ＲＮＡから２７３塩基のＳ
１耐性プローブ断片を生じると思われる。
ローブを用いた本発明の新規ＲＮＡに対する推定Ｓ１機
構を示す。図２の変ったＳ１パターン及びそのｃＤＮＡ
クローンから検出される新規ＲＮＡから２７３塩基のＳ
１耐性プローブ断片を生じると思われる。
【００５３】図２（上）は（Ａ）のＡＰＰリボプローブ
及びポリ−（Ａ＋）または全ＲＮＡを用いたＳ１ヌクレ
アーゼ保護解析のオートラジオグラフを示す。サンプル
は全ＲＮＡを含む。サンプルはヒト脳側頭皮質由来の全
ＲＮＡ（第２及び３レーン）、ヒト前骨髄白血病（ＨＬ
６０）細胞ポリ−（Ａ＋）（第４レーン）、及びそれぞ
れ第５〜７レーンにはヒト、マウス及びラツト脳ポリ−
（Ａ＋）ＲＮＡを含む。ＡＰＰ７７０、ＡＰＰ３６５、
及びＡＰＰ６９５に相当するバンドは第２〜３レーンに
示されている。第４レーンには、変種ＡＰＰ３６５及び
ＡＰＰ７５１ＲＮＡのＳ１保護断片に相当する関連した
バンドをより視覚化するためにＡＰＰ７５１領域が拡大
されている。マーカー（第１レーン）は32Ｐ標識したφ
Ｘ１７４由来のＨａｅIII制限断片である。
及びポリ−（Ａ＋）または全ＲＮＡを用いたＳ１ヌクレ
アーゼ保護解析のオートラジオグラフを示す。サンプル
は全ＲＮＡを含む。サンプルはヒト脳側頭皮質由来の全
ＲＮＡ（第２及び３レーン）、ヒト前骨髄白血病（ＨＬ
６０）細胞ポリ−（Ａ＋）（第４レーン）、及びそれぞ
れ第５〜７レーンにはヒト、マウス及びラツト脳ポリ−
（Ａ＋）ＲＮＡを含む。ＡＰＰ７７０、ＡＰＰ３６５、
及びＡＰＰ６９５に相当するバンドは第２〜３レーンに
示されている。第４レーンには、変種ＡＰＰ３６５及び
ＡＰＰ７５１ＲＮＡのＳ１保護断片に相当する関連した
バンドをより視覚化するためにＡＰＰ７５１領域が拡大
されている。マーカー（第１レーン）は32Ｐ標識したφ
Ｘ１７４由来のＨａｅIII制限断片である。
【００５４】図２（下）もまたＳ１ヌクレアーゼ保護解
析に供したＡＰＰ３６５、ＡＰＰ７５１及びＡＰＰ７７
０ｃＤＮＡの移動度を比較している（実施例３に記
載）。ＨＬ６０ｃＤＮＡライブラリーをクニツツプロテ
アーゼインヒビター特異的プローブでスクリーニング
し、ラムダＤＮＡのポジテイブな単離物をＳ１ヌクレア
ーゼ保護解析に供する。代表的なラムダＤＮＡｃＤＮＡ
クローン単離物はＡＰＰ７７０（第６及び７レーン）、
ＡＰＰ７５１（第３及び５レーン）及び新規ＡＰＰ３６
５（第４レーン）と思われる。断片の長さを持つバンド
を示す。マーカー（第１レーン）は上に記載した通り、
Ｓ１処理をしていないリボプローブも示されている（第
２レーン）。
析に供したＡＰＰ３６５、ＡＰＰ７５１及びＡＰＰ７７
０ｃＤＮＡの移動度を比較している（実施例３に記
載）。ＨＬ６０ｃＤＮＡライブラリーをクニツツプロテ
アーゼインヒビター特異的プローブでスクリーニング
し、ラムダＤＮＡのポジテイブな単離物をＳ１ヌクレア
ーゼ保護解析に供する。代表的なラムダＤＮＡｃＤＮＡ
クローン単離物はＡＰＰ７７０（第６及び７レーン）、
ＡＰＰ７５１（第３及び５レーン）及び新規ＡＰＰ３６
５（第４レーン）と思われる。断片の長さを持つバンド
を示す。マーカー（第１レーン）は上に記載した通り、
Ｓ１処理をしていないリボプローブも示されている（第
２レーン）。
【００５５】図３は本発明の新規ＡＰＰ３６５ｃＤＮＡ
