JP4723550B2

JP4723550B2 - 生存運動ニューロン（ｓｍｎ）遺伝子；脊髄筋萎縮

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Publication number: JP4723550B2
Application number: JP2007271610A
Authority: JP
Inventors: ミュニッシュアルノール; メルキジュディス
Original assignee: アンスティテュナショナルドゥラサンテエドゥラルシェルシュメディカル
Priority date: 1994-10-19
Filing date: 2007-10-18
Publication date: 2011-07-13
Anticipated expiration: 2015-10-19
Also published as: EP0708178A1; JPH08228785A; US8962269B2; AU3436995A; US20070166737A1; ATE301191T1; US7033752B1; DE69534351D1; US8394932B2; US20130323759A1; US20110294226A1; US6080577A; AU702252B2; JP4283345B2; DE69534351T2; JP2008099696A; US20060089490A1; CA2160937C; CA2160937A1

Description

本発明は染色体５−ＳＭＡ（脊髄筋萎縮）決定遺伝子であるヒト生存運動ニューロン遺伝子又はＳＭＮ遺伝子の発見に関連する。本発明は更に、ＳＭＮ遺伝子をコードするヌクレオチド配列及び対応のアミノ酸配列、ＳＭＮタンパク質をコードする遺伝子又はこの遺伝子に対応するＤＮＡ配列を含むベクター、並びにＳＭＮ遺伝子又はこの遺伝子に対応するＤＮＡ配列を含む形質転換体に関連する。

より詳しくは、本発明は知覚の変化を伴う又は伴わない筋肉の弱体化の症状を有する運動ニューロン障害、例えば筋萎縮性外側硬化症（ＡＬＳ）、脊髄筋萎縮（ＳＭＡ）、一次外側硬化症（ＰＬＣ）、先天性多発性関節拘縮症（ＡＭＣ）等を検査するための手段及び方法に関連する。かかる運動ニューロン障害を検査するための方法は、限定することなく、ＰＣＲ技術における特異的なＤＮＡプライマーの利用、ハイブリダイゼーションプローブの利用、並びにポリクローナル及びモノクローナル抗体の利用を含む。

更にもっと詳しくは、本発明はヒトＳＭＮ遺伝子もしくはその遺伝子の一部、ｃＤＮＡ、オリゴヌクレオチド又はそれによりコードされたタンパク質もしくはその一部の治療における利用に関連し、その治療はかかるヒトＳＭＮ遺伝子もしくはその遺伝子の一部、ｃＤＮＡ、オリゴヌクレオチド又はそれによりコードされたタンパク質もしくはその一部を骨髄細胞を含む体細胞に輸送するための無害な担体を担う操作されたウィルス又はベクターに、必要ならばかかるヒトＳＭＮ遺伝子もしくはその遺伝子の一部、ｃＤＮＡ、オリゴヌクレオチド又はそれによりコードされたタンパク質もしくはその一部を挿入することによる。

本発明は更にＳＭＮ遺伝子に対して誘導された抗原配列に関連する。

運動ニューロン障害の治療のための手段を提供するため、本発明はＳＭＮ遺伝子によりコードされるタンパク質にも関連する。

本発明は更にマウスＳＭＮ遺伝子、このマウスＳＭＮ遺伝子をコードするヌクレオチド配列及び対応のアミノ酸配列の単離に関連する。このＳＭＮ遺伝子全体又はその一部を過剰発現する遺伝子導入マウスモデル及び突然変異したＳＭＮ遺伝子との相同的組換により生成された遺伝子導入マウスモデルも記述する。

変性運動ニューロン障害は３つの主要カデゴリーに分類できる。筋萎縮性外側硬化症又はＡＬＳ；運動ニューロン障害、例えば脊髄筋萎縮（ＳＭＡ）；更には一次外側硬化症（ＰＬＳ）の如くのその他の変性障害に関係する運動ニューロン障害。

筋萎縮性外側硬化症（ＡＬＳ）は進行性のニューロン障害の最もよく遭遇する形態であり、そしてそれは特徴的な中年の障害である。この障害は、大脳皮質及び脊髄の前角の両者における運動ニューロンと、脳幹の一部の運動核の中のその同族体との進行性欠損を特徴とする。それは一般に上部及び下部運動ニューロンに影響を及ぼすが、しかしながらその変異体は主に特定の運動ニューロンのサブセット、特に病気の経過における初期のニューロンのサブセットのみに関与しうる。

ＡＬＳは冒された筋肉の疲労及び痙攣を伴う非対称的な虚弱化の発症により明確となる。その虚弱化には目に見えるるいそうが伴い、そして筋肉の萎縮が進展し、そして時間が経過すると、かむ、のむ、並びに顔面及び舌の運動の筋肉を含む全ての領域の対称性分布に障害が及ぶまで一層多くの筋肉が関与し始める。ＡＬＳを有する患者の５０％が障害の発症から３〜５年で死亡することが予測されうる。現在、ＡＬＳの病理進行に効果のある処置はない。

脊髄筋萎縮（ＳＭＡ）は、筋肉の萎縮にかかわる進行性の対称的四肢及び体幹麻痺を招いてしまう脊髄の前角細胞の変性を特徴とする。ＳＭＡは二番目に致死的な、嚢胞性線維症後の常染色体劣性障害である（６０００人の新生児のうち１人）。子供のＳＭＡは一般に、発症年齢及び臨床経過に基づいて３つの臨床グループに副分類される。急性のウェルドニグ・ホフマン (Werdnig-Hoffmann) 病（Ｉ型）は、重症の全身化筋肉虚弱並びに誕生時及び生後３ヶ月内での緊張低下を特徴とする。呼吸困難による死亡が、最初の２年以内に通常起こる。この障害は中間（II型）及び若年(III型、クーゲルベルグ−ウェランダー (Kugelberg-Welander) 障害）形態とは区別できる。II型の子供は座ることはできるが、立つ又は助けなしで歩行することができず、２才以降に起こる。基礎となる生化学的欠陥はわかっていないままである。更に、時折りＳＭＡIVと呼ばれる、ゆっくりと進行する成人のＳＭＡ形態があることも知られている。

一次外側硬化症（ＰＬＳ）はＡＬＳの変種であり、そして高齢の散在性障害として認められる。ＰＬＳにおける神経病理学においては皮質脊髄（ピラミッド）管の変性があり、これは脳幹レベルにおいてはほぼ正常であるが、それらが脊髄を下ると萎縮性が高まる。下肢は初期において、且つ最もひどく冒される。

先天性多発性関節拘縮症（ＡＭＣ）は先天的な関節固定（新生児３０００人のうちの１人）を特徴とし、子宮内での胎児運動低下に由来するよくある症状である(Stern, W.G., JAMA, 81：1507〜1510 (1923) ；Hall, J.G., Clin.Orthop. 194 ：44-53 (1985)) 。ＡＭＣは羊水過少症か、又は中枢神経系、骨格筋もしくは脊髄にかかわる様々な障害のいづれかを原因とする。神経変性及び神経細胞侵食は又は前角において生ずるため、神経原起源のＡＭＣは急性脊髄筋萎縮、即ちＩ型ＳＭＡウェルドニグ−ホフマン障害に関連しうるものと仮定されている（Bander, B.Q., Hum.Pathol. , (1980)；117 ：656-672)。

ＡＬＳ，ＡＭＣ，ＳＭＡ及びＰＬＳについての検査及び臨床診断は筋肉生検にかなり制約されている。診断は医師により筋電計（ＥＭＧ）により行われる。例えば、ＳＭＡを診断するための臨床基準はClinical Criteria International SMA Consortium (Munsal T.L., Neuromuscular Disorders, Vol.1, p81 (1991))に記載されている。しかしながら、運動神経障害を検査するための様々な検査の複雑さのため、臨床医は通常、上記の検査法を利用する前に、構造的損傷、感染症、中毒、代謝障害及び遺伝的生化学的障害の如くの様々なカテゴリーの障害を省こうとする。

現在、いづれの上記の運動ニューロン障害にとっての処置法もない。様々な複数の機械的な助けを含む基本的なリハビリテーション的手段が、このような障害を有する患者がその不具に打ち勝つ助けとなることがあるが、しかし往々にしてかかる患者が長く生存するには拘束的な呼吸補助システムを必要とする。

従って、本発明の目的はＳＭＡ障害の原因となるＳＭＡ遺伝子を特性決定すること、及びＳＭＡ遺伝子をベクター、例えばプラスミド、コスミド、ファージ、ＹＡＣベクターであって、ＳＭＮ遺伝子及びＳＭＮタンパク質を大量に生産させるようにする形質転換工程において利用できうるものにクローニングすることにある。

本発明の更なる別の観点は、ＡＭＣ，ＡＬＳ，ＳＭＡ及びＰＬＳの如くの運動ニューロン障害を有する患者を検査及び診断するためのプライマー及びハイブリダイゼーションプローブの利用にある。本発明の更なる別の観点は、ＳＭＮ遺伝子もしくはその一部、又はｃＤＮＡ、オリゴヌクレオチド、タンパク質もしくはその一部の、ＡＭＣ，ＳＭＡ，ＡＬＳ及びＰＬＳ患者の如くの障害、特に遺伝子障害を治す治療における利用にある。

更なる別の観点において、本発明はＳＭＡ患者におけるＳＭＮ遺伝子欠陥の検出のためのモノクローナル及びポリクローナル抗体を提供する。

本発明の別の観点は、マウスにおけるＳＭＡ遺伝子の特性決定を提供する。遺伝子導入マウスのモデルであって、ＳＭＮ遺伝子全体又はその一部分を過剰発現するもの、又は突然変異したマウスＳＭＮ遺伝子による相同的組換によりＳＭＮ遺伝子を異常に生産する遺伝子導入マウスも述べる。

本発明の更なる観点に従うと、運動ニューロン障害の治療はＳＭＮ遺伝子によりコードされるタンパク質を包括しうる。

これら及びその他の目的は本発明の概要、好適な態様の説明及び請求の範囲により明らかとなる。

本発明の目的は、新規のヒト生存運動ニューロン遺伝子又はＳＭＮ遺伝子、そのＤＮＡ配列及びアミノ酸配列を提供することにある。

本発明の別の観点は新規のマウス生存運動ニューロン遺伝子又はＳＭＮ遺伝子、そのＤＮＡ配列及びアミノ酸配列を提供することにある。

本発明の更なる別の観点は、宿主微生物の中で複製できて、大量のヒト又はマウスＳＭＮタンパク質を供することのできるベクターの提供にある。

本発明の別の観点は、脊髄筋萎縮及びその他の運動ニューロン障害を検査及び診断するのに利用することのできる特異的なＤＮＡ配列の提供にある。これらのＤＮＡ配列はＳＭＮ遺伝子配列、ＳＭＮ遺伝子配列のトランケート又は突然変異バージョンを増幅及び検出するため、又は前記配列の欠失を検出するために、ポリメラーゼ連鎖反応においてプライマーとして利用することができ、これによりＳＭＡ，ＡＭＣ及びその他の運動ニューロン障害の診断ができる。

本発明の更なる別の観点は、ＳＭＮ遺伝子全体もしくはその一部を過剰発現する遺伝子導入マウスを提供し、又は突然変異されたマウスＳＭＮ遺伝子による相同的組換によりＳＭＮ遺伝子を異常に生成する遺伝子導入マウスも述べる。

本発明者は、運動ニューロン障害に関与するＴ−ＢＣＤ５４１及びＣ−ＢＣＤ５４１と称する２種の遺伝子を同定した。

Ｔ−ＢＣＤ５４１遺伝子はＳＭＡ型の運動ニューロン障害の原因であり、なぜならそれらの部分的もしくは全体的欠損、突然変異又はその他の任意の改良は、臨床的筋電図又は筋肉形態レベルでの病理状態を招くに足りるからである。

