DE69021742T2

DE69021742T2 - Verfahren zum Nachweis von kleinzelligem Carzinom und die Verwendung von Sequenzen, die Acylpeptid-Hydrolase codieren, für diesen zweck.

Info

Publication number: DE69021742T2
Application number: DE69021742T
Authority: DE
Inventors: John A Smith
Original assignee: General Hospital Corp
Current assignee: General Hospital Corp
Priority date: 1989-01-13
Filing date: 1990-01-12
Publication date: 1996-02-22
Anticipated expiration: 2010-01-13
Also published as: EP0378224A3; US5268267A; EP0378224A2; US5512467A; IE900141L; ES2076976T3; JPH04502557A; DE69021742D1; IL92956A0; FI913391A0; AU5356990A; ATE126830T1; WO1990008457A2; EP0378224B1; CA2044595A1; DK0378224T3; PT92844A; WO1990008457A3; GR3017739T3; AU633896B2

Description

Die Erfindung betrifft die Diagnose eines kleinzelligen Karzinoms durch die Verwendung einer Gensequenz, welche für die Rattenleber-Acylpeptidhydrolase kodiert.
Seit der Entdeckung einer Acetylgruppe am Amino-Ende des Tabak-Mosaik-Virus-Hüllenproteins ist in Tieren, Pflanzen und deren Viren, und auch in Bakterien und Pilzen eine Reihe van Nα-acetylierten Proteinen gefunden worden. Die Nα-Acetylierung wird daher als eine der typischen Modifikationen von Proteinen in lebenden Organismen angesehen. Weiterhin ist die Vermutung ausgesprochen worden, daß in einigen Eukaryontenzellen mehr als % der intrazellulären, löslichen Proteine Nα-acetyliert sind (Brown, J. L., J. Biol. Chem., 254:1447-1449 (1979)).
Die biologische Bedeutung der Nα-Acetylierung von Proteinen ist nach wie vor eine offene Frage (siehe Tsunasawa et al., Method Enzymol., 106:165-170 (1984). Die Vermutung ist ausgesprochen worden, daß diese nach der Translation auftretende Modifikation intrazelluläre Proteine vor einer Proteolyse schützt. Dies gilt jedoch nicht für alle Proteine. Im Falle von Aktin aus Schleimschimmelpilzen wird der proteolytische Abbau langsamer, wenn das Protein Nα-acetyliert ist. Im Gegensatz hierzu wird das Katzen-Hämoglobin unabhängig von der Nα-Acetylierung mit der gleichen Geschwindigkeit abgebaut. (Tsunasawa et al., 1984).
Ergebnisse, die in der letzten Zeit aus DNA-Sequenzierungen gewonnen worden sind, haben gezeigt, daß in Strukturgenen für die sekretorischen Proteine, welche Nα-acetyliert sind, dem Codon für den acetylierten Rest am Amino-Ende das Startcodon ohne Insertion zusätzlicher Codons für Aminosäuren unmittelbar vorangeht (Tsunawa et al., 1984). Bisher sind noch kaum Untersuchungen mit dem Ziel durchgeführt worden, die Beziehung zwischen der Nu-Acetylierung und dem Transport sekretorischer Proteine quer durch biologische Membranen besser zu verstehen. Für ein vollständiges Erkennen der Funktion der N α-Acetylierung wird es wichtig sein, die Nα-acetylierten Aminosäuren in Proteinen und Peptiden im mikroanalytischen Maßstab zu identifizieren. Zu diesem Zweck muß ein wirksames Entfernen der Nα-Acetylgruppe oder der Nα-Acetylaminosäure bewirkt werden.
Die Acylpeptidhydrolase (APH) ist erfolgreich für die Hydrolyse Nα-acylierter Peptide eingesetzt worden. Ein solches Enzym, welches aus tierischer Leber isoliert und gereinigt worden ist, kann die Nα-Acetylaminosäure aus ziemlich kurzen Peptiden freisetzen, die aus Nα-acetylierten Proteinen stammen (Tsunasawa et al., 1984). Die Substratspezifität für den Rest am Amino-Ende ist weitreichend. Die APH spaltet die endständige, Nα-acetylierte oder -formylierte Aminosäure von einem mit einer Schutzgruppe versehenen Peptid ab (Jones et al, BBRC, 126:933 (1985)). Dieses Enzym katalysiert die Hydrolyse einer mannigfaltigen Anzahl von Peptiden und zeigt dabei verschiedene pH-Optima für gewisse Substrate. Dieses Enzym mag auch eine Hauptrolle bei der Verarbeitung von Polypeptidketten während der Biosynthese spielen. Die APH ist aus Rattenleber (Tsunasawa et al., J. Biochem., 77:89-102 (1975)); [aus Rinderleber (Gäde et al., Biochim. Biophys. Acta, 662:86-93 (1981))]; aus Schweineleber (Tsunasawa et al., J. Biochem., 93:1217-1220 (1983)); aus Rattengehirn (Marks et al., J. Neurochem., 41: 201-208 (1983)); und aus Human-Erythrozyten (Jones et al., Biochem. and Biophys. Res. Comm., 126:933-940 (1985)) isoliert und gereinigt worden.
Eine Rattenleber-Acylpeptidhydrolase (APH), welche die Hydrolyse des acetylierten Restes aus Nα-acetylierten Peptiden katalysiert, ist kürzlich bis zur Homogenität gereinigt worden, und verschiedene Hemmungsversuche zeigen an, daß dieselbe wahrscheinlich eine Serin-Protease ist, welche ein Ladungs-Relais- System ("charge relay system") benützt, an welchem Serin, Histidin und wahrscheinlich eine Carboxylgruppe beteiligt sind (Kobayashi, K. und Smith, J. A., J. Biol. Chem., 262: 11435(1987)) . Es ist jedoch noch nicht klar, ob die Acylpeptidhydrolase eine einzigartige Serin-Protease ist.
Um ein vollständigeres Erkennen der Regelung der Ratten- Acylpeptidhydrolase in vivo zu erleichtern, ist es daher erwünscht, das Ratten-Acylpeptidhydrolase-Gen zu klonieren und zu sequenzieren. Die Rattenleber-Acylpeptidhydrolase und Verfahren zur Erzeugung und Verwendung derselben sind in der EP 0 303 997 A2 beschrieben, welche unter den Artikel 54(3) EPÜ fällt.
Die Acylpeptidhydrolase katalysiert die Hydrolyse eines Nα-acetylierten Aminosäurerestes aus einem Nα-acetylierten Peptid. Zwei überlappende, entartete Oligonukleotid-Gensonden auf der Basis der Sequenz eines durch Spaltung mit Trypsin erhaltenen Peptides, welches aus einer gereinigten Ratten- Acylpeptidhydrolase stammte, wurden synthetisiert und zum Durchmustern einer Rattenleber-γgtll-cDNA-Genbank verwendet. Eine 2,5-kb-cDNA würde kloniert und sequenziert. Dieser Klon enthielt 2364 bp der Ratten-Acylpeptidhydrolase-Sequenz, es fehlte ihm aber ein Startcodon. Unter Verwendung einer 220 bp- Gensonde, welche aus dem 5'-Ende dieser nahezu in voller Länge vorhandenen cDNA stammte, zum neuerlichen Durchmustern der Genbank, wurden die volle Länge aufweisende Klone isoliert, welche bei den Nukleotiden 6 bis 8 ein In-frame-ATG-Codon enthielten und für die Sequenz am NH&sub2;-Ende, Met-Glu-Arg-Gln..., kodierten Die DNA-Sequenz kodierte für ein Protein aus 732 Aminosäurenresten, von denen 40 % durch Proteinsequenzdaten aus 19 Peptiden, die durch Spaltung mit CNBr oder mit Trypsin gewonnen worden sind, bestätigt worden sind. Das isolierte Enzym weist eine Schutzgruppe am NH&sub2;-Ende auf (Kobayashi, K., und Smith, J.A. (1987), J. Biol. Chem., 262:11435-11445); und auf der Basis der Proteinsequenz am NH&sub2;-Ende, welche aus der DNA- Sequenz und aus der Sequenz des dem NH&sub2;-Ende am nächsten gelegenen CNBr-Peptides abgeleitet worden ist, ist es wahrscheinlich, daß der Rest am NH&sub2;-Ende ein acetylierter Methioninrest ist, weil solche Reste häufig neben Glutamylresten stehen (Persson, B., et al., Eur. J. Biochem., 152 (1985) , 523-527) . Die RNA-Blot-Analyse ergab ein einziges Signal von 2,7 kb in den verschiedenen untersuchten Rattengeweben. Obgleich es bekannt ist, daß dieses Enzym durch Diisopropylfluorphosphat und Acetylalaninchlormethylketon gehemmt wird (Kobayashi, K. und Smith, J.A. (1987), J. Biol. Chem., 262:11435-11445, konnte keine starke Ahnlichkeit in der Proteinsequenz mit anderen Serin-Proteasen festgestellt werden. Dieses Ergebnis legt es nahe, daß die Acylpeptidhydrolase eine einzigartige Serin-Protease sein mag.
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweisen eines kleinzelligen Karzinoms, welches umfaßt:
a. Inkubieren einer Nukleinsäureprobe aus einem Patienten, bei welchem der Verdacht besteht, daß er an einem kleinzelligen Karzinom leidet, in Gegenwart eines Nukleinsäuremoleküls, welches eine Sequenz aufweist, die aus einer aus
i. einer Sequenz, welche für die Gesamtheit oder einen Teil eines Acylpeptidhydrolase-Enzyms gemäß Fig. 1 kodiert; und
ii. einer Sequenz, welche komplementär zu einer Sequenz ist, welche für die Gesamtheit oder einen Teil eines Acylpeptidhydrolase-Enzyms gemäß Fig. 1 kodiert;
bestehenden Gruppe ausgewählt ist; wobei diese Inkubation unter Bedingungen durchgeführt wird, welche dafür ausreichen, daß eine Nukleinsäure-Hybridisierung zwischen der Nukleinsäureprobe und dem Nukleinsäuremolekül stattfinden kann und dadurch ein hybridisiertes Molekül gebildet wird; und
b. Nachweisen, wie z. B. durch eine Analyse der Restriktionsfragment-Längenpolymorphismen, eines kleinzelligen Karzinoms, indem man feststellt, ob sich das hybridisierte Molekül in seiner Sequenz von einem Bezugsmolekül unterscheidet, wobei dieses Bezugsmolekül eine Nukleinsäureprobe aus einem normalen Individuum umfaßt, welche an ein Nukleinsäuremolekül hybridisiert ist, welches für die Gesamtheit oder einen Teil eines Acylpeptidhydrolase-Enzyms gemäß Fig. 1 kodiert.
Die Erfindung betrifft weiterhin ein zweisträngiges Nukleinsäuremolekül, welches umfaßt:
A. einen ersten Strang, welcher eine Sequenz aufweist, die aus einer aus
i. einer Sequenz, welche für die Gesamtheit oder einen Teil eines Acylpeptidhydrolase-Enzyms gemäß Fig. 1 kodiert; und
ii. einer Sequenz, welche komplementär zu einer Sequenz ist, welche für die Gesamtheit oder einen Teil eines Acylpeptidhydrolase-Enzyms gemäß Fig. 1 kodiert;
bestehenden Gruppe ausgewählt ist; wobei dieser erste Strang hybridisiert ist mit:
B. einem zweiten Strang, wobei dieser zweite Strang eine Sequenz aufweist, die In ihrer Sequenz zu der Sequenz des ersten Stranges im wesentlichen komplementär ist, und wobei diese komplementäre Sequenz des zweiten Stranges aus einem Individuum stammt, bei welchem der Verdacht besteht, daß es an kleinzelligem Karzinom leidet.

