Technisches Gebiet
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Die vorliegende Erfindung liegt auf dem Gebiet der
Molekularbiologie und bezieht sich auf eine Erkennung von Unterschieden
zwischen mutierten Allelen und deren entsprechenden Wildtyp-
Allelen, insbesondere ein RAS-Onkogen und ein Proto-Onkogen,
sowie auf Bestimmungen, die derartige Unterschiede ausnützen.
Stand der Technik, von dem die Erfindung ausgeht
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Frühere Arbeiten über die chemische Krebserzeugung haben
gezeigt, daß die karzinogene Potenz einer Verbindung häufig mit
ihrer mutagenen Kraft in Wechselbeziehung steht. Man vergleiche
McCann, J., Choi, E., Yamasaki, E. und Ames, B.N. "Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 72", 5135-5139 (1975), McCann, J. und Ames,
B.N. "Proc. Natl. Acad. Sci. USA 73", 950-954 (1976), Bridges,
B.A. "Nature 261", 195-200 (1976) und Bouck, N. und diMayorca,
G. "Nature 264", 722-727 (1976). Diese Arbeiten lassen darauf
schließen, daß die DNA das letzte Ziel der karzinogenen
Aktivierung ist. Aus diesem Grunde haben die Forscher versucht,
DNA-Segmente in Tumorzellen, häufig als "Onkogene" bezeichnet,
deren Veränderung von entscheidender Bedeutung für eine
onkogene Konversion ist, zu identifizieren und zu untersuchen.
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Ein jüngster Versuch der Isolierung eines Onkogens war mit
der Übertragung von Tumorzellen-DNA von der
EJ-Blasenkrebszellinie auf nicht-umgewandelte NIH3T3-Mausfibroblaste
verbunden. Es wurde gefunden, daß der Phenotyp der
Zellumwandlung auf diese Weise von Zelle zu Zelle weitergegeben werden
konnte. Die Tumor-DNA war in der Lage, Herde (Foci)
umgewandelter Zellen in die Rezipienten-NIH-Monoschichtkultur zu
induzieren, während DNA von normalen, nicht umgewandelten
Spenderzellen keine Herde produzierte. Man vergleiche Shih, C.,
Shilo, B., Goldfarb, M.P. Dannenberg, A. und Weinberg, R.A.
"Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76", 5714-5718 (1979), Cooper,
G.M., Okenquist, S. und Silverman, L. "Nature 284", 418-421
(1980), Shih, C. Padhy, L.C., Murray, M.J. und Weinberg, R.A.
"Nature 290", 261-264 (1981), Krontiris, T.G. und Cooper, G.M.
"Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78", 1181-1184 (1981) und Peruche,
M. et al "Cell 27" 467-476 (1981). Diese Ergebnisse zeigten,
daß in der EJ-Tumor-Zellinie-DNA onkogene Faktoren vorhanden
waren, die anscheinend in der DNA normaler Zellen fehlten.
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Studien, die die Sensitivität oder Resistenz onkogener DNA
der EJ-Blasenkarzinomlinie gegenüber einer Behandlung
verschiedener ortsspezifischer Endonucleasen untersuchten, zeigten
an, daß bestimmte spezifische Spender-DNA-Sequenzen an einer
derartigen Zellumwandlung beteiligt waren. Man vergleiche Lane,
M.A., Sainten, A. und Cooper, G.M. "Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 78", 5185-5189 (1981) und Shilo, B. und Weinberg, R.A.
"Nature 289", 607-609 (1981). Dieses Konzept eines diskreten,
definierbaren Onkogens wurde später direkt durch molekulare
Isolierung diskreter Umwandlungsgene aus der
EJ-Humanblasenkarzinomzellinie durch ein Verfahren nachgewiesen, das von
Murray et al in "Cell 25", 355-361 (1981) beschrieben wird.
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Auf diese Weise wurde von der EJ-Zellinie isolierte DNA
serienmäßig durch Transfektion auf NIH3T3-Mausfibroblastzellen
übertragen, bis eine Mausfibroblastzelle ausgewählt wurde, die
im wesentlichen nur das Humanblasenkrebsonkogen und einen
Markierungsstoff
enthielt. Der bei dieser Arbeit verwendete
Markierungsstoff war eine Alu-DNA-Sequenz, die etwa 300.000 mal
in menschlicher DNA wiederholt wird, jedoch nicht in
Mausfibroblast-DNA vorhanden ist. Die Artentransfektion führte somit
zu der abschließenden Auswahl einer Zelle, die das
interessierende Onkogen und seinen zugehörigen Markierungsstoff enthielt.
Die gesamte DNA von dieser transfektierten Zelle wurde zur
Bildung einer genomischen DNA-Bank in einem Lambdaphage
verwendet, und der geeignete chimärische Lambdaphage wurde dann
unter Verwendung einer für den menschlichen
Alu-Markierungsstoff spezifischen Probe ausgewählt.
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Diese Arbeit resultierte in der Lokalisierung der onkogenen
Aktivität für die EJ-Blasenkarzinom-DNA auf ein 6,6 kb langes
DNA-Segment, das durch die Endonuclease BamHI erzeugt wurde.
Das 6,6kb-Segment wurde im Plasmidvektor pBR322 kloniert und
dann als eine Sequenzprobe in einer Southern-Blot-Analyse
verwendet. Diese zeigte an, daß das Onkogen von einer Sequenz
gleichartiger Struktur stammte, die in dem normalen
menschlichen Genom vorhanden ist. Man vergleiche Goldfarb, M.,
Shimizu, Perucho, M. und Wigler, M. "Nature 296", 404-409 (1982)
und Shih, C. und Weinberg, R. "Cell 29", 161-169 (1982). Somit
ergab sich, daß das menschliche Blasenonkogen durch Mutation
eines normalen Zellgens während des Prozesses der Karzinogenese
entstanden war.
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Der Vergleich des EJ-Blasenonkogens mit seiner entsprechenden
normalen Zellsequenz (dem "Proto-Onkogen") wurde durch die
nachfolgende Feststellung unterstützt, daß dieses Onkogen
homolog mit dem Umwandlungsgen des rattenabgeleiteten Harvey-
Maussarkomvirus war. Man vergleiche Der, C., Krontiris, T.G.
und Cooper, G.M. "Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79" 3637-3640
(1982), Parada, L.F., Tabin, C.J., Shih, C. und Weinberg, R.A.
"Nature 297", 474-479 (1982) und Santos, E. et al "Nature 298",
343-347 (1982). Dieses Rattensarkomvirusgen, v-Ha-RAS genannt,
war aus dem Rattengenom während des Prozesses der Bildung des
chimären Virusgenoms gewonnen worden. Man vergleiche Scolnick,
E.M. und Parks, W.P. "J. Virol. 13", 1211-1219 (1974) und Shih,
T.Y., Williams, D.R., Weeks, M.O., Maryak, J.M., Vass, W.C.
und Scolnick, E.M. "J. Virol. 27", 45-55 (1978). Sowohl das
Ratten- als auch das menschliche Zellhomologe des v-Ha-RAS
sind im Verlauf der Untersuchungen dieses Gens isoliert worden.
