JP3616274B2 - 中枢神経系疾患の検査方法および治療薬のスクリーニング方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、プレセニリン−２の新規なスプライシング変種、ならびに中枢神経系疾患の治療薬のスクリーニング方法及び同定方法に関する。また、本発明は、中枢神経系疾患の検査方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
真核生物のゲノムＤＮＡ上では、成熟したｍＲＮＡに対応する配列が何ヶ所かに分断されて存在していることが多い。このような場合、遺伝子の転写は、成熟ｍＲＮＡに対応する配列を含む全領域にわたって一続きで行われて前駆体ｍＲＮＡ（ｐｒｅ−ｍＲＮＡ）（成熟ｍＲＮＡには不必要な部分も含む転写産物）が作られる。そして、この前駆体ｍＲＮＡがプロセッシングを受けて成熟したｍＲＮＡとなる。プロセッシングの過程では、キャップ構造やポリＡの付加が行われると同時に、成熟ｍＲＮＡには不必要な部分（イントロン又は介在配列）が切り取られ、成熟ｍＲＮＡに対応する部分（エキソン）が貼りあわされて成熟ｍＲＮＡとなる。このような切り貼りの過程は「スプライシング」と呼ばれるが、スプライシングは、スプライソソームと呼ばれる大型の蛋白質−ＲＮＡ集合体の関与により、複数の切断と連結が調節される複雑で繊細な過程である。例えばゲノム上のイントロン−エキソンの境界領域に起こった突然変異などにより、しばしば異なった種類の成熟ｍＲＮＡ、すなわち「スプライシング変種」が生じるが、このような変種の中には機能的に異常な変異型蛋白質を生じて疾病の原因となる例が知られている。これまでに種々の疾病や障害について、発症メカニズム解明のために原因遺伝子におけるスプライシング変種が研究されるとともに、スプライシング変種を疾病の診断マーカーとして利用すること等もなされてきた。
【０００３】
一方、家族性アルツハイマー病（ＦＡＤ）の主な原因遺伝子としては、これまでに第２１染色体上のアミロイド前駆体蛋白質（ＡＰＰ：Ａｍｙｌｏｉｄ Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ）遺伝子、第１４染色体上のプレセニリン−１（ＰＳ−１：Ｐｒｅｓｅｎｉｌｉｎ−１）遺伝子、及び第１染色体上のプレセニリン−２（ＰＳ−２：Ｐｒｅｓｅｎｉｌｉｎ−２）遺伝子が知られている。そして、これら原因遺伝子において見い出されている突然変異やスプライシング変種等に着目し、アルツハイマー病の発症メカニズムとの関係について研究がなされている。しかしながら、アルツハイマー病の大部分を占める孤発性アルツハイマー病の発症メカニズムについては、まだほとんど何も解明されていない状況にある。
【０００４】
例えばプレセニリン−１遺伝子（Ｓｈｅｒｒｉｎｇｔｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ、第３７５巻、第７５４−７６０頁、１９９５年）については、家族性又は孤発性アルツハイマー病患者と正常の脳組織に由来するｍＲＮＡの解析が行われ、種々のスプライシング変種の存在が報告されている（Ｃｌａｒｋら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、第１１巻、第２１９−２２２頁、１９９５年；Ａｎｗａｒら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第６６巻、第１７７４〜１７７７頁、１９９６年）。
【０００５】
プレセニリン−２遺伝子（Ｌｅｖｙ−Ｌａｈａｄら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、第３４巻、第１９８−２０４頁、１９９６年；Ｌｅｖｙ−Ｌａｈａｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２６９巻、第９７３−９７７頁、１９９５年；Ｒｏｇａｅｖら、Ｎａｔｕｒｅ、第３７６巻、第７７５−７７８頁、１９９５年）は、プレセニリン−１遺伝子と同様、１２のエキソンから構成されており、このうち１０のエキソン（エキソン３〜１２）が蛋白質をコードしていることが知られている。また、正常ヒト組織において、エキソン８が欠失したスプライシング変種や、エキソン３及びエキソン４が同時に欠失したスプライシング変種の存在が報告されている（Ｐｒｉｈａｒら、ＮｅｕｒｏＲｅｐｏｒｔ、第７巻、第１６８０〜１６８４頁、１９９６年）。しかし、プレセニリン−２遺伝子について、アルツハイマー病（特に孤発性アルツハイマー病）に特異的なスプライシング変種の報告はない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、中枢神経系疾患（アルツハイマー病等）治療薬の新規なスクリーニング方法及び同定方法を提供することにある。また、中枢神経系疾患（アルツハイマー病等）の新規な検査方法を提供することにある。また、本発明の別の目的は、中枢神経系疾患の研究に有用な新規なプレセニリン−２由来スプライシング変種を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
発明者らは、神経細胞の培養系において、酸化ストレス負荷やβ−アミロイド刺激などにより、正常状態では見られない異常なプレセニリン−２ｍＲＮＡのスプライシング変種（（ｉ）エキソン５を欠くスプライシング変種、（ｉｉ）エキソン３を欠くスプライシング変種、及び（ｉｉｉ）エキソン３とエキソン４を欠くとともにイントロン配列の一部を有するスプライシング変種）が発現誘導されることを独自に見出した。また、それらスプライシング変種のうちの一つであるエキソン５欠失変種について、ヒト脳組織における発現を調べたところ、孤発性アルツハイマー病患者の脳組織において、エキソン５を欠くスプライシング変種が高頻度に存在することを独自に見出し、本発明を完成するに到った。
【０００８】
すなわち、本発明は、プレセニリン−２遺伝子から転写されるスプライシング変種の発現に対する被検物質の抑制作用を検定することを特徴とする、中枢神経系疾患治療薬もしくは予防薬のスクリーニング方法および同定方法である。
【０００９】
また、動物個体由来の被検試料中における、プレセニリン−２遺伝子から転写されたスプライシング変種の発現を検出することを特徴とする中枢神経系疾患の検査方法である。
【００１０】
さらに、プレセニリン−２遺伝子から転写されたスプライシング変種（以下、プレセニリン−２のスプライシング変種）に由来する塩基配列を有する核酸及び該スプライシング変種にコードされるポリペプチドである。
【００１１】
本発明において、エキソン５を欠くスプライシング変種とは、エキソン４とエキソン６が接合した領域を有するスプライシング変種を意味する。エキソン３を欠くスプライシング変種とは、エキソン２とエキソン４が接合した領域を有するスプライシング変種を意味する。エキソン３及びエキソン４を欠くとともにイントロン配列の一部を有するスプライシング変種とは、エキソン２の下流にイントロン（エキソン４及びエキソン５の間に位置するイントロン）由来の配列が付加されその下流にエキソン５の領域を有するスプライシング変種を意味する。
【００１２】
後記配列表の配列番号１および図３には、既報のヒトプレセニリン−２遺伝子のｃＤＮＡ配列（全エキソンを含む）を示した。配列番号２、３及び４には、本発明者らが新たに見出したヒトプレセニリン−２スプライシング変種（ｍＲＮＡ）に対応するｃＤＮＡ配列を示し、配列番号５にはスプライシング変種にコードされる変異型ポリペプチドの配列を示した。
【００１３】
配列番号２は、ヒトプレセニリン−２遺伝子のエキソン５を欠くスプライシング変種のｃＤＮＡ配列を示す。このようなスプライシング変種におけるエキソン４とエキソン６の接合（ｊｕｎｃｔｉｏｎ）部位は、配列番号２の第７０５番目と７０６番目の塩基の間に存在する。発明者らはエキソン５欠失に加えてさらにエキソン８が欠失したスプライシング変種も見出しており、このようなスプライシング変種のｃＤＮＡは、配列番号２において第９９５〜１０９３番目の塩基（エキソン８に相当する領域）が欠失した塩基配列を有する。
【００１４】
配列番号３は、ヒトプレセニリン−２遺伝子のエキソン３を欠くスプライシング変種のｃＤＮＡ配列を示す。エキソン２とエキソン４の接合部位は、配列番号３の第３２９番目と３３０番目の塩基の間に存在する。
【００１５】
配列番号４は、ヒトプレセニリン−２遺伝子のエキソン３及びエキソン４を同時に欠くとともにイントロン配列の一部を有するスプライシング変種のｃＤＮＡ配列を示す。エキソン２とエキソン５の接合域に存在するイントロン（イントロン４）由来の配列は、配列番号４の第３３０〜４０９番目の塩基に存在する。
【００１６】
配列番号５は、ヒトプレセニリン−２遺伝子のエキソン５を欠くスプライシング変種ｃＤＮＡ（配列番号２）の翻訳領域の塩基配列（配列番号５上段）及びそこにコードされる変異ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号５下段）を示す。
【００１７】
前記配列番号２から５で示される塩基配列もしくはアミノ酸配列について、既知ＤＮＡデータベース（ＧｅｎＢａｎｋおよびＥＭＢＬ）及びプロテインデータベース（ＮＢＲＦ及びＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ）に含まれる全ての配列に対してホモロジー検索を行った結果、完全に一致するものはなく、これら配列は新規なものであると考えられる。
【００１８】
【発明の実施の形態】
本発明の方法（検査方法及びスクリーニング方法並びに同定方法）は、アルツハイマー病（家族性又は孤発性）（アルツハイマー型老年性痴呆）の他、びまん性レビー小体病、ボクサー脳等の中枢神経系疾患に適用され、とりわけ、アルツハイマー病、特に孤発性アルツハイマー病のために好適に適用される。本発明の方法は、ヒトの疾病に対して適用されるほか、サル、イヌ、ラット、マウスなどの哺乳動物の疾病や疾病モデルに対しても適用される。
【００１９】
本発明のスクリーニング方法及び同定方法は、プレセニリン−２のスプライシング変種の発現を抑制する作用を検定することにより実施される。より具体的には、例えば細胞や組織を被検物質の存在下に培養するか、あるいは被検物質を動物個体に投与した後、細胞や組織中のプレセニリン−２スプライシング変種の発現量を検出することにより、中枢神経系疾患の治療薬又は予防薬のスクリーニング又は同定を実施できる。
【００２０】
培養系を用いてスクリーニング又は同定を行う場合、細胞を例えば酸化ストレス負荷（低酸素負荷、低酸素負荷後の再酸素化処理、過酸化水素添加等）やβ−アミロイド刺激等の条件下に培養する。このような培養条件により、正常状態では見られない以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）のような異常なプレセニリン−２のスプライシング変種が発現誘導されるので、これら培養系をインビトロの病態モデルとし、被検物質の作用を調べるために用いることができる。
【００２１】
（ｉ）エキソン５を欠くスプライシング変種は、細胞に低酸素負荷を与えて培養することにより発現誘導される。発現誘導されるエキソン５欠失スプライシング変種の中にはさらにエキソン８を欠くものも含まれる。
【００２２】
（ｉｉ）エキソン３を欠くスプライシング変種及び（ｉｉｉ）エキソン３とエキソン４を欠くとともにイントロン配列の一部を有するスプライシング変種は、低酸素負荷後の再酸素化処理、過酸化水素添加およびβ−アミロイド刺激により発現誘導される。
【００２３】