BESCHREIBUNG DER FIGUREN

Die Fig. 1 veranschaulicht die Aminosäurensequenz der APH. Die aus der cDNA-Sequenz abgeleitete Proteinsequenz (Fig. 3) ist durch die Einbuchstaben-Notation für die Aminosäuren angegeben. Die zwischen Klammern gesetzten Linien zeigen die Enden der CB-, CB-R- und CB/R-Peptide an. Die nach rechts zeigenden Pfeile weisen darauf hin, daß der entsprechende Aminosäurerest als PTH-Aminosäurerest während eines automatisierten Edman-Abbaues identifiziert worden ist (Tabelle 1) . Eine Leerstelle zeigt an, daß in diesem Abbauzyklus keine PTH-Aminosäure identifiziert worden ist. Ein Sternchen zeigt an, daß während dieses Abbauzyklus statt der PTH-Lys ein PTH-Trp zusammen mit einem nicht-identifizierten, spät eluierenden PTH-Derivat identifiziert worden ist. Die Cysteinreste wurden als PTH-Derivate von [¹&sup4;C]-S-Carboxymethylcystein identifiziert. Das aktive Serin ist in den Positionen 620 bis 627 der Fig. 1 (mit diagonalen Linien gefüllter Kasten) dargestellt. Die Identifizierung der hier dargestellten Peptide ist in Tabelle 3 definiert.
Die Fig. 2 veranschaulicht das Klonieren und Sequenzieren der für die Ratten-Acylpeptidhydrolase kodierenden cDNA. (A) Oligonukleotid-Gensonden, welche für das anfängliche Durchprüfen der Rattenleber-λgtll-cDNA-Genbank verwendet wurden. Die Aminosäurensequenz eines durch Spaltung mit Trypsin gewonnenen, durch RPLC gereinigten Peptides(C818-R11-13-c; Tabelle 3) wurde als Basis für die Synthese von zwei überlappenden, entarteten Oligonukleotiden, YS17.2 und Y20.1, verwendet. (B) Restriktionskarte der Klone und auf dieselben angewendete DNA-Sequenzierungstaktik. Unter Verwendung der entarteten Oligonukleotide gemäß Fig. 2A wurde - wie nachstehend beschrieben ist - aus einer Rattenleber-λgtll-cDNA-Genbank der APH5.2 erhalten. Die Pfeile zeigen die Richtung und das Ausmaß der Bestimmung der DNA-Sequenz für jedes Fragment an. Die DNA-Sequenzanalyse für diesen Klon ergab die erwartete Hybridisierungsstelle in der Nähe seines 5'-Endes (offene Region in der fettgedruckten Linie), eine poly(A)-Sequenz an seinem 3'-Ende, und eine nichtverwandte Sequenz an seinem 3'-Ende (schraffierter Kasten).
Nach einem neuerlichen Durchprüf en der Rattenleber-λgtll-cDNA- Genbank mit dem aus dem APH5.2 stammenden XmnI-KpnI-Fragment (längerer offener Kasten) fehlte dem APH36.1 ein ATG-Startcodon, und er enthielt auch ein 120 Basenpaare umfassendes Fragment, das für Rattenserumalbumin kodierte (Kasten mit diagonalen Linien). Nach einem neuerlichen Durchprüfen der Genbank mit einem aus dem APH36.1 stammenden 220 bp-Banll-PstI-Fragment (kürzerer offener Kasten), wurde der APH2.7 kloniert, und anschließend wurde er in dem Bluescript-Plasmid (Stratagene) subkloniert und teilweise sequenziert. Abkürzungen: B, BanI; P, PstI; X, XmnI; und K, KpnI.
Die Fig. 3 zeigt die Nukleotidsequenz und die daraus abgeleitete Aminosäurensequenz einer Rattenleber-Acylpeptidhydrolase. Die vollständige, für die Rattenleber-Acylpeptidhydrolase kodierende cDNA wurde durch Kombinieren der DNA-Sequenzdaten von APH36.1 und APH2.7 (Fig.2B) abgeleitet. Die abgeleitete Proteinsequenz ist in der Einbuchstaben-Notation für die Aminosäuren angegeben.
Die Fig. 4 zeigt die Nukleotidsequenz des Ratten-Acylpeptidhydrolase-Gens und von dessen flankierender Region. Die Beginnstelle der Transkription des Gens ist durch einen vertikalen Pfeil angezeigt. Dem Nukleotid in dieser Position wird die Zahl 1 zugeordnet. Die Intron-DNA-Sequenz ist in Unterkasten- Buchstaben dargestellt, und die Exon-DNA-Sequenz ist in Oberkasten-Buchstaben dargestellt. Der Anfang und das Ende eines jeden Introns sind durch vertikale Linien gekennzeichnet. Die Stelle für den Beginn der Translation befindet sich bei den Nukleotiden 625 bis 627. Das Polyadenylierungssignal befindet sich bei den Nukleotiden 9708 bis 9713. Die "TATA"-kastenartige Sequenz (Nukleotide -24 bis -30) und die "CAAT-Kasten"-artige Sequenz (Nukleotide -95 bis -99) sind jeweils in einem Kasten dargestellt. Die GC-Repeats sind unterstrichen. Repeats von 200 bp in Tandem-Anordnung sind strichliert unterstrichen.
Die Fig.5 zeigt einen strukturellen Aufbau des Ratten- Acylpeptidhydrolase-Gens. Die Fig. 5A zeigt überlappende, rekombinante λ-Phagen, welche das Acylpeptidhydrolase-Gen enthalten. Die überlappenden, genomischen Klone, APHE5 und APHH6, welche zusammengenommen das gesamte Acylpeptidhydrolase-Gen enthalten, sind durch die zusammenhängenden, horizontalen Linien dargestellt. Die Fig. 5B zeigt die Restriktionskarte des Acylpeptidhydrolase-Gens und von dessen flankierenden Regionen. Die EcoRI-(E)-, BamHI-(B)-, HindIII-(H)- und PstI-(P)-Stellen sind durch vertikale Striche angezeigt. Die Transkriptionsausrichtung dieses Gens von 5' (links) nach 3' (rechts) ist dargestellt. Die Fig. 5C zeigt den Exon-Intron-Aufbau des Ratten- Acylpeptidhydrolase-Gens. Die Stellen der 23 Exons innerhalb des Ratten-Acylpeptidhydrolase-Gens sind durch gefüllte Kästen angezeigt. Die Stellen des Translationsstartcodons, ATG, und des Polyadenylierungssignals, AATAAA, sind durch vertikale Linien gekennzeichnet.
Die Fig. 6 zeigt einen Vergleich der Aminosäurensequenz der Acylpeptidhydrolase mit jener des Proteins DNF 1552.
In den Figuren sind die Aminosäuren mit einzelnen Buchstaben des Alphabets bezeichnet worden, so daß: A = Alanin, B = Asparaginsäure oder Asparagin, C = Cystein, D = Asparaginsäure, E = Glutaminsäure, F = Phenylalanin, G = Glycin, H = Histidin, I = Isoleucin, K = Lysin, L = Leucin, M = Methionin, N = Asparagin, P = Prolin, Q = Glutamin, R = Arginin, S = Serin, T = Threonin, V = Valin, W = Tryptophan, Y = Tyrosin, Z = Glutamin oder Glutaminsäure.