Man vergleiche DeFeo, D., Gonda, M.A., Young, H.A., Change,
E.H., Lowy, D.R., Scolnick, E.M. und Ellis, R.W. "Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 78", 3328-3332 (1981) und Chang, E.H., Gonda,
M.A., Ellis, R.W., Scolnick, E.M. und Lowy, D.R. "Proc. Natl.
Acad. Sci 79", 4848-4852 (1982). Es wurde gefunden, daß das
menschliche Zellhomologe des v-Ha-RAS genau dem normalen
Vorgänger des EJ-Blasenonkogens entspricht. Man vergleiche
Parada, L.F., Tabin, C.J., Shih, C. und Weinberg, R.A. "Nature
297", 474-479 (1982).
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Vorläufige Vergleiche zwischen dem EJ-Onkogen und dessen
normalem Zellgegenstück, c-Ha-RAS genannt, wurden angestellt.
Man vergleiche Ellis, R.W., DeFeo, D., Maryak, J.M., Young,
H.A., Shih, T.Y., Chang, E.H., Lowy, D.R. und Scolnick, E.M.
"J. Virol. 26", 408-420 (1980). In dieser Arbeit wurde gezeigt,
daß ein molekularer Klon des normalen Zellgens keine Herde
bei Anwendung auf NIH3T3-Monoschichten hervorrief, während
ein Klon des Blasenonkogens eine biologische Aktivität von
ca. 5 · 10&sup4; Herde bildenden Einheiten pro Mikrogramm
transfektierter DNA zeigte. Man vergleiche Shih, C., und Weinberg,
R.A. "Cell 29", 161-169 (1982) und Chang, E.H., Gonda, M.A.,
Ellis, R.W., Scolnick, E.M. und Lowy, D.R. "Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 79", 4848-52 (1982).
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Dieser starke Unterschied in der Funktion stand in keiner
Beziehung mit irgendwelchen offensichtlichen strukturellen
Unterschieden zwischen den beiden Klonen. Eine rauhe
Restriktionsendonucleasenortskartierung des EJ-Onkogenklons und des
nicht klonierten verwandten menschlichen Proto-Onkogens zeigte
an, daß sie beide im Grunde nicht unterscheidbar über die 6,6-
kb-Sequenz waren, die die Umwandlungsaktivität des EJ-Onkogens
enthielt. Man vergleiche Shih, C. und Weinberg, R.A. "Cell
29", 161-169 (1982). Eine feinere Kartierung wurde später durch
den direkten Vergleich molekularer Klone der beiden Gene
möglich gemacht, jedoch wiederum wurden keine Unterschiede bei
Benutzung einer Reihe verschiedener Endonukleasen gefunden,
ausgenommen ein einziger Unterschied 3' (stromabwärts) der
Codierungsregion des Gens. Dieser Unterschied wurde als die
Darstellung eines funktionell stillen Polymorphismus des im
Genpool vorhandenen Gens des früher von anderen dokumentierten
Typs interpretiert. Man vergleiche Goldfarb, M., Shimizu,
Perucho, M. und Wigler, M. "Nature 296", 404-409 (1982).
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Somit war ein drastischer funktioneller Unterschied für zwei
strukturell gleiche Gene, das menschliche Blasenkrebsonkogen
und dessen normales Proto-Onkogen, gezeigt worden. Es waren
keine Unterschiede in der Struktur der beiden Gene bekannt,
jedoch hatte man die Theorie, daß Unterschiede vorhanden sein
könnten, die funktionelle Unterschiede auf einem von zwei Wegen
hervorrufen. Die Veränderungen könnten eine Änderung in den
die Genexpression regulierenden Sequenzen mit sich bringen,
oder alternativ könnte der umgewandelte Phenotyp Änderungen
im Protein codierenden Bereich des Gens zuzuschreiben sein.
Die erste Hypothese würde voraussichtlich eine Aufregulierung
der Transkription oder Translation des Gens hervorrufen und
hohe Niveaus eines ansonsten normalen Proteinprodukts
erbringen, während die zweite Hypothese auf eine Synthese eines
geänderten Proteins schließen lassen würde. Beide
Veränderungsarten könnten auch gemeinsam zur Erzeugung des beobachteten
Funktionsunterschieds wirken.
Beschreibung der Erfindung
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Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur
Bestimmung von durch die Mutation eines RAS-Proto-Onkogens
in ein RAS-Onkogen verursachter Karzinogenese bei einem
menschlichen Lebewesen, wobei sich das RAS-Onkogen vom RAS-Proto-
Onkogen beim Gly¹²-Kodon unterscheidet, darin bestehend, daß
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a) eine Zellprobe von dem menschlichen Lebewesen mit einem
Antikörper in Berührung gebracht wird, der in der Lage ist,
das durch das Onkogen kodierte Protein, nicht aber das durch
das Proto-Onkogen kodierte Protein zu binden, und
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b) festgestellt wird, ob eine Antikörperbindung aufgetreten
ist, wobei eine Antikörperbindung indikativ ist für eine
Karzinogenese.
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Die Erfindung folgte einer Untersuchung der Unterschiede
zwischen dem EJ-Onkogen, von dem schon früher nachgewiesen
wurde, daß es menschlichen Blasenkrebs verursacht, und dessen
Proto-Onkogen. Die bei der Untersuchung verwendeten
Verfahren können zur Definition von Unterschieden zwischen jedem
mutierten Allel und dessen entsprechendem Wildtyp-Allel
verwendet werden; die Verfahren sind besonders nützlich zur
Definition von Unterschieden zwischen Onkogenen und
Proto-Onkogenen.
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Zu Beginn wurden Versuche durchgeführt, um festzustellen, ob
der interessante Funktionsunterschied zwischen dem EJ-Onkogen
und dessen Proto-Onkogen einem Regulationsmechanismus oder
einem der Sequenzunterschiede zuzuschreiben wäre. Diese
Versuche liefern Daten, die anzeigen, daß eine Aufregulierung
dieses Gens nicht für eine Zellumwandlung verantwortlich war.
Somit wurde geschlossen, daß die erheblichen
Funktionsunterschiede auf Veränderungen in der DNA-Sequenz dieser Gene
zurückzuführen sein müssen.
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Der Bereich des pEJ von 6,6 kb, der für die Zellumwandlung
zu NIH3T3-Fibroblasten verantwortlich ist, wurde auf ein
Segment von 350 kb durch eine Reihe von in-vitro-Rekombinationen
verengt. Dieses Segment von 350 kb wurde dann für das Onkogen
und das Proto-Onkogen sequenziert, und es wurde gefunden, daß
Einzelbasensubstitutionen für den Unterschied am 60.
Nukleotiden vom XmaI-Restriktionsort verantwortlich waren. Diese
Substitution im Kodon für Glycin (Gly¹²), das normalerweise
als GGC auftritt, wurde in die Sequenz GTC geändert, welches
Kodon Valin ausprägt. Somit wurde der spezifische Unterschied
in der Zell-DNA vom EJ und dessen Proto-Onkogen lokalisiert,
und der Unterschied in der Aminosäuresequenz des entsprechenden
p21-Proteins wurde ebenfalls bestimmt.
