MXPA94008258A - Gen de la galactocinasa humana. - Google Patents

Abstract

Esta invencion se relaciona con la gelactocinasa humana, con acidos nucleicos aislados que codifican par la misma, con la celula huesped recombinante transformada con el ADN que codifica para tal proteina y con los usos de la proteina expresada y secuencias de acidos nucleicos en aplicaciones terapeuticas y de diagnostico.

Description

GEN DE LA GALACTOC INASA HUMANA Inventor (es): DERK JON BER6SMA y DWI6HT EDUARD STAMBOLIAN, Norteamericanos, con domicilio en: 271 Irish Road, Berwyn, Pennsylvania 19312 y 6 Fa n Court, Marlton, New Jersey 08053, respectivamente E.U.A.

Causahabiente: SMITHKLINE BEECHAM CORPORATION, una sociedad Norteamericana, organizada y existente de acuerdo con las leyes del Estado de Commonweal h of Pennsylvania, E.U.A. , con domicilio en: One Franklin Plaza, Phi ladelphia, PA 19103 y UNI ERSITY OF PENNSYLVANI , una institución Norteamericana, con domicilio en: 3700 Market Street, Suite 300, Phi ladelphia, Pennsylvania 19104-3147, E.U.A.

RESUMEN DE LA INVENCION Esta invención se relaciona con la galacto nasa humana, con ácidos nucleicos aislados que codifican para la misma, con la célula huésped recombinante trans ormada con el AON que codifica para tal proteína y con los usos de la proteína expresada y secuencias de ácidos nucleico en aplicaciones terapéuticas y de diagnóstico.

Esta invención se hace en parte con el apoyo del gobierno bajo EY-09404 concedido por los Institutos Nacionales de Salud. El Gobierno de los Estados Unidos tiene ciertos derechos en la invención.

CAMPO DE LA INVENCION Esta invención se relaciona con la galactocinasa humana, con los ácidos nucleicos aislados que codifican para la misma, con células huésped recombinantes transformadas con el ADN que codifica para tal proteína y con los usos de la proteína expresada y con las secuencias de ácidos nucleicos en aplicaciones terapéuticas y de diagnóstico.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION Existen numerosos desórdenes metabólicos humanos heredados, la mayoría de los cuales son recesivos. Muchos tienen efectos devastadores que pueden incluir una combinación de varias características clínicas, tales como retardo mental severo, lesión del sistema nervioso periférico, ceguera, deficiencia auditiva y organomegalia. La mayoría de los desórdenes son raros. Sin embargo, la mayoría de tales desórdenes no pueden ser tratados con fármacos. La deficiencia de la galactocinasa es una de las tres formas conocidas de la galactosemia. Las otras formas son la deficiencia de la galactosa-1 -fosfato uridiltransferasa y la deficiencia de la UDP-galactosa-4-epimerasa. Todas las tres enzimas están implicadas en el metabolismo de la galactosa, es decir la conversión de galactosa a glucosa en el cuerpo- La deficiencia de la galactocinasa es heredada como un rasgo recesivo autosómico con una frecuencia heterozigota calculada del 0.2% en la población general (véase, por ejemplo, Levy et al., J. Pediatr.. ¿2:871-877 (1978)). Como resultado de esta deficiencia, la galactosa se acumula en el cuerpo provocando toxicidad celular la cual con frecuencia se manifiesta por sí misma como cataratas en los recién nacidos. En algunos casos también se observa retraso mental. Esta invención proporciona un gen para la galactocinasa humana. Los ADN de esta invención, tales como las secuencias específicas descritas en la presente, son útiles en que codifican para la información genética requerida para la expresión de esta proteína. Adicionalmente, las secuencias pueden ser utilizadas como sondas para aislar e identificar miembros adicionales de la familia, tipo y/o subtipo así como también mutaciones que pueden formar la base de la deficiencia de la galactocinasa, la cual puede ser caracterizada por mutaciones sitioespecíficas o por la expresión atípica del gen de la galactocinasa. El gen de la galactocinasa también es útil como un agente de diagnóstico para identificar las proteínas de la galactocinasa mutante o como un agente terapéutico por medio de la terapia de genes. Las primeras pruebas clínicas de la terapia con genes comenzaron en 1 990. Desde ese tiempo, se han revisado y aprobado más de 70 protocolos de pruebas clínicas por una autoridad reguladora tal como NIH's Recombinant Advisory Committee (RAC) , véase, por ejemplo, Anderson, W. F. , Human Gene Therapy, .5 : 281 -282 ( 1 994 ) . El tratamiento terapéutico de las enfermedades y desórdenes por la terapia de genes implica la transferencia e inserción estable de nueva información genética dentro de las células. La corrección de un defecto genético por la reintroducción del alelo normal de un gen ha demostrado por lo tanto que este concepto es clínicamente factible (véase, por ejemplo, Rosenberg et al., New ??s. J. Med.. 323 : 570 ( 1 990 ) ) . Estos usos y usos adicionales para los reactivos descritos en la presente, se volverán aparentes para aquellos con habilidad ordinaria en la técnica por la lectura de esta especificación.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION Esta invención proporciona moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican para la galactocinasa humana incluyendo los ARNm, los ADN (por ejemplo, los ADNc, los ADN genómicos, etc.), así como también sus análogos antisentido y sus fragmentos biológicamente activos y diagnóstica o terapéuticamente útiles. Esta invención también proporciona vectores recombinantes, tales como la clonación y expresión de los plásmidos útiles como reactivos en la producción recombinante de las proteínas de la galactocinasa humana, así como también las células huésped procariótica y/o eucariótica recombinantes, que comprenden una secuencia de ácido nucleico de galactocinasa humana. Esta invención también proporciona un procedimiento para preparar la proteína de galactocinasa humana, el cual comprende cultivar células huésped procarióticas y/o eucarióticas recombinantes, que contienen una secuencia de ácidos nucleicos de galactocinasa humana, bajo condiciones que promueven la expresión de la proteína y la recuperación subsiguiente de la proteína. Otro aspecto relacionado de esta invención es una proteína de la galactocinasa humana aislada, producida por el método. En aún otro aspecto, esta invención también proporciona anticuerpos que están dirigidos (es decir, unidos) a la galactocinasa humana. Esta invención también proporciona sondas de ácido nucleico que comprenden moléculas de ácido nucleico de suficiente longitud, para hibridizar específicamente a las secuencias de galactocinasa humana. Esta invención también proporciona un método para diagnosticar la deficiencia de la galactocinasa humana, la cual comprende aislar una muestra de ácido nucleico de un individuo y evaluar la secuencia de la muestra del ácido nucleico con el gen de referencia de la invención y comparando las diferencias entre la muestra y el ácido nucleico de la presente invención, en el que las diferencias indican mutaciones en el gen de la galactocinasa humana aislados de un individuo. La muestra puede evaluarse por comparación de la secuencia directa (es decir, la secuenciación del ADN) , en la que la muestra de ácido nucleico puede compararse al gen de galactocinasa de referencia por hibridación (por ejemplo ensayos de desplazamiento de movilidad tal como electroforesis en gel de heteroduplex, SSCP u otras técnicas tales como inmunotranferencia Northern o Southern, las cuales se basan en la longitud de la secuencia de ácidos nucleicos) u otros métodos de electroforesis en gel conocidos, tales como RLFP. Alternativamente, el método de diagnóstico comprende aislar las células de un individuo que contiene el ADN genómico y ensayar la muestra (por ejemplo ARN celular) por la hibridación in situ utilizando la secuencia de ADN de la invención como una sonda. Esta invención también proporciona un oligonucleótido antisentido que tiene una secuencia capaz de unirse con los ARNm que codifican para la galactocinasa humana para identificar los genes de la galactocinasa mutantes. Esta invención también proporciona animales no humanos transgénicos, que comprenden una molécula de ácido nucleico que codifica para la galactocinasa humana. También se proporcionan métodos para el uso de animales transgénicos como modelos para enfermedades, mutaciones y SAR. Esta invención también proporciona un método para el tratamiento de condiciones las cuales se relacionan a la actividad de galactocinasa humana insuficiente, la cual comprende administrar a un paciente que necesita del mismo una composición farmacéutica que contiene la proteína galactocinasa de la invención, la cual es efectiva para suplementar la galactocinasa endógena del paciente y por lo tanto aliviar la condición. Esta invención también proporciona un método para el tratamiento de condiciones, las cuales se relacionan a la actividad de galactocinasa humana insuficiente por medio de la terapia de genes. Un gen de referencia adicional que comprende el gen de galactocinasa de la presente invención, se inserta en las células del paciente ya sea in vivo o ex vivo. El gen de referencia se expresa en células transfectadas y como resultado, la proteína codificada por el gen de referencia corrige el defecto (es decir, la deficiencia de galactocinasa) permitiendo así que las células transfectadas funcionen normalmente y alivien las condiciones de la enfermedad (o síntomas) .