Ｃ−ＢＣＤ５４１遺伝子はｃＤＮＡのレベルでＴ−ＢＣＤ５４１遺伝子とは異なり、なぜなら２個のヌクレオチドが改良されているからである。にもかかわらず、このＣ−ＢＣＤ５４１遺伝子はコントロール及び運動ニューロン障害に苦しむ患者における転写の際に適正にプロセシングされないからである。このＣ−ＢＣＤ５４１遺伝子のゲノムＤＮＡは転写の際に適正にスプライスされず、それ故異常な転写物である。Ｔ−ＢＣＤ５４１及びＣ−ＢＣＤ５４１遺伝子のスプライシング間での相違はこれらの遺伝子のイントロン配列における相違に由来する。

従って、本発明はヒトＳＭＮ遺伝子の構造及び結合を更に特性決定し、これは長さ約２０kbであり、そして８本のイントロンにより分断された９本のエクソンより成ることがわかった。ヒトＳＭＮ遺伝子のヌクレオチド配列、アミノ酸配列及びエクソン−イントロン境界を図１２に示す。全てのエクソン−イントロン境界はその他のヒト遺伝子において見い出された共通配列を示している。ポリアデニル化共通部位が停止コドンの約５５０bp下流にある（図１２）。ＳＭＮ遺伝子の全イントロン／エクソン構造は、ＳＭＡ障害又はその他の運動ニューロン障害におけるＳＭＮ遺伝子突然変異の特性決定を可能にする。

本発明はまた、Ｔ−ＢＣＤ５４１遺伝子のレベル又はＣ−ＢＣＤ５４１遺伝子のレベルでの運動ニューロン障害に関係するゲノム異常の検査のための手段も規定する。

本発明の遺伝子は、その各々が下記の配列に対応するイントロン配列を含んで成ることで更に規定されうる：
Ｔ−ＢＣＤ５４１遺伝子において、

Ｃ−ＢＣＤ５４１遺伝子において、

本発明の好適な態様において、本発明の遺伝子はプローブとして用いる図４及び５の配列とストリンジェンシー条件においてハイブリダイズできる。

上記の如く、本発明は更にＳＭＮ遺伝子の変異体に関連し、この変異体は図２及び３の配列に対応するｃＤＮＡ配列を有するＣ−ＢＣＤ５４１である。

本発明はまた、上記の遺伝子のいづれかから獲得できるかの如くのｃＤＮＡ配列に関連もする。かかるｃＤＮＡ配列を図２及び３、並びに図４及び５に開示する。これらのｃＤＮＡ配列は共に図１に記載のアミノ酸配列を含んで成るタンパク質をコードすることができる。

かかるタンパク質をコードする能力にもかかわらず、本発明者はＣ−ＢＣＤ５４１遺伝子がインビボでこのタンパク質を生成できるか、又は転写の際の遺伝子の異常なスプライシングに基づき有意義な量でそれを生成できないことを認識した。即ち、Ｃ−ＢＣＤ５４１遺伝子の存在はインビボで、ＳＭＡ型の運動ニューロン障害又はその他の運動ニューロン障害の原因たるＴ−ＢＣＤ５４１遺伝子の欠陥（欠損、突然変異）を修復できない。

特定の態様において、本発明は図４及び５の配列のヌクレオチド３４〜９１５を含んで成るヌクレオチド配列、又は図２及び３の配列のヌクレオチド３４〜９１５を含んで成る配列にも関連する。

これらのヌクレオチド配列はそれぞれＴ−ＢＣＤ５４１遺伝子及びＣ−ＢＣＤ５４１遺伝子をコードする配列に対応する。

上記の遺伝子のイントロンも本明細書に含ませた。特にイントロン６及び７はそれぞれ下記の配列を有する：

Ｔ−ＢＣＤ５４１遺伝子について：

Ｃ−ＢＣＤ５４１遺伝子について：

本発明は更に、ヌクレオチド配列であって、少なくとも約９個のヌクレオチドを含んで成り、且つ上記の配列を含んで成るか、又はオリゴヌクレオチドを選定した後に決定されるハイブリダイゼーション条件において上記の配列とハイブリダイズすることを特徴とする配列を包括する。

ハイブリダイゼーション条件の決定については、Sambrookら、Molecular Cloning, a Laboratory Manual 第２版、１９８９を参照のこと。

本発明の配列はＤＮＡ（特にゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡ又は合成ＤＮＡ）又はＲＮＡである。これらはＴ−ＢＣＤ５４１又はＣ−ＢＣＤ５４１遺伝子の検出のためのプローブとして、又は生物試料中に存在するゲノムＤＮＡの増幅のためのプライマーとして利用できうる。

好適なプライマーは、下記の配列を含んで成るか、又はそれに対応するものである：

上記のプライマーはＴ−ＢＣＤ５４１遺伝子のエクソン７を特徴とする。

上記のプライマーはＴ−ＢＣＤ５４１遺伝子のエクソン８を特徴とする。

ペアーで使用するプライマーは運動ニューロン障害を検査するため、ゲノムＤＮＡの増幅のためのセットを構成できる。

上記のプライマーに関する反転相補性配列も使用してよい。

好適なプライマーのセットは以下の通りである：
−図４及び５の配列のヌクレオチド９２１〜１４６９を含んで成る配列の中に含まれるプライマーのペアー及び／又は
−以下の配列を含んで成るプライマーのペアー：

別の好適なプライマーのセットは以下を含んで成る：
−以下の配列を有するプライマーのペアー：

−以下の配列を有するプライマーのペアー：

エクソン７における相違の検出のための一般的観点から、Ｔ−ＢＣＤ５４１及びＣ−ＢＣＤ５４１遺伝子の間で、オリゴヌクレオチドプライマーをその相違の５′側のフラグメントにおいて、且つエクソン７又はイントロン７の中で決定できる。

診断の目的のためのＳＳＣＰ分析に利用できうるその他のプライマーはとりわけ以下の通りである：

本発明はまた、Ｃ−ＢＣＤ５４１遺伝子と、そして特にイントロン配列と、特にＴ−ＢＣＤ５４１遺伝子における対応部とは異なるイントロンのフラグメントとハイブリダイズできるアンチセンスＤＮＡ又はＲＮＡに関する。

本発明はまた、図１のアミノ酸配列を含んで成るタンパク質、又は図１０のアミノ酸配列を有するタンパク質に関する。

図１の配列に関するタンパク質は、経口、筋肉内、静脈内投与を介して、又は脊髄流体への投与を介して、運動ニューロン障害の処置のための組成物において利用できうる。

本発明は更に、運動ニューロン障害のインビトロ診断のためのキットを提供し、このキットは：
−上記のプライマーのセット；
−増幅反応のための試薬；及び
−増幅生成物の検出のためのプローブ；
を含んで成る。

本発明の別の態様に従うと、上記のハイブリダイゼーションプローブを含む運動ニューロン障害の検査のためのキットを提供する。

遺伝子間の相違に対応するオリゴヌクレオチドプローブを利用してよい。

診断は特にＳＭＡ運動ニューロン病理に向けられている。

本発明は上記のヌクレオチド配列を含んで成るクローニング又は発現ベクターに関する。かかるベクターは、例えばプラスミド、コスミド、ファージ、ＹＡＣ、ｐＹＡＣ等であってよい。好ましくは、かかるベクターは運動ニューロン向性を有する。特に遺伝子治療のための手段を規定する目的のためには、とりわけポリオウィルスベクター、ヘルペスウィルス、アデノウィルス、レトロウィルスベクター、合成ベクター等が選ばれうる。

本発明の範囲において更なる組換配列を考慮する。本発明は更に組換宿主細胞、即ち、上記の組換配列により形質転換された酵母、ＣＨＯ細胞、バキュロウィルス、骨髄細胞、Ｅ．コリ、繊維芽細胞−上皮細胞に関する。

本発明は更に、脊髄筋萎縮、栄養性外側硬化症及び一次外側硬化症を含む運動ニューロン障害の検査のための方法であって：
（ａ）患者の試料からＤＮＡを抽出する；
（ｂ）前記ＤＮＡを前記のプライマーにより増幅させる；
（ｃ）この増幅したＤＮＡをＳＣＣＰにかける；
（ｄ）このゲルをオートラジオグラフィーにかける；そして
（ｅ）運動ニューロン障害の有無を検出する；
工程を含んで成る方法に関する。

工程（ｃ）及び（ｄ）はＢｓｒＩ酵素もしくは遺伝子間の相違又は遺伝子における誤対合を特異的に認識できるその他の酵素による消化の工程又は配列決定の工程に置き換えてよい。

本発明は更に、脊髄筋萎縮を検査するための方法であって、
（ａ）患者の試料からＤＮＡを抽出する；
（ｂ）前記ＤＮＡを、ストリンジェンシー条件において図４及び５又は図２及び３のＤＮＡ配列全体又はその一部を含んで成るＤＮＡプローブとハイブリダイズさせる；そして
（ｃ）形成された可能性のあるハイブリドを検出する；
ことを含んで成る方法に関する。

本発明は更に、先天性多発性関節拘縮症（ＡＭＣ）を検査するための方法であって：
（ａ）患者の試料からＤＮＡを抽出する；
（ｂ）前記ＤＮＡをＳＭＮ遺伝子のエクソン７又はエクソン８由来の未ラベルプライマーを用いるＰＣＲを介して増幅させる；
（ｃ）この増幅させたＤＮＡをＳＣＣＰにかける；
（ｄ）このゲルをオートラジオグラフィーにかける；そして
（ｅ）先天性多発性関節拘縮症の有無を検出する；
工程を含んで成る方法に関する。

先天性多発性関節拘縮症を検査するための更なる別の方法は、ＰＣＲ増幅後にゲノタイプ用マーカーＣ２７２及びＣ２１２を用いるジヌクレオチド反復多形態分析を考慮する。

本発明は更に図１のタンパク質、図１０のタンパク質及び図１５のタンパク質に対して誘導したポリクローナル抗血清又はモノクローナル抗体を考慮する。

本発明の別の観点はＳＭＡを検査するためのプローブ並びに動物又は生体におけるＳＭＮ遺伝子運動ニューロンに関連する遺伝子を同定及びクローニングするためのプローブとしてＳＭＮの全又は部分ヌクレオチド配列の利用に向けられている。

本発明の更なる別の観点は、ポリクローナル及びモノクローナル抗体を製造するためのＳＭＡタンパク質の利用にあり、その抗体はＳＭＡを検査及び診断するのに利用できうる。

別の観点において、図１，１０及び１５のアミノ酸配列（アミノ酸末端及びカルボキシ末端を含む）に対応する合成ペプチドに対するポリクローナルウサギ抗血清を作った。

従って、その方法の一の観点において、本発明はＳＭＡ又はＡＭＳ，ＡＬＳ及びＰＬＳの如くの関連の運動ニューロン障害を有する患者におけるＳＭＡの検査に関する。

本発明の更なる別の観点は、ＳＭＮ遺伝子もしくはその一部、ｃＤＮＡ又はオリゴヌクレオチドを、かかる遺伝子を欠くか、又はかかる遺伝子が遺伝子的に欠陥となっている患者に、そのまま、又は操作したウィルスもしくはベクターに組込んでから投与することにある。

本発明のこれら及びその他の観点を本発明の好適な態様において以下に詳しく説明する。

本明細書で用いる語「contig」とは、重複するヌクレオチド配列を意味する。

リンケージ分析による従来の研究は、脊髄筋萎縮の３種の形態が全て５ｑ１１．２−ｑ１３．３に位置することを示す(L.M.Brzustowiczら、Nature, 344, 540 (1990) ; J.Melkiら、Nature, 345, 823 (1990) ; J.Melkiら、Lancet, 336, 271 (1990))。その領域においてコピー反復が少ないことを示す、障害遺伝子座に広がる５ｑ１３領域の酵母人工染色体（ＹＡＣ）contigを、構築した。２０１ＳＭＡ家族におけるＹＡＣcontig（Ｃ２１２，Ｃ２１７及びＣ１６１）に由来するマーカーにより検出される最も近い遺伝子座においてアレル・セグレゲーションが分析された。これらのマーカーは５ｑ１３領域上の２つの遺伝子座（Ｃ２１２，Ｃ２７２）又は３つの遺伝子座（Ｃ１６１）を示した。固有及び de novo欠失が９人の無縁のＳＭＡ患者において認められた。更に、研究した遺伝子座についてのめざましいヘテロ接合欠損の観察により、Ｉ型のＳＭＡ患者の１８％以上において欠損があることが強く裏付けられた。これらの結果は、欠損現象がＳＭＡの重症な形態に系統的に係っていることを示唆した。