Definitionen

Für ein besseres Verständnis der Beschreibung und der Patentansprüche, einschließlich des Umfanges, der solchen Ausdrücken gegeben werden soll, werden die folgenden Definitionen angeführt.
Transkription: Das Verfahren der Erzeugung von mRNA aus einem Strukturgen.
Translation: Das Verfahren der Erzeugung eines Polypeptides aus mRNA.
Expression: Das Verfahren, dem ein Strukturgen zur Erzeugung eines Polypeptides unterworfen wird. Es handelt sich dabei um eine Kombination von Transkription und Translation.
Plasmid: Ein kreisförmiges, doppelsträngiges DNA-Molekül, das keinen Teil des Hauptchromosoms eines Organismus darstellt&sub1; und das Gene enthält, die Resistenz gegenüber spezifischen Antibiotika verleihen. Wird das Plasmid in einen einzelligen Organismus eingebracht, dann können die charakteristischen Merkmale dieses Organismus als Ergebnis der Plasmid-DNA verändert oder transformiert werden. Beispielsweise transformiert ein Plasmid, welches das Gen für Tetracyclinresistenz (Tetr) enthält, eine Zelle, welche zuvor Tetracyclin-empfindlich war, in eine Zelle, welche Tetracyclin-resistent ist. Eine durch ein Plasmid transformierte Zelle wird "Transformand" genannt.
Klonierungsvehikel: Ein Plasmid, eine Phagen-DNA oder sonstige DNA-Sequenzen, welche in einer Wirtszelle replikationsfähig sind. Das Klonierungsvehikel ist durch eine oder eine kleine Anzahl von Endonukleasen-Erkennungsstellen gekennzeichnet, an denen solche DNA-Sequenzen in bestimmbarer Weise und ohne Verlust einer wesentlichen biologischen Funktion der DNA zerschnitten werden können, wobei das Klonierungsvehikel einen Marker enthalten kann, der zur Verwendung beim Identifizieren transformierter Zellen geeignet ist. Die Marker sind beispielsweise Tetracyclinresistenz oder Ampicillinresistenz. Ein Klonierungsvehikel wird häufig Vektor genannt.
Rekombinante DNA-Moleküle oder Hybrid-DNA: Ein Molekül, welches aus DNA-Segmenten aus verschiedenen Genomen besteht, weiche DNA-Segmente außerhalb lebender Zellen Ende an Ende miteinander verbunden worden sind, und welche die Fähigkeit haben, irgendeine Wirtszelle zu infizieren und in derselben erhalten zu werden.
Operator: Eine DNA-Sequenz, welche zur Wechselwirkung mit einem spezifischen Repressor befähigt ist und dadurch die Transkription des benachbarten Gens oder der benachbarten Gene regeln kann.
Promotor: Eine DNA-Sequenz, an welche sich die RNA-Polymerase bindet und die Transkription eines benachbarten Gens oder benachbarter Gene auslöst.
Acylpeptidhvdrolase (APH): Dieser Ausdruck soll eine Acylpeptidhydrolase oder Acylpeptidhydrolasen aus irgendeiner Spezies umfassen, welche die Aktivität des Freisetzens der endständigen Nα-acylierten Aminosäure aus irgendeinem Protein oder Peptid in einem in-vivo- oder in-vitro-System aufweist bzw. aufweisen. Der Ausdruck Acylpeptidhydrolase wird im Rahmen dieser Erfindung auch dahingehend verwendet, daß er irgendein Analogon, irgendeine homologe Verbindung, irgendeine Mutante oder irgendein Derivat einer natürlich vorkommenden Acylpeptidhydrolase umfaßt, welche bzw. welches die Nα-acetylierte Aminosäure aus dem endständigen Nα-Teil eines Peptides oder eines Proteins abspaltet. Der Ausdruck soll auch Fragmente umfassen, welche weniger als die natürlich vorkommende Anzahl von Aminosäuren aufweisen, wie z. B. Teilfragmente von natürlichen Acylpeptidhydrolasen, welche die Aktivität des Abspaltens der acylierten Aminosäure von dem Ende mit dem endständigen N eines Proteins oder Peptides beibehalten. Der Ausdruck wird auch dahingehend verwendet, daß er irgendein Produkt umfaßt, welches die Sequenz einer natürlich vorkommenden Acylpeptidhydrolase oder eines Analogons hievon, zusammen mit einer oder mit mehreren, flankierenden Aminosäuren, enthält, und welches Acylpeptidhydrolaseaktivität zeigt. Der Ausdruck "Acylpeptidhydrolase" umfaßt auch Synomyme, wie z. B. Acylaminosäure-freisetzender Faktor, Acylaminosäure-freisetzendes Enzym, Acylaminopeptidhydrolase und Acetylaminoacyl-p-nitroanilidase.
Im wesentlichen in reiner Form: Die hierin verwendeten Ausdrücke "im wesentlichen rein" oder "im wesentlichen gereinigt" sollen das Protein beschreiben, welches im wesentlichen frei von irgendeiner Verbindung ist, die normalerweise mit dem Faktor in seinem natürlichen Zustand assoziiert ist. Der Ausdruck soll weiterhin auch jenen Faktor beschreiben, der gemäß einem oder mehreren Reinheits- oder Homogenitätsmerkmalen, wie dieselben von den Durchschnittsfachleuten auf diesem Fachgebiet verwendet werden, homogen ist. Beispielsweise wird ein im wesentlichen reiner Faktor konstante und reproduzierbare, charakteristische Merkmale zeigen, welche innerhalb der Standardabweichungen bei Versuchen für solche Parameter wie die nachstehenden liegen: Molekulargewicht, Chromatographietechniken und andere derartige Parameter. Der Ausdruck soll jedoch künstliche oder synthetische Gemische des Faktors mit anderen Verbindungen nicht ausschließen. Der Ausdruck soll auch das Vorliegen kleiner Verunreinigungen nicht ausschließen, welche die biologische Aktivität des Faktors nicht stören, und welche z. B. wegen einer unvollständigen Reinigung vorhanden sein können.
Das durch Gelfiltration abgeschätzte Molekulargewicht der Rattenleber-APH beträgt 290.000 bis 320.000. Es hat den Anschein, daß es vier identische Untereinheiten gibt, mit jeweils einem aktiven Serin pro Untereinheit. Das Nα-Ende der APH ist acyliert. Die APH scheint eine Serin-Protease zu sein, mit einem Ladungs-Relais-System unter Beteiligung von Serin, Histidin und Carboxylgruppen. Das aktive Serin ist in den Positionen 620 bis 627 der Figur 1 dargestellt (durch einen mit diagonalen Linien gefüllten Kasten). Die Aminosäurensequenz dieser Stelle ist MGGSHGGF. Die Umgebung der aktiven Stelle unterscheidet sich von anderen Proteasen der Trypsin-Familie durch das Vorliegen von Histidin und das Fehlen von Asparaginsäure. Obgleich die APH eine breite Spezifität für Substrate aufweist, so spaltet sie dennoch Ac-Ala-, Ac-Ser- und Ac-Met-enthaltende Peptide (nämlich die am häufigsten vorkommenden, am endständigen N acetylierten Reste) wirksamer als andere acylierte Dipeptide. Die APH hat nur eine sehr geringe oder überhaupt keine Aktivität gegenüber Ac-Trp-, Ac-Asp-, Ac-Glu-, Ac-Arg-, Ac-Phe- und Ac-Pro-enthaltenden Peptiden.
Die Acylpeptidhydrolase (APH) ist zu unterscheiden von der Nα-Acetyltransferase, welche die Reaktion katalysiert, in welcher ein Protein die Acetylgruppe aus einem Acetyl-CoA annimmt (Tsunasawa et al., Methods in Embryology, 106:165-170 (1984)). Die Acylpeptidhydrolase sollte auch von der Aminoacylase < Szajani, Acta Biochim. et Biophys. Acad.Sci.Hung., 15:223-228 (1980)) [auch als α-N-Acylaminosäurehydrolase bekannt (Gade et al., Biochim. Biophys. Acta, 662:86-93 (1981))] unterschieden werden.
Die für die APH kodierende DNA-Sequenz kann aus einer Vielfalt von Quellen abgeleitet werden. Beispielsweise kann die für die APH kodierende mRNA aus den Geweben irgendeiner APH-produzierenden Spezies unter Anwendung des Northern-Blot-Verfahrens (Alwine et al., Method Enzymol., 68:220-242 (1979)) und unter Verwendung markierter Oligonukleotid-Gensonden isoliert werden. Die mRNA kann dann nach den Fachleuten auf diesem Gebiet bekannten Techniken in die cDNA umgewandelt werden. Die Gensonden können auf der Basis der bekannten Aminosäurensequenz von APH- Peptiden synthetisiert werden.
Alternativ können degenerierende DNA-Gensonden zum Durchprüfen einer DNA-Genbank einer APH-produzierenden Spezies verwendet werden, wodurch ein Klon isoliert wird, der die für die APH kodierende DNA-Sequenz enthält. Die DNA-Genbank wird durch Fragmentierung, unter Verwendung von einer oder mehreren Restriktionsendonukleasen, der Genom-DNA, das anschließende Einschleusen der Fragmente in Vektoren und deren Verwendung zum Transformieren von Wirtszellen, welche dann ausplattiert und durchgeprüft werden, geschaffen.
Die DNA-Gensonde kann mit einer nachweisbaren Gruppe markiert werden. Eine solche nachweisbare Gruppe kann irgendein Material sein, welches eine nachweisbare physikalische oder chemische Eigenschaft aufweist. Solche Materialien sind auf dem Gebiet der Immunoassays wohlentwickelt worden; und im allgemeinen können die meisten Labels, die bei solchen Verfahren verwendbar sind, auch im Rahmen der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden. Besonders nützlich sind enzymatisch wirksame Gruppen, wie z. B. Enzyme (siehe Clin. Chem., 22:1243 (1976)); Enzymsubstrate (siehe die GB-PS 1 548 741); Coenzyme (siehe die US-PSen Nrn. 4 230 797 und 4 238 565) und Enzyminnibitoren (siehe die US-PS Nr. 4 134 792) Fluoreszenzmittel (siehe Clin. Chem., 25:353 (1979)); Chromophore; Lumineszenzmittel, wie z. B. Chemilumineszenzmittel und Biolumineszenzmittel (siehe Clin. Chem., 25:512 (1979)); spezifische, bindungsfähige Liganden; proximale, in Wechselwirkung tretende Paare; und Radioisotopen, wie z. B. ³H, ³&sup5;S, ³²P, ¹²&sup5;I und ¹&sup4;C. Solche Labels und markierende Paare werden auf der Basis ihrer eigenen physikalischen Eigenschaften (z. B. Fluoreszenzmittel, Chromophore und Radioisotopen) oder aufgrund ihrer Reaktions- oder Bindungseigenschaften (z.B. Enzyme, Substrate, Coenzyme und Inhibitoren) nachgewiesen. Beispielsweis kann eine mit einem Cofaktor markierte Gensonde durch die Zugabe des Enzyms, für welches das Label ein Cofaktor ist, und eines Substrates für das Enzym nachgewiesen werden. Beispielsweise kann man ein Enzym verwenden, welches auf ein Substrat unter Bildung eines Produktes mit einer meßbaren, physikalischen Eigenschaft einwirkt. Beispiele für solche Enzyme umfassen, aber ohne Beschränkung darauf, β- Galactosidase, alkalische Phosphatase und Peroxidase.
Eine für die APH kodierende DNA-Sequenz kann mit einer Vektor-DNA gemäß herkömmlichen Techniken rekombiniert werden, welche glatte Enden oder versetzte Enden für die Ligation, Verdauung mit Restriktionsenzymen zur Schaffung der entsprechenden Enden, Auffüllen kohäsiver Enden nach Maßgabe des Erforderlichen, Behandlung mit alkalischer Phosphatase zur Vermeidung eines unerwünschten Bindens und das Ligieren mit den entsprechenden Ligasen umfassen.
Eine prokaryontische Wirtszelle mit einem Plasmid, welches die für die APH kodierende cDNA enthält, ist am 21. August 1987 bei der American Type Culture Colletion, Rockville, MD, USA, hinterlegt worden und hat die Hinterlegungnummer ATCC 67504 erhalten.
Nachdem diese Erfindung nunmehr allgemein beschrieben worden ist, wird dieselbe unter Bezugnahme auf spezifische Beispiele besser verständlich sein, welche hierin einzig und allein zu Zwecken der Veranschaulichung angeführt werden, welche aber - sofern nichts anderes angegeben ist - nicht als einschränkend aufzufassen sind.

BEISPIELE

Beispiel 1 - Extraktion und Reinigung von Acylpeptidhydrolase (APH)
Materialien - Die DEAE Sepharose CL-68, die FPLC-Säulen (Mono Q HRS/5, und Mono S HRS/5), das Sephacryl S300-Superfine, die Octyl-Sepharose und der Polypuffer 74 waren von Pharmacia. Die Spherogel -CAa-HIC-Säule (0,46 x 10 cm) war von Beckman. Das Hydroxylapatit (Biogel HT) war von Bio-Rad. Das Glycerin war von ERL. Das Reactigel 6X war von Pierce. Die Aminosäuren (Ac-L-Ala) waren von Sigma. Alle anderen Chemikalien waren von Reagenzienqualität oder von noch besserer Qualität.
Die Reinigung des Enzzms - Die APH wurde aus 300 g Rattenleber (männlich, CD-Stamm) wie von Tsunasawa et al., J. Biochem. (Tokyo), 77:89-102 (1975) beschrieben isoliert und gereinigt, jedoch mit der Ausnahme, daß die DEAE-Zellulose durch DEAE-Sepharose CL-68 ersetzt wurde, und daß die Sepharose 68 durch Sephacryl S-300 ersetzt wurde. Die Säulengrößen und Gradienten waren ebenfalls verändert. Für die Hydroxylapatit-Chromatographie war der Ausgangsgradient ein 5 mM Phosphatpuffer statt eines 20 mM Phosphates, und es wurde ein 10 %iges Glycerin in dem Gradienten verwendet. Es wurden 4 mg an gereinlgtem Enzym erhalten. Während der DEAE-Sepharose-CL-68-Chromatographie wurde eine Zunahme in der Gesamtaktivität beobachtet. Zur Bestätigung der Homogenität des mit dem Sephacryl S-300 erhaltenen Proteins wurden zusätzliche Chromatographieverfahren durchgeführt: (i) Ionenaustauschchromatographie mit dem Pharmacia- FPLC-System auf Mono-Q- und Mono-S-Säulen mit verschiedenen Puffern von pH-Werten zwischen 5 und 8; (ii) Auf hydrophoben Wechselwirkungen basierende Chromatogrphie auf Octyl-Sepharose und Spherogel CAA-HIC; (iii) Chromatofokussieren auf Mono-P mit Polypuffer 74; und (iv) Affinitätschromatographie unter Verwendung von Ac-L-Ala-Sepharose, die aus Reacti-Gel 6X (Pierce) und Acetyl-L-alanin hergestellt worden war. In keinem Fall wurde eine weitere Auftrennung oder eine erhöhte Aktivität beobachtet. Die Reinigung ist in der Tabelle1 zusammengefaßt. Tabelle 1 Isolierung und Reinigung von Acylpeptidhydrolase aus Rattenleber Stufe Aktivität (Einheiten) Protein (mg) Spezifische Aktivität (Einheiten/mg) Ausbeute (%) Reinigung Homogenat Überstand Ammoniumsulfat Wärmebehandlung DEAE-Sepharose Hydroxylapatit Sephacryl
Beispiel 2 - Aminosäurensequenzierung von durch Spaltung mit Trypsin bzw. Bromcyan erhaltenen Fragmenten der APH
Materialien - Die APH wurde wie in Beispiel 1 beschrieben isoliert und gereinigt. Der Reinheitsgrad wurde durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese nach dem Verfahren von Laemmli, Nature, 227:680-685 (1970), bestätigt.
Unter Verwendung eines Hewlett-Packard-8450A-UV-Spektrophotometers wurden UV-Meßdaten erhalten. Die Proteinmenge wurde nach dem Verfahren von Bradford, M.M, (Anal.Biochem., 72:248- 254 (1976)), unter Verwendung von Rinderserumalbumin als Standard, und ausgedrückt als nmol von Rattenleber-Acylpeptidhydrolasenuntereinheit, unter der Annahme bestimmt, daß 1 nMol des Enzyms 1 nMol der Untereinheit des Enzyms vom Mr = 80.000 entspricht (Kobayashi, K. und Smith, J.A., J. Biol. Chem., 262:11435-11445 (1987)). Die radioaktiven Proben wurden auf einem Beckman-LS-3801-Szintillationszähler ausgezählt.
Das Bromcyan, das Guanidin-HCL, das 2-Mercaptoethanol und die Trifluoressigsäure (TFA) wurden von Pierce bezogen. Das Acetonitril (HPLC-Qualität; UV-Cutoff 188 nm) war von J. T. Baker. Das mit N-Tosyl-PheCH&sub2;Cl behandelte Trypsin wurde von Worthington bezogen. Das Bradford-Protein-Assay-Reagenz und die Elektrophoresereagenzien wurden von Bio-Rad bezogen, mit Ausnahme der Molekulargewichtsmarker und des Tris, welche von Sigma bezogen wurden. Das Zwittergent 3-14 war von Calbiochem.; und die [¹&sup4;C]-Iodessigsäure (9,8 mCi/mMol) war von New England Nuclear. Alle anderen Reagenzien wiesen jeweils den höchsten im Handel erhältlichen Reinheitsgrad auf.
Aminosäurenanalyse - Die Acylpeptidhydrolase wurde extensiv gegen 0,1 M Essigsäure dialysiert, lyophilisiert und bei 110ºC während 24 h und 48 h in 6 M HCl mit einem Gehalt von 0,1 % an Phenol hydrolysiert. Die Aminosäurenzusammensetzung wurde unter Verwendung eines Beckman-Aminosäuren-Analysiergerätes vom Typus "Beckman Amino Acid Analyzer" bestimmt (siehe Moore, S., In: Chemistry and Biology of Peptides, (Meinhofer, J., Hsg.), S. 629-652, Ann Arbor Science, Ann Arbor, MI (1972)) (Tabelle 2).

