DE69131133T2

DE69131133T2 - Verwendung von gro-genen und proteinen

Info

Publication number: DE69131133T2
Application number: DE69131133T
Authority: DE
Inventors: John Haskill; George Martin; Danute Nitecki; Peter Ralph
Original assignee: University of North Carolina at Chapel Hill; Chiron Corp; University of North Carolina System
Current assignee: University of North Carolina at Chapel Hill; Novartis Vaccines and Diagnostics Inc; University of North Carolina System
Priority date: 1990-09-28
Filing date: 1991-09-24
Publication date: 1999-12-09
Anticipated expiration: 2011-09-25
Also published as: EP0550661B1; EP0550661A1; DE69131133D1; EP0909817A1; WO1992006196A1; CA2092924A1; US5858688A; US5977323A; AU8755591A; AU5053396A; US6001605A; ATE178942T1; US5994060A; JPH06503952A

Description

Die Erfindung betrifft allgemein das Gebiet der Molekularbiologie/Immunologie und diagnostische Anwendungen darin.
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Cytokinen, besonders GRO-Gene und -Proteine, die von den cDNAs von induzierten peripheren Blutzellen, beispielsweise Monocyten, stammten. Die nachstehende Erläuterung stellt den Hintergrund von Cytokinen, Monocyten und GRO-Genen und -Proteinen dar.
Cytokine sind Proteine mit kleinem Molekulargewicht, die ein breites Spektrum von zellregulatorischer Aktivität sowohl in vitro als auch in vivo aufweisen. (Hintergrundinformationen geben F. R. Balkwill et al., Immun. Today 10 (1989), 299). Einige Cytokine besitzen die Aktivität eines Wachstumsfaktors. Beispiele für das Zellwachstum hemmende oder Zellen direkt abtötende Cytokine sind Interferone (IFNs), Tumornekrosefaktor (TNF), Lymphotoxin (LT), Interleukin-1s (IL-1s) und transformierender Wachstumsfaktor B (TGF-β). Die meisten Cytokine wirken auf B- oder T-Zellen in irgendeiner Phase ihrer Antwort. Ein Beispiel für die physiologische Wirkung von Cytokinen kann bei Cytokinen beobachtet werden, die die Entzündungs- Antwort durch Variation der T- und B-Lymphocyten-Aktivierung, Chemotaxis, Eicosanoidsekretion und Kollagenproduktion regulieren. Differentielle Expression dieser Entzündungs-n Mediatoren kann das Fortbestehen einer chronischen Entzündung und fibrotische Manifestationen beeinflussen.
Monocyten werden durch chemotaktische Faktoren, die als Ergebnis einer Entzündung oder Infektion freigesetzt werden, zu Infektionsstellen geleitet (S. A. Sporn et al., J. of Immun. 144 (1990), 4434-4441). Die Wanderung von Monocyten in das Gewebe schließt eine Interaktion mit dem vaskulären Endothel und die anschließende Wanderung der Monocyten durch die darunterliegende Basalmembran ein, während der die Monocyten in engen Kontakt mit extrazellulären Matrixbestandteilen und Bindegewebezellen kommen (J. M. Harlan, Blood 65 (1985), 513; P. C. Wilkinson et al., Curr. Top Pathol. 68 (1979), 47).
B. Thorens et al., Cell 48 (1987), 671, berichteten, daß die Haftung für die transkriptionale Expression von Makrophagen-Mediatoren der Entzündung und die Haftung an verschiedene Matrices zu einer bevorzugten Geninduktion führt. Ferner gibt es Hinweise auf eine Beteiligung von Zelladhäsionsmolekülen bei der Entwicklungs- Interaktion zwischen Epithel- und Mesenchymzellen, die eine Zelldifferenzierung beeinflussen (Sanders, E. J., Biochem. Cell Biol. 66 (1988), 530). Es wurde ferner gezeigt, daß innerhalb von 30 Minuten der Monocyten-Haftung an Plastik eine komplexe Abfolge von regulatorischen Ereignissen initiiert wird, wie durch schnelle Veränderungen der mRNA- Niveaus von mehreren Proto-Onkogenen und Entzündungs-n Mediatoren definiert ist (S. Haskill et al., J. of Immunol. 140 (1988), 1690). IL-1β-, TNF-α und c-fos-Niveaus erhöhen sich schnell, während sich die mRNA-Niveaus des CSF-1-Gleichgewichts ("Steady state") nach 90 Minuten erhöhten. Im Gegensatz dazu wird die Expression von cfms und Lysozym schnell herunterreguliert. Diese Gene werden durch Haftung an verschiedene biologisch relevante Substrate moduliert (Eierman, D. F., J. of Immunol. 142 (1989), 1970-1970).
Obwohl hohe Gleichgewichts ("Steady state")-mRNA-Niveaus von wichtigen Entzündungsmediatoren schnell durch Haftung induziert werden, ist die Haftung selber nicht ausreichend, um eine effiziente Translation und Sekretion von IL-1β, TNF-α oder CSF-1 zu bewirken (S. Haskill et al., a.a.O.). Eine Aktivierung durch ein zweites Signal, wie ein bakterielles Endotoxin, ist zur Sezernierung aller drei Genprodukte erforderlich. Daher ist es klar, daß während der Haftung entstehende Signale wahrscheinlich eine signifikante Rolle bei der Aktivierung und Differenzierung von Monocyten spielen, was ihnen eine Antwort auf eine Infektion und eine Beeinflussung der lokalen Gewebeumgebung ermöglicht (Sporn, S. A., a.a.O.). Kürzliche Untersuchungen zeigen, daß eine Haftung zu einer allgemeinen Aktivierung von zahlreichen Genen führt, die an einer frühen Verteidigungsantwort beteiligt sind und deren Expression durch selektive Gewebe/extrazelluläre Matrix-Interaktionen reguliert werden können. Id.
Eine Haftung von Monocyten führt zu einer schnellen Induktion von hohen Niveaus von meistens kurzlebigen mRNAs von verschiedenen neuen Entzündungs-n Mediatorgenen (S. A. Sporn et al., a.a.O.). Einer dieser neuen Clone, GROα, hatte eine abgeleitete Aminosäuresequenz, die der für das ursprüngliche GRO-Genprodukt beschriebenen ähnlich ist. Kartierungsuntersuchungen von GRO (A. Anisowicz et al., PNAS (USA) 85 (1988), 964-9649, und A. Richmond et al., EMBO J. 7 (1988), 2025-2033) identifizierten eine einzige GRO-Stelle auf Chromosom 4q21. Das GRO-Gen gehört zu einer Gen-Superfamilie, die eine Gruppe von verwandten Cytokinen codiert, die NAP- 1/IL-8 (K. Matsushima et al., J. Exp. Med. 167 (1988), 1883-1893; J. Schmid et al., J. of Immunol. 139 (1987), 250-256; und P. Peveru et al., J. Exp. Med. 167 (1988), 1547-1559) und das Blutplättchen-Basisprotein (PBP) einschließt. PBP ist der Vorläufer des Bindegewebe-aktivierenden Proteins III (CTAP III), von β-Thromboglobulin (C. W. Castor et al., PNAS (USA) 80 (1983), 765-769), Blutplättchenfaktor 4 (PF4) (T. F. Deuel et al., PNAS (USA) 74 (1977), 2256-2258), γ-Interferon-induzierbarem Peptid (γIP-10) (A. D. Luster et al., Nature (London) 315 (1985), 672-676) und entzündlichem Makrophagen- Protein 2 (MIP-2) (S. D. Wolpe et al., PNAS (USA) 86 (1989), 612-616).
GRO wurde anfänglich durch seine konstitutive Überexpression in spontan transformierten Fibroblasten des chinesischen Hamsters (A. Anisowicz et al., PNAS (USA) 84 (1987), 7188-7192) identifiziert. Ein verwandtes Gen wurde in v-src-transformierten Hühnerzellen identifiziert (S. Sugano et al., Cell 49 (1987), 321-328; und P. A. Bedard et al., PNAS (USA) 84 (1987), 6715-6719). In Expressionsuntersuchungen mit normalen Fibroblasten zeigte GRO c-fos gleichende frühe Antwortkinetiken, die zur Bezeichnung GRO (reguliertes Wachstum, "growth regulated") führten (A. Anisowicz et al., 1987, a.a.O.). Später wurde gezeigt, daß ein Protein mit einer Melanom-stimulierenden Aktivität (MGSA) (A. Richmond et al., a.a.O.) von GRO codiert wird, und eine Sequenzähnlichkeit wurde für das murine frühe Antwortgen KC beschrieben (P. Oquendo et al., J. Biol. Chem. 264 (1989), 4133-4137).
Voruntersuchungen zeigten, daß das GRO-α-Gen bei der aktiven ulcerativen Colitis-Erkrankung, jedoch nicht in inaktivem Gewebe, exprimiert wurde. (K. Isaacs et al., "Profiles of cytokine activation in inflammatory bowel disease tissue: measurement of cDNA amplifikation", American Gastroenterological Assoc. & American Assoc. for the Study of Liver Diseases, 13. bis 16. Mai 1990, Texas (Abstract)). Andererseits war die Ungleichheit der Expression des GRO-α-Gens im Fall von aktiven Geweben gegenüber inaktiven Geweben bei der Crohns-Krankheit geringer. Die Expression des GRO-a-Gens in der aktiven Dickdarmentzündung weist auf eine Rolle dieser Cytokine in der Pathogenese der Entzündungs-n Darmkrankheit hin.
Eine cDNA mit der Bezeichnung MAD-2 wurde auf der 1988iger RES- Konferenz vorgestellt. (S. Sporn et al., "Isolation of Adherence Specific cDNA Clones from a Monocyte cDNA Library" Society for Leukocyte Biology (RES), Washington, D. C., 27. bis 30. Oktober 1988; und S. A. Sporn et al., J. of Immunol 144 (1990), 4434). MAD-2 wurde durch differentielle Hybridisierung von einer cDNA-Bank isoliert, die im bakteriellen Expressionsvektor λgt10 durch Verwendung von Gesamt-RNA von menschlichen Blutmonocyten, die an Plastik 30 Minuten bei 37ºC hafteten, hergestellt wurde. S. A. Sporn et al., J. of Immunol., 1990, a.a.O. Von MAD-2 und menschlichem GRO wurde auf der Basis einer Southern-Blot-Analyse und Unterschieden in den Aminosäuresequenzen der carboxyterminalen Aminosäuren angenommen, daß sie getrennte Genprodukte sind. Id. bei 4440. Im Cytokin-Workshop vom 13. Dezember 1989, Hilton Head, Georgia, präsentierte Ruth Sager die Aminosäuresequenzen sowohl von GROβ als auch -γ.
Kürzlich wurden zwei cDNAs der menschlichen Homologen von murinem MIP-2 von einer Bank geclont, die aus Phorbol-Myristat-Acetat (PMA)-behandelten und Lipopolysaccharid (LPS)-stimulierten U937-Zellen hergestellt wurde (P. Tekamp-Olson et al., J. Exp. Med. 172 (1990), 911. Diese cDNAs mit den Bezeichnungen MIP-2γ und MIP- 2β sind zu den in der anhängigen Patentanmeldung beschriebenen cDNAs stark homolog.
Die Erfindung stellt Verfahren bereit, die GROγ oder -β zur Diagnose von Krebs, vorzugsweise menschlichem Kolonkrebs im Fall von GROγ, einschließen.
Die Fig. 1(a) und 1(b) zeigen die cDNA-Sequenzen und abgeleiteten Translationssequenzen der offenen Leserahmen für GROβ und GROγ im Vergleich mit GROα, wobei die Positionen der Aminosäureunterschiede gekennzeichnet sind. Sonden, die für den Southern-DNA-Transfer verwendet werden, und Primer, die für eine Polymerase-Kettenreaktions (PCR)-Analyse der RNAs verwendet werden, sind unterstrichen. Fettgedruckte Bereiche zeigen die Positionen des ATTTA-Motifs, und konservierte Bereiche zwischen den 3 menschlichen GRO-Isolaten (beginnend am bp 848 für GROα) sowie ein Bereich, der bei Mensch und Hamster übereinstimmt (bp 930 GROα), sind in Kästchen angegeben.
Fig. 2 zeigt die Southern-Transfer-Analyse, die die Gegenwart der drei unterschiedlichen GRO-Gene zeigte. Bahnen 1 bis 3, Hybridisierung mit den GROα, -β und γcDNA-Clonen. Bahnen 4 bis 7, Oligonucleotid-Hybridisierung an dehydratisierte Agarosegele (D. Caput et al., PNAS (USA) 83 (1986), 1670-1674). Bahn 4, Oligonucleotid ML80; Bahn 5, GM349; Bahn 6, GROα-spezifisches Oligonucleotid (GM350); und Bahn 7, GROβ-spezifisches Oligonucleotid GM272.
Fig. 3 zeigt die PCR-Analyse der GRO-Expression in verschiedenen Zellen vom gleichen Individuum oder gleichen Zellen von verschiedenen Individuen, die durch verschiedene Signale stimuliert werden. Bahn 1, Neutrophile; 2, Lymphocyten; und 3, Monocyten, die alle 45 Minuten an Fibronectin-beschichtetem Plastik hafteten; 4, haftende Monocyten, die mit bakteriellem Polysaccharid (LPS) 4 Stunden stimuliert wurden; 5, Monocyten, die unter nicht-haftenden Bedingungen mit Phorbol 12-Myristat- 13-Acetat (PMA) 4 Stunden stimuliert wurden; 6, endotheliale Zellen, die mit LPS stimuliert wurden; und 7, frische Biopsie von Dickdarmkarzinomen. Alle Daten sind nach 30 Amplifikationszyklen dargestellt.
Die hier beschriebene Erfindung stützt sich auf zuvor veröffentlichte Arbeiten und anhängige Patentanmeldungen. Beispielsweise bestehen diese Arbeiten aus wissenschaftlichen Abhandlungen, Patenten oder anhängigen Patentanmeldungen. Alle diese zuvor oder nachstehend zitierten Veröffentlichungen und Anwendungen sind hiermit durch Bezugnahme eingeschlossen.
Obwohl beliebige ähnliche oder äquivalente Verfahren und Materialien zur Durchführung oder zum Test der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, werden die bevorzugten Verfahren und Materialien nachstehend beschrieben.