のヌクレオチド及び推定されるアミノ酸配列を図説する
（より完全には下に記載）。その構成は５’から３’の
方向になつている。ＰＩと表されるクニツツプロテアー
ゼインヒビターは８６６から１０３３の位置に見出さ
れ、Ｃドメインは１０３４から１０９０の位置である。
１２ヌクレオチドの欠失（８０６から８１７の位置）及
び新規カルボキシ末端（１０９１から１７６０の位置）
が示されている。線の下の表記はそれぞれのドメイン由
来のアミノ酸残基数を示す。
のヌクレオチド及び推定されるアミノ酸配列を図説する
（より完全には下に記載）。その構成は５’から３’の
方向になつている。ＰＩと表されるクニツツプロテアー
ゼインヒビターは８６６から１０３３の位置に見出さ
れ、Ｃドメインは１０３４から１０９０の位置である。
１２ヌクレオチドの欠失（８０６から８１７の位置）及
び新規カルボキシ末端（１０９１から１７６０の位置）
が示されている。線の下の表記はそれぞれのドメイン由
来のアミノ酸残基数を示す。
【００５６】図４はカルボキシ末端における新規６アミ
ノ酸配列と共に図３で表わされた挿入物の最初の６７０
ヌクレオチドを示す。
ノ酸配列と共に図３で表わされた挿入物の最初の６７０
ヌクレオチドを示す。
【００５７】図５は本発明の新規ＡＰＰ３６５ｃＤＮＡ
のヌクレオチド及び推定されるアミノ酸配列を示す。１
１５の位置（カンゲ(Kange)ら、３２５ネイチヤー(Natu
re)７３３（１９８７）が記載した番号系による）から
始まり付加した１６３０ヌクレオチドが続くように５’
から３’に構成されている。１２ヌクレオチドの欠失は
ヌクレオチド８０５及び８０６の間の垂直矢印で示され
ている。二重下線を施した残基はクニツツプロテアーゼ
インヒビター領域を示し、一本下線は新規６残基のカル
ボキシ末端を示す。
のヌクレオチド及び推定されるアミノ酸配列を示す。１
１５の位置（カンゲ(Kange)ら、３２５ネイチヤー(Natu
re)７３３（１９８７）が記載した番号系による）から
始まり付加した１６３０ヌクレオチドが続くように５’
から３’に構成されている。１２ヌクレオチドの欠失は
ヌクレオチド８０５及び８０６の間の垂直矢印で示され
ている。二重下線を施した残基はクニツツプロテアーゼ
インヒビター領域を示し、一本下線は新規６残基のカル
ボキシ末端を示す。
【００５８】上述の記載は本技術分野における平均的な
技術者に対して本発明の実行方法を教えるためのもので
あり、記載を読んで技術者が明らかにするであろう修正
及び変法のすべてを詳述するものではない。しかし、そ
のようなすべての修正及び変法は付随する請求項で定義
する通り本発明の範囲内に含まれる。
技術者に対して本発明の実行方法を教えるためのもので
あり、記載を読んで技術者が明らかにするであろう修正
及び変法のすべてを詳述するものではない。しかし、そ
のようなすべての修正及び変法は付随する請求項で定義
する通り本発明の範囲内に含まれる。
【００５９】
【参考一覧】アウフデンブリンケ、Ｂ．(Aufdembrinke,
B.)ら、米国特許第４,７１１,８９１号（１９８７）。
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【００６０】アウスベル、Ｆ．Ｍ．(Ausubel, F. M.)
