PT92844A - Metodo para a producao e utilizacao de hidrolase de acil-peptideos - Google Patents

Description

-3-

Referencia Cruzada a pedidos de patente relacionados: £ste pedido é uma oontinuação em par te do Pedido de Patente U.S.No.de serie 07/296,996 (entregue em 13 de Janeiro de 1989), o qual é uma continuqção em parte do Pedido de Patente U.S.No. de Serie 07/087,936 (entregue em 21 de Agosté de 1987), ambas aqui incluídas por referencia.

Campo do Invento 0 presente invento é dirigido â produção de Hidrolase de Aci1-peptideos por tecnologia de DNA recombinante. Ele temabem se dirige â utilização de anzima para catalisar a hidrólise de um peptideo ou pro-;teina acilado e â reacção entre um dador de N^-acetil--aminoácido derivatizados e a uma proteína aceitadora com um grupo alfa-NH2 livre. 0 invento diz ainda respeito a uma sequencia genetica que codifica a hidrolase de acil--peptideos de rato. 0 invento também se dirige ao diagnostico do carcinoma de células pequenas através da utilização da hidrolsase de acil-peptideos e de sequências de genes que codificam a hidrolase de acil-peptideos. -4-

Breve descrição de trabalhos anteriores:

Desde a descoberta de um grupo aceti lo no extremo amina da proteína da capside do virus do mos saico do tabaco, foram encontrados uma serie de proteína N<*>-acetiladas em animais, plantas e seus viros e também em bactérias e fungos. A N <-acetilação é portanto considerada como uma das modificações típicas de proteínas em organismos vivos. Ainda, nalgumas células eucarioticas, foi sugerido que mais de 80¾ das proteínas intracelulares sejam N ^-acetiladas(Brown, J.L, J.Biol.Chem. 254:1447-1449 (1979). O significado biologico da N^-acetj_ lação das proteínas é ainda uma questão em aberto (ver Tsunasawa et al_, Method Enzymul.106: 165-170 ( 1984). Foi proposta que esta modificação pós-tradução protege as proteínas intracelulates da proteôlise. No entanto, não ser verifica para todas as proteínas. No caso da activa do "slime mold", a degradação proteolitica torna-se mais lenta quando a proteína é N -acetilada. Pelo contrario, a hemoglobolina do gato ê degradada â mesma velocidade independentemente da N-acetilação (Tsunasawa et aj_, 1984)

Resultados recentes de sequencíaçaão de DNA mostraram que nos genes estruturais das proteínas secretadas que são N&-aceti1adas o codlo do residuo amino terminal acetilado ê directamente precedido pelo codão de -5-

iniciação sem a inserção de codões adicionais para os aminoâcidos (Tsunasawa et al_, 1984). Fez-se pouco esforço para compreender a relação entre N-^aceti lação e o transporte de proteínas secretadas de membranas biológicas.

Para compreender completamente a função de Nv-acetilação serâ importante identificar os aminoâcidos N^-acetilados nas proteínas e peptideos numa escala microanalitica.

Com esta finalidade a remoção do grupo N^-acetilo do N06--aceti1-aminoScido deve ser eficazmente conseguido. A Midrolase de Acil-peptideos {APH) tem sido usada com êxito para a hidrólise de aminoâcidos N ^'-acilados. Tal enzima que foi purificada a partir de figado animal, pode libertar o N ^-aceti1-aminoácido de pep-tídeos relativamente pequenos derivados de proteínas -acetiladas (Tsunasawa et aj_, 1984). A especificidade do substarto é larga para o resíduo amino-terminal. APHJcliva o aminoácido N°^-terminal acetilado ou formilado de um peptideo bloqueado (Oonas et aj_, BBRC 126:933 (1985).

Esta enzima catalisa a hidrólise de um numero diversode peptideos e apresenta diferentes pHs optimos para certos substractos ao faze-lo. Esta enzima pode também desempenhar pepel "pivot" no procedimento de cadeias polipeptide-cas durante a biossintese. A PH foi purificada a partir de figa do de rato (Tsunasawa et al_, J. Biochem. 77_, 89-102(1975) /"a partir do figado bovino(Gade et aj_, Biochim. Biophys Acta 662:86-83 (1981)7; a partir do figado porcino (Tsunasawa et al, J.Biochem. 93:1217-1220 (1983); a partir de cerebro de rato (Marks et al, J.Neurochem. 41: 201-208 (19.83)); e a partir de eritrocitos humanos (Jones et al, Biochem. and Biophys. Res-Comm,126:933-940 (1985)). -6-

Uma hidrolase do aci1-peptídeos de figado de rato (APH) que catalisa a hidrólise de residuo acetilado a partir de peptideos N^-aceti lados foi recen-temente purificada até à homogeneidade e varias experiências de inibição indicaram que ê provavelmente uma profcea-se serina, utilizando um sistema de substituição de cargas envolvendo serina, histidina e provavelmente um grupo car-boxilo (Kobayashi, K. e Srnith, J.A. J.Biol ,Chem,262: 11435-11445 (1987). No entanto, não está ainda claro se a hidrolase de aci1-peptideos é uma protease serina única.

Para facilitar uma compreensão mais completa de regulações de hidrolase de aci1-peptideos deA rato Γη vivo, ê portanto, desejável donar e sequenciar o gene da hidrolase de acil-peptideos.

Sumario do Invento A hidrolase de acil peptideos eatali sa a hidrólise de um residuo de aminoácido N^-acetilado. de um peptideos N^-acetilado. Duas sondas oligonucleo-tidicas degeneradas e sobrepossiveis baseadas na sequencia de um peptideo triptico, derivado da hidrolase de acil--peptideos de rato purificada, foram sintetizadas e usadas no despéste de uma biblioteca de cDNA derivado de figado de rato em Xgt11. Um cDNA de 2,5 kb foi clonado e sequencia^ do. Este clone continha 2364pb da sequencia da hidrolase de acil-peptideos de rato mas não possuia um codão de iniciação. Usando uma sonda de 220pb derivada do extremo 5' -7- deste cDNA de quase tamanho completo para fazer novo despiste da biblioteca, isolaram-se clones de tamanho completo, os quais continham um codão AT6 na mesma grelha de leitura nos nucleotideos 6-8 e codificadores da sequencia NH2--terminal, Met-Glu-ArgpGln... A sequencia de DNA codificava uma proteína de 732 resíduos de aminoácidos, 30% dos quais foram confirmados por resultados da sequencia proteiea de 19 peptideos CNBr ou tripticos. A enzima isolada está bloqueada no extremo NH2 (Kobayashi, K, e Smith J.A.(1987). J.Biol.Chem, 262 : 11435-11445). e com base na sequencia proteica NH2-terminal deduzida a partir de sequencia de DNA e ne sequencia do peptideo CNBr do extremo NH2, é provável que o residuo NH2-terminal seja um resíduo de metio-nina acetilado, uma vez que tres resíduos estão frequentemente justapostos aos resíduos glutamilo (Person, B.et al (1985) Eur.J.Biochem. 152, 523-527). A analise da transfe rencia de RNA revelou um unico mensageiro de 2,7 kb em vários tecidos de rato examinados, Sebem que se saiba que esta enzima ê inibida por fluorofosfato de diisopropilo e por acetilalanina-clorometiIcetona (Kobayashi, K. e Smith, J.A.(1987), J.Biol.Chem.262;1 1435-1 1445), não se encontrou qualquer semelhança forte na sequencia proteica com outras proteases serina. Este resultado sugere que a hidrolase de acil-peptideos poderá ser uma protease serina diferente.

Este invento ê dirigido a uma protei na.Hidrolase de Acil-peptideos (APH), a qual se caracteriza pela sequencia de aminoácidos de Figura 1. Ele também é dirigido â produção de APH por tecnologia de DNA recombinaq te e â utilização de APH na hidrólise ou aminoácileção de -8- ou proteínas. 0 invento diz também respeito â clo-nagem e analise da sequencia de uma hidrolase de acil-pep-tideos derivada de fígado de rato descrita por Kobayashi K.et al., (J. Biol.Chem. 264:8892-8899) (Maio, 1989) cuja referencia ê aqui incluída por referencia.

Uma molécula de DNA recombinante cod^ ficadora de APH do presente invento pode ser usada para transformar qualquer um de urna serie de hospedeiros, criando novas fontes de fornecimentos ilimitados de APH. 0 invento ainda compreende as sequên cias geneticas codificadoras de uma enzima tendo a sequeii cia de aminoãcidos designada na Figura 1, veiculos contendo a sequencia genetica, hospedeiros transformados com eles, produção da enzima por expressão no hospedeiro trasn-formado e utilização da enzima na hidrol ise ou na amino-á^ cilação de peptideos ou proteínas. E uma finalidade deste invento proporcionar novas fontes de APH substancialmente pura de que se disporia numa fonte ilimitada.

Em adição este invento engloba a utilézação da enzima para catalisar a hidrólise de uma proteína N^-acilada ou a recação entre um dador de N°Lr-acetil-aminoãcidos e uma proteína aceitadora com um grupo alfa-NHglivre. -9-

Portanto, são finalidades adicionais deste invento proporcionar num meio de hidrólise de proteínas N^-aciladas e de amino-acilação de qualquer polipep tideo ou proteína a partir de um dador de Nrv-aceti iaminoá-cidos e de um aceitador com um grupo alfa-NHg, livre usando a APH.

Detalhadamente, o invento diz respeito a hidrolase de Aci1-peptideos na forma pura, 0 invento também diz respeito a Hidrolase de Acil-peptideos sem gli-cosilação nativa. 0 invento ainda diz respeito a uma molécula de acido nucleico recombinante, RNA, ΠΝΑ genômico ou cDNA, a qual contem uma sequencia genetica codificadora da Hidrolase de Acil-peptideos. A molécula de ecido nucleji co pode ser um vector ou plasmideo.

Oinvento também diz respeito a um hospedeirp como seja uma bactérias, uma levedura ou uma célula de mamífero, etc., transformada com qualquer uma das moléculas de acido nucleico recombinante atrás descritas . 0 invento também die respeito a um método para e produção da Hidrolase de Acil-peptideos que se caracteriza por: -10-

(a) obtenção de qualquer uma das moléculas de acido nu-cleico atrás descritas, ern que a molécula é DNA; (b) inserção da molécula de DNA num vector; (c) transformação de um sistema hospedeiro com o vector; (d) expressão da sequencia de DNA da hidrolase de Aci1 --peptideos da molécula de DNA recombinante no hospedeiro; e (e) recuperação da hidrolase de Acil-peptideos produ-ziada pela expressão. 0 invento também inclui a Hidrolase de Acil-peptideos produzida pelo método atras descrito. 0 invento também inclui a Hidrolase de Acil-peptideos atrás desccita na forma imobilizada. 0 invento também inclui um método de hidrólise do aci1-aminoácido N-terminal de um polipeptideo acilado, o qual compreende o contacto do polipeptideo com a Hidrolaae de Acil-peptideos atras descrita. 0 invento também inclui um método de catálise de reacção entre um dador de Ns6 -acetil-aminoáci-dos derivatizado e um aceitador com um grupo alfa-NH2 livre que compfeende o contacto do dador como aceitador na presença da Hidrólise de Acil-peptideos atrás descrita. -11- 0 invento também ingloba um método de detecção do carcinoma de células pequenas que se carac-teriza por: a. incubação de uma amostra de acido nucleico de um paciente suspeito de ter carcinoma de células pequenas, na presença de uma molécula de acido nucleico tendo uma sequencia seleccionada do grupo constituído por: a: uma sequencia que codifica toda ou parte de uma enzima hidrolase de acil-peptideos; e b. uma sequencia que é complementar de uma sequencia que codifica toda ou parte da enzima hidrolsse de acil-peptide os; a incubação sendo em condições suficientes para permitir a hibridação de ácidos nucleicos entre a amostra de acido nucleico e a molécula de acido nucleico e para assim formar uma molécula hibrida; e b. detecção como seja por uma analise de polimorfismo de comprimentos de fragmentos de restrição, de carcinoma das células pequenas determinando se a molécula híbrida difere na sequencia de uma molécula referencia compreendendo uma amostra de acido nucleico de um indivíduo normal hibridada com uma molécula de acido nucleico que codifica toda ou parte de uma enzima hidrolase de acil-peptideos. 0 invento ainda inclui uma molécula de acido nucleico de cadeia dupla compreendendo: A. uma primeira cadeia tendo uma sequencia seleccionada de um grupo constituído por: -12-

a„ uma seuqnecia que codifica toda ou parte de uma enzima hidrolase de acii-peptideos; e b. uma sequencia que é complementar de uma sequencia que codifica toda ou parte de uma enzima hidrolase de acil-peptideos; a primrira cadeia usa e sendo hibridade com: B. uma segunda cadeia, a segunda cadeia tendo uma sequen cia que ê substancialmente complementar em sequencia da sequencia da primeira cadeia, a sequencia complementar da segunda cadeia derivada de um indivíduo suspeito de ter car cinoma das células pequenas.

Descrição das Figuras A Figura 1 ilustra a sequencia de aminoacido de ΑΡΗ. A sequencia proteica deduzida da sequencia de cDNA (Figura 3) esta indicada pelo codigo de uma unica letra para os aminoácidos. As linhas entre pareji tesis indicam os extremos dos peptideos CB, CB-R e CB/R.

As setas que apontam para a direita indicam que o correspondente resíduo de aminoacido foi i-dentifi cado como o resíduo de aminoácido PTH durante a de-gradaç-ão automática de Edman (Tabela 1). Um "blank" indica que um aminoácido PTH foi não identicado neste ciclo degradativo. Um asterisco indica que um Pth-Trp juntamente com um-.derivado PtH não identificado e que elui uma fase tardia foi identificado em vez de Pth-Lis durante este -13- ciclo degradativo. Os resíduos cisteina foram identificados como derivados Pth de Ç7S-carboximetilcisteina. A seH na activa está apresentada nas posições 620-627 da Figura 1 (caixa preenchida com diagonais). A descrição dos pepti-deos apresentados aqui está definido na Tabela 3. A Figura 2 ilustra a clonagem e sequenciaçao de cDNA codificador da hidrolase de acíl-pep tidoes de rato. (A) Sondas oligonucleotídícas usadas para o despiste inicial da biblioteca de cDNA de fígado de rato em >gt11. A sequência de aminoacidos de im peptideo triptico purificado por RPLC (CB18-R11-13C; Tabela 2) foi usada como base para a sintese de dois oligonucleotideos degenerados sobreponí-veis YS17.2 e YS20.1. (B) Mapa de restrição e estratégia de sequenciaçao do * DNA dos clones: Usando os oligonucleotideos degenerados na Figura 2A, APH5.2 foi obtido a partir de uma biblioteca de cDNA de fígado de rato em A gt11. como descrito abaixo As setas indicam a direcção e grau de determinação da sequencia de DNA para cada fragmento. A analise da sequencia de DNA para este clone revelou o sitio de hibridação esperado perto do seu extremo 5'(região aberta em "bold line") uaa sequencia poli(A), no seu extremo 3' e uma sequencia não relacionada no seu extremo 3'(caixa tracejado).