Die Begriffe "GROβ" und "GROγ", wie im Zusammenhang mit Proteinmaterial in der ganzen vorliegenden Anmeldung und den Ansprüchen verwendet, bezeichnen Proteinmaterialien mit den in Fig. 1(b) dargestellten Aminosäuresequenzen und ihre funktionellen Äquivalente. Zwei Aminosäuresequenzen sind funktionell äquivalent, wenn sie im wesentlichen die gleichen biologischen Aktivitäten aufweisen. Ferner sind in die Bedeutung von "GROβ" und "GROγ" ihre Propolypeptid- und reifen Polypeptidformen eingeschlossen. Fig. 1(b) zeigt die Propolypeptide von GROβ und GROγ, die ihre Signalpeptide oder Leadersequenz einschließen. Die Zellen sezernieren reife Polypeptide, von denen die Signalpeptide entfernt wurden. Für therapeutische oder diagnostische Anwendungen werden die reifen Polypeptide dem Propolypeptid vorgezogen. Ferner können verschiedene Signalpeptide die natürlich vorkommenden ersetzen. Das reife Polypeptid beginnt etwa an Position 35 (Ala&sub3;&sub5;) bei GROβ und etwa an Position 34 (Ala&sub3;&sub4;) bei GROγ.
Unabhängig von ihren biologischen Aktivitäten werden zwei Polypeptide auch für funktionell äquivalent gehalten, wenn sie ähnliche Sequenzen aufweisen oder im wesentlichen äquivalente Sequenzen zeigen, wie die Propolypeptidsequenzen von GROβ oder GROγ in Fig. 1(b) oder ihre reifen Polypeptidsequenzen. Vorzugsweise sind zwei Polypeptide funktionell äquivalent, wenn mindestens etwa 88% ihrer Aminosäuren über eine definierte Länge der reifen Polypeptide übereinstimmen. Bei dieser Berechnung gibt es einen Fehler von einer falschen Aminosäure pro fehlgepaartem oder nicht-gepaartem (Deletion) Rest.
Modifizierte Proteine sind ebenfalls in diese Patentanmeldung eingeschlossen.
Diese Modifikationen können bewußt herbeigeführt werden, wie beispielsweise durch stellenspezifische Mutagenese erhaltene Modifikationen, oder zufällig sein, wie durch Mutationen in den Wirten erhaltene Modifikationen.
Wie bei allen Proteinen hängt ferner die genaue chemische Struktur von einer Reihe von Faktoren ab. Bei Vorhandensein von ionisierbaren Amino- und Carboxylgruppen im Molekül kann ein bestimmtes Protein als ein saures oder basisches Salz oder in neutraler Form erhalten werden. Alle diese Präparate, die ihre Aktivität in geeigneten Umweltbedingungen behalten, sind in die Definition eingeschlossen. Ferner kann die primäre Aminosäuresequenz durch Derivatbildung unter Verwendung von Zuckereinheiten (Glykosylierung) oder durch andere ergänzende Moleküle wie Lipide, Phosphat, Acetylgruppen etc., häufiger durch Konjugation mit Sacchariden, vergrößert werden. Die primäre Aminosäurestruktur kann auch unter Bildung von Komplexen, am häufigsten von Dimeren, aggregieren. Bestimmte Gesichtspunkte dieser Vergrößerung werden durch post-translationale Prozessierungssysteme des produzierenden Wirts erreicht; weitere Modifikationen können in vitro eingeführt werden. In jedem Fall sind diese Modifikationen in die Definition eingeschlossen, sofern die Aktivität des Proteins nicht zerstört wird. Es wird erwartet, daß diese Modifikationen die Aktivität entweder durch Erhöhung oder Verminderung der Aktivität des Proteins in verschiedenen Tests quantitativ oder qualitativ beeinflussen können.
Einzelne Aminosäurereste in der Kette können ebenfalls durch Oxidation, Reduktion oder andere Derivatbildung modifiziert werden, und das Protein kann zum Erhalt von aktiv bleibenden Fragmenten gespalten werden. Diese die Aktivität nicht zerstörenden Veränderungen der Proteinsequenz sind in die Definition eingeschlossen. Modifikationen der primären Struktur selber durch Deletion, Addition oder Veränderung der Aminosäuren, die an der Sequenz während der Translation erfolgen, können ohne Zerstörung der Aktivität des Proteins hergestellt werden. Diese Substitutionen oder andere Veränderungen führen zu Proteinen mit einer Aminosäuresequenz, die von der Definition der GROB- und -γ-Proteine eingeschlossen ist. Neben anderen Dingen sind die GRO-Proteine an der Entzündungs-n Antwort beteiligt. Der Begriff "Entzündungs-Cytokin" soll in seine Bedeutung die GROβ- und -γ- Proteine, die hier spezifisch erwähnt sind, sowie alle ihre funktionellen Äquivalente einschließen.
In ähnlicher Weise betreffen die Begriffe "GROβ" und "GROγ", wie im Zusammenhang mit DNA-Sequenzen in der ganzen vorliegenden Anmeldung und Ansprüchen verwendet, DNA-Sequenzen, die in den Fig. 1(a) und (b) dargestellt sind, und ihre funktionellen Homologe. Auch im Schutzbereich dieser Patentanmeldung sind DNA-Sequenzen oder Fragmente davon, die ein Protein oder Peptid mit im wesentlichen den gleichen biologischen Aktivitäten wie GROβ- oder -γ aufweisen. Diese DNA- Sequenzen oder Fragmente davon werden hier nachstehend als funktionelle Homologe bezeichnet.
In der Definition von funktionellen Homologen und unabhängig von ihren biologischen Aktivitäten sind ferner DNA-Sequenzen einbezogen, die zu den DNA- Sequenzen von GROβ oder -γ, die in den Fig. 1(a) und (b) dargestellt sind, und den DNA-Sequenzen ihrer funktionellen Homologen im wesentlichen homolog sind. Zwei DNA-Sequenzen sind "im wesentlichen homolog", wenn mindestens etwa 94% der Nucleotide über die definierte Länge der DNA-Sequenzen übereinstimmen, wobei die DNA-Sequenzen vorzugsweise keine Leadersequenz aufweisen. Im wesentlichen homologe Sequenzen können durch Vergleich der Sequenzen unter Verwendung von in Sequenzdatenbanken erhältlicher Standard-Software oder in einem Southern-Hybridisierungsexperiment bei beispielsweise stringenten Bedingungen, wie für dieses spezielle System definiert, identifiziert werden. Die Definition von geeigneten Hybridisierungsbedingungen gehört zum Stand der Technik. Vgl. z. B. Maniatis et al., 1982, DNA Cloning: A Practical Approach, Bd. I & II, (Glover, D. N., Hrsg., 1985); und B. D. Hanes et al., 1985, Nucleic Acid Hybridization).
Im nachstehenden Beispiel 1 stammten GROβ und -γ von der cDNA von aktivierten oder induzierten (die Begriffe "Aktivierung" und "Induktion" werden austauschbar verwendet) peripheren Blutzellen. Die bevorzugten Zellen sind periphere Blutleukocyten und am meisten bevorzugt Monocyten. Im bevorzugten Aktivierungsverfahren bei peripheren Blutleukocyten wird Mezerein und Calciumionophor verwendet. Das bevorzugte Aktivierungsverfahren bei Monocyten ist die Haftung an extrazelluläre Matrices oder andere Substrate. Das dargestellte spezifische Beispiel beinhaltet eine Haftung an Plastik. Es werden jedoch andere Zellinien oder andere Quellen zur Entwicklung von entweder dem Material, von dem das GROβ und GROγ anschließend isoliert wird, oder dem GROβ und GROγ selber, hier in Betracht gezogen und die vorliegende Erfindung ist daher nicht begrenzt. Zur Betrachtung dieser Patentanmeldung gehören Zellen, die aktiviert oder induziert werden, beispielsweise durch Mitogene wie LPS oder PMA oder Haftung an andere extrazelluläre Matrices oder durch virale Infektionen und dadurch GROβ oder GROγ exprimieren. (Ein Beispiel der viralen Induktion beschreiben L. Dudding et al., J. Immunology 143 (1989), 3343, "Human Cytomegalovirus Infection Stimulates Expression of Monocyte-Associated Mediator Genes"). Tumorzellen, die GROβ oder GROγ exprimieren, sind ebenfalls ein Gesichtspunkt dieser Patentanmeldung.
Alternative Verfahren wie die genetische Replikation, die gemäß den im Stand der Technik gut bekannten Prinzipien der Rekombinationstechnologie durchgeführt wird, werden hier als zur Erfindung gehörig angesehen.
Daher können GROβ- und GROγ-Nucleinsäuresequenzen durch Absuchen einer genomischen oder cDNA-Bank jeder Zelle erhalten werden. Die DNA kann auch durch Synthese der DNA unter Verwendung von allgemein verfügbaren Verfahren und DNA-Synthesegeräte erhalten werden. Eine Synthese kann vorteilhaft sein, da einmalige Restriktionsstellen während der Herstellung der DNA eingeführt werden können, wodurch die Verwendung der Gene in Vektoren erleichtert wird, die ansonsten nicht in der nativen Quelle vorhandene Restriktionsstellen enthalten. Ferner kann eine Modifikation jeder gewünschten Stelle in die DNA durch Synthese eingeführt werden, ohne daß eine weitere Modifikation der DNA durch Mutagenese erforderlich wäre.
Ein "Antikörper" ist hier so definiert, daß er jedes Immunglobulin, einschließlich Antikörper und Antigen-bindende Fragmente davon (z. B. Fab, F(ab)&sub2;, Fv), die ein spezifisches Epitop binden, einschließt. Der Begriff umfaßt unter anderem polyclonale, monoclonale, einzelkettige und chimere Antikörper, wobei die zuletzt erwähnten genauer in den US-Patenten mit den Nrn. 4,816,397 und 4,816,567 beschrieben sind.
Eine vollständige cDNA-Sequenz, die das Entzündungs-Cytokin codiert, kann unter Verwendung von im Stand der Technik gut bekannten Verfahren der Molekularbiologie mit den nachstehend beschriebenen Ausnahmen erhalten werden.
Mehrere Verfahren zur Identifizierung der Cytokin-cDNA-Sequenzen sind verfügbar. Das bevorzugte Verfahren ist die Erzeugung einer Bank unter Verwendung von RNA, die von peripheren Blutzellen, stärker bevorzugt von peripheren Blutleukocyten und Monocyten, isoliert wurde, eine Bank kann jedoch von praktisch jeder Quelle von biologischem Material, das das Entzündungs-Cytokin exprimiert, erzeugt werden; cDNA- Banken sind sogar im Handel erhältlich. Monocyten und periphere Blutzellen sind die bevorzugten Ausgangsmaterialien, da die Haftung von Monocyten an eine geeignete Oberfläche und die Aktivierung der peripheren Blutleukocyten durch Calciumionophor und Mezerein die Expression der Entzündungs-Cytokine induziert.
Ein Beispiel für ein Verfahren zur Herstellung einer die Entzündungs- Cytokinsequenzen enthaltenden cDNA-Bank besteht aus der Isolierung der gesamten cytoplasmatischen RNA aus einem geeigneten Ausgangsmaterial und der anschließenden Isolierung von Messenger-RNA daraus. Letztere kann weiter in poly(A+)-Messenger- RNA fraktioniert werden, die wiederum noch weiter in poly(A+)-Messenger-RNA- Fraktionen, die Entzündungs-Cytokin-Messenger-RNA enthalten, fraktioniert werden können. Die Messenger-RNA kann anschließend revers transkribiert und in einen geeigneten Vektor zur Bildung der cDNA-Bank cloniert werden.
Das Ausgangsmaterial (d. h. Gewebe, Zellen) wird genauer gesagt mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung gewaschen und ein nichtionisches Detergens, wie Ethylenoxid, in einer die zellulären, jedoch nicht die nukleären Membranen lysierenden Menge, üblicherweise etwa 0,3%, zugesetzt. Die Kerne können anschließend durch zehnminütige Zentrifugation bei 1 000 · g entfernt werden. Der post-nukleäre Überstand wird zu einem gleichen Volumen von TE (10 mM Tris und 1 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), pH 7,5) gesättigtem PhenollChloroform (1 : 1)-Gemisch, das 0,5% Natriumdodecylsulfat (SDS) und 10 mM EDTA enthielt, zugesetzt. Der Überstand wird 4 Mal hintereinander extrahiert und durch Zentrifugation bei 2 000 · g für 120 Minuten in die Phasen getrennt. Die RNA wird durch Einstellung der Proben auf 0,25 M NaCl, Zugabe von 2 Volumen 100% Ethanol und Aufbewahren bei -20ºC ausgefällt. Die RNA wird anschließend bei 5 000 · g 30 Minuten pelletiert, mit 70% und 100% Ethanol gewaschen und getrocknet. Dies stellt die gesamte cytoplasmatische RNA dar.
Alternativ kann die gesamte cytoplasmatische RNA unter Verwendung des Guanidin-Isothiocyanat-Cäsiumchlorid-Verfahrens, wie von Chirgwin et al., Biochem. 18 (1979), 5294, beschrieben, isoliert werden.