Tabelle 2 Aminosäurenzusammensetzung der Rattenleber-Acylpeptidhydrolase

Die theoretische Zusammensetzung wurde anhand der aus der Nukleotidsequenz in Fig. 3 abgeleiteten Primärsequenz bestimmt. Die beobachtete Zusammensetzung wurde durch Aminosäurenanalyse der gereinigten Rattenleber-Acylpeptidhydrolase abgeschätzt Die beobachtete Zusammensetzung wurde unter der Annahme eines Mr für die Untereinheit von gleich 80.000 berechnet. Aminosäure Theoretisch Beobachtet Insgesamt
a) Abkürzungen: Asx = Asn + Asp; Glx = Gln + Glu; ND, nicht bestimmt.
Reduktion von Disulfidbindunqen und Alkylierung mit Iodessiqsäure - Gereinigte Ratten-APH (3 nMol) wurde in 0,5 M Tris.HCl (vom pH 8,5) mit einem Gehalt an 7M Guanidin.HCl/2 mM EDTA aufgelöst, und sie wurde dann während 12 h bei Raumtemperatur oder während 3 h bei 37ºC mit 8 bis 10 mM 2-Mercaptoethanol unter Argon reduziert. Zu dem Gemisch (0,19 ml) wurde [¹&sup4;C]-Iodessigsäure (2,6 -Mol in 30 ul von 0,5 M Tris.HCl (pH 8,5)/7 M Guanidin.HCl/2 mM EDTA) zugegeben, wonach die Reaktion während 1 h bei 37ºC im Dunkeln durchgeführt wurde. Dann wurde 2-Mercaptoethanol auf eine Endkonzentration von 0,2 M zugegeben. Das Protein wurde entweder durch Ausfällen mit vier Volumensanteilen von Aceton/Methanol (3:1, Vol./Vol.) oder durch Dialyse gegen 0,1 M Essigsäure entsalzt und in einem Savant- Konzentrator/Verdampfer lyophilisiert.
Spaltung mit Bromcyan - Das carboxymethylierte Protein wurde in 70 %iger Ameisensäure (0,1 bis 0,2 ml) aufgelöst, zu welcher Lösung 10 bis 15 ul einer CNBr-Lösung (100 mg/ml in 70 %iger Ameisensäure) zugegeben wurden. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur während 24 h inkubiert und nach der Verdünnung mit Wasser vakuumgetrocknet. Die durch Spaltung mit dem CNBR erhaltenen Peptidfragmente wurden durch Umkehrphasen-HPLC (RPLC) oder durch Lyophilisierung in einem Savant-Konzentrator/Verdampfer gereinigt oder sie wurden durch Verdauen mit Trypsin weiter fragmentiert.
Verdauen mit Trypsin - Das Rohgemisch der CNBR-Peptide (3nMol) wurde in 0,2 ml einer 0,2 M Ammoniumbicarbonatlösung mit einem Gehalt von 0,2 % an Zwittergent 3-14 aufgelöst und mit Trypsin (50 pMol), das während 20 h bei 37ºC mit N-Tosyl-PheCH&sub2;Cl behandelt worden war, verdaut. Das so verarbeitete Produkt wurde vakuumgetrocknet und für eine RPLC-Reinigung in 6 M Guanidin- HCl in 0,1 %iger TFA aufgelöst.
Reinigung der Peptidfragmente durch Umkehrphasen-HPLC - Die Peptide wurden durch RPLC auf einem Beckman-HPLC-System 344, unter Verwendung einer C&sub4;-Säule (Vydac 0,46 x 25 cm, 10 um- Teilchen mit einer Porengröße von 300 Å) für die CNBr-Fragmente oder mit einer Phenyl-Säule (Vydac, 0,46 x 25 cm, 5 um-Teilchen mit einer Teilchengröße von 300 Å) für die durch Spaltung mit Trypsin erhaltenen Fragmente, gereinigt. Das Rohpeptidgemisch wurde auf eine mit 0,1 %iger TFA äquilibrierte Säule aufgebracht und mit einem linearen Acetonitrilgradienten von 0 bis 80 % in 0,1 %iger TFA (für die CB-R- und CB-Peptide) oder mit 0 bis 60 %igem Acetonitril in 0,1 %iger TFA (für die CB/R-Peptide), jeweils während 160 min bei einer Fließgeschwindigkeit von 1 ml/min, eluiert. Ein Gemisch von durch Spaltung mit Trypsin erhaltenen Peptiden, das aus einem Rohgemisch von CNBR- Peptiden stammte, wurde wie oben beschrieben auf die Säule aufgebracht und mit einem linearen Acetonitrilgradienten von 0 bis 60 % in 0,1 %iger TFA während 180 min bei einer Fließgeschwindigkeit von 1 ml/min eluiert. Die Elutionen wurden durch die dekadische Extinktion sowohl bei 214 nm als auch bei 280 nm überwacht. Jeder Peak wurde händisch gesammelt und wurde erforderlichenfalls durch isokratische RPLC unter Verwendung der gleichen Säule weiter gereinigt, nachdem er getrocknet und erneut in 0,2 ml von 6 M Guanidin.HCl in 0,1 %iger TFA aufgelöst worden war. Die optimale Konzentration des Acetonitrils zum Auf trennen der Peptide jeder Fraktion wurde anhand des Elutionsmusters aus der ersten HPLC abgeschätzt (siehe die Gleichung von Wong et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 82:7711-7715 (1985)).
Peptid-Sequenzierung - Die Peptidsequenzanalysen wurden unter Verwendung eines Protein-Sequenziergerätes vom Typus "Applied Biosystems 470A Protein Sequencer" und eines PTH-Analysengerätes vom Typus "Applied Biosystems 120a PTH Analyzer" durchgeführt (siehe Hewick et al., J. Biol. Chem., 256:7900-7997 (1981)) (Table 3). Tabelle 3 Proteinsequenzanalyse Dis aus der Spaltung mit CNBr bzw. Trypsin stammenden Peptide wurden wie oben beschrieben abgeleitet und sequenziert. Die Peptide werden gemäß ihrer spaltung und Reinigung identifiziert: CB, ein CNBr-Spaltfragment, das durch RPLC gereinigt worden ist; CB-R, ein aus der Spaltung mit Trypsin stammendes, durch RPLC gereinigtes Peptid, welches aus einem durch einem durch RPLC gereinigten CNBr-Peptid abgeleitet ist; und CB/R, ein durch Spaltung mit Trypsin erhaltenes, durch RPLC gereinigtes Peptid, das aus einem Rohgemisch von CNBr- Peptiden stammt. Die in jedem Abbauzyklus nachgewiesene Rückgewinnung an PTH-aminosäuren ist in pMol angegeben, woraus die sich wiederholende Ausbeute berechnet wird. Die Zahlen entsprechen verschiedenen, händisch gesammelten Fraktionen, welche aus einer Gradienten RPLC stammten; und die Unterkastenbuchstaben entsprechen den verschiedenen, händisch gesammelten Fraktionen, welche aus einer isokratischen RPLC stammten, die für die weitere Reinigung erforderlich war. Peptid PTH-Aminosäure/Abbauzyklus (pMol) Tabelle 3 (Forts.) Peptid PTH-Aminosäure/Abbauzyklus (pMol) a) Abkürzungen: "mix": auch andere Reste sind identifiziert worden. "N/A" ("not appropriate"): Eine Berechnung der sich wiederholenden Ausbeute war nicht zweckdienlich. "RY": Durchschnittlich, sich widerholende Ausbeute. ...: Es wurde kein PTH- Derivat identifiziert. b) "Trp" zeigt an, daß bei diesem Abbauzyklus ein in der Position des PTH-Trp eluierendes PTH-Derivat identifiziert worden ist. Da in der aus der cDNA-Sequenz abgeleiteten Proteinsequenz ein Lys-Rest vorgefunden wird, ist es wahrscheinlich, daß das Trp eine modifizierte Form von Lus, "m", darstellt, doch ist dessen chemische Struktur noch nicht bestimmt worden.

