JPH10506529A

JPH10506529A - ヒト・ガラクトキナーゼ遺伝子

Info

Publication number: JPH10506529A
Application number: JP8510858A
Authority: JP
Inventors: バーグスマ，ダーク・ジョン; スタンボリアン，ドワイト・エドワード
Original assignee: SmithKline Beecham Corp
Current assignee: SmithKline Beecham Corp
Priority date: 1994-09-23
Filing date: 1995-05-26
Publication date: 1998-06-30
Also published as: NO971359L; NO971359D0; BR9509211A; JPH10505757A; EP0783567A1; NO971363D0; MXPA94008258A; EP0783567A4; AU2653695A; AU7958194A; WO1996009374A1; WO1996009408A1; PL319344A1; ZA947865B

Abstract

(57)【要約】本発明は、ヒト・ガラクトキナーゼおよびガラクトキナーゼのミスセンスおよびナンセンス変異、さらにはそれらをコードしている単離核酸、かかる蛋白をコードしているＤＮＡで形質転換された組み換え宿主細胞、ならびに治療および診断のための発現蛋白および核酸配列の使用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】ヒト・ガラクトキナーゼ遺伝子本発明は、一部には、米国国立衛生研究所により与えられたＥＹ−０９４０４の下で政府の援助で行われた。関連出願の相互参照：本願は、１９９４年９月２３日出願のＰＣＴ／ＵＳ９４／１０８２５の一部継続出願である。発明の分野：本発明は、ヒト・ガラクトキナーゼおよびガラクトキナーゼのミスセンスおよびナンセンス変異の同定、ならびにガラクトキナーゼをコードしている単離核酸、かかる蛋白をコードしているＤＮＡで形質転換された組み換え宿主細胞、ならびに発現された蛋白および核酸配列の治療および診断用途への使用に関する。発明の背景：多くの遺伝的なヒトの代謝疾患が存在し、それらの大部分は劣性である。多くのものは有害な効果を有し、それらは、重い精神遅滞、末梢神経系損傷、盲、聴覚障害および臓器肥大症のごときいくつかの臨床的特徴の組み合わせを包含する。大部分の疾患はまれなものである。しかしながら、かかる疾患の大部分は薬剤によっては治療できない。ガラクトキナーゼ欠乏症は３つの形態のガラクトース血症の１つである。他の形態はガラクトース−１−リン酸ウリジルトランスフェラーゼ欠乏症およびＵＤＰガラクトース−４−エピメラーゼ欠乏症である。３種の酵素はすべてガラクトース代謝、すなわち体内でのガラクトースのグルコースへの変換に関与している。ガラクトキナーゼ欠乏症は、一般的集団において０.２％あると見積もられたヘテロ接合体頻度で常染色体劣性遺伝する（例えばLevy et al.,J.Pediatr. 92:871〜877(1978)参照）。通常には、ヘテロ接合体ガラクトキナーゼ欠乏症の患者は、ガラクトース血症、ガラクトース尿症、ガラクチトールレベルの上昇、白内障、そして少ないケースであるが精神遅滞を幼児期の初期に発症する（Sega l et al.,J.Pediatr.,95:750〜752(1979)）。通常には、これらの徴候はガラクトース不含治療食の投与により劇的に改善される。ガラクトキナーゼ欠乏症に関するヘテロ接合体は、２０〜５０歳の間に発症する初老期白内障を起こす傾向がある（Stambolian et al.,Invest.Ophthal.Vis.Sci.27:429〜433(1986)）。肝臓、腎臓、脳、眼球、胎盤、赤血球および白血球を包含する種々の哺乳動物組織においてガラクトキナーゼ活性が見いだされている。該蛋白はイー・コリから精製されているが、それが細胞において低濃度であるために哺乳動物組織からの該蛋白の精製は困難であることがわかっている。さらに、ガラクトキナーゼ欠乏症の分子的根拠は未知である。本発明はヒト・ガラクトキナーゼ遺伝子を提供する。本明細書に開示された特定の配列のごとき本発明ＤＮＡは、それらがこの蛋白の発現に必要な遺伝情報をコードしているという点で有用である。さらに、該配列をプローブとして用いてファミリー、タイプおよび／またはサブタイプならびに変異のさらなるメンバーを単離し同定することができ、それらをガラクトキナーゼ遺伝子の部位特異的変異または不規則な発現により特徴づけることができる。また、ガラクトキナーゼ遺伝子は、変異ガラクトキナーゼ蛋白を同定するための診断薬として、あるいは遺伝子治療による治療薬として有用である。遺伝子治療の最初の臨床試験は１９９０年に始まった。その時以来、７０例以上の臨床試験プロトコールが検閲され、ＮＩＨのRecombinant Advisory Committ ee（ＲＡＣ）のごとき規制当局により是認されてきた。例えば、Anderson,W.F., Human Gene Therapy,5:281〜282(1994)参照。遺伝子治療による疾患および疾病の治療的処置は、新たな遺伝情報を細胞中に移すことおよび安定に挿入することを包含する。それゆえ、遺伝子の正常対立遺伝子の再導入による遺伝学的欠陥の修正は、この概念が臨床的に実行可能であることを示すものである（例えば、Rosenberg et al.,New Eng.J.Med.,323:570(1990)）。本明細書開示の試薬についてのこれらのおよびさらなる使用は、本明細書を読めば当業者に明らかとなるであろう。発明の概要：本発明は、ヒト・ガラクトキナーゼをコードする単離核酸分子、ならびにミスセンスおよびナンセンス変異をコードする核酸分子を提供し、それらはｍＲＮＡ、ＤＮＡ（例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ等）、ならびにそれらのアンチセンスアナログおよびそれらの診断上または治療上有用なフラグメントを包含する。また、本発明は、ヒト・ガラクトキナーゼ蛋白の組み換え生産における試薬として有用なクローニングベクターおよび発現ベクターのごとき組み換えベクター、ならびにヒト・ガラクトキナーゼ核酸配列を含む組み換え原核および／または真核宿主細胞を提供する。また、本発明は、ヒト・ガラクトキナーゼ核酸配列を含有する組み換え原核および／または真核宿主細胞を、該蛋白の発現およびその回収を促進する条件下で培養することを含むヒト・ガラクトキナーゼ蛋白の製造方法を提供する。本発明のもう１つの関連態様は、該方法により製造される単離ヒト・ガラクトキナーゼ蛋白である。さらなる態様において、本発明はヒト・ガラクトキナーゼ蛋白に指向された（すなわち結合する）抗体も提供する。また、本発明は、ミスセンスまたはナンセンス変異を有する単離ヒト・ガラクトキナーゼ蛋白ならびに該蛋白と特異的に反応する抗体（モノクローナルまたはポリクローナル）を提供する。また、本発明はヒト・ガラクトキナーゼ配列に特異的にハイブリダイゼーションするに十分な長さの核酸分子を含む核酸プローブおよびＰＣＲプライマーを提供する。また、本発明は、個体から核酸試料を単離し、本発明リファレンス遺伝子を用いて該核酸試料の配列をアッセイし、次いで、該試料と本発明核酸との間の相違を比較することを含み、該相違が個体から単離されたヒト・ガラクトキナーゼ遺伝子における変異を示すものである、ヒト・ガラクトキナーゼ欠乏症の診断方法を提供する。試料を直接配列比較（すなわち、ＤＮＡ配列決定）によりアッセイすることができ、ハイブリダイゼーション（例えば、ヘテロ二重鎖ゲル電気泳動、ＳＳＣＰまたはノーザンもしくはサザンブロッティングのような他の方法のごとき核酸配列の長さに基づく移動度シフトアッセイ）またはＲＬＦＰ（例えば、ＰＣＲ（ＤＮＡの場合）またはＰＣＲ−ＲＴ（ＲＮＡの場合）により増幅された試料の制限エンドヌクレアーゼ消化による）のごとき他の知られたゲル電気泳動法により試料核酸をリファレンスガラクトキナーゼ遺伝子と比較することができる。別法として、該診断方法は、個体からゲノムＤＮＡを含有する細胞を単離し、本発明ＤＮＡ配列、または少なくとも１のエキソン、または少なくとも１５個、好ましくは１８個、より好ましくは２１個のひとつづきの塩基対をプローブとして用いるin situハイブリダイゼーションにより該試料（例えば、細胞ＲＮＡ）をアッセイすることを含む。また、本発明は、変異ガラクトキナーゼ遺伝子を同定するための、ヒト・ガラクトキナーゼをコードしているｍＲＮＡに結合する能力のある配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。