ら編、カレント プロトコール インモレキユラー バイ
オロジー(Current Protocols in Molecular Biology)、
ジヨン ウイリー ＆ サンズ(John Wiley & Sons)、
ニユーヨーク(New York)、１９８９年３.１２.１から
３.１２.３。
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ジヨン ウイリー ＆ サンズ(John Wiley & Sons)、
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【００６１】ベンドツテイ、Ｃ．(Bendotti, C.)ら、８
５ プロシーデイング ナシヨナルアカデミツク サイ
エンス イン Ｕ．Ｓ．Ａ．(Proc. Nat. Acod. Sci.
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【００６２】カード、Ｊ．Ｐ．(Card, J.P.)ら、１ ニ
ユーロン(Neuron)８３５（１９８８）。
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【００６３】チヤーグウイン(Chirgwin)ら、２４ バイ
オケミストリー(Biochem.)５２９４（１９７９）。
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【００６４】コーレ、Ｇ．(Cole, G.)ら、１００ニユヘ
ロサイエンス レターズ(Neurosci, Lett.)３４０（１
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【００６５】デービス、Ｌ．Ｇ．(Davis, L.G.)、デイ
ブナー、Ｍ．Ｄ．(Dibner, M.D.)及びバツテイ、Ｊ．
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York)、１９８６年、６７−７８ページ。デサベージ、
Ｆ．(DeSavage, F.)及びオクターブ、Ｊ．Ｎ．(Octave,
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９）。
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Res.)３８７（１９８６）。
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【００６７】ドンネリー、Ｒ．Ｊ．(Donnelly, R.J.)
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【００６８】デイルクス、Ｔ．(Dyrks, T.)ら、７ エ
ンボ(EMBO)９４９（１９８８）。
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【００６９】フルヤ、Ｈ．(Furuya, H.)ら、 １５０ バ
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５（１９８８）。
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バイオフイジツクス リサーチ コミユニケーシヨン
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【００７１】ゴードン、Ｐ．(Gordon, P.)米国特許第
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【００７２】ハーデイー、Ｊ．Ａ．(Hardy, J.A.)ら、
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８９（１９８６）。
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【００７３】カング、Ｊ．(Kang, J.)ら、３２５ ネイ
チヤー(Nature)７３３（１９８７）。カング、Ｊ．(Kan
g, J)及びミユラーヒル、Ｂ．（Muller-Hill，B.)、 １
７ ヌクレイツク アシツド リサーチ(Nucleic Acids
Res.)２１３０（１９８９）。カツツマン、Ｒ．(Katzm
an, R.)３３ アーカイブズ ニユーロル(Arch. Neuro
l.)２１７（１９７６）。
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【００７４】キタグチ、Ｎ．(Kitaguchi, N.)ら、３３
１ ネイチヤー(Nature)５３０（１９８８）。
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【００７５】ラスコウスキー、Ｍ．(Laskowski, M.)及
びカトー、Ｉ．(Kato, I.)、４９ アニユアル レビユ
ー オブ バイオケミストリー(Ann. Rev. Biochem.)５
９３（１９８０）。
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【００７６】レメイヤー、Ｈ．Ｇ．(Lemaire, H.G.)
ら、１７ ヌクレイツク アシツド リサーチ(Nucleic
Acid Res.)５１７（１９８９）。
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【００７７】リンドバーグ、Ｕ．Ｈ．Ａ．(Lindberg,
U.H.A.)及びオエグレン、 Ｓ．Ｏ．(Oegren, S.O.)米国
特許第４,４６９,７０７号（１９８４）。
U.H.A.)及びオエグレン、 Ｓ．Ｏ．(Oegren, S.O.)米国
特許第４,４６９,７０７号（１９８４）。
【００７８】マスターズ、Ｃ．(Masters. C.)ら、８２
プロシーデイング ナシヨナル アカデミツク サイ
エンス イン Ｕ．Ｓ．Ａ．(Proc. Nat. Acad. Sci.