Beispiel 3 - Herstellung von Gensonden

Aufbau der Gensonden: Zwei überlappende, degenerierende Oligonukleotid-Gensonden, YS20.1 und YS17.2 (Fig. 2A), welche aus der Aminosäurensequenz des Peptides CBI8-R11-13c (Tabelle 3) stammen, wurden synthetisiert und zum Durchprüf en einer Rattenleber-λgtll-cDNA-Genbank verwendet. Die Oligonukleotid-Gensonden und die Primer wurden unter Verwendung von β-Cyanoethylphosporamiditen (Sinha, N. D. et al., Nucl. Acid Res., 12:4539- 4557 (1984)) mit einem DNA-Synthesegerät vom Typus "Applied Biosystems 380A DNA Synthesizer" synthetisiert und durch Polyacrylamidgelelektrophorese gemäß dem Handbuch "Applied Biosystems Manual" oder durch Ausfällen mit Ethanol aus einer Oligonukleotidlösung mit einem Gehalt an 10 mM MgCl&sub2; gereinigt. YS17.2 und YS20.1 stellen Pools von 128-fach degenerierenden Oligonukleotiden dar. Die YS17.2- und YS20.1-Pools hatten Kettenlängen von 17 bzw. 20 Nukleotiden. Die zwei Gensonden überlappen einander um 12 Nukleotide, so daß eine aufeinanderfolgende Verwendung der Gensonden zum Durchmustern einer DNA-Genbank die wirksame Suche nach einem 25 Nukleotide umfassenden Stück der für die APH kodierenden DNA bedeuten würde.
Beispiel 4 - Schaffung und Durchmustern der cDNA-Genbank und Sequenzieren der für die APH kodierenden cDNA.
Herstellung der RNA - Rattenleber des Stammes CD wurde rasch in flüssigem Stickstoff eingefroren und in Guanidinisothiocyanat aufgetaut; und die RNA wurde durch Zentrifugieren durch CsCl (Chirgwin et al., Biochem., 18:5294-5299 (1979)) isoliert und gereinigt. Die Ausbeute betrug 600 ug von RNA. Die poly(A)&spplus;RNA wurde durch Hindurchführen der Gesamt-RNA durch eine Oligo(dt)- Zellulose-Säule (Aviv, H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.), 69:1408-1412 (1972)) ausgewählt. Es wurden 45 ug an poly(A)&spplus;RNA gewonnen, und es wurde durch eine RNA-Blot-Analyse von 1 ug RNA durch Hybridisieren mit einer Aktin-cDNA-Gensonde (Spiegelman, B.M. et al., J. Biol. Chem., 258:10083-10089 (1983)) aufgezeigt, daß diese poly(A)&spplus;RNA nicht abgebaut worden war.
Herstellung einer cDNA-Genbank - Aus 10 ug poly(A)&spplus;RNA wurde nach dem Verfahren von Gubler, U. et al. (Genen 25:263-269 (1983)) komplementäre DNA synthetisiert und wie von Klickstein, L. B. (in: Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel, F. M. et al., Hsg.) S. 5.8.1. - 5.8.4., Wiley-Interscience and Greene Publishing Associates, New York, NY (1987)) beschrieben, in dem λgtll-Vektor kloniert (Young, R.A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.), 80:1194-1198 (1983)). Die Ausbeute an Rekombinanten aus 100 ng cDNA und 10 ug λgtll-Vektor-DNA betrug 4 Millionen. Die Genbank wurde in dem E. coli-Stamm Y1088 (δ lacUl69, supE, supF, HsdR&supmin;, HsdM&spplus;, metB, trpR, tonA21, proC::Tn5 (pMC9)) amplifiziert und bei 4ºC gelagert.
Isolierung von cDNA-Klonen - Die Genbank wurde in einer Konzentration von 25.000 Plaques pro 150 mm-Platte (zum Durchmustern von 106 oder weniger Plaques) oder in einer Konzentration von 106 Plaques pro Platte von 225 mm x 225 mm (zum Durchmustern von mehr als 10&sup6; Plaques) ausplattiert, und von jeder Platte wurden doppelte Filter erhoben (Maniatis, T. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1982)).
Für das Durchmustern mit Oligonukleotiden wurden die Oligonukleotide an ihrem 5'-Ende mit [γ-³²P]-ATP und T4-Polynukleotidkinase (Zoller, M. et al., DNA, 3:479-488 (1985)) auf eine spezifische Aktivität von 2 bis 8 x 10&sup8; cpm/ug markiert. Die Filter wurden mit dem Oligonukleotid in 6xSSC, 0,1 % SDS, 0,05 % Natriumpyrophosphat, 1x Denhardt's Lösung und 100 ug/ml Lachsspermien-DNA bei 65ºC über Nacht hybridisiert. Wie dies schon früher für kurze Sequenzen beschrieben worden ist (Suggs, S.V. et al., in: Developmental Biology Using Purified Genes (Brown, D., Hsg.), S. 683-693, Academic Press, New York, NY (1981), wurden die Td max und die Td min für jedes Gemisch von Oligonukleotiden nach der Formel: Td=4(G+C)+2(A+T) berechnet. Die Sequenzen wurden bei fortschreitend höheren Temperaturen in 6xSSC, 0,05% Natriumpyrophosphat und 0,1 % SDS so lange gewaschen, bis das nicht-spezifische Binden reduziert war.
Für das Durchmustern mit cDNA-Gensonden (nämlich dem XmnI- KpnI-Fragment aus APH5.2 oder dem BanII-PstI-Fragment aus APH36.1; Fig. 28) wurden die Filter über Nacht mit durch Nick- Translation markierten Gensonden in 50 % Formamid, 5xSSC, 5x Denhardt's Lösung, 10 mM Natriumphosphat, 0,1 % SDS, 1mM EDTA und 50 ug/ml von beschallter, denaturierter Lachsspermien-DNA bei 42ºC hybridisiert. Die Filter wurden in 0,2xSSC, 0,1 % SDS, 1 mM Natriumphosphat, pH 7,0 und 1mM EDTA bei 55ºC gewaschen. Die gewaschenen Filter wurden bei -70ºC mit einer Verstärkerblende auf einen Kodak-XAR-Film aufgelegt. Phagen, welche Doppelsignale ergaben, wurden durch zusätzliche Durchmusterungsrunden mit Hilfe von Plaques gereinigt.
DNA-Sequenzanalyse - Restriktionsfragmente aus APH5.2 und APH36.1 wurden in M13mp18 oder M13mp19 subkloniert und nach dem Didesoxynukleotid-Kettenabbruchsverfahren (Sanger, F. et al., J. Molec.Biol., 94:441-448 (1975)) sequenziert. Die Sequenz einiger Klone wurde dadurch erhalten, daß man zuerst unter Verwendung von Exonuclease III (Henikoff, S., Gene 28:351-356 (1984)) Deletionsmutanten konstruierte. Das cDNA-Insert von APH2.7 wurde in dem Bluescript-Plasmid (Stratagene) subkloniert und nach dem Didesoxy-Kettenabbruchsverfahren, in dessen Modifikation für das Sequenzieren von Doppelsträngen gemäß Guo et al. (Nucl. Aclds Res., 12:387-394 (1983)), sequenziert. Die DNA-Sequenzdaten wurden mit Hilfe der University of Wisconsin Genetics Computer User Group Programs (Devereux, J. et al., Nucl. Acid Res., 12:387-395 (1984)) analysiert.
Klonieren und Sequenzieren der cDNA. welche für die Rattenleber-Acylneptidhydrolase kodiert - Es wurde gefunden, daß sich 27 aus 450.000 rekombinanten Klonen mit der Gensonde YS20.1 hybridisieren. 12 dieser Klone wurden erneut mit der Gensonde YS17.2 durchgemustert, wobei ein einzelner Klon, APH5.2, erhalten wurde, der ein 1,3 kb-Insert enthielt (Fig.28) . Die DNA-Sequenz des APH5.2 kodierte für die gesamte Peptidsequenz des durch Spaltung mit Trypsin erhaltenen Peptides CB18-R11-13-c, wodurch bestätigt wurde, daß der APH5.2 ein authentischer Klon war. Da der APH5.2 eine Poly(A)&spplus;-Sequenz an seinem 5'-Ende enthielt (Fig. 2B, schraffierter Kasten), die wahrscheinlich während des Aufbauens der cDNA-Genbank durch Einwirkung eines Reagenz hervorgerufen worden war, wurde ein Xmni-Kpni-Fragment des APH5.2 zum neuerlichen Durchmustern von einer Million Klonen aus der gleichen cDNA-Genbank verwendet, wobei der ein 2,5 kb- Insert enthaltende APH36.1-Klon (Fig. 2B) erhalten wurde. Die aus der DNA-Sequenz des APH36.1 abgeleitete Proteinsequenz enthielt alle Proteinsequenzen in der Tabelle 3, mit Ausnahme der drei Reste am Amino-Ende des Peptides C817-R13. Das 5'-Ende dieser DNA-Sequenz enthielt jedoch ein 120 bp-Fragment, welches für Rattenserumalbumin kodierte (Fig. 28, Kasten mit diagonalen Linien).
Um die fehlenden 5'-Sequenzdaten zu erhalten, wurde ein 220 bp-BanII-PstI-Fragment (Fig. 2B) zum neuerlichen Durchmustern der gleichen cDNA-Genbank verwendet. Aus 5 Millionen Rekombinanten wurden 5 positive Klone mit unterschiedlichen Längen der Poly(A)-Schwänze erhalten. Vier cDNA-Klone, darunter der APH2.7, begannen mit der gleichen Nukleotidsequenz und enthielten ein In-frame-ATG-Codon bei den Nukleotiden 6 bis 8, während dem 5'-Ende des fünften cDNA-Klons 18 Basenpaare fehlten. Ein Polyadenylierungssignal, AATAAA, wurde bei den Nukleotiden 2344-2349 gefunden. Die Fig. 3 veranschaulicht die vollständige cDNA-Sequenz für die APH, wie dieselbe aus APH5.2, APH36.1 und APH2.7 abgeleitet worden ist.
Die aus der cDNA aboeleitete Primärstruktur der Acylpeptidhydrolase - Die vollständige DNA-Sequenz wurde durch Kombinieren der Sequenzen von APH36.1 und APH2.7 (Fig.3) bestimmt. Die DNA-Sequenz kodiert für ein Protein, welches 732 Aminosäurenreste enthält, unter der Annahme, daß das ATG bei den Nukleotiden 6 bis 8 das Translationsstartcodon ist. Die abgeleitete Proteinsequenz enthält alle Peptidsequenzen in der Tabelle 3 (Fig.1) . Das Protein hat ein berechnetes Molekulargewicht von 81.347, und die Aminosäurenzusammensetzung auf der Basis der abgeleiteten Proteinsequenz stimmt fast genau mit der beobachteten Zusammensetzung überein (Tabelle 2). Gemäß der Herleitung aus der DNA-Sequenz wurden drei Lysylreste an den Aminosäurenresten 118, 291 und 443 identifiziert, welche den Positionen entsprechen, wo PTH-Trp zusammen mit einem spät eluierenden PTH-Derivat beobachtet wurden (Tabelle 3 und Fig.1). Bei den Resten 134-136, 233-235 und 243-245 werden drei übereinstimmende N-Glykosylierungssequenzen (nämlich Asn-Xxx-Thr/Ser (Parodi, A. J. et al., Biochim. Biophys. Acta, 559:1-37 (1979)) identifiziert.
Hydrophobizitätsanalyse - Das Hydrophobizitätsprofil wurde unter Verwendung des Algorithmus von Kyte, J. et al. (J. Molec. Biol., 157:105-132 (1982)) mit einer Fenstergröße von 8 bestimmt.
Die abgeleitete Proteinsequenz der Ratten-Acylpeptidhydrolase wurde mit der Protein-Datenbank der National Biomedical Research Foundation sowie mit der Schweizerischen Protein-Datenbank unter Verwendung der Programme "Wordsearch and Bestfit programs from the University of Wisconsin Genetics Computer User Group programs" (Devereux, J. et al., Nucl. Acid Res., 12:387-395 (1984)) sowie des auf dem Algorithmus von Lipman, D. J. et al. (Science, 227:1435-1441 (1985)) basierenden FASTP- Pragramms verglichen. Um die Regionen möglicher aktiver Stellen in der Ratten-Acylpeptidhydrolase zu identifizieren, wurde deren Sequenz mit den Peptidsequenzen verglichen, welche die aktiven Stellen mit Seryl-, Histidyl- oder Asparagylresten enthalten, wie dieselben aus bekannten Serin-Proteasen abgeleitet worden sind.
Die Hydrophobizitätskurve zeigt, daß das Protein eine zwischen den Resten 80 und 220 lokalisierte, hydrophile Region enthält; es bleibt jedoch unklar, ob diese Region eine spezifische Rolle bei Wechselwirkungen mit anderen Proteinen oder in der Katalyse spielt. Die Computer-Suche in der Protein-Datenbank der National Biomedical Research Foundation sowie in der Schweizerischen Protein-Datenbank ergab keine stark homologen Proteine. Außerdem ergab der Vergleich zwischen der Ratten- Acylpeptidhydrolase und kurzen Peptiden, welche aktive Serin-, Ristidin- und Asparaginsäurestellen aufweisen, und welche aus bekannten Serin-Proteasen abgeleitet sind, keinerlei signifikante Ähnlichkeiten. Obgleich schon früher gezeigt worden ist, daß die Acylpeptidhydrolase eine Serin-Protease ist, und zwar durch Hemmversuche unter Verwendung von Diisopropylfluorphosphat, Acetylalaninchlormethylketon und anderer Enzyminhibitoren (Kobayashi, K. und Smith, J. A., J. Biol. Chem., 262:11435- 11445 (1987; Tsunasawa et al., J. Biochem. (Tokyo), 77:89-102 (1975)), wurde keine starke Ahnlichkeit zwischen der Ratten- Acylpeptidhydrolase und aktiven Stellen entsprechenden Peptiden aus anderen Serin-Proteasen festgestellt, was nahelegt, daß dieses Enzym eine einzigartige Serin-Protease sein mag.
Beispiel 4 - Klonieren des gesamten Ratten-Acylpeptidhydrolase- Gens
Materialien - Die Restriktionsenzyme, T4-Ligase, T4-Polynukleotid-Kinase, E. coli-DNA-Polymerase I und ihr Klenow-Fragment, die AMV-Reverse Transcriptase, Exonuclease III, Dnase I, RNase H, T4 DNA-Polymerase, EcoRI-Methylase, alkalische Phosphatase aus Kälberdärmen und die Nuclease SI waren von Boehringer Mannheim und New England Biolabs. Die Rnase A war von Sigma. Das Bluescript-Plasmid, die λgt10-Arme und der Verpackungsextrakt waren von Stratagene. Das [γ-³²P]ATP, [α-³²P]dCTP, und die Gene- Screen-Plus-Membran wurden von New England Nuclear bezogen. Das [α-³&sup5;S]dATPαS war von Amersham Corp. Die Oligo(dT)-Zellulose war von Collaborative Research. Die synthetischen Oligonukleotide wurden mit einem Synthesegerät vom Typus "Applied Biosystems 380A DNA Synthesizer" und unter Verwendung einer festen Phase auf Silikabasis (Matteucci, M. D. et al., J. Am. Chem. Soc. 103:3185-3191 (1981)) sowie nach dem β-Cyanoethylphosphoramiditverfahren (Sinha, N. D et al., Nucleic Acids Res., 12:4539-4544 (1984)) synthetisiert.
Herstellung von Rattenleber-DNA und -RNA - Die Quelle für genomische Ratten-DNA und zytoplasmische Leber-RNA ist die Leber Von erwachsenen Sprague-Dawley-Ratten. Die Leber wurde wie von Blin and Stafford (Blin, N. et al., Nucleic Acids Res., 3:2303- 2308 (1976)) beschrieben, präpariert. Die Rattenleber-Gesamt- RNA wurde wie von Chrigwin et al. (Chirgwin, J. M. et al., Biochemistry, 18:5294-5299 (1979)) beschrieben, nach dem Guanidinthiocyanatverfahren, isoliert. Die Polyadenylierte RNA wurde durch Oligo(dt)-Zellulosechromatographie (Aviv, H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69:1408-1412 (1972)) gereinigt.
RNA-Blot-Analyse -- Die RNA wurde wie oben beschrieben gereinigt, bei 65ºC denaturiert und auf eine Zetabind-Membran übertragen (Thomas, P.S., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.), 77:5201- 5202 (1980)). Die Blots wurden mit dem durch Nick-Translation markierten XmnI-KpnI-cDNA-Fragment aus APH5.2 in 50 %igem Formamid, 5XSSC, 5X Denhardt'scher Lösung, 10 mM Natriumphosphat, 0,1 % SDS, 1 mM EDTA und beschallter, denaturierter Lachsspermien-DNA (50 ug/m1) hybridisiert. Die Filter wurden bei 55ºC in 0,2xSSC, 0,1 % SDS, 10 mM Natriumphosphat, pH 7,0, und 1 mM EDTA gewaschen.
Die RNA-Blot-Analyse der Gesamt-RNA, unter Verwendung des aus dem APH5.2 stammenden XmnI-KpnI-cDNA-Fragmentes als Gensonde (Fig. 2B) zeigte, daß eine einzelne mRNA von 2,7 kb in ungefähr äquivalenten Mengen für die Acylpeptidhydrolase in verschiedenen Rattengeweben kodiert (nämlich in der Milz, in Muskeln, in der Lunge, Leber, in der Niere und im Gehirn).