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Esta invención se relaciona con la galactocinasa humana y su uso como un agente de diagnóstico y terapéutico. La secuencia particular de la galactocinasa humana está identificada como la SECUENCIA DE IDENTIFICACION NO: 4 como se describió más completamente en lo siguiente. Para describir además la presente invención, se emplearán los siguientes términos adicionales y están destinados para ser definidos como se indica en lo siguiente. Un "antígeno" se refiere a una molécula que contiene uno o más epítopes que estimularán el sistema inmune del huésped para formar una respuesta especxfica del antígeno humoral y/o celular. El término también se utiliza en la presente intercambiablemente con "inmunógeno" . El término "epítope" se refiere al sitio sobre un antígeno o hapteno al cual se une una molécula de anticuerpo específica. El término se utiliza también en la presente intercambiablemente con "determinante antigénico" o "sitio determinante antigénico". Una secuencia de codificación está "unida funcional u operablemente" a otra secuencia de codificación cuando la ARN polimerasa, tanscribirá la dos secuencias de codificación en un solo ARNm, el cual se traduce entonces en un polipéptido individual que tiene los aminoácidos derivados de ambas secuencias de codificación. Las secuencias de codificación no necesitan estar contiguas entre sí, mientras que la secuencia expresada sea procesada por último para producir la proteína deseada. Los polipéptidos "recora inantes" se refieren a polipéptidos producidos por técnicas de ADN recombinante; es decir, producidas a partir de las células transformadas por un constructo de ADN exógeno que codifica para el polipéptido deseado. Los polipéptidos "sintéticos" son aquellos preparados por síntesis química. Un "replicón" es cualquier elemento genético (por ejemplo, plásmido, cromosoma, virus) que funciona como una unidad autónoma de la replicacion del ADN in vivo; es decir, capaz de la replicacion bajo su propio control. Un "vector" es un replicón tal como un plásmido, fago o cósmido al cual otro segmento de ADN puede estar unido, para llevar a cabo la replicacion del segmento unido. Un "virus deficiente en la replicacion" es un virus en el cual las funciones de corte y/o replicacion han sido alteradas, de tal manera que después de la transfección en una célula huésped, el virus no es capaz de reproducirse y/o infectar a las células adicionales.

Un gen "de referencia" se refiere a la secuencia de la galactocinasa de la invención y se entiende que incluye las diversas secuencias de polimorfismos que existen, en las que las sustituciones del nucleótido en la secuencia del gen existen, pero no afectan la función esencial del producto del gen. Un gen "imitante" se refiere a las secuencias de galactocinasa diferentes del gen de referencia, en el que las sustituciones y/o eliminaciones y/o inserciones de nucleóticos resultan en un daño de la función esencial del producto del gen de tal manera que las concentraciones de galactosa en un individuo (o paciente) están elevadas atípicamente. Una "secuencia de codificación de" o una "secuencia de nucleótidos que codifican para" un ADN para una proteína particular es una secuencia de ADN en la cual es transcrita y traducida a un polipéptido cuando se coloca bajo el control de las secuencias reguladoras apropiadas . Una "secuencia promotora" es una región reguladora de ADN capaz de unir a ARN polimerasa en una célula e iniciar la transcripción de una secuencia de codificación corriente abajo (dirección 3')· Para los fines de definir la presente invención, la secuencia promotora está unida en la terminal 31 por un codón de inicio de la traducción (por ejemplo, ATG) de una secuencia de codificación y se extiende corriente arriba (dirección 5') para incluir el número mínimo de bases o elementos necesarios para iniciar la transcripción a niveles detectables por arriba de los niveles base. Dentro de la secuencia promotora se encontrará un sitio de iniciación de la transcripción (definido convenientemente por la formación del mapa con la nucleasa S1 ) , así como también dominios de enlace de la proteína (secuencias consensos) responsables para el enlace de la ARN polimerasa. Los promotores eucarióticos con frecuencia, pero no siempre, contendrán los cuadros "TATA" y los cuadros "CAT". Los promotores procarióticos contienen las secuencias Shine-Dalgarno además de las secuencias consenso -10 y -35. Las "secuencias control" del ADN se refieren colectivamente a las secuencias promotoras, sitios de enlace del ribosoma, señales de la poliadenilación, secuencias para la terminación de la transcripción, dominios de reguladores corriente arriba, raejoradores y similares, los cuales colectivamente se proporcionan para la expresión (es decir, la transcripción y traducción) de una secuencia de codificación en una célula huésped.

Una secuencia control "dirige la expresión" de una secuencia de codificación en una célula, cuando la ARN polimerasa se unirá a la secuencia promotora y transcribe la secuencia de codificación en el ARNm, el cual es traducido al polipéptido codificado por la secuencia de codificación. Una "célula huésped" es una célula la cual ha sido transformada o transfectada o es capaz de transformación o transfección por una secuencia de ADN exogeno. Una célula ha sido "tranformada" por el ADN exógeno cuando tal ADN exógeno ha sido introducido dentro de la membrana celular. El ADN exógeno puede o no estar integrado (unido covalentemente) en el ADN cromosómico formando el genoma de la célula. En procariotes y levaduras, por ejemplo, el ADN exógeno puede ser mantenido en un elemento episomal, tal como un plásmido. Con respecto a las células eucarióticas , una célula transformada o transfectada establemente es una en la cual el ADN exógeno ha llegado a integrarse en el cromosoma, de tal manera que es heredado por las células hijas por medio de la replicación del cromosoma. Esta estabilidad está demostrada por la capacidad de las células eucarióticas para establecer líneas celulares o clonas formadas de una población de células hijas que contienen el ADN exógeno. La "transfección" o "transfectada" se refiere a un procedimiento por el cual las células incorporan el ADN extraño e integran ese ADN extraño en sus cromosomas. La transfección puede realizarse, por ejemplo, por diversas técnicas en las cuales las células incorporan el ADN (por ejemplo, precipitación con fosfato de calcio, electroporación, asimilación de liposomas, etc.) o por infección, en la cual los virus son utilizados para transferir el ADN dentro de las células. Una "célula objetivo" es una célula que es transfectada selectivamente sobre otros tipos de células (o líneas de células) . Una "clona" es una población de células derivadas de una célula individual o de un ancestro común por mitosis. Una "línea celular" es una clona de una célula primaria que es capaz de crecer en forma estable in vitro durante muchas generaciones. Una región "heteróloga" de un constructo de ADN es un segmento de ADN identificable dentro de o unido a otra molécula de ADN que no se encuentra en asociación con la otra molécula en la naturaleza. De esta forma, cuando la región heteróloga codifica para un gen, el gen normalmente estará flanqueado por el ADN que no flanquea el gen en el genoma de la fuente animal. Otro ejemplo de una secuencia de codificación heteróloga es un constructo, donde la secuencia de codificación por sí misma no se encuentra en la naturaleza (por ejemplo, secuencias sintéticas que tienen codones diferentes del gen nativo) . Variación alélica o eventos mutacionales que se presentan en forma natural que no producen una región heteróloga del ADN como se utiliza en la presente. "Condiciones las cuales están relacionadas a la actividad de galactocinasa humana insuficiente" o una "deficiencia en la actividad de la galactocinasa" significa mutaciones de la proteína galactocinasa, la cual afecta la actividad de la galactocinasa o puede afectar la expresión de la galactocinasa o ambas de tal manera que las concentraciones de galactosa en un paciente están atípicamente elevadas. Además, esta definición está destinada para cubrir los niveles bajos atípicamente de la expresión de la galactocinasa en un paciente debido a las secuencias de control defectuosas para la proteína galactocinasa de referencia. Esta invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que codifica para una proteína galactocinasa humana y sustancialmente secuencias similares. Las secuencias de ácido nucleico aisladas son sustancialmente similares y: (i) son capaces de hibridar bajo condiciones de severidad moderada a la SECUENCIA DE IDENTIFICACION NO: 4; (ii) o codifican a las secuencias de ADN las cuales están degeneradas para la SECUENCIA DE IDENTIFICACION NO: 4. Las secuencias de ADN degeneradas que codifican para la misma secuencia de aminoácidos como la SECUENCIA DE IDENTIFICACION NO: 4, pero tienen variaciones en las secuencias de codificación de los nucleótidos. La hibridación bajo condiciones moderadamente severas se describe en lo siguiente. En forma alternativa, las secuencias sustancialmente similares son sustancialmente las mismas cuando aproximadamente 66.% (de preferencia aproximadamente 75%, de mayor preferencia aproximadamente 90%) de los nucleótidos o aminoácidos se acoplan sobre una longitud definida de la molécula. Como se utiliza en la presente, sustancialmente similar se refiere a las secuencias que tienen identidad similar a las secuencias de la presente invención. De esta forma las secuencias de nucleótidos que son sustancialmente las mismas pueden ser identificadas por hibridación o por la comparación de la secuencia. Las secuencias de proteína que son sustancialmente las mismas, pueden ser identificadas por uno o más de los siguientes: digestión proteolítica, electroforesis en gel y/o microsecuenciación o microdeterminación de la secuencia. La hibridación bajo condiciones moderadamente severas puede realizarse como sigue. Los filtros de nitrocelulosa se prehibridan a 65°C en una solución que contiene 6X SSPE, 5X de solución de Denhardt (10 g de Ficoll, 10 g de BSA y 10 g de polivinilpirrolidona por litro de solución), 0.05% de SDS y 100 microgramos de ARNt. La sondas de hibridación se marcan, de preferencia se radiomarcan (por ejemplo, utilizando el equipo Bios TAG-ITR) . La hibridación se realiza durante aproximadamente 18 horas a 65°C. Los filtros se lavan en una solución de 2X SSC y 0.5% de SDS a temperatura ambiente durante 15 minutos (se repite una vez). Subsiguientemente, los filtros se lavan a 58 °C, se secan al aire y se exponen a una película de rayos X durante la noche a -70°C con una pantalla de intensificación. Un elemento para aislar una molécula de ácido nucleico que codifica para una galactocinasa humana es para sondear una biblioteca de ADNc o genómica humana con una sonda natural o diseñada artificialmente utilizando los procedimientos reconocidos en la técnica (véase, por ejemplo: "Current Protocols in Molecular Biology", Ausubel, F.M. , et al. (eds.) Greene Publishing Assoc. and John Wiley Interscience, New York, 1989, 1992). Se apreciará un experto en la técnica que la SECUENCIA DE IDENTIFICACION NO: 4 o sus fragmentos (que comprenden por lo menos 15 nucleótidos contiguos) es una sonda particularmente útil. Otras sondas particularmente útiles para este propósito son las SECUENCIAS DE IDENTIFICACION NOS: 1, 2 y 3 o sus fragmentos hibridizables (es decir, que comprenden por lo menos 15 nucleótidos contiguos). También se apreciará que tales sondas pueden ser y de preferencia se marcan con un reactivo analíticamente detectable para facilitar la identificación de la sonda. Los reactivos útiles incluyen, pero no están limitados a la radioactividad, colorantes fluorescentes o enzimas capaces de catalizar la formación de un producto detectable. De esta forma las sondas son útiles para aislar copias complementarias del ADN genómico, ADNc o ARN de fuentes de humano, mamíferos u otros animales o para seleccionar tales fuentes para las secuencias relacionadas (por ejemplo, miembros adicionales de la familia, tipo y/o subtipo) e incluyendo los elementos reguladores y de control de la transcripción definidos en lo anterior, así como también otra estabilidad, procesamiento, traducción y regiones que terminan la especificidad del tejido de las regiones 5' y/o 3* en relación con las secuencias de codificación descritas en la presente. Esta invención también se proporciona para la terapia con genes. La "terapia con genes" significa la suplementación con genes. Es decir, una copia adicional (es decir, referencia) del gen de interés es insertada en las células de los pacientes. Como resultado, la proteína codificada por el gen de referencia corrige el defecto (es decir, la deficiencia de la galactocinasa) y permite que las células funcionen normalmente, mitigando así los síntomas de la enfermedad. La terapia con genes de la presente invención, puede ocurrir in vivo o ex vivo. La terapia de genes ex vivo requiere el aislamiento y purificación de las células del paciente, la introducción de un gen terapéutico e introducción de las células genéticamente alteradas de regreso al paciente. Un virus deficiente de la replicación tal como un retrovirus modificado puede ser utilizado para introducir el gen terapéutico (galactocinasa) en tales células. Por ejemplo, el virus de la leucemia Moloney de ratón (MMLV) es un vector bien conocido en las pruebas clínicas para la terapia con genes (véase, por ejemplo, Boris-Lauerie et al., Curr. Qoin. Genet . Dev. , 3:102-109 (1993)).