U.S.A.)４２４５（１９８５）。
プロシーデイング ナシヨナル アカデミツク サイ
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【００７９】モナード、Ｄ．(Monard, D)、トレンズ
ニユーロサイエンス(Trends Neurosci.)１１：５４１−
５４４、１９８８。
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【００８０】マードツク、Ｇ．(Murdoch, G.)ら、１６
ヌクレイツク アシツド リサーチ(Nucleic Acids R
es.)３５７（１９８８）。
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【００８１】ポドリスニー、Ｍ．(Podlisny, M.)ら、２
３８ サイエンス(Science)６６９（１９８７）。
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【００８２】ポンテ、Ｐ．(Ponte, P.)ら、３３１ ネ
イチヤー(Nature)５２５（１９８８）。
イチヤー(Nature)５２５（１９８８）。
【００８３】ロツホ、Ｍ．(Roch, M.)ら、２０９ ネイ
チヤー(Nature)１０９（１９６６）。ローゼンバーグ、
Ａ．Ｈ．(Rosenberg, A.H.)ら、５６ ジーン(Gene)１
２５（１９８７）。
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y Manual)、第２版、コールドスプリング ハーバー
ラボラトリー プレス(Cold Spring Harbor Laboratory
Press)、 １９８９年、１０.２９から１０.３７。
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【００８５】スキヤンゴス、Ｇ．(Scangos, G.)ら、欧
州特許、Ap. 第３４１,４９１号（１９８９）。
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【００８６】セントジヨージ ハイスロツプ、Ｐ．Ｈ．
(St. George-Hyslop, P.H.)ら、２３５ サイエンス(Sc
ience)２３５（１９８７）。
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【００８７】ストユデア、Ｆ．Ｗ．(Studier, F.W.)及
びモフフアツト、Ｂ．Ａ．(Moffatt, B.A.)、189 ジヤー
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【００８８】セルコエ、Ｄ．Ｊ．(Selkoe, D.J.)ら、85
プロシーデイング ナシヨナル アカデミツク サイエ
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S.A.)７３４１（１９８８）。
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S.A.)７３４１（１９８８）。
【００８９】タンツイ、Ｒ．(Tanzi, R.)ら、３３１
ネイチヤ(Nature)５２８（１９８８）。
ネイチヤ(Nature)５２８（１９８８）。
【００９０】トウトル、Ｒ．Ｒ．(Tuttle, R.R.)、米国
特許第４,５１１,５７０号（１９８５）。
特許第４,５１１,５７０号（１９８５）。
【００９１】ビテツク、Ｍ．Ｐ．(Vitek, M.P.)ら、４
モレキユラー ブレイン リサーチ(Mol. Brain Re
s.)１２１（１９８８）。
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【００９２】ウオング、Ｃ．(Wong, C.)ら、８２ プロ
シーデイン ナシヨナル アカデミツク サイエンス
イン Ｕ．Ｓ．Ａ．(Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A.)８
７２９（１９８２）。
シーデイン ナシヨナル アカデミツク サイエンス
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【００９３】ウインガーデン、Ｊ．Ｂ．(Wyngaarden,
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キストブツク オブ メデイシン (Cecil's Textbook
of Medicine)、第１８版、Ｗ．Ｂ．サウンダース(W.B.S
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aunders)、１９８９年、２０８９から２０９０ページ。
【００９４】ザイン、Ｓ．Ｂ．(Zain, S.B.)ら、８５
プロシーデイン ナシヨナル アカデミツク サイエン
ス イン Ｕ．Ｓ．Ａ．(Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.
A.)９２９（１９８８）。
プロシーデイン ナシヨナル アカデミツク サイエン
ス イン Ｕ．Ｓ．Ａ．(Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.