Isolierung genomischer Klone - Es wurden zwei Ratten-Genom-Genbanken zum Durchmustern auf das APH-Gen verwendet. Eine Genbank war von Clonetech, welche durch teilweises Verdauen von Sprague-Dawley-Leber-DNA mit ECORI und Klonieren im λ-Phagen Charon 4A aufgebaut worden war. Ein 2,4 kb-EcoRI-Restriktionsfragment, welches aus dem APH36.1 stammte und für die Ratten- APH kodierte, wurde durch Nick-Translation (Sargent, T.D et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:3256-3260 (1979)) mit [α- ³²P]dCTP auf eine spezifische Aktivität von 10&sup8; cpm/ug markiert und als Gensonde zum Durchmustern dieser genomischen Genbank verwendet. Die andere Genbank, welche durch teilweises Verdauen mit HaeIII und Klonieren im λ-Phagen Charon 4A aufgebaut worden war, war ein großzügiges Geschenk von Professor James Bronner vom California Institute of Technology (Church, G.M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:1991-1995 (1984)). Ein 200 bp- BanII-PstI-Fragment von APH36.1, das durch Random-Priming (Feinberg, A. et al., Anal. Biochem., 132:6-13 (1983)) mit [α- ³²P]dCTP auf eine spezifische Aktivität von 10&sup9; cpm/ug markiert worden war, wurde zum Durchmustern dieser Genbank verwendet. Etwa 1 x 10&sup6; Phagen aus jeder Genbank wurden durch Plaque- Hybridisierung (Church, G.M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:1991-1995 (1984)) durchgemustert. Positive Plaques wurden gereinigt, und die Phagen-DNA wurde isoliert (Maniatis, T. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cöld Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1982)).
Analyse der DNA durch Restriktionskartierung und DNA-Hybridisierung - Die Restriktionskarte des klonierten Gens wurde durch Verdauen der Phagen-DNA mit verschiedenen Restriktionsendonukleasen konstruiert (Maniatis, T. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1982)). Für die DNA-Blot-Analyse wurden die DNA-Restriktionsfragmente in einem Agarosegel aufgetrennt, auf eine Genescreen Plus-Membran übertragen und gemäß den Anweisungen des Herstellers mit einer durch ³²P markierten Gensonde hybridisert. Die Gensonden sind drei mit ³²P markierte Ratten- APH-cDNA-Fragmente von APH36.1: ein 5' 200 bp-BanII-PstI-Fragment, ein 420 bp-Kpn-EcoRI-Fragment und ein 2,4 kb-EcoRI-Fragment. Für die Blot-Hybridisierung der genomischen DNA wurde das 2,4 kb-EcoRI-Fragment von APH2.7 als Gensonde verwendet.
DNA-Sequenzierung - Restriktionsfragmente dar genomischen Ratten-Klone wurden in dem Bluescript-Plasmid subkloniert. Mit Hilfe des Didesoxy-Kettenabbruchverfahrens von Sanger (Sanger, F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74:5463-5467 (1977)), das für das Sequenzieren von Doppelsträngen modifiziert worden war (Guo, L.-H. et al., Nucleic Acids Res., 11:5521-5539 (1983)) sowie unter Anwendung der Sequenzierungsstrategieen des DNase-I-Deletionsverfahrens (Lin, H.-C. et al., Anal. Biochem., 147:114-119 (1985)), des Exonuclease-III-Deletionsverfahrens (Henikoff, S., Gene 28:351-359 (1984)) und von synthetischen Oligonukleotid-Primern wurden beide Ausrichtungen der vollständigen Sequenz sowie die stromaufwärtigen und stromabwärtigen Regionen des Ratten-APH-Gens bestimmt. Die Nukleotidsequenzdaten wurden mit dem Genetics Computer Group Sequence Analysis Software Package, Version 5.0 (Devereux, J. et al., Nucleic Acids Res., 12:387-395 (1984)), kompiliert und analysiert.
Herstellung einer cDNA-Genbank, welche eine 5'-untranslatierte Reoion der APH-mRNA enthält - Ein 17 bp umfassendes, synthetisches Oligonukleotid, 5' GTGACCTCCGGACCCAG 3', das komplementär zu den Nukleotiden 95-112 des APH2.7 ist, wurde als spezifischer Primer für den Aufbau einer cDNA-Genbank in dem λgt10 verwendet. Das synthetische Oligonukleotid (1 ug) wurde mit 10 ug poly(A)&spplus;RNA unter Bildung eines Doppelstranges hybridisiert (="Annealing"), wobei die Synthese des ersten und des zweiten Stranges der cDNA nach dem Verfahren von Gubler und Hoffman (Gubler, U. et al., Gene, 25:263-269 (1983)) durchgeführt wurde. Die Enden der cDNAS wurden mit T4 DNA-Polymerase glatt gemacht, und die inneren ECORI-Stellen wurden methyliert. Die glattendigen cDNAS wurden an EcoRI-Linker ligiert, und im Anschluß an das Verdauen mit EcoRI wurden die cDNAs auf einer CL- 48-Säule (Wong, W.W. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 82:7711-7715 (1985)) der Größe nach fraktioniert. Dann wurden die cDNAS an λgt10-Arme ligiert, und die rekombinante Phagen-DNA wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers (Stratagene) verpackt. Die rekombinanten Phagen wurden mit zwei synthetischen Oligonukleotiden, 5' AAGTCCCGGAAGTGAGG 3' und 5' CTGACGCTCCATAGTCG 3', deren Sequenzen aus der genomischen Sequenz (Nukleotide 586 bis 592, Fig.4) bzw. aus der cDNA-Sequenz (Nukleotide 1 bis 17 des APH2.7) abgeleitet waren, durchgemustert. Die Phagen-DNA mit dem größten Insert wurde gereinigt (Maniatis, T. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1982)), und das Insert wurde in dem Bluescript-Plasmid subkloniert.
Primer-Verlängerung - Ein Oligonukleotid, 5' TAGGAGTGAGAAAATCA 3', das komplementär zu der Nukleotidsequenz in dem ersten Exon (Nukleotide 44-60, Fig. 4) war, wurde am 5'-Ende mit [γ-³²P]ATP und T4-Polynukleotidkinase markiert und dann mit 10 ug einer Rattenleber-poly(A)&spplus;RNA in einer Lösung von 0,1 M KCl, 5 mM EDTA und 5 mM Natriumphosphat, pH 6,8, hybridisiert. Für die Hybridisierung wurde die Temperatur der Lösung während 5 min auf 90ºC angehoben und dann allmählich auf 42ºC zurückgebracht. Die RNA-DNA-Hybriden wurden dann der Reaktion mit Reverser Transkriptase unterworfen. Nach einem Verdauen mit RNase A, einer Extraktion mit Phenol:Chloroform und einem Ausfällen mit Ethanol wurde das Primer-Verlängerungsprodukt dann auf einem 8 %igen Polyacrylamid-Sequenziergel der Elektrophorese unterworfen.
Isolierung und DNA-Sequenz des Ratten-Acyloeptidhydrolase-Gens Zuerst wurde eine Ratten-Genom-Genbank, welche in dem Charon 4A aus einem Produkt des teilweisen Verdauens von Sprague-Dawley- Rattenleber-DNA mit EcoRI aufgebaut worden war, unter Verwendung des mit ³²P markierten Rattenleber-APH-cDNA-Inserts von APH36.1 als Gensonde durchgemustert. Eine Million Plaques wurden durchgemustert, und 28 hybridisierten sich mit der Gensonde. Alle 28 Plaques wurden isoliert und durch Kartierung mit Restriktionsenzymen gekennzeichnet, wobei sie als identisch festgestellt wurden. DNA-Blots der durch Verdauen mit Restriktionsendonukleasen aus jeder rekombinanten DNA abgeleiteten Produkte wurden mit den cDNA-Inserts des APH36.1, dem 200-bp- BanII-PstI-Fragment (5'-Ende des APH36.1) und dem 420-bp-KpnI- EcoRI-Fragment (3'-Ende des APH36.1) als Gensonden durchgemustert, wobei ein jedes ein dem 3'-Ende der cDNA entsprechendes 9,7 kb-EcoRI-Fragment enthielt. Einer dieser Klone, APHES (Fig. 5A), wurde mit Restriktionsenzymen kartiert, in dem Bluescript subkloniert und sequenziert. Eine zweite Ratten-Genom-Genbank, welche durch teilweises Verdauen von Rattenleber-DNA mit HaeIII und Klonieren in dem Charon 4A aufgebaut worden war (und welche in großzügiger Weise von Professor J. Bronner, California Institute of Technology zur Verfügung gestellt worden war), wurde mit dem 200 bp-BanII-PstI-Fragment des APH36.1 durchgemustert. Acht aus einer Million Plaques hybridisierten sich mit der Gensonde, und deren Phagen-DNAS wurden isoliert. Nach einem Kartieren mit Restriktionsenzymen und einer DNA-Hybridisierung wurde ein Klon, nämlich APHH6 (Fig. 5A), der sich mit dem Klon APHE5 überlappte und sich weiter in der 5'-Richtung erstreckte, analysiert. Die kombinierte Restriktionskarte des APHE5 und des APHH6 ist in der Fig. 5B dargestellt.
Die DNA-Blot-Analyse der Ratten-Genom-DNA ergab zwei Banden, welche BamHI-Restriktionsfragmenten von etwa 4 und 9,4 kb entsprachen. Die Größe des größeren Fragmentes stimmt mit der aus der Restriktionskarte berechneten Größe überein, und das kleinere Fragment erstreckt sich über der 3'-Ende der Karte hinaus (Fig. 5B). Es wurden zwei Banden beobachtet, welche EcoRI-Restriktionsfragmenten von etwa 7,5 und 9,7 kb entsprachen. Die Größen beider Fragmente stimmen mit den aus der Restriktionskarte bestimmten Größen überein (Fig. 5B) . Dies zeigt an, daß das APH-Gen in dem Ratten-Genom in einer einzigen Form vorliegt.
Für die Sequenzanalyse wurden die einzelnen EcoRI-, Psti- oder BamHI-Fragmente in dem Bluescript subkloniert, und die einzelnen Subklone wurden entweder einem begrenzten, in einer Richtung verlaufenden Verdauen mit der Exonuclease III und einem anschließenden Verdauen mit der Nuclease S1 unterworfen, oder sie wurden einer begrenzten Ausbildung von zufallsmäßigen, offenen Phosphodiesterbindungen ("nicks") mit Dnase I und einem anschließenden Verdauen mit Restriktionsenzymen unterworfen, um einen Satz von untergebrachten ("nested") Deletionen zu erzeugen. Aus jeder Deletion wurde eine doppelsträngige Plasmid-DNA hergestellt und nach dem Didesoxy-Kettenabbruchsverfahren sequenziert. Für bestimmte Regionen wurde die Sequenz durch Verwendung spezifischer, synthetischer Oligonukleotide als Sequenzier-Primer bestimmt. Diese zwei genomischen Klone wurden in beiden Richtungen sequenziert. Die vollständige Nukleotidsequenz ist in der Fig. 4 dargestellt. Der Einfachheit halber wird für die Erörterung der Genomsequenz ein Numerierungssystem angewendet, bei welchem die Transkriptionsstartstelle des APH- Gens mit der Position +1 bezeichnet wird. Wie aus der Fig. 5C und aus der Tabelle 4 hervorgeht, wurden die genauen Stellen von jeder der 5'- und 3'-Exon-Intron-Begrenzungen durch Ausrichten der Genomsequenz nach der cDNA-Sequenz definiert.
Analyse der 5'-untranslatierten Region der Ratten-Acylpeptidhydrolase-mRNA - Da aufgrund einer Schätzung mit Hilfe des Vergleiches der Größe der APH-mRNA mit der Größe der cDNA der cDNA-Sequenz etwa 300 Basenpaare der 5'-untranslatierten Region fehlten, wurde wie oben beschriben eine cDNA-Genbank aufgebaut, welche die 5'-untranslatierte Region der APH-mRNA enthielt.
Diese Genbank wurde mit zwei mit ³²P markierten Oligonukleotid-Gensonden durchgemustert, deren Sequenzen komplementär zu den ersten 17 Basen des cDNA-Klons APH2.7 oder zu den Nukleotiden 586 bis 602 der genomischen DNA (Fig. 4) waren. Ein 466 bp-cDNA-Insert wurde isoliert, in dem Bluescript subkloniert und nach dem Didesoxy-Kettenabbruchsverfahren sequenziert. Diese 3'-Verlängerungssequenz enthielt die Nukleotid- sequenz, welche den Nukleotiden 37 bis 262, 492 bis 636 und 711 bis 805 der genomischen DNA (Fig. 4) entspricht. Daher ist das w Translationsstartcodon, ATG, bei den Nukleotiden 623 bis 627 (Fig. 4) lokalisiert, weil diesem Codon im Leserahmen ein Stopcodon, TAG, bei den Nukleotiden 568 bis 570, vorangeht, und weil sich kein anderes ATG-Codon dazwischen befindet. Tabelle 4 Intron-Exon-Verbindunosstellen in dem Acylpeptidhydrolase-Gen Exon Nr. Exongröße 5'-Spleißstelle 3'-Spleißstelle Introngröße
Bestimmung der Translationsstartstelle des Ratten-Acylpeptidhydrolase-Gens - Das 5'-Ende der APH-mRNA wurde durch Primer- Extensions-Analyse kartiert. Ein mit ³²P markiertes Oligonukleotid, 5' TAGGAGTGAGAAAATCA 3', das komplementär zu den Nukleotiden 44 bis 60 (Fig. 4) war, wurde mit Rattenleber-poly(A)&spplus;RNA hybridisiert. Dieser Primer wurde mit Reverser Transcriptase in Gegenwart von Desoxynukleotiden verlängert, und die wie oben beschrieben bestimmte Länge des verlängerten Produktes betrug 60 Nukleotide. Weiterhin wurde kein verlängertes Produkt dann beobachtet, wenn statt der Rattenleber-poly(A)&spplus;RNA eine Hefe-poly(A)&spplus;RNA verwendet wurde. Es wurde gefunden, daß die Transkription an der DNA-Matrize mit einem T- Rest beginnt, was einem A-Rest in der Position 1 in der Fig. 4 entspricht. Dieser A-Rest ist 395 bp 5' von dem ATG-Translationsstartcodon entfernt angeordnet.
Zusammenfassend läßt sich sagen, daß diese Beispiele zeigen, daß das Ratten-APH-Gen in einer einzigen Form vorliegt. Es wurde die vollständige Sequenz des Ratten-APH-Gens bestimmt, einschließlich von 2,58 kb an 5'-flankierender DNA, 2,75 kb an Exon-DNA, 6,94 kb an Intron-DNA, und von 1 kb an 3'-flankierender DNA (Fig. 4). Durch die Daten betreffend die Exon-DNA wurde die Translationsstartstelle eindeutig identifiziert, welche dem Codon entspricht, das für das Methionin am Rest 1 der Ratten- Acylpeptidhydrolase kodiert, weil zwischen dem In-frame-Stopcodon (Fig. 4, Nukleotide 568 bis 570) und dem Translationsstartcodon im Exon 2 (Fig. 4) kein ATG-Codon vorhanden war.
Diese Ergebnisse weisen auch darauf hin, daß die APH nicht als Vorläuferprotein synthetisiert wird, weil die Proteinsequenz der APH, die auf das am NH&sub2;-Ende befindliche Met folgt, durch einen automatisierten Edman-Abbau im Anschluß an eine Spaltung mit CNBR identifiziert werden konnte.
Aus der Fig. 5C geht hervor, daß das Ratten-APH-Gen, welches sich über 9,69 kb erstreckt, in 23 Exons aufgeteilt wird. Die einzelnen Exons variieren in ihrer Größe zwischen 41 und 262 bp (Tabelle 4). Das erste Intron unterbricht die 5'-untranslierte Sequenz; alle anderen Introns befanden sich innerhalb der Proteinkodierregion des Gens. In der Tabelle 4 sind die Sequenzen der 5'- und 3'-Verbindungsstellen jedes Introns angeführt,. und diese Sequenzen stehen in Einklang mit den übereinstimmenden Sequenzen für die Intron-Exon-Verbindungsstellen anderer eukaryontischer Gene (Sharp, P.A., Cell, 23:643-646 (1981); Breathnach, R. et al., Annu. Rev. Biochem., 50:349-383 (1981); Mount, S.M., Nucleic Acids Res., 10:459-472 (1982)). Alle Introns beginnen mit der Sequenz GT an der 5'- Grenze und enden mit der Sequenz AG zu der 3'-Grenze hin; und in allen Fällen sind die Intron-Sequenzen, welche die 5'-Grenze bzw. die 3'-Grenze flankieren, purin- bzw. pyrimidinreich. Die Exon-Intron-Gliederung des APH-Gens, welches vermutlich für eine Protease mit einem Serinrest als aktive Stelle kodiert (Kobayashi, K. und Smith, J.A., J. Biol. Chem., 262:11435-11445 (1987)), ist viel komplexer als jene von entweder Trypsin oder Chymotrypsin, welche 5 bzw. 7 Exons enthalten (Rogers, J., Nature, 315:458-459 (1985)). Es ist bekannt, daß die Reste der Ladungs-Relais-Systeme dieser Enzyme durch getrennte Exons kodiert werden, doch sind für die Verteilung der entsprechenden Reste in der APR weitere Untersuchungen erforderlich. Aufgrund ausgedehnter Durchsuchungen der Protein-Datenbank der National Biomedical Research Foundation und der Schweizer Protein-Datenbank, sowie aufgrund eines Vergleiches mit der Exon-Intron- Gliederung anderer Serin-Proteasen (z. B. von Trypsin, Chymotrypsin, Elastase, Urokinase, Kallikrein, Adipsin), ist die Acylpeptidhydrolase mit keiner dieser Serin-Proteasen eindeutig ähnlich.