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Da die durch diese Gene codierten p21-Proteine unterschiedlich
sind, können auch serologische Reagentien, wie polyklonale
oder monoklonale Antikörper, entwickelt werden, welche für
die veränderten oder die normalen Sequenzdomänen in
p21-Proteinen spezifisch sind oder für eine Aminosäuresequenz, die
nicht an der Veränderung beteiligt ist, welche während der
Karzinogenese auftritt. Solche serologischen Reagentien können
dann gemäß der Erfindung in vielfältigen Verfahren eingesetzt
werden, um einen sehr sensitiven Test für die
Humanblasenkarzinogenese zu liefern. Diese Verfahren sollten eingesetzt
werden, um Veränderungen in anderen Wildtyp-Allelen zu finden,
die mutierte Gene verursachen.
Kurze Beschreibung der Figuren
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Fig. 1A zeigt elektrophoretische Gelmuster von
Gesamtzell-RNA, erhalten sowohl von normalen als auch von
umgewandelten Blasenzellen, welche Muster durch Autoradiographie
sichtbar gemacht wurden,
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Fig. 1B zeigt elektrophoretische Gelmuster, erhalten
durch Fällung von metabolisch markierten Proteinlysaten sowie
von EJ als normalen Blasenzellen unter Verwendung monoklonaler
Antisera gegen das v-Ha-RAS-p21-Protein,
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Fig. 2A veranschaulicht elektrophoretische Gelmuster
von polyadenylierter Gesamt-RNA aus den gleichen vier
transfektierten Zellinien,
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Fig. 2C zeigt elektrophoretische Gelmuster von p21-
Protein, immunausgefällt von Zellysaten der gleichen vier
transfektierten Zellinien,
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Fig. 3A-3D sind Fotografien, die durch ein
Phasen-Kontrast-Mikroskop bei 500facher Vergrößerung von vier mit pEJ
oder pEC transfektierten Zellinien aufgenommen worden sind,
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Fig. 4 zeigt elektrophoretische Gelmuster von
immunausgefälltem p21-Protein von mit pEJ oder pEC transfektierten
Zellen,
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Fig. 5 ist eine schematische Darstellung von in-vitro-
Genrekombinanten, hergestellt aus dem EJ-Umwandlungsgen und
dessen normalem Zellhomologem, und enthält ferner eine
Zusammenstellung von Transfektions- und Umwandlungsdaten für mit
derartigen Genrekombinanten durchgeführte Versuche,
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Fig. 6 zeigt elektrophoretische Gelmuster für eine
Wanderung von p21-Proteinen, die aus Zellen immunausgefällt
wurden, welche mit in-vitro-Rekombinanten des EJ-Onkogenklons
(pEJ) und dessen homologern Proto-Onkogenklon (pEC)
transfektiert waren,
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Fig. 7 veranschaulicht einen Vergleich der DNA-Sequenz
des molekularen Klons des EJ-Umwandlungsgens und dessen Nicht-
Umwandlungszellhomologen und gibt ferner die für jeden
ausgeprägten Aminosäurensequenzen an,
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Fig. 8 zeigt elektrophoretische Gelmuster, die
Unterschiede in Fragmenten der Klone der durch das
NaeI-Restriktionsenzym erzeugten EJ-EC-Gene veranschaulichen, und
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Fig. 9 und 10 sind Blockdiagramme, die
Bestimmungsprotokolle, die Endonukleasen oder Antisera gegen durch
normale Gene oder Umwandlungsgene codiertes Protein verwenden,
veranschaulichen.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
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Wie oben festgestellt, führte die in "Cell 25", 355-361 (1981)
beschriebene Arbeit zur Isolierung eines Onkogens aus der EJ-
Blasenzellkarzinomzellinie. Das Onkogen enthielt 6,6 kb und
es wurde gezeigt, daß es eine Umwandlungsaktivität mit NIH3T3-
Mausfibroblasten hat. Da die hier beschriebene Arbeit auf
dieser früheren Arbeit aufbaut, wird auf die Erkenntnisse dieser
früheren Arbeit insbesondere Bezug genommen.
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So, wie er hier verwendet wird, wird der Ausdruck "Onkogen"
in der Bedeutung einer genetischen Sequenz verwendet, deren
Ausprägung in einer Zelle diese Zelle dazu veranlaßt, von einer
normalen Zelle in eine Tumorzelle umgewandelt zu werden. In
gleicher Weise wird der Ausdruck "Proto-Onkogen" hier in der
Bedeutung einer genetischen Sequenz verwendet, die in dem
normalen Genom einer normalen, Nicht-Tumorzelle enthalten ist,
die, bei Veränderung in entsprechender Weise, das Potential
hat, ein Onkogen zu werden.
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Die Sequenzierung des gesamten Onkogenklons (pEJ), der in der
in "Cell 25", 355-361 (1981) beschriebenen Arbeit isoliert
wurde, und dessen normalen menschlichen homologen Klons (pEC)
wurde nicht in einem einfachen Vergleich der Sequenzen dieser
beiden Gene verwendet. Da das Onkogen und seine normale Proto-
Onkogen-Gegenstücksequenz aus den DNAs gesonderter Individuen
abgeleitet wurden, könnten die meisten Sequenzunterschiede
zwischen ihnen natürlich vorkommende, schweigende
Polymorphismen an diesem Genort widerspiegeln. Andere Sequenzunterschiede
könnten die Folge während der Karzinogenese erlittener
Mutationsangriffe sein, die funktionell still und somit ohne
Bedeutung für den Aktivierungsprozeß sind.
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Zur Feststellung, ob der signifikante Unterschied zwischen
dem Onkogen und dem Proto-Onkogen ein Regulationsunterschied
war, wurde ein Vergleich der Ausprägung des c-Ha-RAS-Proto-
Onkogens (EC) von einer normalen menschlichen
Blasenepithelzellinie mit der Ausprägung des Onkogens in der
EJ-umgewandelten Blasenzelle angestellt. Die verwendeten Blasenepithelzellen,
Hb1-5, waren ein primäres Gewebekulturexplantat von einer fünf
Monate alten Blase, gezüchtet auf inaktivierten
NIH3T3-Zubringerschichten. Diese Kultur wurde von frischem menschlichem
Blasengewebe vermehrt, und es wurde gezeigt, daß sie mehrere
der erwarteten Eigenschaften des Blasenübergangsepithels
offenbarte. Sie war frei von unterliegendem Stroma-Material und
stellte folglich ein genaues Gegenstück der Zellen dar, von
denen das Blasenkarzinom herstammte.
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Gesamtzell-RNA wurde sowohl von normalen als auch von
umgewandelten Blasenzellen hergestellt. Transkripte wurden
analysiert, indem man die RNA auf ein Formaldehydgel gab, sie zu
einem Nitrozellulosefilter überführte und den Filter mit einem
Nick-Transplantations-EJ-Onkogenklon untersuchte.