Die polyadenylierte poly(A+)-Messenger-RNA (mRNA) kann von der cytoplasmatischen Gesamt-RNA durch Chromatographie auf oligo(dT)-Cellulose erhalten werden (J. Aviv et al., PNAS 69 (1972), 1408-1412). Die RNA wird in ETS (10 mM Tris, 1 mM EDTA und 0.5% SDS, pH 7,5) bei einer Konzentration von 2 mg/ml gelöst. Diese Lösung wird 5 Minuten auf 65ºC erhitzt und anschließend schnell auf 4ºC abgekühlt. Nach Erwärmung auf Raumtemperatur wird die RNA-Lösung auf 0,4 M NaCl eingestellt und langsam durch eine oligo (dT)-Cellulosesäule, die zuvor mit Bindungspuffer (500 mM NaCl, 10 mM Tris und 1 mM EDTA, pH 7,5) äquilibriert wurde, geleitet. Der Durchfluß wird zwei weitere Male über die Säule geleitet und die Säule mit 10 Volumen Bindungspuffer gewaschen. Die poly(A+)-mRNA wird mit Aliquots von ETS eluiert, einmal mit einem TE-gesättigten PhenoliChloroform-Gemisch extrahiert und durch Zugabe von NaCl zu 0,2 M und 2 Volumen 100% Ethanol ausgefällt. Die RNA wird zweimal nacheinander ausgefällt, einmal in 70% gewaschen und anschließend in 100% Ethanol vor der Trocknung gewaschen. Die poly(A+)-mRNA kann anschließend zur Konstruktion einer cDNA-Bank verwendet werden.
cDNA kann aus der angereicherten mRNA-Fraktion unter Verwendung des oligo(dT)-Priming der poly(A)-Schwänze und der reversen Transkriptase des Vogel- Myeloblastosevirus (AMV) unter Verwendung des Verfahrens von H. Okayama et al., Mol. Cell Biol. 3 (1983), 280, hergestellt werden.
Weitere Verfahren zur Herstellung von cDNA-Banken sind selbstverständlich auf dem Fachgebiet gut bekannt. Ein nun klassisches Verfahren verwendet oligo(dT)- Primer, reverse Transkriptase, Anfügen eines poly(dG)-Schwanzes an die doppelsträngige cDNA und Anelierung in einen geeigneten Vektor wie pBR322 oder in ein Derivat davon, das an der gewünschten Restriktionsstelle gespalten und mit einem poly(dC)-Schwanz versehen wurde. Eine genaue Beschreibung dieses alternativen Verfahrens wird beispielsweise im am 21. Mai 1985 erteilten und dem gleichen Anmelder übertragenen US- Patentes Nr. 4,18,584 gegeben.
Unter Verwendung der partiellen Aminosäuresequenz von GROα (vgl. Fig. 1(a) und (b)) und bekannten Codonredundanzen können mehrere DNA-Oligonucleotidsonden synthetisiert und zum Absuchen der cDNA-Bank verwendet werden.
Ein bevorzugtes Verfahren, durch das ein die Entzündungs-Cytokine codierender cDNA-Clon identifiziert werden kann, ist die Verwendung einer cDNA-Bank, die unter Verwendung von von induzierten Monocyten oder peripheren Blutzellen erhaltener RNA produziert wird, und der Nachweis einzelner Clone, die an unter Verwendung von RNA von induzierten und nicht-induzierten Monocyten oder peripheren Blutzellen produzierten cDNA-Sonden unterschiedlich hybridisieren. Clone, die bevorzugt an cDNA- Sonden hybridisieren, die von induzierten, jedoch nicht von nicht-induzierten Monocyten oder von peripherer Blutzell-RNA produziert werden, enthalten die die erfindungsgemäßen Entzündungs-Cytokine codierenden cDNAs.
cDNA-Insertionen können unter Verwendung der bekannten Verfahren sequenziert werden. Das bevorzugte Verfahren ist die Subclonierung der Insertionen in einen geeigneten Vektor, wobei ein Beispiel für einen Vektor pGEM-blue (Promega Biotec. Madison, Wisconsin Corp.) ist, und die Sequenzierung der doppelsträngigen DNA unter Verwendung des von Sanger et al., PNAS (USA) 74 (1977), 5463, beschriebenen Didesoxy-Kettenterminationsverfahrens. Die Sequenzierung wird bequemerweise unter Verwendung von im Handel erhältlichen Kits, vorzugsweise des Sequenase-Sequenzier- Kits, das durch die United States Biochemical Co. Cleveland, Ohio, produziert wird, und unter Verwendung von geeigneten Primem wie T7 und SP6, die von der Promega Biotec. Madison, Wisconsin, erhältlich sind, und sequenzspezifischen Primem durchgeführt.
Die Gegenwart des Entzündungs-Cytokins kann durch eine Reihe von auf dem Fachgebiet bekannten immunologischen Verfahren nachgewiesen werden. Beispiele für geeignete Verfahren sind: das "kompetitive" Verfahren, das in den US-Patenten mit den Nrn. 3,654,090 und 3,80,752 offenbart ist; das "Sandwich"-Verfahren, das in den US- Patenten mit den Nm. RE 31,006 und 4,016,043 offenbart ist; und das "zwei Antikörper"- oder "Fang"-Verfahren. Im Fangverfahren werden drei Antikörper verwendet: Ab&sub1;, Ab&sub2; und Ab&sub3;. Das Verfahren kann durch die nachstehende Gleichung dargestellt werden: Ab&sub1; + Cyt + Ab&sub2; + *Ab&sub3; = Ab&sub1;CytAb&sub2;*Ab&sub3;. Cyt repräsentiert das Entzündungs-Cytokin und *Ab&sub3; das markierte Ab&sub3;. Ab&sub1; und Ab&sub2; erkennen das Entzündungs-Cytokin, während das markierte * Ab&sub3; Ab&sub2; erkennt. Ab&sub1; ist an einen Träger gebunden. Die Gegenwart des Entzündungs-Cytokins wird durch den erhaltenen markierten Komplex von Ab&sub1;CytAb&sub2;*Ab&sub3; nachgewiesen.
In jedem der Verfahren bildet das Entzündungs-Cytokin Komplexe mit einem oder mehreren Antikörpern oder Bindungspartnern und ein Mitglied des Komplexes wird mit einem nachweisbaren Marker markiert. Die Tatsache, daß sich ein Komplex gebildet hat, und gegebenenfalls die Menge davon kann durch bekannte zum Nachweis von Markern geeignete Verfahren ermittelt werden.
Die am häufigsten für diese Untersuchungen verwendeten Marker sind radioaktive Elemente, Enzyme, bei einer Exposition gegen ultraviolettes Licht fluoreszierende Chemikalien, etc. Eine Reihe von fluoreszierenden Materialien sind bekannt und können als Marker verwendet werden. Diese schließen beispielsweise Fluorescein, Rhodamin und Auramin ein. Ein bestimmtes Nachweismaterial ist der anti-Kaninchen-Antikörper, der in Ziegen hergestellt wird und mit Fluorescein über ein Isothiocyanat konjugiert ist. Das Entzündungs-Cytokin oder seine Bindungspartner können auch mit einem radioaktiven Element oder einem Enzym markiert werden. Der radioaktive Marker kann durch jedes der gegenwärtig verfügbaren Zählverfahren nachgewiesen werden. Das bevorzugte Isotop kann aus ¹&sup4;C, ¹³¹I, ³H, ¹²&sup5;I und ³³S ausgewählt werden.
Enzymmarker sind in ähnlicher Weise nützlich und können durch jedes der gegenwärtig verwendeten kolorimetrischen spektrophotometrischen, fluorospektrophotometrischen oder gasometrischen Verfahren nachgewiesen werden. Das Enzym wird an die gewählten Partikel durch Umsetzung mit Brückenmolekülen wie Carbodiimide, Diisocyanate, Glutaraldehyd etc. konjugiert. Viele in diesen Verfahren verwendbare Enzyme sind bekannt und können verwendet werden. Die bevorzugten sind Peroxidase, β-Glucuronidase, β-D-Glucosidase, β-D-Galactosidase, Urease, Glucoseoxidase plus Peroxidase und alkalische Phosphatase. Auf die US-Patente mit den Nrn. 3,654,090, 3,850,752 und 4,016,043 wird hier wegen der Offenbarung von alternativen Markierungsmaterialien und -verfahren als Beispiele bezug genommen.
Die vorstehend beschriebenen Verfahren und ihre Anwendungen sind dem Fachmann alle vertraut und können daher im Schutzbereich der Erfindung verwendet werden.
Nachstehend sind allgemeine Rekombinationsverfahren, die vom Fachmann zum Erhalt von rekombinantem GROβ und -γ modifiziert werden können, beschrieben. In allgemeiner Hinsicht umfaßt die Produktion einer rekombinanten Form von GROB oder -γ üblicherweise das nachstehend beschriebene:
Zunächst eine DNA, die das reife Protein codiert (wie hier verwendet, schließt es alle Muteine ein); das Präprotein; oder eine Fusion des GROβ- oder -γ-Proteins an eine weitere Sequenz, die ihre Aktivität nicht zerstört, oder an eine weitere Sequenz, die unter kontrollierten Bedingungen (wie eine Behandlung mit Peptidase) zur Bereitstellung eines aktiven Proteins erhalten wird. Wenn die Sequenz durch Introns nicht unterbrochen wird, ist sie zur Expression in jedem Wirt geeignet. Wenn es Introns gibt, ist die Expression in Säugern oder anderen eukaryotischen Systemen, die sie verarbeiten können, durchführbar. Diese Sequenz muß ausgeschnitten und gewonnen werden können. Die ausgeschnittene oder gewonnene codierende Sequenz wird anschließend mit geeigneten Kontrollsequenzen in einem replizierbaren Expressionsvektor funktionell verknüpft. Der Vektor wird zur Transformation eines geeigneten Wirts verwendet und der transformierte Wirt unter geeigneten Bedingungen gezüchtet, um das rekombinante GROβ oder -γ zu produzieren.
Genomische oder cDNA-Fragmente werden erhalten und direkt in geeigneten Wirten verwendet. Die in einer Reihe von Wirten funktionierenden Konstruktionen von Expressionsvektoren werden unter Verwendung von geeigneten Replikations- und Kontrollsequenzen, wie nachstehend beschrieben, hergestellt. Geeignete Restriktionsstellen können, sofern sie nicht schon vorhanden sind, an die Enden der codierenden Sequenz angefügt werden, so daß ein ausschneidbares Gen zur Insertion in diese Vektoren bereitgestellt werden kann.
Die Kontrollsequenzen, Expressionsvektoren und Transformationsverfahren sind von der Art der zur Expression des Gens verwendeten Wirtszelle abhängig.
Allgemein sind prokaryotische, Hefe- oder Säugerzellen gegenwärtig als Wirte nützlich. Wirtssysteme, die eine richtige post-translationale Prozessierung durchführen können, sind bevorzugt. Obwohl daher prokaryotische Wirte üblicherweise am effizientesten und bequemsten zur Produktion von rekombinanten Proteinen sind, sind eukaryotische Zellen und besonders Säugerzellen wegen ihrer Prozessierungskapazität, beispielsweise der Fähigkeit zur Bildung von richtigen Glycosylierungsmustern, bevorzugt. Ferner gibt es mehr Sicherheit, daß die native Signalsequenz durch die Säugerwirtszelle erkannt wird, wodurch eine Sekretion möglich und eine Reinigung dadurch leichter wird.
Prokaryoten werden am häufigsten von verschiedenen Stämmen von E. coli repräsentiert. Andere mikrobielle Stämme wie Bacilli, beispielsweise Bacillus subtilis, verschiedene Arten von Pseudomonas oder andere bakterielle Stämme können jedoch auch verwendet werden. In diesen prokaryotischen Systemen werden Plasmidvektoren, die Replikationsstellen und Kontrollsequenzen enthalten, die von einer mit dem Wirt kompatiblen Art stammen, verwendet. Beispielsweise wird E. coli üblicherweise unter Verwendung von Derivaten von pBR322, einem Plasmid, das von einer E. coli-Art durch Bolivar et al., Gene 2 (1977), 95, abgeleitet wird, transformiert. pBR322 enthält Gene für eine Ampicillin- und Tetracyclin-Resistenz und liefert daher weitere Marker, die bei der Konstruktion des gewünschten Vektors entweder erhalten bleiben oder zerstört werden. Üblicherweise verwendete prokaryotische Kontrollsequenzen sind hier so definiert, daß sie Promotoren zur Transkriptionsinitiation einschließen, gegebenenfalls mit einem Operator, zusammen mit Sequenzen von Ribosomenbindungsstellen, die so häufig verwendete Promotoren wie die beta-Lactamase (Penicillinase)- und Lactose (lac)- Promotorsysteme (Chang et al., Nature 198 (1977), 1056), das Tryptophan (trp)-Promotorsystem (Goeddel et al., Nucleic Acids Res. 8 (1980), 4057) und den von λ stammenden PL-Promotor und die N-Gen-Ribosomenbindungsstelle (Shimatake et al., Nature 292 (1981), 128), die als bewegliche Kontrollkassette verwendet werden können, wie im am 8. Dezember 1987 erteilten US-Patent Nr. 4,711,845 offenbart ist, einschließen. Jedes verfügbare mit Prokaryoten kompatible Promotorsystem kann verwendet werden.
Neben Bakterien können auch eukaryotische Mikroben wie Hefe als Wirte verwendet werden. Laborstämme von Saccharomyces cerevisiae, der Bäckerhefe, werden am häufigsten verwendet, obwohl einige andere Stämme allgemein erhältlich sind.
