DE3382767T2 - Ein Verfahren zur Herstellung eines Antikörpers, der zur Bestimmung der Anwesenheit eines menschlichen Oncogens befähigt ist. - Google Patents

Ein Verfahren zur Herstellung eines Antikörpers, der zur Bestimmung der Anwesenheit eines menschlichen Oncogens befähigt ist.

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DE3382767T2
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Description

    Staatliche Förderung
  • Die hier beschriebene Arbeit wurde durch Zuschüsse des National Institute of Health gefördert.
    • Technisches Gebiet
  • Die vorliegende Erfindung liegt auf dem Gebiet der Molekularbiologie und bezieht sich im engeren Sinne auf eine Erkennung von Unterschieden zwischen mutierten Allelen und deren entsprechenden Wildtyp-Allelen, insbesondere Onkogenen und Proto-Onkogenen, sowie auf Bestimmungen, die derartige Unterschiede ausnützen.
    • Stand der Technik, von dem die Erfindung ausgeht
  • Frühere Arbeiten über die chemische Krebserzeugung haben gezeigt, daß die karzinogene Potenz einer Verbindung häufig mit ihrer mutagenen Kraft in Wechselbeziehung steht. Man vergleiche McCann, J., Choi, E., Yamasaki, E. und Ames, B.N. "Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72", 5135-5139 (1975), Mccann, J. und Ames, B.N. "Proc. Natl. Acad. Sci. USA 73", 950-954 (1976), Bridges, B.A. "Nature 261", 195-200 (1976 und Bouck, N. und dimayorca, G. "Nature 264", 722-727 (1976). Diese Arbeiten lassen darauf schließen, daß die DNA das letzte Ziel der karzinogenen Aktivierung ist. Aus diesem Grunde haben die Forscher versucht, DNA-Segmente in Tumorzellen, häufig als "Onkogene" bezeichnet, deren Veränderung von entscheidender Bedeutung für eine onkogene Konversion ist, zu identifizieren und zu untersuchen.
  • Ein jüngster Versuch der Isolierung eines Onkogens war mit der Übertragung von Tumorzellen-DNA von der EJ-Blasenkrebszellinie auf nicht-umgewandelte NIH3T3-Mausfibroblaste verbunden. Es wurde gefunden, daß der Phenotyp der Zellumwandlung auf diese Weise von Zelle zu Zelle weitergegeben werden konnte. Die Tumor-DNA war in der Lage, Herde (Foci) umgewandelter Zellen in die Rezipienten-NIH-Monoschichtkultur zu induzieren, während DNA von normalen, nicht umgewandelten Spenderzellen keine Herde produzierte. Man vergleiche Shih, C., Shilo, B., Goldfarb, M.P. Dannenberg, A. und Weinberg, R.A. "Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76", 5714-5718 (1979), Cooper, G.M., Okenquist, S. und Silverman, L. "Nature 284", 418-421 (1980), Shih, C. Padhy, L.C., Murray, M.J. und Weinberg, R.A. "Nature 290", 261-264 (1981), Krontiris, T.G. und Cooper, G.M. "Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78", 1181-1184 (1981) und Peruche, M. et al "Cell 27" 467-476 (1981). Diese Ergebnisse zeigten, daß in der EJ-Tumor-Zellinie-DNA onkogene Faktoren vorhanden waren, die anscheinend in der DNA normaler Zellen fehlten.
  • Studien, die die Sensitivität oder Resistenz onkogener DNA der EJ-Blasenkarzinomlinie gegenüber einer Behandlung verschiedener ortsspezifischer Endonucleasen untersuchten, zeigten an, daß bestimmte spezifische Spender-DNA-Sequenzen an einer derartigen Zellumwandlung beteiligt waren. Man vergleiche Lane, M.A., Sainten, A. und Cooper, G.M. "Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78", 5185-5189 (1981) und Shilo, B. und Weinberg, R.A. "Nature 289", 607-609 (1981). Dieses Konzept eines diskreten, definierbaren Onkogens wurde später direkt durch molekulare Isolierung diskreter Umwandlungsgene aus der EJ-Humanblasenkarzinomzellinie durch ein Verfahren nachgewiesen, das von Murray et al in "Cell 25", 355-361 (1981) beschrieben wird.
  • Auf diese Weise wurde von der EJ-Zellinie isolierte DNA serienmäßig durch Transfektion auf NIH3T3-Mausfibroblastzellen übertragen, bis eine Mausfibroblastzelle ausgewählt wurde, die im wesentlichen nur das Humanblasenkrebsonkogen und einen Markierungsstoff enthielt. Der bei dieser Arbeit verwendete Markierungsstoff war eine Alu-DNA-Sequenz, die etwa 300.000 mal in menschlicher DNA wiederholt wird, jedoch nicht in Mausfibroblast-DNA vorhanden ist. Die Artentransfektion führte somit zu der abschließenden Auswahl einer Zelle, die das interessierende Onkogen und seinen zugehörigen Markierungsstoff enthielt. Die gesamte DNA von dieser transfektierten Zelle wurde zur Bildung einer genomischen DNA-Bank in einem Lambdaphage verwendet, und der geeignete chimärische Lambdaphage wurde dann unter Verwendung einer für den menschlichen Alu-Markierungsstoff spezifischen Probe ausgewählt.
  • Diese Arbeit resultierte in der Lokalisierung der onkogenen Aktivität für die EJ-Blasenkarzinom-DNA auf ein 6,6 kb langes DNA-Segment, das durch die Endonuclease BamHI erzeugt wurde. Das 6,6kb-Segment wurde im Plasmidvektor pBR322 kloniert und dann als eine Sequenzprobe in einer Southern-Blot-Analyse verwendet. Diese zeigte an, daß das Onkogen von einer Sequenz gleichartiger Struktur stammte, die in dem normalen menschlichen Genom vorhanden ist. Man vergleiche Goldfarb, M., Shimizu, Perucho, M. und Wigler, M. "Nature 296", 404-409 (1982) und Shih, C. und Weinberg, R. "Cell 29", 161-169 (1982). Somit ergab sich, daß das menschliche Blasenonkogen durch Mutation eines normalen Zellgens während des Prozesses der Karzinogenese entstanden war.
  • Der Vergleich des EJ-Blasenonkogens mit seiner entsprechenden normalen Zellsequenz (dem "Proto-Onkogen") wurde durch die nachfolgende Feststellung unterstützt, daß dieses Onkogen homolog mit dem Umwandlungsgen des rattenabgeleiteten Harvey- Maussarkomvirus war. Man vergleiche Der, C., Krontiris, T.G. und Cooper, G.M. "Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79" 3637-3640 (1982), Parada, L.F., Tabin, C.J., Shih, C. und Weinberg, R.A. "Nature 297", 474-479 (1982) und Santos, E. et al "Nature 298", 343-347 (1982). Dieses Rattensarkomvirusgen, v-Ha-RAS genannt, war aus dem Rattengenom während des Prozesses der Bildung des chimären Virusgenoms gewonnen worden. Man vergleiche Scolnick, E.M. und Parks, W.P. "J. Virol. 13", 1211-1219 (1974) und Shih, T.Y., Williams, D.R., Weeks, M.O., Maryak, J.M., Vass, W.C. und Scolnick, E.M. "J. Virol. 27", 45-55 (1978). Sowohl das Ratten- als auch das menschliche Zellhomologe des v-Ha-RAS sind im Verlauf der Untersuchungen dieses Gens isoliert worden. Man vergleiche Defeo, D., Gonda, M.A., Young, H.A., Change, E.H., Lowy, D.R., Scolnick, E.M. und Ellis, R.W. "Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78", 3328-3332 (1981) und Chang, E.H., Gonda, M.A., Ellis, R.W., Scolnick, E.M. und Lowy, D.R. "Proc. Natl. Acad. Sci 79", 4848-4852 (1982). Es wurde gefunden, daß das menschliche Zellhomologe des v-Ha-RAS genau dem normalen Vorgänger des EJ-Blasenonkogens entspricht. Man vergleiche Parada, L.F., Tabin, C.J., Shih, C. und Weinberg, R.A. "Nature 297", 474-479 (1982).
  • Vorläufige Vergleiche zwischen dem EJ-Onkogen und dessen normalem Zellgegenstück, c-Ha-RAS genannt, wurden angestellt. Man vergleiche Ellis, R.W., DeFeo, D., Maryak, J.M., Young, H.A., Shih, T.Y., Chang, E.H., Lowy, D.R. und Scolnick, E.M. "J. Virol. 26", 408-420 (1980). In dieser Arbeit wurde gezeigt, daß ein molekularer Klon des normalen Zellgens keine Herde bei Anwendung auf NIH3T3-Monoschichten hervorrief, während ein Klon des Blasenonkogens eine biologische Aktivität von ca. 5 x 10&sup4; Herde bildenden Einheiten pro Mikrogramm transfektierter DNA zeigte. Man vergleiche Shih, C., und Weinberg, R.A. "Cell 29", 161-169 (1982) und Chang, E.H., Gonda, M.A., Ellis, R.W., Scolnick, E.M. und Lowy, D.R. "Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79", 4848-52 (1982).
  • Dieser starke Unterschied in der Funktion stand in keiner Beziehung mit irgendwelchen offensichtlichen strukturellen Unterschieden zwischen den beiden Klonen. Eine rauhe Restriktionsendonucleasenortskartierung des EJ-Onkogenklons und des nicht klonierten verwandten menschlichen Proto-Onkogens zeigte an, daß sie beide im Grunde nicht unterscheidbar über die 6,6- kb-Sequenz waren, die die Umwandlungsaktivität des EJ-Onkogens enthielt. Man vergleiche Shih, C. und Weinberg, R.A. "Cell 29", 161-169 (1982). Eine feinere Kartierung wurde später durch den direkten Vergleich molekularer Klone der beiden Gene möglich gemacht, jedoch wiederum wurden keine Unterschiede bei Benutzung einer Reihe verschiedener Endonukleasen gefunden, ausgenommen ein einziger Unterschied 3' (stromabwärts) der Codierungsregion des Gens. Dieser Unterschied wurde als die Darstellung eines funktionell stillen Polymorphismus des im Genpool vorhandenen Gens des früher von anderen dokumentierten Typs interpretiert. Man vergleiche Goldfarb, M., Shimizu, Perucho, M. und Wigler, M. "Nature 296", 404-409 (1982).