ＹＡＣcontigに由来する全ての多形態ＤＮＡマーカーを研究することにより、最小のリアレンジメントは、Ｃ１６１及びＣ２１２−Ｃ２７２により検出される遺伝子座に接しており、且つ全体的に１．２−ＭｂＹＡＣクローン９０３Ｄ１に含まれている領域内で認められた。例えば、フランス特許出願第９４０６８５６を参照のこと。

本発明は、ＳＭＡ患者における遺伝子的及び物理的地図化の組合せにより、約１４０kbの小さなネスト型基準ＳＭＡ領域を特徴とする。この領域はＳＭＡ遺伝子についての適正な位置決定を提供し、従って、候補遺伝子についてサーチする一定の領域を提供する。本発明は５ｑ１３領域由来の二本鎖遺伝子を同定した。その一方（テロマー遺伝子）はこの基準領域内にある。更に、この遺伝子は２３０人のＳＭＡ患者のうちの２１３人（９２．２％）において欠失しているか、又は２３０人のうちの１３人（５．６％）において分断されている。テロマー遺伝子が欠失していない又は分断されていない患者において、生存運動ニューロン（ＳＭＮ）遺伝子と呼ばれるこのテロマー遺伝子が示唆する有害な突然変異は、染色体５ＳＭＡ決定遺伝子である。

ＳＭＮ遺伝子は、制限地図化、サザンブロットによるＥ^Tel からＥ^Cen の区別、並びに遺伝子的及び物理的地図化によるＳＭＡ患者におけるＥ^Tel 間の相違の決定の複合系を用いて発見した。ＳＭＮ遺伝子の位置を確認した後、このテロマー要素の基準領域に広がるファージcontigを、ＳＭＮ遺伝子を含む特定のクローンを同定するために構築した。

正常の患者のＳＭＮ遺伝子と比べたＳＭＡ患者におけるＳＭＮ遺伝子の分析は、ＳＭＡ患者の９８％においてＳＭＮ遺伝子が欠失しているかもしくはトランケートされている、又は正常のコントロール患者において存在しない組合せ突然変異を有することを示した。

５ｑ１３領域の大きな反転二量化及び複雑なゲノム統合を同定するため、ＹＡＣcontigのパルプ・フィールド・ゲル電気泳動（ＰＧＦＥ）を利用し、長レンジ制限地図化を行った。

ＹＡＣはそのハロタイプを、ヒトドナーのそれと、多形態遺伝子座検出されたマーカーＣ２１２，Ｃ２７２，Ｃ１７１及びＣ１６１において比較することにより順序立てた（図６）。

制限酵素ＳａｃII，ＢｓｓＨII，ＳｆｉＩ，ＥａｇＩ及びＸｈｏＩを、マーカーＣ２１２，Ｃ２７２，Ｃ１７１及びＣ１６１により検出されたテロマー遺伝子座を含むＹＡＣ（ＹＡＣクローン５９５Ｃ１１）、これらのマーカーにより検出されたセントロマー遺伝子座（ＹＡＣクローン１２１Ｂ８，７５９Ａ３，２７８Ｇ７）、又はその両者（ＹＡＣクローン９０３Ｄ１及び９２０（ａ）を消化するために用いた。ＹＡＣ５９５Ｃ１１，１２１Ｂ８及び９０３Ｄ１のラムダファージライブラリーを構築し、そしてマーカーＣ２１２（ｐ３２２），Ｃ２７２（１３２ＳＥ１１），Ｃ１６１（Ｈｅ３）、ＡＦＭ１５７ｘｄ１０（１３１ｘｂ４）及びＣＭＳ１（ｐ１１Ｍ１）を含むファージ由来のサブクローンをＰＦＧＥ分析のためのプローブとして用いた。図７は、プローブ１３２ＳＥ１１，１１Ｐ１及びＰ３２２が２つの遺伝子座を示し、そしてプローブＨｅ３がＹＡＣcontig上で４つの遺伝子座を示し、そしてプローブ１３１ｘｂ４が５ｐ及び５ｑ１３上の複数の遺伝子座を示すことを示した。その制限地図（図８）は、５ｑ１３領域が、テロマー及びセントロマー要素のそれぞれについてのＥ^Tel 及びＥ^Con と呼ばれる少なくとも５００kbの要素（Ｅ）の大きな反転二量体を含むことを示した。

ＳＭＡ及びコントロール個体のＰＦＧＥ分析は、制限フラグメントの多様性の度合いの高さを示し、これはＥ^Tel からＥ^Cen の区別及びＳＭＡ患者における異常な制限フラグメントの認識を妨げた。

Ｅ^Tel とＥ^Cen とを区別するため、サザンブロット分析を行った。このサザンブロットはSambrookら、前掲に記載の方法により実施した。

より詳しくは、ＹＡＣクローン、コントロール及びＳＭＡ患者由来のＤＮＡを、サザンブロッティングのために制限酵素ＳａｃＩ，ＫｐｎＩ，ＭｓｐＩ，ＰｓｔＩ，ＰｖｕII，ＥｃｏＲＩ，ＨｉｎｄIII ，ＢｇｌII及びＸｂａＩで消化し、そしてプローブとしてクローン１３２ＳＥ１１，１１ｐ１，Ｈｅ３，１３１ｘｂ４及びｐ３２２を用いてハイブリダイズさせた。１２，１１及び３．７kbの３本のＨｉｎｄIII 制限フラグメントがプローブＨｅ３により検出された。１２kbのＨｉｎｄIII 制限フラグメントはＹＡＣクローン７５４Ｈ５及び７５９Ａ３において検出され、このフラグメントがＥ^Cen におけるほとんどのセントロマー遺伝子座に対応することを示唆した。反対に、１１kbのＨｉｎｄIII フラグメントがＹＡＣクローン５９５Ｃ１１，９０３Ｄ１及び９２０Ｃ９において検出され、このフラグメントがＥ^Tel 上の一の遺伝子座に対応することを示唆した。最後に、３．７kbのＨｉｎｄIII フラグメントがＥ^Tel 又はＥ^Cen のいずれかを含む非重複ＹＡＣにおいて認められ、このフラグメントが２種類の遺伝子座に対応することを示唆した。同様の結果がＳａｃＩ及びＫｐｎＩで得られた。Ｈｅ３により検出される３つの制限フラグメントが単染色体ハイブリドＨＨＷ１０５／ Carlock, L.R.ら、Am.J.of Human Genet. 1985, Vol.37, p839)上及び３０人の無縁の健康な個体において認められ、これらのフラグメントが多形性によるものでないことを確証せしめた。サザン分析の結果は、コントロール及びＳＭＡ患者の両者においてＥ^Tel からＥ^Cen を区別することを可能とした。

従って、Ｅ^Tel からＥ^Cen を区別した後、ＳＭＡ患者におけるＥ^Tel と正常コントロールのそれとの間の相違を決定する必要があった。これは遺伝子的及び物理的地図化によって行った。この遺伝子的及び物理的地図化はＳＭＡ患者のＥ^Tel のテロマー要素におけるゲノムのリアレンジメントと同定せしめた。

２０１人のＳＭＡ患者のうちの９人（９／２０１）が一の突然変異染色体上に、マーカーＣ２１２及びＣ２７２により検出される１又は２つの遺伝子座のいづれかを包括する大スケール欠損を示すことを示した(J.Melkiら、Science , 264, 1474 (1994)) 。一方、血族関係にある親から生まれた３０人の患者のうちの２２人（２２／３０）（そのうち、１４人のうちの１３人（１３／１４）がＩ型であり、そして１０人のうち９人（９／１０）が III型ＳＭＡである）が、最も近くに隣接する多形性マーカーについての遺伝によりホモ接合性であった。

大スケール欠損を有する９人の患者及び遺伝によりホモ接合性を示す２２人の血族関係にある親のゲノムＤＮＡをサザンブロッティングのためにＨｉｎｄIII で消化し、そしてプローブＨｅ３とハイブリダイズさせた。プローブＨｅ３により示される１１kbのフラグメントは１３人の血族関係にあるＩ型の親１３人のうちの１２人（１２／１３）になかった。１２人のうちの２人において（２／１２）、その欠損は３．７kbのフラグメントも含んでいた。一方、８人の血族関係にある III型の親のうちの１人（１／８）においてのみ、１１kbのフラグメントがなかった。これと一致して、一の突然変異染色体上に大スケール欠損を有する９人の患者のうちの４人（４／９）において１１kbのＨｉｎｄIII フラグメントがなかった。特に注目されるのは、マーカーＣ２１２及びＣ２７２により検出される２つの遺伝子座のうちの一つの欠損を有する患者における１１kbのフラグメントのなさである。

一緒に分析したとき、これらの観察はＳＭＡ患者におけるＥ^Tel のゲノムアレンジメントについての証拠を提供し、そして１１kbのＨｉｎｄIII フラグメントにより示される遺伝子座に対するＳＭＡ遺伝子のセントロマー位置を裏付けし、なぜなら１人を除く全ての血族関係にある III型患者がこの遺伝子座について欠失していなかったからである。

この障害におけるゲノムリアレンジメントのセントロマー境界を特性決定するため、血族関係にあるＳＭＡ患者におけるマーカーＣ２７２により検出される遺伝子座においてアレルセグレーションを分析した。血族関係にあるＳＭＡＩ型患者は全て一のＰＣＲ増幅生成物を有し、それに比べて６０人のコントロールでは０人であった。このめざましいヘテロ接合欠損はＣ２７２により検出される２つの遺伝子座のうちの一方の欠損に基づき、それはこのマーカーの近くを地図化するプローブ１３２ＳＥ１１を有する遺伝子量のめざましい低下により示される。一方、９人の血族関係にある III型ＳＭＡ患者のうちの７人が両親から遺伝されたＣ２７２増幅生成物を有し、マーカー２７２により検出される各座においてのホモ接合性を示唆する。更に、プローブ１３２ＳＥ１１では遺伝子量効果は認められず、 III型の血族関係にある患者におけるＣ２７２により検出される遺伝子座に係る欠損のなさを示唆する。

３種のＳＭＡの全てにおいて同一の遺伝子座が係っていると仮定して、これらの結果は、この障害を及ぼす遺伝子がＣ２７２により検出されるテロマー遺伝子座から離れていることを示唆する。

これらの研究は、ＳＭＡ遺伝子を、マーカーＣ２７２及びＨｅ３により検出されるテロマー遺伝子座の間（１１kbのＨｉｎｄIII フラグメント）にあるテロマー要素Ｅ^Tel 内に位置決めする。ＹＡＣcontigのＰＧＦＥを用いる長レンジ制限地図化に基づき、この基準領域はＹＡＣクローン９０３Ｄ１の１４０kbのＳａｃIIフラグメント（又はＹＡＣクローン９２０Ｄ９の１５０kbのＳａｃIIフラグメント）内に全体的に含まれている。

ＳＭＮ遺伝子が１４０kbのＳａｃIIフラグメント上にあることを確認後、テロマー要素の基準領域に広がるファージcontigをＳＭＮ遺伝子の同定及び特性決定のために構築した。