また、本発明は、血清または組織試料を得て；抗体（または抗体フラグメント）と変異ガラクトキナーゼ蛋白との間に抗原−抗体複合体が形成される条件下で本発明変異ヒト・ガラクトキナーゼ蛋白に特異的に結合する抗体または抗体フラグメントにかかる試料を接触させ；次いで、該複合体の存在または不存在を検出することを含む、ヒト・ガラクトキナーゼ欠乏症のさらに別の診断方法を提供する。また、本発明は、ヒト・ガラクトキナーゼをコードする核酸分子を含むトランスジェニック非ヒト動物を提供する。また、疾病状態、変異およびＳＡＲについてのモデルとしての該トランスジェニック動物の使用方法も提供される。また、本発明は、患者の内在ガラクトキナーゼを補足するのに有効な本発明ガラクトキナーゼ蛋白を含有する医薬組成物を治療を要する患者に投与し、そのことにより該症状を改善することを含む不十分なヒト・ガラクトキナーゼ活性に関連した症状の治療方法を提供する。また、本発明は、不十分なヒト・ガラクトキナーゼ活性に関連した症状の遺伝子治療による治療方法を提供する。本発明非変異ガラクトキナーゼ遺伝子を含むさらなる遺伝子またはリファレンス遺伝子をin vivoまたはex vivoにおいて患者の細胞中に挿入する。リファレンス遺伝子はトランスフェクションされた細胞において発現され、結果として、リファレンス遺伝子によりコードされる蛋白が欠損（すなわち、ガラクトキナーゼ欠乏）を修正し、かくして、トランスフェクションされた細胞が正常に機能することが可能となり、疾病症状（または徴候）が改善される。図面の簡単な説明：図１は、ヒト・ガラクトキナーゼ遺伝子のイントロン／エキソン配置を示す。図２は、ヒト・ガラクトキナーゼについてのゲノムＤＮＡ配列（および１文字アミノ酸略記）［配列番号：７］である。太字ＤＮＡ配列はヒト・ガラクトキナーゼのエキソン領域に対応し、通常または太字でないタイプはヒト・ガラクトキナーゼのイントロン領域に対応する。発明の詳細な説明：本発明は、ヒト・ガラクトキナーゼ（アミノ酸およびヌクレオチド配列）およびその診断および治療試薬としての使用に関する。ヒト・ガラクトキナーゼの詳細なｃＤＮＡおよびアミノ酸配列を配列番号：４によってさらに十分に確認する。また、本発明は、ヒト・ガラクトキナーゼに関するゲノムＤＮＡ配列［配列番号：７］、さらに変異ヒト・ガラクトキナーゼ遺伝子およびアミノ酸配列［配列番号：５および６］、ならびに診断目的のためのそれらの使用に関する。本発明のさらなる説明において、以下のさらなる用語を用い、それらを以下のように定義する。「抗原」とは、宿主の免疫系を刺激して体液性および／または細胞性抗原特異的応答を作り出す１またはそれ以上のエピトープを含む分子をいう。本明細書においては該用語を「免疫原」と入れ替えて使用することがある。用語「エピトープ」とは、特異的抗体分子が結合する抗原またはハプテン上の部位をいう。本明細書においては該用語を「抗原決定基」または「抗原決定部位」と入れ替えて使用することがある。ＲＮＡポリメラーゼが２つのコーディング配列を単一のｍＲＮＡへと転写する場合、１のコーディング配列は別のコーディング配列に「作動可能に結合」され、次いで、ｍＲＮＡは、両方のコーディング配列に由来するアミノ酸を有する単一のポリペプチドへと翻訳される。発現された配列が最終的にプロセッシングされて所望蛋白を生じる限り、コーディング配列は互いに隣り合っている必要はない。「組み換え」ポリペプチドとは、組み換えＤＮＡ法により製造される、すなわち、所望ポリペプチドをコードしている外来性ＤＮＡ構築物により形質転換された細胞から産生されるポリペプチドをいう。「合成」ポリペプチとは、化学合成により製造されたものである。「レプリコン」は、in vivoにおけるＤＮＡ複製の自律的単位として機能する、すなわち、それ自身の制御下で複製しうる遺伝学的エレメント（例えば、プラスミド、染色体、ウイルス）である。「ベクター」は、別のＤＮＡセグメントが結合していて該結合セグメントの複製を引き起こすことのできるプラスミド、ファージまたはコスミドのごときレプリコンである。「複製欠損ウイルス」は、宿主細胞中へのトランスフェクション後にウイルスが産生され得ず、そして／またはさらなる細胞に感染し得ないように切断および／または複製機能が変化しているウイルスである。「リファレンス」遺伝子とは、本発明ガラクトキナーゼ配列をいい、存在する種々の配列多型性を含むものと理解され、その遺伝子配列中にヌクレオチド置換が存在するが、その置換は遺伝子産物の必須機能には影響しない。「変異」遺伝子とは、リファレンス遺伝子と異なるガラクトキナーゼ配列をいい、その配列においてはクレオチド置換および／または欠失および／または挿入が遺伝子産物の必須機能に損傷を引き起こし、その結果、個体（または患者）におけるガラクトースレベルが異常に上昇する。例えば、ヒト・ガラクトキナーゼにおける位置１２２におけるＧのＡへの置換は、ガラクトキナーゼ欠乏症患者に関連したミスセンス変異である［配列番号：５］。さらにＧのＴへの置換は成熟蛋白の位置８０におけるアミノ酸のインフレームナンセンスコドンを作り出す。その結果、ヒト・ガラクトキナーゼの最初の７９個のアミノ酸からなる切断蛋白が生じる。特定の蛋白のＤＮＡ「コーディング配列」または特定の蛋白を「コードしているヌクレオチド配列」は、適当な調節配列の制御下に置かれた場合、ポリペプチドに転写翻訳されるＤＮＡ配列である。「プロモーター配列」は、細胞中のＤＮＡポリメラーゼを結合し、下流（３' 方向）のコーディング配列の転写を開始しうるＤＮＡ調節領域である。本発明を明確にする目的において、プロモーター配列は、その３'末端において、コーディング配列の翻訳開始コドン（例えば、ＡＴＧ）によって結合され、上流（５' 方向）に伸長しているものであって、バックグラウンド以上の検出可能なレベルでの転写を開始するのに必要な最小数の塩基またはエレメントを包含する。転写開始部位（便利にはヌクレアーゼＳ１でのマッピングにより決定）ならびにＲＮＡポリメラーゼ結合に関与する蛋白結合ドメイン（コンセンサス配列）がプロモター配列中に見いだされるであろう。真核細胞のプロモーターは、しばしば、「ＴＡＴＡ」ボックスおよび「ＣＡＴ」ボックスを含むが、常に含むとは限らない。原核細胞のプロモーターは、−１０および−３５コンセンサス配列に加えてシャイン−ダルガノ配列を含む。ＤＮＡ「制御配列」とは、プロモーター配列、リボソーム結合配列、ポリアデニレーションシグナル、転写終結配列、上流調節ドメイン、エンハンサー等をまとめていうが、それらは一緒になって宿主細胞におけるコーディング配列の発現（すなわち、転写および翻訳）を行う。ＲＮＡポリメラーゼがプロモーター配列に結合し、コーディング配列をｍＲＮＡに転写する場合に、制御配列は細胞中のコーディング配列の「発現を指令」し、次いで、ｍＲＮＡはコーディング配列によりコードされるポリペプチドへと翻訳される。「宿主細胞」は、形質転換もしくはトランスフェクションされた細胞であるか、あるいは外来性ＤＮＡ配列により形質転換もしくはトランスフェクションされうる細胞である。かかる外来性ＤＮＡが細胞膜内部に導入された場合に細胞は外来性ＤＮＡにより「形質転換」される。外来性ＤＮＡは、細胞のゲノムを構成している染色体ＤＮＡ中に組み込まれてもよく（共有結合）、組み込まれなくてもよい。例えば、原核細胞および酵母において、外来性ＤＮＡはプラスミドのごときエピソームエレメント上に維持される。真核細胞に関しては、安定に形質転換もしくはトランスフェクションされた細胞は、外来性ＤＮＡが染色体中に組み込まれて染色体複製によりそれが娘細胞に遺伝する細胞である。この安定性は、真核細胞が外来性ＤＮＡを含む娘細胞集団を含む細胞系またはクローンを確立する能力により示される。「トランスフェクション」または「トランスフェクションされた」とは、細胞が外来ＤＮＡを取り込み、該外来ＤＮＡをその染色体中に組み込むプロセスをいう。例えば、細胞にＤＮＡを取り込ませる種々の方法により（例えば、リン酸カルシウム沈殿、エレクトロポレーション、リポソーム融合等）、あるいはウイルスを用いてＤＮＡを細胞中に移行させる感染により、トランスフェクションを行うことができる。「標的細胞」は、他の細胞タイプ（または細胞系）よりも選択的にトランスフェクションされる細胞である。「クローン」は、有糸分裂により単一細胞または共通の祖先に由来する細胞集団である。「細胞系」は、何世代にもわたりin vitroで安定に増殖しうる初代細胞のクローンである。ＤＮＡ構造の「異種」領域は、もう１つの遺伝子中にあるかまたはそれに結合した同定可能なＤＮＡのセグメントであって、天然においては他の分子と結合した形では見いだされないものである。