  • Somit war ein drastischer funktioneller Unterschied für zwei strukturell gleiche Gene, das menschliche Blasenkrebsonkogen und dessen normales Proto-Onkogen, gezeigt worden. Es waren keine Unterschiede in der Struktur der beiden Gene bekannt, jedoch hatte man die Theorie, daß Unterschiede vorhanden sein könnten, die funktionelle Unterschiede auf einem von zwei Wegen hervorrufen. Die Veränderungen könnten eine Änderung in den die Genexpression regulierenden Sequenzen mit sich bringen, oder alternativ könnte der umgewandelte Phenotyp Anderungen im Prot£in codierenden Bereich des Gens zuzuschreiben sein. Die erste Hypothese würde voraussichtlich eine Aufregulierung der Transkription oder Translatjon des Gens hervorrufen und hohe Niveaus eines ansonsten normalen Proteinprodukts erbringen, während die zweite Hypothese auf eine Synthese eines geänderten Proteins schließen lassen würde. Beide Veränderung- arten könnten auch gemeinsam zur Erzeugung des beobachteten Funktionsunterschieds wirken.
    • Beschreibung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung eines zum Nachweis des Vorhandenseins eines durch ein menschliches Onkogen codierten Proteins fähigen Antikörpers, bei dem
  • a) ein Antigen erzeugt wird, das durch eine im Onkogen vorhandene Nukleotidsequenz codiert ist, die sich von der entsprechenden im Proto-Onkogen vorhandenen Nukleotidsequenz unterscheidet, derart, daß das Antigen, bei Immunisierung eines Wirts, in der Lage ist, die Herstellung eines Antikörpers hervorzurufen, der spezifisch ist für das durch das menschliche Onkogen codierte Protein und nicht für das durch das menschliche Proto- Onkogen codierte Protein, und
  • b) der Wirt mit dem Antigen unter Bedingungen immunisiert wird, bei denen der Wirt den Antikörper herstellt.
  • Nach einem anderen Aspekt bezieht sich die Erfindung ferner auf ein Verfahren zur Herstellung eines zum Nachweis des Vorhandenseins eines durch ein menschliches Proto-Onkogen codierten Proteins fähigen Antikörpers, bei dem
  • a) ein Antigen erzeugt wird, das durch eine im Proto-Onkogen vorhandene Nukleotidsequenz codiert ist, die sich von der entsprechenden im Onkogen vorhandenen Nukleotidsequenz unterscheidet, derart, daß das Antigen, bei Immunisierung eines Wirts, in der Lage ist, die Herstellung eines Antikörpers hervorzurufen, der spezifisch ist für das durch das menschliche Proto-Onkogen codierte Protein und nicht für das durch das menschliche Onkogen codierte Protein, und
  • b) der Wirt mit dem Antigen unter Bedingungen immunisiert wird, bei denen der Wirt den Antikörper herstellt.
  • Nach einem weiteren Aspekt bezieht sich die Erfindung auf ein Verfahren zur Herstellung eines zum Nachweis von durch ein Onkogen hervorgerufener Karzinogenese fähigen Antikörpers, bei dem
  • a) ein Oligopeptid synthetisch hergestellt wird, das eine in einem durch das Onkogen codierten Protein vorhandene Aminosäurensequenz enthält, die sich von der entsprechenden in einem durch das entsprechende Proto-Onkogen codierten Protein vorhandenen Aminosäurensequenz unterscheidet, und
  • b) ein Wirt mit dem Oligopeptid unter Bedingungen immunisiert wird, bei denen der Wirt den Antikörper herstellt.
  • Zu Beginn wurden Versuche durchgeführt, um festzustellen, ob der interessante Funktionsunterschied zwischen dem EJ-Onkogen und dessen Proto-Onkogen einem Regulationsmechanismus oder einem der Sequenzunterschiede zuzuschreiben wäre. Diese Versuche liefern Daten, die anzeigen, daß eine Aufregulierung dieses Gens nicht für eine Zellumwandlung verantwortlich war. Somit wurde geschlossen, daß die erheblichen Funktionsunterschiede auf Veränderungen in der DNA-Sequenz dieser Gene zurückzuführen sein müssen.
  • Der Bereich des pEJ von 6,6 kb, der für die Zellumwandlung zu NIH3T3-Fibroblasten verantwortlich ist, wurde auf ein Segment von 350 kb durch eine Reihe von in-vitro-Rekombinationen verengt. Dieses Segment von 350 kb wurde dann für das Onkogen und das Proto-Onkogen sequenziert, und es wurde gefunden, daß Einzelbasensubstitutionen für den Unterschied am 60. Nukleotiden vom Xmal-Restriktionsort verantwortlich waren. Diese Substitution im Kodon für Glycin (Gly¹²), das normalerweise als GGC auftritt, wurde in die Sequenz GTC geändert, welches Kodon Valin ausprägt. Somit wurde der spezifische Unterschied in der Zell-DNA vom EJ und dessen Proto-Onkogen lokalisiert, und der Unterschied in der Aminosäuresequenz des entsprechenden p21-Proteins wurde ebenfalls bestimmt.
  • Bestimmungen zur Feststellung solcher Veränderungen in den DNA-Sequenzen wurden dann entwickelt. Bei einer Art der Bestimmung wurden Restriktionsenzyme, die für einen Ort des Onkogens oder des Proto- Onkogens spezifisch sind, aber nicht für den anderen, zur Feststellung von Unterschieden in derartigen DNA-Sequenzen verwendet.
  • Da die durch diese Gene codierten p21-Proteine unterschiedlich sind, können auch serologische Reagentien, wie Polyklonale oder monoklonale Antikörper, entwickelt werden, welche für die veränderten oder die normalen Sequenzdomänen in p21-Proteinen spezifisch sind oder für eine Aminosäuresequenz, die nicht an der Veränderung beteiligt ist, welche während der Karzinogenese auftritt. Solche serologischen Reagentien können dann gemäß der Erfindung in vielfältigen Verfahren eingesetzt werden, um einen sehr sensitiven Test für die Humanblasenkarzinogenese zu liefern. Diese Verfahren sollten eingesetzt werden, um Veränderungen in anderen Wildtyp-Allelen zu finden, die mutierte Gene verursachen.
    • Kurze Beschreibung der Figuren
  • Figur 1A zeigt elektrophoretische Gelmuster von Gesamtzell-RNA, erhalten sowohl von normalen als auch von umgewandelten Blasenzellen, welche Muster durch Autoradiographie sichtbar gemacht wurden,
  • Figur 1 B zeigt elektrophoretische Gelmuster, erhalten durch Fällung von metabolisch markierten Proteinlysaten sowohl von EJ wie normalen Blasenzellen unter Verwendung monoklonaler Antisera gegen das v-Ha-RAS-p21-Protein,
  • Figur 2A veranschaulicht elektrophoretische Gelmuster von polyadenyliertergesamt-RNA aus den gleichen vier transfektierten Zellinien,
  • Figur 2C zeigt elektrophoretische Gelmuster von p21- Protein, immunausgefällt von Zellysaten der gleichen vier transfektierten Zellinien,
  • Figur 3A-30 sind Fotografien, die durch ein Phasen-Kontrast-Mikroskop bei Soofacher Vergrößerung von vier mit pEJ oder pEC transfektierten Zellinien aufgenommen worden sind,
  • Figur 4 zeigt elektrophoretische Gelmuster von immunausgefälltem p21-Protein von mit pEJ oder pEC transfektierten Zellen,
  • Figur 5 ist eine schematische Darstellung von in-vitro- Genrekombinanten, hergestellt aus dem EJ-Umwandlungsgen und dessen normalem Zellhomologem, und enthält ferner eine Zusammenstellung von Transfektions- und Umwandlungsdaten für mit derartigen Genrekombinanten durchgeführte Versuche,
  • Figur 6 zeigt elektrophoretische Gelmuster für eine Wanderung von p21-Proteinen, die aus Zellen immunausgefällt wurden, welche mit in-vitro-Rekombinanten des EJ-Onkogenklons (pEJ) und dessen homologern Proto-Onkogenklon (pEC) transfektiert waren,
  • Figur 7 veranschaulicht einen Vergleich der DNA-Sequenz des molekularen Klons des EJ-Umwandlungsgens und dessen Nicht- Umwandlungszellhomologen und gibt ferner die für jeden ausgeprägten Aminosäurensequenzen an,
  • Figur 8 zeigt elektrophoretische Gelmuster, die Unterschiede in Fragmenten der Klone der durch das NaeI-Restriktionsenzym erzeugten EJ-EC-Gene veranschaulichen, und
  • Figuren 9 und 10 sind Blockdiagramme, die Bestimmungsprotokolle, die Endonukleasen oder Antisera gegen durch normale Gene oder Umwandlungsgene codiertes Protein verwenden, veranschaulichen.
    • Detaillierte Beschreibung der Erfindung
  • Wie oben festgestellt, führte die in "Cell 25", 355-361 (1981) beschriebene Arbeit zur Isolierung eines Onkogens aus der EJ- Blasenzellkarzinomzellinie. Das Onkogen enthielt 6,6 kb und es wurde gezeigt, daß es eine Umwandlungsaktivität mit NIH3T3- Mausfibroblasten hat. Da die hier beschriebene Arbeit auf dieser früheren Arbeit aufbaut, wird auf die Erkenntnisse dieser früheren Arbeit insbesondere Bezug genommen.
  • So, wie er hier verwendet wird, wird der Ausdruck "Onkogen" in der Bedeutung einer genetischen Sequenz verwendet, deren Ausprägung in einer Zelle diese Zelle dazu veranlaßt, von einer normalen Zelle in eine Tumorzelle umgewandelt zu werden. In gleicher Weise wird der Ausdruck "Proto-Onkogen" hier in der Bedeutung einer genetischen Sequenz verwendet, die in dem normalen Genom einer normalen, Nicht-Tumorzelle enthalten ist, die, bei Veränderung in entsprechender Weise, das Potential hat, ein Onkogen zu werden.