マーカーＣ２１２，Ｃ２７２，Ｃ１７１及びＣ１６１を含むファージクローンをＹＡＣクローン５９５Ｃ１１及び９０３Ｄ１から構築したλファージライブラリーより単離し、そして二方向歩行(bidirectional walking) のための出発点として使用した。マーカーＣ２１２，Ｃ２７２及びＣ１７１のまわりのファージcontig（６０kb）をファージクローンの制限地図に基づいて構築した（図８）。

contigの中の遺伝子を同定するため、以下の３段階手法を利用した；
１）種間保存配列についてのサーチを行う；
２）エクソン・トラッピング法を行う；及び
３）直接ｃＤＮＡ選択を行う。マーカーＣ２７２を含むファージに由来するゲノムプローブ１３２ＳＥ１１は、ハムスターＤＮＡと陽性ハイブリダイゼーションシグナルを供し、種間保存配列の存在を示唆した。プローブ１３２ＳＥ１１によるλｇｔ１０ヒト胎児脳ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングは、１．６kbp にわたって広がる７つの重複λクローンの選択をもたらした。クローンの配列分析は、８８２bpのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）及び５８０bpの非コード領域を示した。１．５kbp のクローン（ＢＣＤ５４１）はコード配列全体及び３′非コード領域のほとんどを含んでいた。ｃＤＮＡの３′末端とそのポリ（Ａ) ⁺ テールをリンホブラストイド細胞系ｃＤＮＡライブラリーのＰＣＲ増幅により獲得した。

２つのｃＤＮＡクローンは６６１〜７５５のヌクレオチドを欠き、別のスプライシングが生じうることを示唆する。心臓、脳、肝臓、筋肉、肺、腎臓及び膵臓を含む様々な組織由来のポリ（Ａ) ⁺ ＲＮＡのノーザンブロット分析は、幅広く実現される１．７kbの転写体の存在を示した。ＯＲＦは約３２kDの推定分子量の２９４個のアミノ酸の推定タンパク質をコードする。

ＦＡＳＴＡ及びＢＬＡＳＴネットワークを使用する相同性サーチでは、ヌクレオチドレベルでもアミノ酸レベルでも相同性を全く検出できなかった。

５ｑ１３領域においてＢＣＤ５４１遺伝子の任意の重複があるかを更に調べるため、ＢＣＤ５４１ｃＤＮＡを、障害遺伝子座に広がるＹＡＣクローンのサザンブロット及びＰＦＧＥ分析のためのプローブとして用いた。

Ｅ^Cen のみ（ＹＡＣクローン７５９Ａ３，１２１Ｂ８及び２７８Ｇ７）又はＥ^Tel のみ（ＹＡＣクローン５９５Ｃ１１）のいづれかを含む非重複ＹＡＣとの特異的なハイブリダイゼーションは、ＢＣＤ５４１遺伝子の二量化についての証拠を担う。各遺伝子は約２０kbを占め、そして同一の制限パターンを示す。２つの遺伝子のヘッド間配方についての証拠は、Ｅ^Cen 又はＥ^Tel のいづれかを含む非重複ＹＡＣクローンのＳａｃII及びＥａｇＩ制限部位の位置決定、それに続く各要素のＳａｃII及びＥａｇＩ部位に隣接するプローブＢＣＤ５４１及びｐ３２２によるハイブリダイゼーション実験に由来する。

ＢＣＤ５４１遺伝子の２つのコピーにおける相違を探すため、テロマー遺伝子の統合を特性決定し、そしてセントロマー対応物のそれと比較した。ゲノム配列分析は、テロマーＢＣＤ５４１遺伝子が８のエクソンより成ることを示した（図４及び５）。しかしながら、従来から公知であったエクソン２は図１２及び１３に示す追加のイントロンにより分割された２つのエクソンより成ることがこの度わかり、従って、ＳＭＮ遺伝子は９つのエクソンより成る。

セントロマー又はテロマー遺伝子座（ＹＡＣクローン１２１Ｂ８及び５９５Ｃ１１のそれぞれ）のいづれから出発して、各エクソン及びその隣接領域のＰＣＲ−増幅及び配列は、セントロマーとテロマーＢＣＤ５４１遺伝子間で５つの相違を示した。最初のものはテロマー（ＴＴＣ）又はセントロマーＢＣＤ５４１遺伝子（ＴＴＴ）に特異的なエクソン７（コドン２８０）における保存性置換である。第二のものは、３′非コード領域に位置し（エクソン８、ヌクレオチドｎ°１１５５）、テロマー（ＴＧＧ）又はセントロマーＢＣＤ５４１遺伝子（ＴＧＡ）に特異的である。第６及び７番目イントロンにおいて３つの更なる塩基置換が認められた。

両遺伝子座を含むＹＡＣクローン（ＹＡＣクローン９２０Ｃ９）又は単染色体ハイブリドＨＨＷ１０５のいづれかの上の各エクソン（エクソン７及び８）の両バージョンの観察は、これらの置換がアレルでもなく、多形性に基づくものでもないことを示した。増幅させたエクソン７及び８のＳＳＣＰ分析に基づくバンドシフトは、コントロール及びＳＭＡ患者の両者におけるテロマー（Ｔ−ＢＣＤ５４１）及びセントロマー遺伝子（Ｃ−ＢＣＤ５４１）の容易なる識別を可能にする。試験した無縁の健康コントロール全員（ｎ＝７５）がエクソン７及び８のＳＳＣＰ分析による決定に従い、Ｔ−ＢＣＤ５４１遺伝子を有していた（１００％）。そのほとんど（８９．３％）がＣ−ＢＣＤ５４１遺伝子も有していたが、７５人のうちの８人（１０．７％）がＣ−ＢＣＤ５４１を欠いていた。

ゲノムＤＮＡのＰＣＲ−増幅の後に、ＳＳＣＰ法によりエクソン７及び８において検出される単塩基置換について全部で２３０人のＳＭＡ患者を試験した。そのうち、１０３人がＩ型に、９１人がII型に、そして３６人が III型に属した。興味深いことに、２３０人のＳＭＡ患者のうちの２１３人（９２．６％）が両突然変異染色体上にＴ−ＢＣＤ５４１遺伝子を欠き、それに比して７５人のコントロールではそれは０であった（０％）。更に、２３０人のＳＭＡ患者のうちの１３人（５．６％）が両突然変異染色体上のエクソン７についてのＴ−ＢＣＤ５４１遺伝子を欠き、しかしエクソン８についてのＴ−ＢＣＤ５４１遺伝子は保持しており、それに比して７５人のコントロールではそれは０であった（０％）。最後に、２３０人のＳＭＡ患者のうちの４人（１．７％）がエクソン７及び８のＳＳＣＰ分析による決定に従い、Ｔ−ＢＣＤ５４１遺伝子を有していた。

これらの結果は、ＳＭＡ患者のうちの９８％において、Ｔ−ＢＣＤ５４１遺伝子が欠いているか又はトランケートされていることを示す。更に、これらのデーターは、Ｃ２７２及びＴ−ＢＣＤ５４１遺伝子のエクソン８により検出されるテロマー遺伝子座の間に障害遺伝子が位置する見地を裏付けする。従って、ファージcontigの重複制限地図に従い、基準領域は２０kbにおいて全体的に含まれており、テロマーＢＣＤ５４１遺伝子が染色体５ＳＭＡ決定遺伝子の中にあることを示唆する。

Ｔ−ＢＣＤ５４１遺伝子がＳＭＡの原因であることを実証するため、Ｔ−ＢＣＤ５４１遺伝子のリアレンジメントが認められていない４人のＳＭＡ患者における部位突然変異をサーチした。各エクソンとその隣接領域のＰＣＲ増幅生成物の直接配列決定をこの４人の患者について行った。

イントロン６の３′スプライスアクセプター部位における７bp欠損（ポリピリミジン・トラクト）が患者ＳＡにおいて見い出せた。この欠損イントロンに隣接するエクソン７の配列分析は、Ｔ−ＢＣＤ５４１遺伝子に特異的な配列を認識せしめた。更に、同一の領域に対応する非欠損ＰＣＲ生成物はＣ−ＢＣＤ５４１に特異的な配列を有し、その他の突然変異アレルがＴ−ＢＣＤ５４１遺伝子を欠くことを示唆する。

患者ＢＩにおいては、イントロン７の５′共通スプライスドナー部位における４bpの欠損が見い出された。この欠損は隣接するエクソン７の配列分析による決定に従いＴ−ＢＣＤ５４１遺伝子上に認められた。

患者ＨＵにおいて、コドン２７２の部位突然変異（ＴＡＴ→ＴＧＴ）が認められた。この突然変異はチロシンをシステインに変えた。この患者は突然変異に関してヘテロ接合性であり、おそらくは別のアレル上に別のＳＭＡ突然変異を有している。患者ＳＡ，ＨＵ及びＢＩの全員において認められた３つの突然変異は全て、正常な１００の染色体においては検出されず、まれなる多形態の可能性を排除する。

エクソン７の様々なスプライシングは、逆転写ベースＰＣＲを利用することにより、Ｃ−ＢＣＤ５４１をＴ−ＢＣＤ５４１遺伝子から区別させた。１１人のＳＭＡ患者をノーザンブロット又は逆転写ベースＰＣＲ増幅によりその転写体の分析について選別した。そのうちの８人はＩ型に、１人はII型に、そして２人が III型に属した。ゲノムＤＮＡのＳＳＣＰ分析は、１０人の患者におけるＴ−ＢＣＤ５４１遺伝子のなさを示し、そして１人の患者（ＳＡ）はエクソン７及び８の両方についてのＣ−ＢＣＤ５４１及びＴ−ＢＣＤ５４１遺伝子を有していた。６人の無縁のコントロールであってＣ−ＢＣＤ５４１及びＴ−ＢＣＤ５４１遺伝子の両方を有する者及び２人のコントロールであってＴ−ＢＣＤ５４１遺伝子のみを有する者をこの研究に含ませた。

リンホブラストにおけるこの遺伝子の発現は、コントロール及びＳＭＡ患者に由来する細胞系におけるＢＣＤ５４１転写体の分析を可能にした。リンホブラストイド細胞系由来のＲＮＡのノーザンブロット分析は、全サンプルにおける１．７kbのｍＲＮＡの存在を示した。どのＳＭＡ患者も、サイズの変った転写体を示さなかった。４人のＩ型ＳＭＡ患者のうちの３人において、β−アクチン遺伝子の発現と比べたときに、転写レベルの低下は認められなかった。その他のＳＭＡプロバンドにとっての正常なｍＲＮＡレベルが認められた。

ノーザンブロット分析は、ＳＳＣＰ分析による決定に従いエクソン７及び８の両者についてのみのＣ−ＢＣＤ５４１遺伝子を有するＳＭＡ患者において、転写体の存在を示したため、これらの結果は、Ｃ−ＢＣＤ５４１及びＴ−ＢＣＤ５４１遺伝子が共に発現されたことを示唆する。両ＢＣＤ５４１遺伝子が発現されたかを証明するため、コントロール及びＳＭＡ患者由来のリンホブラストイド細胞系から単離したＲＮＡのＲＴ−ベースＰＣＲ増幅を利用した。エクソン７及び８に隣接するＰＣＲ生成物の直接配列決定は、Ｃ−ＢＣＤ５４１のみを有する患者がＣ−ＢＣＤ５４１遺伝子に特異的な配列を示すことを示した。Ｔ−ＢＣＤ５４１及びＣ−ＢＣＤ５４１遺伝子の両方を有するコントロールは両ＢＣＤ５４１遺伝子に対応する２種の転写体を有していた。この結果は、両遺伝子が発現されたことを確証せしめる。更に、異なる転写体をもたらすエクソン５又はエクソン７が関与する２つの別のスプライシングが観察された。エクソン５の別のスプライシングは、ｃＤＮＡクローン上の従来の配列データーを確証せしめた。

エクソン６〜８を包括するＲＴ−ＰＣＲ増幅生成物の分析は、エクソン７を保持しているスプライスされた転写体が、Ｃ−ＢＣＤ５４１及びＴ−ＢＣＤ５４１遺伝子の両者を有するコントロール並びにＴ−ＢＣＤ５４１遺伝子のみを有するコントロールにおいて存在していることを示した。逆に、エクソン７を欠く別のスプライスされた転写体は、両方の遺伝子を有するコントロールにおいては認められたが、Ｔ−ＢＣＤ５４１遺伝子のみを有するコントロールにおいては認められなかった。これらの結果は、エクソン７を欠く別のスプライスされた転写体はＣ−ＢＣＤ５４１遺伝子のみに由来することを示唆する。