よって、異種領域が１の遺伝子をコードしている場合、通常には、該遺伝子は、遺伝子源となった動物のゲノムにおいては隣り合っていないＤＮＡと隣り合っている。異種コーディング配列のもう１つの例は、コーディング配列自体が天然において見いだされない構築物である（例えば、もとの遺伝子とは異なるコドンを有する合成配列）。対立遺伝子変種または自然に生じる変異は、本発明で用いるＤＮＡの異種領域を生じない。「不十分なヒト・ガラクトキナーゼ活性に関連した症状」または「ガラクトキナーゼ活性の欠乏」とは、ガラクトキナーゼ蛋白の変異を意味し、該変異蛋白はガラクトキナーゼ活性またはガラクトキナーゼ発現に、あるいはそれら両方に影響して患者におけるガラクトースレベルを異常に上昇させる。さらに、この定義は、リファレンスガラクトキナーゼ蛋白に関する制御配列の欠損が原因の、患者における異常に低レベルのガラクトキナーゼ発現も包含する。本発明は、ヒト・ガラクトキナーゼ蛋白および実質的に類似の配列をコードする単離核酸分子を提供する。（i）単離核酸配列が大体同じ長さであり（すなわち、配列番号：４のコーディング配列の少なくとも８０％）；（ii）それらが配列番号：４によってコードされる蛋白と同じガラクトキナーゼ活性（強度のオーダーの範囲内で）を有する蛋白をコードしており；（iii）それらが中程度の厳密さの条件下で配列番号：４にハイブリダイゼーションでき；あるいはそれらが配列番号：４に縮重する配列ＤＮＡ配列をコードしている場合、単離核酸配列は「実質的に類似」である。縮重ＤＮＡ配列は配列番号：４と同じアミノ酸配列をコードするが、ヌクレオチドコーディング配列において変異を有する。中程度の厳密さの条件下でのハイブリダイゼーションを以下に概説する。以下のようにして中程度の厳密さの条件下でのハイブリダイゼーションを行うことができる。６ＸＳＳＰＥ、５Ｘデンハーツ溶液（溶液１リットルあたり１０ｇフィコール、１０ｇＢＳＡおよび１０ｇポリビニルピロリドン）、０.０５％ＳＤＳおよび１００μｇｔＲＮＡを含む溶液中で、６５℃においてニトロセルロースフィルターをプレハイブリダイゼーションさせる。ハイブリダトを用いて）。次いで、ハイブリダイゼーションを６５℃で約１８時間行う。次いで、２ＸＳＳＣおよび０.５％ＳＤＳ中で、室温で１５分間フィルターを洗浄する（もう１度繰り返し洗浄）。次いで、フィルターを５８℃で洗浄し、風乾し、増強スクリーンを用いて−７０℃で一晩Ｘ線フィルムに対して露光する。あるいはまた、ヌクレオチド分子およびかかる配列によりコードされる蛋白の一定の長さ（少なくとも配列番号：４のコーディング領域の８０％）にわたり約６６％（好ましくは約７５％、最も好ましくは約９０％）のヌクレオチドまたはアミノ酸の合致部分があり、配列番号：４によりコードされる蛋白と同じガラクトキナーゼ活性（すなわち、強度のオーダーの範囲内で）を有する場合、「実質的に類似」の配列は実質的に同じである。本明細書における実質的に類似とは、本発明配列に対して同様の同一性を有する配列をいう。よって、ハイブリダイゼーションまたは配列比較により、実質的に同じヌクレオチド配列を同定することができる。１またはそれ以上の下記手段によって、実質的に同じ蛋白配列を同定することができる：蛋白分解消化、ゲル電気泳動および／または微小配列決定（ microsequencing）。また、本発明は、ヒト・ガラクトキナーゼ蛋白のミスセンス変異をコードする単離核酸分子（配列番号：５）またはナンセンス変異をコードする単離核酸分子（配列番号：６）、および配列番号：５または６に縮重したＤＮＡ配列を提供する。縮重ＤＮＡ配列は配列番号：５または６と同じアミノ酸配列（または終結部位）を有するが、ヌクレオチドコーディング配列中に変異を有する。ヒト・ガラクトキナーゼをコードする核酸分子を単離するための１の手段は、当該分野で認められている方法（例えば、"Current Protocols in Molecular Bi ology",Ausbel,F.M.,et al.(eds.)Greene Publishing Assoc.and John Wiley In terscience,New York,1989,1992参照）を用い、天然または人工的に設計したプローブを用いてヒト・ゲノムまたはｃＤＮＡライブラリーを探索することである。配列番号：４またはそのフラグメント（少なくとも１５個のひとつづきのヌクレオチドを含む）は特に有用なプローブであることが当業者に認識される。この目的のためのいくつかの特に有用なプローブ、またはハイブリダイゼーション可能なそのフラグメント（すなわち、少なくとも１５個のひとつづきのヌクレオチドを含む）を表１に示す。かかるプローブを標識することができ、好ましくはプローブの同定を容易にするための分析的に検出可能な試薬で標識できることも理解される。有用な試薬は放射活性、蛍光色素または検出可能な生成物の形成を触媒しうる酵素を包含するが、これらに限らない。よって、プローブは、ヒト、哺乳動物または他の動物起源のゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはＲＮＡの単離、あるいは関連配列を求めてのかかる起源（例えば、ファミリーのさらなるメンバー、タイプおよび／またはサブタイプ）のスクリーニングに有用であり、該関連配列は、上で定義した転写調節および制御エレメントならびに本発明開示のコーデイング配列に対して５'および／または３'領域由来の他の安定性、プセッシング、翻訳および組織特異性決定領域を包含する。また、本発明は遺伝子治療を提供する。「遺伝子治療」とは遺伝子の補足を意味する。すなわち、対象とする遺伝子のさらなるコピー（すなわちリファレンスのコピー）を患者の細胞中に挿入するのである。結果として、リファレンス遺伝子によりコードされた蛋白は欠陥（すなわち、ガラクトキナーゼ欠乏症）を修正し、細胞が正常に機能し、そのことにより疾病の徴候が改善されることを可能にする。本発明の遺伝子治療をin vivoまたはex vivoで行うことができる。ex vivo遺伝子治療は患者細胞の単離精製、治療遺伝子の導入、および遺伝学的に変化した細胞を患者に戻すことを必要とする。修飾レトロウイルスのごとき複製欠損ウイルスを用いて治療遺伝子（ガラクトキナーゼ）をかかる細胞に導入することができる。例えば、マウス・モロニー白血球ウイルス（mouse Moloney leukemia vir us）（ＭＭＬＶ）は臨床的遺伝子治療試験においてよく知られたウイルスである（例えば、Boris-Lauerie et al.,Curr.Opin.Genet.Dev.,3:102〜109(1993)参照）。対照的に、in vivo遺伝子治療は患者細胞の単離精製を必要としない。典型的には、治療遺伝子を、患者への投与のために、リポソームまたはアデノウイルス（例えば、Berkner,K.L.,Curr.Top.Microbiol.Immunol.,158:39〜66(1992)参照）もしくはアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクター（例えば、Muzyczka,N.,Curr .Top.Microbiol.Immunol.,158:97〜129(1992)および米国特許第５,２５２,４７９号「遺伝子治療用の安全なベクター（Safe Vector for Gene Therapy）」参照）のごとき複製欠損ウイルス中に「パッケージ」する。もう１つのアプローチは、いわゆる「裸のＤＮＡ」の投与であり、治療遺伝子が血流中または筋肉組織中に直接注射されるものである。本発明遺伝子治療に有用な細胞タイプは肝細胞、線維芽細胞、リンパ球、および目のいずれかの細胞（例えば、網膜）、上皮および内皮細胞を包含する。好ましくは、細胞は肝細胞、目の細胞または呼吸器（または肺）の上皮細胞である。リポソーム、ＤＮＡ−蛋白複合体または複製欠損アデノウイルス中のＤＮＡベクターの細分された調合物の吸入により、（肺の）上皮細胞のトランスフェクションを行うことができる（例えば、米国特許第５,２４０,８４６号「嚢胞性線維症用遺伝子治療ベクター（Gene Therapy Vector for Cystic Fibrosis）」参照）。また、本発明は、ヒト・ガラクトキナーゼ蛋白の製造方法を提供する。非変異蛋白は配列番号：４記載のアミノ酸配列を参照して定義され、同じガラクトキナーゼ活性を有する実質的に類似のアミノ酸配列を伴った変種を包含する。本発明のさらなる蛋白は配列番号：５または６に示す変異ヒト・ガラクトキナーゼ蛋白を包含する。好ましくは、本発明蛋白を組み換え遺伝子工学的方法により製造する。単離核酸、詳細にはＤＮＡを、遺伝子発現に必要な発現制御領域（例えば、調節領域）に作動可能に結合することにより発現ベクター中に導入することができる。