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Die spezifischen dabei verwendeten Verfahrensschritte waren
wie folgt. Gesamtpolyadenylierungs-RNA wurde nach der Technik
von Varmus et al hergestellt. Man vergleiche Varmus, H.E.,
Quintrell, N. und Ortiz, S. "Cell 25", 23-26 (1981). Vier
Mikrogramm RNA wurden dann fraktioniert durch Elektrophorese
durch formaldehydhaltige zweiprozentige Agarosegels und auf
Nitrozellulose übertragen. Eine RAS-spezifische Probe wurde
hergestellt durch Schneiden von pEJ mit BamHI, Fraktionieren
der resultierenden Abschnitte durch ein einprozentiges
Agarosegel und Extrahieren des Inserts von 6,6 kb mit NaI und
Glasperlen. Das Nick-Translationsfragment (6,6 · 10&sup7; cpm
Mikrogramm ) wurde zu immobilisierter RNA aufgeschmolzen. Man
vergleiche Rigby, R.W. et al "J. Mol. Biol. 13", 237-251 (1977),
und Wahl, G.M., Stern, M. und Stark, G.R. "Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 76", 3638-3687 (1979). Zu der Probe homologe Streifen
wurden durch Autoradiographie sichtbar gemacht. Die
Molekulargewichte
wurden durch Vergleich mit Markierungsstoffen bestimmt,
die man in einer in-vitro-Ablauf-Transkription des
Adenovirusspätpromoters erhielt. Man vergleiche Manley, J.L. et al "Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 77", 3855-3859 (1980). Die Fig. 1A zeigt
die relativen Niveaus der c-Ha-RAS-spezifischen RNA in den
beiden Zelltypen: Bahn 1, RNA aus EJ-Zellen; Bahn 2, RNA aus
Hb1-5-Zellen. Wie ersichtlich ist, wurden gleiche Niveaus von
RNA in den beiden Kulturen festgestellt und die Transkripte
hatten eine Größe von 1,2 kb.
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Die einzigen bekannten Erzeugnisse von RAS-Genen sind Proteine
von etwa 21.000 Dalton Masse, als p21 bezeichnet. Es wurden
Versuche durchgeführt, um die Mobilitätsraten von
p21-Proteinlysaten sowohl von EJ- als auch normalen Blasenzellen zu
analysieren. Es wurden monoklonale Antisera gegen das v-Ha-RAS-
p21-Protein verwendet. Man vergleiche Furth, M.E., Davis, L.J.,
Fleurdelys, B. und Scolnick, E.M. "J. Virol. 43", 294-304 (1982).
Kontrollversuche gewährleisteten, daß die verwendeten
Antikörpermengen im Überschuß zu denjenigen waren, die für eine
Immunpräzipitation des vorhandenen Antigens erforderlich waren.
Die Ergebnisse sind in Fig. 1B gezeigt.
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Speziell wurden Kulturen mit ³&sup5;S-Methionin 12 Stunden markiert.
Lysate wurden dann hergestellt und immungefällt mit
Nicht-Immunsera (Bahnen 1a und 2a), einem monoklonalen Antiserum (Y13-
238), welches das durch Ha-MuSV codierte p21, jedoch nicht
das durch Ki-MuSV codierte p21 ausfällt (Bahnen 1b und 2b)
oder einem monoklonalen Antiserum (Y13-259), welches sowohl
die Ha-MuSV- als auch die Ki-MuSV-p21er feststellt (Bahn 1c
und 2c). Man vergleiche Shih, T.Y., Weeks, M.O., Young, H.A.
und Scolnick, E.M. "Virology 96", 64-79 (1979). 20 · 10&sup6; cpm
Lysat pro Probe wurde durch Elektrophorese durch ein
12,5-prozentiges SDS-Polyacrylamidgel aufgetrennt.
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Die Fig. 1B zeigt einen Vergleich von p21-Proteinen, die von
Zellysaten der EJ-Zellklone (Bahnen 1, a-c) und Hb1-5-Zellen
(Bahnen 2, a-c) immungefällt wurden. Diese Daten zeigen an,
daß zumindest zwei Bahnen radiomarkierten Proteins speziell
durch das Anti-p21-Serum aus normalen Blasenzellen ausgefällt
wurden. Eine detaillierte Untersuchung des gesehenen
Proteinmusters des Blasenkarzinoms offenbarte eine komplexe Anordnung
von Banden: Zwei Paare eng beabstandeter Dubletten. Nach einem
Vergleich der Intensität der p21-Banden mit den Intensitäten
der nicht-spezifisch ausgefällten Hintergrundbanden wurde
deutlich, daß die p21-Proteine der normalen und der Tumorzellen
in vergleichbaren Mengen vorhanden waren.
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Die obigen Daten zeigen an, daß die erhöhten
Transkriptionsniveaus für die vom EJ-Onkogen gezeigte neue Aktivität nicht
verantwortlich waren. Dieser Schluß beruht zum Teil auf der
Tatsache, daß unter den verwendeten Hybridisierungsbedingungen
die Onkogenprobe ausschließlich mit Transkripten des
menschlichen c-Ha-RAS-Gens reagierte. Die Interpretation der
Proteindaten war weniger eindeutig, es war jedoch offensichtlich,
daß beide Zellen vergleichbare Proteinniveaus hatten, die mit
Harvey-spezifischem Serum reaktiv waren und daß diese Proteine
zusammengefaßt als "p21" bezeichnet werden konnten.
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Es blieb möglich, daß die Blasenepithelzellen nicht
repräsentativ für normale Präkursoren der Blasenkarzinomzellen waren.
Eine solche Möglichkeit könnte die Interpretation trüben, da
ein RAS-Gen bei einem hohen Niveau in einem Zelltyp ausgeprägt
werden könnte, ohne eine Umwandlung einzuleiten, und dieser
Phenotyp nur bei unangemessener Ausprägung in einem zweiten
Zelltyp erreicht werden könnte. Daher wurden die Transkriptions-
und Translationsniveaus der beiden Gene in demselben
Zellhintergrund gemessen.
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Molekulare Klone beider Gene wurden in NIH3T3-Zellen eingeführt.
Kolonien, die das EJ-Onkogen erwarben, konnten einfach durch
deren umgewandelte Morphologie identifiziert werden. Jedoch
waren Zellen, die Normalallelklone erwarben, nicht durch
irgendeine offensichtliche Verhaltensänderung identifizierbar.
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Aus diesem Grunde wurde ein Klon des dominierenden
selektierbaren Ecogpt-Gens in NIH3T3-Zellen zusammen mit einem
zehnfachen Überschuß entweder des klonierten EJ-Onkogens oder des
klonierten Proto-Onkogens (pEC) überführt. Speziell wurden
Transfektionen ausgeführt unter Verwendung von 75 Mikrogramm
NIH3T3-Träger-DNA, 500 ng pEJ- oder pEC-DNA und 50 ng pSVZgpt-
DNA pro 2 · 10&sup6; Zellen durch bekannte Techniken. Man vergleiche
Graham, F.L. und von der Eb, A.J. "Virology 52", 456-471 (1973),
und Andersson, P., Goldfarb, M.P. und Weinberg, R.A. "Cell
16", 63-65 (1979). In jedem Fall wurden Kolonien in bezug auf
die Resistenz gegenüber Mycophenolsäure, erhalten durch das
erworbene Ecogpt-Gen, ausgewählt. Man vergleiche Mulligan,
R. und Berg, P. "Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78", 2072-2076
(1981).