Ｔ−ＢＣＤ５４１遺伝子のイントロン６の３′スプライスアクセプター部位の７bpの欠損をもつ患者ＳＡの転写体分析は、エクソン７を保持するスプライスされた転写体及びエクソン７を欠く別のスプライスされた転写体の両方の存在を示す。更に、エクソン７を保持しているスプライスされた転写体由来の増幅生成物の配列分析は、Ｃ−ＢＣＤ５４１遺伝子に特異的な配列を示した（図２及び３）。これらの結果は、患者ＳＡにおいて認められたイントロン６の７bpの欠損がＴ−ＢＣＤ５４１遺伝子のみのエクソン７の適正なスプライシングにとって有害であることを示す。更に、エクソン７の示差的なスプライシングは２ＢＣＤ５４１遺伝子の区別を可能とするため、この相違をコントロールと、ＳＡ患者を含むＳＭＡ患者との間で分析した。コントロールにおいては、エクソン７を欠く別のスプライスされた転写体の量はエクソン７を保持しているスプライスされた生成物のそれより少なかった。逆に、ＳＭＡ患者においては、エクソン７を欠く別のスプライスされた転写体の量はエクソン７を保持しているスプライスされた生成物のそれと同等又はそれより多かった。

これらの結果は、これらの遺伝子の転写レベルのでのコントロールとＳＭＡ患者との間での相違についての証拠を供する。エクソン７を欠く別のスプライスされた転写体は、タンパク質融合に影響を及ぼしうる別のＣ−末端タンパク質を有する短めのＯＲＦをもたらす。

ヒトＳＭＮ遺伝子の全体構造及び統合を更に特性決定するため、３種のゲノムクローンをＹＡＣクローン５９５Ｃ１１由来のＦＩＸIIファージライブラリーから単離し、そしてプローブとしての全長ＢＣＤ５４１ｃＤＮＡ（図２）でスクリーニングした。プローブにハイブリダイズする複数のクローンを選別後、制限地図化及びサザンブロット分析は全ＳＭＮ遺伝子に広がるファージＬ−１３２，Ｌ−５及びＬ−１３を示唆した。

これらの３つのファージクローンを更に、Sambrookら前掲に開示のMaxam-Glbert又はSangerらの配列決定法を利用して配列決定にかけた。

エクソン及びイントロンを含む全ＳＭＮ遺伝子のヌクレオチド及びアミノ酸配列を図１２及び１３に示す。ヒト遺伝子は長さ約２０kbであり、そして図１２及び１３に示すように８イントロンで分断された９つのエクソンより成る。ヒトＳＭＮ遺伝子は約３２kDA の分子量を有する。

１つのエクソン２のみがＳＭＮ遺伝子の中に存在しているものと考えられているにもかかわらず（Lefebvreら、Cell, 80：155-165 (1995)) 、配列決定データーは、Lefebvreら前掲における事前に述べられているエクソン２が、図１１並びに１２及び１３に示しているように、更なるイントロンにより２つのエクソンに分割されて成ることを証明した。エクソンの再番号付けの混乱を避けるため、エクソン２の中の２つのエクソンをエクソン２ａ及びエクソン２ｂと呼ぶ。

エクソン−イントロン境界は全てその他のヒト遺伝子において見い出せる共通配列を示し、そしてポリアデニル化共通部位は停止コドンから５５bp下流に位置する（図１２及び１３）。

ＹＡＣクローン１２１Ｂ８又は５９５Ｃ１１（これらはそれぞれＣ−ＢＣＤ５４１及びＳＭＮ遺伝子を含む：Lefebvreら、前掲を参照のこと）のいづれかから出発して、イントロンのＰＣＲ増幅及び配列分析は、従来述べられているものの他に（Lefebvreら、前掲による）ＳＭＮとＣ−ＢＣＤ５４１との間に３つの相違を示した。これらにはイントロン６における２塩基の変化（−４５bp／エクソン７、ａｔｇｔ、テロマー；ａｔａｔ、セントロマー）及びイントロン７における塩の変化（＋１００bp／エクソン７、ｔｔａａ、テロマー；ｔｔａｇ、セントロマー、及び位置＋２１４bp／エクソン７、ｔｔａｔ、テロマー；ｔｔｇｔ、セントロマー、図１２及び１３）。両遺伝子を含むＹＡＣクローン（ＹＡＣ９２０Ｃ９）における及びコントロール集団における両バージョンの存在は、これらの置換が、多形性に基づくものでなく、遺伝子座特異性であることを示す。ＰＣＲ増幅したイントロン７の一本鎖コンホメーション多形性（ＳＳＣＰ）分析に基づくバンドシフトは、ＳＭＮ及びそのセントロマー対応物（Ｃ−ＢＣＤ５４１）の容易なる識別を可能とした（図１８参照のこと）。

プロモーター機能にとって潜在的に有能な配列を同定するため、ＳＭＮ及びＣ−ＢＣＤ５４１遺伝子のエクソン１のまわりの領域の統合を特性決定した。制限地図化、サザンブロットハイブリダイゼーション及びＰＣＲ増幅に基づき、エクソン１及びＣ２７２マーカー（Ｄ５Ｆ１５０Ｓ１，Ｄ５Ｆ１５０Ｓ２）をＬ−１３２ファージの同一のＢｇｌII−ＥｃｏＲＩ制限フラグメントの上に載せた（図１１）。Ｃ２７２ｆプライマー及びエクソン１の中で選んだリバースプライマーを用いるＰＣＲ増幅を行い、そして増幅生成物を直接配列決定した。配列分析は、Ｃ２７２マーカーに対応する（ＣＡ）リピートが推定ＡＴＧ翻訳開始部位から４６３bp上流に位置することを示した（図１４）。対比配列分析は、ＳＭＮ遺伝子の５′末端とそのセントロマー対応物（Ｃ−ＢＣＤ５４１）との間に相違がないことを示した。更に、配列分析は以下の転写因子にとっての推定結合部位の存在を示した：ＡＰ−２，ＧＨ−ＣＳＥ２，ＤＴＦ−１，Ｅ４ＦＩ，ＨｉＮＦ−Ａ，Ｈ４ＴＦ−１，β−ＩＦＮ，ＳｐＩ（図１４；Faisstら、Nucleic Acids Res., 20：3-26 (1992))。

ヒトＳＭＮ遺伝子の単離及び特定決定の他に、ＳＭＮ遺伝子のマウス同族体もクローニングした。ヒトＳＭＮ遺伝子とげっ歯類との交差種保存性がLefebvreら前掲に示され、そしてマウスＳＭＮ遺伝子の単離に役立った。プローブとしてヒトＳＭＮｃＤＮＡを利用するマウス胎児ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングは、２つの重複するマウスｃＤＮＡクローンの単離を可能にした。クローンの配列分析は、８６４bpのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を示した（図１５）。ＯＲＦは、ヒトＳＭＮアミノ酸配列と８３％の相同性を有する（図１６）２８８個のアミノ酸の推定タンパク質（図１５）をコードする。

単離されたヒト又はマウスのＳＭＮのいづれであろうと、その遺伝子はｐＵＣ１８，ｐＢｒ３２２，ｐＵＣ１００，λｇＨＩ，λ１８−２３，λＺＡＰ，λＯＲＦ８等の如くの様々なプラスミドに挿入できる。遺伝子を別のプラスミドベクターに挿入するための方法はSambrookら前掲に記載されている。様々な微生物が、ベクターを形質転換させてＳＭＮ遺伝子を生成するのに使用できる。例えば、宿主微生物には、限定することなく、酵母、ＣＨＯ細胞、Ｅ．コリ、バチルス・スブチリス等が含まれる。

一旦組換えたら、ヒトＳＭＮタンパク質又はマウスＳＭＮタンパク質は当業界公知の方法により宿主培養物から更に精製できる。

ＳＭＮタンパク質を組換的に生成する他に、本発明はポリクローナル及びモノクローナル抗体を製造することに関連する。これらの方法はSambrookら、前掲により明示されている通り、当業界に公知である。モノクローナル抗体は Kohler and Milstein, Nature, 256 : 495 (1975)；Eur.J.Immunol., 6 : 511 (1976)又はHarlow and Lane Antibodies, a Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1988)の手順により獲得でき、そして、例えばＳＭＡ及びその他の運動ニューロン障害の診断に利用できる。

ポリクローナルウサギ抗血清もアミノ末端及びカルボキシ末端を含むＳＭＮアミノ酸配列の任意の部分に対応する合成ペプチドに対して作製されうる。より詳しくは、以下のペプチドが図１に記載のアミノ酸に基づいて合成できる：

この合成ペプチドはキーホール・リンペット・ヘモシアニン（ＫＬＨ）の如くの担体タンパク質に、所望の配列に合成付加できうるアミノ−又はカルボキシ−人工システイン残基を介して複合させることができうる。システイン残基をその合成ペプチドを担体タンパク質に複合させるリンカーとして使用してよい。合成ペプチドをＫＬＨに複合するのに用いる手順は Greenら Cell, 28：477 (1982)に記載されている。

約５０〜１００μｇ、好ましくは１００μｇの合成抗原をバッファーの中に溶かし、そして等容量のフロインドの完全アジュバントで乳化させる。約０．０２５ml〜０．５mlの乳化抗原アジュバントをウサギに筋肉内的又は皮内的に注射できる。４〜６週間後に、そのウサギをブーストにかけ、そして各ブースター注射の７〜１０日後に２０〜４０mlの血液を採血する。次いでその血清をＲＩＡ，ＥＬＩＳＡ又は免疫沈殿を用いて抗原の存在について試験する。陽性抗体画分は例えばGoudswaaldら Scand.J.Immunol. 8：21 (1978) の方法に従い、プロテインＡに対する吸着によって精製できる。

より詳しくは、上記の組換技術によって調製した抗原又は合成的に作った抗原約２０〜５０μｇを約１００mlのバッファーの中に希釈し、そして等量のフロインドの完全アジュバントを乳化させる。約３０〜６０、好ましくは５０μｌの乳化抗原−アジュバントをマウスに４箇所において皮下注射する。４〜６週後、そのマウスを５〜１０μｇの抗原を含む約１００μｌのバッファーの腹腔内注射によりブーストにかける。このマウスをブースター注射の７〜１０日後に中尾静脈から採血し、そしてその血清を標準の方法を利用して試験した。次いで血液を抗体力価が低下するまで３〜４日毎に採血した。

上記のモノクローナル又はポリクローナル抗体を用いてＳＭＡ障害を検査するのに、ウェスタンブロット（１又は２次元）又はＥＬＩＳＡにより、組織、血漿、血清、脊髄流体等を利用してよい。これらの方法は当業界に公知であり、そしてSambrookら、前掲に記載されている。

運動ニューロン障害を有する可能性のあるＳＭＡ並びにＡＬＳ、ＡＣＭ及びＰＬＳ患者の検査のための方法も本発明に含まれる。この方法は、ＳＭＡを有すると予測される患者の試料からＤＮＡを抽出することを含む。この試料は血清、血漿、脊髄流体等であってよい。当業界に公知の方法によりＤＮＡを抽出した後、ＳＭＮ遺伝子のエクソン７及び８由来のプライマーをそのＤＮＡの増幅のために用いる。

プライマーによる増幅後、増幅生成物をＳＳＣＰ（一本鎖コンホメーション多形性）に委ねる。

次いでゲルをオートラジオグラフィーにかけ、ＳＭＡが試料中に存在しているかを調べる。

より詳しくは、ＳＭＡに係る先天性多発性関節拘縮症（ＡＭＣ）の１２例において、１２人の患者のうちの６人がＳＭＮ遺伝子を欠くことが発見された。

様々な地理上の起源の８人の男性及び４人の女性を含む全部で１２人無縁の患者を研究のために選んだ。これらの患者は、彼らが以下に該当することの基準に基づいて選んだ：
（１）身体の少なくとも２箇所の領域の先天的関節拘縮（Stern , JAMA, 81：1507-1510 (1923)参照のこと）；
（２）筋肉萎縮及び眼球外振幅のない反射消失を伴う全身筋肉虚弱化；
（３）筋電図が脱神経及び低下した運動活動電位振幅を示す；並びに
（４）貯蔵物質又はその他の構造的異常の徴候のない脱神経を一貫して伴う筋肉生検(Munstat, Neuromuscular Disorders , 1 : 81 (1991))。