A.)９２９（１９８８）。
【００９５】ツアーン、Ａ．Ｄ．(Zurn, A.D.)ら、デペ
ロツプメント ニユロサイエンス(Dev.Newrosci.)１０：
１７−２４、１９８８年。
ロツプメント ニユロサイエンス(Dev.Newrosci.)１０：
１７−２４、１９８８年。
【００９６】本発明の主な特徴及び態様は以下のとおり
である。
である。
【００９７】１．可溶性ヒト脳組織アミロイドペプチド
前駆体タンパク質をコードする精製単離されたＲＮＡ配
列。
前駆体タンパク質をコードする精製単離されたＲＮＡ配
列。
【００９８】２．（ａ） 図５で説明されるＤＮＡ配列
にハイブリダイゼーシヨンするＲＮＡ配列、及び（ｂ）
タンパク質の生物学的性質を持つように図５のＤＮＡ
にコードされるタンパク質を十分に複製しうる可溶性脳
組織アミロイドタンパク質前駆体をコードする、ＲＮＡ
配列、（ｃ） 図５で説明されるＤＮＡ配列によつてコ
ードされるＲＮＡ配列、から成る群から選ばれた精製単
離されたＲＮＡ配列。
にハイブリダイゼーシヨンするＲＮＡ配列、及び（ｂ）
タンパク質の生物学的性質を持つように図５のＤＮＡ
にコードされるタンパク質を十分に複製しうる可溶性脳
組織アミロイドタンパク質前駆体をコードする、ＲＮＡ
配列、（ｃ） 図５で説明されるＤＮＡ配列によつてコ
ードされるＲＮＡ配列、から成る群から選ばれた精製単
離されたＲＮＡ配列。
【００９９】３．可溶性ヒト脳組織アミロイドペプチド
前駆体タンパク質をコードする精製単離されたＤＮＡ配
列。
前駆体タンパク質をコードする精製単離されたＤＮＡ配
列。
【０１００】４．（ａ） 図５で説明されるＤＮＡ配列
にハイブリダイゼーシヨンするＤＮＡ配列、及び（ｂ）
タンパク質の生物学的性質を持つように図５のＤＮＡ
にコードされるタンパク質を十分に複製しうる可溶性脳
組織アミロイドタンパク質前駆体をコードするＤＮＡ配
列、及び（ｃ） 図５で説明されるＤＮＡ配列に相当す
るＤＮＡ配列、から成る群から選ばれた精製単離された
ＤＮＡ配列。
にハイブリダイゼーシヨンするＤＮＡ配列、及び（ｂ）
タンパク質の生物学的性質を持つように図５のＤＮＡ
にコードされるタンパク質を十分に複製しうる可溶性脳
組織アミロイドタンパク質前駆体をコードするＤＮＡ配
列、及び（ｃ） 図５で説明されるＤＮＡ配列に相当す
るＤＮＡ配列、から成る群から選ばれた精製単離された
ＤＮＡ配列。
【０１０１】５．上記３または４項に従うＤＮＡ配列か
ら成る生物学的機能性を持つ環状プラスミドまたはウイ
ルスＤＮＡベクター。
ら成る生物学的機能性を持つ環状プラスミドまたはウイ
ルスＤＮＡベクター。
【０１０２】６．宿主細胞にヒトアミロイド前駆体タン
パク質を発現させるために上記４項によるＤＮＡ配列に
よつて形質転換または感染された原核または真核の宿主
細胞。
パク質を発現させるために上記４項によるＤＮＡ配列に
よつて形質転換または感染された原核または真核の宿主
細胞。
【０１０３】７．生物学的機能性プラスミドｐＣＬＬ３
６５、Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．，ロツクビレ(Rockville)、メ
リーランド(Maryland)、登録番号６８２０７。
６５、Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．，ロツクビレ(Rockville)、メ
リーランド(Maryland)、登録番号６８２０７。
【０１０４】８．上記７項に従うプラスミド中にコード
されているＤＮＡによつて形質転換された細菌宿主細胞
で、該宿主細胞はヒトアミロイド前駆体タンパク質を発
現する。
されているＤＮＡによつて形質転換された細菌宿主細胞
で、該宿主細胞はヒトアミロイド前駆体タンパク質を発
現する。
【０１０５】９．精製単離した可溶性ヒト脳組織アミロ
イドペプチド前駆体タンパク質。
イドペプチド前駆体タンパク質。
【０１０６】１０．図５のＤＮＡにコードされている可
溶性脳組織アミロイドタンパク質前駆体を十分に複製し
該タンパク質の生物学的性質を持ち、または図５のＤＮ
Ａにコードされているアミノ酸配列から成る精製単離さ
れた可溶性脳組織アミロイドタンパク質前駆体。
溶性脳組織アミロイドタンパク質前駆体を十分に複製し
該タンパク質の生物学的性質を持ち、または図５のＤＮ
Ａにコードされているアミノ酸配列から成る精製単離さ
れた可溶性脳組織アミロイドタンパク質前駆体。