当該分野においてよく知られた方法（Ausubel et al.,上記）により、原核細胞（例えば、細菌）または真核細胞（例えば、酵母または哺乳動物）のごとき適当な宿主細胞中にベクターを導入することができる。製造または単離された所望蛋白のコーディング配列を適当なベクターまたはレプリコン中にクローンすることができる。多くのクローニングベクターが当業者に知られており、適当なクローニングベクターの選択は選択の問題である。クローニング用組み換えＤＮＡベクターおよび形質転換できる宿主細胞の例は、バクテリオファージλ（イー・コリ（E.coli））、ｐＢＲ３２２（イー・コリ）、ｐＡＣＹＣ１７７（イー・コリ）、ｐＫＴ２３０（グラム陰性細菌）、ｐＧＶ１１０６（グラム陰性細菌）、ｐＬＡＦＲ１（グラム陰性細菌）、ｐＭＥ２９０(非イー・コリグラム陰性細菌)、ｐＨＶ１４（イー・コリおよびバチルス・ズブチリス（Bacillussubtilis ））、ｐＢＤ９（バチルス）、ｐＩＪ６１（ストレプトミセス（Streptomyces））、ｐＵＣ６（ストレプトミセス）、ＹＩｐ５（サッカロマイセス（Saccharomyces））、バキュロウイルス昆虫細胞系、ショウジョウバエ（D rosophila）昆虫系、およびＹＣｐ１９（サッカロミセス）を包含するがこれらに限らない。一般的には、"DNA Cloning":Vols.I&II,Glover et al.ed.IRL Pres s Oxford(1985)(1987)およびT.Maniatis et al.,"Molecular Cloning" Cold Spr ing Harbor Laboratory(1982)参照。遺伝子をプロモーター、リボソーム結合部位（細菌での発現の場合）および所望によりオペレーター（本明細書ではまとめて「制御」エレメントという）の制御下に置いて、この発現構築物を含むベクターにより形質転換された宿主細胞において所望蛋白をコードしているＤＮＡ配列がＲＮＡに転写されるようにすることができる。コーディング配列はシグナルペプチドまたはリーダー配列を含んでいてもよく、含んでいなくてもよい。例えば、イー・コリのｔａｃプロモーターまたはプロテインＡ（ｓｐａ）プロモーターおよびシグナル配列を用いて本発明のサブユニット抗原を発現させることができる。翻訳後プロセッシングにおいて細菌宿主によりリーダー配列が除去されうる。例えば、米国特許第４,４３１,７３９号；第４,４２５,４３７号；第４,３３８,３９７号参照。制御配列のほかに、宿主細胞の増殖に比例して蛋白配列の発現を調節する調節配列を添加することが望ましいかもしれない。調節配列は当業者に知られており、例は、調節化合物の存在を包含する化学的または物理的刺激に対応して遺伝子発現をスイッチオンまたはオフするものを包含する。他のタイプの調節エレメント、例えばエンハンサーがベクター中に存在してもよい。特定のコーディング配列が適当な調節配列を伴ってベクター中に存在するように発現ベクターを構築し、制御配列に対するコーディング配列の位置および方向は、コーディング配列が制御配列の制御下で転写される（すなわち、制御配列においてＤＮＡ分子に結合するＲＮＡポリメラーゼがコーディング配列を転写する）ような位置および方向である。対象とする特定の抗原をコードしている配列の修飾は、この目的の達成に望ましいかもしれない。例えば、いくつかの場合、適当な方向、すなわち、読み枠を維持する方向で配列が制御配列に結合できるように配列を修飾する必要があるかもしれない。上記クローニングベクターのごときベクター中に挿入する前に制御配列および他の調節配列をコーディング配列に連結してもよい。別法として、すでに制御配列および適当な制限部位を有している発現ベクター中にコーディング配列を直接クローンすることもできる。いくつかの場合において、ガラクトキナーゼ蛋白の他の変異体またはアナログを製造することが望ましいかもしれない。該蛋白をコードしている配列の一部の欠失、配列の挿入および／または配列中の１個またはそれ以上のヌクレオチドの置換により変異体またはアナログを製造することができる。部位特異的突然変異法のごときヌクレオチド配列修飾法は当業者によく知られている。例えば、上記 T.Maniatis et al.,DNA Cloning,Vols.I and II；および上記Nucleic Acid Hybr idization参照。多くの原核発現ベクターが当該分野において知られている。例えば、米国特許第４,５７８,３５５；４,４４０,８５９；４,４３６,８１５；４,４３１,７４０；４,４３１,７３９；４,４２８,９４１；４,４２５,４３７；４,４１８,１４９；４,４１１,９９４；４,３６６,２４６；４,３４２,８３２号参照；さらに英国特許第出願ＧＢ２,１２１,０５４；ＧＢ２,００８,１２３；ＧＢ２.００７,６７５；および欧州特許出願第１０３,３９５号参照。酵母発現ベクターも当該分野において知られている。例えば、米国特許第４,４４６,２３５；４,４４３,５３９；４,４３０,４２８号参照；さらに欧州特許出願第１０３,４０９；１００,５６１；９６,４９１号参照。哺乳動物細胞において発現をドライブするためにＳＶ４０後期プロモーターを用いたｐＳＶ２neo（J.Mol.Appl.Genet.1:327〜341）または発現をドライブするためにＣＭＶプロモーターを用いたｐＣＤＮＡ１由来のベクターであるｐＣＤＮＡ１neo（Mol.Cell Biol.7:4125〜4129）もある。これら２つのベクターを、哺乳動物細胞における一時的または安定な（Ｇ４１８耐性を用いる）発現のために使用することができる。昆虫細胞発現系、例えば、ショウジョウバエも有用である。例えば、ＰＣＴ出願ＷＯ９０／０６３５８およびＷＯ９２／０６２１２ならびにＥＰ２９０,２６１−Ｂ１参照。選択された発現系および宿主に応じて、上記発現ベクターにより形質転換された宿主細胞を適当な条件下で増殖させ、そのことにより対象蛋白を発現させることにより本発明蛋白を製造する。好ましい哺乳動物細胞はヒト・胚腎細胞、サル・腎臓細胞（ＨＥＫ−２９３細胞）、線維芽細胞（ＣＯＳ）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ショウジョウバエまたはネズミ・Ｌ−細胞を包含する。発現系が蛋白を増殖培地中に分泌する場合には、蛋白を培地から直接精製することができる。蛋白が分泌されない場合には、蛋白を細胞溶解物から単離するか、または細胞膜フラクションから回収する。適当な増殖条件および回収方法の選択は当該分野の技術の範囲内である。本発明蛋白を同定するための別法は、遺伝子ライブラリーを構築し、得られたクローンを用いてイー・コリを形質転換し、個々のコロニーをプールし、ガラクトキナーゼに対するポリクローナル血清またはモノクローナル抗体を用いて個々のコロニーをスクリーニングすることによる。既知アミノ酸配列または対象遺伝子のＤＮＡ配列由来のアミノ酸配列を用いる固相ペプチド合成のごとき化学合成により本発明蛋白を製造してもよい。かかる方法は当業者に知られている。ペプチドの化学合成が特に好ましいわけではない。本発明蛋白または少なくとも１つのエピトープを含むそれらのフラグメントを用いてポリクローナルおよびモノクローナル両方の抗体を製造することができる。ポリクローナル抗体が所望の場合、免疫応答を誘導しうる（すなわち、少なくとも１つのエピトープを有する）本発明蛋白またはそのフラグメントで選択動物（例えば、マウス、ウサギ、ヤギ、ウマ等）を免疫する。知られた方法に従って免疫動物由来の血清を集め、処理する。ポリクローナル抗体を含有する血清を用いる場合、免疫アフィニティークロマトグラフィーまたは他の知られた方法によりポリクローナル抗体を精製することができる。当業者は、本発明蛋白およびそれらのフラグメントに対するモノクローナル抗体も容易に製造することができる。ハイブリドーマ法を用いることによるモノクローナル抗体製造の一般的方法論がよく知られている。細胞融合により、また腫瘍遺伝子ＤＮＡでのＢ細胞の直接形質転換またはエプスタイン−バールウイルスでの感染のごとき他の方法によっても不死抗体産生細胞系を作ることができる。例えば、M.Schreier et al.,"Hybridoma Techniques"(1980)；Hammerling et al. ,"Monoclonal Antibodies and T-cell Hybridomas"(1981)；Kennett et al.,"Mo noclonal Antibodies"(1980)参照；さらに米国特許第４,３４１,７６１；４,３９９,１２１；４,４２７,７８３；４,４４４,８８７；４,４５２,５７０；４,４６６,９１７；４,４７２,５００；４,４９１,６３２；および４,４９３,８９０号参照。