Por el contrario, la terapia con genes in vivo no requiere del aislamiento y purificación de las células del paciente. El gen terapéutico es "empacado" típicamente para la administración a un paciente tal como en liposomas o en el virus deficiente en la replicación tal como adenovirus (véase, por ejemplo, Berkner, K.L., Curr. Top. Microbiol. immunol.. 158:39-66 (1992)) o vectores del virus asociados con adenovirus (AAV) (véase, por ejemplo, Muzcyczka, N. , Curr . Toa . Microbiol . Immunol .. 158:97-129 (1992) y la Patente Norteamericana 5,252,479 "Safe Vector for Gene Therapy") . Otro enfoque es la administración del llamado "ADN desnudo" en el cual el gen terapéutico es inyectado directamente en la corriente sanguínea o en el tejido muscular. Los tipos de células útiles para la terapia con genes de la presente invención incluyen hepatocitos, fibroblastos, linfocitos, cualquier célula del ojo, (por ejemplo la retina) , células epiteliales y endoteliales. De preferencia las células son hepatocitos, cualquier célula de los ojos o células epiteliales respiratorias (o pulmonares) . La transfección de las células epiteliales (pulmonares) puede ocurrir por medio de la inhalación de una preparación nebulizada de los vectores de ADN en los liposomas, complejos de ADN-proteína o adenovirus deficientes en la replicación (véase, por ejemplo, la Patente Norteamericana 5,240,846 "Gene Therapy Vector for Cystic Fibrosis" . Esta invención también proporciona un procedimiento para preparar una proteína de galactocinasa humana. Esta proteína está definida con referencia a la secuencia de aminoácidos listada en la SECUENCIA DE IDENTIFICACION NO: 4 e incluye variantes con una secuencia de aminoácidos sustancialmente similares, que tienen la misma actividad de galactocinasa. Las proteínas de esta invención de preferencia se hacen por técnicas de ingeniería genética recombinantes . Los ácidos nucleicos aislados, particularmente los ADNs pueden ser introducidos en los vectores de expresión por el enlace operativo o funcional del ADN a las regiones de control de expresión necesarias (por ejemplo regiones reguladoras) requeridas para la expresión del gen. Los vectores pueden ser introducidos en las células huésped apropiadas tales como células procarióticas (por ejemplo bacterias) , o eucarióticas (por ejemplo de levadura o mamífero) por métodos bien conocidos en la técnica (Ausubel et al . , supra) . Las secuencias de codificación para la proteína deseada que se han preparado o aislado, pueden clonarse en cualquier vector o replicón apropiado. Se conocen numerosos vectores de clonación para aquellos con habilidad en la técnica y la selección de un vector de clonación apropiado es una cuestión de elección. Los ejemplos de los vectores de ADN recombinantes para la clonación y las células huésped las cuales pueden transformar incluyen, pero no están limitados a, el bacteriófago lambda [E. coli) , pBR322 (E. coli) , pACYC177 (E. coli) , pKT230 (bacterias gram negativas), pGV1106 (bacterias gram negativas) , pLAFRI (bacterias gram negativas) , pME290 (bacterias gram negativas que no son E. coli) , PHV14 (E. coli y Bacillus subtilis) , pBD9 (Bacillus), pIJ61 {Streptomyces) , pUC6 (Streptomyces) , YIp5 (Saccharomyces) , un sistema de células del insecto baculovirus, un sistema de insecto Drosophila y YCp19 (Saccharomyces) . Véase, por lo general. "DNA Cloning" : Vols. I & II, Glover et al. ed. IRL Press Oxford (1985) (1987) y; T. Maniatis et al. ("Molecular Cloning" Cold Spring Harbor Laboratory (1982). El gen puede ser colocado bajo el control de un promotor, un sitio de enlace del ribosoma (para la expresión bacteriana) y opcionalmente , un operador (mencionado colectivamente en la presente como elementos de "control") , de tal manera que la secuencia de ADN que codifica para la proteína deseada se transcribe en el ARN en la célula huésped transformada por un vector que contiene esta construcción de expresión. La secuencia de codificación puede o no puede contener un péptido de señal o una secuencia líder. Los antígenos de la subunidad de la presente invención, pueden expresarse utilizando, por ejemplo el promotor tac de E. coli o un promotor del gen de la proteína A (spa) y la secuencia de señal. Las secuencias líder pueden ser eliminadas por el huésped bacteriano en el proceso post-traduccional. Véase . por e-i emolo. las Patentes Norteamericanas Nos. 4 , 431 , 739 ; 4 , 425 , 437 ; 4 , 338 , 397 . Además de las secuencias control, puede ser ventajoso agregar secuencias reguladoras las cuales permitan la regulación de la expresión de las secuencias de la proteína en relación con el crecimiento de la célula huésped. Las secuencias reguladoras son conocidas para aquellos con habilidad en la técnica y los ejemplos incluyen aquellos los cuales provocan la expresión de un gen que va a ser activado o desactivado en respuesta a un estímulo químico o físico, incluyendo la presencia de un compuesto regulador. Otros tipos de elementos reguladores también pueden estar presentes en el vector, por ejemplo secuencias mejoradoras. Un vector de expresión se construye de tal manera gue la secuencia de codificación particular está ubicada en el vector con las secuencias reguladoras apropiadas, la colocación y orientación de la secuencia de codificación con respecto a las secuencias control de tal manera que la secuencia de codificación se transcribe bajo el "control" de las secuencias control (es decir, la ARN polimerasa la cual se une a la molécula de ADN en las secuencias control transcribe la secuencia de codificación) . La modificación de las secuencias que codifican para el antígeno particular de interés puede ser ventajoso para lograr este fin. Por ejemplo, en algunos casos puede ser necesario modificar la secuencia, de tal manera que pueda unirse a las secuencias control con la orientación apropiada; es decir para mantener el marco de lectura. Las secuencias control y otras secuencias reguladoras pueden ligarse a la secuencia de codificación antes de la inserción en un vector, tal como los vectores de clonación descritos en lo anterior. Alternativamente, las secuencia de codificación pueden ser clonadas directamente en un vector de expresión, el cual ya contiene las secuencias control y un sitio de restricción apropiado.