【０１０７】１１．可溶性ヒト脳組織アミロイドペプチ
ド前駆体タンパク質をコードする精製単離されたＤＮＡ
配列によつて形質転換または感染された宿主細胞を該宿
主細胞が該タンパク質前駆体を発現するための十分な条
件下一定時間培地で増殖させ、次に該培地、該宿主細胞
の溶解物及び該宿主細胞の膜画分から成る群から選ばれ
た材料から可溶性脳組織アミロイドタンパク質前駆体を
回収することを特徴とする可溶性脳組織アミロイドタン
パク質前駆体を生成する方法。
ド前駆体タンパク質をコードする精製単離されたＤＮＡ
配列によつて形質転換または感染された宿主細胞を該宿
主細胞が該タンパク質前駆体を発現するための十分な条
件下一定時間培地で増殖させ、次に該培地、該宿主細胞
の溶解物及び該宿主細胞の膜画分から成る群から選ばれ
た材料から可溶性脳組織アミロイドタンパク質前駆体を
回収することを特徴とする可溶性脳組織アミロイドタン
パク質前駆体を生成する方法。
【０１０８】１２．可溶性ヒト脳組織アミロイドペプチ
ド前駆体タンパク質をコードするＤＮＡ配列によつて原
核または真核宿主細胞を感染または形質転換し、該宿主
細胞に該ＤＮＡによつてコードされるタンパク質を発現
させることを特徴とする可溶性脳組織アミロイドタンパ
ク質前駆体を発現する原核または真核細胞を作成する方
法。
ド前駆体タンパク質をコードするＤＮＡ配列によつて原
核または真核宿主細胞を感染または形質転換し、該宿主
細胞に該ＤＮＡによつてコードされるタンパク質を発現
させることを特徴とする可溶性脳組織アミロイドタンパ
ク質前駆体を発現する原核または真核細胞を作成する方
法。
【０１０９】１３．神経細胞に効果的な量のＡＰＰ−３
６５タンパク質またはその活性部分を添加することを特
徴とするin vivoまたはin vitroで神経細胞の生育を
刺激する方法。
６５タンパク質またはその活性部分を添加することを特
徴とするin vivoまたはin vitroで神経細胞の生育を
刺激する方法。
【図１】図１は（Ａ）ＡＰＰプローブを用いたＳ１ヌク
レアーゼ保護解析、（Ｂ）既知ＡＰＰを用いた分析によ
る推定される保護機構、及び（Ｃ）本発明の新規ＲＮＡ
に対する推定される保護機構について図説している。
レアーゼ保護解析、（Ｂ）既知ＡＰＰを用いた分析によ
る推定される保護機構、及び（Ｃ）本発明の新規ＲＮＡ
に対する推定される保護機構について図説している。
【図２】図２はＳ１ヌクレアーゼ保護解析のオートラジ
オグラフ（上）及びＳ１ヌクレアーゼ保護解析を施した
ＡＰＰｃＤＮＡクローンの移動度の比較（下）を示す。
オグラフ（上）及びＳ１ヌクレアーゼ保護解析を施した
ＡＰＰｃＤＮＡクローンの移動度の比較（下）を示す。
【図３】３図は本発明の新規ＡＰＰｃＤＮＡのヌクレオ
チド及び推定されるアミノ酸配列の構成を表わす。
チド及び推定されるアミノ酸配列の構成を表わす。
【図４】図４は新規挿入物の最初の６７０ヌクレオチ
ド。
ド。
【図５】図５は本発明の新規ＲＮＡに相当するｃＤＮＡ
の完全なかヌクレオチド及び推定されるアミノ酸配列を
図説している。
の完全なかヌクレオチド及び推定されるアミノ酸配列を
図説している。
【手続補正書】
【提出日】平成５年６月２日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正内容】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は（Ａ）ＡＰＰプローブを用いたＳＩヌク
レアーゼ保護解析、（Ｂ）既知ＡＰＰを用いた分析によ
る推定される保護機構、及び（Ｃ）本発明の新規ＲＮＡ
に対する推定される保護機構について図解したものであ
る。
レアーゼ保護解析、（Ｂ）既知ＡＰＰを用いた分析によ
る推定される保護機構、及び（Ｃ）本発明の新規ＲＮＡ
に対する推定される保護機構について図解したものであ
る。
【図２】図２はＳＩヌクレアーゼ保護解析のオートラジ
オグラフ（上）及びＳＩヌクレアーゼ保護解析を施した
ＡＰＰｃＤＮＡクローンの移動度の比較（下）を示す電
気泳動の図である。
オグラフ（上）及びＳＩヌクレアーゼ保護解析を施した
ＡＰＰｃＤＮＡクローンの移動度の比較（下）を示す電
気泳動の図である。
【図３】図３は本発明の新規ＡＰＰｃＤＮＡのヌクレオ
チド及び推定されるアミノ酸配列の構成を表わす。
チド及び推定されるアミノ酸配列の構成を表わす。
【図４】図４は新規挿入物の最初の６７０ヌクレオチド
の配列である。
の配列である。