Após novo despiste da biblioteca de cDNA de figado de rato em A gt11 com o fragmento XmnI-Kpnl derivado de APH5.2 (caixa aberta maior). A PH 36.1 nõo -14- *

possuía um codão de iniciação ATG e também continha um fragmento de 120 pares de bases codificador da albumina de soro de rato (caixa de/com diagonáis). Apôs novo despiste da biblioteca de/oom um fragmento BamII-PstII de 220pb derivado de APH 36.1 (caixa pequena aberta), APH 2.7 foi clonado, o qual foi subsequentemente subclonado no plasflií-deo Bluescript (Strategene) e sequenciado em parte.

Abreviaturas: B, Baml; P, PstI; X, Xmnl; e K, Kpnl. A Figura 3 mostra a sequencia de nu-cleotideo e a sequencia de aminoácidos deduzida da hidro-lase de acil-peptideos de figado ou rato. 0 cDNA completo codificador da hidrolase de acil-peptideos de figado de rato foi derivado combinando os resultdaos da sequencia de DNA de APH 25.1 e APH 2.7(Figura 2B). A sequencia proteica deduzida está indicada pelo codigo de uma letra para ss aminoácidos.

J A Figura 4 mostra a sequencia de nucleotideos do gene da hidrolase de acil-peptideos de rato e a sua região delimitante. 0 sistio de iniciação da transcrição do gene está indicado pela seta vertical. 0 nucleotideo nesta posição está assinalado com o numero. A sequencia de DNA intrõnica está apresentada em letras minúsculas e a sequencia de DNA exõnico está apresentado em letras rniÉiúsculas. 0 começo e o fim de cada intrão estão marcados por linhas· verticais. 0 sistio de iniciação da tradução está situado nos nucleotideos 625-627. 0 sinal de poliadenilaçõo está situa_ do nos nucleotideos 9708-9713. A sequencia tipo caixa "TATA" (nucleotideos 24á -30) e a sequencia tipo caixa CAAT" (nucleotideos 95 a -991/ estão dentro de rectangulos. As repetições SC estão sublinhadas. As repetições de 200pb em tandem estão sublinhadas a tracejado. A figura 5 mostra uma organização estrutural do gene da hidrolase de aci1-peptideos de rato. A Finura 5A mostra fagos recombinantes sobreponíveis contendo o gene da hidrolase de acil-peptídeos. Os clones ge-nórnicos sobreponissiis, ΛΡΗΕ5 e APKE6, tendo em conjunto todo o gene da hidrolase de acil-peptideos, estão indicados por linhas horizontais a cheio. A Figura 5B mostra o mapa de restrição do gene da hidrólise de acil-peptideos e as suas regiões delimitantes. Os sitios EcoRI(E), BamHI(B), HindIII(H) e Pstl(P) estão indicados por bases verticais. Esta apresen tada a orientação da transcrição de 5'(esquerda) para 3' (direita) deste gene. A Figura C mostra a organização exão--intrão do gene de hidrolase de acil-peptideos de rato. A localização dos 23 exões dentro do gene da hidrolase de acil-peptideos de rato está indicada por retângulos a cheio. As localizações do codão de iniciação da tradução, $TG, e o -16-

sinal de poliadenilação, AAiAAA, estão marcados por linhas verticais. A Figura 6 mostra uma comparação das sequências de arainoácidos da hidrolase de aci1-pepti-deos e dasvproteínas DMF 1552 .

Nas Figuras, os arninoãcidos foram designados por uma unica letraodo alfabeto: A= Alanina, B= Acido Aspártico ou Asparagina, C s Cisteina , D= Acido Aspártico, E = Acido Glutêmico, F = Fenilalanina, G = Glicina, H « istidina; I = Isoleu-cina, lí = Usina, L = Leucina, M = Metionina, N = Aspara gina, P = prolina, 0 = Glutamina, R = Arginina, S ’= Seri-na, T = Treonina , V = Vaiina , W = Triptofano, Y = Tirosi-na, Z- Glutamina ou Acido Glutâmico. -17-

Discussão Detalhada do Invento

Definições

Para ajudar na compreensão da especificação e reivindicações, incluindo o âmbito a ser dado a tais termos, são dadas as seguintes definições.

Transcrição 0 processo de produção de mRNA a par tir de um gene estrutural.

Tradução 0 processo de produção de um polipep- tideú a partir de mRWA„

Expressão 0 processo sofrido por um gene estru tural para produzir .um polipeptideo. E uma combinação de transcrição e tradução.

Plasmideo

Uma molécula de DNA circular de cadeia dupla que não faz parte do cromossoma principal de um organismo contendo qenes que conferem resistência a anticorpos específicos. Quando o plasmideo é colocado den tro cie um organismo unicelular, as caracteristicas deste podem ser alteradas ou transformadas caso resultado do DMA do plasmideo. Por exemplo, um plasmideo portador do gene da resistência â tetraciciina (Tet^) transforma uma célula previamente sensível â tetraciciina numa que lhe é resistente. Uma célula transformada por ura plasmideo é designado um "transformante".

Veiculo de clonagern

Um plasmideo, DNA fágico ou outras sequências de DNA que são capazes de se replicar numa célula hospedeira. 0 veiculo de clonagern ê Garacterizado por um ou um pequeno número de sítios de endonuclease de restrição nos quais tais sequências de DNA podem ser cortadas de modo determinável sem perda de uma função biologica, essencial do DNA, o qual pode conter uma marca adequada para usar na identificação de células transformadas. São marcas, por exemplo a resistência â tetraciciina ou â ampicilina.

Um veiculo de clonagern é por vezes designado num vector.

Moléculas de DNA recombinante ou DMA híbrido

Uma molécula consistindo em segmentos de DNA de diferentes genomas que foram ligados extremo a extremo fora das células vivas e que tem a capacidade de infectar algumas células hospedeiras e nelas se manter.

Operador

Uma sequencia de DNA capaz de inter-actuar com o repressor especifico, controlando assim a transcrição de gene (s) adjacente(s).

Promotor

Urna sequencia de DNA em que a RNA polimerase se liga e inicia a transcrição de um gene(s) adjacente(s).

Hidrolase de Aci1-peptideos (APH).

Este termo pretende, incluir uma (s) hidrolase(s) de acil-peptideos de qualquer especie, a qual tem actividade de libertação do aminoãcido acilado N **· -terminal de qualquer proteína de peptideo num sistema jjn vivo ou iji vitro. o termo hidrolase de acil-peptideos é também usado neste invento para incluir qualquer analogé, homologo, mutante ou derivado de uma hidrolase de acil-peptideos natural a qual cliva o aminoãcido N ^-acetilado de -20-

fracção N '-acetilado da fracção N -terminal de um peptideo ou proteína. 0 termo pretende também incluir fragmentos tendo menor numero de amibiacidos do que o natural, como sejam fragmentos parciais de hidrolases de aci1-peptídeos naturais que retem a actividade de clivagem do aminoácido aci lado do extremo de M-terminal de uma pirosteina a/ou peptideo. 0 termo é também usado para incluir qualquer produto que compreenda a sequencia de uma hidrolase de acil-pepti-deos natural ou um seu homologo, juntamente com um; ou ma is aminoâcidos delimitantes que apresente actividade de hidrolase de acil-peptideos. 0 termo hidrolase de acil-peptide- os também inclui sinónimos tais como factor de libertação de acil-aminoãcidos, enzima libertadora de aci1-aminoácidos hidrolase de aci1-aminopeptideos e acetilaminoaci1-p-nitro anilidase,

Forma substancialmente pura

Tal como aqui é usado, o termo "subs tancialmente pura" ou "substancialmente purificada" pretende descrever a proteína que está substancialmente livre de qualquer composto normalmente associado com o factor no seu estado natural. 0 termo pretende ainda descrever que é hoogêneo por um ou mais caracteristicas de pureza ou homogeneidade normalmente usadas. Por exemplo, num factor substancialmente puro apresentará caracteristica constantes e reprodutíveis com desvios padrão experimentais para parâmetros tais como os que se seguem: peso molecular, técnicas cromatograficas e outros parâmetros do mesmo tipo. 0 termo, no entanto, não pretende excluir misturas artificiais ou sirfeticas do factor com outros compostos. 0 termo não pretende incluir /excluir a presença de impurezas existentes em quantidades muito pequenas que não interferem com

a actividade biologica do factor e que podem estar presentes por exemplo devido a purificação incompleta.

0 peso moldecular da APH de fígado de rato, conforme calculado por filtração em gel, é 290 000 - 320 000. Parece possuir quatro subunidades idênticas, com uma serina activa por subunidade. 0 extre mo N ^ da APH ê acilado. APH parece ser uma protease-seri-na, com um sistema de substituição de cargas envolvendo serina, histidina e grupos carbonilo, A serina activa está mostrada nas posiÇSes 520-627 da Figura 1 (caixa preenchida com diagonais). A sequencia de aminoácidos deste sitio ê MGGSHGGF. O ambiente do sitio activo defere de outras proteases da fami1 ia tripsina, devido â presença de histidina e â ausência de ácido aspártico.

Se bem que APH apresente uma larga especificidade para substractos, ela cliva peptfdeos contendo Ac-Ala-,

Ac-Ser- e Ac-Met-(os resíduos N-terminais mais vulgarmente acilados) mais eficazmente do que outros dipeptideos aci-lados. APH tem uma actividade baixa ou nehuma para peptideos contendo Ac-Trp-, Ac-Asp-, Ac-Glu, Ac-Arg-, Ac-Fen e Ac-Pro. A Hidrólise de Acil-peptideos (APH) deve-se distinguir da N^-acetil transferase, aqual catalisa a reacção em que uma proteína aceita o grupo acetilo de um acetil-CoH (Tsanasawa et al.S^lethods in Embriology 106;165-170( 1984)). A Hidrolase de Acilpeptide os deverá ser distinguida da Amino-Acilase (Szajami, Acta Biochim. et Biophys. Acad. Sei. Hung, 15:223-228(1980) -22-

/"também conhecida como hidrsolase de alfa-N-acilaminoáci- dos (Gade et aJU Biochim,, Biophys. Acta 662:86-93(1981 )7.

Se bem que APH· tenha sido isolada e purificada a partir de varias fontes» atéagora não foi feita sequenciação de APH. 0 presente invento descreve aquela sequencia (Figura 1). A sequencia de DNA codificadora de APH pode ser derivada de uma unidade de variedade de fontes. Por exemplo, mRNA codificador de APH pode ser isoaldp a partir dos tecidos de qualquer especie que produz APH, usando o método de transferencia Northern (Alwine et al_, Method. Enzymol. 68:220-242 (1979) e sondas oligo-nucleotídicas marcadas. 0 mRNA pode então ser conver tido em cDNA poe técnicas conhecidas. As sondas podem ser sintetizadas com base na sequencia de aminoácidos conhe cidas de peptideos APH.

Como alternativa, sondas de ADN degenerativas podem ser usadas para fazer o despiste de uma biblioteca de DNA de uma especie que produz APH, isolando assim um clone que contem a sequencia de DNA codi ficadora de ΑΡΗ. A biblioteca de DNA foi criada cortando o DNA genomico com uma ou mais eundcoinucleases de restrição, seguido de incorporação em vectores de sua utilização para transformar células hospedeiras as quais são então semeadas e despistadas. 23-

A sonda de Ί3ΝΑ pode ser marcada com um grupo detectável. Tal grupo detectavel pode ser qualquer material tendo uma propriedade fisica ou química detectavel. Tais materiais foram bem desenvolvidos no campo dos imunoensaios e em geral qualquer marca util em tais métodos pode ser aplicada ao presente invento. São particularmente uteis os grupos enzimáticamente activos, esmo sejam enzimas (ver Clin Chem. 22:1243 (1975), subtractos de enzimas (ver. E.p. Pat Britânica 1548 741) coenzimas (ver Pat.US Nos. 4230 797 e 4 238 565) e inibidores de enzimas (ver Pat.U.S. No. 4 134 792); compostos fluorescentes (ver Clin. Chem. 25 353 (1979)) cromôforos; substancias luminescentes tais como quimioluminescentes e bioluminescentes (ver Clin.

Chem. 25: 512(1979)), ligando especificamente ligáveis; pares de interaeção peroximal; e radioisôtopos, tais como 3H, 35S, 32P, 125I e 14C.

Tais como arcas e pares de marcação são detectados em base nas suas próprias propriedades físicas (e.g. compostos fluorescentes, cromôforos e radioisõtopos) ou na sua reactividade ou propriedades de ligação (e.g. enzimas, substractos, coenzimas e inibidores) . Por exemplo, uma sonda marcada com cofactor pode ser detetada pela adição da enzima para a qual a marca é um cofactor e um substracto da enzima. Por exemplo, pode-se usar uma enzima que actue num substracto para gerar um produto com uma propriedade fisica mensurável. Exemplos desta ultima incluem mas não está limitada a ^B-lactosidade fosfatase alcalina e peroxidase. -24- -24-

Uma sequencia de DNA codificadora de APH pode ser recombinada cor? DNA vector de acordo com técnicas convencionais, incluindo a ligação de extre mos oerses ou coesivos para ligação, digestão com enzimas de restrição para se obter os extremos apropriados, preenchimento dos extremos coesivos conforme adequado, tra tatamento com fosfatase alcalina para evitar ligações indesejáveis e ligação com ligases apropriadas.

Para expressar APH são neces sarias sinais de transcrição e tradução reconhecidos por um elemento do hospedeiro adequado. Os hospedeiros podem ser células de mamífero capazes de serem cultivadas iji vitro , particularmente leucócitos, mais particularmente células de mieloma ou outros 1infocitos transformados ou oncogénicos, e.g., células transformadas por EBV.