Eine Analyse der 5'-flankierenden DNA des APH-Gens ergab eine Anzahl von konservierten Sequenzen. Diese umfassen eine Sequenz 5' TGATAAA 3', welche eine Sequenz-Variante für einen bei den Nukleotiden -24 bis -30 lokalisierten "TATA"-Kasten sein könnte. Es ist dies eine übliche Stelle für den TATA-Kasten, der typischerweise 26 bis 34 Nukleotide stromaufwärts von der Translationsstartstelle vorgefunden wird (Cordon, J. et al., Science, 209:1406-1414 (1980)). Eine weitere Sequenz, 5 - TCAAT-3' (Nukleotide -95 bis -99), findet sich 95 Nukleotide stromaufwärts von der Transkriptionsstartstelle und ähnelt der Sequenz des "CCAAT"-Kastens, welcher gewöhnlich 70 bis 80 Basen von der Transkriptionsstartstelle entfernt vorgefunden wird. Außerdem wird eine 6 bp-Sequenz, GGGCGG, dreimal wiederholt. Ein Repeat ist bei den Positionen -81 bis -76 lokalisiert und bef indet sich vermutlich innerhalb der Promotorregion des APH- Gens. Die anderen zwei Repeats, die in der umgekehrten Ausrichtung als CCGCCC vorliegen, sind 5 Nukleotide bzw. 31 Nukleotide stromabwärts von der Transkriptionsstartstelle entfert lokalisiert. Es wird berichtet, daß alle SpI-Bindungsregionen eine oder mehrere genaue Kopien dieser GGGCGG-Sequenz enthalten, welche hinsichtlich der Transkription in jeder der beiden Ausrichtungen vorhanden sein können (Dynan, W.S. et al., Nature, 316:774-448 (1985)).
Eine 200-bp-Sequenz erscheint in Tandem-Anordnung, beginnend 917 bp stromaufwärts von der Transkriptionsstartstelle. Verglichen mit anderen Sequenzen in der Genbank sind die 3'- Zweidrittel dieser Sequenz ähnlich wie das Mäusetypus-2-Alu- Repeat (80 % Ahnlichkeit) (Kominami, R. et al., J. Mol. Biol., 165:209-228 (1983)). Eine ähnliche Sequenz, aber nur als eine einzelne Kopie, ist an der Verbindungsstelle zwischen dem SV40 und der Fisher-Ratten-DNA (Hasson, J.-F. et al., J. Mol. Biol., 177:53-68 (1984)) sowie mehreren anderen Genen vorhanden (Min, H. Y. et al., Nucleic Acids Res., 14:8879-8892 (1986); Osumi, T. et al., J. Biol. Chem., 262:8138-8143 (1987); Corden, L.J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:7934-7938 (1985); Phillips, M. et al., J. Biol. Chem., 261:10821-10827 (1986)). Dieses Repeat mag eine regulatorische Rolle spielen.
Dieses Gen kann durch entweder cis- und/oder trans-wirksame Regelfaktoren spezifisch reguliert werden. Eine solche Regelung kann entweder mit einer Proteinsynthese oder mit einem Proteinabbau assoziiert sein.
Acylpeptidhydrolasen sind aus verschiedenen Säugetiergeweben isoliert worden, und ihre Molekulareigenschaften und ihr Reaktionsmechanismus sind teilweise gekennzeichnet worden. Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Primärstruktur der Rattenleber-Acylpeptidhydrolase, welche aus der Nukleotidsequenz von zwei aus einer Rattenleber-λgtll-Genbank isolierten cDNA-Klonen abgeleitet worden ist (Fig. 3). Diese cDNA kodiert für ein Protein von 732 Aminosäurenresten, und durch Proteinseouenzanalysen auf der Basis von 19 durch Spaltung mit CNBr bzw. Trypsin erhaltenen Peptiden wurde die Identität von 292 Resten bestätigt. Es ist gezeigt worden, daß dieses Enzym aus vier Untereinheiten von identischer Größe besteht, und zwar auf der Basis des abgeschätzten Mr für das natürlich vorkommende Protein und dessen Untereinheiten durch Gelfiltration bzw. SDS- PAGE (Kobayashi, K. und Smith, J.A., J. Biol. Chem., 262:11435- 11445 (1987)) . Da alle erhaltenen Peptidsequenzen in der abgeleiteten Proteinsequenz vorgefunden wurden, ist es wahrscheinlich, daß die vier Untereinheiten in ihrer Primärstruktur identisch sind. Ein Vergleich der abgeleiteten Proteinsequenz (Fig. 1) mit den Aminosäurensequenzen, die aufgrund eines automatisierten Edman-Abbaues abgeleitet worden sind (Tabelle 3), zeigt daß das Protein drei äquivalent modifizierte Lysylreste (nämlich die Reste 118, 291, 443) enthält, obwohl die chemische Natur dieser Modifikation noch nicht festgestellt worden ist.
Es gibt drei indirekte Beweisführungen, welche es nahelegen, daß der Methioninrest in der Position 1 tatsächlich das NH&sub2;-Ende des Proteins ist. Erstens stimmt das berechnete Molekulargewicht sehr nahe mit dem Mr der Untereinheit überein, das durch SDS-PAGE abgeschätzt worden ist (81.347 gegen 80.000 (Kobayashi, K. und Smith, J.A., J. Biol. Chem., 262:11435-11445 (1987)). Zweitens gleicht die theoretische Aminosäurenzusammensetzung der für die gereinigte Acylpeptidhydrolase beobachteten Aminosäurenzusammensetzung (Tabelle 2). Drittens befindet sich das Startcodon, ATG, das diesem Methionin entspricht, im richtigen Kontext für ein Startcodon, wie dies von Kozak, M. (Cell 44:283-292 (1986)) beschrieben worden ist.
Die Sequenz am NH&sub2;-Ende der abgeleiteten Primärstruktur des Enzyms ist Met-Glu-Arg-Gln... . Eine frühere Proteinsequenzanalyse zeigte jedoch an, daß das NH&sub2;-Ende des Proteins eine Schutzgruppe aufweist (Kobayashi, K. und Smith, J.A., J. Biol. Chem., 262:11435-11445 (1987)). Würde das Methionin während der Translation durch eine methioninspezifische Aminopeptidase entfernt werden, so wurde man erwarten, daß ein mehr gegen das C-Ende hin lokalisierter Rest eine Schutzgruppe aufweisen würde, in welchem Fall die Sequenz des Peptides CB17- R13 (Glu-Arg-Gln...) nicht erhalten werden könnte. Daher verbleibt der Methioninrest auf der Polypeptidkette und unterliegt einer Modifikation am NH&sub2;-Ende. Obgleich die chemische Natur dieser Schutzgruppe noch nicht festgestellt worden ist, so wird es doch durch das gut dokumentierte Vorkommen von Glutamylresten und von Asparaginsäureresten sowie von Asparaginylresten neben acetylierten Methionresten nahegelegt, daß das Protein wahrscheinlich Nα-acetyliert ist. Wenn dies der Fall ist, dann wird das Ac-Met der Acylpeptidhydrolase während seiner Verarbeitung oder während des intrazellulären Sichtens oftensichtlich weder in vitro noch in vivo durch sich selbst oder durch andere, das NH&sub2;-Ende verarbeitende Enzyme gespalten.
Es ist aufgezeigt worden, daß die Acylpeptidhydrolase keine acetylierte Aminosäure aus natürlich vorkommenden oder denaturierten Proteinen in vitro wirksam entfernt (Kobayashi, K. und Smith, J.A., J. Biol. Chem., 262:11435-11445 (1987), Gade et al., Biochim. et Biophys. Acta, 662:86-93 (1981)), obwohl solche Reste von Nα-acetylierten Peptiden (mit < 20 Resten) in wirksamer Weise abgespalten werden. Es scheint daher wahrscheinlich zu sein, daß die in-vivo-Substrate für dieses Enzym kurze Nα-acetylierte Peptide sein mögen, welche aus einem Proteinabbau stammen. Es kann jedoch nicht ausgeschlossen werden, daß dieses Enzym beim Entternen von Nα-acetylierten Aminosäuren von anderen Polypeptidketten während des co-translationalen Verarbeitens eine Rolle spielt (Rubenstein, P.A. et al., J. Biol. Chem., 258:11354-11360 (1983)).
Eine RNA-Blot-Analyse zeigt an, daß in allen untersuchten Rattengeweben eine einzelne 2,7 kb-RNA für die Acylpeptidhydrolase kodiert. Weiterhin scheint die Menge der in diesen Geweben nachgewiesenen mRNA ungefähr äquivalent zu sein, wodurch es nahegelegt wird, daß es keine gewebespezifische Regelung der Gehalte an Acylpeptidhydrolase-mRNA gibt.
Beipiel 5 - Nachweis und Diagnose von kleinzelligem Karzinom Es gibt vier Hauptarten von Bronchialkarzinomen: - das Kleinzellige Karzinom (auch "Oatzell"-Karzinom genannt), das squamöse Karzinom (auch Plattenepithel-Karzinom genannt), das Adenokarzinom und das Großzellige Karzinom - welche zusammengenommen 95 % aller primären Lungenkarzinome ausmachen. Das kleinzellige Karzinom ist von wesentlicher medizinischer Bedeutung. Es macht etwa 25 % aller Lungenkarzinome aus. Während andere Formen von Lungenkarzinomen eine Uberlebenszeit von 5 Jahren von 27 bis 37 % aufweisen, überleben weniger als 1 % der an kleinzelligem Karzinom leidenden Patienten 5 Jahre ab dem Zeitpunkt der Diagnose (siehe z. B. Harrison's Principles of Internal Medicine, 11. Aufl., Braunwald, E. et al., Hsg. (1987), S. 1115-1123.
Derzeit wird das kleinzellige Karzinom im allgemeinen durch routinemäßige Röntgenuntersuchungen des Brustkorbes nachgewiesen; es sind aber so viele wie 5 bis 15 % solcher Karzinome zum Zeitpunkt des Nachweises asymptomatisch. Die Krankheit gilt als in einem beschränkten Stadium befindlich, wenn sie auf einen halben Brustkorb und regionale Lymphknoten beschränkt ist; die Krankheit gilt als in einem ausgedehnten Stadium befindlich, wenn eine größere Ausbreitung beobachtet wird.
Der frühe Nachweis eines kleinzelligen Karzinoms ist mit einer wesentlich verbesserten Prognose verbunden. Die Heilungsraten nach 5 Jahren für die Erkrankung im beschränkten Stadium betragen potentiell 15 bis 25 %, während die potentielle Heilungsrate nach 5 Jahren für die Erkrankung im ausgedehnten Stadium nur 1 bis 5 % beträgt.
Das kleinzellige Karzinom wird mit intensiver Chemotherapie und Strahlentherapie behandelt. Das anfängliche Ziel der Behandlung liegt darin, eine vollständige Rückbildung des Tumors innerhalb von 6 bis 12 Wochen nach Beginn der Therapie zu erzielen. Obgleich der Tumor oft wiederkehrt, so korreliert doch das Ausmaß der Rückbildung sowohl mit der mittleren Überlebensrate als auch mit der Langzeit-Überlebensrate. Wegen seiner potentiellen Metastasierung ist das kleinzellige Karzinom im allgemeinen chirurgisch nicht behandelbar. Wird es jedoch in einem frühen Stadium nachgewiesen, so ist eine chirurgische Resektion möglich, und sie ist mit signifikant verbesserten Heilungsraten verbunden.
Untersuchungen des Karyogramms (=Chromosomenbestandes) haben eine übereinstimmende Deletion des Chromosoms 3p (p14-p23) bei kleinzelligen Karzinomen ergeben (Whang-Peng, J. et al., Science, 215:181-182 (1981)). Diese Beobachtung ist durch Untersuchungen von DNA-Sequenz-Polymorphismen, nämlich mit Restriktionstragment-Längenpolymorphismus ("RFLP") -Markern, gestützt worden (Naylor, S.L. et al., Nature, 329:451-454 (1987); Kok, K. et al., Nature, 330:578-581 (1987); Brauch, H. et al., N. Engl. J. Med., 317:1109-113 (1987); Yakota, J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.), 84:9252-9256 (1987)). Die Häufigkeit des Allelverlustes zeigt an, daß praktisch alle kleinzelligen Karzinome eine Deletion für einen Teil des Chromosoms 3 aufweisen (Naylor, S.L. et al., Genomics, 4:355-361 (1989).
Der kurze Arm des Chromosoms 3 ist auch mit anderen Lungenkarzinomen, mit Nierenzellkarzinomen und mit dem Hippel-Lindau-Syndrom in Verbindung gebracht worden (Kok, K. et al., Nature, 330:578-581 (1987); Brauch, H. et al., N. Engl., J. Med., 317:1109-1113 (1987); Zbar, B. et al., Nature, 327:721-724 (1987); Kovacs, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.), 85:1571-1575 (1988); Seizinger, B.R. et al., Nature, 332: 268-269 (1988) Der Verlust der Aktivität von Aminoacylase 1 in Tumoren vom Typus eines kleinzelligen Karzinoms und die Familienverbindung bei einigen dieser Krankheiten ist eine weitere Stütze für die Wechselbeziehung zwischen diesen Krankheiten und einer Deletion im kleinen Arm des Chromosoms 3 (Naylor, S.L et al., Genomics, 4:355-361 (1989)).
In jüngster Zeit ist eine (mit "DNF 1552" bezeichnete) DNA-Sequenz kloniert und hinsichtlich des Chromosoms 3 kartiert worden (Gerber, M.J. et al., Amer. J. Hum. Genet., 43:442-451 (1988); Naylor, S.L. et al., Genomics, 4:355-361 (1989)). Es wurde festgestellt, daß die klonierte DNA bef ähigt war, RFLP- Unterschiede zwischen normaler DNA und der DNA aus kleinzelligen Karzinomen zu identifizieren. Insbesondere wurden die Polymorphismen unter Verwendung des Restriktionsenzyms TaqI identifiziert.
Die Aminosäurensequenz der Acylpeptidhydrolase der vorliegenden Erfindung gleicht im wesentlichen der Aminosäuren- Sequenz, welche durch die Sequenz der DNF-1552-Gensonde kodiert wird. Von den 621 Resten des DNF-1552-Proteins waren 67,6 % identisch mit jenen, die in der Acylpeptidhydrolase der vorliegenden Erfindung vorgefunden werden (Fig. 6). Somit können Nukleotidsequenzen, welche für die Acylpeptidhydrolase der vorliegenden Erfindung kodieren, oder für Fragmente dieses Enzyms kodieren, als Gensonden zum Nachweisen und zum Identifizieren von kleinzelligen Karzinomen und von anderen Karzinomen, die mit einer Deletion im Chromosom 3 assoziiert sind, verwendet werden.
Werden solche Sequenzen als eine Gensonde verwendet, dann werden sie unter Bedingungen inkubiert, welche es ihnen ermöglichen, sich an die DNA oder RNA eines Patienten zu hybridisieren, der untersucht wird, um das Vorliegen eines kleinzelligen Karzinoms zu bestimmen. Geeignete Hybridisierungsverfahren sind auf dem Fachgebiet wohlbekannt (siehe z. B. Hames, B.D. und Higgins, S.J., Nucleic Acid Hybridization, a practical approach, IRL Press, Washington, D.C. (1985)).
Nachdem die Hybridisierung bewirkt worden ist, können wohlbekannte Verfahren für den Nachweis von Polymorphismus (vorzugsweise die Analyse auf der Basis des Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus ("RFLP")) angewendet werden, um festzustellen, ob eine nukleinsäurehältige Probe einen Polymorphismus oder eine Sequenz enthält, welcher bzw. welche in Wechselbeziehung mit dem Vorliegen eines kleinzelligen Karzinoms oder eines anderen Karzinoms gebracht wird. Es sind viele Verfahren zur Durchführung von Analysen zum Nachweis des Vorliegens eines Polymorphismus bekannt und können ohne weiteres dahingehend angepaßt werden, daß man die für die Acylpeptidhydrolase kodierenden Sequenzen der vorliegenden Erfindung für den Nachweis von kleinzelligem Karzinom und von anderen Karzinomen verwendet (siehe z. B. Wainscoat, J.S. et al,, Hum. Genet., 75:384-387 (1987); Rabin, D. et al., Hum. Genet., 75:120-122 (1987); Azuma, C. et al., Amer. J. Obstet. Gynecol., 160:734-736 (1989); Pakkala, S. et al., Leuk. Res. 12:757-762 (1988); Todd, S. et al., Genomics, 4:53-59 (1989); Chowdhury, M.K.U. et al., Theor. Appl. Genet., 76:25-32 (1988); Yam, P. et al., Amer. J. Hum. Genet., 41:867-881 (1987); Freeman, S.M. et al., Hum. Immunol., 20:1-12 (1987); Yoffe, G. et al., Exper. Hematol., 15:725-728 (1987); Jones, F.S. III et al., Gene, 39:77-84 (1986); Bernheim, A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.),, 80:7571-7575 (1983)).
Tests zum Nachweisen des Vorliegens von Polymorphismus sind benützt worden, um Karzinome nachzuweisen und zu identifizieren (Wada, M. et al., Jpn. J. Canc. Res., 78:780-784 (1987); Naylor, S.L. et al., Genomics, 4:355-361 (1989); Gerber, M.J. et al.&sub1; Amer. J. Hum. Genet., 43:442-451 (1988); Kakehi, Y. et al., Int. J. Cancer, 43:391-394 (1989); Gum, J.R. et al., J. Biol. Chem., 264:6480-6487 (1989)). Solche Tests können als allgemeines Modell für die Tests der vorliegenden Erfindung verwendet werden.