  • Die Sequenzierung des gesamten Onkogenklons (pEJ), der in der in "Cell 25", 355-361 (1981) beschriebenen Arbeit isoliert wurde, und dessen normalen menschlichen homologen Klons (pEC) wurde nicht in einem einfachen Vergleich der Sequenzen dieser beiden Gene verwendet. Da das Onkogen und seine normale Proto- Onkogen-Gegenstücksequenz aus den DNAS gesonderter Individuen abgeleitet wurden, könnten die meisten Sequenzunterschiede zwischen ihnen natürlich vorkommende, schweigende Polymorphismen an diesem Genort widerspiegeln. Andere Sequenzunterschiede könnten die Folge während der Karzinogenese erlittener Mutationsangriffe sein, die funktionell still und somit ohne Bedeutung für den Aktivierungsprozeß sind.
  • Zur Feststellung, ob der signifikante Unterschied zwischen dem Onkogen und dem Proto-Onkogen ein Regulationsunterschied war, wurde ein Vergleich der Ausprägung des c-Ha-RAS-Proto- Onkogens (EC) von einer normalen menschlichen Blasenepithelzellinie mit der Ausprägung des Onkogens in der EJ-umgewandelten Blasenzelle angestellt. Die verwendeten Blasenepithelzellen, Hb1-5, waren ein primäres Gewebekulturexplantat von einer fünf Monate alten Blase, gezüchtet auf inaktivierten NIH3T3-Zubringerschichten. Diese Kultur wurde von frischem menschlichem Blasengewebe vermehrt, und es wurde gezeigt, daß sie mehrere der erwarteten Eigenschaften des Blasenübergangsepithels offenbarte. Sie war frei von unterliegendem Stroma-Material und stellte folglich ein genaues Gegenstück der Zellen dar, von denen das Blasenkarzinom herstammte.
  • Gesamtzell-RNA wurde sowohl von normalen als auch von umgewandelten Blasenzellen hergestellt. Transkripte wurden analysiert, indem man die RNA auf ein Formaldehydgel gab, sie zu einem Nitrozellulosefilter überführte und den Filter mit einem Nick-Transplantations-EJ-Onkogenklon untersuchte.
  • Die spezifischen dabei verwendeten Verfahrensschritte waren wie folgt. Gesamtpolyadenylierungs-RNA wurde nach der Technik von Varmus et al hergestellt. Man vergleiche Varmus, H.E., Quintrell, N. und Ortiz, S. "Cell 25", 23-26 (1981). Vier Mikrogramm RNA wurden dann fraktioniert durch Elektrophorese durch formaldehydhaltige zweiprozentige Agarosegels und auf Nitrozellulose übertragen. Eine RAS-spezifische Probe wurde hergestellt durch Schneiden von pEJ mit BamHI, Fraktionieren der resultierenden Abschnitte durch ein einprozentiges Agarosegel und Extrahieren des Inserts von 6,6 kb mit NaI und Glasperlen. Das Nick-Translationsfragment (6,6 x 10&sup7; cpm Mikrogramm&supmin;¹) wurde zu immobilisierter RNA aufgeschmolzen. Man vergleiche Rigby, R.W. et al "J. Mol. Biol. 13", 237-251 (1977), und Wahl, G.M., Stern, M. und Stark, G.R. "Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76", 3638-3687 (1979). Zu der Probe homologe Streifen wurden durch Autoradiographie sichtbar gemacht. Die Molekulargewichte wurden durch Vergleich mit Markierungsstoffen bestimmt, die man in einer in-vitro-Ablauf-Transkription des Adenovirusspätpromoters erhielt. Man vergleiche Manley, J.L. et al "Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77", 3855-3859 (1980). Die Figur IA zeigt die relativen Niveaus der c-Ha-RAS-spezifischen RNA in den beiden Zelltypen: Bahn 1, RNA aus EJ-Zellen; Bahn 2, RNA aus Hb1-5-Zellen. Wie ersichtlich ist, wurden gleiche Niveaus von RNA in den beiden Kulturen festgestellt und die Transkripte hatten eine Größe von 1,2 kb.
  • Die einzigen bekannten Erzeugnisse von RAS-Genen sind Proteine von etwa 21.000 Dalton Masse, als p21 bezeichnet. Es wurden Versuche durchgeführt, um die Mobilitätsraten von p21-Proteinlysaten sowohl von EJ- als auch normalen Blasenzellen zu analysieren. Es wurden monoklonale Antisera gegen das v-Ha-RAS- p21-Protein verwendet. Man vergleiche Furth, M.E., Davis, L.J., Fleurdelys, B. und Scolnick, E.M. "J. Virol. 43", 294-304 (1982). Kontrollversuche gewährleisteten, daß die verwendeten Antikörpermengen im Überschuß zu denjenigen waren, die für eine Immunpräzipitation des vorhandenen Antigens erforderlich waren. Die Ergebnisse sind in Figur 1B gezeigt.
  • Speziell wurden Kulturen mit ³&sup5;S-Methionin 12 Stunden markiert. Lysate wurden dann hergestellt und immungefällt mit Nicht-Immunsera (Bahnen 1a und 2a), einem monoklonalen Antiserum (Y13- 238), welches das durch Ha-MuSV codierte p21, jedoch nicht das durch Ki-MuSV codierte p21 ausfällt (Bahnen 1b und 2b) oder einem monoklonalen Antiserum (Y13-259), welches sowohl die Ha-MuSV- als auch die Ki-MuSV-p21er feststellt (Bahn 1c und 2c). Man vergleiche Shih, T.Y., Weeks, M.O., Young, H.A. und Stolnick, E.M. "Virology 96", 64-79 (1979). 20 x 10&sup6; cpm Lysat pro Probe wurde durch Elektrophorese durch ein 12,5-prozentiges SDS-Polyacrylamidgel aufgetrennt.
  • Die Figur 1B zeigt einen Vergleich von p21-Proteinen, die von Zellysaten der EJ-Zellklone (Bahnen 1, a-c) und Hb1-5-Zellen (Bahnen 2, a-c) immungefällt wurden. Diese Daten zeigen an, daß zumindest zwei Bahnen radiomarkierten Proteins speziell durch das Anti-p21-Serum aus normalen Blasenzellen ausgefällt wurden. Eine detaillierte Untersuchung des gesehenen Proteinmusters des Blasenkarzinoms offenbarte eine komplexe Anordnung von Banden: Zwei Paare eng beabstandeter Dubletten. Nach einem Vergleich der Intensität der p21-Banden mit den Intensitäten der nicht-spezifisch ausgefällten Hintergrundbanden wurde deutlich, daß die p21-Proteine der normalen und der Tumorzellen in vergleichbaren Mengen vorhanden waren.
  • Die obigen Daten zeigen an, daß die erhöhten Transkriptionsniveaus für die vom EJ-Onkogen gezeigte neue Aktivität nicht verantwortlich waren. Dieser Schluß beruht zum Teil auf der Tatsache, daß unter den verwendeten Hybridisierungsbedingungen die Onkogenprobe ausschließlich mit Transkripten des menschlichen c-Ha-RAS-Gens reagierte. Die Interpretation der Proteindaten war weniger eindeutig, es war jedoch offensichtlich, daß beide Zellen vergleichbare Proteinniveaus hatten, die mit Harvey-spezifischem Serum reaktiv waren und daß diese Proteine zusammengefaßt als "p21" bezeichnet werden konnten.
  • Es blieb möglich, daß die Blasenepithelzellen nicht repräsentativ für normale Präkursoren der Blasenkarzinomzellen waren. Eine solche Möglichkeit könnte die Interpretation trüben, da ein RAS-Gen bei einem hohen Niveau in einem Zelltyp ausgeprägt werden könnte, ohne eine Umwandlung einzuleiten, und dieser Phenotyp nur bei unangemessener Ausprägung in einem zweiten Zelltyp erreicht werden könnte. Daher wurden die Transkriptions und Translationsniveaus der beiden Gene in demselben Zellhintergrund gemessen.
  • Molekulare Klone beider Gene wurden in NIH3T3-Zellen eingeführt. Kolonien, die das EJ-Onkogen erwarben, konnten einfach durch deren umgewandelte Morphologie identifiziert werden. Jedoch waren Zellen, die Normalallelklone erwarben, nicht durch irgendeine offensichtliche Verhaltensänderung identifizierbar.
  • Aus diesem Grunde wurde ein Klon des dominierenden selektierbaren Ecogpt-Gens in NIH3T3-Zellen zusammen mit einem zehnfachen Überschuß entweder des klonierten EJ-Onkogens oder des klonierten Proto-Onkogens (pEC) überführt. Speziell wurden Transfektionen ausgeführt unter Verwendung von 75 Mikrogramm NIH3T3-Träger-DNA, 500 ng pEJ- oder pEC-DNA und 50 ng pSVZgpt- DNA pro 2 x 10&sup6; Zellen durch bekannte Techniken. Man vergleiche Graham, F.L. und von der Eb, A.J. "Virology 52", 456-471 (1973), und Andersson, P., Goldfarb, M.P. und Weinberg, R.A. "Cell 16", 63-65 (1979). In jedem Fall wurden Kolonien in bezug auf die Resistenz gegenüber Mycophenolsäure, erhalten durch das erworbene Ecogpt-Gen, ausgewählt. Man vergleiche Mulligan, R. und Berg, P. "Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78", 2072-2076 (1981).
  • Diese Strategie wurde angewandt, da die Einführung eines nicht- ausgewählten Segments durch Kotransfektion mit einem selektierbaren Gel sichergestellt werden konnte. Man vergleiche Wigler, M. et al "Cell 16", 777-785 (1979). In diesem Fall waren ersichtlich 75 Prozent der aus der Kotransfektion von Ecogpt und pEJ stammenden mycophenolsäureresistenten Kolonien morphologisch umgewandelt; wie erwartet, war keine der nach der Kotransfektion mit pEC aufkommenden Kolonien umgewandelt.
  • Zell-DNA beider Kolonieklassen wurde auf das Vorhandensein von pEC- oder pEJ-Sequenzen analysiert. Zehn Mikrogramm jeder DNA wurde mit Endonuklease BamHI digestiert, was nach den Erwartungen ein Fragment von 6,6 kb von jeder intakten Kopie des klonierten Onkogens oder Proto-Onkogens freisetzen würde. Die digestierte DNA wurde durch ein einprozentiges Agarosegel fraktioniert und auf Nitrozellulosepapier übertragen. 5 x 10&sup6; cpm einer RAS-spezifischen Probe, wie oben beschrieben, wurde mit filtergebundener DNA inkubiert. Die Ergebnisse sind in Figur 2A gezeigt, mit den Bahnen: Bahn 1 NIH3T3-DNA; Bahnen 2 und 3, DNA aus Zellinien, transfektiert mit pEJ: EJ/Gpt-2 (2) und EJ/Gpt-3 (3); Bahnen 4 und 5, DNA aus Zellinien, transfektiert mit pEC: EC/Gpt-1 (4) und EC/Gpt-5 (5).