Como alternativa, podem-ser empregues células que não as de mamífero, tais como bactérias, fungos, e.g. levedura, fungos filamentosos ou similares. São hospedeiros possíveis pa^ ra a produção de APH células de mamífero, cultivadas in vitro em culturas de tecidos ou ijn vivo em animais.

As células de mamífero podem proporcionar modificações pós-tradução a moléculas APH incluindo enrolamento ou gli-cosilação correctas nos sitios certos. As células de mami feros que podem ser uteis como hospedeiro^ incluem células de origem fibrobiástica tais como VERO ou CH0-K1 ou células de origem linfoide, tais como o hibridoma SP'a/0 AG14 -25-

S ου o mieloma Ρ3χ63 Sgh e seus derivados.

Geralmente a oonstrução APH será parte de um vector tendo um sistema de replicação reconhecido pela células hospedeira.

Numa realização preferida, uma célula procariotica ê transformada por um plasmideo portador do gene codificador de APH. Os hospedeiros bacterianos de particular interesse incluem E.coli K12 estirpe 294 (ATCC 31446), E.coli X1776 (ATCC31537), E.coli W3110; (F. Lambda", proptotr(3fica (ATCC 27325) e outras enterobac tereãceas, tais como Salmonnella Typhimurium ou Serratia marcescens ,e varias especies de Pseudomonas. Em tais condições, a APH não será g1icosliada. 0 hospedeiro procario tico deve ser compatível com o replica~e sequências de con trole no plasmideo de expressão. Um hospedeiro procarioti-co com um plasmideo contendo o cDNA codificador de APH foi depositado em 21 de Agosto , 1987 na American Type Culture Collection, Rockville, M.D. USA, e dado o numero de acesso ATCC 67504.

Em geral, tais vectores contendo replicio e sequências de controle que derivam de especies compatíveis com uma célula hospedeira são usados em ligação com o hospedeiro. 0 vector normalmente é porta dor de um sitio replica~assim como de genes específicos que são capazes de proporcionar selecção fenotipica em células transformadas. A expressão do DNA codificador de APH pode ser também colocado sob o controle de outras sequências reguladoras que podem ser homologos do organismo no seu estado não transformado. -26-

Por exemplo, DNA cromossómi-co de E.coli dependente de lactose compreende um operão lactose ou lac que medeia a utilização de lactose ao elaborar a enzima B-galactosidase. Os elementos de contro le la£ podem ser obtidos a partir de bacteriofago lambda plac5, o qual é infeccioso para E.coli. 0 sistema promotor--operadorlac pode ser induzido por IPTG.

Outros sistemas promotor (operador ou porções deles podem igualmente ser empregues. Por exemplo podem ser usados colicina E1 , galactose, fso-fatase alcalina, triptofano, xilose, tax e similares.

Para um hospedeiro mamífero existem disponíveis para expressão vários sistemas vector possíveis. Uma closse de vectores utiliza elementos de DNA que proporcionam plasmideos extracromossómicos de repli-cação autonoma, derivados de virus animais tais como virus do papiloma bovino, virus polioma, adenovirus ou virus SV40. Uma segunda classede vectores baseia-se na integra-cção das sequências de genes pretendidas no cromossoma hospedeiro.

As células que têm estável mente integrado o DNA introduzido nos seus cromossomas pode ser seleccionado introduzindo também uma ou mais marcas que permitam a selecç'ao de células hospedeiras que contem o vector de expressão. A marca pode proporcionar prototro-fia a um hospedeiro auxotrófico, resistência a biocidas e.g. antibióticos ou metais pesados, tais como cobre ou similares, -27-

0 gene da marca seleccionavel pode ser directamente ligado â sequências de DNA a serem expressas ou introduzidas na mesma célula por cotransfor-mação. Podem ser igualmente necessários elementos adicionais para a síntese óptima de mRNA. Estes elementos podem incluir sinais de "splícing", assim como promotores de transcrição., potencíadores e sinais de terminação. Os vec tores de expressão e cDNA qae incorporam tais elementos incluem os descritos por Okayama, H. Mol. Cel. 8iol. 3: 280(1982) e outros.

Podem ser empregues uma gran de variedade de sequências reguladoras da transcrição e tradução, depeçdendo da natureza 17 do hospedeiro. Os sinais de transcrição e tradução podem derivar de fontes de virais, tais como adenovírus, virus do papiloma bovino, virus simio ou similares, sempre que os sinais reguladores estejam associados a um gene particular que tenha um nível elevado de expressão. Como alternativa podem ser empregues promotores de produtos de expressão de mamíferos, tais como actina, miosina, etc.

Podem também ser seleccionados sinais de iniciação da transcèição, que permitam a repressão ou activação de modo a poder-se modular a expressão dos genes. São de interesse sinais reguladores que sejam sensíveis à temperatura de tal forma que variando a temperatura , a expressão pode ser reprimida ou iniciada ou que estejam sujeitos a regulação química. e,g, metabolito.

Uma vez preparado o vector ou sequencia de DNA contendo as construções para expressão as construções de DNA podem ser introduzidas num hospedeiro -28-

adequado. Podem ser empregues varias técnicas tais como fusão de protoplastos, precipitação com fosfato de cálcio, electroporação ou outras técnicas convencionais. Após a fusão, as células foram cultivadas em meio e despistadas -quanto âs actividades adequadas. A expressão do(s) gene(s) resulta na produção da APí-I.

As células hospedeiras para a produção de APH podem ser celulas imortalizadas, principal mente células de mieloma ou de linfoma. Estas células podem ser cultivadas num meio nutritivo adequado em frascos de cultura ou injectadas num hospedeiro sinergfstico, e.g. ratinho ou rato, ou hospedeiro imunodeficiente ou sitio imunodeficiente de um hospedeiro, e.g., ratinho labro ou bolsa de hamstfe,rí- Â APH do invento pode ser isolada e purificada de acordo com as condições convencionais como seja extracção, precipitação, cromatografia, croma-tografia de afinidade, electroforese ou similares. -29-

Utilizações ΑΡΗ, uma vez produzida e purificada, pode set usada, por exemplo no contexto de produ ção farmacêutica para hidrolisar um peptideo N ^-acilado ou para amino-acilar o extremo N^-de um peptideo.

Este ultimo é efectuado numa solução aquosa e torna resistentes proteínas susceptiveis â degradação de Edman. Aquela pode ser efectuada num ambiertetquase anidro e é util na redução da degradação de proteínas e a serem usadas terapeuticamente. Ver a discussão a seguir a A. Klibrinov, "Unconvertional Catalytic Proberties of Convencional Enzyrnes" em Basic Biology of New Deveíopments in Biotechnology, pag. 497-518. (A Hollander ed, 1973), sobre a utilização de enzimas em sistemas fcifá-sicos para sintese organica. 0 ambiente quase anidro alternará a especificidade de substracto de APH, de tal modo que ocorra a amino-acilação dos peptideos. A especificida de do substracto de uma enzima em solventes orgânicos pode ser radicalmente diferentes, e muitas vezes oposta, âs na água (ver Zaks et aj_, J.Atn. Chem. Sei .108:2757-2768 (1984).

Demonstrou-se que os peptide os podem ser sintetizados por tripsina e alfa-quimotripsina em soolventes misciveis em/ou imisciveis com agua (ver Puhniere et al, Proteins, Structure.Function and Genetics) 1:134-138 (1986)). As klipases pancreaticas porcina, de -30- levedura e de fungos actuam fortemente oomo catalisadores numa serie de solventes quase anidros. A actividade das lipases nos meios orgânicos depende do pH da solução aquosa a partir da qual a lipase é recuperada. A actividade maxima de lipa-se bo solventes orgânico coincide com o pH optimo da actividade enzimatica em água (ver Zaks et al_, Proc.Natl.Acad. Sei. USA 82:3192-3196(1985). Foi também demonstrado que uma carboxipeptidase serina, como seja, a carboxipeptidase Y derivada de levedura pode siantetizar um peptideo a partir da reacção de um êstet ou arnida de aminoãcido ou outro subs-tracto com um aminoãcido ou outro componentes amina (Patente U.S. No.4339 534).

Enzimas tais como APH podem funcionar bem como cataiisadores em solventes orgânicos incluem (1) uma escolha correcta do solventes (sendo pre-feridofi os hidrofóbioos se não removerem a camada essencial de agua da molécula de enzima); (2) a utilização de uma enzima recuperada a partir de uma solução aquosa do pH optimo para a actividade enzimatica; e (3) eliminação das limitações de difusão por agitação vigorosa e dispersão fina do pô de enzima no solvente orgânico (ver Zaks et al, 1986).

Os reagentes na reacção de condensação catalisado por APH sao polipeptideos aceitadores e.g. proteínas com um grupo terminal N^· livre em um substrato tal como um derivado de álcool benzílico de um aminoãcido acilado. A concentração de subtracto necessita de ser sifi-ciente para que se dê a reacção de amino-acilação. 0 sol- -31-

vente escolhido ê um gue seja hidrofôbíco e que não remova a camada essencial de molécula de âgua que rodeiam o enzima. A APH, antes de ser colocada no solvente, ê recuperada da solução aquosa do pH optimo para a actividade enzi-mética. A dispersão do pô fino de APH no solvente e agita ção forte soa usados para ultrapassar limitações de difusão (Zaks et al_" J.A..Cherc. Soc 108:2767-2768 (1986)).

Em adição o ambiente orgânico facilitará a extracção da APH devido â insolubilidade da enzima em meios orgânicos (Zaks et al, Proc. Watl Acad. Sei. USA 82:3192-3196(1935)). APH pode ser suspensa no seu pó fino hidratado ou pode ser imobilizado num veciculo. A estabilidade das enzimas em relação a agentes inactiva-dores, tais como álcoois mono-hídricos ê muitas vezes aumentada por imobilização. Foi demonstrado que a tripsina e alfa-auiraiotripsina, quando imobilizadas num complexo inso lúvel de alêmina-fosfocolamina, apresenta notável resisten cia a solventes orgânicos, incluindo álcoois mono-hidricos misciveis em água (Pugniere et al, 1986). APH podem ser imobilizada por-metodos conhecidos em esferas ou outros veículos, os quais podem então ser usados em bloco ou em colunas.

Tendo descrito de um modo gerai este invento o mesmo será melhor compreendido com re ferencia a exemplos específicos, os quais aqui são incluídos apenas com fins ilustrativos e não peetendem ser 1i mi -tantes a.menos que seja especificado. -32-

EXEMPLOS

Exemplo 1

Extrscção e purificação da Hidrólise de Acil-peptideos ÍAPH)

Materiais DEAE.Sepharose CL-6B, colunas de FPIC (Mono-Q HR5/5 e MOMO S HP.5/5). Sephacryl S-300 superfina, Octii-Sepharose e Polybuffer 74 foram da Pharmacia. A coluna de Spherogal CAA-HIC (0,46 χ 10 cm) foi da Beckman. A hidroxilapatite (Bisflcl HT) foi da Bio-Rad. 0 glicerol foi da BRL. Reactigel 6* foi da Pierce. Os aminoácidos (Ac-L-Ala) foram da Signa. Todos os outros produtos químicos foram grau de pureza reagente ou melhor.

Purificação da enzima APH foi purificada a partir de 300 g de fígado de rato (macho, estirpe CD) corno descrito por Tsunasawa et al, u.Biochem. (Tokyo) /7:80-102( 1975), excepto no que respeita â substituição DEAE-celulose e Sepharose 6B por DEAE--Sepharose CL-68 e Sephacryl S-300, respectivamente.

Os tamanhos das colunas e os gardientes foram também alterados. Para a cromatografia em hidroxilapaptite o gradiente de partida foi de tampão fosfato 5 mM em vez de fosfato 20 mM e usou-se 10¾ de glicerol no gradiente.

Durante a cromatografia em DEAE-Sepherose CL-68 observou-se um aumento na activi-dade total. Para confirmar a homogeneidade da proteína da coluna de Sephacryl S-300, efectupu-se uma cromatogra-fia adicional: (i) cromatografia de permuta ionica com o -33- sistema de FPLC Pharmacia ern Mono Q e Mono S com vários tampões a pH entre 5 e 8; (ii) cromatografia de interacçSo hidrofôbica em Octil-Sepharose e Spherogel CAA-HIC ; (iii) cromatofocagem em Mono P com Polybuffer 74; e (iv) cromatografia de afinidade usando Ac^L-Ala-Sepharose, preparada a partir de Reacti-Gel 6x (Pierce) e acetil-L-alanina. Em nenhum dos casos foi observado outra separa ção ou aumento de actividade. A purificação estâ resumida na Tabela 1. TABELA 1

Purificação da Hidrolase de AciI-peptideos de fígado de rato

Proteína (mg)

PASSO

Actividade (unidades)

Actividade rendi-Purifi_ especifica mento cação (unit/mg) (%) 1 Homogenato 194 44200 0,00439 00 2 12000 x g 194 39400 0,00492 100 h 12 Sobrenadante 3 ' Sulfato de amó- 150 25400 0 r 00591 77 1, 35 nio (20-50%) 4 Tratamento;-p/calor 139 2520 0,0552 65 5 5 DEAE-Sepharose 208 29.3 5,90 7,10 25.1 108 1630 6 Hidroxilapatite 148 76 5780 7 Sephacryl S-300 118 4,04 29,2 61 6090 -35-

Exemplo 2

Sequenciação de aminoâcidos de fragmentos cie APH tripti-cos e de brometo de cianogênio.

Materiais APH foi purificada corno no Exemplo 1. A pureza foi confir mada por electroforese em gel de SDS-poliacrilamida pelo método de Laemmli; Nature 227:660-685 (1970). -As medições de UV foramlobti dos usando om espectrofotômetro de UV Hewlett-Packard 8450A. A quantidade de proteína foi determinada pelo mêto do de Sradford, Μ.M. (Anal. Biochem. 72:248-254(1976) usan do albumina de soro bovino como padrão e expressa em nrnol de subunidade de hidrolase de aci 1-peptideos de figado de rato, assumindo que 1 mmol de enzima se refere a 1 nmol de subunidade de M -80000 da enzima (Kobayashi, K.e.

Smith, J.A. J. Biol. Chem. 252:11435-11445 (1987). âs amostras radiocativas foram contadas num contador de cintilação Beckmann LS3801.

Brometo de cianogenio, guani.-dina-HCl, 2-mercaptoetanol, acido trifluoroacêtico (TFA) foram adquiridos à Pierce. 0 acetonitrilo (grau de pureza para HPLC com absorção de UV a 188 nm) foi de J.T.Baker. -36-

A tripsina tratada com N-to-sil-Fen ChgCl foi aduirido aí Worthington. 0 reagente Bradford para o ensaio de proteínas e os reagentes para electroforese foram adquiridos â Bio-Rad, excepto os marca dores de peso molecular e Tris, os quais foram adquiridos à Sigma.