Beispiele für eine Hefeexpression geeignete Plasmidvektoren sind in J. R. Broach, Meth. Enz. 101 (1983), 307, Stinchcomb et al., Nature 282 (1979), 39, Tschempe et al., Gene 10 (1980), 157, und L. Clarke et al., Meth. Enz. 101 (1983), 300, dargestellt. Kontrollsequenzen für Hefevektoren schließen Promotoren zur Synthese von glykolytischen Enzymen ein (Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg. 7 (1968), 149; und Holland et al., Biochemistry 17 (1978), 4900). Beispiele für weitere auf dem Fachgebiet bekannte Promotoren sind der Promotor für die 3-Phosphoglyceratkinase (Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255 (1980), 2073) und die für andere glycolytische Enzyme wie Glyceraldehyd-3- phosphat-Dehydrogenase, Hexokinase, Pyruvatdecarboxylase, Phosphofructokinase, Glucose-6-phosphat-Isomerase, 3-Phosphoglyceratmutase, Pyruvatkinase, Triosephosphatisomerase, Phosphoglucoseisomerase und Glucokinase. Weitere Promotoren, die den zusätzlichen Vorteil der durch die Wachstumsbedingungen kontrollierten Transkription aufweisen, sind die Promotorbereiche für die Alkoholdehydrogenase 2, Isocytochrom C, saure Phosphatase, abbauende Enzyme, die mit dem Stickstoffmetabolismus zusammenhängen, und Enzyme, die für die Maltose- und Galactose-Verwendung (Holland, a.a.O.) verantwortlich sind. Es wird ferner angenommen, daß Terminatorsequenzen am 3'-Ende der codierenden Sequenzen wünschenswert sind. Diese Terminatoren werden im 3'-nicht-translatierten Bereich nach den codierenden Sequenzen in von Hefe stammenden Genen gefunden. Viele der erläuterten Vektoren enthalten Kontrollsequenzen, die vom das Enolasegen enthaltenden Plasmid peno46 (M. J. Holland et al., J. Biol. Chem. 256 (1981), 1385) oder dem von YEp13 erhaltenen LEU2-Gen (J. Broach et al., Gene 8 (1978), 121) stammen, jedoch ist jeder Vektor, der einen Hefekompatiblen Promotor, Replikationsursprung und andere Kontrollsequenzen enthält, geeignet.
Es ist ferner selbstverständlich möglich, Polypeptide codierende Gene in von multizellulären Organismen stammenden eukaryotischen Wirtszelikulturen zu exprimieren. Vgl. beispielsweise Tissue Culture, 1973, Cruz und Patterson, Hrsg., Academic Press. Nützliche Wirtszellinien schließen murine Myelom N51-, VERO- und HeLa-Zellen und Ovarialzellen des chinesischen Hamsters (CHO) ein. Expressionsvektoren für diese Zellen schließen mit Säugerzellen kompatible Promotoren und Kontrollsequenzen ein, wie beispielsweise die üblicherweise verwendeten frühen und späten Promotoren vom Simian Virus 40 (SV40) (Fiers et al., Nature 273 (1978), 113) oder andere virale Promotoren wie die von Polyoma, Adenovirus 2, Rinder-Papilloma-Virus oder die Vogel-Sarkoma-Viren oder Immunglobulin-Promotoren und Hitzeschockpromotoren. Allgemeine Gesichtspunkte der Säugerzell-Wirtssystem-Transformationen wurden von Axel im am 16. August 1983 erteilten US-Patent Nr. 4,399,216 offenbart. Es scheint nun auch, daß "Enhancer"- Bereiche zur Optimierung der Expression wichtig sind; diese sind allgemein Sequenzen, die stromaufwärts des Promotorbereichs gefunden werden. Replikationsursprünge können, falls erwünscht, von viralen Quellen erhalten werden. Die Integration in das Chromosom ist jedoch ein üblicher Mechanismus der DNA-Replikation in Eukaryoten. Die Pflanzenzellen sind nun auch als Wirte verfügbar, und Kontrollsequenzen, die mit Pflanzenzellen wie dem Nopalin-Synthase-Fromotor und Polyadenylierungssignalsequenzen (A. Depicker et al., J. Mol. Appl. Gen. 1 (1982), 561) kompatibel sind, sind verfügbar. Verfahren und Vektoren zur Transformation von Pflanzenzellen wurden in der am 7. November 1985 veröffentlichten PCT-Veröffentlichung Nr. WO 85/04899 offenbart.
Wirtsstämme, die hier zur Clonierung und Expression verwendet werden können, sind nachstehend beschrieben:
Zur Clonierung und Sequenzierung und zur Expression der Konstruktion unter der Kontrolle der meisten bakteriellen Promotoren kann der E. coli-Stamm MM294, der vom E. coli Genetic Stock Center GCSC #6135 erhalten wurde, verwendet werden. Zur Expression unter der Kontrolle des PLN~5-Promotors kann das E. coli K12-MC1000- Lambda-Lysogen, N&sub7;N&sub5;&sub3;cI857 SusP80, ein bei der American Type Culture Collection hinterlegter Stamm (ATCC 39531), verwendet werden. E. coli DG116, der am 7. April 1987 bei der ATCC (ATCC 53606) hinterlegt wurde, kann ebenfalls verwendet werden.
Für M13-Phagen-Rekombinante können die für eine Phageninfektion empfindlichen E. coli-Stämme wie der E. coli K12-Stamm DG98 verwendet werden. Der Stamm DG98 wurde am 13. Juli 1984 bei der ATCC (ATCC 39768) hinterlegt.
Eine Säugerexpression kann in COS-A2-Zellen, COS-7-, CV-1-, Hamster- und Mauszellen erreicht werden. Eine Expression durch Insektenzellen kann in Spodoptera frugiperda erfolgen.
Je nach der verwendeten Wirtszelle wird die Transformation unter Verwendung von für diese Zellen geeigneten Standardverfahren durchgeführt. Die Calciumbehandlung unter Verwendung von Calciumchlorid, wie von S. N. Cohen, PNAS (USA) 69 (1972), 2110, beschrieben, wird für Prokaryoten oder andere Zellen, die wesentliche Zellwandbarrieren enthalten, verwendet. Die Infektion mit Agrobacterium tumefaciens (C. H. Shaw et al., Gene 23 (1983), 315) wird für bestimmte Pflanzenzellen verwendet. Für Säugerzellen ohne diese Zellwände wird das Calciumphosphatpräzipitationsverfahren von Graham und von der Eb, Virology 52 (1987), 546, bevorzugt. Transformationen in Hefe werden gemäß dem Verfahren von P. Van Solingen et al., J. Bact. 130 (1977), 946, und C. L. Hsiao et al., PNAS (USA) 76 (1979), 3829, durchgeführt.
RNA wird für einen Northern-Blot durch Agaroseplatten-Gelelektrophorese unter vollständig denaturierenden Bedingungen unter Verwendung von Formaldehyd (T. Maniatis et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Press, (1982), 202-203) oder 10 mM Methylquecksilber (CH&sub3;HgOH) (J. M. Bailey et al., Anal. Biochem. 70 (1976), 75- 85, und P. B. Shegal et al., Nature 288 (1980), 95-97) als Denaturierungsmittel fraktioniert. Für Methylquecksilbergele werden 1,5% Gele durch Schmelzen der Agarose in Laufpuffer (100 mM Borsäure, 6 mM Natriumborat, 10 mM Natriumsulfat und 1 mM EDTA, pH 8,2), Abkühlen auf 60ºC und Zugabe von 1/100 Volumen von 1 M CH&sub3;HgOH hergestellt. Die RNA wird in 0,5 · Laufpuffer gelöst und durch Inkubation in 10 mM Methylquecksilber 10 Minuten bei Raumtemperatur denaturiert. Glycerin (20%) und Bromphenolblau (0,05%) werden zum Laden der Proben zugesetzt. Die Proben werden bei 500 bis 600 Volt/Std. bei Rezirkulation des Puffers einer Elektrophorese unterzogen. Nach der Elektrophorese wird das Gel 40 Minuten in 10 mM 2-Mercaptoethanol gewaschen, um das Methylquecksilber zu enttoxifizieren, und Northern-Blots werden durch Transfer der RNA vom Gel auf ein Membranfilter hergestellt.
cDNA- oder Genombanken werden unter Verwendung des Kolonie- oder Plaque-Hybridisierungsverfahrens abgesucht. Bakterienkolonien oder die Phagenplaques werden auf Nitrocellulosefilterpapierduplikate (S&S-Typ BA-85) transferiert. Die Plaques oder Kolonien werden lysiert und die DNA an das Filter durch sequentielle Behandlung 5 Minuten mit 500 mM NaOH und 1,5 M NaCl fixiert. Die Filter werden zweimal 5 Minuten jedesmal mit 5 · Standard-Kochsalzcitrat (SSC) gewaschen, an der Luft getrocknet und 2 Stunden bei 80ºC gebacken.
Die Gele für Northern-Blot oder die Duplikatfilter für die cDNA- oder Genomabsuche werden bei 25º bis 42ºC 6 bis 8 Stunden mit 10 ml pro Filter an DNA- Hybridisierungspuffer ohne Sonde (0 bis 50% Formamid, 5 bis 6 · SSC, pH 7,0, 5 · Denhardt's-Lösung (Polyvinylpyrrolidin, plus Ficoll und Rinderserumalbumin; 1 · = jeweils 0,02%), 20 bis 50 mM Natriumphosphatpuffer bei einem pH-Wert von 7,0, 0,2% Natriumdodecylsulfat (SDS), 20 ug/ml poly U (bei einer Absuche von cDNA) und 50 ug/ml denaturierte Lachssperma-DNA) vorhybridisiert. Die Proben werden anschließend durch Inkubation bei einer geeigneten Temperatur etwa 24 bis 36 Stunden unter Verwendung des die Kinase behandelte Sonde (für Oligomere) enthaltenden Hybridisierungspuffers hybridisiert. Sonden für längere cDNA oder Genomfragmente wurden durch Nicktranslation oder Primerextension markiert.
Die Bedingungen sowohl der Vorhybridisierung als auch der Hybridisierung hängen von der gewünschten Stringenz ab und ändern sich beispielsweise mit der Sondenlänge. Unter üblichen Bedingungen für relativ lange Sonden (z. B. mit mehr als 30 bis 50 Nucleotiden) wird eine Temperatur von 42ºC bis 55ºC und ein etwa 20 bis 50% Formamid enthaltender Hybridisierungspuffer verwendet. Für geringere Stringenzen, die für oligomere Sonden von etwa 15 Nucleotiden benötigt werden, werden geringere Temperaturen von etwa 25 bis 42ºC und geringere Formamidkonzentrationen (0% bis 20%) verwendet. Bei längeren Sonden können die Filter beispielsweise viermal 30 Minuten jedesmal bei 40 bis 55ºC mit 2 · SSC, 0,2% SDS und 50 mM Natriumphosphatpuffer bei pH 7 gewaschen werden und anschließend zweimal mit 0,2 · SSC und 0,2% SDS gewaschen, an der Luft getrocknet und bei -70ºC 2 bis 3 Tage autoradiographiert werden. Die Waschbedingungen sind bei kürzeren Sonden etwas weniger streng.
Zur Konstruktion von geeigneten Vektoren, die die gewünschten codierenden und Kontrollsequenzen enthalten, werden auf dem Fachgebiet gut bekannte Standardligierungs- und Restriktionsverfahren verwendet. Isolierte Plasmide, DNA-Sequenzen oder synthetisierte Oligonucleotide werden gespalten, zugeschnitten und in der gewünschten Form erneut ligiert.
Die stellenspezifische DNA-Spaltung wird durch Behandlung mit dem geeigneten Restriktionsenzym (oder -enzymen) unter Bedingungen, die auf dem Fachgebiet allgemein bekannt sind und deren Einzelheiten durch den Hersteller dieser im Handel erhältlichen Restriktionsenzyme beschrieben werden, durchgeführt. Vgl. z. B. New England Biolabs, Product Catalog. Allgemein wird etwa 1 ug Plasmid oder DNA- Sequenz durch 1 Einheit Enzym in etwa 20 ul Pufferlösung gespalten; in den nachstehend beschriebenen Beispielen wird üblicherweise ein Überschuß an Restriktionsenzym zur Sicherstellung einer vollständigen Spaltung des DNA-Substrats verwendet. Inkubationszeiten von etwa 1 Stunde bis 2 Stunden bei etwa 37ºC sind geeignet, obwohl Variationen toleriert werden können. Nach jeder Inkubation wird das Protein durch Extraktion mit Phenol/Chloroform und gegebenenfalls mit einer anschließenden Etherextraktion und die Nucleinsäure aus den wäßrigen Fraktionen durch Präzipitation mit Ethanol entfernt. Falls gewünscht kann eine Größentrennung der gespaltenen Fragmente durch Polyacrylamidgel- oder Agarosegelelektrophorese unter Verwendung von Standardverfahren durchgeführt werden. Eine allgemeine Beschreibung von Trennungen nach Größe gibt Methods of Enzymology 65 (1980), 499-560.
Durch Restriktion gespaltene Fragmente können ein glattes Ende durch Behandlung mit dem großen Fragment der E. coli-DNA-Polymerase I (Klenow) in Gegenwart der vier Desoxynucleotidtriphosphate (dNTPs) unter Verwendung von Inkubationszeiten von etwa 15 bis 25 Minuten bei 20 bis 25ºC in 50 mM Dithiothreit (DTT) und 5 bis 10 uM dNTPs aufweisen. Das Klenowfragment füllt 5'-seitig überstehende Enden auf, verkürzt jedoch 3'-seitig-überstehende Einzelstränge, obwohl die vier dNTPs vorhanden sind. Falls gewünscht kann eine selektive Reparatur durch Zugabe nur eines der oder von selektierten dNTPs innerhalb der durch die Natur der überstehenden Enden diktierten Beschränkungen durchgeführt werden. Nach einer Behandlung mit Klenow wird das Gemisch mit Phenol/Chloroform extrahiert und mit Ethanol ausgefällt. Eine S1-Nuclease- Behandlung unter geeigneten Bedingungen bewirkt eine Hydrolyse jedes einzelsträngigen Teils.
Synthetische Oligonucleotide können durch das Triesterverfahren von Matteucci et al., J. Am. Chem. Soc. 103 (1981), 3185-3191, oder unter Verwendung von automatisierten Syntheseverfahren hergestellt werden. Eine Kinasebehandlung von Einzelsträngen vor der Anelierung oder zur Markierung wird unter Verwendung eines Überschusses, z. B. etwa 10 Einheiten Polynucleotidkinase zu 1 nmol Substrat, in Gegenwart von 50 mM Tris, pH 7,6, 10 mM MgCl&sub2;, 5 mM DTT und 1 bis 2 mM ATP erreicht. Wenn eine Kinasebehandlung der Markierung der Sonde dient, enthält das ATP 32YP mit hoher spezifischer Aktivität.