  • Das normale Maushomologe des RAS-Gens hybridisiert nur schwach zu der pEJ-Probe. Man vergleiche Parada, L.F., Tabin, C.J., Shih, C. und Weinberg, R.A. "Nature 297", 474-479 (1982). Folglich wurden durch sein Vorhandensein die Ergebnisse nicht herabgesetzt. Um zu gewährleisten, daß die transfektierten pBR322- Sequenzen nicht störend in die Interpretation der Daten eingreifen, wurden die RAS-spezifischen Sequenzen von pEJ hergestellt und als Probe verwendet. 75% der mit dem Proto-Onkogen transfektierten nicht-umgewandelten Kolonien und sämtliche der umgewandelten onkogen-transfektierten Kolonien zeigten das Vorhandensein von pEJ-Homologen, bei 6,6 kb migrierenden Sequenzen.
  • Die positiven Kolonien hatten ferner zu der Probe aufschmelzende BamHI-Fragmente anderer Größen. Diese stellen Kopien der Klone dar, die während des Transfektionsprozesses aufgespalten wurden.
  • Zwei Zellinien, die intakte Kopien des Onkogens enthalten, und zwei Linien, die eine annähernd gleiche Zahl intakter Kopien des Proto-Onkogens enthalten, wurden für die weitere Analyse ausgewählt. Fotografien dieser Zellinien, die mit einem Phasenkontrastmikroskop bei Soofacher Vergrößerung aufgenommen wurden, sind in Figur 3 gezeigt. Mit pEJ transfektierte Zellinien sind bei der Konfluenz (EJ/Gpt-2, Foto 3A) und Subkonfluenz (EJ/Gpt-3, Foto 38) gezeigt. Mit pEC transfektierte Zellinien sind ebenfalls in der Konfluenz (EC/Gpt-5, Foto 3C) und Subkonfluenz (EC/Gpt-1, Foto 3D) gezeigt.
  • Gesamtzell-RNA wurde von allen vier transfektierten Zellinien hergestellt. Die RNA-Präparate wurden dann auf ein Formaldehydgel gegeben, auf Nitrozellulose übertragen und mit RAS-spezifischer DNA untersucht. Die oben beschriebenen Verfahrensschritte wurden angewandt, und die Ergebnisse sind in Figur 28 gezeigt, mit den Bahnen: Bahn 1, RNA von NIH3T3-Zellen, Bahn 2, EJ/Gpt-2- Zellen; Bahn 3, EJ/Gpt-3-Zellen; Bahn 4, EC/Gpt-1-Zellen; Bahn 5, EC/Gpt-5-Zellen.
  • Die Niveaus von p21 in diesen Zellen wurden ebenfalls untersucht. Zellysate wurden hergestellt, immungefällt und analysiert, wie oben beschrieben. Die Ergebnisse sind in Figur 2C wiedergegeben als: Immunausfällungen mit nicht-immunem Serum (Bahnen 1, 2, 7, 8) oder dem monoklonalen Antiserum (Y13-238), welches das Ha-MuSV-p21 (Bahnen 3-6) fällt. Zellysate wurden von EJ/Gpt-2 (Bahnen 1, 3) hergestellt; EC/Gpt-1 (Bahnen 2, 4); EJ/Gpt-3 (Bahnen 5, 7) und EC/Gpt-5 (Bahnen 6, 8). Wie ersichtlich ist, fällte das monoklonale Serum gegen p21 gleiche Mengen von p21- Protein in pEC- und pEJ-transfektierten Zellen aus.
  • Diese Daten sprechen nicht vollständig die Frage an, ob die beiden klonierten Gene mit denselben Raten in den Zellen transkribiert sind, da es formell möglich blieb, daß einige wenige der erworbenen Kopien des pEJ in diesen besonderen pEJ-transfektierten Zellen aktiv waren, während sämtliche Kopien des transfektierten pEC-Gens in den anderen Zellen aktiv sein könnten. In einem derartigen Fall würden die festgestellten vergleichbaren Niveaus von Protein oder RNA nicht genau die intrinsischen transkriptionalen Aktivitäten der beiden Gene reflektieren.
  • Jedoch trat ein Punkt deutlich hervor: Ein Niveau von EJ-spezifiziertem p21 führte zu einer Umwandlung, während ein vergleichbares Niveau des proto-onkogen-spezifizierten p21 keine Auswirkung auf den Phenotyp hatte. Da die p21-Proteine die einzigen augenscheinlichen Genprodukte sind, die durch diese Gene codiert werden, wurde geschlossen, daß der Funktionsunterschied zwischen dem EJ-Onkogen und dem Proto-Onkogen von strukturellen Veränderungen im p21-Protein abgeleitet werden muß. Umgekehrt erschienen regulative Änderungen bei der Umwandlungsaktivität des Onkogens nicht kritisch.
  • Aus diesem Grunde wurde den früher festgestellten leichten Variationen in den Migrationsraten des p21-Proteins von verschiedenen Zellen (Figuren 1b und 2c) erneute Bedeutung beigemessen. Daher wurde das p21-Protein unter Bedingungen neu analysiert, bei denen Migrationsunterschiede leichter aufgelöst werden konnten. Diese Ergebnisse sind in Figur 4 dargestellt. Insbesondere wurden Zellen mit ³&sup5;S-Methionin drei Stunden metabolisch markiert; Zellysate wurden hergestellt, immungefällt und analysiert, wie oben beschrieben. Lysate von der Zellinie EJ/Gpt-3 (Bahnen 1, 3) und von der Zellinie EC/Gpt-1 (Bahnen 2, 4) wurden mit dem monoklonalen Anti-p21-Antiserum Y13-238 (Bahnen 1, 2) oder mit Nicht-Immunserum (Bahnen 3, 4) ausgefällt. Schemadiagramme (Bahn 5: EJ/Gpt-3; Bahn 6: EC/Gpt-1) zeigen sowohl die relativen Positionen der festgestellten p21- Banden als auch die Beziehungen dieser Banden (Pfeile) auf der Grundlage kinetischer Daten und früher veröffentlicher Versuche. Man vergleiche Shih, T.Y. et al "J. Virol. 42", 253- 361 (1982).
  • Die Daten der Figur 4 zeigen an, daß die pEJ- und pEC-Trans fektanten jeweils zwei Banden p21 darboten. Das p21-Protein höheren Molekulargewichts der pEJ-Transfektanten migrierte langsamer als das Protein höheren Molekulargewichts der pEC- Transfektanten, und das p21 niederen Molekulargewichts der pEJ-Transfektanten migrierte ebenfalls langsamer als das p21 niederen Molekulargewichts der pEC-Transfektanten. In jedem Fall verhielt sich die langsamer migrierende Bande als eine kinetische Vorstufe zu der schneller migrierenden Bande. Vergleichbare Daten zum p21-Protein des v-Ha-RAS wiesen darauf hin, daß die höhere Bande eine post-translationale Spaltung erfuhr, um ihren niederen, schneller mirgrierenden Partner hervorzubringen. Man vergleiche Shih, T.Y. et al "J. Virol. 42", 253-261 (1982).
  • Da keines dieser p21-Proteine in irgendeinem Ausmaß phosphoryliert schien, wurden die Unterschiede in den Migrationsraten zwischen dem pEC- und dem pEJ-Protein rasch Änderungen in der Anzahl der Aminosäuren oder Änderungen in der Konformation zugeschrieben.
  • Die Daten und die Schemadarstellung der Figur 4 können eine Erklärung für die Komplexität der p21-Proteine liefern, die in normalen und transformierten Blasenzellen (Figur 1b) ersichtlich sind: die normalen Zellen zeigten zwei Banden, reflektiv für die Ausprägung eines Proto-Onkogens; die Karzinomzellen zeigten vier Banden, von denen zwei von dem Onkogen dieser Zellen und zwei von dem normalen Proto-Onkogen des anderen homologen Chromosoms spezifiziert wurden.
  • Die physikalischen Unterschiede, die zwischen p21-Protein von Onkogenen und Proto-Onkogenen beobachtet wurden, hätten funktionell bedeutende Veränderungen im p21-Protein reflektieren oder alternativ Unterschiede darstellen können, die den Transformationsprozeß nicht beeinflußten. Um dies festzustellen, wurdeeine Reihe unabhängiger Versuche aufgebaut, um die Regionen des Onkogens genetisch zu lokalisieren, die die geänderten Migrationsraten des Proteins und die Veränderung in der Genfunktion spezifizierten. Diese Versuche basierten auf homologer Rekombination in vitro zwischen Klonen der beiden Gene.
  • Die Versuchsstrategie bestand darin, ein Restriktionsfragment aus dem Onkogenklon (pEJ) herauszuschneiden und als Ersatz für das homologe Stück des Proto-Onkogenklons (pEC) zu benutzen. Zur gleichen Zeit wurde die reziproke Konstruktion durch Spleissen des Fragments des Proto-Onkogenklons in den Onkogenklon ausgeführt. Diese rekombinanten Konstruktionen wurden dann auf Umwandlungsfähigkeit in der Transfektionsuntersuchung getestet. Bei der Untersuchung wurde die Fähigkeit eines Fragments des Onkogens gemessen, Umwandlungsaktivität zu vermitteln, wenn es inmitten des Proto-Onkogens plaziert wurde, und umgekehrt wurde in der reziproken Rekombination der Verlust der Aktivität bestimmt, wenn das entsprechende Proto-Onkogenfragment in den Onkogenklon eingesetzt wurde. Die Figur 5 stellt ein Diagramm der spezifischen Konstruktionen und eine Zusammenfassung der erhaltenen Transfektions- und Transformationsdaten dar.
  • Die Restriktionskarte zeigt die Spaltungsorte für verschiedene Enzyme in dem 6,6-kb-BamHI-Insert in pBR322. Sämtliche für die Enzyme spezifischen Orte sind gezeigt, außer für XmaI, welches in verschiedenen anderen Plätzen wirkt, die nicht gut charakterisiert worden sind. Der gezeigte Ort ist der einzige XmaI-Ort zwischen dem ersten BsteEII-Ort und dem KpnI-Ort. Die dunklen Kästen auf der Karte zeigen die Lage der Codierungsexons.