Zwittergent 3-14 foi da Cal-14 biochem e o acido Γ -Ç7 iodoacético (9,8 mCi/mmol) foi da New England Nuclear. Todos os outros reagentes foram do maior grau de pureza disponível comercialmente.

Análise dos aminoácidos A hidrolase de acil-peptideos foi dialisada extensivamente contra ácido acético 0,1M, 1iofi1izada e hidrolisada a 110°C durante 24 h e 48h em 6M HC1 contendo 0,1¾ de fenol. A 110°C da composição em aminoácidos foi determinada usando um Analisador de Aminoá eidos Beckman (ver Moore, S, Em. Chemistry and Biology of Peptides, (Meinhofer, J.Ed), pp.629-652, Ann Arbor Science Ann Arbor MI(1972) (Tabela 2). 37-

TABELA 2

Composição em aminoácidos da Hidrolase de Aci1-Peptídi os de figado de rato A composição teórica foi determinada a partir da sequer^ cia primária deduzida da sequencia nucleotídica na Fig.3 A composição observada foi calculada por analise de amino£ eidos de Hidrolase de Acil-Peptideos de figado de rato purificada (N-3). A composição observada foi calculada assumindo uma subunidade Mf = 80,000.

Aminoácido . -Teórico. Observado Asx 57 55 Thr 29 29 Ser 67 64 Glx 80 84 Gly 54 52 Ala 45 45 Vai 61 61 Met 19 15 Ile 24 23 Leu 75 77 Tyr 24 26 Phe 29 36 His 19 19 Lys 30 31 Arg 34 34 Pro 50 65 Cys 19 NDa Trp 16 ND TOTAL 732 a

Abreviaturas: Asx = Asn + Asp; Glx = Gin + Glu; ND, não determinado. -38-

Redução de pontes dissulfureto e alquilação com ácido iodô acético APH de rato purificada (3 mmoles) foi dissolvido em Tris-HCl (pH 8,5) contendo 7 M guanidina HCl/2mM EDTA e reduzida cpm 8-10mM 2-mercaptoe-tanol em atmosfera de argon à temperatura ambiente durante 12 h ou a 37°C durante 3 horas. A mistura foi adicionado (0,19 ml) de ácido Γ ^Ç7iodoacético (2,6 umoles)em 30 ul de 0,5MTris-RCl (pH 8,5) /7M guanidina HCl/2mM EDTA) e a reacção decorreu durante 1h a 37°C no escuro.

Adicionou-se então 2-mercap- toetanol para uma concentração final de 0,2M. Removeu-se o sal â proteína por precipitação com quatro volumes de acetona/metanol (3:1 v/v) ou por diáiise contra 0,1M ácido acético e 1iofi1izou-se numa concentraçao/evaporador Savant.

Clivagem com brometo de cianogénio A proteína carboximetilada foi dissolvida em 7-¾¾ de acido formico (0,1-0,2 mol) ao qual se adicionou 10-15 μ\ de solução de CNBr (100 mg/ ml) em acido formico a 70¾). A mistura foi incubada à temperatura ambiente durante 24 h e seca sob vacuo após diluição com água. Os fragmentos peptidicos obtidos por clivagem com CNBr foram precipitados por HPLC de fase reversa (RPLC) ou por 1iofilízação num concentrador/evapo-rador Savant ou ainda fragmentos pôr digestão triptica.

Digestão com Tripsina A mistura bruta dos pepti- deos CNBR (3mmoles) foi dissolvida em 0,2 ml de bicarbonato de amonio 0,2M contendo 0,2¾ de Zv/ittergent 3-14 e digerida com Tripsina (50 pmoles) tratada com N-tosil-Fen CHgCl durante 20 h a 37°C„ 0 produto da digestão foi seco sob vacuo e dissolvido em 6M guanidina HC1 em 0,1% TFA para purificação por RPLC.

Purificação dos fragmentos peptidicos por HPLC de fase reversa

Os peptideos foram purificados por RPLC num sistema de HPLC beckman 344, usando uma coluna C4 (Vydac, 0,46 χ 25 cm, partículas de 10 microns com 300A de poro) para fragmentos CNBr ou uma coluna Phenyl (Vydac, 0,46 χ 25 cm, partículas de 5 micron com 3008 de poro) para os fragmentos tripticos. A mistura de peptideos bruta foi aplicada numa coluna equilibrada com 0,1% de TFA e eluida com um gradiente linear de 0-80% de acetonitrilo em 0,1% TFA (para peptideos CB/R) em 160 min a um fluxo de 1 ml/min.) Uma mistura de peptideos tripticos derivada de uma mistura bruta de peptideos CNBr foi aplicada como descrito atrás e eluida com um gradiente linear de 2-60% de acetonitrilo em 0,1% TFA em 180 minutos a um fluxo de 1ml/min.

As eluições foram escolhidas e controladas por absorvância a 2/4 nm e a 280 nm. Cada pico foi colhido manualmente e, se necessário, ainda purificado por RPLC isocrática usando a mesma HCl-0,1% TFA. A concentração óptima de acetonitrilo para a separação dos peptideos de cada fracção foi calculada a partir do padrão de eluição da primeira HPLC (ver equação de Wong et aU Proc. Natl. Acad. Sei.USA 82:7711-7715 (1985).

Sequenciação dos peptideos

As analises de sequências peptidicas foram efectuadas usando um Sequenciador de Proteinas Applied Biosjsstems 470A e um Analisador Pth Appliet Biosystems 120A (ver Hewick et a_l_, J. Bioí. Chem. 256: 7900-7997 (Tabela 3).

OftBEP*Sc3S3ESV 41- Η od «Μ θ'

ANALISE DE SEQUÊNCIAS PROTEICAS O I φ ί- 03 XJ CG Ό L-4 ζ Ο 03 03 P υ Φ ε ί- I ΙΛ CL Ό 3 05 ί- ΙΌ φ ε •Ν Φ Ο 1—1 a. ο Ρ φ Ό ο 3 ο ο. ο Ο ΙΛ φ ΙΌ ΙΛ ΙΛ O ε Q. ο Ό Ο Ο φ Ό ΙΌ ί- C 05 ε 03 Ο φ •fH • <σ 3 > ε ε V) > •Η ε ο VO •Η φ ί- φ C ΙΛ S- ι-Η ο φ ΙΌ |.Λ ο Ό (Λ C/5 ί- ro ο Ο Ο Ρ φ Ό Ο σ Φ o Ό CD Ρ ΙΌ Γ—4 P > α. Ρ • •rH Ο ·»Η ΟΖ υ ο ΙΛ ί- Ρ ί. φ > 03 υ C φ ί ρ •1—1 </5 φ Ό ο φ Ρ Φ Φ ε ο. Τ3 •Η Ό Ο) Ο Ο CO _1 ο ΙΛ φ Ρ Ο ί- α. Ό Ο ο. θ ε Ρ αζ 03 Ό φ α: ο υ • ι—1 ί ο ε ί •ι—1 Ο φ 3 ο Ρ «Ο ο Ό ΙΛ ο. •Η ο Ρ Ο CQ ί- C C Φ Ό Ο ο 3 Ή φ Ρ Π3 • · "Ο CL ε ε C •Η Ο ΙΌ <υ •fH φ υ !ίΟ υ Ο ι Τ3 •—ι C Ο" •Η ο £2 C "Ο Φ ΙΌ Ρ •Η *Ρ Φ 03 3 υ •ΙΗ Ρ Ο- ί ί- CT •Η ί- Cl 05 φ Ρ 3 Ή Φ ο <Λ ·»Η CL 5- Ό Ο ί- Ρ 03 Τ3 CU 3 Ο Ο ίΉ Ο. υ Ο «σ 3 (Λ C0 φ υ* Ο 03 ο φ Ρ Ό 03 ~Ό τη CL Ή ί- 03 ΙΌ «0 ε ρ φ (J > > φ ί- CL ο. •Η •ιΗ 05 Ρ Φ 3 Φ ί- ί- «3 Ο. υ ΙΛ φ Φ > ο φ ο •σ •Η φ ε !_ 1—4 Ι—Η ο 3 03 ΙΛ ε U •ι—1 < 3 ΙΌ «ο Ρ - θ' ο ί- Π3 CL αζ •fH Ο Φ '— • «Ο JC 4- ε Cl Ρ ί- Ό 1—4 ο ο 00 Ο ΙΛ ο ε Ζ ΙΛ Ο Ο 3 φ Ο Φ Ο ο ΙΛ •Η ο - <Λ Ο Φ +"* ί ΟΖ • - Ο ε 50 ο. ο 1 ο φ ε ο •Η ο CQ Ρ Ό CL U ϊ- Π3 Ο α. •γΗ 03 Ρ αζ Ρ ε ί- φ • - ο. φ Ρ Φ Ό Ο Ι φ Ρ Ο Cl 03 ΙΛ αζ ΙΛ ο. Cl Ο 10 CQ Ο ΩΖ Φ 03 Η ζ Ό Ο Τ3 Ο ί- ο <53 ί Ό •fH 03 υ ο 03 03 Ό > (Λ •Η CL υ Ρ C Ο Ρ Ή 3 •ΓΗ 03 Φ •rt ο Ρ ί- σ Ρ Ό •Η Χ3 ντ3 ε •fH C 03 ϊ- Ρ φ Ρ φ υ 3 03 ΙΛ Ό Q. Ό Ή Ο. ί- Φ C Φ •Η Ρ 3 Ο Ο. •ιΗ αζ Ρ Ο ο. Ο ί- ca </5 > ΙΛ !Λ !Π3 3 ζ •Η • «Η Φ ο ΙΛ CL ο ε Ρ 1- 04 η 04 ΙΛ ΙΌ 04 •Η OJ ϊ- <ο ΙΛ ΙΛ 04 Φ Φ Φ Ο C 04 - 03 Ο Ο f— •Η Ρ Ό3 co ί ο cn lo Ο <Λ fP L. < •Η 1—4 w— Ο t- r\j ο >- co Ρ ε Ό *“ α- Cl α: — -* 3 fP O co φ ο cn _j Ό > r~ •1—4 Q Kl ΙΛ Ρ c Kl 03 03 Ό Τ3 *— 03 03 <0 o > 1- >4 •Η 05 Kl ί- Φ αι Ό α Kl Ό Ο OJ < Kl Φ 1—4 Ρ Ο D O C «»Η —' o φ Ο O ε Ρ- T— 4—4 ο c O 03 3 Ό •fH o co - C Ο 03 *53 o o ε ο C Ι- Ου Kl 1Λ •Η o 03 • ε D Ό •Η ο !03 < I O Kl JC Ο” χζ CO 1—4 03 Ρ t- o Ο υ Ο *γΗ Cl o </) Kl Ρ S- ΙΛ •Η D >» Φ ί. O IO ΙΟ 3 p OJ Ο" α. o ο D IA 03 ί- OJ co ί- Ο -J C\J Ρ •Η LO ί- o V) Φ α O 03 Ρ > rsj fH <Λ NÍ ί- Ο C C0 Ό3 α. —> LO > 03 Kl O OJ ΙΛ ί. C7) Ό «53 03 L_ o CL < ε OJ φ D θ' Ό nT C O OJ Ο r> CL Ο • • ΙΛ Ό Kl Φ V-4 ί. Ρ , ί. CL fv. Ο Φ Ο α. cn u

X o CQ X Os «0 X Kl Os X Ό 03 Leu 20 >"sT — OJ O c- m -C 04 b~ — OJ o D *- «*· r* O t~ o. >-r- b- — co <Q 04 > C l n 22 L τ-Ο «O cn L 04 JC lo f- c o «Λ OJ -c t_ -C f— LO >*Kl —* LO o Λ3 nj· > «J T— — IO < 3 O — -J· o Ο Ό U -J“ Cl Kl <0 T-> Pro 51 >sO — Ό O 3 CA —· OJ O Gly 107 <0 Ό —' LO < 3 CA CJ Kl _i Leu 63 Φ Kl JC Ό a. 41 IA JZ OJ a. Cys 107 — o 01 Os > C N- — OJ o <0 Ό — N < — N- <0 *o. > > Ala 80 i~ sO OJ co 01 f 3 OJ — LA u t- Kl Cj Ό C/3 f— σ> co c_ < Ο.Ό cn < ·- 3 Oi — 'ί-Ο cn in >*KI Leu 93 C Os - Kl C3 — fp u >*co —* fp o 3 fp —· Kl u L- Kl Cl pj· cn <_ f— Os 03 Q.N- «Λ LO < L. C0 O o cn t— 3 4A CJ «sj· Pro 119 as <- Kl ♦— m sr ·— co X — GO <0 o > f « »4 —* CA < Gin 152 3 Os — N C3 f- «J T- r Oi a. T- c OJ JC Os *— C Ό CJ fp </) σ» co fp < U .c Ol Ό — Kl β Kl > «- >· Ό — OJ o «- 3 IA CJ co -J L. -sí a> o tn κι <Λ N. X f- 3 O O 04 —J OJ >sO — Os o cós cn < L eu 21 —* io 10 CQ > ·*“ <- co >-o « co — Os < Cl Kl J= ssí a. *- >-(\J ID >r* í- o JC fp ►— *— C co —> OJ O OJ W Os >ssj _J T— c. o CJ P? cn ·- CS 16R18. 19-c Kl az fp QD CJ IP O* oc P. CD u «o θ α: •p CD o Kl Kl a * fp CD CJ

42- I

O ε CL a >«o TJcus- cn <11 T3 TABELA 3 (CONT) υ »1*·! OS.0 Ό •fHυνα Ο e *HEco 1 XI +JD. o UJ O i—i ΙΟ. LU CL. - Ti