Ligierungen werden in 15 bis 30 ul Volumen unter den nachstehend beschriebenen Standardbedingungen und Temperaturen durchgeführt: 20 mM Tris-Cl, pH 7,5, 10 mM MgCl&sub2;, 10 mM DTT, 33 ug/ml Rinderserumalbumin (BSA), 10 mM bis 50 mM NaCl, und entweder 40 uM ATP, 0,01 bis 0,02 (Weiss) Einheiten T4-DNA-Ligase bei 0ºC (Ligierung mit "überstehenden Enden") oder 1 mM ATP und 0,3 bis 0,6 (Weiss) Einheiten T4-DNA-Ligase bei 14ºC (zur Ligierung "glatter Enden"). Intermolekulare Ligierungen über "überstehende Enden" werden üblicherweise bei 33 bis 100 ug/ml Gesamt-DNA-Konzentration (5 bis 100 nM Gesamtendkonzentration) durchgeführt. Intermolekulare glattendige Ligierungen (üblicherweise einen 10 bis 30fachen molaren Überschuß von Linkem verwendend) werden bei 1 uM Endkonzentration durchgeführt.
In der Vektorkonstruktion, in der "Vektorfragmente" verwendet werden, wird das Vektorfragment üblicherweise mit bakterieller alkalischer Phosphatase (BAP) zur Entfernung des 5'-Phosphats und Verhinderung einer erneuten Ligierung des Vektors behandelt. BAP-Spaltungen werden bei pH 8 in etwa 150 mM Tris in Gegenwart von Na²&spplus; und Mg²&spplus; unter Verwendung von etwa 1 Einheit BAP pro ug Vektor bei 60ºC etwa 1 Stunde durchgeführt. Zur Gewinnung der Nucleinsäurefragmente wird die Präparation mit Phenol/Chloroform extrahiert und mit Ethanol ausgefällt. Alternativ kann eine erneute Ligierung in Vektoren, die durch eine weitere Spaltung der unerwünschten Fragmente durch Restriktionsenzyme doppelt gespalten wurden, verhindert werden.
Für Teile der Vektoren, die von cDNA oder genomischer DNA stammen, die Sequenzmodifikationen erfordern, wird eine von einem stellenspezifischen Primer abhängige Mutagenese verwendet. Dieses Verfahren ist nun Standard auf dem Fachgebiet und wird unter Verwendung eines als Primer dienenden synthetischen Oligonucleotids, das zu einer mutagenisierten Einzelstrang-Phagen-DNA komplementär ist, ausgenommen von begrenzten, die gewünschte Mutation repräsentierenden Fehlpaarungen, durchgeführt. Kurz gesagt, das synthetische Oligonucleotid wird als Primer zur direkten Synthese eines Phagen-komplementären Strangs verwendet, und die erhaltene doppelsträngige DNA wird in ein Phagen-unterstützendes Wirtsbakterium transformiert. Die Kulturen der transformierten Bakterien werden in Topagar plattiert, was eine Plaquebildung aus einzelnen den Phagen enthaltenden Zellen ermöglicht.
Theoretisch enthalten 50% der neuen Plaques den Phagen mit der mutierten Form als Einzelstrang: 50% haben die ursprüngliche Sequenz. Die Plaques werden mit Kinase behandeltem synthetischem Primer bei einer Temperatur, die eine Hybridisierung bei einer genauen Übereinstimmung ermöglicht, bei der jedoch die Fehlpaarungen mit dem ursprünglichen Strang zur Verhinderung einer Hybridisierung ausreichen, hybridisiert. Mit der Sonde hybridisierende Plaques werden anschließend gepickt und gezüchtet, und die DNA wird gewonnen.
Korrekte Ligierungen für die Plasmidkonstruktion konnten bestätigt werden, indem zunächst der E. coli-Stamm MM294 oder ein anderer geeigneter Wirt mit dem Ligierungsgemisch transformiert wurde. Erfolgreiche Transformanten werden durch Ampicillin, Tetracyclin oder eine andere Antibiotikaresistenz oder unter Verwendung von anderen Markern, je nach der Art der Plasmidkonstruktion, wie es auf dem Fachgebiet bekannt ist, selektiert. Plasmide von den Transformanten werden anschließend gemäß dem Verfahren von D. B. Clewell et al., PNAS (USA) 62 (1969), 1159, gegebenenfalls nach einer Chloramphenicol-Amplifikation (D. B. Clewell, J. Bacteriol. 110 (1972), 667) hergestellt. Die isolierte DNA wird durch Restriktion analysiert und/oder durch das Didesoxy-Verfahren von F. Sanger et al., PNAS (USA) 74 (1977), 5463, wie von Messing et al., Nucleic Acids Res. 9 (1981), 309, genauer beschrieben, oder durch das Verfahren von Maxam et al., Methods in Enzymology 65 (1980),499, sequenziert.
Der allgemeine Ablauf zur Isolierung und Reinigung der Entzündungs- Cytokine besteht aus der Freisetzung des Moleküls aus dem Cytoplasma der geeigneten Zellen, Gewebe oder Organe, mit einer anschließenden Entfernung von unlöslichem Material und Unterziehen der löslichen Fraktion einem oder mehreren chromatographischen Schritten einschließlich einer Anionen- und Kationenaustauschchromatographie. Verschiedene Reinigungsverfahren können zur Reinigung der Entzündungs- Cytokine verwendet werden. Ungeachtet des gewählten Verfahrens und je nach der Art des biologischen Materials, aus dem die Entzündungs-Cytokine gereinigt werden, kann es wünschenswert sein, daß ein oder mehrere Proteaseinhibitoren, beispielsweise PMSF, in verschiedenen Reinigungslösungen vorhanden sind. Ferner können, wie es auf dem Fachgebiet bekannt ist bestimmte Reinigungsschritte bei Temperaturen durchgeführt werden, die das Proteolyserisiko der Entzündungs-Cytokine reduzieren.
Genauer gesagt wird jedes Entzündungs-Cytokin durch Freisetzung des Moleküls aus dem Cytosol unter Verwendung einer beliebigen Zahl von Verfahren, einschließlich Gefrieren/Auftauen, Ultraschallbehandlung, milde Detergensextraktion etc. hergestellt. Dieses Verfahren wird vorzugsweise in einer physiologisch gepufferten Lösung, die einen oder mehrere Proteaseinhibitoren enthält, durchgeführt. Ferner kann zur weiteren Inhibition der Proteaseaktivität, besonders der Proteasen, die für ihre Aktivität Metallionen benötigen, die Extraktionslösung Metallionenchelatoren enthalten. Die bevorzugte Extraktionslösung ist eine physiologisch balancierte Salzlösung, die die Chelatoren Ethylenglycoltrichloressigsäure (EGTA) oder EDTA, plus den Proteaseinhibitor Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) enthält. Der Metallionenchelator(en) sowie die Proteaseinhibitor(en) sind in eine Proteolyse effektiv hemmenden Konzentrationen vorhanden, vorzugsweise etwa 5 mM bzw. 100 uM. Es wird jedoch selbstverständlich dem Fachmann bewußt sein, daß, da die Arten und Mengen von Proteasen je nach Ausgangsmaterial, das zur Extraktion des Entzündungs-n Cytokins verwendet wird, variieren, die Konzentrationen, bei denen Proteaseinhibitoren oder Chelatbildner verwendet werden, falls sie überhaupt verwendet werden, ebenfalls variieren.
Das Gemisch, das das Entzündungs-Cytokin enthält, wird durch Zentrifugation oder andere Verfahren zur Entfernung von unlöslichem Material aus der wäßrigen Cytosolfraktion geklärt. Wenn die Cytosolfraktion geringe Mengen von Entzündungs- Cytokin enthält, kann es durch ein beliebiges, dem Fachmann bekanntes Verfahren, einschließlich Ausfällung mit einer großen Menge Salz, beispielsweise Ammoniumsulfat, oder durch Ultrafiltration konzentriert werden. Bei einer Konzentration durch Ausfällung wird das Entzündungs-Cytokin anschließend vorzugsweise in einer geeigneten physiologischen Salzlösung, die einen Proteaseinhibitor(en) enthält und etwa 0,1% nichtionisches Detergens enthalten kann, resuspendiert. Diese Lösung wird anschließend für eine Ionenaustauschchromatographie hergestellt, indem sie gegen eine kompatibel gepufferte Chromatographielösung dialysiert wird, die vorzugsweise millimolares Phosphat, einen Metallionenchelator und einen Proteaseinhibitor enthält.
Das Reinigungsverfahren enthält vorzugsweise mindestens einen Ionenaustauschschritt. Ein Beispiel eines Kationenaustauschers ist ein SP-Cellulosekationenaustauscher. Diese sind im Handel von AMF Molecular Separations Division, Meridian, CT, unter den Markennahmen ZetaPrep SP-Patronen erhältlich. Der SP- Cellulose-Kationenaustauscher ist ein elastisches 3-dimensionales Netzwerk, das aus den Cellulosehauptsträngen besteht, die mit dem angehängte funktionelle Sulfopropylgruppen enthaltenden Vinylpolymer vernetzt sind. Die Matrix wird vorzugsweise für eine radiale Fließpassage der Entzündungs-Cytokinlösung verwendet. Die Fließrate der Lösung durch die Matrix hängt von Größe und Geometrie der verwendeten Matrix ab. Dem Fachmann ist jedoch bewußt, daß eine vorsichtige Durchführung nötig ist, um eine Überschreitung der Einheitenkapazität der Matrix für das Entzündungs-Cytokin zu vermeiden. Bei einer Überschreitung der Kapazität wird das Entzündungs-Cytokin nicht vollständig zurückgehalten und überschüssiger nicht zurückgehaltener Inhibitor ist im Ausfluß vorhanden. Beispiele für verwendbare Anionenaustauschchromatographie-Materialien sind DEAE-Sepharose (Pharmacia Corp.) und TSK-DEAE-5-PW.
Wie vorstehend beschrieben ist die anfängliche Abfolge der Chromatographieverfahren nicht streng und kann variiert werden. Neben der Anionenaustauschchromatographie können andere auf dem Fachgebiet bekannte und durchgeführte Chromatographieverfahren allein oder kombiniert verwendet werden. Beispiele für Verfahren schließen eine Affinitätschromatographie vorzugsweise unter Verwendung von für die Entzündungs-Cytokine spezifischen Antikörpern ein.
Die Verfahren zur Elution von Proteinen aus Anionenaustauschern und Affinitätssäulen sind gut dokumentiert und auf dem Fachgebiet allgemein bekannt. Beispielsweise können die Entzündungs-Cytokine von DEAE unter Verwendung eines geeignet gepufferten Salzgradienten eluiert werden, während im letzteren Fall die Zugabe eines chaotropen Mittels effektiv sein kann. Der Salzgradient und die Konzentration des Chaotrops können empirisch ermittelt werden.
Ein drittes chromatographisches Verfahren, das allein oder kombiniert zur Reinigung der Entzündungs-Cytokine verwendet werden kann, ist die hydrophobe Interaktionschromatographie. Eine Reihe von hydrophoben lnteraktionschromatographiematrices kann verwendet werden. Allgemein werden Materialien und Verfahren zur hydrophoben Chromatographie von S. Shaltie, Methods in Enzymology 104 (1984), 69, beschrieben. Die Herstellung dieser Lösungen ist auf dem Fachgebiet bekannt. Die Reinheit der so erhaltenen Entzündungs-n Cytokine kann durch eine unter reduzierenden Bedingungen durchgeführte Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese überwacht werden. Die allgemeinen Verfahren zur Herstellung und Verwendung der vorstehend beschriebenen Reinigungsmaterialien sind dem Fachmann bekannt.
Wie nachstehend in Beispiel 1 beschrieben, wurden die GROβ- und -γ-Gene in Gegenwart von Entzündungs-n Wirkstoffen exprimiert. Ohne an das nachstehende Postulat gebunden zu sein, wird postuliert, daß Behandlungen unter Verwendung von GROβ und γ die Schwere der Entzündung und die damit verbundene Krankheit oder den damit zusammenhängenden Zustand verhindern oder mildern.
Beispiel 1 zeigt ferner, daß GROγ in Dickdarmepitheltumorzellen, jedoch nicht in benachbarten normalen Epithelzellen gefunden wurde. Im Vergleich dazu wurde beobachtet, daß GROG in anderen Tumorzellinien wie CHEF/16-Zellen, src-transformierten Hühnerfibroblasten und menschlichen Melanomen überexprimiert wird. Andererseits wurde ebenfalls beobachtet, daß GROα in normal wachsenden Säugerzellen exprimiert wird, jedoch in vielen Carcinomen fehlte. (A. Anisowicz et al., 1988, PNAS (USA), a.a.O.). Es erscheint, daß die differentielle Expression von GROβ oder -γ in verschiedenen Zellinien die Transformation dieser Zellen beeinflussen kann. Daher umfaßt je nach den fraglichen Zell- und Tumorarten der Tumorbehandlungsplan die Variation der für Zellen zugänglichen Menge von GROβ oder -γ. Dies kann entweder durch eine Erhöhung oder Abnahme der den Zellen verfügbaren Mengen von GRO- Proteinen, in Abhängigkeit davon, ob die Tumorigenese auf eine Über- oder Unterexpression der GRO-Gene zurückzuführen ist, erreicht werden.
Nach der Beschreibung der Erfindung aus der Sicht der Anmelder werden die nachstehenden Beispiele zur Erläuterung der Erfindung präsentiert und sollen nicht so ausgelegt werden, daß sie den Schutzbereich der Erfindung begrenzen. Beispielsweise kann eine Variation in: der Quelle der Entzündungs-Cytokine; dem Verfahren zur Induktion, Aktivierung und allgemein zur Produktion und zum Erhalt der Entzündungs- Cytokine und Antikörper gegen sie; den sie verwendenden Diagnosetests; den Nachweistests für sie verwendet werden, ohne den Schutzbereich der vorliegenden Erfindung zu verlassen.