Claims

1. Verfahren zum Nachweisen eines kleinzelligen Karzinoms, welches umfaßt:

A. Inkubieren einer Nukleinsäureprobe aus einem Patienten, bei welchem der Verdacht besteht, daß er an einem kleinzelligen Karzinom leidet, in Gegenwart eines Nukleinsäuremoleküls, welches eine Sequenz aufweist, die aus einer aus

i. einer Sequenz, welche für die Gesamtheit oder einen Teil eines Acylpeptidhydrolase-Enzyms gemäß Fig. 1 kodiert; und

ii. einer Sequenz, welche komplementär zu einer Sequenz ist, welche für die Gesamtheit oder einen Teil eines Acylpeptidhydrolase-Enzyms gemäß Fig. 1 kodiert;

bestehenden Gruppe ausgewählt ist; wobei diese Inkubation unter Eedingungen durchgeführt wird, welche dafür ausreichen, daß eine Nukleinsäure-Hybridisierung zwischen der genannten Nukleinsäureprobe und dem genannten Nukleinsäuremolekül stattfinden kann und dadurch ein hybridisiertes Molekül gebildet wird; und

B. Nachweisen eines kleinzelligen Karzinoms, indem man feststellt, ob sich dieses hybridisierte Molekül in seiner Sequenz von einem Bezugsmolekül unterscheidet, wobei dieses Bezugsmolekül eine Nukleinsäureprobe aus einem normalen Individuum umfaßt, welche an ein Nukleinsäuremolekül hybridisiert ist, welches für die Gesamtheit oder einen Teil eines Acylpeptidhydrolase-Enzyms gemäß Fig. 1 kodiert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Stufe B eine Analyse der Restriktionsfragment-Längenpolymorphismen umfaßt.

3. Zweisträngiges Nukleinsäuremolekül, welches umfaßt:

A. einen ersten Strang, welcher eine Sequenz aufweist, die aus einer aus

bestehenden Gruppe ausgewählt ist; wobei dieser erste Strang hybridisiert ist mit:

B. einem zweiten Strang, wobei dieser zweite Strang eine Sequenz aufweist, die in ihrer Sequenz zu der Sequenz des ersten Stranges im wesentlichen komplementär ist, und wobei diese komplementäre Sequenz des zweiten Stranges aus einem Individuum stammt, bei welchem der Verdacht besteht, daß es an kleinzelligem Karzinom leidet.