【図５】図５は本発明の新規ＲＮＡに相当するｃＤＮＡ
の完全なヌクレオチド及び推定されるアミノ酸配列を図
解したものである。（図６につづく）
の完全なヌクレオチド及び推定されるアミノ酸配列を図
解したものである。（図６につづく）
【図６】図６は本発明の新規ＲＮＡに相当するｃＤＮＡ
の完全なヌクレオチド及び推定されるアミノ酸配列を図
解したものである。（図５からつづく）
の完全なヌクレオチド及び推定されるアミノ酸配列を図
解したものである。（図５からつづく）
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 8214−4Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 8310−2Ｊ 33/60 7055−2Ｊ // Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 7823−4Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/58 Ａ 7055−2Ｊ (72)発明者 ジヤツク・スチーブン・ジエイコブセン アメリカ合衆国ニユージヤージイ州07011 クリフトン・イーストクリフトンアベニユ ー111
Claims (12)
- 【請求項１】可溶性ヒト脳組織アミロイドペプチド前駆
体タンパク質をコードする精製単離されたＲＮＡ配列。 - 【請求項２】（ａ） 図５で説明されるＤＮＡ配列にハ
イブリダイズするＲＮＡ配列、及び （ｂ） タンパク質の生物学的性質を持つように図５の
ＤＮＡにコードされるタンパク質を十分に複製しうる可
溶性脳組織アミロイドタンパク質前駆体をコードする、
ＲＮＡ配列、 （ｃ） 図５で説明されるＤＮＡ配列によつてコードさ
れるＲＮＡ配列、から成る群から選ばれた精製単離され
たＲＮＡ配列。 - 【請求項３】 可溶性ヒト脳組織アミロイドペプチド前
駆体タンパク質をコードする精製単離されたＤＮＡ配
列。 - 【請求項４】（ａ） 図５で説明されるＤＮＡ配列にハ
イブリダイゼーシヨンするＤＮＡ配列、及び （ｂ） タンパク質の生物学的性質を持つように図５の
ＤＮＡにコードされるタンパク質を十分に複製しうる可
溶性脳組織アミロイドタンパク質前駆体をコードするＤ
ＮＡ配列、及び （ｃ） 図５で説明されるＤＮＡ配列に相当するＤＮＡ
配列、から成る群から選ばれた精製単離されたＤＮＡ配
列。 - 【請求項５】宿主細胞にヒトアミロイド前駆体タンパク
質を発現させるために請求項４によるＤＮＡ配列によつ
て形質転換または感染された原核または真核の宿主細
胞。 - 【請求項６】生物学的機能性プラスミドｐＣＬＬ３６
５、Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．，ロツクビレ(Rockville)、メリ
ーランド(Maryland)、寄託番号６８２０７。 - 【請求項７】請求項６によるプラスミド中にコードされ
ているＤＮＡによつて形質転換されたヒトアミロイド前
駆体タンパク質を発現しうる、細菌宿主細胞。 - 【請求項８】精製単離した可溶性ヒト脳組織アミロイド
ペプチド前駆体タンパク質。 - 【請求項９】図５のＤＮＡにコードされている可溶性脳
組織アミロイドタンパク質前駆体を十分に複製し該タン
パク質の生物学的性質を持ち、または図５のＤＮＡにコ
ードされているアミノ酸配列から成る精製単離された可
溶性脳組織アミロイドタンパク質前駆体。 - 【請求項１０】可溶性ヒト脳組織アミロイドペプチド前
駆体タンパク質をコードする精製単離されたＤＮＡ配列
によつて形質転換または感染された宿主細胞を該宿主細
胞が該タンパク質前駆体を発現するための十分な条件下
一定時間培地で増殖させ、次に該培地、該宿主細胞の溶
解物及び該宿主細胞の膜画分から成る群から選ばれた材
料から可溶性脳組織アミロイドタンパク質前駆体を回収
することを特徴とする可溶性脳組織アミロイドタンパク
質前駆体を生成する方法。 - 【請求項１１】可溶性ヒト脳組織アミロイドペプチド前
駆体タンパク質をコードするＤＮＡ配列によつて原核ま
たは真核宿主細胞を感染または形質転換し、該宿主細胞
に該ＤＮＡによつてコードされるタンパク質を発現させ
ることを特徴とする可溶性脳組織アミロイドタンパク質
前駆体を発現する原核または真核細胞を作成する方法。 - 【請求項１２】神経細胞に効果的な量のＡＰＰ−３６５
タンパク質またはその活性部分を添加することを特徴と