O < •s. se « O O- X tn «0 X o €0 87X £1 < zc X CM O X co CO X CO co C LA O 'í CM O (M — fM f- K» Cl co co Ο Ό C- α 3 Ό to to «M « o. —- cg < Xco — co o • • 1 3 -T 41 _< CM CM —'* IA 40 > 3 O* 05 CM (D Ό —» t— < t- CD Ό C Cl o CM ; i- (Λ O sf CO CO T— —' co < D ΤΟ (0 IA < O CM C LA O >»fn — fo C3 c- O JC τι— ♦— 3 Κ-O 3 m o CS </) Ό =C Q.O iA im < 3 O o r- 3 CA ci Cl fs. x: τα CQ >* Ό O t- CO ω is. co t- o O fs. CO t- C_ N. Cl co 4 fM — O <0 T-> — <s ca > 3 —τ Cl v— ! — Ό <0 > 3 ΤΟ T- Ό C T- (/) «— < C CS w < D το rs _1 Cl m — m ; Q. r- to < A >- N. L3 ; 3 <M — O O c. cg O sj CO CM U LA Cl »-V) <0 fs. —' iA < •si O CSI i_ τα Cur to < <Λ *0 >-fn O T- >O — eo O CM — o <0 «— > C- CM 1— m 3 O 01 T- O co l. τα </} IA >T-_J T— Ctlm Br L *r-JC -y ·— ro *_ sO Cl T-co c rn o fM I- o Cl T- ΟΊ 3 m 01 <M _l <0 θ' > τ —' la O T- C CM O (M C Ό O (0 (Λ > T“* 3 ST 01 T- _J «Λ t— >*fM O α co — o O fM >"0 O CM C_ CM .c m i~ -y 3 O — CM O c m «Λ t— < O 0) >S» t_ Ό O -y cn O T- L. ΤΑ. m <_ O Cl *— co τ- 0.0 v) m «c m 3" 3 sr —» to o θ' t_ CO 01 T- co C LA v» fM < ci -r —» LA — fM co Ό >- sy 3 »A Cl co —1 fM CO .y > sr >"0 — CM O C LA O eo CL CO W IA < t— -y OJ st CO t- co >"í m <- OJ .e ts. s- *— CLro <o o < T- (0 co —’ la < LA o o *- M O. CL O LO IA < fs. c co o c. Ό >· sy r- tn m >*r*- -j in i — ia «} vj- > fM to N JC o CL Sí O o u sT α O CS C- α τ Ό > o —' m o O fM l- Ό a 41 IA — Ό — ΓΟ Phe 277 L «- >HT- 1— vT 3 Ό Cl CM —i ό O tO *- -y α ο ΙΑ «- CO α τ IA O CM c τα τ- oi r-gr to α oi m xr ia a O Kl c. O a st Phe 293 o O >» O f— v} 0.0 tfí O < CS 3 st to to ο ο t- CM α τ- Sj* Ο Sí t- o α T- >·. m w θ' <D >-K> — Ό O c- o o o co Ό Ser 152 3 ΙΛ Cl LA —i 'Μ C T-— s- o vr to *a -c cn Q. * • m « LA x: m ♦— t- o J= o 10 T- S sy -J Ό 3 Ό O ro α: *o - *í < M cn cm L (A < rv >»K> — 03 o 3 fM 01 «ο fM 3 CO ei m _l T- l_ 00 01 fM CO 3 fM — M O ατ- tn Ό < m A 1 a 535 U <M Cl «o CO t— u X Cl — </> e — Is. <0 LA > — CO «D LA > fM <d m > T- ( — o <0 cs > T- 3 Ό o o -> Ό LA θ' oe o la cc 03 o QC Ό

U S

CD O

CO O

» O co . ·— CO 03 ·— O .

• -O co ·

O co CJ cc o 05 fs. o — CB/R60 -43- σο η < _ι 1x1 CQΡΕ

οαο > »Η 4- * (Ο •σ «α 5-D) φ α ο (™Ί υ «Ηο ο Ό •Η α ο C

4-3 CL Ο LU Q ΗΗ ί α. UI α. « X X 1 CVJ CO Ο •1-4 ο Ο C0 CO -Ρ Ο C0 ^ ρ CM & L 0% (Μ Ο CM <Λ

3 Os ρ- Φ CM .J φ α. 0) Ι Ο Ρ C φ ε «ιΉ Τ3 C Φ %- α > •ι-Ι Ρ «3 σ (Ο s- σ> φ Ό «λ κι Φ Os X o — _> fM — ο ο p ·* ρ τ Ο Φ T- α. «r- CO (— >τ • >S*“ CO « *- T~ 1 3 «3 C m Ο CM fs--- — T- O 3 Ο >sO* Ο ΚΙ Ό —- <M _1 *- o 3 Ο Φ Os Φ fM Ο fM JZ ΙΛ£Μ _I α. -r- G_ σι r- Ρ *ί >*Os Ρ τ- φ ιη V» —» fvj < ιο «— O —» Ν Ο.ΓΜ P r— α ÍM (Λ ΙΛ κι x: ím > < P l— Ο νΤ Ρ Ν ρ κι ρ K Ρ Ν Φ ΚΙ Φ *sT CVJ Φ Kl α. 00 C0 P- C0 —> Ν. D S4· xm >» Ό <0 tn w ιη -ρ Ό ·— —· VT > ο C3 o C Ό cd τ- 3 Kl i ιη ιη —· ιη Φ m o · < < _ι * σι ο 3 ιη «I Os p Os Ρ.Κ1 ιη ♦— Ο >S sj < ο X Τ- Os y— <Ζ> νΤ -- Ν- Ρ C0 —- U1 <ο m X CO « < > *— co » (0 ο 1 w r- —' o >·νί 1 **- Kl co m 1 X p- Γρ > 3 h- Ρ ν0 3 ví 4 C Kl Φ CM Φ Ό Φ fs- « o —* -j C0 _l Ό i Kl O α cm 3 si ακ 3 Kl t w Ό Φ C0 P NÍ φ h- Os · < -J H- in -J CM · σι (Μ α ο 3 *- —* eo >*in Ρ Ό — ο· Φ Os CQ ΙΛ co —* p- C < _J S* > CM O ρ ο <Λ ρ- W < co p- —' So >»tn — κι CQ Ό — Ό fs- IQ »— X > T- Kl c CM > Ρ Ν. C Ο* Φ Ό Φ o C Kl >-ΙΛ (Λ τ- —* O JZ >o Ό «1 N *— < «" < <M cm a. <M < Ε Ο 3 · #"*Η c υ S- Ρ-ι-ι (0 0-0 3 Ο φ Ο Ό -Μ í—ι (Ο C/7 (Ο > Ο) Ο —t C S- (Ο Φ Ο Ό Τ3ίο ta ο. ο υ ο ο'ρ ό *σ—ι (Ο (Ο ρ 3 Ο C cr-r-i φ φ ρ-σ Ό "rH *rí (Ο Ρ C Ή Ο Φ Ο ί(0 ό ι^-ε ·«—· < οά —. «ο %. ξ: c(- V) α Χ3 (Ο ο *£Ζ •Ρ •α. ·« ο * Ό ρ π> —i -.3 Ο Ρ Ό ί(0 C V3J Ο· ΦΕ« Ό ιη ·<-ι ο Ο _ > α. «υ -Ω Ε (Ο ρ (Λ Ο 3 Ό Ρ (Ο c 4- 3 φ ο Q.TD φ Ή 5— 3 I—! Ο Φ Ρ C£ Φ Ρε ο- 10 φ 5- σ ο U) CO Ο φ (0 ί- S- > Ρ '-Η 3 >> S-Q C£ φ • *ι-Γ3 D Ο — ο C3 Ν Α- <Μ Φ fs-co «— C Os Ο) Ό < *“ >» Ό ΙΛ —- τ~ fM Ο co cu Ό

r. O X > E •rH •rH E P Φ · 3 (Λ CT ro s- (0 3 O P *rH 10 X} •rH c > Ή Φ í- Q. J3 .S- < !— (0 .O

TABELA 3 (CONT)

Π3 •fl O 3 cd cr 3 <U 40 40 ca ra Ό o P s- c • rl cd P P u c Cd cu O. o ca c «3 3 T3 o N =5 40 T3 •ri 0) P a cu (0 "O o •H Cd <u •o P cd o o ί •ri ο. P •ri <3 TD •ri o O ε c cu Cd 3 ε cr ί cu ο co P • cd cd cd Ό c ε cd 3 c 40 •i—I •ri cd ε P P í- c <u o cu P 3 40 CU Ό cu Ό •ri ί 40 ο. cd <u CU a s- ί c ‘rt ε α» íO 3 P c •H 3 cu o O ε P i- M P CU o c > «d o vd c o > c ί Cd cu ο o a • H cu ε </) a •H ,í- 3 cu 1— cr 3 cr Cd ft í- N <c 3 cu s P > O 3 o $- Cd P CU 40 -5 T3 CU -45-

Exemplo 3

Preparação de sondas

Construção de sondas

Sintetizaram-se dtiias sondas de oligonucleotídeos degeneradas e sobreponíveis, YS20.1 e YS17.2 (Figura 2A), derivados da sequencia de aminoãcidos do peptideo CB18-R11-13c (Tabela 3) e usaram-se para o despiste de uma biblioteca de cDNA de figado de rato em ^gt11. As sondas oligonucleotidicos e os iniciadores foram sintetizados com um sintetizador de DNA Applied Biosys-tem 380A usando fosforaihidetos de B-cianoetil(Sinha, N.D.^eta^, Nucl. Acid. Res. J_2:4539-4557(1984) e purificados por electroforese em gel de poliacrilamida de acordo com o Manual da Applied Biosystems por precipitação com etanol a partir de uma solução de oligonucleotídeo contendo 10mM MgClg. YS17.2 e YS20.1, respectiva mente conjuntos representam oligonucleotídeos 128 vezes degenerados. As sondas YS17.2 e YS20.1, tinham 17 e 20 nucleotideos de comprimento, respectivamente. As doas sondas sobrepoêm-se 12 nucleotideos, de tal forma que a utilização sequenciada das sondas para fazer o despiste da biblio teca de DNA faz um despiste eficaz de um pedaço de 25 nucleotideos de DNA codificador de APH. -46-

Preparação de RNA Fígado de rato da estirpe CD foi rápidamente congelado em aa.oto liquido e descongelado em isotiocianato de guanidina, e o RNA foi purificado por centrifugação em CsCl (Chirgwin et aj_, Biochem.18 :5294-5299 (1979). 01 rendimento foi de 60 jug de RNA. Seleccionou-se RNA Poli(A) + por passagem de RNA total através de uma coluna de oligo(df) celulose (Aviv, H. et aK Proc. Natl. Acad. Sei (USA) 69:14 8-1412(1972). Obteve-se quarenta e cinco pg de RNA poli(A) + que se verificou não estar degrada^ . do por analise de transferencias de RNA de 1 /ug de RNA e hibridando com uma donda de cDNA da actina (Spiegehman, B.M. et al, J. Biol. Chem. 258:10083-10089 (1983).

Preparação da biblioteca de cDNA

Sintetixou-se DNA complementar a partir de 10 jug de RNA (Poli(A) + pelo método de Gubler, U. et al_ (Gene, 25:263-269( 1983) e clonou-se em / gt11 (Young, RA et aK, Proc. Natl. Acad. Sei.(USA) 80:1194--1198 (1983)), como foi descrito por Klickstein, L.B. (Em: Current Protooolo in Moldcular Biology (Ausubel, f.M. et aj_, Eds), pags 5,8,4, Wiley-Interscience and Greene Publishing Associates, New York, NY (1987) A produção de recombinante foi de 4 milbões a partir de 100 ng de cDNA é 10 /jg de DNA ê 10jug de DNA de Λ gt 11. A biblioteca foi amplificada em E.coli estirpe Y10088(6IacU169, supE, supF, HsdR-,

HsdM+ , metB, trpR, tonA21, proC:Tn5 (pMC9) e guardada a4°C. -47-

Isolamento de clones de cDNA A biblioteca foi semeada a 6 25 000 placas de placa de 150 mm(para o despiste de 10 ou menos placas) ou a 10® placas por placa de 225 mm χ 225 mm(para o despiste de mais de 10® placas) e obtiveram-se filtros de transferências em duplicado para cacLa uma ^Maniatis, T et al_, Molecular Cloning: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1982).

Para o despiste com oligonucle otideos, os oligonucleotídeos foram marcados no extremo 5' para uma actividade dspecifica de 2-8 χ 108 cpm//ug qo ' com /S - P?-ATP e polinucleotídeo-cinase de T4 (Zolier, M. et aj_, DNA 3^:479-488 (1985). Os filtros foram hibridados com oligonucleotídeo com 6 x SSC, 0,1% SDS, 0,1%SDS, 0,05% pirofosfato de sodio, solução do Denhardt 1 χ e 100 jgg/ ml de DNA de esperma de salmão a 65°C durante a noite.

As Td max e Tdmin foram calculadas para cada mistura de oligonucleotfdeos com a formula : Td = 4(G+C)+2(A+T), como prêviamente descrito para sequências curtas (Suggs, S.V. et £l, Em: Developmeotal Biology Using Purified Genes (Brown, D. Ed). pag.683-693 Academic Press, New York,NY (1981). As sequências foram lavadas a temperaturas progressivamente mais altas em 6 χ SSC 0,05% de pirofosfato de sodio, e 0,1% de SDS até estar reduzida a ligação inespecifica.

Para o despiste com sondad de cDNA (fragmento Xmnl-Kpnl de APH5.2 ou fragmento Bamll-Pstl de APH36-1; Figura 2B) os filtros foram hibridados durante a noite com sondas sujeitas a "nick-translation" em 50¾ de formamida, 5XSSC, solução de/ou Denhardt 's fosfato do sodio 10rnM, 0,1% de SOS, 1mM EDTA, e 50 ug/ml de DNA de esperma de salmão desnaturado e sonicado a 42°è Os filtros foram lavados em 0,2 χ SSC, 0,1% de SDS, fosfato de sodio 1mM, pH 7,0 e· 1 mM EDTA a 55%C. Os filtros lavados foram expostos a filme Kodak XAR com um écran intensificado a -70°C. Os fogos que deram sinais em duplicado foram puri^ ficados por placas em ciclos repetidos de despiste.

Análise de sequencia de DNA

Fragmentos de restrição de APH5.2 e APH 36.1 foram subclonados em M13mp18 ouM13mp19 e sequenciados pelo método de terminação de cadeias didesoxi-nucleotídicas (Sanger F. et al., J. Molec. Biol. 94 :441-448(1975). A sequencia de alguns clones foi obtida cons-truiddo primeiro mutantes de delecção usando exonuciease III(Henikoff, S. Gene 28: 351 -356 (1984). A inserção de cDNA do APH2.7 foi subclonado no plasmídeo Bluescript (Stratagene) e sequenciada pelo método de terminação de cadeias didesoxi, modificado para sequenciação de cadeia dupla por Guo et al.,(Nucleic Acid. Res.12 :387-394 (1983) Os resultados de sequenciação de DNA foram analisados com os dados do University of Wisconsin Genetics Computer User Group (Devereaux, J. et aj_, Nucle. Acid. Res. 12: 387-395 (1984).