  • In Figur 5 sind pEJ/pEC-Chimären mit dem von pEJ abgeleiteten Segmenten gezeigt, die als geschlossene Schiene gezeigt sind, und die Segmente von pEC, die als offene Schiene gezeigt sind. pEJ und pEC wurden mit den angegebenen Enzymen entweder zur Vervollständigung oder zu einer teilweisen Digestion aufgespalten, wie es erforderlich ist, um jedes angegebene Fragment zu erhalten. Die Erzeugnisse wurden durch Elektrophorese durch 1,2 % Agarose separiert und durch Schmelzen eines NaI eluiert sowie von Glasperlen absorbiert. Das p8r322 enthaltende Fragment wurde dann mit kälberintestinaler Phophatase behandelt. Die angegebenen Fragmente wurden entweder mit der Enzym-T4-DNA-Ligase oder in einer Scheinligation ohne Enzym vereinigt. Die Konstruktionen a-e wurden in bimolekularen Ligationen hergestellt. Die Konstruktionen in f wurden durch gleichzeitiges Mischen der drei Fragmente und in g und h durch gleichzeitiges Mischen der vier Fragmente hergestellt. Die Ligationsgemische wurden direkt in den Stamm HB101 von E. coli umgewandelt. Nur wenn Kolonien von Scheinligationen weniger als 2 % der Ligationen waren, wurden die Kolonien auf das Vorhandensein von Klonen mit angemessenen Restriktionskarten analysiert. 20 ng jedes Klons wurden zu NIH3T3-Zellen transfektiert, wie oben beschrieben, und dann ohne Selektion gehalten, bis in 10 bis 14 Tagen Herde sichtbar wurden. Ergebnisse der Transfektionen sind in der ersten Spalte gezeigt. Die zweite Spalte zeigt die Anzahl unabhängiger Bakterienkolonien, die ausgelesen und dann zu NIH3T3-Zellen transfektiert wurden.
  • Es war wichtig zu verifizieren, daß die Umwandlungsklone tatsächlich Chimären des vermischten pEJ- und pEC-Ursprungs waren, und nicht Kontaminante des einen oder anderen Ursprungs. Dies erfolgte auf drei Wegen. Bei den einfacheren Konstruktionen unter Beteiligung von Ligationen von zwei Fragmenten gleichzeitig wurden die mit verstärkten rekombinanten Klonen erhaltenen Ergebnisse durch direkte Transfektion der unverstärkten Erzeugnisse der Ligationsreaktionen und der nicht mit der Ligase behandelte isolierte Fragmente enthaltenden Scheinligationen überprüft. Eine zweite Bestätigung hing von der Tatsache ab, daß die Plasmide pEJ und pEC ihre jeweiligen Zellgene in entgegengesetzten Richtungen in den pBR322-Plasmidvektor eingesetzt enthielten. Somit konnte der Ursprung eines Elternteils einer Rekombinanten durch diagnostische Restriktionsdigestionen der flankierenden Plasmidregionen bestimmt werden. Da das kontaminierende pEC selbst kein falsch positives Ergebnis abgeben konnte, mußten alle aktiven klontragenden Proto-Onkogen-Flankensequenzen als eine Folge des Erwerbs von Bereichen des Umwandlungsgens entstanden sein. Schließlich wurden die Ergebnisse mit mehreren unabhängigen, aus einer Ligationsreaktion gewonnenen Klonen bestätigt.
  • Wie aus Figur 5 ersichtlich, wurde schließlich eine 350 Nukleotiden lange genetische Region identifiziert, die bei Übertragung von dem Onkogen auf eine entsprechende Region in dem Proto-Onkogen in der Lage war, letzterem Aktivität zu vermitteln. Diese Region erstreckte sich von dem ersten XmaI-Endonucleaseort zu dem KpnI-Ort. 55 % dieser Region bestehen aus dem ersten Codierungsexon, 10 % ist 5' zu dem Exon und 35 % ist Teil des ersten Introns.
  • Frühere Versuche hatten einen Unterschied in der Migration des durch das Onkogen und das Proto-Onkogen codierten p21-Proteins identifiziert. Nachdem nun ein kurzer Bereich des Gens bestimmt wurde, der die Umwandlungsverletzung enthielt, wurde es wichtig festzustellen, ob die Region auch die Spezifizität für das geänderte Protein enthielt. Daher wurde eine Immunfällung der mit den Erzeugnissen der in-vitro-Rekombinanten transfektierten Zellen durchgeführt.
  • NIH3T3-Zellen, umgewandelt mit dem EJ-Blasentumoronkogen, seinem normalen Proto-Onkogen oder Rekombinanten zwischen den beiden Genen wurden zuerst biologisch in 0,35 % Agar kloniert und dann metabolisch mit ³&sup5;S-Methionin 18 Stunden markiert. Lysate wurden hergestellt und immungefällt (5 x 10&sup6; cpm TCA-fällbarer Zählungen) durch einen monoklonalen Antikörper, der das durch Ha-MuSV codierte p21, jedoch nicht das durch Ki-MuSV (Y13-172) codierte p21 feststellte. Man vergleiche Furth, M.E., David, L.J., Fleurdelys, B. und Scolnick, E.M. "J. Virol. 43", 294- 304 (1982), und Shih, T.Y., Weeks, M.0., Young, H.A. und Scolnick, E.M. "Virology 96", 64-79 (1979). Gelöste Immunpräzipitate wurden dann durch Elektrophorese in einem 12-%igen SDS- Polyacrylamidgel aufgetrennt und die Ergebnisse sind in Figur 6 gezeigt als: Bahnen 1 bis 7a, kein Antikörper; Bahnen 1 bis 7b, monoklonaler Antikörper Anti-Harvey p21. Die Zellysate waren von: NIH3T3-Zellen (Bahn 1); Zellen, umgewandelt mit dem Proto-Onkogen - dem LTR-aktivierten 3kb-SacI-Fragment, beschrieben in Payne, G.S., Courtneidge, S.A., Crittendon, L.B., Fadly, A.M., Bishop, J.B. und Varmus, H.E. "Cell 23", 311-322 (1981) - (Bahn 2); Klon 504-17, umgewandelt mit dem EJ-Onkogen (6,6-kb-Fragment in pBR) (Bahn 3); Klon 511-74, umgewandelt mit der Ligation des Proto-Onkogen-1-kb-SacI-Fragments zum EJ-Onkogen-3-kb-SacI-Fragment (Bahn 4); Klone 510-9 und 510-13, umgewandelt mit Ligationen eines sich von dem XhoI- Ort zu dem zweiten BstEII-Ort erstreckenden Fragments des EJ- Onkogens zu einem Klon des Proto-Onkogens, von dem das homologe Fragment entfernt worden war (Bahnen 5 und 6), und Klon 508-8, umgewandelt mit der Ligation des EJ-Onkogens linksseitig des KpnI-Orts zum Proto-Onkogen rechtsseitig dieses Orts (Bahn 7).
  • Wie aus Figur 6 ersichtlich ist, komigrierte das Protein, das in Lysaten von Xho-BstEII, SacI-SacI- und BstEII-KpnI-Rekombinationstransfektanten abgegeben wurde, sämtlich mit dem EJ- Protein und hatte eine Beweglichkeit, die sich von der des EC-Proteins unterschied. Eine Markierung der Kulturen für 18 Stunden führte zu hohen Markierungsniveaus in den Niedermolekulargewichtsformen des p21 und unfeststellbaren Markierungsmengen in den kinetisch unstabilen Höhermolekulargewichtsformen. Aus den erhaltenen Daten wurde geschlossen, daß die Phenotypen der onkogenen Transformation und der geänderten elektrophoretischen Migration kosegregieren und beide durch das gleiche DNA-Segment 350 nt codiert wurden. Die geänderte Migrationsrate wurde als wahrscheinlich für eine Reflektion einer funktionell wichtigen Änderung eines Proteins angesehen.
  • Das kurze (350 kb) Fragment, von dem gezeigt wurde, daß es biologische Signifikanz besitzt, wurde für DNA vom Onkogen und Proto-Onkogen sequenziert. Diese Sequenzen wurden durch die vorwärts und rückwärts gerichtete Didesoxy-DNA-Sequenzie rungstechnik von Seif et al und durch das chemische Verfahren von Maxam und Gilbert bestimmt. Man vergleiche Seif, I., Khoury, G. und Dhar, R. "Nucl. Acid Res. 8", 2225-2238 (1980), und Maxam, A.H. und Gilbert, W. "Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74", 560-564 (1977). Die Ergebnisse sind in Figur 7 gezeigt, in der der Codierungs-DNA-Strang zusammen mit der hergeleiteten Aminosäuresequenz gezeigt ist. Wo EJ und das Proto-Onkogen differieren, sind beide Codons und Aminosäuren angegeben.
  • Wie aus Figur 7 ersichtlich ist, liegt der einzige Unterschied zwischen den beiden DNA-Segmenten in der p21-Codierungsregion des ersten bekannten Exons, speziell 60 Nukleotiden vom Xma- Spaltungsort. Es tritt in einer Dreiergruppe auf, die Glycin in den normalen Ratten- und Menschen-c-Ha-RAS-Genen codiert. Die im EJ-Onkogen beobachtete Sequenz codiert Valin. Somit ist diese Veränderung verantwortlich für die Funktionsveränderung des Protein p21 und für die onkogene Aktivierung des c-Ha-RAS-Gens, das in dem EJ-Blasenkarzinom auftritt.
  • Eine Konsequenz der Einzelbasenänderung ist die Veränderung des Spaltungsortes zweier verschiedener ortspezifischer Endonucleasen. Die Sequenz GCCGGC tritt im Proto-Onkogen auf und stellt somit einen Erkennungsort für die Endonuclease NaeI dar. Diese Sequenz enthält auch den Erkennungsort CCGG der Endonuclease HpaI. Diese sind beide in dem Onkogen verändert, dessen Sequenz in der Region GCCGTC lautet.