Beispiel 1

Die cDNA-Bank aus haftenden Monocyten wurde im bakteriellen Expressionsvektor λgt10 unter Verwendung von Gesamt-RNA von menschlichen Blutmonocyten, die 30 Minuten bei 37ºC an Plastik haften, hergestellt. Die cDNA-Bank wurde in dieser Anmeldung verwendet und die Konstruktion und Absuche der Bank, wie in S. A. Sporn, J. of Immunol., a.a.O., beschrieben, durchgeführt. Das Verfahren war, wie nachstehend beschrieben.
Die Monocyten wurden aus Plättchen-Phorese-Rückstandsbeuteln vom American Red Cross (Durham, NC) isoliert. Mononukleäre Zellen wurden zunächst durch Ficoll-Hypaque-Sedimentation gemäß dem in Boyum, A., Scand. J. Clin. Lab. Invest. 21 (1986), 77, beschriebenen Verfahren isoliert und dreimal mit Versene (GIBCO, Grand Island, NY) zur Entfernung der Plättchen gewaschen. Die Monocyten wurden anschließend durch Percoll-Dichtefraktionierung, wie von A. J. Ulmer et al., J. Immunol. Methods 30 (1979), 1, beschrieben, oder durch Haftung an Gewebekulturgefäßen aus Plastik (Corning 25020, Corning, NY), wie von D. F. Eierman et al., 1989, a.a.O., beschrieben, isoliert.
Monocyten wurden in Endotoxin-freiem RPMI 1640-Medium (Cell-gro, Fisher Scientific, Raleigh, NC) entweder an Plastik haftend bei 1 bis 2 · 10&sup7; Zellen/Gefäß oder nicht-haftend in 50 ml-Polypropylen-Röhrchen (Fisher) bei 10&sup6; Zellen/ml (30 ml/Röhrchen) gezüchtet. Monocyten wurden serumfrei, sofern nicht anders angegeben, bei 37ºC in 5% CO&sub2; gezüchtet. Die Beschichtung der Platten mit Fibronectin (FN), Kollagen oder FN/anti-FN-Komplexen wurde, wie von D. F. Eierman et al., 1989, a.a.O., beschrieben, durchgeführt.
Die Gesamt-R. NA, die von 30 Minuten an Plastik haftenden Monocyten isoliert wurde, wurde zur Konstruktion einer cDNA-Bank unter Verwendung von modifizierten Verfahren von Watson und Jackson verwendet (C. J. Watson et al., DNA Cloning, A Practical Approach Bd. 1 (1985), 79, Glover, D. M., Hrsg., IRL Press, Oxford, England, und T. V. Huynh et al., DNA Cloning, A Practical Approach Bd. 1 (1985), 49, Glover, D. M., Hrsg., IRL Press. Oxford, England). RNA wurde unter Verwendung der reversen Transkriptase des Vogel-Myeloblastosevirus und des Klenowfragments der DNA- Polymerase 1 in dscDNA umgewandelt. dscDNA-Fragmente mit EcoRI-Linkem wurden nach Größe selektiert und in λgt10 unter Verwendung von Gigapack (Stratagene, San Diego, CA) verpackt. Die nicht-amplifizierte Bank enthielt etwa 5,3 · 10&sup6; Rekombinanten mit einer Häufigkeit von 7 · 10&sup7;/ug DNA.
Fünfzigtausend Plaques der ursprünglichen Bank wurden gezüchtet und Plaquelifts an cDNA-Sonden eines ³²P-markierten ersten Strangs, die aus Zeitpunkt 0 (nicht-induzierter)-Monocyten-RNA hergestellt wurden, hybridisiert. Zur Reduktion der Zahl von Clonen beim Absuchen, die von nicht-induzierten Monocyten exprimiert werden, wurden 4 000 Clone, die nicht an die Zeitpunkt 0-Sonde hybridisierten, selektiert und zur Bildung einer Unterbank vereinigt. Die ursprüngliche Bank und anschließend die Unterbank wurden mit einer IL-1β-Sonde, die ein Beispiel eines durch Haftung induzierten Gens ist, hybridisiert. Dies zeigte eine 3- bis 4fache Anreicherung der induzierten Clone in der Unterbank und einen Verlust von mehr als 80% von Clonen, der bei haftenden und nicht-haftenden Monocyten üblich war.
Die Unterbank wurde durch differenzielle Hybridisierung mit ³²P-markierten Gesamt-Erststrang-cDNA-Sonden, die von RNA entweder von 30 Minuten und 4 Stunden haftenden oder nicht-haftenden Monocyten hergestellt wurden, unter Verwendung des von T. V. Huynh et al., 198. a.a.O., beschriebenen Verfahrens abgesucht. Plaques, die bevorzugt mit den Gesamt-cDNA-Sonden hybridisierten, die von adhärenten Monocyten im Gegensatz zu nicht-adhärenten Monocyten hergestellt wurden, wurden selektiert und erneut abgesucht. Insgesamt 35 Clone von 111 ursprünglichen Isolaten blieben positiv nach dem zweiten Absuchen.
PMA, E. coli-Serotyp 055:BS LPS, das Calciumionophor A23187 und menschliches Kollagen Typ I wurden von der Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO) erhalten. Menschliches FN und anti-menschliches FN wurden von der Collaborative Research (Bedford, MA) erhalten.
Die Gesamt-RNA wurde unter Verwendung des Guanidinisothiocyanat- Cäsiumchlorid-Verfahrens, wie von J. M. Chirgwin et al., Biochemistry 18 (1979), 5294, beschrieben, isoliert. Die Gesamt-RNA (15 ug/Bahn) wurde denaturiert und einer Elektrophorese auf 1% Agarosegelen, die Formaldehyd enthielten, unterzogen. RNA wurde anschließend durch Northern-Transfer (wie von Thomas, P. S., PNAS (USA) 77 (1980), 5201, beschrieben) auf Nitrocellulose geblottet. Clon-cDNA-Insertionen wurden vom λgt10-Vektor ausgeschnitten, durch Nick-Translation mit ³²P-markiert und als Sonden zur Hybridisierung von Northem-Blots verwendet. Die Hybridisierungen wurden bei 42ºC, wie von Haskill et al., 1988, a.a.O., beschrieben, durchgeführt und die Blots mit einer Stringenz von 0,2 · SSC bei 56ºC gewaschen.
cDNA-Insertionen wurden in den doppelsträngigen Vektor pGEM-blau (Promega Biotec, Madison, Wl) subcloniert. Die dsdDNA-Sequenzierung wurde durch das Didesoxy-Kettenterminationsverfahren (wie von F. S. Sanger et al., PNAS (USA) 74 (1977), 5463, beschrieben) unter Verwendung des Sequenase-Sequenzier-Kits (United States Biochemical Co., Cleveland, OH) mit T7- und SP6-Primern (Promega), sowie Sequenz-spezifischen Oligonucleotidprimem (Cetus Corp., Emeryville, CA) durchgeführt.
Menschliche Monocyten-DNA wurde (wie von T. Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, N. Y., S. 382, beschrieben) isoliert und mit den angegebenen Restriktionsenzymen gespalten. Die gespaltene DNA wurde auf einem 1% Agarosegel einer Elektrophorese unterzogen, denaturiert und auf Nitrocellulose (wie von Southern, E. M., J. Mol. Biol. 98 (1975), 503, beschrieben) transferiert.
Ein 880 bp partieller Clon (C2 m) (mit der Bezeichnung MAD-2 in Sporn et al., 1990, a.a.O.), der durch subtraktive Hybridisierung isoliert wurde, zeigte eine Sequenzähnlichkeit zum ursprünglichen GRO, enthielt jedoch eine Reihe von Veränderungen im codierenden 3'-Bereich. Dieser Clon wurde zur Isolierung von 5 weiteren Clonen von einer zweiten Bank verwendet, die von Mezerein- und Calciumionophor-stimulierten Leukocyten produziert wird; das Verfahren ist nachstehend beschrieben.
Die cDNA wurde von RNA erzeugt, die von induzierten peripheren Blutlymphocyten erhalten wurde. Diese Verfahren sind auf dem Fachgebiet gut bekannt. Das bevorzugte Verfahren besteht aus der dreitägigen Induktion von peripheren Blutzellen mit einem Calciumionophor und Mezerein. Das bevorzugte Ionophor ist A-23187. Das Induktionsverfahren wird allgemein im am 15. März 1983 erteilten US-Patent Nr. 4,376,821 "Production of Human IFN-Gamma (Immune) Interferon" für I. A. Braude offenbart.
Genauer gesagt wurden Leukocyten mit 100 ng/ml Mezerein und 0,25 ug/ml Calciumionophor A-23187 induziert. Der Induktionszeitraum war etwa 3 Tage, wonach die Gesamt-RNA von den induzierten peripheren Blutlymphocyten isoliert wurde, unter Verwendung von im wesentlichen dem Guanidinisothiocyanat-Cäsiumchlorid, das von Chirgwin et al., 1979, a.a.O., beschrieben wurde, und die poly(A+)-Messenger-RNA wurde von der Gesamt-RNA-Fraktion durch Chromatographie auf oligo (dT)-Cellulose, wie von Aviv et al., 1972, a.a.O., beschrieben, isoliert.
Anschließend wurde der erste Strang der cDNA durch reverse Transkription der mRNA, wie nachstehend beschrieben, erhalten. 33 ug der poly(A+)-RNA wurden in ein Mikrozentrifugenröhrchen gegeben und 5 Minuten bei 65ºC inkubiert und anschließend 5 Minuten auf Eis gekühlt. Anschließend wurde der RNA nacheinander folgendes zugesetzt: 66 ul 250 mM Tris-HCl, pH 8,3; 375 mM KCl; 15 mM MgCl&sub2;; 10,0 mM DTT; 9,0 ul RNAs in [40 E/ul]; 16,5 ul 10 mM dNTPs (d. h. 10 mM dATP + 10 mM dCTP + 10 mM dGTP + 10 mM dTTP); 35,0 ul p(dT)12-18(100 umol/ul) (p(dT)12-18 bezeichnet Oligodesoxythymidilinsäure-Population mit Längen von 12-mer, 13-mer etc. bis zu 18- mer); und 16,5 ul Maus-Leukämievirus (MLV)-reverse Transkriptase (200 E/ul) und Wasser für ein Gesamtvolumen von 330 ul.
Zur Überwachung der Effizienz der Erststrangsynthese durch alkalische Agarosegelelektrophorese wurde ein zweites Röhrchen hergestellt, das 2 ul [α³²P]dCTP (10 uCi/ul) und 20 ul des Erststrangreaktionsgemisches, wie vorstehend beschrieben hergestellt, enthielt.
Beide Röhrchen wurden 60 Minuten bei 37ºC inkubiert, wonach die Reaktionen durch Stellen der Röhrchen in Eis beendet wurden. 5 ul 0,5 M EDTA und 23 ul Wasser wurden dem [α³²P] dCTP enthaltenden Röhrchen zugesetzt. Beide Röhrchen wurden bei -20ºC aufbewahrt.
Der zweite Strang des cDNA-Duplex wurde, wie nachstehend beschrieben, hergestellt. 37.5 ul des wie vorstehend beschrieben synthetisierten Erststranggemisches wurden in 8 getrennten Röhrchen auf Eis aliquotiert. Ferner wurden 6,25 ul des Gemisches in ein 9. Röhrchen auf Eis pipettiert. Anschließend wurden jedem der 8 Röhrchen 262,5 ul eines Zweitstrangcocktails und zum Rest oder Kontrollröhrchen 43,75 ul zugesetzt. Der Zweitstrangcocktail bestand aus dem folgenden: 600,0 ul 5 · Zweitstrangpuffer (SSB) (5 · SSB bestand aus 94 mM Tris-HCl, pH 8,3, 453 mM KCl, 23,3 mM MgCl&sub2;, 18,7 mM DTT) 1802,9 ul Wasser, 56,3 ul 10 mM dNTPs, 12,5 ul [α³²P] dCTP, 75,0 ul 6 mM β-NAD, 75,0 ul DNA-Polymerase I (10 E/ul) und 3,4 ul E. coli-Ligase (9 E/ul)). Das Gesamtvolumen der Reagenzien im Zweitstrangcocktail war 2 625,0 ul. Alle 9 Röhrchen wurden 2 Stunden bei 16ºC inkubiert, wonach zum 9. Röhrchen 5 ul 0,5 M EDTA und 65 ul Wasser zugesetzt wurden. Die Inhalte dieses Röhrchens wurden bei -20ºC für eine anschließende alkalische Agarosegelanalyse aufbewahrt.
Anschließend wurden die Inhalte der 8 Röhrchen mit Phenol extrahiert und zweimal mit Ethanol ausgefällt und die Pellets in 128 ul TE kombiniert.
Die vorstehend hergestellte cDNA wurde mit RNase H, wie nachstehend beschrieben, behandelt. Zu 128 ul cDNA wurde folgendes zugesetzt: 128 ul 5 · RNase H- Puffer, der aus 100 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM KCl, 50 mM MgCl&sub2;, 0,7 mM DTT und 0,5 mM EDTA bestand. Ferner enthielt das Röhrchen 377,3 ul Wasser und 6,7 ul RNase H (1,9 E/ul). Das Gesamtvolumen der RNase H-Spaltungsreaktion ist 640 ul. Das Gemisch wurde 20 Minuten bei 37ºC inkubiert, wonach 5 ul 0,5 M EDTA zur Beendigung der Reaktion zugesetzt wurden. Schließlich wurde das Reaktionsgemisch mit Phenol extrahiert, zweimal mit Ethanol ausgefällt und das Pellet in 12 ul TE resuspendiert.
Die cDNA wurde fraktioniert und durch neutrale Agarosegelelektrophorese gereinigt. cDNAs von etwa 0,25 bis 7,0 Kilobasen Länge wurden von den Gelen entfernt, mit Glaskügelchen gereinigt und in 107,5 ul glasdestilliertem Wasser resuspendiert. Anschließend wurde an die cDNA ein C-Schwanz angehängt und in den Vektor pCDLSRa-296 [von der DNAX-Corporation erhalten und von Takebe et al., Molecular and Cellular Biology 8(1) (1988), 466, beschrieben und im US-Patent Nr. 4,695,542, wie nachstehend beschrieben, offenbart]. Der 10 · terminale Desoxynucleotidyltransferasepuffer (hier nachstehend als 10 · TdT-Puffer bezeichnet) wurde wie folgt hergestellt: 13,8 g Cacodylsäure wurde zu 3,0 g Tris-Base in 60 ml Wasser zugesetzt. Die Lösung wurde auf p87,6 durch langsame Zugabe von festem KOH eingestellt, wonach das Volumen auf 88 ml mit Wasser erhöht wurde. Anschließend wurde die Lösung auf 0ºC abgekühlt, anschließend wurden 2 ml 0,1 M DTT zugesetzt, wonach 10 ml 0,1 M MnCl&sub2; bei ständigem Rühren der Lösung tröpfchenweise zugesetzt wurden. Zu 38,3 ml 10 · TdT- Puffer wurden 5,7 ul 1 mM dCTP und 0,6 ug doppelsträngige cDNA zugesetzt. Eine Wassermenge wurde zugesetzt, um die Lösung auf ein Gesamtvolumen von 380,5 ul zu bringen. Die Lösung wurde 15 Minuten auf 37ºC erwärmt und 360 Einheiten TdT in etwa 3 ul zugesetzt. 60 ul Aliquot wurden zu verschiedenen Zeiten entfernt und mit 468 ul 1 mM EDTA kombiniert. Jeder Aliquot wurde anschließend mit dem zuvor mit einem G- Schwanz versehenen Vektor in einer geeigneten Menge von Anelierungspuffer kombiniert und in einen geeigneten Wirt transformiert. Der mit C-Schwanz versehene Vektor, der die größte Zahl von Transformanten produzierte, wurde zur Transformation in großem Maßstab verwendet.