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Diese Strategie wurde angewandt, da die Einführung eines
nichtausgewählten Segments durch Kotransfektion mit einem
selektierbaren Gel sichergestellt werden konnte. Man vergleiche Wigler,
M. et al "Cell 16", 777-785 (1979). In diesem Fall waren
ersichtlich 75 Prozent der aus der Kotransfektion von Ecogpt
und pEJ stammenden mycophenolsäureresistenten Kolonien
morphologisch umgewandelt; wie erwartet, war keine der nach der
Kotransfektion mit pEC aufkommenden Kolonien umgewandelt.
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Zell-DNA beider Kolonieklassen wurde auf das Vorhandensein
von pEC- oder pEJ-Sequenzen analysiert. Zehn Mikrogramm jeder
DNA wurde mit Endonuklease BamHI digestiert, was nach den
Erwartungen ein Fragment von 6,6 kb von jeder intakten Kopie
des klonierten Onkogens oder Proto-Onkogens freisetzen würde.
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Die digestierte DNA wurde durch ein einprozentiges Agarosegel
fraktioniert und auf Nitrozellulosepapier übertragen. 5 · 10&sup6;
cpm einer RAS-spezifischen Probe, wie oben beschrieben, wurde
mit filtergebundener DNA inkubiert. Die Ergebnisse sind in
Fig. 2A gezeigt, mit den Bahnen: Bahn 1 NIH3T3-DNA; Bahnen
2 und 3, DNA aus Zellinien, transfektiert mit pEJ: EJ/Gpt-2
(2) und EJ/Gpt-3 (3); Bahnen 4 und 5, DNA aus Zellinien,
transfektiert mit pEC: EC/Gpt-1 (4) und EC/Gpt-5 (5).
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Das normale Maushomologe des RAS-Gens hybridisiert nur schwach
zu der pEJ-Probe. Man vergleiche Parada, L.F., Tabin, C.J.,
Shih, C. und Weinberg, R.A. "Nature 297", 474-479 (1982).
Folglich wurden durch sein Vorhandensein die Ergebnisse nicht
herabgesetzt. Um zu gewährleisten, daß die transfektierten pBR322-
Sequenzen nicht störend in die Interpretation der Daten
eingreifen, wurden die RAS-spezifischen Sequenzen von pEJ
hergestellt und als Probe verwendet. 75% der mit dem Proto-Onkogen
transfektierten nicht-umgewandelten Kolonien und sämtliche
der umgewandelten onkogen-transfektierten Kolonien zeigten
das Vorhandensein von pEJ-Homologen, bei 6,6 kb migrierenden
Sequenzen.
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Die positiven Kolonien hatten ferner zu der Probe
aufschmelzende BamHI-Fragmente anderer Größen. Diese stellen Kopien
der Klone dar, die während des Transfektionsprozesses
aufgespalten wurden.
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Zwei Zellinien, die intakte Kopien des Onkogens enthalten,
und zwei Linien, die eine annähernd gleiche Zahl intakter Kopien
des Proto-Onkogens enthalten, wurden für die weitere Analyse
ausgewählt. Fotografien dieser Zellinien, die mit einem
Phasenkontrastmikroskop bei 500facher Vergrößerung aufgenommen wurden,
sind in Fig. 3 gezeigt. Mit pEJ transfektierte Zellinien sind
bei der Konfluenz (EJ/Gpt-2, Foto 3A) und Subkonfluenz (EJ/Gpt-3,
Foto 3B) gezeigt. Mit pEC transfektierte Zellinien sind
ebenfalls in der Konfluenz (EC/Gpt-5, Foto 3C) und Subkonfluenz
(EC/Gpt-1, Foto 3D) gezeigt.
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Gesamtzell-RNA wurde von allen vier transfektierten Zellinien
hergestellt. Die RNA-Präparate wurden dann auf ein
Formaldehydgel gegeben, auf Nitrozellulose übertragen und mit
RAS-spezifischer DNA untersucht. Die oben beschriebenen Verfahrensschritte
wurden angewandt, und die Ergebnisse sind in Fig. 2B gezeigt,
mit den Bahnen: Bahn 1, RNA von NIH3T3-Zellen, Bahn 2, EJ/Gpt-2-
Zellen; Bahn 3, EJ/Gpt-3-Zellen; Bahn 4, EC/Gpt-1-Zellen; Bahn
5, EC/Gpt-5-Zellen.
-
Die Niveaus von p21 in diesen Zellen wurden ebenfalls
untersucht. Zellysate wurden hergestellt, immungefällt und analysiert,
wie oben beschrieben. Die Ergebnisse sind in Fig. 2C
wiedergegeben als: Immunausfällungen mit nicht-immunem Serum (Bahnen
1, 2, 7, 8) oder dem monoklonalen Antiserum (Y13-238), welches
das Ha-MuSV-p21 (Bahnen 3-6) fällt. Zellysate wurden von EJ/Gpt-2
(Bahnen 1, 3) hergestellt; EC/Gpt-1 (Bahnen 2, 4); EJ/Gpt-3
(Bahnen 5, 7) und EC/Gpt-5 (Bahnen 6, 8). Wie ersichtlich ist,
fällte das monoklonale Serum gegen p21 gleiche Mengen von p21-
Protein in pEC- und pEJ-transfektierten Zellen aus.
-
Diese Daten sprechen nicht vollständig die Frage an, ob die
beiden klonierten Gene mit denselben Raten in den Zellen
transkribiert sind, da es formell möglich blieb, daß einige wenige
der erworbenen Kopien des pEJ in diesen besonderen
pEJ-transfektierten Zellen aktiv waren, während sämtliche Kopien des
transfektierten pEC-Gens in den anderen Zellen aktiv sein
könnten. In einem derartigen Fall würden die festgestellten
vergleichbaren Niveaus von Protein oder RNA nicht genau die
intrinsischen transkriptionalen Aktivitäten der beiden Gene
reflektieren.
-
Jedoch trat ein Punkt deutlich hervor: Ein Niveau von
EJ-spezifiziertem p21 führte zu einer Umwandlung, während ein
vergleichbares Niveau des proto-onkogen-spezifizierten p21 keine
Auswirkung auf den Phenotyp hatte. Da die p21-Proteine die einzigen
augenscheinlichen Genprodukte sind, die durch diese Gene codiert
werden, wurde geschlossen, daß der Funktionsunterschied zwischen
dem EJ-Onkogen und dem Proto-Onkogen von strukturellen
Veränderungen im p21-Protein abgeleitet werden muß. Umgekehrt
erschienen regulative Änderungen bei der Umwandlungsaktivität
des Onkogens nicht kritisch.
-
Aus diesem Grunde wurde den früher festgestellten leichten
Variationen in den Migrationsraten des p21-Proteins von
verschiedenen Zellen (Fig. 1b und 2c) erneute Bedeutung beigemessen.
Daher wurde das p21-Protein unter Bedingungen neu analysiert,
bei denen Migrationsunterschiede leichter aufgelöst werden
konnten. Diese Ergebnisse sind in Fig. 4 dargestellt.