この研究は、１２人の患者の末梢血液白血球、リンホブラストイド細胞系又は筋肉組織から抽出したＤＮＡに基づくジヌクレオチド・リピート・ポリモルフィズム・分析及びＳＭＮ遺伝子分析（実施例参照のこと）より成る。

この研究由来のデーターを以降の表１にまとめる。

診断は、ひどい緊張低下、眼球外運動を除く動きのなさ及び少なくとも２箇所の関節での拘縮を特徴とする不均一な表現型を誕生時に行った。冒された関節及びひどい体位性欠陥の数は子供間で異なり、それを表１に示す。低下した胎児の運動は１２人の患者のうちの７人（７／１２）において認められた。新生児の呼吸困難は１２人の患者のうち９人（９／１２）に見い出され、小顎症に係る顔面麻痺は１２人の患者のうち４人（４／１２）において認められた。ほとんどの場合、１２人のうちの８人（８／１２）が生後１ヶ月以内で死亡した。４人の新生児はまで生存している。子供及び父親が冒されており、ＡＭＣの常染色体優勢形態が示唆される家族１２を除き、家族歴はなかった。

表１は、１２人の患者のうちの６人（６／１２）（症例１〜６）における両突然変異染色体上でＳＭＮ遺伝子が欠損していることを示す。そのうち、６人の患者のうちの３人（３／６）が一方の親アレル上のマーカーＣ２１２及びＣ２７２により検出される両遺伝子座に係る大きな遺伝的欠損を有し、他方の親アレルは図１７に示している通り、予測の２つでなく１つの遺伝子のみを有する。

ＳＭＮエクソンの分析はＳＭＮ遺伝子が欠損を示さない患者において遺伝子内突然変異を示さない（症例７〜１２）。遺伝子分析は、家族における障害遺伝子（症例９）が染色体５ｑ１３に連結されていないことを示し、なぜなら冒された及び健康な子孫の両者が同一の５ｑ１３ハロタイプを有するからである。これらのデーターは、ＳＭＮ遺伝子が欠損を示さない患者の遺伝子が５ｑ１３ＳＭＡ遺伝子座と連結していないことを強く裏付ける（症例７〜１２）。

現在まで、関節拘縮症はＳＭＡ専用の基準として認められている（Munsat, 前掲）。しかし、１２人の患者のうちの６人（６／１２）におけるＳＭＮ遺伝子の欠損の観察は、神経原性起源の関節拘縮症がＳＭＡに関連し、そしてこのサブグループ及びＳＭＡがアレル障害であることを強く示唆する。しかし、神経原性のＡＭＣは遺伝的に異種の症状であり、なぜなら障害遺伝子は１２人の患者のうちの６人（６／１２）におけるＳＭＮ遺伝子座に連結していなかったからである。染色体５ｑの排除もLuntら、J.Med.Genet. 29 : 273(要約)(1992) に記載の通り、２人のＡＭＣ−ＳＭＡ患者を有する一の家族において示された。

従って、ジヌクレオチド・リピート・ポリモルフィズム・分析及びＳＭＮ遺伝分析により、ＡＭＣの臨床診断はＳＭＮ遺伝子のなさ又は分断により確認できた。本発明は生存患者又は子宮内のいづれかのＡＭＣを検査する方法を提供する。

本発明の更なる別の態様は、図４及び５、図１２及び１３に示すヌクレオチド配列又は図１５のマウスＳＭＡに基づく特異的なオリゴヌクレオチドプローブを用いるＳＭＡの検査にある。もし患者が総合的にＳＭＮ遺伝子を欠くなら、特異的なプローブとのハイブリダイゼーションは起こらない。ハイブリダイゼーション条件は使用する試料のタイプに依存して変わりうる。かかるハイブリダイゼーション分析は、当業界に公知であり、且つSambrookら前提に記載のストリンジェンシー条件下で行うことが好ましい。このオリゴヌクレオチドプローブは酵素、放射能等の如くのあらゆる手段でラベルできうる。ラジオラベル化プローブを利用することが好ましい。

本発明の別の態様において、ヒトＳＭＮ遺伝子はＳＭＡ又は関連の運動ニューロン障害に苦しむ患者に直接インビボ投与するための、又は骨髄細胞、上皮細胞、線維芽細胞にインビトロ投与し、次いで患者に投与するためのウィルス又は非ウィルスベクターと一緒に利用できうる。例えば Resenfeldら、Science (1991) 252 、頁 431〜434 を参照のこと。

本発明は胎児におけるＳＭＮ遺伝子の欠陥又はＳＭＮ遺伝子全体の欠失を検査する方法を提供する。妊婦から採取した羊水を本発明に係る方法に従ってＳＳＣＰ分析にかける。

実施例１
１２１Ｂ８，５９５Ｃ１１及び９０３Ｄ１ＹＡＣクローンからのファージライブラリーの構築。
Ｃ２１２，Ｃ２７２及びＣ１６１により検出されるテロマー遺伝子座を含むＹＡＣクローン５９５Ｃ１１、又はこれらのマーカーにより検出されるセントロマー遺伝子座を含むＹＡＣクローン１２１Ｂ８、又は両遺伝子座を含む９０３Ｄ１ＹＡＣクローンからの全酵母ＤＮＡを精製し、そしてＳａｕ３Ａで部分消化した。１２〜２３kbのサイズ範囲のＤＮＡを０．５％のSeaplaque ＧＴＧアガロースゲル電気泳動後に切り出し、そしてβ−アガロース消化後にエタノールで沈殿させた。Ｓａｕ３Ａ部位の部分フィル・インの後、ＤＮＡをバクテリオファージＦＩＸ III（Stratagene）の部分的に補完したＸｈｏＩ部位において、サブクローニングした。マイクロサテライトＤＮＡマーカーＣ２１２（Ｌ−５１），Ｃ２７２（Ｌ−５１，Ｌ−１３２），Ｃ１７１（Ｌ−５，Ｌ−１３），Ｃ１６１（５９５Ｂ１）、１１Ｍ１（Ｌ−１１），ＡＦＭ５７ｘｄ１０（Ｌ−１３１）を含むλクローンをＥｃｓＲＩもしくはＨｉｎｄIII のいづれか又はその両者で消化し、そしてｐＵＣ１８プラスミドベクターの中にサブクローニングした。マーカーＣ２１２（ｐ３２２），Ｃ２７２（１３２ＳＥ１１），Ｃ１６１（Ｈｅ３），ＡＦＭ５７ｘｄ１０（１３１ｘｂ４）及びＣＭＳ１（ｐ１１Ｍ１）を含むファージ由来のサブクローンをプローブとして用いた。

実施例２
パルス・フィールド・ゲル電気泳動分析
高分子量のＤＮＡを、上記の通りコントロール及び患者から樹立したEpstein-Barrウィルス形質転換リンホブラストイド細胞系又はＹＡＣクローンから、アガロースプラグにおいて単離した。プラグを１０〜２０min.vol.づつのＴＥで３０分、２回すすいだ。このプラグを、０．１mg／mlのＢＳＡ(Pharmacia) を含む０．３mlの適当な制限酵素バッファーで４℃で３０分平衡にした。次いで過剰のバッファーを除き、そしてプラグを一回の反応当り４０Ｕの制限酵素で１６ｈ適温でインキュベートした。ＤＮＡを制限酵素ＢｓｓＨII，ＥａｇＩ，ＳｆｉＩ，ＳａｃＩ，ＫｐｎＩ，ＳａｃII，ＳｐｅＩで消化した。ＤＮＡフラグメントの分離はＣＨＥＦ− III−ＤＲＰＧＦＥ装置（Biorad) を用いて行った。５０〜１２００kbのフラグメントを１％のアガロースSeakemを通じて、２００Ｖ、２４ｈ、１４℃で、３０〜７０分のランピングパルス時間を用い、０．５×ＴＢＥランニングバッファーで電気泳動させることにより分離した。５〜１００kbのフラグメントの分離は２００Ｖ、１９ｈ、１４℃で、５−２０分のランピングパルス時間を用い、０．５×ＴＢＥバッファーで電気泳動させることにより行った。０．２５ＮのＨＣｌで２０分処理した後、パルスにかけたフィールドゲルを０．４ＭのＮａＯＨ、０．４ＭのＮａＣｌの中で２０ｈかけて Hybond N+ Nylon膜 (Amersham) にブロットした。プローブを順に同じフィルターにハイブリダイズして正確なデーターを確実なものとした。ハイブリダイゼーションは上記の通りに実施した。

実施例３
ＹＡＣライブラリースクリーニング
ＣＥＰＨからのＹＡＣライブラリーをマイクロサテライトＣ２１２，Ｃ２７２，Ｃ１７１，ＣＭＳ１及びＣ１６１によるＰＣＲによりスクリーニングした。ＹＡＣゲノタイプを変性ポリアクリルアミドゲル上でのＰＣＲ生成物の電気泳動により樹立した。ＹＡＣのサイズはパルス・フィールド・ゲル電気泳動により推定した。

実施例４
サザンブロット分析
ＤＮＡサンプルを末梢血液白血球又はリンホブラストイド細胞系のいづれかから抽出した。ＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩ，ＨｉｎｄIII ，ＢｇｌII，ＸｂａＩ，ＰｖｕII，ＸｍｎＩ，ＲｓａＩ，ＰｓｔＩ，ＢａｍＨＩにより消化し、サザンブロッティングのために０．８％のアガロースゲルで電気泳動することにより分離し、そして放射性ラベルプローブとハイブリダイズさせた。

実施例５
ジヌクレオチド・リピート・多形性
ゲノタイプデーターをＣ２１２（Ｄ５Ｆ１４９Ｓ１，−Ｓ２），Ｃ２７２（ＤＦ５１５０Ｓ１，−Ｓ２）及びＣ１６１（ＤＦ５１５３Ｓ１，−Ｓ２）ジヌクレオチドリピートのために獲得した。増幅条件は下記の通りとした：９４℃での変性、５５℃でのアニーリング、及び７２℃での伸長（１min づつ、３０サイクル）。ジヌクレオチドリピート多形性の検出のために用いた手順は公知である。

実施例６
ｃＤＮＡクローン及びＤＮＡ配列決定
λｇｔ１０ヒト胎児脳ライブラリーの２百万個の組換体を製造者（Clontech) に従ってプレート培養した。プリハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションは１０％の硫酸デキストランナトリウム、１ＭのＮａＣｌ、０．０５ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ pH７．５、０．００５ＭのＥＤＴＡ及び１％のＳＤＳと、２００mg／mlの剪断ヒト胎盤ＤＮＡ(Sigma）との中で６５℃で１６時間行った。このフィルターを０．１×ＳＳＥＰ−０．１％のＳＤＳの中で６５℃で洗い、そしてオートラジオグラフィーを２４時間行った。陽性ｃＤＮＡクローンのＤＮＡを精製し、ＥｃｏＲＩで消化し、そしてＭ１３バクテリオファージの中にサブクローニングした。一本鎖ＤＮＡをDye Deoxy(商標）ターミネーター・サイクル・シーケンシング・キットを用い、Applied Biosystems, Inc.より供給のプロトコールに従って配列決定し、そしてＡＢＩモデル３７３ＡＤＮＡ自動シーケンサーで分析した。ｃＤＮＡの３′末端とそのポリ（Ａ）⁺ テールとを獲得するため、リンホブラストイド細胞系ｃＤＮＡライブラリーのＰＣＲ増幅をこのクローンの３′末端に相補性の特異的なプライマー及びｃＤＮＡライブラリーのベクターアームに特異的なプライマーを用い、従来記載の通りに行った(Fouriner B., Saudubray, J.M., Benichou B.ら、1994 J.Clin.Invest. 94 : 526-531)。特異的なＰＣＲ生成物をDye Deoxy(商標）ターミネーター・サイクル・シーケンシング・キットを用い、Applied Biosystems, Inc.により供給されたプロトコールに従い直接配列決定し、そしてＡＢＩモデル３７３ＡＤＮＡ自動シーケンサーで分析した。