Clonagem e Sequenciação de cDNA codificador da Hidrolase de Aci1-Peptideos de Figado de Rato__

Encontrou-se vinte e sete de 45 0000 clones recombinantes que hibridaram com a sonda YS2Q.1. Doze destes clones foram novamente despintados com a sonda, YS17.2 para dar um único clone, APH 5.2, contendo uma inserção de 1,3Kb (Figura 2B). A sequencia de DNA de APH 5.2 codificava toda a sequencia peptidica do peptideo triptico CB18-R11-13C confirmando qee APH5.2 era um clone autentico. Uma vez que APH5.2 continha uma sequencia poli(A)+ no seu extremo 5' (Figura 2B, rectan-giilo sombreada com 1 inhascruzadas) provavelmente um artefacto criado durante a construção da biblioteca de cDNA, usou-se um fragmento XmnI-Kpnl de APH5.2 para fazer novo despiste de um milhão de clones da mesma biblioteca de cDNA e obteve-se o clone APH36.1, contendo uma inserção de 2,5kb (Figura 2B). A sequencia proteica deduzida a partir de sequências de DNA de APH35.1 continha todas as sequências proteicas na Tabela 3, excepto os tres resíduos de extremo amina do peptideo CB17-R13. No entanto, o seu extremo 5' continha um fragmento de 120pb codificador de àlbumina serica de rato (Figura 2B, rectângulo com diagonais).

Para se obter os resultados de sequenciação 5' que faltam, usou-se um fragmento BamlI-•^PstI de 220pb (Figura 2B) para fazer novo despiste da mesma biblioteca de cDNA. Obtiveram-se cinco clones positivos com diferentes tamanhos de caudes poli(A) a partir dos 5 milhões de recombinantes. Quatro clones de cDNA, -50-

incluindo ΑΡΗ 2.7, comecavam com a mesma sequencia de núcleo tideos e continham um codão ATG na mesma grelha de leitura, nos nucleotideos 6-8, enquanto que o extremo 5~do quinto clone de cDNA nao possuia 18 pares de bases. Nos nucleotide os 2344-2349 encontrou-se um sinal de poliadenilação, AATAAA. A Figura 3 ilustra a sequencia completa de cDNA de APH, conforme derivadi de APH5.2, APH36.1 e APH 2.7.

Estrutura primária de hidrolase de sei1-peptideos deduzida a partir de cDNA_ A sequencia de DNA completa foi determinada combinando as sequências de APH35.1 e APH2.7 (Fig.3). A sequencia de DNA codifica uma proteína contendo 732 resíduos de aminoácidos assumindo que o ATG nos núcleo tideos 6-8 é o codão de iniciação de tradução. A sequencia proteica deduzida contei todas as sequências peptidicas na Tabela 3 (Fig.;l). A proteína tem um peso molecular calculado de 81 347 e a composição em aminoácidos baseada na sequencia proteica deduzida está de acordo oom a composição observada (Tabela 2). Conforme deduzido a partir de sequencia de DNA, foram identificados tres residu os de aminoácidos 118, 291 e 443 os quais correspondem as posições onde Pth-Trp juntamente com um derivado de Pth que elui na fase tardia (Tabela 3 e Figa.1). -51-

Nos resíduos 134-136, 233-235 e 243-245 foram identificadas tres sequências consensus de N-glicosilação (i .e., Asn-Xxx-Tre/Ser (Parodi, A.J. et al, Biochim. Biophys. Acta 559: 1-37 (1979).

Analise da hidrofobicidade 0 perfil de hidrofobicidade foi determinado usando o algoritmo de Kyte, a. et al (J. Molec. Biol. 157:105-132 (1982) com uma janela de 8.

Asequencia de proteica da hidrol£ se de acil-peptideos de rato foi recuperada com as bases de dados de proteínas National Biomedical Research Boun-dation e Swiss usando os programas Wordsearch e Bestfit da Universidade de Wisconsin Genetics Computer User Group (Deveraux J. et al., Nuel. Acid. Res. 12: 387-395 (1984) e o programa FASTP baseado no algoritmo de Ripman, D.J. et aK, (Science 227 : 1435-1441 (1985)). Para identificar possíveis regiões de sítios activos na hidrolase de acil-peptideos de rato, a suasequencia foi comparada com as sequências peptidicas, contendo os resíduos serilo, histi-dilo ou aspartilo de sítios activos, derivados de protea-ses serina conhecidos. A representação grafica de bidro-fobicidade revela que a proteína contem uma região hidro-filica localizada entre os residiuos 80 e 220, maq, não é claro que se esta região tem um papel especifico mas interações com outras proteínas ou na catalise. A pesquisa baseada em computador de base de dados do National Biomedical Research Foundation e da Swiss Protein não revelou proteínas fortemente homologas. Em adição a comparação entre hidrolase de aci1-peptideos de rato e peptideos cur tos do centro-activo, contendo serina3 histidina e ácido aspértico, derivados de proteases serina conhecidas não revelou semelhantes significativas.

Se bem que a hidro lase de acil-peptideos se tenha demonstrado ser uma protease-serina por experiencias de inibição, usando fluorofosfato de di-isopropilo, acetilalanina, clorometilcetona e outros inibidores de enzimas (Kobayashi, K. Smith , J.A. J.Biol Chem. 262:11435-11445(1087); Tsunasawa êt al J.Biochem. (Tokyo) 77:89-102(1975) não se enoaontrou semelhança forte entre a hidrolase de acil-peptideos de rato e peptideos do sitio activo de outras proteases serina, sugerindo que esta enzima pode ser uma protease serina única.

Exemplo 4

Clonagem de todo o gene da hidrolase de acil-peptideos de rato. -53-

Materiais

Enzimas de restrição, ligase de T4, polinucleotídeo-cinase de T4, DNA-Polimerase I de E. coli e o seu fragmento Klenow, trasnscriptase reversa de AMV, exonuclease III, DNasel, RNase H, DNA-polimerase de T4, EcoRI-metilase; fosfatase alcalina de intestino de vitela e nuclease S1 foram de Boehringer Mannheim e New England Biolabs. A RNase A foi da Sigma. 0 plasmi-deo Bluescript, braços Λ.gt10 e extracto de empacotamento foram de Stratagene /"/ -32P7ATP, /“alfa-32P7dCTP e membrana GeneSereen Plus foram adquiridos â New England Nuclear /“alfa ^S)7 /“dATPalfaS foi da Amersham Corp. 01igo(dT)-celulose foi da Kollaboratives Research.

Os oligonucleotideos sintéticos foram sintetizadps com um sintetizador de DNA Applied Biosystems 380A usando a fase solida baseada em sílica. (Matteucci, M.D. et aj_., J. Ame. Chem. 6$c. 103:3185-3191 (1981) e o método com fosforamideto de B-cianoetilo (Sinha, N.D. et aj,." Nucleic Acids Res. 12:4539-4544 (1984). -54-

%

Preparação de DNA e RNA de figado de rato A fonte de DNA genômico de rato e de RNA citoplasmâtico de figado ê figado de rato adulto Sprague-Dawley. 0 DNA de figado foi preparado como descri to por BIin e Stafford (Blin, N, et aJL Nucleic Acid Res. 3:2303-2308 (1976). 0 RNA total de figado de rato foi isolado pelo método de tiocianato de guanidina, como descrito por Chrigiwin e^t a_l_ (Chwigwin, J .M. et a_l_, Biochemis-try 18: 5294-5299 (1979). 0 RNA poliadenilado foi purifi cado por cromatogra#ia em oligo(dT-)-celulose (Avir, H. et al. ,Proc.Batl. Acad.Sci .USA 69:1408-1412(1972)

Análise de transferencia de RNA

Purificou-se RNA como descrito atrás desnaturou-se a 65°C e transferiu-se para membrana Zetabind (Thomas, P.S., Proc. Natl.Acad. Sei. (USA) 77:6201-5282 (1980). As transferências foram hibridadas com o fragmento de cDNA XmnI-Kpnl de APH5.2 sujeito a "nick-translation" em 50¾ de formamida, 5XSSC, solução de Denhardt 5X, fosfato de sodio 10mM, 0,1% de SDS, 1mM EDTA e DNA de esperma de salmão desnaturado e sonicado (50 pg/ml). Os filtros foram lavados em 0,2XSSC, 0,1% de SDS, fosfato de sodio 10mM pH 7,0 e 1 mM EDTA a 55°C.

A análise da transferência de RNA de RNA total, usando o fragmento de cDNA Xmnl-Kpml derivado de APH5.2 como sonda (Fig.2) revelou que apenas um mRNA de 2,7 kb em quantidades sensivelmente equivalentes codifica a hidrolase de acil-peptideos em vários tecidos de rato (i.e. baço, músculo, pulmão, figado, rim e cérebro.).

Isolamento de clones genômicos

Usaram-se duas bibliotecas genômi-cas de rato para o despiste de gene APH. Uma biblioteca foi da Clonetech, a qual foi construída por digestão parcial com EcoRI de DNA de figado de Sprague-Dawley e clonagem em Charon 4A do fago X . Um fragmento de restrição EcoRI de 2,4 kb codificador de APH de rato derivado de APH 36.1 foi marcado por nick-translation (Sargent, T.D. et al, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 76: 3256-3260 (1979) epo

' —- Q /06 - P7 dCTP para uma actividade especifica de 10 cpm/yjg e usando sonda para o despiste desta biblioteca genômica. A outra biblioteca genômica que foi construída por digestão parcial com HaelII e clonagem em Charon 4A do fago foi uma oferta generosa do Professor James Bomner de Califórnia Institute of Technology (

Church, G.M. et a^, Proc. Natl. Acad.Sei.USA 81:1991-1995 (1984). Um fragmento BamII-PstI de 200 pb de APH36.1 marca do por iniciação ao aceso (Feinberg, A. et a_l_, Anal. Biochem. 132:6-13(1983) com /¾ -32P7 dCTP para uma actividade espe Q " “ cifica de 10 cpm^ug, foi usado no despiste desta biblioteca, Aproximadamente 1 χ 10® fagos de cada uma das biblio-

tecas foram despistadas por bibridação de placas (Chrurch, G.M. et al Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81:1991-1995 (1984)

As placas positivas foram purifica das e isolado o DNA fagico (Manie-tis, T.et al,Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Cold Spring Harbor, New York (1982).

Analise de DNA por Mapeamento de restrição e hibridação de DNA

0 mapa de restrição do gene clona-do foi construído por digestão de DNA fagico com varias endooucleases de restrição (Maniatis, T. ejt aj_, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Cold Spring Harbor, New York (1982). Para a análise de transferencias de DNA, os fragmentos de restrição do DNA separados num gel de agarose, trasnsferidos para membrana Gene Screen Plus e hibridados com a sonda marcada com P de acordo com as recomendações do fabricante. As sondas são tres fragmentos de cDNA de APH de rato de APH36.1 marcados com P: um fragmento 5' BanII-PstI de 200 pb, um fragmento kpn-EcoRI de 42o pb e um fragmento EcoRI de 2,4kb. Para a hibridação de transferencias de DNA genômico o fragmento de 2,4 kb do APH2.7 foi usado como sonda.

Sequenciação de DNA

Fragmentos de restrição dos clones genóÈicos de rato foram subclonados no plasmfdeo Bluescript. Ambas as orientações das sequências completa, assim como regiões a montante e a jusante, do gene APH de rato foram determinadas pelo método de terminação de cadeias didespxi de Sanger (Sanger, F. et aK Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74: 5463-5467 (1977), modificado para sequenciação de cadeia dupla (Guo, L. H et al_, Nucleic, Acids. Res. 1 1:5521-5539, empregando estratégias de sequenciação do método de delecção com DNase I (Lin, H.-C. et al Anal. Biochem. 147:114-1 19(1985), o método de delecção com exontuclease III (HeniKoff, S. Bene 28:351-359 (1984) e iniciadores oligonu-cleotidicos sintéticos. Os resultados de sequencia de nucLeptideos foram compilados e analisados pelo Genetics Computer Group Sequence Analysis Software Package, versão 5.0 (Devereux, 0. et al_, Nucleic Acids. Res. 12:387-395 (1984).

Preparação de uma biblioteca de cDNA contendo a região 5' não traduzida do mRNA de APH

Um oligonucleotideo sintético de 17pb, 5' GTGACCTCCGGACCCAG 31, complememntar dos nucleoti-deos 95-112 do APH2.7., foi usado como iniciador especifico para construir uma biblioteca de cDNA em^gtlO. 0 oligonucleotideo sintético (1 ^ug) foi emparelhado com 10 de RNA poli(A)+ e a síntese da primeira e segunda cadeia de cDNA foi efectuada pelo método de Gubler e Hoffman (Gubler, U et al, Gene 25:263-269 (1983). Os extremos de cDNAs -58- foram tornados cerses com DNA-polimerase de T4 e os sitios EcoRI internos foram meti lados. Os cDNAs de extremos cerses foram ligadosa adaptadores EcoRI e apôs digestão com EcoRI o cDNAs foram fraccionados por tamanho numa coluna CL-4B (Wong, W.W. £t aK Proc. Natl. Acad.Sci. USA 82: 7711-7715 (1985). Em seguida os cDNAs foram ligados a braços Λ gt10 e o DNA dos fagos recombinantes foi empacotado de acordo com as recomendações do fabricante (Stratagene) Os fagos recombinantes foram despistados com o oligonucleo tídeos sintéticos, 51AAGTCCCGGAAGTGAGG 3' e 5' CTGACGCTCCA SAGTCG 3' cujas sequenciuas foram derivadas da sequencia (nucleotídeos 585-592, Fig.4) e de cDNA (nucleotídeos 1-17 de APH 2.7) respectivamente,. 0 DNA fâgico com a inserção maior foi purificado (Maniatis T, et a_l_, Molecular Cloning; A Laboratorv Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Cold Spring Harbor New York, (1982) e a inserção foi subclonada no plasmideo Bluescript.