Insbesondere wurden Zellen mit ³&sup5;S-Methionin drei Stunden
metabolisch markiert; Zellysate wurden hergestellt, immungefällt
und analysiert, wie oben beschrieben. Lysate von der Zellinie
EJ/Gpt-3 (Bahnen 1, 3) und von der Zellinie EC/Gpt-1 (Bahnen
2, 4) wurden mit dem monoklonalen Anti-p21-Antiserum Y13-238
(Bahnen 1, 2) oder mit Nicht-Immunserum (Bahnen 3, 4)
ausgefällt. Schemadiagramme (Bahn 5: EJ/Gpt-3; Bahn 6: EC/Gpt-1)
zeigen sowohl die relativen Positionen der festgestellten p21-
Banden als auch die Beziehungen dieser Banden (Pfeile) auf
der Grundlage kinetischer Daten und früher veröffentlicher
Versuche. Man vergleiche Shih, T.Y. et al "J. Virol. 42", 253-
361 (1982).
-
Die Daten der Fig. 4 zeigen an, daß die pEJ- und
pEC-Transfektanten jeweils zwei Banden p21 darboten. Das p21-Protein
höheren Molekulargewichts der pEJ-Transfektanten migrierte
langsamer als das Protein höheren Molekulargewichts der pEC-
Transfektanten, und das p21 niederen Molekulargewichts der
pEJ-Transfektanten migrierte ebenfalls langsamer als das p21
niederen Molekulargewichts der pEC-Transfektanten. In jedem
Fall verhielt sich die langsamer migrierende Bande als eine
kinetische Vorstufe zu der schneller migrierenden Bande.
Vergleichbare Daten zum p21-Protein des v-Ha-RAS wiesen darauf
hin, daß die höhere Bande eine post-translationale Spaltung
erfuhr, um ihren niederen, schneller mirgrierenden Partner
hervorzubringen. Man vergleiche Shih, T.Y. et al "J. Virol.
42", 253-261 (1982).
-
Da keines dieser p21-Proteine in irgendeinem Ausmaß
phosphoryliert schien, wurden die Unterschiede in den Migrationsraten
zwischen dem pEC- und dem pEJ-Protein rasch Änderungen in der
Anzahl der Aminosäuren oder Änderungen in der Konformation
zugeschrieben.
-
Die Daten und die Schemadarstellung der Fig. 4 können eine
Erklärung für die Komplexität der p21-Proteine liefern, die
in normalen und transformierten Blasenzellen (Fig. 1b)
ersichtlich sind: die normalen Zellen zeigten zwei Banden,
reflektiv für die Ausprägung eines Proto-Onkogens; die
Karzinomzellen zeigten vier Banden, von denen zwei von dem Onkogen
dieser Zellen und zwei von dem normalen Proto-Onkogen des
anderen homologen Chromosoms spezifiziert wurden.
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Die physikalischen Unterschiede, die zwischen p21-Protein von
Onkogenen und Proto-Onkogenen beobachtet wurden, hätten
funktionell bedeutende Veränderungen im p21-Protein reflektieren
oder alternativ Unterschiede darstellen können, die den
Transformationsprozeß nicht beeinflußten. Um dies festzustellen,
wurde eine Reihe unabhängiger Versuche aufgebaut, um die
Regionen des Onkogens genetisch zu lokalisieren, die die
geänderten Migrationsraten des Proteins und die Veränderung in
der Genfunktion spezifizierten. Diese Versuche basierten auf
homologer Rekombination in vitro zwischen Klonen der beiden
Gene.
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Die Versuchsstrategie bestand darin, ein Restriktionsfragment
aus dem Onkogenklon (pEJ) herauszuschneiden und als Ersatz
für das homologe Stück des Proto-Onkogenklons (pEC) zu benutzen.
Zur gleichen Zeit wurde die reziproke Konstruktion durch
Spleissen des Fragments des Proto-Onkogenklons in den Onkogenklon
ausgeführt. Diese rekombinanten Konstruktionen wurden dann
auf Umwandlungsfähigkeit in der Transfektionsuntersuchung
getestet. Bei der Untersuchung wurde die Fähigkeit eines
Fragments des Onkogens gemessen, Umwandlungsaktivität zu
vermitteln, wenn es inmitten des Proto-Onkogens plaziert wurde, und
umgekehrt wurde in der reziproken Rekombination der Verlust
der Aktivität bestimmt, wenn das entsprechende
Proto-Onkogenfragment in den Onkogenklon eingesetzt wurde. Die Fig. 5 stellt
ein Diagramm der spezifischen Konstruktionen und eine
Zusammenfassung der erhaltenen Transfektions- und
Transformationsdaten dar.
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Die Restriktionskarte zeigt die Spaltungsorte für verschiedene
Enzyme in dem 6,6-kb-BamHI-Insert in pBR322. Sämtliche für
die Enzyme spezifischen Orte sind gezeigt, außer für XmaI,
welches in verschiedenen anderen Plätzen wirkt, die nicht gut
charakterisiert worden sind. Der gezeigte Ort ist der einzige
XmaI-Ort zwischen dem ersten BsteEII-Ort und dem KpnI-Ort.
Die dunklen Kästen auf der Karte zeigen die Lage der
Codierungsexons.
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In Fig. 5 sind pEJ/pEC-Chimären mit dem von pEJ abgeleiteten
Segmenten gezeigt, die als geschlossene Schiene gezeigt sind,
und die Segmente von pEC, die als offene Schiene gezeigt sind.
pEJ und pEC wurden mit den angegebenen Enzymen entweder zur
Vervollständigung oder zu einer teilweisen Digestion
aufgespalten, wie es erforderlich ist, um jedes angegebene
Fragment zu erhalten. Die Erzeugnisse wurden durch Elektrophorese
durch 1,2% Agarose separiert und durch Schmelzen eines NaI
eluiert sowie von Glasperlen absorbiert. Das pBR322
enthaltende Fragment wurde dann mit kälberintestinaler Phophatase
behandelt. Die angegebenen Fragmente wurden entweder mit der
Enzym-T4-DNA-Ligase oder in einer Scheinligation ohne Enzym
vereinigt. Die Konstruktionen a-e wurden in bimolekularen
Ligationen hergestellt. Die Konstruktionen in f wurden durch
gleichzeitiges Mischen der drei Fragmente und in g und h durch
gleichzeitiges Mischen der vier Fragmente hergestellt. Die
Ligationsgemische wurden direkt in den Stamm HB101 von E. coli
umgewandelt. Nur wenn Kolonien von Scheinligationen weniger
als 2% der Ligationen waren, wurden die Kolonien auf das
Vorhandensein von Klonen mit angemessenen Restriktionskarten
analysiert. 20 ng jedes Klons wurden zu NIH3T3-Zellen transfektiert,
wie oben beschrieben, und dann ohne Selektion gehalten, bis
in 10 bis 14 Tagen Herde sichtbar wurden. Ergebnisse der
Transfektionen sind in der ersten Spalte gezeigt. Die zweite Spalte
zeigt die Anzahl unabhängiger Bakterienkolonien, die
ausgelesen und dann zu NIH3T3-Zellen transfektiert wurden.