  • NaeI-Endonuclease wurde dazu benutzt, unabhängig die Unterschiede zwischen den beiden Sequenzen zu überprüfen. Nael wurde anstelle von HpaI benutzt, weil Naei die DNA weniger häufig spaltet als HpaI. Wie erwartet, zeigte der pEC-Klon einen Spaltungsort mehr in seinen Inserts als sein pEJ-Gegenstück. Dies liefert auch eine retrospektive Verifizierung der in-vitro- Rekombinationsklone. Es war ersichtlich, daß die allelspezifizierende Transformation und abnormale p21-Migration genau mit der allelzurückweisenden NaeI-Spaltung an diesem Ort kosegregierte.
  • Figur 8 stellt die Ergebnisse einer NaeI-Restriktionsenzymbestimmung des EJ-Onkogens und dessen entsprechenden Proto- Onkogens dar. Gemäß den beschriebenen Methoden wurde bestimmt, daß ein Nael-Restriktionsort im Proto-Onkogen existieren muß, der in der Abwandlung, die das Onkogen produzierte, verloren ist. Molekulare Klone des Onkogens (pEJ) und des Proto-Onkogens (pEC) sowie das Plasmid, in das jedes kloniert war (pBR322), wurden jeweils durch bekannte Verfahren gereinigt. Ein Mikrogramm von jedem wurde mit dem Enzym Naei geschnitten und die resultierenden Fragmente wurden durch Elektrophorese durch ein 15-%iges Bis-Acrylamidgel aufgetrennt. Das Gel wurde durch den interkalierenden Farbstoff Ethidiumbromid eingefärbt und bei ultraviolettem Licht fotografiert.
  • In Figur 8 sind die Bahnen: Bahn 1 ist ∅ x 174 DNA, geschnitten mit dem Enzym HaeIII als eine Markierungsbahn, die Banden bekannter Größe produziert; Bahn 2 ist pBR322, geschnitten mit Naei unter Veranschaulichung von in dem Plasmidvektor ihren Ursprung habenden Fragmenten; Bahn 3 ist durch Nael aufgespaltene pEJ-DNA und Bahn 4 ist durch Nael aufgespaltene pEC-DNA.
  • Die pEJ-DNA enthält eine mit einem Molekulargewicht von 1200 Basenpaaren wandernde Bande, die in der pEC-Bahn fehlt. Die pEC-Bahn hat jedoch zwei zusätzliche Banden, eine von 400 Basen und die andere von 800 Basen Länge, die in der pEJ-Bahn fehlen. Somit ist der NaeI-Ort im pEC, der eine Aufspaltung der Bande 1200 bp in zwei Banden von 400 und 800 Basen ermöglicht, in der Bildung des EJ-Onkogens verloren.
  • Von der einfachen Ersetzung von Valin für Glycin beim Protein p21 konnte nicht erwartet werden, daß dies eine so tiefgreifende Funktionsveränderung des Proteins p21 haben würde. Dennoch scheinen mehrere Überlegungen dieser Strukturveränderung Bedeutung beizumessen. Die erste stammt aus einem Vergleich dieser Domäne des p21, codiert durch das menschliche c-Ha-RAS- Gen, das Ratten-c-Ha-RAS-Gen und das v-Ha-RAS-Onkogen des Harvey-Sarkomvirus. Die 37 Rest langen Aminosäuresequenzen codiert durch die ersten Exons der beiden Zellgene, sind identisch, was die große Evolutionserhaltung dieser Region anzeigt. Die Analyse des Harvey-Sarkomvirus-Onkogens hat jedoch offenbart, daß sie von ihrer direkten Rattenzellvorstufe in nur einer Position in dieser Domäne abweicht, einer Umwandlung von Glycin zu Arginin an genau dem gleichem Rest, der in dem EJ-Onkogen verändert wird. Folglich kann vermutet werden, daß die Änderung dieses kritischen Restes sowohl für die Aktivierung des v-Ha- RAS-Gens von seinem Rattenzellvorgänger als auch für die Aktivierung des EJ-Blasenonkogens von seinem normalen menschlichen Gegenstück von Bedeutung war. Eine gleiche Veränderung kann in der onkogenen Aktivierung eines anderen Mitglieds der RAS- Genfamilie, des v-Ki-RAS-Gens des Kirsten Maussarkomvirus, signifikant sein. Das Kirstenumwandlungsgen ist eng mit dem v-Ha-RAS-Gen verwandt. Man vergleiche Dhar, R., Ellis, R.W., Shih, T.Y., Oroszlan, S., Shapiro, B., Maizel, J., Lowy, D.R. und Scolnick, E.M. "Science 217", 934-936 (1982). Der einzige Unterschied zwischen dem p21 des v-Ki-RAS und dem des v-Ha- RAS in den ersten 36 Aminosäuren liegt bei Position 12, wo der Rest bei Kirsten Serin ist. Man vergleiche Tsuchida, N., Ryder, T. und Ohtsubo, E. "Science 217", 937-939 (1982). Dies ist genau der gleiche Ort wie in den EJ- und Harveysarkomvirus codierten p21ern verändert. Da Sequenzinformationen über das Zellhomologe des v-Ki-RAS nicht verfügbar sind, kann vermutet werden, daß eine Umwandlung vom Glycin in einen neuen Aminosäurerest bei Position 12 auch bei der Aktivierung dieses RAS- Onkogens beteiligt ist.
  • Eine zweite Überlegung stammt aus einer Untersuchung der beobachteten spezifischen Aminosäurenveränderungen. In beiden Fällen wird Glycin durch eine Aminosäure mit einer verhältnismäßig großen Seitenkette ersetzt. Glycin stellt eine Anomalie unter den 20 Aminosäuren dar, da ihm eine Seitenkette fehlt. Folglich ist es in der Lage, an extremen Biegungen und Faltungen des Polypeptidrückgrats teilzunehmen, und es ist der stärkste Aufspalter von Alpha-Helices. Man vergleiche Cantor, C.R. und Schimmel, P.R. "Biophysical Chemistry, Vol. 1", Seite 303, W.H. Freeman und Co., San Francisco (1980). Somit stellen Ersetzungen von Glycin durch Valin oder Arginin abrupte Veränderungen in der örtlichen Stereochemie eines Proteins dar.
  • Man ist der Auffassung, daß der Verlust von Glycin am Rest 12 eine signifikante Veränderung in der wesentlichen Domäne des Proteins p21 darstellt. Eine Folge dieser Veränderung kann eine Konformationsverschiebung des Proteins sein, die ihrerseits zu der anomalen elektrophoretischen Migration oder Reifung von p21-Proteinen führt. Eine zweite, bedeutendere Folge ist ein tiefgehender Einfluß auf die Funktion des p21-Proteins. Es ist wahrscheinlich, daß diese Veränderung die Wechselwirkung des p21 mit zellulären Zielen beeinflußt. Es existieren Präzedenzfälle für andere Einzelaminoveränderungen, die weitgehende Auswirkungen auf die Zell- und Organphysiologie nehmen. Der bekannteste von ihnen ist das Sichelzellensyndrom, bei dem eine Umwandlung von Glutamin zu Valin die Löslichkeit von Hämoglobin in Erythrozyten beeinflußt.
  • Die hier beschriebenen Entdeckungen scheinen einer Reihe von Versuchen der letzten Jahre zu widersprechen, die als zentrales Ereignis bei der Karzinogenese Aufregulierung angeben. Derartige Experimente umfassen die Aktivierung des MYC-Proto-Onkogens, das bei der Leukemogenese aviärer Retroviren auftritt - man vergleiche Neel, B.G., Hayward, W.S., Robinson, H.L., Fang, J. und Astrin, S.M. "Cell 23", 323-324 (1981), und Payne, G.S., Courtneidge, S.A., Crittendon, L.B., Fadly, A.M., Bishop, J.M. und Varmus, H.E. "Cell 23", 311-322 (1981) - und die Demonstration, daß eine in-vitro-Verschmelzung eines Retrovirus- LTR-Promoters und eines zellulären Proto-Onkogens zu einem aktiv transformierenden Gen führt - man vergleiche Defeo, D., Gonda, M.A., Young, H.A., Chang, E.H., Lowy, D.R., Scolnick, E.M. und Ellis, R.W. "Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78", 3328- 3332 (1981), Blair, D.G., Oskarsson, M., Wood, T.G., McClements, W.L., Fischinger, P.J. und Vandewoude, G. "Science 212", 941- 943 (1981), und Change, E.J., Furth, M.E., Scolnick, E.M. und Lowy, D.R. "Nature 297", 479-483 (1982). Diese letzteren Ergebnisse fügen sich besonders gut ein, da einige von ihnen eine Aktivierung von Klonen der Ratten- und Human-c-Ha-RAS- Proto-Onkogene demonstrieren. Es ist unwahrscheinlich, daß die proteincodierenden Sequenzen dieser c-Ha-RAS-Gene irgendwelche Strukturveränderungen bei der Konstruktion dieser Virus- Zellen-Chimären erfahren haben. Eher hat es den Anschein, daß der einzige wesentliche Unterschied zwischen den Proto-Onkogenen und ihren LTR-aktivierten Gegenstücken in den Expressionsraten liegt. Dies bedeutet, daß das RAS-Proto-Onkogen durch einen zweiten unabhängigen Mechanismus aktiviert werden kann, der im Prinzip genauso wirksam ist wie die Schaffung eines Onkogens wie das hier beschriebene.
  • Onkogene anderer Tumore sind ebenfalls auf RAS-Gene untersucht worden. Speziell wurde bei Kolon- und Lungenkarzinomen festgestellt, daß sie Onkogene enthalten, die aus der Aktivierung zellulärer Ki-RAS-Gene abgeleitet sind. Man vergleiche Der, C., Krontiris, T.G. und Cooper, G.M. "PRoc. Natl. Acad. Sci. USA 79", 3637-3640 (1980). Daher ist es wahrscheinlich, daß die Aktivierung vieler dieser Onkogene auch von Strukturveränderungen abhängig ist, ähnlich den oben berichteten.
  • Wie oben beschrieben, macht die Veränderung des Gly¹²-Kodons im EJ-Onkogen eine einfache Diagnosebestimmung für Karzinogenese oder eine Umwandlung möglich, die durch eine Veränderung dieses Kodons im Onkogen hervorgerufen worden ist. Jede Mutation des Gly¹²-Kodons, die bei der Karzinogenese oder verwandten Prozessen auftritt, verändert den Spaltungserkennungsort für die NaeI- und HpaII-Endonukleasen und macht die geänderte DNA des Onkogens gegenüber einer Spaltung dieses Ortes resistent. Daher bildet jeder Spaltbarkeitstest der DNA an diesem Ort durch diese Endonukleasen einen Diagnosetest für die Mutationsveränderung dieser Region des Proto-Onkogens.