培養系に被検物質を存在させることにより、被検物質が存在しない場合と比較して、異常なスプライシング変種の発現量が抑制される場合には、その被検物質には病態を正常化させる作用があると判定される。
【００２４】
プレセニリン−２のスプライシング変種のうち、エキソン５を欠くスプライシング変種は実際にアルツハイマー病患者の脳組織中において特異的に見出されており、従って、エキソン５を欠くスプライシング変種を誘導する系、例えば低酸素負荷などの酸化ストレスを与える細胞培養系は、アルツハイマー病（特に孤発性アルツハイマー病）治療薬をスクリーニングもしくは同定するために好適に用いることができる。
【００２５】
培養系において用いる細胞としては、哺乳動物（ヒト、サル等）由来の中枢神経系細胞（神経細胞、グリア細胞、および星状細胞など）のほか、神経系細胞への分化誘導が可能な未分化細胞などを用いることができる。細胞は、動物組織から分離した初代培養細胞であってもよく、癌化もしくは不死化した株化細胞であってもよい。このような株化細胞としては例えば、ヒト神経芽細胞腫ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−１１）、同ＩＭＲ−３２細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−１２７）、同ＳＫＮ−ＭＣ細胞（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−１０）、ヒト腎臓由来トランスフォームド細胞２９３（ｋｉｄｎｅｙ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ２９３；ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５７３）などが挙げられる。
【００２６】
低酸素負荷（低酸素処理）は、例えば細胞を通常の酸素条件下（約２０％Ｏ２、約５％ＣＯ２）で約４８時間以上培養した後、低酸素条件（Ｏ２濃度１％以下、約９５％Ｎ２、約５％ＣＯ２）の培養器中に移して約１２〜４８時間程度培養すればよく、再酸素化処理は、前記のように低酸素処理した細胞を、再び通常培養の条件下に戻して培養すればよい（特開平９−２３８６８５；Ｏｇａｗａら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ、第８５巻、第１０９０〜１０９８頁、１９９０年）。過酸化水素添加は、過酸化水素を培地に終濃度４４〜４４０μＭとなるように添加して約２時間培養すればよい。また、β−アミロイド刺激は、β−アミロイド蛋白質又はその部分ペプチド（例えば、Ａβ２５−３５（β−アミロイド蛋白質の第２５−３５番目のアミノ酸残基からなる部分ペプチド）など）を０．５〜５μＭとなるように添加して約１６時間培養すればよい。
【００２７】
プレセニリン−２の異常なスプライシング変種は、また、中枢神経系疾患の検査に利用できる。本発明の検査方法は、動物個体由来の被検試料中におけるプレセニリン−２のスプライシング変種の発現を検出することにより実施できる。より具体的には例えば、被検試料からＲＮＡを抽出してＲＮＡ中におけるプレセニリン−２のスプライシング変種を検出すればよい。あるいは、被検試料中のスプライシング変種に由来する変異型ポリペプチドを検出してもよい。
【００２８】
アルツハイマー病患者（特に孤発性アルツハイマー病患者）では、脳組織中におけるプレセニリン−２のエキソン５欠失スプライシング変種が、正常人と比較して明確に高い頻度で見出される。従って、プレセニリン−２のエキソン５欠失スプライシング変種が検出された場合には、アルツハイマー病である危険率が高いものと判定できる。
【００２９】
被検試料としては、動物個体由来の組織および体液が挙げられる。特に、好ましい体組織としては、中枢神経系（神経細胞、グリア細胞、および星状細胞など）を含む脳組織や線維芽細胞などが挙げられる。体液としては、血清、血漿などが挙げられる。
【００３０】
本発明の方法において、プレセニリン−２のスプライシング変種の発現を検出するには、細胞や組織からＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を抽出してＲＮＡ中におけるプレセニリン−２のスプライシング変種を検出すればよい。あるいは、スプライシング変種にコードされる変異型ポリペプチドを検出することによって間接的にスプライシング変種の発現を検出することもできる。
【００３１】
プレセニリン−２遺伝子は、ヒト、ラット、マウスなどから既にクローニングされて塩基配列やアミノ酸配列が決定されている（（ヒト）ＧｅｎｅＢａｎｋ／ＥＭＢＬ 登録Ｎｏ． Ｌ４３９６４ 及び Ｎｏ．Ｕ５０８７１、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ登録 Ｎｏ．Ｐ４９８１０ ；Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、第３４巻、第１９８−２０４頁、１９９６年；Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２６９巻、第９７３−９７７頁、１９９５年；Ｎａｔｕｒｅ、第３７６巻、第７７５−７７８頁、１９９５年：（ラット）Ｇｅｎｅ、第１９７巻、第３８３−３８７頁、１９９７年；ＧｅｎｅＢａｎｋ／ＥＭＢＬ登録Ｎｏ． Ｄ８３７００：（マウス）ＧｅｎｅＢａｎｋ／ＥＭＢＬ登録Ｎｏ． ＡＦ０３８９３５）。従って、スプライシング変種の検出の際にはこれら配列情報を利用できる。また、後記配列表に示したヒト由来の各スプライシング変種の塩基配列の情報を利用できる。
【００３２】
ＲＮＡ中のスプライシング変種を検出する場合には、細胞や組織からＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を調製し、そのｍＲＮＡやｍＲＮＡから調製したｃＤＮＡを用い、異常スプライシングにより生じたジャンクション部位とその前後の領域を検出する。検出には、通常のポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ法）、ＲＮＡ分解酵素プロテクションアッセイ法（ＲＮａｓｅ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｓｓａｙ法）もしくはノーザンブロット法などを利用することができる。これら方法により、異常スプライシングによって生じる断片を、断片の大きさを指標として検出する。
【００３３】
ＰＣＲ法（「ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ」Ｉｎｎｉｓ ＭＡ，Ｇｅｌｆａｄ ＤＨ， Ｓｎｉｎｓｋｙ ＪＪ ａｎｄ Ｗｈｉｔｅ ＴＪ ｅｄｓ．， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎｄｉｅｇｏ， １９９０年）を利用する場合、異常スプライシングによって生じるジャンクション部位とその前後の領域を含む断片を増幅するために適当なプライマー（センスプライマー及びアンチセンスプライマー）を設計、合成する。これらプライマーを用い、ｍＲＮＡより合成したｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを実施し、得られたＰＣＲ産物を、必要に応じて電気泳動などにより分離し、その断片の大きさを調べることによりスプライシング変種を検出できる。また、スプライシング変種を詳細に同定するためには、ＰＣＲ産物について塩基配列を決定すればよい。
【００３４】
ＲＮＡ分解酵素プロテクションアッセイ法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、第１２巻、７０３５−７０５６頁、１９８４年）は、一本鎖ＲＮＡを特異的に分解し二本鎖ＲＮＡは分解しない性質を有するＲＮＡ分解酵素を利用する方法であり、検査すべきＲＮＡに対するアンチセンス鎖ＲＮＡを通常プローブとして用いる。検査すべきＲＮＡと、標識したＲＮＡプローブとをハイブリダイズさせた後、ＲＮＡ分解酵素を作用させてハイブリダイズしなかったＲＮＡを分解し、これを電気泳動などで分離して断片を検出・定量する。ＲＮＡプローブの調製は、例えばｍＲＮＡより合成したｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲなどによりプローブとしたい適切な領域を増幅し、得られた断片をプラスミドベクター中のプロモータ下流に適切な方向で接続してＲＮＡプローブ合成用ベクターを構築する。このベクターと、Ｔ３、Ｔ７、ＳＰ６等のＲＮＡポリメラーゼを用いてインビトロでＲＮＡプローブを産生させることができる。プレセニリン−２のスプライシング変種を検出する場合には、プローブとする領域は、異常スプライシングが起こるジャンクション部位を含む領域、例えば、エキソン４からエキソン６を含む領域などを選択すればよい。
【００３５】
上記のような方法のほか、異常なスプライシングによって新たに生じるジャンクション部位を、直接核酸プローブを用いて検出することもできる。この場合、検出すべきジャンクション部位とその周辺の配列情報をもとに、ジャンクション部位とその前後を含む領域に相補的なＤＮＡ（オリゴヌクレオチド）を設計、合成し、これを標識したものをプローブとして用いる。被検細胞又は組織から得たｍＲＮＡ又はそのｃＤＮＡ、あるいはこれらを鋳型としてＰＣＲにより増幅したＤＮＡ断片などについて、前記プローブを用いてノーザンブロッティング又はサザンブロッティングなどを実施し、プローブとハイブリダイズする核酸が存在するかどうかを判定すればよい。
【００３６】
変異型ポリペプチドを検出することによって間接的にスプライシング変種を検出する場合には、例えば、変異型ポリペプチドを特異的に認識する抗体を利用して免疫化学的に検出する方法を用いることができる。特異的抗体としては、変異型ポリペプチドとは反応するが正常プレセニリン−２とは交差反応しない抗体を用いればよい。抗体を調製するための抗原は、例えば、変異型ポリペプチドを遺伝子組換え技術により調製したものを用いることができる。あるいは抗原として合成ペプチドを用いてもよい。例えば、エキソン５欠失スプライシング変種にコードされる変異型ポリペプチドを検出したい場合、特異抗体は、配列番号５のＣ末端側６アミノ酸の配列を含む適当な長さの合成ペプチドなどを、抗原として用いて調製することができる。
【００３７】
変異型ポリペプチド又は正常プレセニリン−２は、プレセニリン−２遺伝子のスプライシング変種又は正常ｍＲＮＡに対するｃＤＮＡを適当なベクタープラスミドに結合した組換え発現ベクターを用いて調製できる。
【００３８】
プレセニリン−２遺伝子のｃＤＮＡは、例えば動物組織や細胞（中枢神経系細胞など）から調製したｍＲＮＡのｃＤＮＡを遺伝子源として単離取得できる。スプライシング変種のｃＤＮＡを取得する場合には、前記のように酸化ストレス負荷（低酸素負荷、低酸素負荷後の再酸素化処理、過酸化水素添加等）やβ−アミロイド刺激等の条件下に培養した細胞を用いればよい。これら遺伝子源から、既知配列情報に基づいて設計したプライマーを用いるＰＣＲによりｃＤＮＡ断片を得る。必要に応じて遺伝子源から調製したｃＤＮＡライブラリー又は市販のライブラリーを用い、ＰＣＲにより増幅した断片や合成オリゴヌクレオチド等をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーションやプラークハイブリダイゼーション法により目的ｃＤＮＡを取得することもできる。
【００３９】