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Es war wichtig zu verifizieren, daß die Umwandlungsklone
tatsächlich Chimären des vermischten pEJ- und pEC-Ursprungs
waren, und nicht Kontaminante des einen oder anderen Ursprungs.
Dies erfolgte auf drei Wegen. Bei den einfacheren
Konstruktionen unter Beteiligung von Ligationen von zwei Fragmenten
gleichzeitig wurden die mit verstärkten rekombinanten Klonen
erhaltenen Ergebnisse durch direkte Transfektion der
unverstärkten Erzeugnisse der Ligationsreaktionen und der nicht
mit der Ligase behandelte isolierte Fragmente enthaltenden
Scheinligationen überprüft. Eine zweite Bestätigung hing von
der Tatsache ab, daß die Plasmide pEJ und pEC ihre jeweiligen
Zellgene in entgegengesetzten Richtungen in den
pBR322-Plasmidvektor eingesetzt enthielten. Somit konnte der Ursprung eines
Elternteils einer Rekombinanten durch diagnostische
Restriktionsdigestionen der flankierenden Plasmidregionen bestimmt
werden. Da das kontaminierende pEC selbst kein falsch positives
Ergebnis abgeben konnte, mußten alle aktiven kiontragenden
Proto-Onkogen-Flankensequenzen als eine Folge des Erwerbs von
Bereichen des Umwandlungsgens entstanden sein. Schließlich
wurden die Ergebnisse mit mehreren unabhängigen, aus einer
Ligationsreaktion gewonnenen Klonen bestätigt.
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Wie aus Fig. 5 ersichtlich, wurde schließlich eine 350
Nukleotiden lange genetische Region identifiziert, die bei
Übertragung von dem Onkogen auf eine entsprechende Region in dem
Proto-Onkogen in der Lage war, letzterem Aktivität zu
vermitteln. Diese Region erstreckte sich von dem ersten
XmaI-Endonucleaseort zu dem KpnI-Ort. 55% dieser Region bestehen aus
dem ersten Codierungsexon, 10% ist 5' zu dem Exon und 35%
ist Teil des ersten Introns.
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Frühere Versuche hatten einen Unterschied in der Migration
des durch das Onkogen und das Proto-Onkogen codierten
p21-Proteins identifiziert. Nachdem nun ein kurzer Bereich des Gens
bestimmt wurde, der die Umwandlungsverletzung enthielt, wurde
es wichtig festzustellen, ob die Region auch die Spezifizität
für das geänderte Protein enthielt. Daher wurde eine
Immunfällung der mit den Erzeugnissen der in-vitro-Rekombinanten
transfektierten Zellen durchgeführt.
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NIH3T3-Zellen, umgewandelt mit dem EJ-Blasentumoronkogen, seinem
normalen Proto-Onkogen oder Rekombinanten zwischen den beiden
Genen wurden zuerst biologisch in 0,35% Agar kloniert und
dann metabolisch mit ³&sup5;S-Methionin 18 Stunden markiert. Lysate
wurden hergestellt und immungefällt (5 · 10&sup6; cpm TCA-fällbarer
Zählungen) durch einen monoklonalen Antikörper, der das durch
Ha-MuSV codierte p21, jedoch nicht das durch Ki-MuSV (Y13-172)
codierte p21 feststellte. Man vergleiche Furth, M.E., David,
L.J., Fleurdelys, B. und Scolnick, E.M. "J. Virol. 43", 294-
304 (1982), und Shih, T.Y., Weeks, M.O., Young, H.A. und
Scolnick,
E.M. "Virology 96", 64-79 (1979). Gelöste
Immunpräzipitate wurden dann durch Elektrophorese in einem 12-%igen SDS-
Polyacrylamidgel aufgetrennt und die Ergebnisse sind in Fig.
6 gezeigt als: Bahnen 1 bis 7a, kein Antikörper; Bahnen 1 bis
7b, monoklonaler Antikörper Anti-Harvey p21. Die Zellysate
waren von: NIH3T3-Zellen (Bahn 1); Zellen, umgewandelt mit
dem Proto-Onkogen - dem LTR-aktivierten 3kb-SacI-Fragment,
beschrieben in Payne, G.S., Courtneidge, S.A., Crittendon,
L.B., Fadly, A.M., Bishop, J.B. und Varmus, H.E. "Cell 23",
311-322 (1981) - (Bahn 2); Klon 504-17, umgewandelt mit dem
EJ-Onkogen (6,6-kb-Fragment in pBR) (Bahn 3); Klon 511-74,
umgewandelt mit der Ligation des
Proto-Onkogen-1-kb-SacI-Fragments zum EJ-Onkogen-3-kb-SacI-Fragment (Bahn 4); Klone 510-9
und 510-13, umgewandelt mit Ligationen eines sich von dem XhoI-
Ort zu dem zweiten BstEII-Ort erstreckenden Fragments des EJ-
Onkogens zu einem Klon des Proto-Onkogens, von dem das
homologe Fragment entfernt worden war (Bahnen 5 und 6), und Klon
508-8, umgewandelt mit der Ligation des EJ-Onkogens
linksseitig des KpnI-Orts zum Proto-Onkogen rechtsseitig dieses Orts
(Bahn 7).
-
Wie aus Fig. 6 ersichtlich ist, komigrierte das Protein, das
in Lysaten von Xho-BstEII, SacI-SacI- und
BstEII-KpnI-Rekombinationstransfektanten abgegeben wurde, sämtlich mit dem EJ-
Protein und hatte eine Beweglichkeit, die sich von der des
EC-Proteins unterschied. Eine Markierung der Kulturen für 18
Stunden führte zu hohen Markierungsniveaus in den
Niedermolekulargewichtsformen des p21 und unfeststellbaren
Markierungsmengen in den kinetisch unstabilen Höhermolekulargewichtsformen.
Aus den erhaltenen Daten wurde geschlossen, daß die Phenotypen
der onkogenen Transformation und der geänderten
elektrophoretischen Migration kosegregieren und beide durch das gleiche
DNA-Segment 350 nt codiert wurden. Die geänderte
Migrationsrate wurde als wahrscheinlich für eine Reflektion einer
funktionell wichtigen Änderung eines Proteins angesehen.
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Das kurze (350 kb) Fragment, von dem gezeigt wurde, daß es
biologische Signifikanz besitzt, wurde für DNA vom Onkogen
und Proto-Onkogen sequenziert. Diese Sequenzen wurden durch
die vorwärts und rückwärts gerichtete
Didesoxy-DNA-Sequenzierungstechnik von Seif et al und durch das chemische Verfahren
von Maxam und Gilbert bestimmt. Man vergleiche Seif, I., Khoury,
G. und Dhar, R. "Nucl. Acid Res. 8", 2225-2238 (1980), und
Maxam, A.H. und Gilbert, W. "Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74",
560-564 (1977). Die Ergebnisse sind in Fig. 7 gezeigt, in
der der Codierungs-DNA-Strang zusammen mit der hergeleiteten
Aminosäuresequenz gezeigt ist. Wo EJ und das Proto-Onkogen
differieren, sind beide Codons und Aminosäuren angegeben.