  • Dieser Test kann in der Weise ausgeführt werden, daß DNAs von Interesse mit Nael als Beispiel behandelt werden, die resultierenden Fragmente durch Agarosegelelektrophorese aufgetrennt werden, die getrennten Fragmente an einen Cellulosenitratfilter überführt werden und die übertragenen Fragmente durch Inkubation des Filters mit einer radiomarkierten, sequenzspezifischen Probe, gefolgt durch Radioautographie, festgestellt werden. Die Verfahren sind weithin bekannt. Man vergleiche Southern, "J. Mol. Biol., 98", 503-17 (1975).
  • Die in derartigen Experimenten verwendete Sequenzprobe kann aus einem beliebigen einer Anzahl von DNA-Segmenten abgeleitet werden, die die Region des Proto-Onkogens überlappen oder die dicht an dieser Region des Proto-Onkogens liegen. Bei dem beschriebenen Beispiel könnte die Sequenzprobe das Nael-Fragment des Onkogens sein, das am Nael-Ort links vom geänderten Kodon beginnt und am Nael-Ort rechts davon endet. Die DNA einer Zelle, die das normale Proto-Onkogen trägt, wird in zwei Teile an diesem Ort durch die Nael aufgespalten, während die DNA des EJ-Blasenkarzinomonkogens an diesem Ort durch die Behandlung mit einer NaeI- Endonuklease unbeeinflußt bleibt.
  • Diese Bestimmung kann allgemein für die Veränderung der DNA eines Proto- Onkogens für dessen entsprechendes Onkogen durchgeführt werden. Die Sensitivität für eine Aufspaltung durch eine Restriktionsendonuklease an einer DNA-Sequenz entweder des Proto-Onkogens oder Onkogens, aber nicht des anderen, ist ein grundlegendes Konzept.
  • Eine weitere Konsequenz der Veränderung der Aminosäuresequenz des durch das Proto-Onkogen codierten p21-Proteins vom durch das Onkogen codierten p21-Protein bezieht sich auf die Erkennung von jedem durch spezifische serologische Reagentien. Die serologischen Reagentien können spezifisch sein für die normale, proto-onkogen-spezifizierte Aminosäuresequenz an diesem Ort des Proteins, oder spezifisch sein für die veränderte, onkogenspezifizierte Aminosäuresequenz an diesem Ort des Proteins. Andere serologische Reagentien könnten eingesetzt werden, die mit einem Bereich des Proteins zur Reaktion gebracht werden, der unverändert ist, und die folglich sowohl mit normalen als auch anomalen Formen des p21- Proteins reaktionsfähig sind.
  • Unter Verwendung von Klonierungsverfahren können bedeutsame Mengen von durch den normalen Ort des Proto-Onkogens oder durch den veränderten Ort des Onkogens codiertem p21-Protein isoliert werden. Solche Proteinsegmente könnten zur Herstellung von Antikörpern durch Standard- Antikörperherstellungs-Verfahren verwendet werden. Somit würden für das Herstellen polyklonaler Antikörper solche Proteine eingesetzt werden, um einen Wirt, wie ein Kaninchen oder eine Ratte, zu immunisieren, und Antikörper zu dem Protein würden aus von dem Wirt erhaltendem Serum gesammelt.
  • Alternativ könnten monoklonale Antikörper hergestellt werden unter Verwendung von Zellen, die Antikörper zu dem Protein produzieren, das von dem isolierten Gensegment in typischen Verschmelzungsverfahren zur Bildung von Hybridomzellen hergestellt wurde. Grundlegend beinhalten diese Verfahren das Verschmelzen der Antikörper produzierenden Zelle mit einer Zelle mit Unsterblichkeit, wie eine Myelomzelle, um ein Fusionszellhybrid zu erhalten, das Unsterblichkeit aufweist und in der Lage ist, den gewünschten Antikörper zu produzieren, in diesem Fall einen Antikörper zu dem normalen oder veränderten Segment des durch das isolierte Gensegment codierten p21-Proteins. Die Hybridzellen werden dann unter die Antikörperbildung förderlichen Bedingungen kultiviert, nach denen Antikörper aus dem Zellkulturmedium gesammelt werden. Solche Verfahren für die Herstellung monoklonaler Antikörper sind in der Literatur hinlänglich beschrieben worden. Man vergleiche zum Beispiel die US-Patente Nr. 4.172.124 und 4.196.265, ausgegeben an Hilary Koprowski et al, deren Lehren hiermit durch den Hinweis aufgenommen sind.
  • Insbesondere können solche serologischen Reagentien durch die bekannten Verfahren entwickelt werden. Man vergleiche Walter, G., Scheidtmann, K.H., Carbone, A., Laudaro, A.P. und Doolittle, R.F. "Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77", 5197-5200 (1980); Lerner, R.A., Green, N., Alexander, H., Liu, F.T., Sutcliffe, J.G. und Schinnick, T.M. "Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78", 3403-3407 (1981).
  • In der Praxis kann ein Peptidsegment durch ein organisches Synthese-Standardverfahren synthetisiert werden, wobei die Sequenz dieses Peptids präzise der Aminosequenz des interessanten Bereichs des zu untersuchenden Proteins entspricht. Dieses Peptid kann dann an ein Trägerprotein gekoppelt und einem geeigneten Wirt (z.B. einer Maus) injiziert werden, um eine Immunantwort auszulösen. Das Serum des auf diese Weise immunisierten Tieres wird dann verwendet, um sowohl das immunisierende Peptid als auch, was wichtiger ist, das Protein immunzufällen, das diese Aminosäuresequenz in einer seiner Domän,en trägt. Folglich kann ein Serum hergestellt werden gegen eine Oligopeptidsequenz (z.B. ein Decapeptid), welche den Aminosäurerest-Ort umspannt, der während der Konversion des normalen Proto-Onkogens in das Onkogen verändert wird. Solch ein Serum kann gegen die normale Peptidsequenz oder alternativ gegen die veränderte Sequenz hergestellt werden. Die Spezifität der Immunglobulin-Antigen-Wechselwirkung wird sicherstellen, daß das mit dem Oligopeptid reagierende Serum nur mit dem Protein reagieren wird, das dieselbe, entsprechende Sequenz in einer seiner Domänen trägt und nicht mit einem Protein, das eine veränderte Version dieser Sequenz in einer seiner Domänen trägt, kreuzreagiert.
  • p21-Protein kann aus einer Tumorprobe oder aus einem Gewebehomogenat oder aus einer von einem autolysierenden Tumorfrag ment freigesetzten Flüssigkeit immungefällt werden unter Verwendung des allgemeinen, nicht-spezifischen p21-Serums, das mit Domänen des Proteins (z.B. C-Terminus) kreuzreagiert, die von den hier beschriebenen mutationsinduzierten Veränderungen unberührt bleiben. Unabhängig davon kann das Serum mit Spezifität gegen den N-terminalen, normale Peptide umgebenden Rest 12 verwendet werden, um Protein aus demselben Lysat immunzufällen. Wenn dieses N-Terminus-spezifische Serum, welches in der Lage ist, normales p21 aus dem nicht-pathologischen Gewebe immunzufällen, nicht in der Lage ist, p21 aus einem interessanten Testgewebe immunzufällen, dann kann von dem p21 aus diesem Testgewebe angenommen werden, daß es in einer Weise verändert ist, die seine Fähigkeit, mit mit der normalen N-Terminus-Sequenz reaktivem Serum zu reagieren, beeinflußt. Die Menge des aus diesem Gewebe durch das allgemeine, nicht-spezifische Serum immungefällten p21 dient als eine Kontrolle für die Menge des p21, die aus dem mit der normalen N-Terminus-Sequenz raaktivem Serum fällbar sein sollte.
  • Die obige Immunfällung kann als ein Maß für das Vorhandensein von verändertem p21 in einer Gewebeprobe verwendet werden. Unabhängig davon kann eine Reihe peptid-spezifischer Sera entwickelt werden zum Erkennen, welcher spezifische Typ der Veränderung aufgetreten ist, um die normale Aminosäuresequenz dieser Region in eine abnorme Sequenz umzuwandeln. Zum Beispiel kann ein Liste der Aminosäuren-Austausche gemacht werden, die durch einfache Punktmutation an dem den Rest 12 codierenden Kodon auftreten können. Für jeden dieser Austausche kann eine neue Version der Oligopeptid-Sequenz dieser Region abgeleitet und ein entsprechendes Peptid zur oben beschriebenen Verwendung synthetisiert werden. Jedes dieser Sera wäre spezifisch reaktiv mit dem veränderten p21, das dem zum Induzieren des fraglichen Serums verwendeten Oligopeptid-Fragment entspricht.
  • Der Begriff "Immunfällung" wird durch eine Reihe alternativer technischer Verfahren beschrieben. Ein allgemein verwendetes Verfahren ist das der Immunfällung eines metabolisch markierten Proteins, gefolgt von Gelelektrophorese und Autoradiographie des resultierenden Gels. Wegen der Schwierigkeiten, Gewebeproben metabolisch zu markieren, wird hier eine Alternative bevorzugt, die in der Verwendung der Gelelektrophorese von nicht-markierten Proteinen, Übertragung der aufgelösten Proteine auf ein Nitrozellulose-Filter und Detektion der interessanten Proteine durch Inkubation des Filters mit radioaktiv markiertem Immunglobulin besteht. Das Immunglobulin kann entweder durch direkte Jodinierung radioaktiv markiert werden oder indirekt durch Inkubation des Immunglobulins mit einem zweiten, radioaktiv markierten Immunglobulin, das mit konstanten Regionen des ersten Immunglobulins reagiert.
  • Obgleich die Diskussion in der vorliegenden Anmeldung und ein großer Teil der Versuchsarbeiten der Feststellung von Unterschieden im EJ-Gen für Humanblasenkrebs und das Proto-Onkogen, c-Ha-RAS, galten, sind die Techniken zur Feststellung dieser Unterschiede sowie die darauf basierenden Bestimmungen von weit allgemeinerer Natur. Tatsächlich wird angenommen, daß sich solche Techniken und Bestimmungen auf jedem Wildtyp-Gen oder -Allel, welches mutiert worden ist, um ein mutiertes Allel oder Gen zu erzeugen, welches eine von dem Wildtyp-Allel drastisch verschiedene Funktion hat, anwenden lassen. Zum Beispiel würde man von solchen Techniken und Bestimmungen erwarten, daß sie geeignet sind für die Verwendung beim Erkennen von Unterschieden in dem Wildtyp-Gen und dem für das Lesch- Nyan-Syndrom verantwortlichen mutierten Gen.