Extensão do iniciador

Um oligonucleotídeo 5' TA6GAGTGAGAAAATCA 3' complementar da sequencia de nu-cleotideos no primeiro exão/nucleotídeos 44-60 Fig.4) foi marcado no extremo 5' com Γ% 32P7ATP e polinucleotí deo-cinase de T4 e depois hibridado com 10 ^ug de RNA poli(A)+ de figado de rato numa solução de 0,1M KC1, 5mM EDTA, tampão fosfato de sodio 5mM, pH 6,8. Para a hi-bridação, a tempertaura da solução foi aumentada para 90°C durante 5 min. e voltou gradualmente para 42°C.

Os hibridos de RNA-DNA foram então sujeitos a reacção com transcriptase reversa. ApósA digestão com RNase A, extracção com fenol: Cloroformio e precipitação com etanol, o produto de extensão com iniciador foi então sujeito a electroforese num gel de sequencia ção de 8% de poliacrilamida.

Isolamento e sequenciação de DNA do gene de hidrolase de aci1-peptideos de rato_

Inicialmente, uma biblioteca de genomica de rato, construída com Charon 4A a partir de uma digestão parcial com EcoRI do DNA de figado de rato Sprague-Dawley, foi despistada usando como sonda, a inserção de cDNA de APH de figado de rato de APH 36-1 marcada 32 com P. Foram despistadas um milhão de placas e vinte e oito hibridaram com a sonda. Todas as vinte oito placas -60- foram isoladas e caracterizadas por mapeamento com enzimas de restrição e verificou-se serem idênticas. Transferencias de DNA dos produtos de digestão com endonucleases de restrição derivados de cada DNA recombinante foram depositadas com as inserções de cDNA de APH36.1, o fragmento Banll-Pstl de 200 pb (extremo 5' de APH 36.1), e o fragmento Kpnl-EcoRI de 420 pb (extremo 3' de APH36.1) e cada um continha um fragmento EcoRI de 9,7Kb, correspondendo ao extremo 3' do cDNA. A um destes clones, APHE5(Fig.5A) foi feito o mapa de restrição, subclonado em Bluescript e sequenciado. Uma segunda biblioteca genômica de rato, construída por digestão parcial com HaelII do DNA de fígado de rato e clonada em Charon 4A (Gentilmente cedido pelo Professor J. Bonner, Califórnia Institute of Technology) foi despistado com o fragmento BanII-PstI de 200 pb de APH36.1.

Oito de um milhão de placas hibridaram com a sonda e os seus DNAs fágicos isolados. Apôs mapeamento com enzimas de restrição e hibridação do DNA, um clone, ΑΡΗ H6 (Fig.5A) sobreponivel com o clone APHE5 e prolongando-se mais na direc ção 5' foi analisado. Na Figura 5Bestá apresentado o mapa de restrição combinado de APHE5 e APHH6. A análise de transferências de DNA do DNA genômica de rato revelou duas bandas correspondendo a fragmebtos de restrição BamHI de cerca de 4 e 9,4 kb. 0 tamanho do fragmento maior está de acordo com o tamanho calculado através do mapa de restrição e o fragmento mais pequeno prolonga qye para além do extremo 3' do mapa (Figura 5B). Duas bandas foram observadas correspondendo a fragmentos de restrição EcoRI com cerca de 7,5 e 9,7 kb. Os tamanhos de ambos os fragmentos estão de acordo com os tamanhos determinados a partir do mapa de restrição (Fig.5B). Isto indica que o gene APH está persente numa única forma do genoma de rato. -61-

Para a análise das sequências os fragmentos individuais EcoRI, PstI ou BamHI. foram sub-clonados em Bluescript e os subclones individuais foram sujeitos e digestão unidireccional limitada com exonuclease III seguido de digestão cêm nuclease S1 ou sãjeitos a cortes limitados acaso com DNAse I seguido de digestão com enzimas de restrição para dar origem a uma serie de delecções. Preparou-se DNA de plasmídeo de cadeia dupla a partir década delecção e sequenciou-se pelo método de ter minação de cadeias didesoxi. Para certas regiões, a sequência foi determinada usando oligonucleotídeos sintéticos específicos como iniciadores de qsequenciação.

Estes dois clones genomicos foram sequenciados em ambas as orientações. A sequencia de nicleo tídeos completa está apresentada na Fig.4. Por questões de simplicidade na discussão da sequencia genómica, usou-se um sistema de numeração em que a posição +1 significa o sitio de iniciação da trasncrição do gene APH„ Como se mostra na Fig*5C e Tabela 4, as localieações precisas de cada uma das fronteiras exão-intrão 5T e 3' foram definidas alinhando a sequencia genómica com a sequencia de cDNA,

Análise da região 5* não traduzida do mRNA da hidrolase de aci 1 peptideos de. fato....................... ........

Devido â sequencia de cDNA nao possuir cerca de 300 pares de bases da região 5' não traduzida, calculado por comparação do tamanho do mRNAAPH com o tamanho do cDNA, construiu-se uma biblioteca de cDNA contendo a região 5' não traduzida do mRNA de APH como descrito atraS· -62-

Esta biblioteca foi despistada com s 3? duas sondas oligonucleotidicas marcadas com P com sequencia complementares das primeiras dezassete bases do clone de cDNA APH2.7 ou oom os nucieotideos 586-602 do DNA genómico, (Fig.4), Uma sinserçâo de cDNA de 466 pb foi isoldada, sub clonada em Bluescript e sequenciada pelo método de terminação de cadeias didesoxi. Esta sequencia de extensão 5' continha a sequencia de nucieotideos correspondendo aos nucieotideos 37 a 262, 492 a 636 e 711 a 805 do DNA genô-A mico (Fig*4)„ Portanto, o codão de iniciação da tradução ATG, está situado nos nucleotidoes 625-627 (Fig.4) uma vez que está precedido na mesma grelha de leitura por um codão de terminação TAG, nos nucieotideos 568-570 e portanto não existe outro codão ATG entre eles. TABELA 4

JUNÇÕES INTRAO-EXAO NO GENE DA HIDROLASE DE ACÍL-PEPTIDEOS exão no. Tamanho do Exão sitio de "splice" 5 sitio de do "splice" 3 TAMANHO Intrão (bp) 1 262 GCTCACAgtcggct--· ---cccccagCTGGTTG 229 2 145 GCGTCAGgtgaggg--· ---tgcgcagGTGCTGC 74 3 133 CACACTGgtgtgta--· ---cttgcagAGTGGAC 452 4 127 GGGGGGAgtaagtg— 746 5 94 CTTGGAGgtgagtc--· 92 6 76 GAGGATGgtgaggc--· ---catgtagACTGCTT 89 7 164 CATCAAGgtgcttg--· —ttctcagGGGGACC 141 8 138 TGGTCAGgtcagca--· ---tttacagGCTTTTT 94 9 92 ATCGCAGgtgagga--· ---tttccagATCAGCT 76 10 41 AAGTGTGgtaagtg--· ---ggcctagAACTACT 91 11 122 CTGCCTGgtgagtt--· ----cttcagTACGACT 462 12 61 CTGGGAGgtaagag--· ---tttgcagAGAGCTT 1003 13 98 TCGGCAGgtaaaag--· ---gtttaagGACCTGT 601 14 52 ACAGCTGgtgagca-.-· ---cctctagCGGGGTC 1104 15 89 AAGCCTGgtgagta--· ---ttggcagAAAGTTG 358 16 139 CAATATGgtgagct--· ---cctgcagCTGACCT 411 17 84 CCCCATGgtaggta--· ---tctgcagGGGGACC 148 18 81 CTTCTGGgtaatgc--· ---ctttcagTGAACTA 454 19 89 TGTCCAGgttgcag--· ---actttagTTTGCAG 93 20 191 CTGATTGgtgagtg-- ---tttatagGTGTATG 84 21 103 CCCTCAGgtactca--· ---tacccagGTAAAGA 87 22 107 CTGTCCGqtqaqtg--· ---cacatagGCTCCTG 85 23 262 -64-

Determioação do sitio de iniciação da tradução da hidrolase de acil-peptideos de rato_________ 0 extremo 5' de mRNA de APH foi mapeado por analise de extensão de iniciador. Um oligonucleo •3 0 ~ tídeo marcado com P, 5' TÂGGAGTGAGAAAATCA 3' complementar dos nucleotideos 44-60 (Fig.4/), foi hibridado com RNA poli (A)+ de figado de rato. Este iniciador foi prolongado com transcriptase reversa na presença de desoxinucleotideos e o comprimento do produto prolongado, determinado como atras foi de 60 nucleotideos. Ainda, se RNA pol i (A)-f de figado de rato for substituído por RNA poli (A) + de lebedu-ra não se observa qualquer produto prolongado. Encontrou-se que a transcrição começa com um resíduo T no molde de DNA, o qual corresponde a um residuo A na posiçãolna Fig.4.

Este residuo A esta situado 395 pb 5! do codão de iniciação da tradução ATG.

Resumindo, estes exemplos mostram que o gene APH de rato está presente numa unica forma. A sequencia completa do gene APH de rato foi determinada, incluindo 3,58 kb do DNA delimitante 51, 2.75 de DMA exônico, 6.94 Kb de DNA intrônico e 1 kb de DNA delimitante 3' (Fig. 4). Os resultados de DNA exônico inequivocamente identificado o sitio de iniciação da tradução coreespondendo ao codão codificador da metionina no residuo 1 da hidrolase de acil-peptideos de rato, numa vez que existe nenhum codão ATG colo cado entre o codão de paragem na mesma grelha de leitura (Figura 4, nucleotideos 568-570) e o codão de iniciação da tradução ço exão 2 (Figura 4). -65-

Estes resultados também indicam que APH não ê sintetizado como uma proteína precursora, Mma vez que a sequencia de APH proteica a seguir I Met NH2--terminal pode ser identificada por degradação automática de Edman apôs clivagem com CNBro

Como se mostra na Fig„5C, o gene APH de rato, abrangendo 9,69 kb está dividido em 23 exões. Os exões individuais variam de tamanho entre 41 e 262 pb (Tabela 4), 0 primeiro intrão interrope a sequencia 5' não traduzida; todos os outros introes estavam dentro da região codificadora da proteína do gene. A Tabela 4 mostra as sequências das junções 5' e 3' de cada intrão e estas sequências são consistentes com as sequências consensus para as junções intrão-exão de outros genes euca-riôticos (Sharp. P,AC Cell,23:643-646 (1981); Breathnach R, et al Ann- Rev, Biochem, 50, 349-383 (1981 ); Mount S. M, Nucleic Acids Res» 10 ;459-472(1982). Todos os introes começam com a sequencia 6T na fronteira 5' e terminam com a sequencia AG para a fronteira 3' e em todos os casos as sequências delimitantes as fronteiras 5! e 3! são ricas em purinas e pirimidinas respectivamente. A organização exão-intrão do gene APH, presumivelmente codificador de uma proteina/protease com um residuo serina no sitio activo (Kobayashi, K, Smith J.A., J> Biol, Chem. 262 ; 11435-11445 (1987). é muito mais complexo do que a de tripsina ou quimiotripsina, as quais contem cinco a sete exões, respectivamente (Rogers, J.

Nature 315: 458-459 (1985), Os resíduos dos sistemas de subs tituiçâo de cargas destas enzimas, é conhecido que sao codi_ ficados por exões eeparados. mas a distribuição dos residu os correspondentes em APH espera maisiestudos - -66-

Com base numa pesquisa exaustiva da National Biomedical Research Foundation and Swiss Protein Detabases» assim como uma comparação da organização exão-intrão de outras proteases serina (e,g, Tripsina quimio tripsina elastase. urocinase, calicreína , adipsina, a hidro lase de acil-peptideos não apresenta qualquer semelhança clara com estas prp&aases serina» A analise do DMA delimitante 5' do gene APH revelou uma serie de sequências consertadas.

Uma destas é a sequencia 51ΤΘΑΤΑΑΑ 3', que poderá ser uma variante da sequencia de uma caixa "TATA", situados nos nucleotideos -24 a -30» Esta é uma localização titica da cai. xa TATA, a qual normalmente se encontra 26-34 nucleotideos a montante de sitio de iniciação da transcrição (Cordon, J» et aK Science 209 :1406-1414 (1980). Uma outra sequen cia, 5’-TCAAT-3: (nucleotideos -95 a -99) encontrou-se §5 nucleotideos a montante do sitio de iniciação da transcrição e é semelhante â sequencia da caixa "CCAAT" a qual geral mente se encontra a 70-80 bases do sitio de iniciação da transcrição. Em adição, uma sequencia de 6pb, CGGCGG, está repetida tres vezes» Uma eepetição está situada nas posições -81 a -76 e presume-se estar dentro da região do promotor do gene APH»

As duas outras repetições, presentes na orientação contraria como CCGCCC estão situadas 5 nucleotideos e 31 nucleotideos a jusante do sitio de inicia ção da transcrição. Esta descrito todas as regiões de liga ção Sp1 contem uma ou ma is copias exactas desta sequencia GGGCGG as quais podem estar presentes em qualquer uma das orientações relativamente â transcrição (Dynan. W ,S„ et al, Nature 316:774-448 (1985). -67-

Uma sequencia de 200 pb aparece em tandem começando a 917pb a montante do sitio de iniciação da transcrição. Comparado com outras sequências no banco de genes,os dois terços 3' desta sequencia é semelhan te â repetição Ala tipo â de ratinho (80¾ de semelhança) (Kominami; R et al_, Ja Mol.Biol,165:209-228 (1983) . Uma sequencia semelhante mas apenas como uma copia está presente na junção de SV40 e DNA de rato Fisher (Hasson, J.F.et al, J.Mol.Biol.177:53-68(1984) e em vários outros genes (MIn. Η,Y. et al_* Nucleic Acid Res.14 :8879-8892( 1986); Osumi, T. et al J. Biol, Chem. 262:8138-8143(1987); Cordon L.J.et al., Proc.Natl.Acad.Sci. USA 82; 7934-7938(1985); Phillips, M et ai, J. Biol. Chem, 261 :10821-10827 (1986) Esta repetição poderá ter um efeito regulador.

Este gene poderá ser especificamente regulado portàctores reguladores que actuam em cis e/ou em trans, Tal regulação pode estar associada â síntese ou degradação de proteínas.

As hidrolases de aci1-peptideos têm sido isoladas a partir de vários tecidos de mamíferos e as suas propriedades moleculares e mecanismo de reacçâo foram parcialmente caracterizadas. Um aspecto de presente invento diz respeito â estrutura primária da hidrolase de aci1-peptideos de figado de rato a qual foi deduzida a partir da sequencia de nucleotídeos de dois clones decDNA isoladas a partir de uma biblioteca de fígado de rato em X gt11(Fig„3). Este cDNA codifica uma proteína de 732 resíduos de aminoâcidos e as analises da sequencia proteica deri vada de 19 peptideos CNBr e tripticos confirmou a identidade dos 292 resíduos. Esta enzima verificou-se consistir

em 4 subunidades de tamanho idêntico baseado em estimativas de Mr para a proteína nativa e para as suas subunidades por filtração em gel e SDS-PAGE, respectivamente (Kobayashi, L e Smith J.A.,J.Biol Chem»262:11435-11445 (1987).