En algunos casos, puede ser ventajoso producir mutantes o análogos de la proteína galactocinasa. Las mutantes o análogos pueden prepararse por la eliminación de una porción de la secuencia que codifica para la proteína, por la inserción de una secuencia y/o por sustitución de uno o más nucleótidos dentro de la secuencia. Las técnicas para modificar las secuencias de nucleótidos, tales como mutagénesis sitiodirigida, son bien conocidas para aquellos con habilidad en la técnica. Véase , por enemplo . T. Maniatis et al., supra; DNA Clonina. Vols. I y II, supra; Nucleic Acid Hybridization. supra. Se conocen muchos vectores de expresión procarióticos en la técnica. Véanse . por ei emplo . las Patentes Norteamericanas Nos. 4,578,355; 4,440,859; 4,436,815; 4,431,740; 4,431,739; 4,428,941; 4,425,437; 4,418,149; 4,411,994; 4,366,246; 4,342,832; véanse también las Solicitudes de Patentes de la Gran Bretaña GB 2,121,054; GB 2,008,123; GB 2,007,675; y la Solicitud de Patente Europea 103,395. Los vectores de expresión en levadura también son conocidos en la técnica. Véanse . por ei emplo. las Patente Norteamericanas Nos. 4,446,235; 4,443,539; 4,430,428; véanse también las Solicitudes de Patentes Europeas 103,409; 100,561; 96,491. El pSV2neo (como se describe en J. Mol. Appl. Genet. 1 :327-341) el cual utiliza el promotor tardío de SV40 para activar la expresión en células de mamífero o pCDNSIneo, un vector derivado de pCDNAl (Mol. Cell Biol. 7:4125-29) el cual utiliza el promotor CMV para activar la expresión. Ambos de estos dos últimos vectores pueden emplearse para la expresión pasajera o estable (utilizando la resistencia a G418) en células de mamífero. Los sistemas de expresión de células de insectos, por ejemplo Drosophila, también son útiles, véanse por ejemplo, las Solicitudes PCT WO 90/06358 y WO 92/06212 como también la EP 290,261-B1. Dependiendo del sistema de expresión y el huésped seleccionado, las proteínas de la presente invención son producidas por el crecimiento de las células huésped transformadas por un vector de expresión descrito en lo anterior bajo condiciones, por las que la proteína de interés se expresa. Las células de mamífero preferidas incluyen células de riñon embriónico humano, células de riñon de mono (células HE -293) , células fibroblasto (COS) , células de ovarios de hámster Chino (CHO) , células de Drosophila o células L-murinas. Si el sistema de expresión secreta la proteína en los medios de crecimiento, la proteína puede ser purificada directamente de los medios. Si la proteína no es secretada, se aisla de los Usados celulares o se recupera de la fracción de la membrana celular. La selección de las condiciones de crecimiento y métodos de recuperación apropiados están dentro de la habilidad de la técnica. Un método alternativo para identificar proteínas de la presente invención, es construyendo bibliotecas del gen, utilizando las clonas resultantes para transformar E. coli y reuniendo y seleccionando colonias individuales utilizando suero policlonal o anticuerpos monoclonales para la galactocinasa. Las proteínas de la presente invención también pueden ser producidas por síntesis química, tales como síntesis de péptidos en fase sólida utilizando las secuencias de aminoácidos conocidas o secuencias de aminoácidos derivadas de la secuencia del ADN de los genes de interés. Tales métodos son conocidos para aquellos con habilidad en la técnica. La síntesis química de los péptidos no es particularmente preferida.

Las proteínas de la presente invención o sus fragmentos que comprenden por lo menos un epítope, pueden utilizarse para producir anticuerpos, ambos policlonales y monoclonales. Si se desean anticuerpos policlonales , un mamífero seleccionado (por ejemplo ratón, conejo, cabra, caballo, etc.) se inmuniza con receptor de la presente invención o su fragmento o un receptor mutado. El suero del animal inmunizado se recolecta y trata de acuerdo con los procedimientos conocidos. Si se utiliza suero que contiene anticuerpos policlonales, los anticuerpos policlonales pueden ser purificados por cromatografía de inmunoafinidad u otros procedimientos conocidos .

Los anticuerpos monoclonales para las proteínas de la presente invención y para los fragmentos de la misma, también pueden producirse fácilmente por alguien con habilidad en la técnica. La metodología general para preparar los anticuerpos monoclonales utilizando la tecnología del hibridoma es bien conocida. Las líneas celulares que producen el anticuerpo inmortal pueden ser creadas por la fusión de las células y también por otras técnicas tales como transformación directa de linfocitos B con el ADN oncogénico o transfección con el virus de Epstein-Barr . Véase, por ejemplo, M. Schreier et al . , "Hybridoma Techniques" ( 1 980 ) ; Hammerling et al.. "Monoclonal Antibodies and T-cell Hybridomas" ( 1 981 ) ; Kennett et al., "Monoclonal Antibodies" ( 1 980) ; véanse también las Patente Norteamericanas Nos. 4,341,761; 4,399,121; 4,427,783; 4,444,887; 4,452,570; 4,466,917; 4,472,500; 4,491,632; y 4,493,890. Los paneles de anticuerpos monoclonales producidos contra el antígeno de interés o un fragmento del mismo, pueden seleccionarse por diversas propiedades; es decir, para isotipo, epítope, afinidad, etc. Los anticuerpos monoclonales son útiles en la purificación, utilizando técnicas de inmunoafinidad de los antígenos individuales contra los cuales están dirigidos. Alternativamente, los genes que codifican para los anticuerpos monoclonales de interés pueden ser aislados de los hibridomas por técnicas PCR conocidas en el arte y clonados y expresados en los vectores apropiados. Los anticuerpos de esta invención, ya sea policlonales o monoclonales tienen utilidad adicional en que pueden ser reactivos empleados en los inmunoensayos , RIA, ELISA y similares. Como se utiliza en la presente, el "anticuerpo monoclonal" se entiende que incluye los anticuerpos derivados de una especie (por ejemplo, murina, de conejo, de cabra, ratón, humano, etc.) así como también los anticuerpos derivados de dos (o quizá más) especies (por ejemplo, anticuerpos quiméricos y humanizados) . Los anticuerpos quiméricos, los cuales las regiones variables no humanas están unidas o fusionadas a las regiones constantes humanas (véase, por ejemplo Liu et al., Proc . Nati Acad. Sci. USA, 84:3439 (1987)), también pueden utilizarse en ensayos o terapéuticamente. De preferencia, un anticuerpo monoclonal terapéutico podría ser "humanizado" como se describe en Jones et al., Nature , 321:522 (1986); Verhoeyen et al., Science , 239:1534 (1988); Kabat et al., J. Immunol . , 147:1709 (1991); Queen et al., Proc. Nati Acad. USA, 86:10029 (1989); Gorman et al., Proc, Nati Acad. Sci . USA, 88:34181 (1991); y Hodgson et al., Bio/Technoloqy, 9 :421 (1991) . Por lo tanto, esta invención también contempla anticuerpos, policlonales o monoclonales (incluyendo quiméricos y "humanizados") dirigidos a los epítopes que corresponden a las secuencias de aminoácidos descritas en la presente de la galactocinasa humana. Los métodos para la producción de anticuerpos policlonales y monoclonales son bien conocidos, véase por ejemplo el Capítulo 11 de Ausubel et al. {supra.) . Cuando el anticuerpo se marca con un reactivo analíticamente detectable tal como radioactividad, fluorescencia o una enzima, el anticuerpo puede ser utilizado para detectar la presencia o ausencia de la galactocinasa humana y/o su nivel cuantitativo.