プレセニリン−２又はその変異型ポリペプチドを生産するための発現系（宿主−ベクター系）としては、例えば、哺乳動物細胞、昆虫細胞、酵母、細菌等の発現系が挙げられる。機能蛋白を得るためには、昆虫細胞（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ ＳＦ９、ＳＦ２１等）および哺乳動物細胞（サルＣＯＳ−７細胞、チャイニーズハムスターＣＨＯ細胞、ヒトＨｅＬａ細胞等）を宿主として用いることが好ましい。昆虫細胞を宿主とする場合のベクターとして例えば、バキュロウイルスベクター等が挙げられる。哺乳動物細胞を宿主とする場合のベクターとして例えば、レトロウイルス系ベクター、パピローマウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、ＳＶ４０系ベクター等が挙げられる。これらベクター中の適当なプロモーターの下流にｃＤＮＡを挿入して発現ベクターを構築することができる。
【００４０】
得られた発現ベクターで宿主細胞を形質転換し、形質転換体を適当な培地で培養することによって、目的とするポリペプチドが生産される。宿主細胞中で産生されたポリペプチドは、摩擦型破砕装置ダイノミル（Ｄｙｎｏ Ｍｉｌｌ）などを用いる物理的な手法、あるいは、リゾチーム処理など化学的な手法により細胞を破砕し、その細胞抽出液から、公知の精製方法（無機塩類による塩析、有機溶媒による分画沈澱、イオン交換樹脂、及び各種カラムクロマトグラフィーによる吸脱着法、ゲルろ過法、蛋白沈澱剤を利用する方法など）又はこれらを適宜組合わせることによって分離、採取することができる。
【００４１】
プレセニリン−２又はその変異型ポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、例えば配列番号１〜４に示される塩基配列を有するヒト由来のｃＤＮＡを用いることができる。このほか、自然界に存在する他の種由来の遺伝子やそれらの対立遺伝子を用いてもよい。また、自然界に存在する塩基配列に限定されず、ポリペプチドのアミノ酸配列に対応するＤＮＡを設計して用いることもできる。この場合、ひとつのアミノ酸をコードするコドンは各々１〜６種類知られており、用いるコドンの選択は任意でよく、利用する宿主のコドン使用頻度等を考慮して、より発現効率の高い配列を設計することができる。
【００４２】
また、スプライシング変種に由来する変異型ポリペプチドは、実質的に同等の免疫原性や機能を有する程度であれば、アミノ酸配列の一部が修飾・改変されたものであってもよい。例えばヒトプレセニリンのエキソン５欠失スプライシング変種に由来するポリペプチドとしては、配列番号５で示されたアミノ酸配列を有するものが挙げられるが、このほか、そのアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換された配列を有するものが挙げられる。アミノ酸の付加、欠失もしくは置換は、通常１〜約２０個、好ましくは１〜約１０個、より好ましくは１〜約５個である。このようなポリペプチドは、配列番号５で示されるアミノ酸配列と通常８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上のアミノ酸配列のホモロジーを有する。
【００４３】
設計したアミノ酸配列をコードするＤＮＡは、ＤＮＡの化学合成、前記ｃＤＮＡの断片化と結合、塩基配列の一部改変等によって取得できる。人為的な塩基配列の一部改変、変異導入は、所望の改変をコードする合成オリゴヌクレオチドからなるプライマーを利用して部位特異的変異導入法（ｓｉｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）（Ｍａｒｋ， Ｄ． Ｆ． ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第８１巻、第５６６２〜５６６６頁（１９８４年）） 等によって実施できる。
【００４４】
また、プレセニリン−２の異常なスプライシング変種（特にエキソン５欠失スプライシング変種）及びその検出方法は、中枢神経系疾患（特にアルツハイマー病）の病態研究にも有用である。異常なスプライシング変種のｃＤＮＡを含む組換え発現プラスミドを細胞に導入して、細胞内における機能を詳細に解析することや、スプライシング変種由来の変異型ポリペプチドの機能・作用を解析することは発症メカニズムの解明につながると考えられる。
【００４５】
以下、実施例をもって本発明をさらに詳しく説明するが、これらの実施例は本発明を制限するものではない。
【００４６】
なお、下記実施例において、各操作は特に明示がない限り、「モレキュラークローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）」（Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．， Ｆｒｉｔｓｃｈ， Ｅ．Ｆ．及びＭａｎｉａｔｉｓ， Ｔ． 著、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓより１９８９年に発刊）に記載の方法により行うか、または、市販の試薬やキットを用いる場合には市販品の指示書に従って使用した。
【００４７】
【実施例】
実施例１ ヒト神経細胞におけるスプライシング変種の検出
（１）ヒト神経細胞の培養とＲＮＡ調製
ヒト神経芽細胞腫ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−１１）を、１０ｃｍ径の培養皿で、１０％ウシ胎児血清含有α−ＭＥＭ培地（α−Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ；ＧＩＢＣＯ社製）中、コンフルエントな状態まで、３７℃で約４８時間ＣＯ２培養器で培養後、ウシ胎児血清不含の同培地に培地交換し、約２時間培養した。
【００４８】
前記培養細胞についてさらに、以下の（ｉ）〜（ｉｖ）の条件で培養した。
【００４９】
（コントロールは前記と同条件でさらに１６時間培養を継続して行った。）
（ｉ）低酸素処理：培養皿を低酸素培養器（酸素濃度１％以下、９５％Ｎ２、５％ＣＯ２）（Ｃｏｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ社製）に移し１６時間培養した。
【００５０】
（ｉｉ）再酸素化処理：培養皿を低酸素培養器（酸素濃度１％以下、９５％Ｎ２、５％ＣＯ２）に移し１６時間培養後、通常のＣＯ２培養器（酸素濃度２０％、７５％Ｎ２、５％ＣＯ２）に戻して４時間培養した。
【００５１】
（ｉｉｉ）β−アミロイド刺激：Ａβ２５−３５（Ｓｉｇｍａ社製）を終濃度０．５μＭ又は５μＭとなるように培地に加え１６時間培養した。
【００５２】
（ｉｖ）過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）添加：過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）を終濃度が４４μＭ又は４４０μＭとなるように培地に添加し２時間培養した。
【００５３】
前記のように培養した細胞を各々回収し、生理的リン酸緩衝液（ＰＢＳ：Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｕｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）で洗浄した。これを、細胞溶解用緩衝液（ＲＬＴ溶液、ＱＩＡＧＥＮ社製）７００μｌに懸濁した後、細胞を破砕し、細胞抽出液を得た。この細胞抽出液から、トータルＲＮＡを調製した。ＲＮＡの調製は、ＲＮＡ調製用キット（商品名：Ｒｎｅａｓｙ ｔｏｔａｌ ＲＮＡキット、ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて行った。
【００５４】
（２）スプライシング変種類の検出
前項（１）で得たＲＮＡ（トータルＲＮＡ、１μｇ）を鋳型とし、オリゴｄＴプライマー（５０ ｐｍｏｌｅ）、ランダムオリゴヌクレオチド（５ ｐｍｏｌｅ）及びリバーストランスクリプターゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製、Ｍｏｌｏｎｅｙ ｌｅｕｋａｅｍｉａ ｖｉｒｕｓ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）（２００単位）を含む緩衝液（０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ ８．３， ０．０７５Ｍ ＫＣｌ， ０．００３Ｍ ＭｇＣｌ２， ＤＴＴ，０．０００２Ｍ ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）０．０５ｍｌ中、４２℃で１時間反応させて、一本鎖ｃＤＮＡを合成した。得られた一本鎖ｃＤＮＡを用い、以下のように、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ：Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）によりスプライシング変種を検出した。
【００５５】
プレセニリン−２（ＰＳ−２）遺伝子用のＰＣＲプライマーとしては、
ＰＳ２５１（配列番号６）（センスプライマー）、ＰＳ２５３（配列番号７）（センスプライマー）、ＰＳ２３３（配列番号８）（アンチセンスプライマー）及びＰＳ２３１（配列番号９）（アンチセンスプライマー）の４種を用いた。
【００５６】
各プライマーに対応するＰＳ−２遺伝子上の位置と方向を図１および図３に示した。
【００５７】
ＰＣＲは、まず、前記で得た一本鎖ｃＤＮＡを鋳型とし、ＰＳ−２遺伝子のコーディング領域全体（約１．６ｋｂｐ）を増幅するためのプライマーとして、ＰＳ２５１（配列番号６）（センスプライマー）及びＰＳ２３１（配列番号９）（アンチセンスプライマー）を用いて、１回目のＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲは、変性反応９５℃、約４０秒、伸長反応７２℃で１分、アニーリング６０℃で約３０秒の条件（サイクル数：３０サイクル）で行った。
【００５８】
反応液を１／５希釈し、その１μｌを鋳型として２回目のＰＣＲを行った。ＰＳ−２のコーディング領域の５’末端側断片を検出するためのＰＣＲプライマーとしては、ＰＳ２５１（配列番号６）（センスプライマー）及びＰＳ２３３（配列番号８）（アンチセンスプライマー）を、また、３’末端側断片を検出するためのＰＣＲプライマーとしては、ＰＳ２５３（配列番号７）（センスプライマー）及びＰＳ２３１（配列番号９）（アンチセンスプライマー）を用いた。ＰＣＲは、前記と同様の条件を用いた。得られたＰＣＲ産物について、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行って、ＤＮＡ断片の大きさを調べた。
【００５９】
結果を図２に示した。図２に示したように、５’末端側断片を増幅したＰＣＲの結果、コントロールでは見られないバンドが、低酸素処理した細胞由来の試料で１本検出された。また、低酸素負荷後の再酸素化処理およびβ−アミロイド刺激した細胞由来の試料で各２本、過酸化水素添加培養した細胞由来の試料で３本、コントロールで見られないバンドが検出された。これに対して３’末端側断片を増幅したＰＣＲの結果では、コントロールを含む全ての試料で、同様に各２本のメジャーバンドが確認された。
【００６０】
これらの結果から、低酸素処理により、５’末端側でスプライシング異常が発生し、少なくとも一種類のスプライシング変種が誘導されたと考えられた。また、低酸素負荷後の再酸素化処理およびβ−アミロイド刺激によっても５’末端側でスプライシング異常が発生し、各々２種及び３種類のスプライシング変種が誘導されたと考えられた。
【００６１】