Uma vez que todas as sequências obtidas se encontrarão na sequencia proteica deduzida ê provável que as quatro subunidades sejam idênticas na sua estrutura primaria.

Uma comparação de sequencia proteica deduzida (Fig„1) e das sequências de aminoácidos derivadas da degradação automática de Edman (Tabela 3) revela que a proteína contem tres grupos lisilo equivalentemente modificadossresiduos 118» 291, 443) se bem» que a natureza química desta modificação não tenha sido ainda determinada .

Existem tres linhas indirectas de evidencia que sugerem que o resíduo de metionina na posição 1 é de facto o extremo MHg da proteína. Primeiro, o peso molecular calculado está de acordo com a Mr da subunidade calculada por SDS-PAGE (81,347 versus 80 000 (Kobayashi K. Smith ,J„A. J. Biol„ Chem. 262:1 1435-1 1445(1987), respec tivamente. Segundo a composição teórica em aminoácidos é semelhante â composição de aminoácidos observada para a hidrolase de acil-peptídeos purificado (Tabela 2).

Terceiro, o codáo de iniciação ATS, correspondendo â metionina está no contexto certo para um codão de iniciação como descrito por Kozak, M (Ce 11 44 283-292 (1986) -69- A sequencia NHg-terminal da estrutura primária deduzida da enzima é Met-Glu-Arg-Gln...

No eniímto, a analise previa da sequencia proteica indicou que o extremo NH2 da proteína está bloqueado (Kobayashi, K. e Smith, J.A. J.Biol.Chem. 262:11435-11445 (1987). Se se remover a metionina durante a tradução por uma aminopepti dase especifica de metionina, será de esperar que um resi-duoiloca Iizado ma is perto do extremo C esteja bloqueado, neste caso a sequencia do peptideo CB17-R13 (Glu-Arg-Gln„..) não podia ser obtida. Portanto, o resíduo metionina permanece na cadeia polipeptidica e sofre uma modificação NFU-terminal Se bem que a natureza química deste grupo blo-queador não tenha ainda sido estabelecida, a ocorrência bem documentada de residuos glutamilo, assim como de resi duos aspartilo easparaginilo adjacentes âs metionina aceti-ladas sugere que a proteína provavelmente esteja N^-aceti^ lada. Neste caso a Ac-Met da hidrolase de acil-peptideos não é aparentemente clivada ijn vitro ou i_n vivo por ela própria ou outras enzimas de poocessamento NH2-terminal durante o seu processamento ou deslocação intracelular.

Foi demonstradp que a hidrolase de acil-peptideos não remove eficazmente um aminoácido acetilado das proteínas nativas ou desnaturadas i_n vitro (Kobayhahi, K. e Smith J.A. J. Biol. Chem. 262 :11435-11445 ( 1987); Gade et aj_, Biochim, et Biophys Acta 662: 86-93(1981) se beml que tais residuos eficazmente clivados dos peptideos N^ - acetílados ( 20 residuos). Portanto, parece provável que os substratos _in vivo para esta enzima possam ser pequenos peptideos N^-acetílados resultantes da degradação de proteínas. No entanto, não pode ser excluído um papel desta enzima na remoção de aminoácidos N-*6 -acetilados, de outras cadeias polipeptidicas durante o processamento co-tradução (Rubenstein, P.A., et al_, <3.Biol. Chem. 258: 11354-11350 (1983). -70- -70-

A analise de transferencias de RNA indica que um unico RNA de 2,7 kb codifica a hidrolase de acil-peptideos em todos os tecidos de rato examinados. Ainda, a quantidade de mRNA detectado nestes tecidos parece ser quase equivalente, sugerindo que não existe regulação especifica de tecidos dos níveis de mRNA da hidrolase de acil-peptideos.

Exemplo 5

Detecçao e díaghástico de carcinoma das células pequenas

Quatro tipos pfeincipais de neoplaj» mas do pulmão,-- carcinoma das células pequenas ítambem referido como carbinoma das "células de aveia" ) carcinoma escamoso (também referido como carcinoma epidermóide) adenocarcinomae carcinoma das células grandes -- constituem 95% dos neoplasmas substancial e primários do pulmão, 0 carcinoma das células pequenas tem substancial importância clinica. Ele constitui cerca de 25% dos neoplasmas do pulmão. Enquanto outras formas de cancro do pulmão têm tempos de sobrevivência de 5 anos em 27-37% dos casos, menos de 1% de pacientes que sofrem de carcinoma das células pequenas sobrevivem 5 anos a partir da altura do diagnostico (ver, por exemplo, Harrison!s Principies of Internai Medicine, 11th Ed. Br.aunwald , E. et aj_, eds. (1987) pag.1115-1123, cuja referencia aqui é incluída como referencia o)» -71-

Presentemente, o carcinoma das ce' luias pequenas é geralmente detectado através de radiografia do tórax de rotina; 5-15% de tais cancros são assinto-mãticos na altura da detecçao» Diz-se què a doença está numa fase limitada quando está confirmada /confinada a um hemi-torax e nódulos linfáticos regionais; a doença é referida corno estando numa fase extensiva quando se observa maior alastramento» A detecção precoce do carcinoma das células pequenas atê associada a um aumento substancial no prognostico. Taxas de curas de 5 anos para a doença na fase limitada são potenciaiemente de 15-25%, no entanto, a taxa dz cura potencial de 5 anos para a doença na fase extensiva ê de apenas 1-5%. 0 carcinoma das células pequenas é tratado com quimioterapia e radioterapia intensiva. 0 objectivo inicial do tratamento é conseguir uma regressão completa do tumor em 6-12 semanas de terapia. Se bem que o tumor muitas vezes volte, o grau de regressão está relacionado com a sobrevivência a médio e longo prazo. Devido ao seu potencial metastático, o carcinoma das células pequenas não é geralmente tratâvel com cirurgia.

No entanto, se detectado na fase inicial, ê possível s remoção cirúrgica e está associado a taxas de cura significativamente maiores» -72-

Os estudos de cariotopos revelaram uma detecção/delação constante no cromossoma 3p (p14-p23) entre o carcinoma das células pequenas (Whang-Peng, et aJL Science 215 : 181-182 (1981 ), Esta observação tem sido suportada por estudos com marcas de RFLP polimórficas (Maylor, S.L. et al flature 329:451-454 (1987) Kok. K. et ah Nature 330:578-581 (1987); Bráuch, H. et ai N, Engi, J. Med. 317:1109-1113 (1987); Yakota, J. et al Proc. Natl» AeacL Sei. USA 8S: 9252-9256 (1987). A frequência da perda de alelos indica que virtualmente todos os carcinomas das células pequenas contêm uma delecção para uma porção do cromossoma 3 (Maylor, $,L, et aJL Genó-mico 4: 355-361 (1989), cuja referência ê aqui incluída por referencia)» 0 braço pequeno do cromossoma 3 tem sido implicado em outros cancros do pulmão, em carcinomas de células renais e no síndroma de von Hippel-Lindau (Kok, K. et aJL Nature 330:578-581 (1987); Brauoh, H. et al, N. Engl. J. Med. 317:1109-1113 (1987); Zbar, B et ai Nature, 327: 721-724 (1987); Kovacs, 6. et al, Proc,, Natl. Acad. Sei. USA 85:1571-1575 (1988); Seizinger, B.R.,

Nature 332:268-269 (1988) cujas referencias são aqui incluídas como referencia. A perda de actividade da amlnoacila se 1 em tumores tipo carcinoma das células pequenas e a associação familiar algumas destas doenças ainda suporta mais a correlação entre estas doenças e uma delecção no bra ço pequeno do cromossoma 3 (Naylon, S.L. et aí. Genomics 4: 355-361(1989). -73-

Recentemente, uma sequencia de DNA (designada "DNF 15S2") fel clonada e oiapeada no cromossoma 3 (Gerber. M„J. et aj_, Amer. <3* Hum, Genet 43: 442-451 (1988),. cuja referencia ê aqui incluída por referencia; Nay lor, S„L. et al Genomics 4; 355:361 (1989). Encontrou-se que o DNA clonado ê capaz de identificar diferenças effi RFLP entre DNA normal e DNA de carcinoma das células pequenas o Em particular, foram identificados polimorfismos usan do a enzima de restrição Taql . A sequencia de aminoâcidos da hi-drolase de acil-peptideos do presente invento ê substanci-almente semelhante â sequencia de aminoâcidos codificada pela sequencia da sonda DNF 15S2* Dos 621 resíduos de proteína DNF 15S2, 67,6¾ eram idênticos dos encontrados naR hidrolase de acil-peptideos do presente invento (Figura 6). Assim',' as sequências nucleotidicas que codificam a hidrolase de acil-peptideos do presente invento ou fragmentos desta enzima, podem ser usados como sondas para detectar e identificar carcinomas das células pequenas e outros cancros associados a uma delecçâo no cromossoma 3.

Quando usado como sonda, tais sequências são incubadas em condições que permitem que lhes hibridem com DNA ou RNA de um paciente a ser testado para determinar a presença de carcinoma das células pequenas, São conhecidos métodos de híbrida ção adequados (ver, por exemplo, Mames B„D„ e Miggins, S.J. Nucleic. Acid. Hybridizatlon, a praticai approach., IRL Press Washington, D.C. (1985), cuja referencia ê aqui incluída por referencia. -74-

Após ter sido conseguida a hibri_ dação métodos bem conhecidos para a detecção de polimorfismo (de preferencia analise do polimorfismo do comprimento dos fragmentos de restrição ("RFLP") podem ser empregues para determinar se uma amostra de acido nucleico contem um polimorfismo ou sequencia que esteja relacionada com a presença de carcinoma das células pequenas ou da outros. Sã©·conhecidos muitos métodos para efectuar a anali se de polimorfismo que podem ser facilmente adaptados ao emprego das sequências codificadoras da hidrolase de aci1-peptideos do presente invento na detecção de cancro das células pequenas de outros cancros (ver, por exemplo, Wainscoat, J.S et aml., Hum. Genet 75: 384-387 (1987);

Rabin, D, ejt aj_, Him Genet 75 :120-122 ( 1987); Azuma C, et al, Amer. J. Obstet Gynecol. 160:734-736 (1986);

Pakkala, S et al., Leuk Res. 12 :757-762 (1988); Todd,S. et cd, Genomics 4 :53-59( 1989 ). Chowdhury, M.K.U., Theor. Appl. Genet.76:25-32( 1988); Yam.P.et al_, Amer, J. Hum. Genet.41 :867-881(1987); Freeman, S.M. et aJL Hum.

Immunol. 20:1-12 (1987); Yoffe G, et al_, Exper. hematol.

Jj5 : 725-728 (1987); Oones F.S. III et al_, Gene 39:77-84 (1986); Bernheim, A. , et aj^, Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 80: 7571-7576 (1983); cujas referencias são aqui incluídas por referencia).

Os ensaios de detecção de polimorfismo têm sido usados para detectar e identificar cancros (Wada, M et Jpn, J. Canc. Res. 78:780-784 (1987);

Naylor , S.L. et al Genemics 4 :355-361 (1989); Gerber M.J. etal Amer. J. Hum. Genet 43: 442-451(1988); Kakehi, Y et al., Int. J. Câncer 43^:391 -394( 1989); Gum, J.R. et al J. Biol. Chem. 264:6480-6487 (1989), cujas referencias são incorporadas aqui por referencia). Tais ensaios podem ser usados como um modelo geral para os ensaios do presente invento. -75- -75-

)

Se bem que ú que foi dito se refe ria a realizações particulares perferidas. serâ compreendido que o presente invento oáo lhes estâ limitado.

Os familiarizados com a matéria verão que podem ser feitas varias mddificações âs realizações divulgadas e que tais modificações pretendem estar dentro do âmbito do presente invento.

Claims (1)

1. -76- REIVINDICAQOES 1-.- Método para a detecção de carcinoma das células pequenas, caracterizado por compreender : A. incubação de uma amosstra de acido nucleico de um pacj[ ente suspeito de ter carcinoma das células pequenas, na presença de uma molécula de ácido nucleico tendo uma sequen cia seleccionada do grupo constituído por: i. uma sequencia que codifica toda ou parte de uma enzima hidrolase de acil-peptideos; e ii. uma sequencia que ê complementar de uma sequencia que codifica toda ou parte de uma enzima hidrolase de acil_ peptídeos; a referida incubação sendo feita em condições suficientes para permitir que se dê a hibridação de ácidos nucleicos entre as referidas amostras de acido nucleico e a referida molécula de ácido nucleico para assim formar uma molécula de acido nucleico nucleico para assim formar uma molécula híbrida; e B. detecção de carcinoma das células pequenas determinando se a referida molécula híbrida difere de uma molécula referencia no que respeita â sequencia, a referida molécula referencia compreende uma amostra de acido nucleico de um indivíduo normal hibridado com uma molécula de ácido nucleico que codifica toda ou arte de uma enzima hidro lase de aci1-peptídeos. -77-

   2a.- Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o referido passo B compreender uma analise dos polimorfismos do comprimento de fragmentos de restrição. 3a.- Processo para a produção de uma molécula de acido nucleico de cadeia dupla, caracterizado por se incorporar na referida molécula: A. uma primeira cadeia tendo uma sequencia seleccionada do grupo constituído por: i. uma sequencia que codifica toda ou parte de uma enzima hidrolase de acil-peptídeos; e ii. uma sequencia que é complementar de uma sequência que codifica toda ou parte de uma enzima hidrolase de acil-peptídeos; sendo a referida primeira cadeia hibri dada com: -78-

   8. uma segunda cadeia, tendo a referida segunda cadeia uma sequencia que é substancialmente complementar em sequen cia de sequencia da referida primeira cadeia, sendo a referida sequencia complementar da referida segunda cadeia derivados de um indivíduo suspeito de ter carcinoma das células pequenas. Lisboa, 11 de Janeiro de 1990

   i- pereira da cruz Agente Gíígísí da Propriedade Industrial aUA VICTOR CGiWN, 10-A, 1/ 12SO USBO&