Esta invención también contempla composiciones farmacéuticas que comprenden una cantidad efectiva de la proteina galactocinasa de la invención y un portador farmacéuticamente aceptable. Las composiciones farmacéuticas de fármacos proteináceos de esta invención son particularmente útiles para la administración parenteral, es decir, subcutánea, intramuscular o intravenosamente. En forma opcional, la proteína galactocinasa está rodeada por una vesícula unida a la membrana tal como un liposoma. La composición para la administración parenteral, comúnmente consistirá de una solución de los compuestos de la invención o una mezcla de los mismos, disueltos en un portador aceptable, de preferencia un portador acuoso. Puede emplearse una diversidad de portadores acuosos por ejemplo agua, agua amortiguada, solución salina al 0.4%, glicina al 0.3% y similares. Estas soluciones son estériles y por lo general están libres de materia en partículas. Estas soluciones pueden esterilizarse por técnicas de esterilización convencionales bien conocidas. Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables según se requiera para aproximarse a las condiciones fisiológicas tales como ajuste del pH y agentes de amortiguamiento, etc. La concentración del compuesto de la invención en tal formulación farmacéutica puede variar ampliamente, es decir de menos de aproximadamente 0.5%, usualmente en o por lo menos aproximadamente 1% a tanto como 15 ó 20% por peso y se seleccionará principalmente con base a los volúmenes del fluido, viscosidades, etc., de acuerdo con el modo particular de administración seleccionado . De esta forma, una composición farmacéutica de la invención para la inyección intramuscular, puede prepararse para que contenga 1 mi de agua amortiguada, estéril y 50 mg de un compuesto de la invención. En forma similar, una composición farmacéutica de la invención para la infusión intravenosa, podría prepararse para que contenga 250 mi de solución de Ringer estéril y 150 mg de un compuesto de la invención. Los métodos actuales para preparar composiciones parenteralmente administrables son conocidas o serán aparentes para aquellos con habilidad en la técnica y se describen en mayor detalle por ejemplo en, Remington's Pharmaceutical Science, 15th ed. , Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania . Los compuestos descritos en la presente puede ser liofilizados para el almacenamiento y reconstituirse en un portador adecuado antes de utilizarse. Esta técnica ha mostrado ser efectiva con proteínas convencionales y pueden emplearse técnicas de liofilización y reconstitución conocidas en el arte. El médico determinará la dosis de los presentes agentes terapéuticos la cual será más adecuada y variará con la forma de administración y el compuesto particular elegido y además variará con el paciente particular bajo el tratamiento. Por lo general se desea iniciar el tratamiento con dosis sustancialmente pequeñas menores que la dosis óptima del compuesto y aumenta la dosis por aumentos pequeños hasta que se alcanza el efecto óptimo bajo las circunstancias. Por lo general, se encuentra que cuando la composición se administra oralmente, se requerirán grandes cantidades del agente activo para producir el mismo efecto que una cantidad más pequeña dada parenteralmente . La dosis terapéutica por lo general será de 1 a 10 miligramos por día y mayor aunque pueda administrarse en diferentes unidades de dosis. Dependiendo del estado del paciente, la composición farmacéutica de la invención puede administrarse para tratamientos profilácticos y/o terapéutico. En la aplicación terapéutica, las composiciones se administran a un paciente que ya padece de una enfermedad en una cantidad suficiente para curar o por lo menos detener parcialmente la enfermedad y sus complicaciones. En las aplicaciones profilácticas, las composiciones que contienen los presentes compuestos o una mezcla de los mismos, se administran a un paciente que aún no tiene la enfermedad para aumentar la resistencia del paciente. Las administraciones individuales o múltiples de las composiciones farmacéuticas puede llevarse a cabo con niveles de dosis y un patrón que se selecciona por médico que da el tratamiento. En cualquier caso, la composición farmacéutica de la invención debe proporcionar una cantidad de los compuestos de la invención suficiente para tratar efectivamente al paciente . Esta invención también contempla el uso del gen de la galactocinasa como un agente de diagnóstico. Por ejemplo, algunas enfermedades resultan de genes defectuosos heredados. Estos genes pueden ser detectados comparando la secuencia del gen defectuoso con aquel de uno normal. Subsiguientemente, puede verificarse que un gen "mutante" está asociado con la deficiencia de la galactocinasa por medio de la galactosa. Es decir, un gen mutante estaría asociado con niveles (atípicamente) elevados de galactosa en un paciente. Además, se pueden insertar genes de galactocinasa mutantes en un vector adecuado para la expresión en un sistema de ensayo funcional (por ejemplo, ensayo colorimétrico, expresión en placas MacConkey, experimentos de complementacion, por ejemplo en una cepa deficiente de galactocinasa de levadura o E. coli) , como aún otro medio para verificar o identificar las mutaciones de la galactocinasa. Como un ejemplo, el ARN de un individuo puede ser transcripto con la transcriptasa inversa a ADNc, el cual entonces puede ser aplicado por una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) , se clona en un vector de expresión de E. coli y se transforma en una cepa deficiente de galactocinasa de E. coli. Cuando se hace crecer en placas indicadoras MacConkey, las células deficientes en galactocinasa producirá colonias que son de color blanco, mientras que las células que se han transformado/complementado con un gen de la galactocinasa funcional serán rojas (véase, por ejemplo la sección del Ejemplo) . Si la mayoría de las colonias de un individuo son rojas, entonces se considera que el individuo es normal con respecto a la actividad de la galactocinasa. Si aproximadamente 50% de las colonias son rojas (el otro 50% blancas) , entonces ese individuo probablemente sea un portador para la deficiencia de la galactocinasa. Si la mayoría de las colonias son blancas, entonces el individuo probablemente sea deficiente en la galactocinasa. Una vez que los genes "mutantes" han sido identificados, entonces puede seleccionarse la población para los portadores del gen de la galactocinasa "mutante" . (Un portador es una persona con salud aparente cuyos cromosomas contienen un gen de galactocinasa "mutante" que puede ser transmitido a la descendencia de esa persona) . Los individuos que portan las mutaciones en el gen de la galactocinasa humana pueden detectarse al nivel de ADN por una diversidad de técnicas. Los ácidos nucleicos utilizados para el diagnóstico (ADN genómico, ARNm, etc.) pueden obtenerse de las células de un paciente, tal como sangre, orina, saliva, biopsia de tejido (por ejemplo muestreo de vellos coriónicos o retiro de células del fluido amniótico) y material de autopsia. El ADN genómico puede utilizarse directamente para la detección o puede ser amplificada enzimáticamente utilizando la PCR, la reacción en cadena de la ligasa (LCR) , amplificación del desplazamiento de una hebra (SDA) , etc. (véase, por ejemplo, Saiki et al., Nature , 324 : 163-166 (1986), Bej , et al., Crit. Rev. Biochem. Molec. Biol., 26:301-334 (1991), Birkenmeyer et al., J. Virol . Meth. , 35 : 117-126 (1991), Van Brunt, J., Bio/Technology, 8:291-294 (1990) antes del análisis. El ARN o el ADNc también pueden utilizarse para los mismos propósitos. Como un ejemplo, los cebadores de la PCR complementarias al ácido nucleico de la presente invención, pueden utilizarse para identificar y analizar las mutaciones de la galactocinasa . Por ejemplo, las eliminaciones e inserciones pueden detectarse por un cambio en el tamaño del producto amplificado en comparación con el genotipo de la galactocinasa normal. Las mutaciones por punto pueden identificarse por hibridación del ADN amplificado al ARN de la galactocinasa radiomarcado (de la invención) o alternativamente, las secuencias de ADN antisentido de la galactocinasa radiomarcada (de la invención) . Las secuencias que se acoplan perfectamente pueden distinguirse de los dúplexes que no se acoplan por digestión con ARNasa A o por diferencias en las temperaturas de fusión (Tm) . Tal diagnóstico sería particularmente útil para la prueba prenatal y a un neonatal . Además, las mutaciones por punto y otras diferencias de la secuencia entre el gen de referencia y los genes "imitantes" pueden identificarse por aún otras técnicas bien conocidas, por ejemplo, secuenciación directa del ADN, polimorfismo conformacional de una sola hebra (SSCP; Orita et al., Genomics , 5:874-879 (1989)). Por ejemplo, un cebador de la secuenciación se utiliza con el producto PCR de doble hebra o una molécula plantilla de una sola hebra bien generada por una PCR modificada. La determinación de la secuencia se realiza por procedimientos convencionales con nucleótidos radiomarcados o por procedimientos de secuenciación automática con marcas fluorescentes. Los segmentos de ADN clonados también pueden utilizarse como sondas para detectar los segmentos ADN específicos. La sensibilidad de este método está muy mejorada cuando se combina con la PCR. La presencia de fragmentos periódicos de nucleótidos pueden correlacionarse a un cambio en la actividad de la galactocinasa (cambio causal) o sirve como un marcador para varios polimorfismos. La prueba genética basada en las diferencias de la secuencia del ADN puede lograrse por la detección de la alteración en la movilidad electroforética de los fragmentos de ADN en geles con o sin agentes desnaturalizantes. Las eliminaciones e inserciones de secuencias pequeñas pueden visualizarse por electroforesis en gel de alta resolución. Los fragmentos de ADN de diferentes secuencias pueden ser distinguidos en geles en gradiente de formamida desnaturalizantes en los cuales las movilidades de los fragmentos de ADN diferentes están retardadas en el gel a diferentes posiciones de acuerdo con sus temperaturas de fusión parcial o de fusión específica (véase, por ejemplo., Myers et al., Science, 230 : 1242 (1985)). Además, las alteraciones en la secuencia en particular eliminaciones pequeñas, puede detectarse como cambios en el diseño de migración de los heterodúplexes de ADN en electroforesis en gel no desnaturalizante (es decir, electroforesis del heteroduplex) (véase, por ejemplo, Nagamine et al., Am. J. Hum. Genet . , 45 : 337-339 (1989) ) . Los cambios en la secuencia en las ubicaciones específicas, también pueden ser revelados por ensayos de protección de la nucleasa, tal como la ARNasa y protección de SI o el método de desdoblamiento químico (por ejemplo, Cotton et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 85:4397-4401 (1985)). De esta forma, la detección de una secuencia de ADN específica puede lograrse por métodos tales como hibridación (por ejemplo electroporación del heteroduplex, véase, hite et al., Genomics , 12 : 301-306 (1992), protección de la ARNasa (por ejemplo, Myers et al., Science , 230 : 1242 (1985)) desdoblamiento químico (por ejemplo, et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 85:4397-4401 (1985))), secuenciación directa del ADN o el uso de enzimas de restricción (por ejemplo, polimorfismos en la longitud del fragmento de restricción (RFLP) en los cuales las variaciones en el número y tamaño de fragmentos de restricción pueden indicar inserciones, eliminaciones, presencia de fragmentos periódicos de nucleótidos y cualquier otra mutación, la cual crea o destruye una secuencia de restricción de la endonucleasa) . La inmunotransferencia Southen del ADN genómico también puede utilizarse para identificar eliminaciones e inserciones grandes (es decir, mayor de 100 pares de base) . Además de la electroforesis en gel más convencional, y la secuenciación de ADN, también pueden detectarse mutaciones (por ejemplo, microeliminaciones, aneuploidias , translocaciones, inversiones) por el análisis in situ (Véase, por ejemplo, Keller et al., DNA Probes, 2nd Ed. , Stockton Press, New York, N.Y., USA (1993)) . Es decir, las secuencias de ADN (o ARN) en las células pueden ser analizadas para mutaciones sin aislamiento y/o inmovilización sobre una membrana. La fluorescencia de la hibridación in situ (FISH) actualmente es el método más comúnmente aplicado y han aparecido numerosas revisiones de la FISH. Véase, por ejemplo, Trachuck et al., Science , 250 : 559-562 (1990) y Trask et al., Trends . Genet . , 7:149-154 (1991) las cuales se incorporan en la presente para referencia para fines de antecedentes. Por lo tanto, utilizando los ácidos nucleicos basados en la estructura de los genes específicos, por ejemplo la galactocinasa , pueden desarrollarse pruebas de diagnóstico para la deficiencia de la galactocinasa. Además, algunas enfermedades son un resultado de, o están caracterizadas por cambios en la expresión del gen que pueden detectarse por cambios en el ARNm. Alternativamente, el gen de la galactocinasa puede utilizarse como una referencia para identificar a individuos que expresan un nivel disminuido de galactocinasa, por ejemplo por inmunotransferencia Northern o por hibridación in si tu. La definición apropiada de las condiciones de hibridación está dentro de la habilidad de la técnica. Véase, por ejemplo, "Current Protocols in Mol. Biol . " Vol . I & II, Wiley Interscience . Ausbel et al . (ed.) (1992) . La tecnología de sondeo es bien conocida en la técnica y se aprecia que el tamaño de las sondas puede variar ampliamente, pero se prefiere que la sonda sea por lo menos de 15 nucleótidos de longitud. También se apreciará que tales sondas pueden estar y de preferencia están marcadas con un reactivo analíticamente detectable para facilitar la identificación de la sonda. Los reactivos útiles incluyen, pero no están limitados a la radioactividad, colorantes fluorescentes o enzimas capaces de catalizar la formación de un producto detectable . Como regla general a condiciones de hibridación más severas se recuperarán los genes más xntimamente relacionados. También dentro del alcance de esta invención están los oligonucleotidos antisentido predichos por las secuencias descritas en la presente para la galactocxnasa humana. Los oligonucleotidos sintéticos o análogos estructurales químicos antisentido relacionados están diseñados para reconocer y unirse específicamente a un ácido nucleico objetivo que codifica para la galactocxnasa y mutaciones de la galactocxnasa. El campo general de la tecnología antisentido está ilustrado por las siguientes descripciones, las cuales se incorporan en la presente para referencia para fines de antecedentes (Cohén, J.S., Trends in Pharm. Sci., 10:435(1989) y eintraub, H.M. Scientific American, Jan. (1990) en la página 40) . Los animales transgénicos , no humanos pueden obtenerse transíectando huevos fertilizados o embriones apropiados de un huésped con ácidos nucleicos que codifican para la galactocxnasa humana descrita en la presente, véase por ejemplo las Patentes Norteamericanas 4,736,866; 5,175,385; 5,175,384 y 5,175,386. El animal transgénico resultante puede utilizarse como un modelo para el estudio de la galactocinasa . Particularmente, los animales transgénicos útiles son aquellos los cuales presenta un fenotipo detectable asociado con la expresión del receptor. Entonces los fármacos pueden ser seleccionados para su capacidad para invertir o exacerbar el fenotipo importante. Esta invención también contempla el enlace funcional al gen que codifica para el receptor para los elementos reguladores los cuales son diferencialmente sensibles a diversas condiciones de temperatura o condiciones metabólicas, por lo que se activa o desactiva efectivamente la expresión fenotípica en respuesta a esas condiciones. Aunque no necesariamente limitantes de esta invención, los siguientes son algunos datos experimentales ilustrativos de esta invención.