対象抗原またはそのフラグメントに対して産生されたモノクローナル抗体の集団を、種々の特性、例えば、イソタイプ、エピトープ、アフィニティー等に関してスクリーニングすることができる。それゆえ、当業者は、変異ガラクトキナーゼ蛋白、例えば、配列番号：５のミスセンス変異種または配列番号：６のナンセンス変異種と特異的に反応するモノクローナル抗体を製造することができる。指向される個々の抗原の免疫アフィニティーを用いる精製においてモノクローナル抗体は有用である。別法として、当該分野において知られたＰＣＲ法により対象のモノクローナル抗体をコードしている遺伝子をハイブリドーマから単離し、適当なベクターにクローンし、発現させることもできる。本発明抗体は、ポリクローナルであってもモノクローナルであっても、イムノアッセイ、ＲＩＡ、ＥＬＩＳＡ等における試薬としてそれらを用いることができるというさらなる有用性を有する。本明細書の用語「モノクローナル抗体」は、１つの種（例えば、ネズミ、ウサギ、ヤギ、ラット、ヒト等）由来の抗体ならびに２つ（またはおそらくそれ以上）の種に由来する抗体（例えば、キメラまたはヒト化抗体）を包含するものと理解される。非ヒト・可変領域がヒト・不変領域に結合または融合されているキメラ抗体（例えば、Liu et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84:3439(1987)）も、アッセイに、あるいは治療的に用いることができる。好ましくは、Jones et al.,Nature,32 1:522(1986)；Verhoeyen et al.,Science,239:1534(1988)；Kabat et al.,J.Imm unol.,147:1709(1991)；Queen et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86:10029(1989) ；Gorman et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88:34181(1991)；およびHodgson et al.,Bio/Technology,9:421(1991)に記載のごとく治療的なモノクローナル抗体を「ヒト化」する。それゆえ、本発明は、ヒト・ガラクトキナーゼ由来の本明細書開示のアミノ酸配列に対応するエピトープに指向されるポリクローナルまたはモノクローナル抗体（キメラおよび「ヒト化」抗体を包含）をも企図する。ポリクローナルおよびモノクローナル抗体の製造方法はよく知られており、例えば、上記Ausbel et alの第１１章参照。放射活性、蛍光または酵素のごとき分析的に検出可能な試薬で抗体を標識する場合、抗体を用いてヒト・ガラクトキナーゼの存在および／またはその量的レベルを調べることができる。さらに、本発明のミスセンスまたはナンセンス変異体に特異的な抗体（ポリクローナルまたはモノクローナル）は診断目的に有用である。血清または組織試料（例えば、肝臓、肺等）を得て、抗体（または抗体フラグメント）と変異ガラクトキナーゼ蛋白との間に抗原−抗体複合体が形成されるような条件下で本発明変異ヒト・ガラクトキナーゼ蛋白に特異的に結合する抗体または抗体フラグメントと接触させる。該複合体の存在または不存在の検出は当該分野の技術の範囲内であり（例えば、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ウェスタンブロッテイング、光学的バイオセンサー（例、BIAcore-Pharmacia Biosensor,Uppsala, Sweden））、本発明を限定しない。また本発明は、有効量の本発明ガラクトキナーゼ蛋白および医薬上許容される担体を含む医薬組成物を企図する。本発明蛋白性医薬組成物は特に非経口投与、すなわち、皮下筋肉内または静脈投与に有用である。所望により、ガラクトキナーゼ蛋白をリポソームのごとき膜結合小胞によって取り囲んでもよい。通常には、非経口投与用組成物は、許容される担体、好ましくは水性担体に溶解された本発明化合物またはそのカクテルの溶液を含む。種々の水性担体、例えば、水、緩衝化された水、０.４％セイライン、０.３％グリシン等を用いることができる。これらの溶液は滅菌されており、一般的には粒状物質を含まない。これらの溶液を慣用的なよく知られた滅菌法により滅菌することができる。組成物は、必要に応じて生理学的条件を調節するためにｐＨ調節剤および緩衝化剤等のごとき医薬上許容される補助的物質を含有していてもよい。かかる医薬処方中の本発明化合物の濃度を広範囲に、すなわち、約０.５重量％未満から、通常には約１重量％または少なくとも１重量％から１５または２０重量％まで変化させることができ、主として液体の体積、粘度等に基づいて、選択される個々の投与方法に応じて選択する。よって、筋肉内注射用本発明医薬組成物を、１ｍＬの滅菌水および５０ｍｇの本発明化合物を含有するように調製することができる。同様に、静脈注射用本発明医薬組成物を、２５０ｍｌまでの滅菌リンゲル溶液および１５０ｍｇの本発明化合物を含有するように調製することができる。非経口投与可能組成物の実際的な調製方法は当業者によく知られているかまたは明らかであろうし、例えば、Re mington's Pharmaceutical Science,15th ed.,Mack Publishing Company,Easton ,Pennsylvaniaに詳細に記載されている。本明細書記載の組成物を保存のために凍結乾燥でき、使用前に適当な担体中に復元することができる。この方法は慣用的な蛋白について効果的であることがわかっており、当該分野で知られた凍結乾燥および復元方法を用いることができる。医師が本発明治療剤の最適用量を決定し、その量は投与形態および選択された個々の化合物に応じて変化させられ、さらにそのうえ、その量は治療中の個々の患者に応じて変化させられるであろう。一般的には、医師は、化合物の最適用量より実質的に少ない用量で治療を開始し、その状況下で最適効果が得られるまで少しずつ用量を増加させていく。組成物が経口的に投与される場合、より少量を非経口的に投与した場合の効果と同じ効果を得るためにはより多量の有効成分が必要である。一般的には、治療用量は、いくつかの異なった１回分の用量として投与できるのであるが、１日１ないし１０ミリグラムおよびそれ以上である。患者の状態に応じて、本発明医薬組成物を予防的および／または治療的処置のために投与することができる。治療的適用において、すでに疾病にかかっている患者に組成物を投与して疾病およびその合併症を治癒し、あるいは少なくとも部分的に進行をくい止める。予防的適用において、本発明化合物またはそのカクテルを、まだ疾病状態にない患者に投与して患者の抵抗力を高める。治療医師により選択された投与レベルおよびパターンに応じて医薬組成物を１回または複数回投与することができる。いずれの場合にも、本発明医薬組成物は患者を治療するに十分な本発明化合物を与えるものであるべきである。また本発明は、本発明ガラクトキナーゼ遺伝子の診断薬としての使用を企図する。例えば、いくつかの疾病は遺伝的に欠陥のある遺伝子から生じる。欠陥遺伝子の配列を正常遺伝子の配列と比較することにより、これらの遺伝子を検出することができる。次いで、ガラクトースを測定することにより、「変異」遺伝子がガラクトキナーゼ欠乏に関連していることを証明することができる。すなわち、変異遺伝子は（異常に）上昇した患者のガラクトースレベルに関連していることとなるであろう。さらに、今までのところガラクトキナーゼ変異を証明しあるいは同定するための別の手段としての機能的アッセイ系（例えば、比色アッセイ、マッコンキープレート上での発現、例えば酵母またはイー・コリのガラクトキナーゼ欠損株における相補性実験）において変異ガラクトキナーゼ遺伝子を適当な発現ベクター中に挿入することができる。一例として、個体からのＲＮＡを逆転写酵素で転写してｃＤＮＡとし、次いで、それをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅し、イー・コリ発現ベクター中にクローンし、イー・コリのガラクトキナーゼ欠損株中に形質転換することができる。マッコンキー指示プレート上で増殖した場合、ガラクトキナーゼ欠損細胞は白色コロニーを生じるであろうが、機能的ガラクトキナーゼ遺伝子で形質転換／相補された細胞は赤色となるであろう（例えば、実施例セクション参照）。個体由来のコロニーの大部分ないしすべてが赤色である場合には、個体はガラクトキナーゼ活性に関して正常であると考えられる。約５０％のコロニーが赤色の場合には（残り５０％は白色）、個体はガラクトキナーゼ欠乏のキャリアである可能性がある。