するin vivoまたはin vitroで神経細胞の生育を刺激
する方法。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US49251790A | 1990-03-12 | 1990-03-12 | |
| US56217790A | 1990-08-03 | 1990-08-03 | |
| US492517 | 1990-08-03 | ||
| US562177 | 1990-08-03 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0690760A true JPH0690760A (ja) | 1994-04-05 |
Family
ID=27050776
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3069366A Pending JPH0690760A (ja) | 1990-03-12 | 1991-03-11 | アミロイドペプチド前駆体のｒｎａ |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0447836A3 (ja) |
| JP (1) | JPH0690760A (ja) |
| AU (1) | AU7279691A (ja) |
| CA (1) | CA2037821A1 (ja) |
| NZ (1) | NZ237289A (ja) |
| PT (1) | PT96974A (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| TW327194B (en) * | 1992-05-01 | 1998-02-21 | American Cyanamid Co | Novel amyloid precursor proteins and methods of using same |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA1340802C (en) * | 1987-08-15 | 1999-10-26 | Yasuyuki Takahashi | Senile amyloid precursor protein and an antibody specific for the same |
| WO1990005138A1 (en) * | 1988-11-08 | 1990-05-17 | The Children's Medical Center Corporation | Cytotoxic amyloid precursors and screening assays using them |
-
1991
- 1991-02-23 EP EP19910102686 patent/EP0447836A3/en not_active Withdrawn
- 1991-03-04 NZ NZ237289A patent/NZ237289A/xx unknown
- 1991-03-08 PT PT96974A patent/PT96974A/pt not_active Application Discontinuation
- 1991-03-08 CA CA002037821A patent/CA2037821A1/en not_active Abandoned
- 1991-03-11 JP JP3069366A patent/JPH0690760A/ja active Pending
- 1991-03-11 AU AU72796/91A patent/AU7279691A/en not_active Abandoned
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU7279691A (en) | 1991-09-12 |
| NZ237289A (en) | 1993-04-28 |
| EP0447836A2 (en) | 1991-09-25 |
| CA2037821A1 (en) | 1991-09-13 |
| EP0447836A3 (en) | 1991-10-02 |
| PT96974A (pt) | 1991-12-31 |
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