実施例７
ＲＮＡの単離及びノーザンブロット分析
コントロール及びＳＭＡ患者のリンホブラスト細胞系由来のｍＲＮＡを Quick Prep mRNA精製キット(Pharmacia) により、供給者の手順に従って単離した。全ＤＮＡはChomczynski and Sacchi (Analytic Biochemistry , 162 ：156-159 (1987)) に記載の一段ＲＮＡ単離法に従って調製した。全ＲＮＡ調製品をＲＱ１−ＤＮＡｓｅ(Promega) で処理して全ての夾雑ゲノムＤＮＡを除去した。ノーザンブロットをｍＲＮＡ及び全ＲＮＡから、メチル水酸化水銀を含む１．５％のSeakemアガロースゲルを通じる電気泳動により作り、そして２０×ＳＳＣ中の正帯電膜に移し、そして８０℃で２時間加熱した。³²Ｐ−ラジオラベルＤＮＡプローブを製造者（Boehringer) に従うランダムプライミング法により合成し、そして５×ＳＳＥＰ、１％のＳＤＳ、５×のDenhardtの中で６５℃で１６時間かけてハイブリダイズさせた。その膜を０．１×ＳＳＥＰ、０．１％のＳＤＳの最終ストリンジェンシーで６５℃で１０分かけて洗った。オートラジオグラフィーは−８０℃で、増強スクリーン及びKodak ＸＡＲフィルムを用いて２〜１０日かけて行った。ｍＲＮＡの量をｂ−アクチンｃＤＮＡプローブで標準化した。オートラジオグラフをコンピューター化デンシトメーター(Hoeffer Scientific Insturments, San Francisco) で６００nmでスキャンした。複数のヒト組織由来のポリＡ＋ＲＮＡをもつノーザンブロットをClontechから購入した。

実施例８
逆転写酵素ベースＰＣＲ増幅及びスクリーニング
各ＰＣＲ増幅をランダムヘキサマープライムした逆転写酵素(Promega) から合成した一本鎖ｃＤＮＡに基づき２０mlの最終容量で行った。このＰＣＲ反応は２ピコモルの前進及び逆行プライマー並びに１unitのＴａｑポリメラーゼを、Perkin Elmer／Cetur により推奨の反応バッファーの中に含む。ＰＣＲ増幅のためのパラメーターは、９４℃で１min 、５５℃で１min 、７２℃で１min の３０サイクル、それに続く７２℃で１０min の最終伸長時間より成る。ＰＣＲ生成物をアクリルアミドゲルから切り出し、そして１００mlのＴＥバッファーの中で溶出させた。希釈フラグメントを、直接配列決定の前に同じプライマーで再増幅させた。このＰＣＲ増幅生成物をアクリルアミドゲルから切り出し、そして１００mlのＴＥバッファーの中で溶出させた。この希釈フラグメントを再増幅させ、次いでDye Deoxy(商標）ターミネーター・サイクル・シーケンシング・キットを用い、Applied Biosystems, Inc.より供給のプロトコールに従って直接配列決定した。そしてＡＢＩモデル３７３ＡＤＮＡ自動シーケンサーで分析した。ｃＤＮＡ配列の中の６セットのプライマーを配列分析のためのＤＮＡ生成物を増幅するために用いた。

実施例９
コンピューター補助分析
５４１Ｃ由来のヌクレオチド及びタンパク質配列の両者との配列相同性分析を、ＦＡＳＴＡ及びＢＬＡＳＴを用い、ＣＩＴＩ２ French ネットワークを介して行った（Dessen P., Fondrat C., Velencien C., Mugnoer C., 1990, CABIOS ; 6 : 355-356)。

実施例１０
ＳＳＣＰ分析
一本鎖コンホメーション多形性（ＳＳＣＰ）分析のため、末梢白血球（２００ng）由来のＤＮＡを、２００μＭのｄＮＴＰ、１unitのＴａｑポリメラーゼ(Gibco-BRL) 及び０．１μｌの³²ＰｄＣＴＰ（１０mCi ／ml、ＮＥＮ）を含む２５μｌの増幅混合物中の未ラベルプライマー（２０μＭ）を用いるＰＣＲ増幅にかけた。増幅させたＤＮＡを等容量のポリアミド添加色素（９５％のポリアミド、２０mMのＥＤＴＡ、０．０５％のブロモフェノールブルー、０．０５％のキシレンシアノール）と混合した。このサンプル（５μｌ）を９５℃で１０分変性させ、そしてポリアクリルアミドゲル(Hydroling MED, Bioprobe) に載せ、そして４℃で１８〜２４ｈ、４Ｗで電気泳動させた。ゲルを３ＭＭ Whatman紙に移し、乾かし、そしてKodak Ｘ−ＯＭＡＴフィルムで２４時間かけてオートラジオグラフィーにかけた。エクソン７オリゴヌクレオチドＲ１１１

５４１Ｃ７７０

を利用した。エクソン８の相違を含むＤＮＡ配列を増幅するため、オリゴヌクレオチド５４１Ｃ９６０

５４１Ｃ１１２０

を利用した。

実施例１１
ヒトＳＭＮ遺伝子のクローニング
ＹＡＣクローン５９５Ｃ１１由来の全酵母ＤＮＡをSambrookら前掲の方法を介して精製し、そして制限酵素Ｓａｕ３Ａにより部分消化した。１２〜２３kDのサイズ範囲のＤＮＡを０．５％のSeaplaque ＧＴＧアガロースゲル電気泳動後に切り出し、そしてβ−アガロース消化の後にエタノールで沈殿させた。Ｓａｕ３Ａ部の部分的フィル・インの後、ＤＮＡをバクテリオファージＦＩＸII（Stratagene）の部分補完ＸｈｏＩ部位でサブクローニングした。

全長ＢＣＤ５４１ｃＤＮＡを、Sambrookら、前掲に記載の条件下でＦＩＸIIファージライブラリーをスクリーニングするためのプローブとして用いた。

名称Ｍ−１３２，Ｌ−５及びＬ−１３のこれらのファージは、ＨｉｎｄIII ，ＥｃｏＲＩ及びＢｇｌIIを用いる制限地図化（図１１参照）及びサザンブロット分析による確認に従い、全ＳＭＮ遺伝子に広がっていた。

このファージを次に実施例８に記載の通りにして配列決定した。遺伝子が配列決定できたら、それをｐＵＣ１８ベクターにクローニングし、そして大量に組換生産し、それを更なる利用のために精製した。

実施例１２
マウスＳＭＮ遺伝子のクローニング
マウスの胎児ｃＤＮＡライブラリーをSambrookら、前掲に従い、プローブとしてヒトＳＭＮｃＤＮＡのコード配列を用いてスクリーニングにかけた。

マウスＳＭＮの全配列を有する２つの重複マウスｃＤＮＡクローンが見い出され、それはｐＵＣ１８ベクター及びＭ１３ベクターにクローニングされた後に実施例８に記載の配列決定法により示された。

実施例１３
遺伝子導入マウス
複数の正常ＳＭＮ遺伝子又はエクソン７を欠くＳＭＮ遺伝子を含む遺伝子導入マウスを Leeら、Neuron, 13；978-988 (1994)に従う方法により製造した。この遺伝子導入マウスを、本発明に記載のプローブを用いてサザン及び／又はノーザンブロットを介して、又は本発明に記載の抗体によるウェスタンブロットでのスクリーニングを介して、ＳＭＮ遺伝子又はエクソン７を欠くＳＭＮ遺伝子の過剰発現について試験し、そして選択した。

異常なＳＭＮ遺伝子を含む遺伝子導入マウスを、Kuhnら、Science , 269 ；1427-1429 (1995)及び Bredley, Current Opinion in Biotechnology 2；823-829 (1991)に記載の通りにして、突然変異したＳＭＮ遺伝子を用いる相同的組換法により獲得した。次いでこの遺伝子導入マウスを、本発明に記載のプローブを用いるサザン及び／又はノーザンブロットを介してＳＭＮ遺伝子の過剰発現について試験及び選択するか、又は本発明に記載の抗体により異常なＳＭＮ遺伝子についてスクリーニングした。

実施例１４
ポリクローナル抗体
以下の配列

を有する１００μｇの合成抗原をバッファーの中に溶かし、そして等容量のフロインドの完全アジュバントで乳化させた。０．５mlの乳化合成抗原−アジュバントをウサギに筋肉内注射した。５週間後、そのウサギをブーストにかけ、そして各ブースター注射の８日後に２０〜４０mlの血液を採血した。その血清をＲＩＡを用いて抗原の存在について試験した。

以下の合成抗原

を用いて同じ方法によりポリクローナル抗体も調製した。

実施例１５
遺伝子療法
Ragotら、Nature, Vol.361 (1993)に記載のアデノウィルス構築体を用い、正常ＳＭＮ遺伝子をその中に挿入し、そしてこの遺伝子を欠く患者に筋肉内注射した。その患者を上記の実施例１０記載のＳＳＣＰ分析を利用してモニターした。

クローンＴ−ＢＣＤ５４１のＳＭＮコード領域のアミノ酸配列。ＳＭＮコード領域及びクローンＣ−ＢＣＤ５４１の５′及び３′隣接領域のヌクレオチド配列。コード領域に下線を付した。図２の続きであり、Ｃ−ＢＣＤ５４１遺伝子のイントロン６から出発してエクソン８までの配列を含む。下線を付した配列はエクソン７及び８である。イントロン６及び７の配列をｃＤＮＡ領域を増幅するオリゴヌクレオチドとして選択しており、エクソン７内のＴ−ＢＣＤ５４１遺伝子とＣ−ＢＣＤ５４１遺伝子との識別が可能となっている。Ｔ−ＢＣＤ５４１とＣ−ＢＣＤ５４１ｃＤＮＡとの相違ヌクレオチドの位置をイタリック体で示す。ＳＭＮコード領域並びにクローンＴ−ＢＣＤ５４１の５′及び３′隣接領域。コード配列に下線を付した。エクソンの番号を配列の上に表示した。星印は各エクソンの始まりを示す。イタリック体で示すヌクレオチドはＣ−ＢＣＤ５４１とＴ−ＢＣＤ５４１遺伝子との相違である。図４の続きであり、Ｔ−ＢＣＤ５４１遺伝子のイントロン６からエクソン８の終りまでの配列を示す。エクソン７及び８の配列に下線を付した。マーカーＣ２１２，Ｃ２７２，Ｃ１７１，ＡＦＭ１５７ｘｄ１０及びＣ１６１のヌクレオチド配列。プローブがハイブリダイズする複数の遺伝子座を示す本発明において利用した様々なプローブ。生存ＳＭＮ遺伝子を含むテロマー要素。近くに地図化されるプローブ１３２ＳＥ１１による遺伝子量のめざましい低下。トランケートＳＭＮタンパク質のアミノ酸配列。ヒトＳＭＮ遺伝子のゲノム構造の模式図。ゲノムクローンの表示及び位置を同図の上に示す。Ｌ−１３２，Ｌ−５及びＬ−１３はＳＭＮ遺伝子全体に広がるゲノムクローンを示し、一方、Ｌ−５１はエクソン１の一部しか広がらない。マイクロサテライト及びＤＮＡマーカーをゲノム地図の上に示す。Ｂ，Ｈ及びＥはＢｇｌII，ＨｉｎｄIII 及びＥｃｏＲＩをそれぞれ示す。Ｃ２１２，ｐ３２２，Ｃ２７２，１３２ＳＥ１１及びＣ１７１は種々のマーカーを示す。１，２ａ，２ｂ，３，４，５，６，７及び８はＳＭＮ及びＣ−ＢＣＤ５４１遺伝子のエクソンを表わす。Ｌ−１３２の全配列をエクソン１からエクソン２ＡまでのＰＣＲ増幅により得た。イントロン及びエクソンを含む全ヒトＳＭＮ遺伝子のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列。翻訳されるヌクレオチド配列を上欄に示し、対応のアミノ酸をその下に示す。ポリアデニル化シグナルは太字で示す。矢印の頭はイントロン６及び７、並びにエクソン７及び８の中でのＳＭＮとＣ−ＢＣＤ５４１遺伝子との間の一塩基相違の位置を示す。イタリック字体はイントロン７における相違の検出のために選んだオリゴヌクレオチドの位置を示す。（^* ) は停止コドンの位置を示す。図１２の続き。ヒトＳＭＮ遺伝子のコード領域の上流のヌクレオチド配列を示し、ＡＰ−２，ＧＨ−ＣＳＥ２，ＤＴＦ−１，Ｅ４ＦＩ，ＮＩＮＦ−Ａ，Ｈ４ＴＦ−１，β−ＩＦＮ及びＳｐＩの転写因子のための推定結合部位の存在を示す。太字はＣ２７２マーカーに対応するジヌクレオチドリピート（ＣＡ）を示す。マウスＳＭＮｃＤＮＡのヌクレオチド及びアミノ酸配列。（^* ) は停止コドンの位置を示す。ヒトＳＭＮ（上）及びマウスＳＭＮ（下）のアミノ酸配列の対比分析。家族６の遺伝子分析。レーンＡは、父親から唯一遺伝されたプロバンドとしてのマイクロサテライトマーカーＣ２７２により認められた遺伝した母系欠損の証拠を示す。レーンＢ及びＣはＳＭＮ（ベタ塗り矢印）並びにそのセントロマーコピー（白抜き矢印）のＰＣＲ増幅したエクソン７（レーンＢ）及び８（レーンＣ）のＳＳＣＰ分析を示す。「Ｆ」は父親、「Ｍ」は母親、そして「Ａ」は冒された幼児を示す。ＰＣＲイントロン７の一本鎖コンホメーション多形性（ＳＳＣＰ）分析上でのバンドシフトを示し、そしてＳＭＮ（ベタ塗り矢印）及びそのセントロマー対応物Ｃ−ＢＣＤ５４１（白抜き矢印）の同定を可能にした。