EJEMPLO I PURIFICACION DE LA GALACTOCINASA HUMANA A PARTIR DEL TEJIDO DE PLACENTA La galactocinasa (galK) se obtiene de la placenta humana como se describe por Stambolian et al.

(Biochim Biophys Acta, 831 : 306-312 (1985)), el cual se incorpora para referencia en su totalidad. En esencia, el tejido de la placenta humana (obtenido a 1 hora del parto) se homogeniza, centrifuga y el sobrenadante resultante se absorbe en DEAE-SephacelR . El material se eluye, se precipita con sulfato de amonio y luego se corre a través de una columna de clasificación (Sephadex G-100 SFR) . Las fracciones activas reunidas se concentran. La proteína purificada se obtiene después de la separación por electroforesis en SDS poliacrilamida y luego se inmunotransfiere por Western utilizando técnicas estándar (véase, Laemmli, Nature , 227 : 680-685 (1970), o LeGendre et al., Biotechniques , 6.: 154 (1988)). Las cantidades menores de la galactocinasa se aislan (microg amos) de rondas múltiples de purificación de la proteina. Después de una digestión con el péptido tripsina, eventualmente se aislan e identifican 7 secuencias de péptidos. Los tres fragmentos más grandes se presentan en lo siguiente: [SEC. DE IDEIMT. NO: 1] Val Asn Leu lie Gly Glu His Thr Asp Tyr Asn Gln Gly Leu Val Leu- Pro Met Ala Leu Glu Leu Met Thr Val Leu Val Gly Ser Pro Arg [SEC. DE IDEIMT. NO: 2] His lie Gln Glu His Tyr Gly Gly Thr Ala Thr Phe Tyr Leu Ser Gln- Ala Ala Asp Gly Ala Lys [SEC. DE IDENT. NO: 3] Ala Gln Val Cys Gln Gln Ala Glu His Ser Phe Ala Gly Met Pro Cys- Gly lie Met Asp Gln Phe lie Ser Leu Met Gly Gln Lys Los fragmentos se comparan con las secuencias del péptido codificadas por los ADNc , en las cuales los ADNc se secuenciaron parcialmente. Los ADNc (también conocidos como secuencias marcadas o EST expresadas) se obtienen de Human Genome Sciences, Inc. (Rockville, MD, USA) . Los mejores alineamientos ocurrieron con una secuencia EST de una biblioteca de células estromales de osteoclastoma humano (SECUENCIA DE IDENTIFICACION N0:1) mostraron 100% de identidad sobre 18 aminoácidos contiguos) y una secuencia EST de una biblioteca de pituitaria humana (SECUENCIA DE IDENTIFICACION NO : 2 mostró el 95.5% de identidad sobre los 22 aminoácidos contiguos) . Un ADNc de longitud completa de la biblioteca de células estromales de osteoclastoma humano se identificó y secuenció (SECUENCIA DE IDENTIFICACION NO: 4) . La secuencia de aminoácidos correspondiente (SECUENCIA DE IDENTIFICACION NO : 4 ) se comparó contra los fragmentos del péptido identificados en lo anterior. La SECUENCIA DE IDENTIFICACION NO : 1 corresponde a los aminoácidos 38-68 de la proteína de galactocinasa humana de longitud completa. En forma similar, las SECUENCIAS DE IDENTIFICACION NOS: 2 y 3 corresponden a los aminoácidos 367-388 y 167-195, respectivamente de la galactocinasa humana.

ANALISIS DEL GEN DE LA GALACTOCINASA HUMANA Una comparación de la secuencia de aminoácidos para la galactocinasa humana con aquella de la galactocinasa de E. coli (Debouck et al., Nuc . Acid Res . , 11:1841-1853 (1985)) muestra 61% de similitud y 44% de identidad. Otra comparación con otro gen de la galactocinasa humana (GK2) reportado (Lee et al., Proc . Nati. Acad. Sci . USA, 89:10887-10891 (1992)) muestra 54% de similitud y 35% de identidad a nivel de los aminoácidos. Además, el gen GK2 forma un mapa para el cromosoma 15 humano lo cual es contrario al gen de la presente invención, el cual forma un mapa para el cromosoma 17 humano, posición q24 como se determina por el análisis de hibridación in si tu fluorescente (FISH) . La SECUENCIA DE IDENTIFICACION NO: 4 se híbrida contra una mancha de inmunotransferencia Northern que contiene el ARN mensajero humano de la placenta, cerebro, músculo esquelético, riñon, intestino, corazón, pulmón e hígado de acuerdo con los procedimientos estándar (véase, por ejemplo, Sambrook et al . , Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) . La hibridación fue más fuerte con el tejido de hígado y del pulmón humanos .