大部分ないしすべてのコロニーが白色である場合には、個体はガラクトキナーゼ欠乏症である可能性がある。「変異」遺伝子を同定したならば、「変異」ガラクトキナーゼのキャリア集団をスクリーニングすることができる（キャリアとは、その者の染色体がその者の子孫に伝達されうる「変異」ガラクトキナーゼ遺伝子を含む、見かけ上健康な人である）。さらに、変異ガラクトキナーゼに特異的なモノクローナル抗体を上記のような診断目的に用いることもできる。ヒト・ガラクトキナーゼ遺伝子における変異を有する個体を、種々の方法によりＤＮＡレベルで検出することができる。診断に用いる核酸（ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ等）を、例えば血液、尿、唾液、組織生検（例えば、絨毛サンプリングまたは羊水細胞取得）および剖検材料の患者細胞から得ることができる。ゲノムＤＮＡを検出に直接使用してもよく、分析前にＰＣＲ、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）等を用いることにより酵素的に増幅してもよい（例えば、Saiki et al.,Nature,324:163〜166(1986)、Bej et al.,Crit.Rev.Bioche m.Molec.Biol.,26:301〜334(1991)、Birkenmeyer et al.,J.Virol.Meth.,35:117 〜126(1991)、Van Brunt,J.,Bio/Technology,8:291〜294(1990)参照）。ＲＮＡを同じ目的に使用してもよい。ＰＣＲ−ＲＴ（ポリメラーゼ連鎖反応−逆転写酵素）を用いてＲＮＡを一度に逆転写し増幅することができ、あるいは未増幅ｃＤＮＡへと逆転写することができる。一例として、本発明核酸に相補的なＰＣＲプライマーを用いてガラクトキナーゼ変異を同定し分析することができる。例えば、正常ガラクトキナーゼ遺伝子型と比較した場合の増幅産物のサイズの変化により欠失および挿入を検出することができる。放射性標識した（本発明の）ガラクトキナーゼＲＮＡ、あるいは放射性標識した（本発明の）ガラクトキナーゼアンチセンスＤＮＡ配列に増幅ＤＮＡをハイブリダイゼーションさせることにより点突然変異を同定することができる。ＲＮａｓｅＡ消化または融解温度（Ｔｍ）の相違により、完全に合致した配列をミスマッチ二本鎖と識別することができる。かかる診断は胎児および新生児の試験に有用であろう。さらに、リファレンス遺伝子と「変異」遺伝子との間の点突然変異および他の配列の相違を、他のよく知られた方法、例えば、直接ＤＮＡ配列決定、１本鎖コンホーメーション多型性（ＳＳＣＰ；Orita et al.,Genomics,5:874〜879(1989) ）により同定することができる。例えば、配列決定プライマーを２本鎖ＰＣＲ生成物または改変ＰＣＲにより得られた１本鎖鋳型分子とともに使用する。放射性標識ヌクレオチドを用いる慣用的方法または蛍光タグを用いる自動配列決定法により配列決定を行う。クローン化したＤＮＡセグメントをプローブとして用いて特定のＤＮＡセグメントを検出してもよい。ＰＣＲと組み合わせた場合この方法の感度は大いに向上する。ヌクレオチド反復の存在はガラクトキナーゼ活性の変化（原因となる変化）に関係している可能性があり、あるいは種々の多型性のマーカーとして役立つ可能性がある。変性剤の存在下または不存在下におけるゲル中のＤＮＡフラグメントの電気泳動度の変化を検出することにより、ＤＮＡ配列の相違に基づく遺伝学的試験を行うことができる。高分解能ゲル電気泳動により小規模な配列の欠失および挿入を可視化することができる。変性作用のあるホルムアミドグラジエントゲル上で異なる配列のＤＮＡフラグメントを識別することができ、異なるＤＮＡフラグメントの移動は、それらの個々の融解温度または部分的融解温度によりゲル中の異なる位置において遅延される（例えば、Myers et al.,Science,230:1242(1985)参照）。さらに、配列の変化、詳細には小規模な欠失を、非変性ゲル電気泳動におけるＤＮＡヘテロ二重鎖の移動パターンの変化として検出することもできる（すなわち、ヘテロ二重鎖電気泳動）（例えば、Nagamine et al.,Am.J.Hum.Genet., 45:337〜339(1989)参照）。ＲＮａｓｅおよびＳ１保護のごときヌクレアーゼ保護アッセイまたは化学的開裂法により、特定の位置での配列の変化も明らかにすることができる（例えば、 Cotton et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85:4397〜4401(1985)）。よって、ハイブリダイゼーション（例えば、ヘテロ二重鎖エレクトロポレーション、White et al.,Genomics,12:301〜306(1992)参照）、ＲＮＡｓｅ保護（例えば、Myers et al.,Science,USA85:4397〜4401(1985)）、直接ＤＮＡ配列決定、または制限酵素の使用（例えば、制限フラグメント長多型性（ＲＦＬＰ）、なおＲＦＬＰにおいては制限フラグメントの数およびサイズの多様性により挿入、欠失、ヌクレオチド反復の存在、およびエンドヌクレアーゼ制限配列を作り出しあるいは破壊する他の変異が示されうる）のごとき方法により、特定のＤＮＡ配列の検出を行うことができる。ゲノムＤＮＡのサザンブロッティングを用いて大規模な（すなわち１００塩基対より大）欠失および挿入を同定してもよい。より慣用的なゲル電気泳動およびＤＮＡ配列決定のほかに、in situ分析（例えば、Keller et al.,DNA Probes,2nd Ed,Stockton Press,New York,N.Y.,USA(1 993)参照）によって変異（例えば、微小な欠失、異数性、トランスロケーション、インバージョン）を検出することもできる。すなわち、単離および／または膜上に固定することなく、細胞中のＤＮＡ（またはＲＮＡ）配列を変異に関して分析することができる。蛍光in situハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）は現在最も普通に用いられている方法であり、ＦＩＳＨについて多くのレビューが出ている。例えば、Trachuck et al.,Science,250:559〜562(1990)およびTrask et al.,Trends.Genet.,7:149〜154(1991)参照、これらを参照により本明細書に記載されているものとみなす。それゆえ、特定遺伝子、例えばガラクトキナーゼ遺伝子の構造に基づく核酸を用いることにより、ガラクトキナーゼ欠乏症に関する診断試験を進歩させることができる。さらに、いくつかの疾病は、ｍＲＮＡにおける変化により検出されうる遺伝子発現の変化の結果であり、あるいはその変化により特徴づけられる。別法として、ガラクトキナーゼ遺伝子をリファレンスとして用いて、例えば、ノーザンブロッティングまたはin situハイブリダイゼーションにより低下したレベルのガラクトキナーゼを発現する個体を同定することができる。適当なハイブリダイゼーション条件を決定することは当該分野の技術の範囲内である。例えば、"Current Protocols in Mol.Biol."Vol.I&II,Wiley Interscie nce.Ausbel et al.(ed.)(1992)参照。プローブ法は当該分野でよく知られており、プローブのサイズを広範囲に変化させることができるが、プローブは少なくとも１５ヌクレオチドの長さであることが好ましいと理解されている。好ましくはかかるプローブを分析的に検出可能な試薬で標識してブローブの同定を容易にできることが理解されている。有用な試薬は放射活性、蛍光色素または検出可能な生成物の形成を触媒する酵素を包含するが、これらに限らない。一般則として、ハイブリダイゼーション条件がより厳密になればなるほど、回収される遺伝子はより密接に関連したものとなるであろう。本明細書開示のヒト・ガラクトキナーゼ配列に対して予想されるアンチセンスオリゴヌクレオチドも本発明の範囲内である。合成オリゴヌクレオチドまたは関連アンチセンス化学構造アアログを設計してガラクトキナーゼおよびガラクトキナーゼ変異をコードしている標的核酸を認識し特異的に結合するようにする。アンチセンス法の一般的利用は下記開示により説明され、背景の目的でそれらを参照により本明細書に記載されているとみなす（Cohen,J.S.,Trends in Pharm.Sci .,10:435(1989)およびWeintraub,H.M.Scientific American,１月号(1990)40ページ）。