（３）ＰＳ−２スプライシング変種の解析
前項（２）で見出されたＰＳ−２スプライシング変種について、以下のように塩基配列を決定した。前記（２）と同様にＰＣＲ産物についてアガロースゲル電気泳動を行い、スプライシング変種に由来すると考えられるＤＮＡ断片（５’末端側断片５種類と３’末端側断片２種類）をゲルから回収し、各々ベクタープラスミドｐＧＥＭ−Ｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）に連結した。得られた組換えプラスミドを用いて、ダイデオキシ法により、挿入断片部分の塩基配列を決定した。塩基配列は、アプライド・バイオシステム社の自動シークエンサー（３７３Ａ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ）を用いて行った。
【００６２】
塩基配列を決定した結果、確認されたスプライシング変種を、図１に模式図で示した。
【００６３】
３’末端側で見出された２種類の断片のうち、１つは正常なスプライシングの産物であり、他の１つはエキソン８が欠失したスプライシング変種であった。エキソン８欠失スプライシング変種は、正常組織での存在が既に報告されており、この欠失はＰＳ−２蛋白質の機能に影響を与えるものではないと考えられる。
【００６４】
一方、低酸素処理の５’末端側断片において見出された変種は、エキソン５が欠失したスプライシング変種であることがわかった。エキソン５欠失スプライシング変種は、これまで正常組織において全く報告されていないものである。このスプライシング変種（エキソン５欠失）に対応するｃＤＮＡ塩基配列を、後記配列表の配列番号２に示した。このスプライシング変種におけるエキソン４とエキソン６の接合部位は、配列番号２の第７０５番目と７０６番目の塩基の間に存在する。エキソン５の欠失によって接合部位から下流で読取枠のずれが生じ、配列番号２におけるオープンリーディングフレームは第３５０〜７２４番目の塩基に存在する。このオープンリーディングフレームの塩基配列及びここにコードされる変異型ポリペプチド（１２４アミノ酸残基）のアミノ酸配列を配列番号５に示した。変異型ポリペプチドは、正常なプレセニリン−２蛋白質（４４８アミノ酸残基）のＮ末端側１１９アミノ酸残基分のＣ末端に、読取枠のずれによって生じた５アミノ酸残基が付加された配列を有する。
【００６５】
また、エキソン５欠失変種の中にはさらにエキソン８が欠失したものも存在しており、このようなスプライシング変種のｃＤＮＡは、配列番号２において第９９５〜１０９３番目の塩基（エキソン８に相当する領域）が欠失した塩基配列を有する。
【００６６】
低酸素負荷後の再酸素化処理、β−アミロイド刺激及び過酸化水素添加の５’末端側断片において見出された変種のうちの一つは、エキソン３を欠失したスプライシング変種であり、もう一つは、エキソン３及びエキソン４を欠失するとともに、イントロン４（エキソン４とエキソン５の間のイントロン）の内部でスプライシングされたスプライシング変種であった。
【００６７】
エキソン３欠失スプライシング変種のｃＤＮＡ配列を配列番号３に示した。エキソン２とエキソン５の接合部位は、配列番号３の第３２９番目と３３０番目の塩基の間に存在する。
【００６８】
また、エキソン３及びエキソン４を欠失するとともにイントロン配列の一部を有するスプライシング変種のｃＤＮＡ配列を配列番号４及び図４に示した。エキソン２とエキソン５の接合域に存在するイントロン（イントロン４）由来の配列は、配列番号４の第３３０〜４０９番目の塩基に存在する。
【００６９】
これまでに正常組織において、エキソン３及びエキソン４を同時に欠失したスプライシング変種は報告されているが、エキソン３のみを欠失した変種、エキソン３及びエキソン４を欠失するとともにイントロン配列の一部を有するスプライシング変種は報告されていない。
【００７０】
実施例２ ヒト神経細胞におけるＰＳ−２スプライシング変種発現誘導に対する薬剤の影響
（１）ヒト神経細胞の低酸素処理下での培養とＲＮＡ調製
ヒト神経芽細胞腫ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞を、前記実施例１の（１）に準じ、以下のように低酸素処理条件下で培養した。すなわち、１０％ウシ胎児血清含有α−ＭＥＭ培地中、コンフルエントな状態まで（約４８時間）３７℃、ＣＯ２培養器（酸素濃度：２０％）で培養後、ウシ胎児血清不含の同培地に培地交換した。培地には、シクロヘキシミド（終濃度０．２μｇ／ｍｌ又は１μｇ／ｍｌ）、Ｎ−アセチル−Ｌ−システインを（終濃度２μＭ又は１０μＭ）又はジフェニレンヨードニウムクロライド（Ｄｉｐｈｅｎｉｌｅｎｅｉｏｄｏｎｉｕｍ Ｃｈｌｏｒｉｄｅ）（終濃度５μＭ又は２０μＭ）を添加した。これを、低酸素培養器（酸素濃度：１％以下）に移し、さらに１６時間培養した。
【００７１】
前記のように培養した細胞を各々回収し、細胞から前記実施例１の（１）項と同様の方法にてＲＮＡ（トータルＲＮＡ）を調製した。
【００７２】
（２）ＰＳ−２スプライシング変種の検出
前項（１）で得たＲＮＡ（トータルＲＮＡ）を用い、実施例１の（２）項と同様の方法で、ＰＳ−２のスプライシング変種の検出を行った。すなわち、前記ＲＮＡを鋳型として一本鎖ｃＤＮＡを調製し、これを鋳型として一回目のＰＣＲを行ってＰＳ−２コーディング領域全長を含むＤＮＡ断片を増幅した。ＰＣＲプライマーとしてはＰＳ２５１（配列番号６）（センスプライマー）及びＰＳ２３１（配列番号９）（アンチセンスプライマー）を用いた。
【００７３】
反応液を希釈し、その１μｌを鋳型として用いて、２回目のＰＣＲを行い、ＰＳ−２のコーディング領域の５’末端側を含むＤＮＡ断片を増幅した。ＰＣＲプライマーとしては、ＰＳ２５１（配列番号６）（センスプライマー）及びＰＳ２３３（配列番号８）（アンチセンスプライマー）を用いた。得られたＰＣＲ産物について、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、スプライシング変種に由来する断片（エキソン５欠失に由来する約６４０塩基長の断片等）の有無を調べた。
【００７４】
その結果を図５に示した。図５に示したように、低酸素処理によって誘導されるエキソン５欠失変種の発現は、蛋白質合成阻害剤であるシクロヘキシミド処理によって抑制された。このことから、エキソン５欠失変種の発現誘導には、低酸素処理時に新生される蛋白質が関与していると考えられた。また、エキソン５欠失変種は、抗酸化剤であるＮ−アセチル−Ｌ−システイン又はジフェニレンヨードニウムクロライドによってもその発現が抑制された。これらのことから、低酸素処理によって誘導されるＰＳ−２エキソン５欠失変種の発現には、活性酸素など低酸素状態での何らかの酸化ストレスが関与していると考えられた。
【００７５】
実施例３ ヒト脳組織におけるＰＳ−２スプライシング変種の発現
ヒト脳組織サンプルについて、ＰＳ−２のエキソン５欠失スプライシング変種の検出を行った。ヒト脳の組織サンプルは、孤発性ＡＤ患者脳（３０例）及びほぼ同年齢の正常者脳（１７例）から採取したもの計４７サンプルを用いた。
【００７６】
脳組織サンプル（凍結保存サンプル）をホモジナイズし、得られた抽出液から、前記実施例１の（１）項と同様にしてＲＮＡを調製した。得られたＲＮＡを用いて、実施例１の（２）項及び実施例２の（２）項と同様にしてＰＳ−２のスプライシング変種の検出をＰＣＲを用いて行った。
【００７７】
その結果を表１に示した。エキソン５欠失スプライシング変種の発現は、正常者脳においては１７例中３例（１７％）であった。これに対して、孤発性ＡＤ患者の脳における発現は、３０例中２１例（７０％）であった。このように孤発性ＡＤ患者の脳においては、正常者脳よりも明らかに高い頻度でエキソン５欠失スプライシング変種が発現していることがわかった。
【００７８】
【表１】
【００７９】
【表２】
【００８０】
【発明の効果】
本発明の方法によれば、従来困難であった孤発性アルツハイマー病など中枢神経系疾患の治療薬・予防薬のスクリーニング及び同定を効率よく実施することができる。本発明のスクリーニング方法によって見出された薬物あるいは同定された薬物は、作用点が明らかとなっているので医薬品としての開発に有利である。
【００８１】
また、中枢神経系疾患、特に従来診断が困難であった孤発性アルツハイマー病の診断を好適に行うことができる。
【００８２】
また、プレセニリン−２の異常なスプライシング変種及びその検出方法は、中枢神経系疾患（特にアルツハイマー病）の病態研究にも有用である。異常なスプライシング変種の細胞内における機能を詳細に解析することや、スプライシング変種由来の変異型ポリペプチドの機能・作用を解析することは発症メカニズムの解明につながる。
【００８３】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】ＰＳ−２遺伝子のＰＣＲプライマー及び各種スプライシング変種由来のＰＣＲ産物を示す模式図。
【図２】ヒト神経細胞におけるＰＳ−２スプライシング変種の発現誘導を示す電気泳動の図（白黒反転させたもの）であり、図中、Ｎはコントロールを表し、Ｈは低酸素処理した細胞を表し、Ｒは低酸素負荷後再酸素化処理した細胞を表し、Ａβ２５−３５はＡβ２５−３５（β−アミロイド蛋白質の第２５−３５番目のアミノ酸残基からなる部分ペプチド）を０．５μＭまたは５μＭ添加培養した細胞を表し、Ｈ２Ｏ２は過酸化水素を４４μＭまたは４４０μＭ添加した細胞を表す。
【図３】ＰＳ−２の全エキソンを含むｃＤＮＡ配列、ＰＣＲプライマー及び各エキソンの位置を示した図。
【図４】ＰＳ−２のエキソン３及びエキソン４を欠失するとともにイントロン配列の一部を有するスプライシング変種のスプライシング部位近傍の配列を示した図。
【図５】ヒト神経細胞におけるＰＳ−２スプライシング変種の発現誘導に対する薬剤の影響を示す電気泳動の図（白黒反転させたもの）であり、図中、Ｎはコントロールを表し、Ｈは低酸素処理した細胞を表し、ＣＨＸはシクロヘキシミドを０．２μｇ／ｍｌまたは１μｇ／ｍｌ添加した後、低酸素処理した細胞を表し、ＤＰＩはジフェニレンヨードニウムクロライドを５μＭまたは２０μＭ添加した後、低酸素処理した細胞を表し、ＮＡＣはＮ−アセチル−Ｌ−システインを２μＭまたは１０μＭ添加した後、低酸素処理した細胞を表す。
【発明の属する技術分野】
本発明は、プレセニリン−２の新規なスプライシング変種、ならびに中枢神経系疾患の治療薬のスクリーニング方法及び同定方法に関する。また、本発明は、中枢神経系疾患の検査方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
真核生物のゲノムＤＮＡ上では、成熟したｍＲＮＡに対応する配列が何ヶ所かに分断されて存在していることが多い。このような場合、遺伝子の転写は、成熟ｍＲＮＡに対応する配列を含む全領域にわたって一続きで行われて前駆体ｍＲＮＡ（ｐｒｅ−ｍＲＮＡ）（成熟ｍＲＮＡには不必要な部分も含む転写産物）が作られる。そして、この前駆体ｍＲＮＡがプロセッシングを受けて成熟したｍＲＮＡとなる。プロセッシングの過程では、キャップ構造やポリＡの付加が行われると同時に、成熟ｍＲＮＡには不必要な部分（イントロン又は介在配列）が切り取られ、成熟ｍＲＮＡに対応する部分（エキソン）が貼りあわされて成熟ｍＲＮＡとなる。このような切り貼りの過程は「スプライシング」と呼ばれるが、スプライシングは、スプライソソームと呼ばれる大型の蛋白質−ＲＮＡ集合体の関与により、複数の切断と連結が調節される複雑で繊細な過程である。例えばゲノム上のイントロン−エキソンの境界領域に起こった突然変異などにより、しばしば異なった種類の成熟ｍＲＮＡ、すなわち「スプライシング変種」が生じるが、このような変種の中には機能的に異常な変異型蛋白質を生じて疾病の原因となる例が知られている。これまでに種々の疾病や障害について、発症メカニズム解明のために原因遺伝子におけるスプライシング変種が研究されるとともに、スプライシング変種を疾病の診断マーカーとして利用すること等もなされてきた。