Claims

脊髄筋萎縮に関連する、変化したヒト生存運動ニューロン（ＳＭＮ）遺伝子の存在をインビトロで検出する方法であって、患者由来の生体試料中の以下の配列：

から成るＴ−ＢＣＤ５４１と定義される遺伝子のエクソン７又はエクソン８を解析すること、そして
前記エクソン７と、正常な組織中に存在する、以下の配列：

のヌクレオチド位３４０からヌクレオチド位４０１の対応するエクソンとを、又は前記エクソン８と、正常な組織中に存在する、以下の配列：

のヌクレオチド位８４６からヌクレオチド位１４０８の対応するエクソンとを比較すること、
を含んで成り、前記の正常な組織を基準とする前記患者の試料中のエクソン７又はエクソン８のいずれかの変化が、前記患者において、脊髄筋萎縮に関連する、変化したヒト生存運動ニューロン（ＳＭＮ）遺伝子の存在を示している、方法。
前記解析が、前記患者の試料中のＴ−ＢＣＤ５４１のエクソン７の有無を決定すること、を含んで成る、請求項１に記載の方法。
前記解析が、前記患者の試料中のＴ−ＢＣＤ５４１のエクソン８の有無を決定すること、を含んで成る、請求項１に記載の方法。
Ｔ−ＢＣＤ５４１遺伝子の全体又はその一部が、エクソン７又はエクソン８の変化について前記遺伝子を解析する前にＰＣＲ増幅にかけられる、請求項１に記載の方法。
前記解析が、Ｔ−ＢＣＤ５４１遺伝子のエクソン７を含んで成る前記患者の試料由来のヌクレオチドフラグメントを増幅させ、
Ｔ−ＢＣＤ５４１遺伝子のエクソン８を含んで成る前記患者の試料由来のヌクレオチドフラグメントを増幅させ、そして
増幅したフラグメント中のエクソン７及びエクソン８の有無を決定すること、
を含んで成る、請求項４に記載の方法。
前記決定が、前記ヌクレオチドフラグメントを含んで成るエクソン７を制限酵素消化にかけ、
前記ヌクレオチドフラグメントを含んで成るエクソン８を制限酵素消化にかけ、そして
前記酵素消化により生成した酵素消化産物を、正常組織由来の生存運動ニューロン遺伝子のエクソン７又はエクソン８の酵素消化産物と比較することで、前記生体試料に由来する、前記酵素消化により生成した酵素消化産物を解析すること、
を含んで成り、ここで、前記の正常な組織を基準とするエクソン７又はエクソン８のいずれかの変化が、前記エクソンの一方又は両方における制限酵素消化パターンの変化によって証明される、請求項５に記載の方法。
前記増幅が、

から成る群から選択されるプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応を用いて実施される、請求項４に記載の方法。
前記解析が、前記患者のＴ−ＢＣＤ５４１遺伝子を、Ｂｓｒ１、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＳａｃＩ又はＫｐｎＩで制限酵素開裂にかけることを含んで成る、請求項１に記載の方法。
前記解析が、前記生体試料中に存在する前記患者のＴ−ＢＣＤ５４１遺伝子を、一本鎖コンホメーション多型（ＳＳＣＰ）解析にかけること、を含んで成り、前記解析が、前記患者の試料から得られたＤＮＡフラグメントのパターンと、コントロールの試料から得られたＤＮＡフラグメントのパターンとを比較して、前記患者の遺伝子の変化を検出すること、を含んで成る、請求項１に記載の方法。
前記生体試料が、血液、脊髄液、末梢血液白血球、リンホブラストイド細胞系及び筋肉組織から成る群から選択される、請求項１に記載の方法。
先天性多発性関節拘縮症の臨床検査方法であって、
患者由来の生体試料中の以下の配列：

から成るＴ−ＢＣＤ５４１と定義される遺伝子のエクソン７又はエクソン８を解析すること、そして
前記エクソン７と、正常な組織中に存在する、以下の配列：

のヌクレオチド位３４０からヌクレオチド位４０１の対応するエクソンとを、又は前記エクソン８と、正常な組織中に存在する、以下の配列：

のヌクレオチド位８４６からヌクレオチド位１４０８の対応するエクソンとを比較すること、
を含んで成り、前記の正常な組織を基準とするエクソン７又はエクソン８のいずれかの変化が、前記患者において、先天性多発性関節拘縮症に関連する、変化したヒト生存運動ニューロン（ＳＭＮ）遺伝子の存在を示している、方法。
前記解析が、Ｔ−ＢＣＤ５４１遺伝子のエクソン７を含んで成る前記患者の試料由来のヌクレオチドフラグメントを増幅させ、
Ｔ−ＢＣＤ５４１遺伝子のエクソン８を含んで成る前記患者の試料由来のヌクレオチドフラグメントを増幅させ、そして
増幅したフラグメント中のエクソン７及びエクソン８の有無を決定すること、
を含んで成る、請求項１１に記載の方法。
前記決定が、前記ヌクレオチドフラグメントを含んで成るエクソン７を制限酵素消化にかけ、
前記ヌクレオチドフラグメントを含んで成るエクソン８を制限酵素消化にかけ、そして
前記酵素消化により生成した酵素消化産物を、正常組織由来の生存運動ニューロン遺伝子のエクソン７又はエクソン８の酵素消化産物と比較することで、前記生体試料に由来する、前記酵素消化により生成した酵素消化産物を解析すること、
を含んで成り、ここで、前記の正常な組織を基準とするエクソン７又はエクソン８のいずれかの変化が、前記エクソンの一方又は両方における制限酵素消化パターンの変化によって証明される、請求項１２に記載の方法。
核酸試料における、以下の配列：

から成る生存運動ニューロン（ＳＭＮ）遺伝子のエクソン７の欠失の有無の同定方法であって、
（ａ）前記試料中の核酸を制限エンドヌクレアーゼによる消化にかけること、ここで、エクソン７が欠失したＳＭＮ遺伝子の前記消化から生じる制限フラグメントは、以下の配列：

から成るＴ−ＢＣＤ５４１遺伝子から得られるものと異なる、そして
（ｂ）対象のＳＭＮ遺伝子のエクソン７の欠失の有無を同定すること、
を含んで成る方法。
制限エンドヌクレアーゼがＢｓｒ−１である、請求項１４に記載の方法。
前記核酸が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に更にかけられる、請求項１４に記載の方法。
前記ポリメラーゼ連鎖反応が、以下の配列

から成る配列に含まれているプライマーのセットを用いて実施される、請求項１６に記載の方法。
脊髄筋萎縮（ＳＭＡ）の存在をインビトロで検出する方法であって：
（ａ）対象から得られたＤＮＡ試料中の以下の配列：

から成るＴ−ＢＣＤ５４１遺伝子におけるエクソン７の欠失を同定すること、を含んで成り、ここで、Ｔ−ＢＣＤ５４１遺伝子におけるエクソン７の欠失の存在は、前記対象におけるＳＭＡの存在を示している、方法。
前記欠失が、Ｔ−ＢＣＤ５４１全体の欠失を含んで成る、請求項１８に記載の方法。
前記エクソン７の欠失が、以下の配列：

によってコードされるタンパク質産物のトランケートをもたらす、請求項１８に記載の方法。
単離された核酸の配列が、直接配列決定によって決定される、請求項１８に記載の方法。
前記核酸が更にポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）にかけられる、請求項１８に記載の方法。
個体から得られたＤＮＡ試料中に存在する、以下の配列：

から成る生存運動ニューロン遺伝子におけるエクソン７の欠失の有無を検出する方法であって、
（ａ）前記ＤＮＡを、以下の配列：

から成る群から選択される核酸配列から成るプライマーで増幅させること、
（ｂ）増幅したＤＮＡを一本鎖コンホメーション多型（ＳＳＣＰ）解析にかけること、ここで、当該解析が、前記患者の試料から得られたＤＮＡフラグメントのパターンと、コントロールの試料から得られたＤＮＡフラグメントのパターンとを比較すること、を含んで成る；及び
（ｃ）生存運動ニューロン遺伝子におけるエクソン７の欠失の有無を検出すること、
を含んで成る方法。
個体から得られたＤＮＡ試料中に存在する、以下の配列：

から成る生存運動ニューロン遺伝子におけるエクソン７の欠失の有無を検出する方法であって、
（ａ）前記ＤＮＡを、以下の配列：

から成る群から選択される核酸配列から成るプライマーで増幅させること、
（ｂ）増幅したＤＮＡを一本鎖コンホメーション多型（ＳＳＣＰ）解析にかけること、ここで、当該解析が、前記患者の試料から得られたＤＮＡフラグメントのパターンと、コントロールの試料から得られたＤＮＡフラグメントのパターンとを比較すること、を含んで成る；及び
（ｃ）生存運動ニューロン遺伝子におけるエクソン７の欠失の有無を検出すること、
を含んで成る方法。
脊髄筋萎縮の有無をインビトロで検出する方法であって、
個体から得られた、生存運動ニューロン遺伝子を含んで成るＤＮＡ試料を解析すること、及び
前記遺伝子のエクソン７又はエクソン８のいずれかあるいはエクソン７及びエクソン８の両方の有無を検出すること、ここで、エクソン７は以下の配列：

のヌクレオチド３４０からヌクレオチド４０１を含んで成り、そしてエクソン８は以下の配列：

のヌクレオチド８４６からヌクレオチド１４０８を含んで成り、ここで、エクソン７又はエクソン８のいずれか、あるいは両方の不在が、脊髄筋萎縮の存在を示す、方法。