宿主の適当な受精卵または胚を本明細書開示のヒト・ガラクトキナーゼをコードする核酸でトランスフェクションすることにより、トランスジェニックな非ヒト動物を得てもよい。例えば、米国特許第４,７３６,８６６；５,１７５,３８５；５,１７５,３８４および５,１７５,３８６号参照。得られたトランスジェニック動物をガラクトキナーゼ研究のモデルとして用いてもよい。詳細には、有用なトランスジェニック動物は受容体の発現に関連した検出可能な表現型を示す動物である。次いで、関連する表現型を逆転または悪化させる能力に関して薬剤をスクリーニングすることができる。さらに本発明は、種々の温度または代謝条件にさまざまに応答する調節エレメントに受容体コーディング遺伝子を作動可能に結合させ、そのことにより、これらの条件に応答して表現型発現を効果的にオンまたはオフすることに関する。必ずしも本発明を限定するものではないが、以下の記載は本発明を説明するいくつかの実験データである。実施例Ｉ胎盤組織からのヒト・ガラクトキナーゼの精製 Stambolianら（Biochim.Biophys.Acta,831:306〜312(1985)）（参照によりその全体を本明細書に記載されているものとみなす）により記載されたようにしてヒト・胎盤からガラクトキナーゼ（galK）を得た。本質的には、ヒト・胎盤組織（分娩１時間以内に得た）をホモジナイズし、遠心分離し、得られた上清をラクションを濃縮した。ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動による分離後、精製蛋白を得て、次いで、標準的方法（Laemmli,Nature,227:680〜685(1970)またはLeGendre et al.,Biotechniques,6:154(1988)参照）を用いてウェスタンブロッティングを行った。複数ラウンドの蛋白精製により微量（マイクログラム）のガラクトキナーゼを単離した。トリプシンペプチド消化後、７個のペプチド配列を最終的に単離し同定した。最も長い３つのフラグメントを下に示す：部分的に配列決定されていたｃＤＮＡによりコードされるペプチド配列と該フラグメントとを比較した。ｃＤＮＡ（発現配列タグまたはＥＳＴｓとしても知られる）をHuman Genom Sciences,Inc.（Rockville,MD,USA）から得た。ヒト・破骨細胞腫間質細胞ライブラリー由来のＥＳＴ配列（配列番号：１は１８個のひとつづきのアミノ酸について１００％の同一性を示した）およびヒト・下垂体ライブラリー由来のＥＳＴ配列（配列番号：２は２２個のひとつづきのアミノ酸について９５.５％の同一性を示した）に関して最大の一致が得られた。ヒト・破骨細胞腫間質細胞ライブラリー由来の全長のｃＤＮＡを同定し、ＡＢＩ３７３Ａ自動シークエンサーによりその全体を配列決定した。両鎖について配列決定を確認した。対応アミノ酸配列（配列番号：４）を上で同定されたペプチドフラグメントと比較した。配列番号：１は全長のヒト・ガラクトキナーゼ蛋白のアミノ酸３６〜６８に対応する。同様に、配列番号：２および３はヒト・ガラクトキナーゼのアミノ酸３６７〜３８８および１６７〜１９５にそれぞれ対応する。ヒト・ガラクトキナーゼ遺伝子の分析：ヒト・ガラクトキナーゼのアミノ酸配列とイー・コリのガラクトキナーゼのアミノ酸配列（Debouck et al.,Nuc.Acid Res.,13:1841〜1853(1985)）との比較により６１％の相同性および４４.５％の同一性が示される。別のヒト・ガラクトキナーゼ遺伝子（ＧＫ２）（Lee et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:10887〜10 891(1992)）とのさらなる比較により、アミノ酸レベルで５４％の相同性および３４.６％の同一性が示された。さらにそのうえ、蛍光in situハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）分析により調べたところ、ヒト・染色体１７、ポジションｑ２４にマッピングされる本発明遺伝子とは対照的に、ＧＫ２遺伝子はヒト・染色体１５にマッピングされる。標準的方法（例えば、Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laborartory Ma nual,2nd Ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989参照）に従って、胎盤、脳、骨格筋、腸、心臓、肺および肝臓由来のヒト・メッセンジャーＲＮＡを含むノーザンブロットに対して配列番号：４をハイブリダイゼーションさせた。ヒト・肝臓および肺組織とのハイブリダイゼーションが最強であった。ガラクトキナーゼ相補：配列番号：４を、イー・コリベクタープラスミドpBluescript［Stratagene］中にサブクローンした。ガラクトキナーゼ欠損株Ｃ６００Ｋ−中に形質転換した場合、形質転換されたイー・コリは１％ガラクトース（およびプラスミド選択のために５０μｇ／ｍｌのアンピシリン）を含有するマッコンキー寒天プレート上で増殖し、レンガ色のコロニーを生じ、糖の醗酵が示された。詳細には、赤色は、ガラクトース醗酵により生成した酸のマッコンキー培地中の胆汁酸塩および指示薬（ニュートラルレッド）に対する作用によるものである。哺乳動物細胞における発現配列番号：４をＣＯＳ−１細胞［ＡＴＣＣＣＲＬ１６５０］中にサブクローンした。Stambolianら（Exp.Eye Res.,38:231〜237(1984)（その全体を参照により本明細書に記載されているものとみなす））により記載された¹⁴Ｃガラクトキナーゼアッセイにより溶解物をアッセイした。一時的にトランスフェクションされたＣＯＳ細胞において発現された場合、ガラクトキナーゼ活性は対照レベルよりも１０倍高かった（１分あたり６４０カウント対６６００カウント−３回繰り返し測定）。これらの結果は、配列番号：４は全長の、生物学的に活性のあるヒト・ガラクトキナーゼ遺伝子をコードしていることを明確に確認するものである。本発明核酸分子を発現ベクターにサブクローンして高レベルのヒト・ガラクトキナーゼ（別の蛋白に融合している、例えば、５’末端において別のコーディング配列に作動可能に結合しているか、あるいは融合していない）を形質転換細胞において産生させることもできる。哺乳動物細胞については、所望により、Ｇ４１８中での増殖能に基づいてトランスフェクション体を選択するためのネオマイシン耐性遺伝子およびＤＨＦＲ^-細胞中のトランスフェクションされた遺伝子の増幅を可能にするジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子を発現ベクターがコードしていてもよい。次いで、プラスミドを宿主細胞、例えば、無血清培地での増殖に適した非付着性ＤＨＦＲ^-細胞系ＣＨＯＡＣＣ９８、およびヒト・胚腎臓２９３細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ１５７３）中に導入し、トランスフェクションされた細胞系をＧ４１８耐性により選択することができる。ヒト・ガラクトキナーゼ遺伝子−ゲノム配列ｇａｌＫのｃＤＮＡをプローブとして用いて、ラムダファージ（λ Fix II）ヒト・ゲノムライブラリー（ヒト・胎盤組織から調製）から全長のガラクトキナーゼゲノム遺伝子コーディング領域を同定した。クローン１７と命名された１の単離体を１９９５年５月３日に受託番号ＡＴＣＣ９７１３５として、アメリカ合衆国メリーランド州RockvilleのAmerican Type Culture Collection(ATCC)に寄託し、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に従って特許寄託物として受託された。ゲノム遺伝子コーディング領域は、４つのＤＮＡフラグメントから単離された少なくとも８つのエキソンに分けられる。配置を図１に示す。ｇａｌＫのｃＤＮＡ配列に対応する（すなわち、ｇａｌＫゲノムエキソンに対応する）複数のオリゴヌクレオチドＰＣＲプライマーならびに引き続き設計された非コーディング領域（すなわち、ｇａｌＫゲノムイントロン）に対応するオリゴヌクレオチドＰＣＲプライマーを用いることによりＤＮＡ配列を決定した。かくして、ガラクトキナーゼゲノム遺伝子の構造を下表１にまとめる（図２および配列番号：７も参照）。ガラクトキナーゼ欠損マーカー／遺伝子ガラクトキナーゼ欠乏症に患者由来の線維芽細胞系（ＧＭ００３３４）を、Co riell Institute for Medical research,401 Haddon Ave.,Camden,New Jersey,0 8103から得た。