【０００３】
一方、家族性アルツハイマー病（ＦＡＤ）の主な原因遺伝子としては、これまでに第２１染色体上のアミロイド前駆体蛋白質（ＡＰＰ：Ａｍｙｌｏｉｄ Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ）遺伝子、第１４染色体上のプレセニリン−１（ＰＳ−１：Ｐｒｅｓｅｎｉｌｉｎ−１）遺伝子、及び第１染色体上のプレセニリン−２（ＰＳ−２：Ｐｒｅｓｅｎｉｌｉｎ−２）遺伝子が知られている。そして、これら原因遺伝子において見い出されている突然変異やスプライシング変種等に着目し、アルツハイマー病の発症メカニズムとの関係について研究がなされている。しかしながら、アルツハイマー病の大部分を占める孤発性アルツハイマー病の発症メカニズムについては、まだほとんど何も解明されていない状況にある。
【０００４】
例えばプレセニリン−１遺伝子（Ｓｈｅｒｒｉｎｇｔｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ、第３７５巻、第７５４−７６０頁、１９９５年）については、家族性又は孤発性アルツハイマー病患者と正常の脳組織に由来するｍＲＮＡの解析が行われ、種々のスプライシング変種の存在が報告されている（Ｃｌａｒｋら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、第１１巻、第２１９−２２２頁、１９９５年；Ａｎｗａｒら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第６６巻、第１７７４〜１７７７頁、１９９６年）。
【０００５】
プレセニリン−２遺伝子（Ｌｅｖｙ−Ｌａｈａｄら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、第３４巻、第１９８−２０４頁、１９９６年；Ｌｅｖｙ−Ｌａｈａｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２６９巻、第９７３−９７７頁、１９９５年；Ｒｏｇａｅｖら、Ｎａｔｕｒｅ、第３７６巻、第７７５−７７８頁、１９９５年）は、プレセニリン−１遺伝子と同様、１２のエキソンから構成されており、このうち１０のエキソン（エキソン３〜１２）が蛋白質をコードしていることが知られている。また、正常ヒト組織において、エキソン８が欠失したスプライシング変種や、エキソン３及びエキソン４が同時に欠失したスプライシング変種の存在が報告されている（Ｐｒｉｈａｒら、ＮｅｕｒｏＲｅｐｏｒｔ、第７巻、第１６８０〜１６８４頁、１９９６年）。しかし、プレセニリン−２遺伝子について、アルツハイマー病（特に孤発性アルツハイマー病）に特異的なスプライシング変種の報告はない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、中枢神経系疾患（アルツハイマー病等）治療薬の新規なスクリーニング方法及び同定方法を提供することにある。また、中枢神経系疾患（アルツハイマー病等）の新規な検査方法を提供することにある。また、本発明の別の目的は、中枢神経系疾患の研究に有用な新規なプレセニリン−２由来スプライシング変種を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
発明者らは、神経細胞の培養系において、酸化ストレス負荷やβ−アミロイド刺激などにより、正常状態では見られない異常なプレセニリン−２ｍＲＮＡのスプライシング変種（（ｉ）エキソン５を欠くスプライシング変種、（ｉｉ）エキソン３を欠くスプライシング変種、及び（ｉｉｉ）エキソン３とエキソン４を欠くとともにイントロン配列の一部を有するスプライシング変種）が発現誘導されることを独自に見出した。また、それらスプライシング変種のうちの一つであるエキソン５欠失変種について、ヒト脳組織における発現を調べたところ、孤発性アルツハイマー病患者の脳組織において、エキソン５を欠くスプライシング変種が高頻度に存在することを独自に見出し、本発明を完成するに到った。
【０００８】
すなわち、本発明は、プレセニリン−２遺伝子から転写されるスプライシング変種の発現に対する被検物質の抑制作用を検定することを特徴とする、中枢神経系疾患治療薬もしくは予防薬のスクリーニング方法および同定方法である。
【０００９】
また、動物個体由来の被検試料中における、プレセニリン−２遺伝子から転写されたスプライシング変種の発現を検出することを特徴とする中枢神経系疾患の検査方法である。
【００１０】
さらに、プレセニリン−２遺伝子から転写されたスプライシング変種（以下、プレセニリン−２のスプライシング変種）に由来する塩基配列を有する核酸及び該スプライシング変種にコードされるポリペプチドである。
【００１１】
本発明において、エキソン５を欠くスプライシング変種とは、エキソン４とエキソン６が接合した領域を有するスプライシング変種を意味する。エキソン３を欠くスプライシング変種とは、エキソン２とエキソン４が接合した領域を有するスプライシング変種を意味する。エキソン３及びエキソン４を欠くとともにイントロン配列の一部を有するスプライシング変種とは、エキソン２の下流にイントロン（エキソン４及びエキソン５の間に位置するイントロン）由来の配列が付加されその下流にエキソン５の領域を有するスプライシング変種を意味する。
【００１２】
後記配列表の配列番号１および図３には、既報のヒトプレセニリン−２遺伝子のｃＤＮＡ配列（全エキソンを含む）を示した。配列番号２、３及び４には、本発明者らが新たに見出したヒトプレセニリン−２スプライシング変種（ｍＲＮＡ）に対応するｃＤＮＡ配列を示し、配列番号５にはスプライシング変種にコードされる変異型ポリペプチドの配列を示した。
【００１３】
配列番号２は、ヒトプレセニリン−２遺伝子のエキソン５を欠くスプライシング変種のｃＤＮＡ配列を示す。このようなスプライシング変種におけるエキソン４とエキソン６の接合（ｊｕｎｃｔｉｏｎ）部位は、配列番号２の第７０５番目と７０６番目の塩基の間に存在する。発明者らはエキソン５欠失に加えてさらにエキソン８が欠失したスプライシング変種も見出しており、このようなスプライシング変種のｃＤＮＡは、配列番号２において第９９５〜１０９３番目の塩基（エキソン８に相当する領域）が欠失した塩基配列を有する。
【００１４】
配列番号３は、ヒトプレセニリン−２遺伝子のエキソン３を欠くスプライシング変種のｃＤＮＡ配列を示す。エキソン２とエキソン４の接合部位は、配列番号３の第３２９番目と３３０番目の塩基の間に存在する。
【００１５】
配列番号４は、ヒトプレセニリン−２遺伝子のエキソン３及びエキソン４を同時に欠くとともにイントロン配列の一部を有するスプライシング変種のｃＤＮＡ配列を示す。エキソン２とエキソン５の接合域に存在するイントロン（イントロン４）由来の配列は、配列番号４の第３３０〜４０９番目の塩基に存在する。
【００１６】
配列番号５は、ヒトプレセニリン−２遺伝子のエキソン５を欠くスプライシング変種ｃＤＮＡ（配列番号２）の翻訳領域の塩基配列（配列番号５上段）及びそこにコードされる変異ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号５下段）を示す。
【００１７】
前記配列番号２から５で示される塩基配列もしくはアミノ酸配列について、既知ＤＮＡデータベース（ＧｅｎＢａｎｋおよびＥＭＢＬ）及びプロテインデータベース（ＮＢＲＦ及びＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ）に含まれる全ての配列に対してホモロジー検索を行った結果、完全に一致するものはなく、これら配列は新規なものであると考えられる。
【００１８】
【発明の実施の形態】
本発明の方法（検査方法及びスクリーニング方法並びに同定方法）は、アルツハイマー病（家族性又は孤発性）（アルツハイマー型老年性痴呆）の他、びまん性レビー小体病、ボクサー脳等の中枢神経系疾患に適用され、とりわけ、アルツハイマー病、特に孤発性アルツハイマー病のために好適に適用される。本発明の方法は、ヒトの疾病に対して適用されるほか、サル、イヌ、ラット、マウスなどの哺乳動物の疾病や疾病モデルに対しても適用される。
【００１９】
本発明のスクリーニング方法及び同定方法は、プレセニリン−２のスプライシング変種の発現を抑制する作用を検定することにより実施される。より具体的には、例えば細胞や組織を被検物質の存在下に培養するか、あるいは被検物質を動物個体に投与した後、細胞や組織中のプレセニリン−２スプライシング変種の発現量を検出することにより、中枢神経系疾患の治療薬又は予防薬のスクリーニング又は同定を実施できる。
【００２０】
培養系を用いてスクリーニング又は同定を行う場合、細胞を例えば酸化ストレス負荷（低酸素負荷、低酸素負荷後の再酸素化処理、過酸化水素添加等）やβ−アミロイド刺激等の条件下に培養する。このような培養条件により、正常状態では見られない以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）のような異常なプレセニリン−２のスプライシング変種が発現誘導されるので、これら培養系をインビトロの病態モデルとし、被検物質の作用を調べるために用いることができる。
【００２１】
（ｉ）エキソン５を欠くスプライシング変種は、細胞に低酸素負荷を与えて培養することにより発現誘導される。発現誘導されるエキソン５欠失スプライシング変種の中にはさらにエキソン８を欠くものも含まれる。
【００２２】
（ｉｉ）エキソン３を欠くスプライシング変種及び（ｉｉｉ）エキソン３とエキソン４を欠くとともにイントロン配列の一部を有するスプライシング変種は、低酸素負荷後の再酸素化処理、過酸化水素添加およびβ−アミロイド刺激により発現誘導される。
【００２３】
培養系に被検物質を存在させることにより、被検物質が存在しない場合と比較して、異常なスプライシング変種の発現量が抑制される場合には、その被検物質には病態を正常化させる作用があると判定される。
【００２４】
プレセニリン−２のスプライシング変種のうち、エキソン５を欠くスプライシング変種は実際にアルツハイマー病患者の脳組織中において特異的に見出されており、従って、エキソン５を欠くスプライシング変種を誘導する系、例えば低酸素負荷などの酸化ストレスを与える細胞培養系は、アルツハイマー病（特に孤発性アルツハイマー病）治療薬をスクリーニングもしくは同定するために好適に用いることができる。
【００２５】
培養系において用いる細胞としては、哺乳動物（ヒト、サル等）由来の中枢神経系細胞（神経細胞、グリア細胞、および星状細胞など）のほか、神経系細胞への分化誘導が可能な未分化細胞などを用いることができる。細胞は、動物組織から分離した初代培養細胞であってもよく、癌化もしくは不死化した株化細胞であってもよい。このような株化細胞としては例えば、ヒト神経芽細胞腫ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−１１）、同ＩＭＲ−３２細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−１２７）、同ＳＫＮ−ＭＣ細胞（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−１０）、ヒト腎臓由来トランスフォームド細胞２９３（ｋｉｄｎｅｙ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ２９３；ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５７３）などが挙げられる。