Die cDNAs wurden in den Plasmidvektor pCDL-SRα296 cloniert. Der Vektor wurde, wie nachstehend beschrieben, hergestellt. 200 ug Plasmid wurden mit 700 Einheiten PstI in 500 ul Gesamtvolumen 60 Minuten bei 37ºC gespalten. Das Plasmid wurde anschließend mit Phenol extrahiert und zweimal mit Ethanol ausgefällt und in 200 ul destilliertem Wasser resuspendiert. Die Konzentration wurde durch Spektrophotometrie ermittelt. Anschließend wurden etwa 136 ug pCDL-SRα296, 112,6 umol 3'-Enden, durch Kombination in einer Lösung, die aus 30 ul 10 · TdT-Puffer, 30 ul [³H] dGTP (etwa 70 pmol/gl), 5,5 ul 1 mM dGTP und Wasser zur Herstellung eines Gesamtvolumens von 297 ul bestand, mit einem G-Schwanz versehen. Die Schwanzbildungsreaktion wurde mehrmals durchgeführt und das Verfahren bestand aus der Entfernung von 30 ul aus dem Reaktionsröhrchen und seine Kombination mit 359 ul 17 mM EDTA, was der Zeitpunkt 0 war. Anschließend wurden 360 Einheiten terminaler Transferase in 3 ul zum vorgewärmten Spaltungsreaktionsgemisch 15 Minuten bei 37ºC zugesetzt und 30 ul Gemisch zu verschiedenen Zeitintervallen entfernt und die Reaktionen durch Pipettierung in 359 ul 17 mM EDTA beendet. Die Länge an G-Schwanz wurde durch Ermittlung der Aufnahme von [³H] dGTP, wie es auf dem Fachgebiet bekannt ist, überwacht. Zur Sicherstellung, daß der pCDL-SRα296-Vektor richtig mit G-Schwanz versehen und nicht mit schwanzlosem Vektor verunreinigt war, wurde eine Probeanelierung und -transformation von DHSα Bakterien durchgeführt, wie es auf dem Fachgebiet bekannt ist. (DHSX- Bakterien wurden von den Bethesda Research Laboratories, Research Products Division, Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD 20877, erhalten. Kat. Nr. 82585A: Max Effizienz DM5αTM-kompetente Zellen). Der Vektor wurde bei -20ºC aufbewahrt und zur Clonierung der vorstehend beschriebenen C-Schwanz-enthaltenden cDNA verwendet.
Kurz gesagt, bestand die Clonierung in pCDL-SRα296 aus der Kombination von 88 ul C-Schwanz-enthaltender cDNA, die jedem Zeitpunkt entsprach, 2 ul G- Schwanz-enthaltendem Vektor und 10 ul 10 · Anelierungspuffer. Das Gesamtvolumen war 100 ul. Der 10 · Anelierungspuffer bestand aus: 0,1 M Tris-HCl, pH 7,6, 1,0 M NaCl und 10 mM EDTA. Die Anelierungsreaktion wurde unter Standardbedingungen durchgeführt und das Gemisch in DHS-Bakterien transformiert.
Die vorstehend erhaltene cDNA-Bank kann unter Verwendung eines der auf dem Fachgebiet gut bekannten Verfahren oder eines neuen nachstehend beschriebenen Festzustand-Amplifikationsverfahrens amplifiziert werden. Das Verfahren bestand aus der Suspension von bakteriellen Transformanten in Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt. Dies ist entgegen den die bakteriellen Transformanten auf geeigneten Kulturgefäßen plattierenden Verfahren des Stands der Technik. Die nachstehenden Materialien und Verfahren wurden verwendet. 0,3% Seaprep-Agarose in 2 · LB-Medien (2% Bactotrypton, 1% Hefeextrakt und 1% NaCl, pH 6,9. Das Bactotrypton und der Hefeextrakt wurden von den Difco Laboratories, Inc., Detroit, MI, erhalten), wurden bei 37ºC in einem Wasserbad gehalten. Eine geeignete Menge von cDNA, die an pCDL-SRα296 aneliert und in DHSα-Bakterien zur Erzeugung von etwa 2,5 · 10&sup6; cfu/ml transformiert war. Zur geeigneten Menge von Agarose wurde Ampicillin zum Erhalt von 50 ug/ml und etwa 1,25 · 10&sup6; cfu von bakteriellen Transfortnanten zugesetzt. 25 ml dieser Lösung wurden in 50 ml konischen Röhrchen (Falcon Corp. Nr. 2098) gegossen. Die Röhrchen wurden in ein Eiswasserbad 20 bis 60 Minuten gegeben und über Nacht bei 37ºC inkubiert. Zur Messung des Titers des Transformantengemisches wurden 100 ul auf LBamp&sup5;&sup0; (amp&sup5;&sup0; meint 50 ug/ml Ampicillin)-Platten plattiert.
Die Bank kann durch Pelletierung der Zellen in 500 ml-Zentrifugenflaschen bei 8 K 20 Minuten bei Raumtemperatur aufbewahrt werden. Die Zellpellets wurden in einem Gesamtvolumen von 100 ml von 12,5% Glycerin in LB-Medien resuspendiert. Aliquots der Suspension wurden bei -70ºC aufbewahrt.
Monocyten und Lymphocyten wurden von normalem Blut durch Ficoll- Hypaque-Sedimentation und eine anschließende Percoll-Dichtetrennung, wie zuvor beschrieben (D. F. Eierman et al., 1989, a.a.O.), isoliert. Neutrophile wurden durch Sedimentation des Ficoll-Hypaque-Pellets in einer 3% Gelatine/PBS (phosphatgepufferte Kochsalzlösung ohne Ca²&spplus; und Mg²&spplus;) 1 Stunde bei 37ºC gereinigt. Monocyten, Lymphocyten und Neutrophile wurden in serumfreiem RPMI-Medium (GIBCO, Grand Island, NY) auf zuvor mit Fibronectin beschichteten Plastikgefäßen oder auf Plastik mit 1 ug/ml bakterielles Endotoxin-Lipopolysaccharid (LPS) oder unter nicht-haftenden Bedingungen mit 5 ng/ml des bekannten Tumorpromotors Phorbol-12-Myristat 13-Acetat (PMA) (D. F. Eierman et al., 1989, a.a.O.) gezüchtet. Die zweite Passage der menschlichen Nabelvenenendothelzellen (HUVE) wurde in 10% fötalem Kälberserum in RPMI-Medium 4 Stunden mit 5 ug/ml LPS gezüchtet. Dickdarmkarzinomzellen stammten von einer frisch operierten Probe. Die Diagnose wurde durch histologische Untersuchungen bestätigt.
Etwa 8 · 10&sup5; Plaques einer menschlichen weiblichen Leukocytenbank in λEMBL 3 wurden mit einer ³²P-markierten GROα-cDNA-Sonde abgesucht. Positive Clone wurden in pGEM3- oder pGEM4Z-Plasmide subcloniert und das gesamte Plasmid oder ExoIII-gespaltene ("nested") Deletionsplasmide durch das Didesoxykettenterminationsverfahren sequenziert. Die drei GRO-Gen-Clone wurden durch Restriktionsfragmentanalyse unterschieden.
Die RNA-Analyse wurde durch PCR durchgeführt. Für die PCR wurde 1 ug Gesamt-RNA in Erststrang-cDNA mit Zufallshexameren, wie von E. S. Kawasaki et al., PCR Technology, (Erlich, H. A., Hrsg.) Stockton Press, New York, S. 89-97, beschrieben, umgewandelt. Die Amplifikation wurde unter Verwendung eines Senseprimers, der den verschiedenen GRO-Clonen gemeinsam war, und von Antisense-Primern, die für jeden spezifisch sind, durchgeführt. GROα wurde mit GM135 und GM350 nachgewiesen; GROβ mit ML80 und GM272; und GROγ mit GM135 und GM221 (vgl. die Fig. 1(a) und (b)).
Die Amplifikationen wurden durchgeführt bis 25, 30 und 35 Cyclen, um nachzuweisen, daß die Reaktionen exponentiell fortschritten. Die dargestellten Daten sind von 30 Zyklen, wobei zu der Zeit alle Proben noch nicht die maximale Intensität erreicht hatten. Die Southern-Transfer-Analyse wurde nach dem Transfer auf Nitrocellulose für zufallsgeprimte cDNA-Sonden oder durch direkte Oligonucleotidhybridisierung an dehydratisierte Agarosegele, wie von Southem, E. M., 1975, a.a.O., und P. D. Siebert et al., 1989, Clontech Laboratories 1989 Technical Report, 6-9, beschrieben, durchgeführt. Waschen wurde zu einer Endstringenz von 2 · SSPE (2 · SSPE bestand aus 0,3 M NaCl, 0,02 M NaH&sub2;PO&sub4; und 0,002 M EDTA) bei 56ºC für Oligonucleotide und 0,2 · SSC bei 65ºC für cDNA-Sonden durchgeführt.
Während der Isolation von cDNAs durch subtraktive Hybridisierung von haftenden vs. nicht-haftende Monocyten (von S. A. Sporn et al., 1990, a.a.O., beschrieben) wurde ein partieller Clon mit einer GRO-verwandten Sequenz identifiziert, und unter Verwendung dieser Sequenz zur Sondierung der vorstehenden Leukocyten-cDNA-Bank wurden Versionen der beiden Sequenzen mit der vollständigen Länge mit der Bezeichnung GROB und GROy gewonnen.
Zusammengefaßt stimulierte einer der 5 Clone, die von der vorstehend beschriebenen Mezerin- und Calciumionophor-stimulierten Leukocyten-cDNA-Bank isoliert wurden, er erhielt die Bezeichnung GROβ. GROβ enthielt ein PstI- und NcoI- Restriktionsmuster, das dem C2m-Isolat glich. Die Primer GM135, GM221, GM297, GM298, GM316, GM349, GM350 und ML80 (in den Fig. 1 (a) und (b) dargestellt) wurden konstruiert, die eine bidirektionale Sequenzierung der Doppelstrangmatrizen ermöglichte. Bei GROβ wurde ein partieller Clon (C2m) (mit der Bezeichnung MAD-2 in S. A. Sporn et al., 1990, J. of Immunol., a.a.O.) und ein Clon mit vollständiger Länge, der 2 Introns (CC2b) und ein Polymerasekettenreaktions (PCR)-Produkt enthielt, zur Bestimmung der vollständigen cDNA-Sequenz verwendet.
Eine partielle Beschreibung des GROβ-Gens wird aus der Sequenzierung von CC2b abgeleitet. Das Ergebnis zeigte eine enge Nucleinsäurehomologie zwischen CC2b und GROα und GROγ am 5'-Ende bis zum Beginn des reifen Proteins. Dabach folgten 95 Nucleinsäuren, bevor ein weiterer homologer Bereich aus den ersten 41 Aminosäuren des reifen Proteins begann. Danach folgte eine weitere Insertion von 118 Nucleinsäuren bevor ein weiterer homologer Bereich von 84 Aminosäuren begann. Ohne auf die folgende Behauptung festgelegt zu werden, wird angenommen, daß die 95 und 118 Nucleinsäurefragmente ohne Homologie für GROα und GROγ -cDNAs Introns des GROβ-Gens repräsentieren und daß diese spezifische cDNA, CC2b, das Unvermögen der Zelle zur vollständigen Entfernung der Introns durch Prozessierung zeigt.
Ein weiterer Clon (GROγ) war bei diesem Absuchen dreimal vorhanden. Das verbleibende Isolat hatte anscheinend PstI- und NcoI-Restriktionscharakteristika des ursprünglichen GRO-Clons GROα. Alle drei unterschiedlichen (d. h. GROα, β und γ) Clone wurden sequenziert und ihre cDNA-Sequenzen sind in den Fig. 1(a) und (b) dargestellt.
Sequenzvergleiche der α-, β- und γ-Formen sind ferner in den Fig. 1(a) und (b) dargestellt. GROβ und GROγ sind zu 93% bzw. 82% identisch, wobei GROα auf dem Nucleotidniveau ist. Im Vergleich zu GROα gibt es 11 Aminosäuresubstitutionen in GROβ, wobei sich 8 aus den ersten und/oder zweiten Positionsveränderungen ergeben. Von den 11 liegen 9 im sezernierten Peptid jenseits des Signalpeptidspaltstelle. Im Vergleich mit der GROα-Sequenz gibt es 15 Aminosäureveränderungen im GROγ, von denen 11 im sezernierten Peptidbereich liegen. Ferner gibt es eine Codondeletion im GROγ bei bp 157.
Im 3'-nicht-translatierten Bereich hat GROβ 11 ATTTA-Repeats, von denen 6 in einem einzelnen Abschnitt bei bp543 liegen. Im Gegensatz dazu enthalten GROα und GROγ 5 bzw. 6 Repeats. Ferner sind ein 64 bp-Bereich und ein 58 bp-Bereich 3'-seitig unter den 3 GRO-Varianten (beginnend am bp847, 870 und 852 in GROα, β bzw. γ) stark konserviert. Die intervenierenden 25 bp sind in GROα und β konserviert. Die 3'-seitigen 58 bp des Bereichs (930-987) sind ebenfalls im Hamstergen konserviert, wie zuvor dargestellt (A. Anisowicz et al., 1987, a.a.O.).
Southern-Blot-Hybridisierung mit GROα-,-ββ-, und -γcDNA-Sonden lieferten ähnliche Restriktionsfragmentmuster mit den Enzymen XbaI und EcoRI, sowie weitere Banden, die für jede cDNA charakteristisch sind. In Fig. 2 wurden diese Muster (Bahnen 1, 2 und 3) mit Southern-Blots unter Verwendung von Oligonucleotidsonden, die für die drei cDNAs gemeinsam sind (Bahnen 4 und 5), sowie GROα-spezifische (Bahn 6) und -β- spezifische (Bahn 7) Sonden verglichen. In den EcoRI-Spaltprodukten identifizierte die gemeinsame Sonde ML80 drei Banden bei 6,6, 4,4 und 3,3 kb. (Die Sequenz für ML80 ist wie in Fig. 1(b) dargestellt). Mit der GROα-spezifischen Sonde GM350 wurde nur die 4,4 kb-Bande (Bahn 6) beobachtet; und mit der β-spezifischen Sonde GM272 wurde nur die 3,3 kb-Bande beobachtet. ML80 wies ferner die 6,6 kb γ-spezifische DNA nach, die nur in Bahn 3 beobachtet wurde. In ähnlicher Weise stimmen in den XbaI-Spaltungen die Ergebnisse mit der Identifizierung von drei Genen überein.
Unter Verwendung der PCR-Primerpaare, die für jede der 3 GRO-cDNAs spezifisch sind, wurde die Expression dieser Gene in (1) Entzündungs-n Zellen von einem einzigen Donor (Neutrophile, Lymphocyten und Monocyten); (2) Nabelvenenendothelzellen; und (3) einem frisch isolierten Dickdarmkarzinom von einem anderen Spender (Fig. 3) charakterisiert. Neutrophile, die an Fibronektin hafteten, produzierten nur die GROα-Version. Lymphocyten produzierten nur GROα, während Monocyten alle drei GRO-Moleküle exprimierten. Daher zeigten die unterschiedlichen Zellen vom gleichen Spender, die durch Haftung an den gleichen extrazellulären Matrixbestandteil stimuliert wurden, eine selektive GRO-Genexpression.
Im gleichen Zelltyp stimulierten jedoch unterschiedliche Induktoren verschiedene Muster der GRO-Expression. Mit PMA stimulierte nicht-haftende Monocyten exprimierten nur die GROβ- und GROγ-Formen, während mit LPS behandelte Monocyten alle 3 Versionen exprimierten. Mit LPS stimulierte, menschliche, Nabelvenen- Endothelzellen exprimierten nur das GROα Genprodukt. Die Expression des GROγ-Gens war nicht auf Makrophagen beschränkt; es wurde durch PCR-Analyse festgestellt, daß frisch isolierte und präparierte Dickdarmepitheltumorzellen hauptsächlich die GROγ- Version exprimierten. In der gleichen Untersuchung exprimierten die den Tumorzellen benachbarten normalen Dickdarmepithelzellen nicht nachweisbare Niveaus von GROγ. Diese Ergebnisse bestätigen, daß alle drei Formen von GRO in den induzierten Zellen exprimiert werden. Die Ergebnisse liefern jedoch keinen genauen quantitativen Vergleich, da die relativen Hybridisierungskonstanten für die drei Sonden verschieden sein können.