ＲＮＡ単用のＲＮＡＺＯＬキット（Biotecx,Houston,Tx）を用いて、培養細胞から全ＲＮＡを単離した。オリゴヌクレオチドプライマー１８２３［配列番号：２９］および１８２５［配列番号：３０］を用いて細胞質ＤＮＡ（１μｇ）を逆転写した。９４℃１分、６０℃１分、次いで７２℃７分を３５サイクル行うことにより試料を増幅した。ＤＮＡ生成物を電気泳動的に精製し、ＴＡクローニングベクター（Invitrogen）に連結し、配列決定した。全部で１２個のｃＤＮＡ（複数の独立したＰＣＲ反応のクローンされたＰＣＲ生成物を表現する）を配列決定した。正常対象（すなわち、ガラクトキナーゼ欠乏症を示さない人）由来の培養線維芽細胞を用いてこの方法を繰り返した。正常対象との比較により、「正常」ヒト・ガラクトキナーゼ遺伝子［配列番号: ４］の位置１２２のＧがＡとなっている単一塩基置換が同定された。その結果は、アミノ酸３２のＶａｌからＭｅｔへのミスセンス変異である［配列番号：５］。ＧからＡへの塩基変化はＭｓｃＩエンドヌクレアーゼ制限部位（すなわち、ＴＧＧ↓ＣＣＡ）を変異対立遺伝子上に作り出す。次いで、この制限部位を用いて、ガラクトキナーゼ欠乏症患者の両親における変異対立遺伝子について迅速にスクリーニングを行う。本質的には、ガラクトキナーゼ残基１から５までをコードしているエキソン（すなわちエキソン１、表１参照）をゲノムラムダファージライブラリーからクローンし、隣り合ったイントロン配列の一部を含めてそのＤＮＡ配列を決定した。ゲノムＤＮＡの３４６塩基対ＤＮＡフラグメント増幅用イントロン配列にハイブリダイゼーションするようにオリゴヌクレオチドプライマー（Ｘ２−５ＯＵＴ［配列番号：３１］およびＸ２−３ＯＵＴ［配列番号：３２］）を設計した。点突然変異、すなわち、１.５％アガロースゲル電気泳動により検出される新たに形成されたＭｓｃＩ部位の存在に関してＰＣＲ生成物をＲＦＬＰにより分析した。「正常」対立遺伝子は酵素ＭｓｃＩで切断されず、よって、アガロースゲル上を３４６塩基対のフラグメントとして移動する。ガラクトキナーゼ欠乏症患者由来のＰＣＲ生成物（すなわち、ＧのＡへの塩基変化）はＭｓｃＩで開裂され、それぞれ１９３および１５３塩基対の２つのフラグメントを生じる。３４６塩基対のフラグメントの不存在は、患者がこの対立遺伝子に関してヘテロ接合であったことを示す。対照的に、この患者の両親由来のＰＣＲ生成物は、ＭｓｃＩによる消化後３つのフラグメント（３４６、１９３および１５３塩基対）を生じ、そのことはＧのＡへの塩基変化についてのヘテロ接合パターンと矛盾しない。すなわち、その両親はともに同じ変異のキャリアであった。ミスセンス変異が酵素活性の低下を引き起こすかどうかを調べるために、ＧからＡへの塩基変化を含むｃＤＮＡクローンをＣＯＳ細胞中にサブクローンし、すでに記載したようにしてガラクトキナーゼ活性についてアッセイした。ミスセンス変異をコードしているｃＤＮＡでトランスフェクションしたＣＯＳ細胞は宿主ＣＯＳ細胞と同レベル、すなわち０.０２ユニット／μｇ蛋白のガラクトキナーゼを有していた。未変異ガラクトキナーゼｃＤＮＡ［配列番号：４］でトランスフェクションしたＣＯＳ細胞は、宿主ＣＯＳ細胞（すなわち対照）と比較すると５０倍高い活性を有していた。この結果は、低下した酵素活性の原因としてのＶａｌ³²からＭｅｔ³²への置換を支持する。白内障を有し、ガラクトキナーゼ欠乏症と診断された（ガラクトキナーゼ活性はほとんどゼロとわかった）無関係な患者において別の変異が発見された。ゲノムＤＮＡをリンパ芽球細胞系から単離し、ＡＢＩ３７３Ａシークエンサーでの自動配列決定により配列決定した。ＧからＴへの単一塩基置換は、アミノ酸位置８０におけるインフレームナンセンスコドン（すなわち、ＴＡＧ）を生じた［配列番号：６］。この変異は未成熟なヒト・ガラクトキナーゼの終結を引き起こし、無機能であると考えられる７９個のアミノ酸の切断蛋白を生じる。（この患者の両親のゲノムＤＮＡは、この変異に関してヘテロ接合であり、それゆえ、ガラクトキナーゼ欠乏症でなかった）上記説明および実施例は、好ましい具体例を含めて本発明を十分に開示する。当業者は、日常的な実験以上のことを用いずに、本明細書の特定の具体例の多くの均等物を認識するであろうし、あるいは確認できるであろう。かかる均等物は下記請求の範囲内にあると考えられる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｑ 1/68 ＡＣ１２Ｑ 1/68 Ｇ０１Ｎ 33/50 ＴＧ０１Ｎ 33/50 33/573 Ａ 33/573 33/577 Ｂ 33/577 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者バーグスマ，ダーク・ジョンアメリカ合衆国19312ペンシルベニア州バーウィン、アイリッシュ・ロード271番 (72)発明者スタンボリアン，ドワイト・エドワードアメリカ合衆国08053ニュージャージー州マールトン、フォーン・コート６番

Claims

【特許請求の範囲】１．（ａ）配列番号：７に示す配列を含む核酸分子；および（ｂ）遺伝コードの縮重のためにコドン配列が（ａ）の核酸分子と異なる核酸分子からなる群より選択される、ヒト・ゲノムガラクトキナーゼをコードしている単離核酸分子。２．請求項１の核酸分子を含むベクター。３．請求項２のベクターを含む組み換え宿主細胞。４．配列番号：５のヌクレオチド２９から１２０４までまたは配列番号：６のヌクレオチド２９から２６５までをコードしているＤＮＡ配列を含む単離核酸分子。５．請求項４の核酸分子を含むベクター。６．プラスミドである請求項５のベクター。７．請求項５のベクターを含む組み換え宿主細胞。８．ヒト・ガラクトキナーゼ蛋白の製造方法であって、該蛋白の発現およびその回収を促進する条件下で請求項７の組み換え宿主細胞を培養することを含む方法。９．請求項４のＤＮＡ配列によりコードされる単離蛋白。１０．請求項９の蛋白と特異的に反応するモノクローナル抗体。１１．個体から血清または組織試料を単離し；請求項９のヒト・ガラクトキナーゼ蛋白に特異的に結合する抗体または抗体フラグメントとヒト・ガラクトキナーゼ蛋白との間に抗原−抗体複合体が形成される条件下で請求項９のヒト・ガラクトキナーゼ蛋白に特異的に結合する抗体または抗体フラグメントにかかる試料を接触させ；次いで、該複合体の存在または不存在を検出することを含む、ヒト・ガラクトキナーゼ欠乏症に関連した症状の診断方法。１２．個体から核酸試料を単離し；該試料およびヒト・ガラクトキナーゼ遺伝子をコードしているＤＮＡ配列または対応ＲＮＡ配列をアッセイし；次いで、該試料と配列番号：４のヌクレオチド２９から１２０４までをコードしている該ＤＮＡ（またはＲＮＡ）との間の相違を比較することを含み、該相違がヒト・ガラクトキナーゼ遺伝子における変異を示すものである、ヒト・ガラクトキナーゼ欠乏症に関連した症状の診断方法。１３．該試料が、後にＰＣＲ−ＲＴにより増幅されるＲＮＡである請求項１２の方法。１４．該試料をアッセイすることが制限エンドヌクレアーゼ消化を含むものである請求項１３の方法。１５．該制限エンドヌクレアーゼがＭｓｃＩである請求項１４の方法。１６．該試料をアッセイすることがハイブリダイゼーションアッセイを含むものである請求項１２の方法。１７．ハイブリダイゼーションアッセイが、ポリアクリルアミドゲルゲル中におけるヘテロ二重鎖生成物の異なる移動度を調べることを含むヘテロ二重鎖電気泳動であり、該ヘテロ二重鎖生成物が、核酸試料と配列番号：４のヌクレオチド２９から１２０４までをコードしているＤＮＡ配列または対応ＲＮＡ配列との間のハイブリダイゼーションの結果物である請求項１６の方法。１８．該試料をアッセイすることが、該核酸試料および配列番号：４のヌクレオチド２９から１２０４までをコードしているＤＮＡ配列または対応ＲＮＡ配列の制限フラグメント長多型性についてのゲル電気泳動を含むものである請求項１２の方法。１９．該試料をアッセイすることがＤＮＡ配列決定を含むものである請求項１２の方法。２０．個体からゲノムＤＮＡを含む細胞を単離し、次いで、配列番号：４のヌクレオチド２９から１２０４まで、配列番号：５のヌクレオチド２９から１２０４までまたは配列番号：６のヌクレオチド２９から２６５までをコードしているＤＮＡ配列；または該配列の少なくとも１つのエキソンをコードしているフラグメント；または該配列の少なくとも１５個のひとつづきの塩基対を含むフラグメントをプローブとして用いるin situハイブリダイゼーションにより該試料をアッセイすることを含む、ヒト・ガラクトキナーゼ欠乏症に関連した症状の診断方法。２１．いずれかの細胞において請求項４のＤＮＡを発現することのできるトランスジェニック非ヒト哺乳動物。