【００２６】
低酸素負荷（低酸素処理）は、例えば細胞を通常の酸素条件下（約２０％Ｏ２、約５％ＣＯ２）で約４８時間以上培養した後、低酸素条件（Ｏ２濃度１％以下、約９５％Ｎ２、約５％ＣＯ２）の培養器中に移して約１２〜４８時間程度培養すればよく、再酸素化処理は、前記のように低酸素処理した細胞を、再び通常培養の条件下に戻して培養すればよい（特開平９−２３８６８５；Ｏｇａｗａら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ、第８５巻、第１０９０〜１０９８頁、１９９０年）。過酸化水素添加は、過酸化水素を培地に終濃度４４〜４４０μＭとなるように添加して約２時間培養すればよい。また、β−アミロイド刺激は、β−アミロイド蛋白質又はその部分ペプチド（例えば、Ａβ２５−３５（β−アミロイド蛋白質の第２５−３５番目のアミノ酸残基からなる部分ペプチド）など）を０．５〜５μＭとなるように添加して約１６時間培養すればよい。
【００２７】
プレセニリン−２の異常なスプライシング変種は、また、中枢神経系疾患の検査に利用できる。本発明の検査方法は、動物個体由来の被検試料中におけるプレセニリン−２のスプライシング変種の発現を検出することにより実施できる。より具体的には例えば、被検試料からＲＮＡを抽出してＲＮＡ中におけるプレセニリン−２のスプライシング変種を検出すればよい。あるいは、被検試料中のスプライシング変種に由来する変異型ポリペプチドを検出してもよい。
【００２８】
アルツハイマー病患者（特に孤発性アルツハイマー病患者）では、脳組織中におけるプレセニリン−２のエキソン５欠失スプライシング変種が、正常人と比較して明確に高い頻度で見出される。従って、プレセニリン−２のエキソン５欠失スプライシング変種が検出された場合には、アルツハイマー病である危険率が高いものと判定できる。
【００２９】
被検試料としては、動物個体由来の組織および体液が挙げられる。特に、好ましい体組織としては、中枢神経系（神経細胞、グリア細胞、および星状細胞など）を含む脳組織や線維芽細胞などが挙げられる。体液としては、血清、血漿などが挙げられる。
【００３０】
本発明の方法において、プレセニリン−２のスプライシング変種の発現を検出するには、細胞や組織からＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を抽出してＲＮＡ中におけるプレセニリン−２のスプライシング変種を検出すればよい。あるいは、スプライシング変種にコードされる変異型ポリペプチドを検出することによって間接的にスプライシング変種の発現を検出することもできる。
【００３１】
プレセニリン−２遺伝子は、ヒト、ラット、マウスなどから既にクローニングされて塩基配列やアミノ酸配列が決定されている（（ヒト）ＧｅｎｅＢａｎｋ／ＥＭＢＬ 登録Ｎｏ． Ｌ４３９６４ 及び Ｎｏ．Ｕ５０８７１、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ登録 Ｎｏ．Ｐ４９８１０ ；Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、第３４巻、第１９８−２０４頁、１９９６年；Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２６９巻、第９７３−９７７頁、１９９５年；Ｎａｔｕｒｅ、第３７６巻、第７７５−７７８頁、１９９５年：（ラット）Ｇｅｎｅ、第１９７巻、第３８３−３８７頁、１９９７年；ＧｅｎｅＢａｎｋ／ＥＭＢＬ登録Ｎｏ． Ｄ８３７００：（マウス）ＧｅｎｅＢａｎｋ／ＥＭＢＬ登録Ｎｏ． ＡＦ０３８９３５）。従って、スプライシング変種の検出の際にはこれら配列情報を利用できる。また、後記配列表に示したヒト由来の各スプライシング変種の塩基配列の情報を利用できる。
【００３２】
ＲＮＡ中のスプライシング変種を検出する場合には、細胞や組織からＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を調製し、そのｍＲＮＡやｍＲＮＡから調製したｃＤＮＡを用い、異常スプライシングにより生じたジャンクション部位とその前後の領域を検出する。検出には、通常のポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ法）、ＲＮＡ分解酵素プロテクションアッセイ法（ＲＮａｓｅ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｓｓａｙ法）もしくはノーザンブロット法などを利用することができる。これら方法により、異常スプライシングによって生じる断片を、断片の大きさを指標として検出する。
【００３３】
ＰＣＲ法（「ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ」Ｉｎｎｉｓ ＭＡ，Ｇｅｌｆａｄ ＤＨ， Ｓｎｉｎｓｋｙ ＪＪ ａｎｄ Ｗｈｉｔｅ ＴＪ ｅｄｓ．， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎｄｉｅｇｏ， １９９０年）を利用する場合、異常スプライシングによって生じるジャンクション部位とその前後の領域を含む断片を増幅するために適当なプライマー（センスプライマー及びアンチセンスプライマー）を設計、合成する。これらプライマーを用い、ｍＲＮＡより合成したｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを実施し、得られたＰＣＲ産物を、必要に応じて電気泳動などにより分離し、その断片の大きさを調べることによりスプライシング変種を検出できる。また、スプライシング変種を詳細に同定するためには、ＰＣＲ産物について塩基配列を決定すればよい。
【００３４】
ＲＮＡ分解酵素プロテクションアッセイ法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、第１２巻、７０３５−７０５６頁、１９８４年）は、一本鎖ＲＮＡを特異的に分解し二本鎖ＲＮＡは分解しない性質を有するＲＮＡ分解酵素を利用する方法であり、検査すべきＲＮＡに対するアンチセンス鎖ＲＮＡを通常プローブとして用いる。検査すべきＲＮＡと、標識したＲＮＡプローブとをハイブリダイズさせた後、ＲＮＡ分解酵素を作用させてハイブリダイズしなかったＲＮＡを分解し、これを電気泳動などで分離して断片を検出・定量する。ＲＮＡプローブの調製は、例えばｍＲＮＡより合成したｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲなどによりプローブとしたい適切な領域を増幅し、得られた断片をプラスミドベクター中のプロモータ下流に適切な方向で接続してＲＮＡプローブ合成用ベクターを構築する。このベクターと、Ｔ３、Ｔ７、ＳＰ６等のＲＮＡポリメラーゼを用いてインビトロでＲＮＡプローブを産生させることができる。プレセニリン−２のスプライシング変種を検出する場合には、プローブとする領域は、異常スプライシングが起こるジャンクション部位を含む領域、例えば、エキソン４からエキソン６を含む領域などを選択すればよい。
【００３５】
上記のような方法のほか、異常なスプライシングによって新たに生じるジャンクション部位を、直接核酸プローブを用いて検出することもできる。この場合、検出すべきジャンクション部位とその周辺の配列情報をもとに、ジャンクション部位とその前後を含む領域に相補的なＤＮＡ（オリゴヌクレオチド）を設計、合成し、これを標識したものをプローブとして用いる。被検細胞又は組織から得たｍＲＮＡ又はそのｃＤＮＡ、あるいはこれらを鋳型としてＰＣＲにより増幅したＤＮＡ断片などについて、前記プローブを用いてノーザンブロッティング又はサザンブロッティングなどを実施し、プローブとハイブリダイズする核酸が存在するかどうかを判定すればよい。
【００３６】
変異型ポリペプチドを検出することによって間接的にスプライシング変種を検出する場合には、例えば、変異型ポリペプチドを特異的に認識する抗体を利用して免疫化学的に検出する方法を用いることができる。特異的抗体としては、変異型ポリペプチドとは反応するが正常プレセニリン−２とは交差反応しない抗体を用いればよい。抗体を調製するための抗原は、例えば、変異型ポリペプチドを遺伝子組換え技術により調製したものを用いることができる。あるいは抗原として合成ペプチドを用いてもよい。例えば、エキソン５欠失スプライシング変種にコードされる変異型ポリペプチドを検出したい場合、特異抗体は、配列番号５のＣ末端側６アミノ酸の配列を含む適当な長さの合成ペプチドなどを、抗原として用いて調製することができる。
【００３７】
変異型ポリペプチド又は正常プレセニリン−２は、プレセニリン−２遺伝子のスプライシング変種又は正常ｍＲＮＡに対するｃＤＮＡを適当なベクタープラスミドに結合した組換え発現ベクターを用いて調製できる。
【００３８】
プレセニリン−２遺伝子のｃＤＮＡは、例えば動物組織や細胞（中枢神経系細胞など）から調製したｍＲＮＡのｃＤＮＡを遺伝子源として単離取得できる。スプライシング変種のｃＤＮＡを取得する場合には、前記のように酸化ストレス負荷（低酸素負荷、低酸素負荷後の再酸素化処理、過酸化水素添加等）やβ−アミロイド刺激等の条件下に培養した細胞を用いればよい。これら遺伝子源から、既知配列情報に基づいて設計したプライマーを用いるＰＣＲによりｃＤＮＡ断片を得る。必要に応じて遺伝子源から調製したｃＤＮＡライブラリー又は市販のライブラリーを用い、ＰＣＲにより増幅した断片や合成オリゴヌクレオチド等をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーションやプラークハイブリダイゼーション法により目的ｃＤＮＡを取得することもできる。
【００３９】
プレセニリン−２又はその変異型ポリペプチドを生産するための発現系（宿主−ベクター系）としては、例えば、哺乳動物細胞、昆虫細胞、酵母、細菌等の発現系が挙げられる。機能蛋白を得るためには、昆虫細胞（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ ＳＦ９、ＳＦ２１等）および哺乳動物細胞（サルＣＯＳ−７細胞、チャイニーズハムスターＣＨＯ細胞、ヒトＨｅＬａ細胞等）を宿主として用いることが好ましい。昆虫細胞を宿主とする場合のベクターとして例えば、バキュロウイルスベクター等が挙げられる。哺乳動物細胞を宿主とする場合のベクターとして例えば、レトロウイルス系ベクター、パピローマウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、ＳＶ４０系ベクター等が挙げられる。これらベクター中の適当なプロモーターの下流にｃＤＮＡを挿入して発現ベクターを構築することができる。
【００４０】
得られた発現ベクターで宿主細胞を形質転換し、形質転換体を適当な培地で培養することによって、目的とするポリペプチドが生産される。宿主細胞中で産生されたポリペプチドは、摩擦型破砕装置ダイノミル（Ｄｙｎｏ Ｍｉｌｌ）などを用いる物理的な手法、あるいは、リゾチーム処理など化学的な手法により細胞を破砕し、その細胞抽出液から、公知の精製方法（無機塩類による塩析、有機溶媒による分画沈澱、イオン交換樹脂、及び各種カラムクロマトグラフィーによる吸脱着法、ゲルろ過法、蛋白沈澱剤を利用する方法など）又はこれらを適宜組合わせることによって分離、採取することができる。
【００４１】