EXPRESION: La SECUENCIA DE IDENTIFICACION NO : 4 se subclonó en un vector de E. coli plásmido pBluescript [Stratagene] . Cuando se transformó en C600K-, una cepa deficiente en galactocinasa, la E. coli transformada creció en placas de agar MacConkey y produjo colonias rojas en forma de ladrillos, indicando la fermentación del azúcar. La SECUENCIA DE IDENTIFICACION NO : 4 también se subclonó en las células COS-1 [ATCC CRL 1650] . Las células se transfectan, se hacen crecer y se preparan los Usados celulares. Los Usados se ensayan por el ensayo de galactocinasa-C"'"^ como se describe por Stambolian et al. (Exp. Eve Res . , 18:231-237 (1984)) la cual es incorpora en la presente para referencia en su totalidad. Cuando se expresan en células COS transfectadas pasajeramente, la actividad de galactocinasa fue diez veces mayor que los niveles control (6600 contra 640 cuentas por minuto - repetidas tres veces) . Estos resultados confirman definitivamente que la SECUENCIA DE IDENTIFICACION NO : 4 codifica para un gen de galactocinasa humano, biológicamente activo, de longitud completa . La molécula de ácido nucleico de la invención, también puede ser subclonada en un vector de expresión para producir altos niveles de la galactocinasa humana (ya sea fusionada a otra proteína, por ejemplo, unida funcionalmente en el extremo 5' con otra secuencia de codificación, o sin fusionar) en células transfectadas . Para las células de mamífero, el vector de expresión codificaría opcionalmente para un gen de residencia a la neomicina para seleccionar las transfectantes con base a la capacidad de crecer en G418 y un gen de la dihidrofolato reductasa, lo cual permite la amplificación del gen transfectado en las células DHFR" . Entonces el plásmido puede ser introducido en líneas celulares huésped, por ejemplo CHO ACC98, una línea celular DHFR", no adherente adaptada para crecer en medio sin suero y células 293 de riñon embriónico humano (ATCC CRL 1573) y las líneas de células transíectadas pueden ser seleccionadas por la resistencia a G418. La descripción anterior y los ejemplos describen completamente la invención, incluyendo sus modalidades preferidas. Aquellos con habilidad en la técnica reconocerán o serán capaces de evaluar utilizando no más que la experimentación de rutina, muchos equivalentes para las modalidades específicas de la presente. Tales equivalentes están destinados para estar dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones .

LISTA DE SECUENCIAS (1) INFORMACION GENERAL: (i) SOLICITANTES: Bergsma, Derk J. Stambolian, Dwight (ii) TITULO DE LA INVENCION: Gen de la Galactocinasa Humana (iii) NUMERO DE SECUENCIAS: 4 (iv) DIRIGIR LA CORRESPONDENCIA: (A) DESTINATARIO: SmithKline Beecham Cor . /Corporate Intellectual Property (B) CALLE: 709 Swedeland Road/UW2220 (C) CIUDAD: Reino de Prusia (D) ESTADO: PA (E) PAIS: EUA (F) ZIP: 19406-0939 (v) FORMA DE LECTURA EN LA COMPUTADORA: (A) TIPO DE MEDIO: disco blando (B) COMPUTADORA: compatible con una PC IBM (C) SISTEMA DE OPERACION: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Reléase #1.0, Versión #1.25 (vi) DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL: (A) NUMERO DE SOLICITUD: (B) FECHA DE PRESENTACION: (C) CLASIFICACION: (viii) INFORMACION DEL APODERADO/AGENTE: (A) NOMBRE: Sutton, Jeffrey A. (B) NUMERO DE REGISTRO: 34,028 (C) REFERENCIA/NUMERO DE EXPEDIENTE: P50268 (ix) INFORMACION DE LA TELECOMUNICACION: (A) TELEFONO: (610) 270-5024 (B) TELEFAX: (610) 270-5090 (2) INFORMACION PARA LA SECUENCIA DE IDENTIFICACION NO: 1: (i) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 31 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: lineal (ii) TIPO DE MOLECULA: proteína (xi) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEC . DE IDENT. NO: 1: Val Asn Leu lie Gly Glu His ?hr Asp Tyr Asn Gln Gly Leu Val Leu 1 5 10 15 Pro Met Ala Leu Glu Leu Met Thr Val Leu Val Gly Ser Pro Arg 20 25 30 (2) INFORMACION PARA LA SECUENCIA DE IDENTIFICACION NO: 2: (i) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: lineal (ii) TIPO DE MOLECULA: proteína (xi) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEC . DE IDENT. NO: 2: His lie Gln Glu His Tyr Gly Gly Thr Ala Thr Pfce Tyr Leu Ser Gln 1 S 10 15 Ala Ala Asp Gly Ala Lys 20 (2) INFORMACION PARA LA SECUENCIA DE IDENTIFICACION NO: 3: (i) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 29 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: lineal (ii) TIPO DE MOLECULA: proteína (xi) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEC . DE IDENT . NO : 3 : Ala Gln Val Cys Gln Gln Ala Glu His Ser Phe Ala Gly Met Pro Cys 1 5 10 15 Gly lie Met Asp Gln Phe lie Ser Leu Met Gly Gln Lys 20 25 (2) INFORMACION PARA LA SECUENCIA DE IDENTIFICACION NO: 4: (i) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 1349 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico (C) FORMA DE LA HEBRA: doble (D) TOPOLOGIA: lineal (ii) TIPO DE MOLECULA: ADNc para ARNm (ix) CARACTERISTICA: (A) NOMBRE/CLAVE : CDS (B) UBICACION: 29..1204 DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEC . IDENT. NO: 4: GAATTCGGCA CGAGTGCAGG CGCGCGTC ATG GCT GCT TTG AGA CAG CCC CAG 52 MeC Ala Ala Lea Arg Gln Pro Gln 1 5 GTC GCG GAG CTC CTG GCC GAG GCC CGG C6A GCC TTC CCC GAG GAG TTC 10O Val Ala Glu L«u Leu Ala Glu Ala Arg Arg ñla Phe Arg Glu Glu Phe 10 15 20 GGG GCC GAG CCC GAG CTG GCC GTG TCA GCG CCG GGC CCC GTC AAC CTC 148 Gly Ala Clu Pro Glu Leu Aja al Sft Ala Pro Gly Arg Val A3fl Leu 25 30 35 lO ATC GGG GAA CR.C ACG GAC TAC AAC- CAG GGC CTG GTG CTG CCT ATG GCT 196 lie Gly Glu Tyr Aan. Gln Gly Un Val Leu Peo Met Ala 45 50 55 CTS GAG CTC A G ACG GTG CTC CTG GGC AGC CCC CGC AAG GAT GGG CTG 244 Leu Glu Leu Met Thr Val Leu Val Gly ser i'r Arg Lys sep Gly Leu 60 6i> 70 GTG TCT CTC CTC ACC ACC TCT GAG GT GCC GAT GAG CCC CAG CGG CTG 292 al Ser Leu Leu Thr Tlir ser Glu Gl Ala As Glu P o Gln Arg Leu 75 80 as CAG ?G? CCA CTG CC ACA GCC CAG CGC TCG CTG GAG CCT GCG ACT CCT 310 Gln f' e Pro L-iu Pro Thr Ala Gln Ary So Leu Clu Pro Gly Thr Pro 90 95 1QO CGG TGG GCC AAC TAT GTC AAG CGA GTC ATT CAG TAC TAC CCA GCT GCC 3BB Arg Trp Ala Asn Tyr Val Lya Gly Val lie Cln lyr Tyr Pro Ais Ala 105 110 115 120 CCC CTC CCT GGC TTC AGT GCA GTG GTG GTC ACC TCA GTG CCC CTG GGG 436 Pro Leu Pro Gly Phe Ser Ala Val Val S -r ser val uro r.«u Gly 125 130 135 GGT GGC CTG -l'CC AGC TCA GCA TCC TTG GAA GTG GCC ACG TAC ACC TTC B4 Gly Gly l.eu Ser Ser Ser Hl. Sur Leu Glu Val Ala mt Tyr Thr Plie 140 14¾ 150 CTC CAG CAG C'C TGT CCA GAC TCG CGC ACA ATA GCT GCC CGC GCC CAG 532 Leu Gln Gln Leo Cys Pro As Ser Gly Thr lio Ala Ala Arg Ala Gln 15Ü 160 lfiS GTG TGT CAG CAG GCC GAG CAC AGC T C GCA GGG ATG CCC TGT GGC ATC 580 Val Cys Gln Gln Ala Glu His Ser Phe Ala Gly Met Pro Cys Gly lie 170 175 180 ATG GAC CAG TTC ATC TCA CTT ATG GGA CAG AAA GGC CAC GCG CTG CTC 626 Het Asp Gln Pne He Ser Leu Met Gly Gln Lys Gly Hls Ala Leu Leu 1B5 190 195 200 ATT GAC TGC AGG TCC TTG GAG ACC AGC CTG GTG CCA CTC TCG GAC CCC 676 lie Asp Cys Arg Ser Leu Glu Thr Ser Leu val Pro Leu Ser Asp Pro 205 210 215 AAG CTG GCC GTG CTC ATC ACC AAC TCT AAT GTC CGC CAC TCC CTG GCC 724 Lys Leu Ala Val Leu He Thr Asn Ser Asn Val Arg His Ser Leu Ala 220 225 230 TCC AGC GAG TAC CCT GTG CGG CGG CGC CAA TGT GAA GAA GTG GCC CGG 772 Ser Ser Glu Tyr Pro Val Arg Arg Arg Gir» Cys Glu Glu Val Ala Arg 235 240 245 GCG CTG GGC AAG 6AA AGC CTC CGG GAG GTA CAA CTG GAA GAG CTA GAG 820 Ala Leu Gly Lys Glu Ser Leu Arg Glu Val Gln Leu Glu Glu Leu Glu 250 255 260 GCT GCC AGG GAC CTG GTG AGC AAA GAG GGC TTC CGG CGG GCC CGG CAC 858 Ala Ala Arg Asp Leu Val Ser Lys Glu Gly Phe Arg Arg Ala Arg His 265 270 275 2T0 GTG GTG GGG GAG ATT CGG CGC ACG GCC CAG GCA GCG GCC GCC CTG AGA 916 Val Val Gly Glu lie Arg Arg Thr Ala Gln Ala Ala Ala, Ala Leu Arg 285 290 295 CGT GGC GAC TAC AGA GCC TTT GGC CGC CTC ATG GTG GAG AGC CAC CGC 964 Arg Gly Asp Tyr Arg Ala Ptie Gly Arg Leu Met al Glu Ser His Arg 300 305 310 TCA CTC AGA GAC GAC TAT GAG GTG AGC TGC CCA GAG CTG GAC CAG CTG 1012 Ser Leu Arg Asp Asp Tyr Glu Val Ser Cys Pro Glu Leu Asp Gln Leu 315 320 325