Beispiel 2

Verfahren zur Identifizierung oder zum Nachweis von Entzilndungs-n und anti- Entzündungs-n Mitteln

Wie Beispiel 1 anzeigt exprimierten die Monocyten unter den nachstehenden Bedingungen GROβ oder -γ, 1) Monocyten, die an Fibronectin hafteten; 2) nicht-haftende Monocyten, die mit PMA stimuliert wurden; und 3) nicht-haftende Monocyten, die mit LPS behandelt wurden. Da PMA die GROB- und -γ-Expression in nicht-haftenden Monocyten stimuliert, zeigt dies, daß die Expression dieser GRO-Gene auf die Gegenwart von Entzündungs-n Mitteln wie PMA und LPS zurückzuführen ist.
Daher kann ein Testsystem zum Absuchen von potentiellen Chemikalien, die die Synthese, Freisetzung oder Aktivität der Entzündungs-Cytokine modulieren können, etabliert werden. Insbesondere kann mit dem Test ermittelt werden, ob eine Chemikalie X ein entzündlicher Stoff ist. Durch Variation der Konzentration von X und Test der Niveaus der Expression von GROβ und -γ, kann ferner die Konzentration X, die eine Entzündungs- Antwort auslösen kann, und die potentielle Stärke der entzündlichen Antwort bei unterschiedlichen Konzentrationen ermittelt werden. Beispielsweise kann eine Probe von Monocyten gegen X in verschiedenen Mengen, vorzugsweise unter nichthaftenden Bedingungen über einen zur Expression des GROβ- oder -γ -Gens geeigneten Zeitraum exponiert werden. Anschließend werden die RNAs der Monocyten gesammelt und mit DNA-Sonden für GROβ und -γ, unter Verwendung der Hybridisierungs- oder PCR-Verfahren, die im Abschnitt "Verfahren" von Beispiel 1(A)(4) beschrieben wurden, sondiert. Eine in situ-Hybridisierung kann auch unter Verwendung von auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren verwendet werden. Die Verfahren zum Erhalt, zur Züchtung und Inkubation der Monocyten mit X entsprechen denen, die im Abschnitt "Verfahren" von Beispiel 1 für Monocyten, die gegen LPS auf PMN exponiert wurden, beschrieben werden. Ein Fachmann kann die Verfahren und die Inkubationszeit für das spezielle verwendete X in geeigneter Weise modifizieren. Dieser Test wäre nützlich, wenn X als ein potentieller Arzneistoff vorgeschlagen würde, da er die potentiellen Verwender über seine Entzündungs- Wirkung und die richtigen zu treffenden Vorkehrungen informieren würde.
Alternativ kann das GROβ und -γ unter Verwendung der a.a.O. allgemein beschriebenen immunologischen Verfahren nachgewiesen werden.
Die vorstehend dargestellten Verfahren konnten modifiziert werden, um antientzündliche Mittel zu identifizieren oder nachzuweisen. Daher kann ein Testsystem zur Absuche von potentiellen Chemikalien, die die Synthese, Freisetzung oder Aktivität der Entzündungs-Cytokine modulieren können, etabliert werden. Insbesondere konnte der Test verwendet werden, um zu ermitteln, ob eine Chemikalie Y ein anti-entzündliches Mittel war. Das Verfahren umfaßt die Exposition einer Probe von Monocyten gegen ein bekanntes Entzündungs-s Mittel wie PMS oder LPS über einen ausreichenden Zeitraum zur Expression von GROβ oder -β. Anschließend wird Y der Kultur zugesetzt. Nach einem geeigneten Inkubationszeitraum werden die RNAs von den Monocyten gesammelt und gereinigt und mit DNA-Sonden für GROβ oder γ, unter Verwendung des Verfahrens, das im Abschnitt "Verfahren" von Beispiel 1(A)(4) beschrieben wurde, abgesucht. Eine in situ-Hybridisierung konnte auch verwendet werden. Alternativ konnten das GROβ- und - γ-Protein unter Verwendung der immunologischen Verfahren, die a.a.O. allgemein beschrieben wurden, nachgewiesen werden. Durch Variation der Konzentration von Y und Testen der Niveaus der Expression von GROB und -γ, konnte auch ermittelt werden, bei welcher Konzentration Y als anti-entzündliches Mittel wirksam war.
Die Verfahren zum Erhalt, zur Züchtung und Inkubation der Monocyten mit X waren denen ähnlich, die im Abschnitt "Verfahren" von Beispiel 1 für gegen LPS auf PMN exponierte Monocyten beschrieben wurden. Ein Fachmann kann die Verfahren für das jeweils verwendete Y und die geeigneten Inkubationszeiten für die entzündlichen und potentiellen anti-entzündlichen Mittel in geeigneter Weise modifizieren. Die Verfahren sind zur Identifizierung von anti-entzündlichen Mitteln und zum Auffinden von neuen anti-entzündlichen Mitteln nützlich. Die Verfahren können auch zur Ermittlung der Effizienz von und der geeigneten Dosismengen für neue oder bekannte anti-entzündliche Mittel verwendet werden.

Beispiel 3

Diagnose von Dickdarmepitheltumorzellen

Wie in Beispiel 1 dargestellt, wurde GROγ in Dickdarmepitheltumorzellen gefunden, jedoch nicht in benachbarten normalen Epithelzellen. Daher konnte der Dickdarmepitheltumor durch Testen auf die differentielle Expression des GRGγ-Gens in den Dickdarmepithelzellen diagnostiziert werden. Ein bevorzugtes Testverfahren schloß die Hybridisierung von mRNA, die von den zu testenden Epithelzellen gesammelt wurde, an eine DNA-Sonde für GROγ ein. Eine in situ-Hybridisierung konnte ebenfalls verwendet werden. Das bevorzugte Verfahren ist das Hybridisierungs- oder PCR- Verfahren, das im Abschnitt "Verfahren" von Beispiel 1(A)(4) beschrieben wurde. Die bevorzugte DNA-Sonde war GM221.

Beispiel 4

Synthese von Peptidsequenzen

Die Peptide, die die Sequenzen von GROβ und -γ enthalten, können durch auf dem Fachgebiet gut bekannte Verfahren synthetisiert werden. Das bevorzugte Verfahren der Peptidsynthese ist das Festphasenverfahren, das genauer in Merrifield, R. B., Science 232 (1985), 341-347, beschrieben wurde, auf einer automatisierten Biosearch 9500- Peptidmaschine, eine Spaltung mit Wasserstoffluorid und Reinigung durch präparative HPLC unter Verwendung einer Waters Delta Prep 3000-Instruments auf einer 15-20 um Vydac CH Prep PAK-Säule. Ein alternatives Verfahren ist mittels einer automatischen ABI-Synthese. Diese synthetischen Peptide können verwendet werden, um die polyclonalen und monoclonalen Antikörper gegen GROβ und -γ zu erzeugen (vgl. nachstehendes Beispiel 5).

Beispiel 5

Produktion von Antikörpern gegen GROβ und -γ

Antikörper gegen Entzündungs-Cytokine werden unter Verwendung von auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren erzeugt. Beispielsweise werden Antikörper durch Injektion eines Wirtstiers wie Kaninchen, Ratte, Ziege, Maus etc. mit den GROβ und -γ- Proteinen oder Peptidfragmenten davon, allein oder an einen geeigneten Träger konjugiert, falls zur Erzeugung einer Antikörperantwort erforderlich, erzeugt. Beispiele für bevorzugte Peptide zur Erzeugung von Antikörpern gegen diese GRO-Proteine sind:
Cys-(Gly)&sub1;&submin;&sub3;-5'-Asn;
Cys-(Gly)&sub1;&submin;&sub3;-5'-Gly; und
Cys-(Gly)&sub1;&submin;&sub3;-5'-(Gly)&sub1;&submin;&sub3;-5'-Gly.
Für GROB wäre das 5'-mer: Lys-Asn-Gly-Lys-Ser. Für GROγ wäre das 5'-mer: Lys-Lys-Gly-Ser-Thr. Der Begriff (Gly)&sub1;&submin;&sub3; bezeichnet einen bis drei Glycinreste. Ferner können GROβ und γ oder Peptidfragmente mit einem Adjuvans, beispielsweise komplettem Freundschem-Adjuvans, kombiniert und zur Immunisierung der Wirtstiere verwendet werden. Alternativ können vor der Injektion in die Wirtstiere diese Proteine oder Peptide mit Napfschnecken ("keyhole limpet")-Hämocyanin (KLH) oder Rinderserumalbumin (BSA) konjugiert werden. Die Konjugation wird über die Sulfhydrylgruppe im Cysteinrest erreicht. Die Verfahren für diese Konjugation und die Produktion von Antikörpern unter Verwendung des so produzierten Konjugats sind im am 9. August 1988 erteilten US-Patent Nr. 4,762,706 für McCormick et al. offenbart. Es wird dem Fachmann bewußt sein, daß monoclonale Antikörper (MABs) gegen GROβ und -γ durch das Hybridomverfahren erzeugt werden. Diese monoclonalen Antikörper sind zum Testen der GRO-Proteine in einem Immuntest, wie vorstehend beschrieben, nützlich.
Die vorliegende Erfindung wurde unter Bezugnahme auf spezifische Ausführungsformen beschrieben. Diese Anmeldung soll jedoch diese Veränderungen und Substitutionen einschließen, die von einem Fachmann, ohne vom Sinn und Schutzbereich der angefügten Ansprüche abzuweichen, durchgeführt werden.

Claims

1. Verfahren zur Diagnose von Krebs in in vitro zu testenden Zellen, das die Schritte umfaßt:

(a) Messung des Gehalts an einem Polypeptid mit der biologischen Aktivität von GROβ oder GROγ, welches von einer DNA-Sequenz codiert wird, die

(aa) die in Fig. 1 (a) oder (b) gezeigte DNA-Sequenz oder ein Teil davon ist; oder

(ab) die in Fig. 1 (a) oder (b) gezeigte DNA-Sequenz ohne die Leader-Sequenz ist; oder

(ac) eine DNA-Sequenz ist, die ein allelisches Derivat der Sequenz aus (aa) oder (ab) ist; oder

(ad) eine DNA-Sequenz ist, die gegenüber einer der Sequenzen aus (aa) bis (ac) degeneriert ist; oder

(ae) eine DNA-Sequenz ist, die mit einer der Sequenzen aus (aa) bis (ad) hybridisiert; und

(b) Vergleich des Gehalts an GROβ oder GROγ in den zu testenden Zellen zu dem von normalen Zellen.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die DNA-Sequenz menschlicher Herkunft ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Krebs menschlichen Dickdarmkrebs umfaßt.

4. Verfahren zur Diagnose von Dickdarmepitheltumoren, umfassend das Testen der unterschiedlichen Expression des GROγ-Gens in Dickdarmepithelzellen mittels Hybridisierung mit mRNA, die von den in vitro zu testenden Epithelzellen gewonnen wurde, oder mittels in situ-Hybridisierung mit einer DNA-Sonde für GROγ.