プレセニリン−２又はその変異型ポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、例えば配列番号１〜４に示される塩基配列を有するヒト由来のｃＤＮＡを用いることができる。このほか、自然界に存在する他の種由来の遺伝子やそれらの対立遺伝子を用いてもよい。また、自然界に存在する塩基配列に限定されず、ポリペプチドのアミノ酸配列に対応するＤＮＡを設計して用いることもできる。この場合、ひとつのアミノ酸をコードするコドンは各々１〜６種類知られており、用いるコドンの選択は任意でよく、利用する宿主のコドン使用頻度等を考慮して、より発現効率の高い配列を設計することができる。
【００４２】
また、スプライシング変種に由来する変異型ポリペプチドは、実質的に同等の免疫原性や機能を有する程度であれば、アミノ酸配列の一部が修飾・改変されたものであってもよい。例えばヒトプレセニリンのエキソン５欠失スプライシング変種に由来するポリペプチドとしては、配列番号５で示されたアミノ酸配列を有するものが挙げられるが、このほか、そのアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換された配列を有するものが挙げられる。アミノ酸の付加、欠失もしくは置換は、通常１〜約２０個、好ましくは１〜約１０個、より好ましくは１〜約５個である。このようなポリペプチドは、配列番号５で示されるアミノ酸配列と通常８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上のアミノ酸配列のホモロジーを有する。
【００４３】
設計したアミノ酸配列をコードするＤＮＡは、ＤＮＡの化学合成、前記ｃＤＮＡの断片化と結合、塩基配列の一部改変等によって取得できる。人為的な塩基配列の一部改変、変異導入は、所望の改変をコードする合成オリゴヌクレオチドからなるプライマーを利用して部位特異的変異導入法（ｓｉｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）（Ｍａｒｋ， Ｄ． Ｆ． ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第８１巻、第５６６２〜５６６６頁（１９８４年）） 等によって実施できる。
【００４４】
また、プレセニリン−２の異常なスプライシング変種（特にエキソン５欠失スプライシング変種）及びその検出方法は、中枢神経系疾患（特にアルツハイマー病）の病態研究にも有用である。異常なスプライシング変種のｃＤＮＡを含む組換え発現プラスミドを細胞に導入して、細胞内における機能を詳細に解析することや、スプライシング変種由来の変異型ポリペプチドの機能・作用を解析することは発症メカニズムの解明につながると考えられる。
【００４５】
以下、実施例をもって本発明をさらに詳しく説明するが、これらの実施例は本発明を制限するものではない。
【００４６】
なお、下記実施例において、各操作は特に明示がない限り、「モレキュラークローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）」（Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．， Ｆｒｉｔｓｃｈ， Ｅ．Ｆ．及びＭａｎｉａｔｉｓ， Ｔ． 著、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓより１９８９年に発刊）に記載の方法により行うか、または、市販の試薬やキットを用いる場合には市販品の指示書に従って使用した。
【００４７】
【実施例】
実施例１ ヒト神経細胞におけるスプライシング変種の検出
（１）ヒト神経細胞の培養とＲＮＡ調製
ヒト神経芽細胞腫ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−１１）を、１０ｃｍ径の培養皿で、１０％ウシ胎児血清含有α−ＭＥＭ培地（α−Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ；ＧＩＢＣＯ社製）中、コンフルエントな状態まで、３７℃で約４８時間ＣＯ２培養器で培養後、ウシ胎児血清不含の同培地に培地交換し、約２時間培養した。
【００４８】
前記培養細胞についてさらに、以下の（ｉ）〜（ｉｖ）の条件で培養した。
【００４９】
（コントロールは前記と同条件でさらに１６時間培養を継続して行った。）
（ｉ）低酸素処理：培養皿を低酸素培養器（酸素濃度１％以下、９５％Ｎ２、５％ＣＯ２）（Ｃｏｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ社製）に移し１６時間培養した。
【００５０】
（ｉｉ）再酸素化処理：培養皿を低酸素培養器（酸素濃度１％以下、９５％Ｎ２、５％ＣＯ２）に移し１６時間培養後、通常のＣＯ２培養器（酸素濃度２０％、７５％Ｎ２、５％ＣＯ２）に戻して４時間培養した。
【００５１】
（ｉｉｉ）β−アミロイド刺激：Ａβ２５−３５（Ｓｉｇｍａ社製）を終濃度０．５μＭ又は５μＭとなるように培地に加え１６時間培養した。
【００５２】
（ｉｖ）過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）添加：過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）を終濃度が４４μＭ又は４４０μＭとなるように培地に添加し２時間培養した。
【００５３】
前記のように培養した細胞を各々回収し、生理的リン酸緩衝液（ＰＢＳ：Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｕｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）で洗浄した。これを、細胞溶解用緩衝液（ＲＬＴ溶液、ＱＩＡＧＥＮ社製）７００μｌに懸濁した後、細胞を破砕し、細胞抽出液を得た。この細胞抽出液から、トータルＲＮＡを調製した。ＲＮＡの調製は、ＲＮＡ調製用キット（商品名：Ｒｎｅａｓｙ ｔｏｔａｌ ＲＮＡキット、ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて行った。
【００５４】
（２）スプライシング変種類の検出
前項（１）で得たＲＮＡ（トータルＲＮＡ、１μｇ）を鋳型とし、オリゴｄＴプライマー（５０ ｐｍｏｌｅ）、ランダムオリゴヌクレオチド（５ ｐｍｏｌｅ）及びリバーストランスクリプターゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製、Ｍｏｌｏｎｅｙ ｌｅｕｋａｅｍｉａ ｖｉｒｕｓ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）（２００単位）を含む緩衝液（０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ ８．３， ０．０７５Ｍ ＫＣｌ， ０．００３Ｍ ＭｇＣｌ２， ＤＴＴ，０．０００２Ｍ ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）０．０５ｍｌ中、４２℃で１時間反応させて、一本鎖ｃＤＮＡを合成した。得られた一本鎖ｃＤＮＡを用い、以下のように、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ：Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）によりスプライシング変種を検出した。
【００５５】
プレセニリン−２（ＰＳ−２）遺伝子用のＰＣＲプライマーとしては、
ＰＳ２５１（配列番号６）（センスプライマー）、ＰＳ２５３（配列番号７）（センスプライマー）、ＰＳ２３３（配列番号８）（アンチセンスプライマー）及びＰＳ２３１（配列番号９）（アンチセンスプライマー）の４種を用いた。
【００５６】
各プライマーに対応するＰＳ−２遺伝子上の位置と方向を図１および図３に示した。
【００５７】
ＰＣＲは、まず、前記で得た一本鎖ｃＤＮＡを鋳型とし、ＰＳ−２遺伝子のコーディング領域全体（約１．６ｋｂｐ）を増幅するためのプライマーとして、ＰＳ２５１（配列番号６）（センスプライマー）及びＰＳ２３１（配列番号９）（アンチセンスプライマー）を用いて、１回目のＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲは、変性反応９５℃、約４０秒、伸長反応７２℃で１分、アニーリング６０℃で約３０秒の条件（サイクル数：３０サイクル）で行った。
【００５８】
反応液を１／５希釈し、その１μｌを鋳型として２回目のＰＣＲを行った。ＰＳ−２のコーディング領域の５’末端側断片を検出するためのＰＣＲプライマーとしては、ＰＳ２５１（配列番号６）（センスプライマー）及びＰＳ２３３（配列番号８）（アンチセンスプライマー）を、また、３’末端側断片を検出するためのＰＣＲプライマーとしては、ＰＳ２５３（配列番号７）（センスプライマー）及びＰＳ２３１（配列番号９）（アンチセンスプライマー）を用いた。ＰＣＲは、前記と同様の条件を用いた。得られたＰＣＲ産物について、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行って、ＤＮＡ断片の大きさを調べた。
【００５９】
結果を図２に示した。図２に示したように、５’末端側断片を増幅したＰＣＲの結果、コントロールでは見られないバンドが、低酸素処理した細胞由来の試料で１本検出された。また、低酸素負荷後の再酸素化処理およびβ−アミロイド刺激した細胞由来の試料で各２本、過酸化水素添加培養した細胞由来の試料で３本、コントロールで見られないバンドが検出された。これに対して３’末端側断片を増幅したＰＣＲの結果では、コントロールを含む全ての試料で、同様に各２本のメジャーバンドが確認された。
【００６０】
これらの結果から、低酸素処理により、５’末端側でスプライシング異常が発生し、少なくとも一種類のスプライシング変種が誘導されたと考えられた。また、低酸素負荷後の再酸素化処理およびβ−アミロイド刺激によっても５’末端側でスプライシング異常が発生し、各々２種及び３種類のスプライシング変種が誘導されたと考えられた。
【００６１】
（３）ＰＳ−２スプライシング変種の解析
前項（２）で見出されたＰＳ−２スプライシング変種について、以下のように塩基配列を決定した。前記（２）と同様にＰＣＲ産物についてアガロースゲル電気泳動を行い、スプライシング変種に由来すると考えられるＤＮＡ断片（５’末端側断片５種類と３’末端側断片２種類）をゲルから回収し、各々ベクタープラスミドｐＧＥＭ−Ｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）に連結した。得られた組換えプラスミドを用いて、ダイデオキシ法により、挿入断片部分の塩基配列を決定した。塩基配列は、アプライド・バイオシステム社の自動シークエンサー（３７３Ａ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ）を用いて行った。
【００６２】
塩基配列を決定した結果、確認されたスプライシング変種を、図１に模式図で示した。
【００６３】
３’末端側で見出された２種類の断片のうち、１つは正常なスプライシングの産物であり、他の１つはエキソン８が欠失したスプライシング変種であった。エキソン８欠失スプライシング変種は、正常組織での存在が既に報告されており、この欠失はＰＳ−２蛋白質の機能に影響を与えるものではないと考えられる。
【００６４】