Claims (17)

GTS GAG GCT GCG CTT GCT GTG CCI GGG GTT TAT GGC AGC CGC ATG ACG 1060 Val Glu Ala Ala Leu Ala Val Pro Gly Val Tyr Gly Sei Arg Met Thr 330 335 340 GGC GGT GGC TTC GGT GGC TGC ACG GTG ACA CTG CTG GAG GCC TCC GCT 1108 Gly Gly Gly P e Gly Gly Cys Thr Val Thr Leu Leu Glu Ala Ser Ala 345 350 355 360 GCT CCC CAC GCC ATG CGG CAC ATC CAG GAG CAC TRC GGC GGG ACT GCC 1156 Ala Pro His Ala Met Arg Hls He Gln Glu His Tyr Gly Gly Thr Ala 365 3T0 375 ACC TTC TAC CTC TCT CAA GCA GCC GAT GGA GCC AAG GTG CTG TGC TTG 1204 Thr Phe Tyr Leu Ser Gln Ala Ala Asp Gly Ala Lys al Leu Cys Leu 380 385 390 TGAGGCACCC CCAGGACAGC ACACGGTGAG GGTGCGGGGC CTGCAGGCCA GTCCCACGGC 1264 TCTGTGCCCG GTGCCATCTT CCATATCCGG G7GCTCAATA AACTTGTGCC TCCAATGTGG 1324 AAAAAAAAAA AAAAAAAAAC TCGAG 1349 NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES

1. Una molécula de ácido nucleico aislado que codifica para la galactocinasa humana, la molécula de ácido nucleico está caracterizada porque se selecciona del grupo que consiste de: (a) una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia como se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACION NO : 4 desde el nucleótido 29 al nucleótido 1204; (b) una molécula de ácido nucleico capaz de. hibridizar bajo condiciones moderadamente severas a la molécula de ácido nucleico de (a) ; y (c) una molécula de ácido nucleico que difiere de la molécula de ácido nucleico de (a) o (b) en la secuencia del codón debido a la degeneración del código genético.

2. La molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque es ADN.

3. La molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque es ARN.

4. Un vector caracterizado porque comprende la molécula de ácido nucleico de ¦ conformidad con la reivindicación 1.

5. El vector de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque es un plásmido .

6. Un virus deficiente en la replicación, caracterizado porque comprende la molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1.

7. Una célula huésped recombinante caracterizada porque comprende el vector de conformidad con la reivindicación 4.

8. Un oligonucleótido antisentido caracterizado porque tiene una secuencia la cual es capaz de unirse a la molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 2.

9. Un procedimiento para preparar una proteína de galactocinasa humana, caracterizado porque comprende cultivar la célula huésped recombinante de conformidad con la reivindicación 7 bajo condiciones que promuevan la expresión de la proteína y su recuperación .

10. Una galactocinasa humana producida por el procedimiento de conformidad con la reivindicación 9.

11. Un anticuerpo dirigido contra la galactocinasa humana.

12. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque es un anticuerpo monoclonal.

13. Una molécula de ácido nucleico, aislada caracterizada porque comprende una secuencia de ADN que codifica para los nucleótidos 29 a 1204 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACION NO : 4.

14. Un método para diagnosticar condiciones asociadas con la deficiencia de la galactocinasa humana, caracterizado porque comprende aislar una muestra de ácido nucleico de un individuo; ensayar la muestra y la secuencia de ADN o la secuencia de ARN correspondiente, que codifica para los nucleótidos 29 a 1204 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACION NO : 4 ; y comparar las diferencias entre la muestra y el ADN (o ARN) , en el que las diferencias indican mutaciones en el gen de la galactocinasa humana.

15. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque el ensayo de la muestra comprende un ensayo de hibridación.

16. El método de conformidad con la reivindicación 15, en el que el ensayo de hibridación es electroforesis heteroduplex, caracterizado porque comprende determinar la movilidad diferencial de los productos heteroduplex en geles de poliacrilamida, los productos heteroduplex son el resultado de hibridación entre la muestra del ácido nucleico y la secuencia de ADN o la secuencia de ARN correspondiente, que codifica para los nucleótidos 29 a 1204 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACION NO : 4.

17. El método de conformidad con la reivindicación 14, en el que el ensayo de la muestra está caracterizado porque comprende electroforesis en gel de los polimorfismos de la longitud del fragmento de restricción de la muestra de ácido nucleico y la secuencia de ADN o la secuencia de ARN correspondiente, que codifica para los nucleótidos 29 a 1204 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACION NO: 4. 1A. El método de conformidad con la reivindica ión 1?·, en el que el ensayo de la muestra está caracterizado porque comprende determinar la secuencia de ADN. 19. Un método para diagnosticar condiciones asociadas con la deficiencia da la galactoc inasa humana, el método está caracterizado porque comprende aislar células de un individuo que contiene ADN genómico y ensayar la muestra por hibridación in situ utilizando la secuencia de ADN que codifica para los nucleótidos 29 a 120'+ de la SECUENCIA DE IDENTIFICACION NO: M- como una sonda. 20. Uso de una composición farmacéu ica que contiene una cantidad efectiva de proteína de galactoc inasa humana para tratar condiciones, las cuales están relacionadas con actividad de qalactoc nasa humana insuficiente. 21. Uso de una célula huésped recombinante de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado además porque es para tratar condiciones, las cuales están relacionadas con actividad de galacto i nasa humana insuf ic iente . 22. El método de conformidad con la reivi dicación 21, caracterizado porque las células son hepatocitos. 23. El método de conformidad con la reivindica ión 21, caracterizado porque las células son cualquier célula del ojo. 24. Uso del ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado además porque es para tratar condiciones, las cuales están relacionadas con actividad de galactoc i nasa humana insuficiente, dicho ácido nucleico expresándose en las células objetivo de un paciente y por lo tanto alivian dichas condiciones» 25. El uso del ácido nucleica de conformidad con la reivindicación 2W, caracteri ado además porque dicho ácido nucleico ha sido transíectado a células objetivo por la infección con un virus deficiente en la replicación o por transfección con un liposoma que comprende dicho ácido nucleico . 26. El uso del ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 24·, caracterizado además porque las células objetivo son hepatocitos. 27. El uso del ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 24·, caracterizado además porque las células objetivo son células epiteliales respiratorias. 2&. El uso del ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 24, caracteri ado además porque las células son cualquier célula del ojo. 29. Un mamífero no humano, transgénico capaz de expresar en cualquier célula del mismo, el DNA de conformidad con la rei indicación 2. En testimonio de lo cual firmo lo anterior en esta Ciudad de México, D.F., a los 25 días del mes de Octubre de 1 1+ . SMITH LINE BEECHAM CORPORATION UNIVE SITY OF PENNSYLVANIA APODERADO MAL/ rg*