  • Die Techniken haben natürlich einen besonderen Nutzen und Vorteil beim Erkennen von Unterschieden zwischen Onkogenen und Proto-Onkogenen. Mitglieder der RAS-Familie der Gene sind bereits diskutiert worden. Jedoch bieten sich die hier beschriebenen Techniken auch dazu an, Unterschiede zwischen anderen Proto-Onkogenen und Onkogenen als den Mitgliedern der RAS-Familie zu ermitteln. Zum Beispiel könnten Unterschiede zwischen dem Onkogen in der HL-60-Zellinie, das als verantwortlich für promylozytische Leukämie, bestimmte Kolonkrebse und Haarzellleukämie bekannt ist, und dessen Proto-Onkogene unter Verwendung der hier beschriebenen Verfahren ermittelt werden. Diese Unterschiede könnten dann in Bestimmungen der beschriebenen Art verwendet werden.
  • Ein sehr allgemeines Protokoll zur Bestimmung von Unterschieden in einem Wildtyp-Gen und dessen korrespondierendem mutierten Gen ist wie folgt:
  • A. Man entwickle eine in-vitro-Bestimmung für die Aktivität eines Gens, dessen Funktion oder Fehlfunktion für den Phenotyp einer genetischen Erkrankung verantwortlich ist. Eine derartige in-vitro-Bestimmung ist im allgemeinen von einer beobachtungsfähigen Veränderung im Verhalten einer gezüchteten Zelle abhängig, die das Gen durch eine Genübertragung erworben hat.
  • B. Man verwende die in in-vitro-Bestimmung zur Isolierung eines Allels des obigen Gens als Molekularklon. Ein derartiges Allel kann entweder ein Wildtyp-Allel oder eine Fehlfunktionsallelvariante des Wildtyp-Allels sein.
  • C. Man verwende das isolierte Allel aus Absatz B zur Isolierung anderer Allelformen des Gens unter Verwendung der Rekombinations-DNA-Techniken. Somit kann das normale Allel als Sequenzprobe zur Ermöglichung der Identifizierung und Isolierung einer Allelvariante des Nicht-Wildtyps verwendet werden.
  • D. Man demonstriere die beobachtungsfähigen verschiedenen und charakteristischen Verhalten des Wildtyp-Allels und einer Nicht-Wildtyp-Variante in dem in-vitro-Bestimmungssystem.
  • E. Man führe in vitro eine genetische Rekombination zwischen den Klonen des Wildtyp- und Nicht-Wildtyp-Allels durch, gefolgt von einer Untersuchung der Rekombinanten im in-vitro- Bestimmungssystem und Bestimmung des durch ein Wildtyp- oder Nicht-Wildtyp-Allel in diesem System (Teil D) herbeigeführten Phenotyps. Auf diese Weise kartiere man genetisch die Region des Nicht-Wildtyp-Allels, das für die Unterschiede in der Funktion zwischen den beiden Allelen verantwortlich ist.
  • F. Man führe eine Struktursequenzanalyse der Region des nachgewiesenen Nicht-Wildtyp-Allels (Teil E) durch, um den Funktionsunterschied zwischen den beiden Allelen zu codieren.
  • G. Nach der Identifizierung einer geänderten Schlüsselsequenz (Teil F), deren Existenz den geänderten Phenotypen des Nicht-Wildtyp-Gens bestimmt, identifiziere man eine oder mehrere ortsspezifische Endonukleasen (Restriktionsenzyme), deren Spaltungserkennungsort während des Prozesses verändert wurde, der ein Wildtyp-Allel in ein Nicht-Wildtyp-Allel umwandelt.
  • H. Man verwende das klonierte Wildtyp-Gen als Sequenzprobe zum Auslesen von DNAS von Versuchsproben oder Versuchsgewebe zur Feststellung, ob oder nicht die Test-DNA eine Sequenzveränderung in jenem Gen trägt und jenem Bereich des Gens, der oben (Teil E) als kritisch bei der Beeinflussung der Funktion des Gens und seiner Nicht-Wildtyp-Allelvarianten gezeigt worden ist, und Prüfung auf das Vorhandensein oder Fehlen des Restriktionsendonukleaseorts (Teil G), dessen Veränderung oben als die Funktion des Gens beeinflussend gezeigt wurde.
  • I. Man leite die durch das normale Wildtyp-Allel des Gens und seine Nicht-Wildtypvarianten-Formen codierten Aminosäuresequenzen ab. Man bestimme, ob der zuvor kartierte Nukleotidsequenz-Unterschied, der zuvor als das Funktionieren des Gens beeinflussend gezeigt wurde, auch die Aminosäuresequenzen der Proteine beeinflußt, die durch Wildtyp- und Nicht- Wildtyp-Allele codiert werden.
  • J. Sollten Aminosäuresequenzen beeinflußt sein, entwickle man für die Wildtyp- und Nicht-Wildtyp-Proteine spezifische Antisera. Zum Beispiel könnte man ein Oligopeptid- Fragment synthetisieren, dessen Sequenzen die Sequenz der Domäne des Nicht-Wildtyp-Proteins reproduzieren, welche es funktionell vom Wildtyp-Protein (Teil I) unterscheiden; man synthetisiere das entsprechende Wildtyp-Oligopeptid; man verwende beide als Immunogene, um Antisera zu bilden, die spezifisch für die Reaktion mit den Wildtyp- und Nicht-Wildtyp-Proteinen sind.
  • K. Man benutze die spezifischen Antisera (Teil J), um die Proteine von Testzellen oder Testgewebe auf das Vorhandenseln von Wildtyp- oder Nicht-Wildtyp-Versionen des besagten Proteins zu untersuchen.
  • L. Man benutze die Protein-Untersuchung (Teil K), um das Vorhandensein von Proteinen zu erkennen, deren Struktur wichtig für die Vermittlung des Phenotyps einer genetischen Krankheit ist.
    • Gewerbliche Anwendbarkeit
  • Die hier beschriebene Erfindung ist bei der Definition der Unterschiede zwischen Proto-Onkogenen und ihren entsprechenden Onkogenen, den durch derartige Gene codierten Proteinen, der Herstellung von Antikörpern zu solchen Proteinen oder Anteilen davon und der Verwendung solcher Antikörper bei Bestimmungen für das Vorhandensein derartiger Proto- Onkogene oder Onkogene als ein Maßstab für Karzinogenese nützlich.
    • Äquivalente
  • Der Fachmann erkennt zahlreiche Äquivalente zu den hier beschriebenen speziellen Ausführungsformen der Erfindung oder ist in der Lage, diese durch einfache Routineuntersuchungen zu ermitteln. Derartige Äquivalente sollen von den folgenden Ansprüchen mitumfaßt sein.

Claims (11)

1. Verfahren zur Herstellung eines zum Nachweis des Vorhandenseins eines durch ein menschliches Onkogen codierten Proteins fähigen Antikörpers, bei dem
a) ein Antigen erzeugt wird, das durch eine im Onkogen vorhandene Nukleotidsequenz codiert ist, die sich von der entsprechenden im Proto-Onkogen vorhandenen Nukleotidsequenz unterscheidet, derart, daß das Antigen, bei Immunisierung eines Wirts, in der Lage ist, die Herstellung eines Antikörpers hervorzurufen, der spezifisch ist für das durch das menschliche Onkogen codierte Protein und nicht für das durch das menschliche Proto-Onkogen codierte Protein, und
b) der Wirt mit dem Antigen unter Bedingungen immunisiert wird, bei denen der Wirt den Antikörper herstellt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das menschliche Onkogen ein menschliche RAS-Onkogen ist.
3. Verfahren zur Herstellung eines zum Nachweis des Vorhandenseins eines durch ein menschliches Proto-Onkogen codierten Proteins fähigen Antikörpers, bei dem
a) ein Antigen erzeugt wird, das durch eine im Proto- Onkogen vorhandene Nukleotidsequenz codiert ist, die sich von der entsprechenden im Onkogen vorhandenen Nukleotidsequenz unterscheidet, derart, daß das Antigen, bei Immunisierung eines Wirts, in der Lage ist, die Herstellung eines Antikörpers hervorzurufen, der spezifisch ist für das durch das menschliche Proto-Onkogen codierte Protein und nicht für das durch das menschliche Onkogen codierte Protein, und
b) der Wirt mit dem Antigen unter Bedingungen immunisiert wird, bei denen der Wirt den Antikörper herstellt.
4. Verfahren nach Anspruch 3, bei dem das menschliche Proto-Onkogen ein menschliches RAS-Proto-Onkogen ist.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem das Antigen ein an einen Polypeptidträger gekoppeltes Oligopeptid umfaßt.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem eine antikörperproduzierende Zelle vom immunisierten Wirt selektiert und zur Herstellung eines monoklonalen Antikörpers verwendet wird.
7. Verfahren nach Anspruch 6, bei dem die antikörperproduzierende Zelle mit einer immortalen Zelle verschmolzen wird, um eine zur Herstellung des monoklonalen Antikörpers fähige immortale Fusionszellhybride herzustellen.
8. Verfahren zur Herstellung eines zum Nachweis von durch ein Onkogen hervorgerufener Karzinogenese fähigen Antikörpers, bei dem
a) ein Oligopeptid synthetisch hergestellt wird, das eine in einem durch das Onkogen codierten Protein vorhandene Aminosäurensequenz enthält, die sich von der entsprechenden in einem durch das entsprechende Proto-Onkogen codierten Protein vorhandenen Aminosäurensequenz unterscheidet, und
b) ein Wirt mit dem Oligopeptid unter Bedingungen immunisiert wird, bei denen der Wirt den Antikörper herstellt.
9. Verfahren nach Anspruch 8, bei dem der Antikörper spezifisch ist für ein RAS-Protein.
10. Antikörper, herstellbar durch das Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche.
11. Screening-Ausrüstung für medizinische Diagnosen mit einem Antikörper nach Anspruch 10.
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