一方、低酸素処理の５’末端側断片において見出された変種は、エキソン５が欠失したスプライシング変種であることがわかった。エキソン５欠失スプライシング変種は、これまで正常組織において全く報告されていないものである。このスプライシング変種（エキソン５欠失）に対応するｃＤＮＡ塩基配列を、後記配列表の配列番号２に示した。このスプライシング変種におけるエキソン４とエキソン６の接合部位は、配列番号２の第７０５番目と７０６番目の塩基の間に存在する。エキソン５の欠失によって接合部位から下流で読取枠のずれが生じ、配列番号２におけるオープンリーディングフレームは第３５０〜７２４番目の塩基に存在する。このオープンリーディングフレームの塩基配列及びここにコードされる変異型ポリペプチド（１２４アミノ酸残基）のアミノ酸配列を配列番号５に示した。変異型ポリペプチドは、正常なプレセニリン−２蛋白質（４４８アミノ酸残基）のＮ末端側１１９アミノ酸残基分のＣ末端に、読取枠のずれによって生じた５アミノ酸残基が付加された配列を有する。
【００６５】
また、エキソン５欠失変種の中にはさらにエキソン８が欠失したものも存在しており、このようなスプライシング変種のｃＤＮＡは、配列番号２において第９９５〜１０９３番目の塩基（エキソン８に相当する領域）が欠失した塩基配列を有する。
【００６６】
低酸素負荷後の再酸素化処理、β−アミロイド刺激及び過酸化水素添加の５’末端側断片において見出された変種のうちの一つは、エキソン３を欠失したスプライシング変種であり、もう一つは、エキソン３及びエキソン４を欠失するとともに、イントロン４（エキソン４とエキソン５の間のイントロン）の内部でスプライシングされたスプライシング変種であった。
【００６７】
エキソン３欠失スプライシング変種のｃＤＮＡ配列を配列番号３に示した。エキソン２とエキソン５の接合部位は、配列番号３の第３２９番目と３３０番目の塩基の間に存在する。
【００６８】
また、エキソン３及びエキソン４を欠失するとともにイントロン配列の一部を有するスプライシング変種のｃＤＮＡ配列を配列番号４及び図４に示した。エキソン２とエキソン５の接合域に存在するイントロン（イントロン４）由来の配列は、配列番号４の第３３０〜４０９番目の塩基に存在する。
【００６９】
これまでに正常組織において、エキソン３及びエキソン４を同時に欠失したスプライシング変種は報告されているが、エキソン３のみを欠失した変種、エキソン３及びエキソン４を欠失するとともにイントロン配列の一部を有するスプライシング変種は報告されていない。
【００７０】
実施例２ ヒト神経細胞におけるＰＳ−２スプライシング変種発現誘導に対する薬剤の影響
（１）ヒト神経細胞の低酸素処理下での培養とＲＮＡ調製
ヒト神経芽細胞腫ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞を、前記実施例１の（１）に準じ、以下のように低酸素処理条件下で培養した。すなわち、１０％ウシ胎児血清含有α−ＭＥＭ培地中、コンフルエントな状態まで（約４８時間）３７℃、ＣＯ２培養器（酸素濃度：２０％）で培養後、ウシ胎児血清不含の同培地に培地交換した。培地には、シクロヘキシミド（終濃度０．２μｇ／ｍｌ又は１μｇ／ｍｌ）、Ｎ−アセチル−Ｌ−システインを（終濃度２μＭ又は１０μＭ）又はジフェニレンヨードニウムクロライド（Ｄｉｐｈｅｎｉｌｅｎｅｉｏｄｏｎｉｕｍ Ｃｈｌｏｒｉｄｅ）（終濃度５μＭ又は２０μＭ）を添加した。これを、低酸素培養器（酸素濃度：１％以下）に移し、さらに１６時間培養した。
【００７１】
前記のように培養した細胞を各々回収し、細胞から前記実施例１の（１）項と同様の方法にてＲＮＡ（トータルＲＮＡ）を調製した。
【００７２】
（２）ＰＳ−２スプライシング変種の検出
前項（１）で得たＲＮＡ（トータルＲＮＡ）を用い、実施例１の（２）項と同様の方法で、ＰＳ−２のスプライシング変種の検出を行った。すなわち、前記ＲＮＡを鋳型として一本鎖ｃＤＮＡを調製し、これを鋳型として一回目のＰＣＲを行ってＰＳ−２コーディング領域全長を含むＤＮＡ断片を増幅した。ＰＣＲプライマーとしてはＰＳ２５１（配列番号６）（センスプライマー）及びＰＳ２３１（配列番号９）（アンチセンスプライマー）を用いた。
【００７３】
反応液を希釈し、その１μｌを鋳型として用いて、２回目のＰＣＲを行い、ＰＳ−２のコーディング領域の５’末端側を含むＤＮＡ断片を増幅した。ＰＣＲプライマーとしては、ＰＳ２５１（配列番号６）（センスプライマー）及びＰＳ２３３（配列番号８）（アンチセンスプライマー）を用いた。得られたＰＣＲ産物について、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、スプライシング変種に由来する断片（エキソン５欠失に由来する約６４０塩基長の断片等）の有無を調べた。
【００７４】
その結果を図５に示した。図５に示したように、低酸素処理によって誘導されるエキソン５欠失変種の発現は、蛋白質合成阻害剤であるシクロヘキシミド処理によって抑制された。このことから、エキソン５欠失変種の発現誘導には、低酸素処理時に新生される蛋白質が関与していると考えられた。また、エキソン５欠失変種は、抗酸化剤であるＮ−アセチル−Ｌ−システイン又はジフェニレンヨードニウムクロライドによってもその発現が抑制された。これらのことから、低酸素処理によって誘導されるＰＳ−２エキソン５欠失変種の発現には、活性酸素など低酸素状態での何らかの酸化ストレスが関与していると考えられた。
【００７５】
実施例３ ヒト脳組織におけるＰＳ−２スプライシング変種の発現
ヒト脳組織サンプルについて、ＰＳ−２のエキソン５欠失スプライシング変種の検出を行った。ヒト脳の組織サンプルは、孤発性ＡＤ患者脳（３０例）及びほぼ同年齢の正常者脳（１７例）から採取したもの計４７サンプルを用いた。
【００７６】
脳組織サンプル（凍結保存サンプル）をホモジナイズし、得られた抽出液から、前記実施例１の（１）項と同様にしてＲＮＡを調製した。得られたＲＮＡを用いて、実施例１の（２）項及び実施例２の（２）項と同様にしてＰＳ−２のスプライシング変種の検出をＰＣＲを用いて行った。
【００７７】
その結果を表１に示した。エキソン５欠失スプライシング変種の発現は、正常者脳においては１７例中３例（１７％）であった。これに対して、孤発性ＡＤ患者の脳における発現は、３０例中２１例（７０％）であった。このように孤発性ＡＤ患者の脳においては、正常者脳よりも明らかに高い頻度でエキソン５欠失スプライシング変種が発現していることがわかった。
【００７８】
【表１】
【表２】
【発明の効果】
本発明の方法によれば、従来困難であった孤発性アルツハイマー病など中枢神経系疾患の治療薬・予防薬のスクリーニング及び同定を効率よく実施することができる。本発明のスクリーニング方法によって見出された薬物あるいは同定された薬物は、作用点が明らかとなっているので医薬品としての開発に有利である。
【００８１】
また、中枢神経系疾患、特に従来診断が困難であった孤発性アルツハイマー病の診断を好適に行うことができる。
【００８２】
また、プレセニリン−２の異常なスプライシング変種及びその検出方法は、中枢神経系疾患（特にアルツハイマー病）の病態研究にも有用である。異常なスプライシング変種の細胞内における機能を詳細に解析することや、スプライシング変種由来の変異型ポリペプチドの機能・作用を解析することは発症メカニズムの解明につながる。
【００８３】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】ＰＳ−２遺伝子のＰＣＲプライマー及び各種スプライシング変種由来のＰＣＲ産物を示す模式図。
【図２】ヒト神経細胞におけるＰＳ−２スプライシング変種の発現誘導を示す電気泳動の図（白黒反転させたもの）であり、図中、Ｎはコントロールを表し、Ｈは低酸素処理した細胞を表し、Ｒは低酸素負荷後再酸素化処理した細胞を表し、Ａβ２５−３５はＡβ２５−３５（β−アミロイド蛋白質の第２５−３５番目のアミノ酸残基からなる部分ペプチド）を０．５μＭまたは５μＭ添加培養した細胞を表し、Ｈ２Ｏ２は過酸化水素を４４μＭまたは４４０μＭ添加した細胞を表す。
【図３】ＰＳ−２の全エキソンを含むｃＤＮＡ配列、ＰＣＲプライマー及び各エキソンの位置を示した図。
【図４】ＰＳ−２のエキソン３及びエキソン４を欠失するとともにイントロン配列の一部を有するスプライシング変種のスプライシング部位近傍の配列を示した図。
【図５】ヒト神経細胞におけるＰＳ−２スプライシング変種の発現誘導に対する薬剤の影響を示す電気泳動の図（白黒反転させたもの）であり、図中、Ｎはコントロールを表し、Ｈは低酸素処理した細胞を表し、ＣＨＸはシクロヘキシミドを０．２μｇ／ｍｌまたは１μｇ／ｍｌ添加した後、低酸素処理した細胞を表し、ＤＰＩはジフェニレンヨードニウムクロライドを５μＭまたは２０μＭ添加した後、低酸素処理した細胞を表し、ＮＡＣはＮ−アセチル−Ｌ−システインを２μＭまたは１０μＭ添加した後、低酸素処理した細胞を表す。
Claims (18)
- プレセニリン−２遺伝子から転写されるスプライシング変種の発現に対する被検物質の抑制作用を検定することを特徴とする、中枢神経系疾患治療薬もしくは予防薬のスクリーニング方法および同定方法であって、スプライシング変種が、プレセニリン−２遺伝子のエキソン５を欠くスプライシング変種である方法。
- スプライシング変種が、プレセニリン−２遺伝子のエキソン５及びエキソン８を欠くスプライシング変種である請求項１記載の方法。
- スプライシング変種の発現が、神経細胞におけるスプライシング変種の発現である、請求項１記載の方法。
- スプライシング変種の発現が、神経細胞に酸化ストレスを負荷することにより誘導されるものである、請求項３記載の方法。
- スプライシング変種の発現が、動物の脳組織におけるスプライシング変種の発現である、請求項１記載の方法。
- 中枢神経系疾患がアルツハイマー病である請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
- 中枢神経系疾患が孤発性アルツハイマー病である請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
- 動物個体由来の被検試料中における、プレセニリン−２遺伝子から転写されたスプライシング変種の発現を検出することを特徴とする中枢神経系疾患の検査方法であって、スプライシング変種が、プレセニリン−２遺伝子のエキソン５を欠くスプライシング変種である方法。
- 中枢神経系疾患が、アルツハイマー病である請求項８記載の検査方法。
- 中枢神経系疾患が孤発性アルツハイマー病である請求項８記載の検査方法。
- 配列番号２記載の塩基配列の第７０５番目及び第７０６番目の塩基とその前後の領域を含む核酸を検出することからなる、プレセニリン−２遺伝子のエキソン５を欠くスプライシング変種の検出方法。
- プレセニリン−２遺伝子のエキソン５を欠くスプライシング変種と同一か又はそれに相補的な塩基配列を有する核酸。
- （１）配列番号２記載の塩基配列、（２）配列番号２において第９９５〜１０９３番目の塩基が欠失した塩基配列、及び（３）前記（１）又は（２）に相補的な塩基配列から選択される塩基配列を有する請求項１２記載の核酸。
- 請求項１２記載の核酸を含む組換えプラスミド。
- プレセニリン−２のエキソン５を欠くスプライシング変種に由来するポリペプチドであって、（１）配列番号５の下段記載のアミノ酸配列を有するか又は（２）配列番号５記載のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸残基が付加、欠失又は置換されたアミノ酸配列を有するポリペプチド。
- 請求項１５記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ。
- 配列番号５の上段記載の塩基配列を有する請求項１６記載のＤＮＡ。
- 請求項１６記載のＤＮＡを含む組換えプラスミド。
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