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Wie aus Fig. 7 ersichtlich ist, liegt der einzige Unterschied
zwischen den beiden DNA-Segmenten in der p21-Codierungsregion
des ersten bekannten Exons, speziell 60 Nukleotiden vom Xma-
Spaltungsort. Es tritt in einer Dreiergruppe auf, die Glycin
in den normalen Ratten- und Menschen-c-Ha-RAS-Genen codiert.
Die im EJ-Onkogen beobachtete Sequenz codiert Valin. Somit
ist diese Veränderung verantwortlich für die
Funktionsveränderung des Protein p21 und für die onkogene Aktivierung des
c-Ha-RAS-Gens, das in dem EJ-Blasenkarzinom auftritt.
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Eine Konsequenz der Einzelbasenänderung ist die Veränderung
des Spaltungsortes zweier verschiedener ortspezifischer
Endonucleasen. Die Sequenz GCCGGC tritt im Proto-Onkogen auf und
stellt somit einen Erkennungsort für die Endonuclease NaeI
dar. Diese Sequenz enthält auch den Erkennungsort CCGG der
Endonuclease HpaI. Diese sind beide in dem Onkogen verändert,
dessen Sequenz in der Region GCCGTC lautet.
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NaeI-Endonuclease wurde dazu benutzt, unabhängig die
Unterschiede zwischen den beiden Sequenzen zu überprüfen. NaeI wurde
anstelle von HpaI benutzt, weil NaeI die DNA weniger häufig
spaltet als HpaI. Wie erwartet, zeigte der pEC-Klon einen
Spaltungsort
mehr in seinen Inserts als sein pEJ-Gegenstück. Dies
liefert auch eine retrospektive Verifizierung der in-vitro-
Rekombinationsklone. Es war ersichtlich, daß die
allelspezifizierende Transformation und abnormale p21-Migration genau
mit der alle zurückweisenden NaeI-Spaltung an diesem Ort
kosegregierte.
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Fig. 8 stellt die Ergebnisse einer
NaeI-Restriktionsenzymbestimmung des EJ-Onkogens und dessen entsprechenden Proto-
Onkogens dar. Gemäß den beschriebenen Methoden wurde bestimmt,
daß ein NaeI-Restriktionsort im Proto-Onkogen existieren muß,
der in der Abwandlung, die das Onkogen produzierte, verloren
ist. Molekulare Klone des Onkogens (pEJ) und des Proto-Onkogens
(pEC) sowie das Plasmid, in das jedes kloniert war (pBR322),
wurden jeweils durch bekannte Verfahren gereinigt. Ein
Mikrogramm von jedem wurde mit dem Enzym NaeI geschnitten und die
resultierenden Fragmente wurden durch Elektrophorese durch
ein 15-%iges Bis-Acrylamidgel aufgetrennt. Das Gel wurde durch
den interkalierenden Farbstoff Ethidiumbromid eingefärbt und
bei ultraviolettem Licht fotografiert.
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In Fig. 8 sind die Bahnen: Bahn 1 ist Φ · 174 DNA, geschnitten
mit dem Enzym HaeIII als eine Markierungsbahn, die Banden
bekannter Größe produziert; Bahn 2 ist pBR322, geschnitten mit
NaeI unter Veranschaulichung von in dem Plasmidvektor ihren
Ursprung habenden Fragmenten; Bahn 3 ist durch NaeI
aufgespaltene pEJ-DNA und Bahn 4 ist durch NaeI aufgespaltene pEC-DNA.
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Die pEJ-DNA enthält eine mit einem Molekulargewicht von 1200
Basenpaaren wandernde Bande, die in der pEC-Bahn fehlt. Die
pEC-Bahn hat jedoch zwei zusätzliche Banden, eine von 400 Basen
und die andere von 800 Basen Länge, die in der pEJ-Bahn fehlen.
Somit ist der NaeI-Ort im pEC, der eine Aufspaltung der Bande
1200 bp in zwei Banden von 400 und 800 Basen ermöglicht, in
der Bildung des EJ-Onkogens verloren.
-
Von der einfachen Ersetzung von Valin für Glycin beim Protein
p21 konnte nicht erwartet werden, daß dies eine so tiefgreifende
Funktionsveränderung des Proteins p21 haben würde. Dennoch
scheinen mehrere Überlegungen dieser Strukturveränderung
Bedeutung beizumessen. Die erste stammt aus einem Vergleich
dieser Domäne des p21, codiert durch das menschliche c-Ha-RAS-
Gen, das Ratten-c-Ha-RAS-Gen und das v-Ha-RAS-Onkogen des
Harvey-Sarkomvirus. Die 37 Rest langen Aminosäuresequenzen codiert
durch die ersten Exons der beiden Zellgene, sind identisch,
was die große Evolutionserhaltung dieser Region anzeigt. Die
Analyse des Harvey-Sarkomvirus-Onkogens hat jedoch offenbart,
daß sie von ihrer direkten Rattenzellvorstufe in nur einer
Position in dieser Domäne abweicht, einer Umwandlung von Glycin
zu Arginin an genau dem gleichem Rest, der in dem EJ-Onkogen
verändert wird. Folglich kann vermutet werden, daß die Änderung
dieses kritischen Restes sowohl für die Aktivierung des v-Ha-
RAS-Gens von seinem Rattenzellvorgänger als auch für die
Aktivierung des EJ-Blasenonkogens von seinem normalen menschlichen
Gegenstück von Bedeutung war. Eine gleiche Veränderung kann
in der onkogenen Aktivierung eines anderen Mitglieds der RAS-
Genfamilie, des v-Ki-RAS-Gens des Kirsten Maussarkomvirus,
signifikant sein. Das Kirstenumwandlungsgen ist eng mit dem
v-Ha-RAS-Gen verwandt. Man vergleiche Dhar, R., Ellis, R.W.,
Shih, T.Y., Oroszlan, S., Shapiro, B., Maizel, J., Lowy, D.R.
und Scolnick, E.M. "Science 217", 934-936 (1982). Der einzige
Unterschied zwischen dem p21 des v-Ki-RAS und dem des v-Ha-
RAS in den ersten 36 Aminosäuren liegt bei Position 12, wo
der Rest bei Kirsten Serin ist. Man vergleiche Tsuchida, N.,
Ryder, T. und Ohtsubo, E. "Science 217", 937-939 (1982). Dies
ist genau der gleiche Ort wie in den EJ- und Harveysarkomvirus
codierten p21ern verändert. Da Sequenzinformationen über das
Zellhomologe des v-Ki-RAS nicht verfügbar sind, kann vermutet
werden, daß eine Umwandlung vom Glycin in einen neuen
Aminosäurerest bei Position 12 auch bei der Aktivierung dieses RAS-
Onkogens beteiligt ist.
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Eine zweite Überlegung stammt aus einer Untersuchung der
beobachteten spezifischen Aminosäurenveränderungen. In beiden
Fällen wird Glycin durch eine Aminosäure mit einer
verhältnismäßig großen Seitenkette ersetzt. Glycin stellt eine Anomalie
unter den 20 Aminosäuren dar, da ihm eine Seitenkette fehlt.
Folglich ist es in der Lage, an extremen Biegungen und Faltungen
des Polypeptidrückgrats teilzunehmen, und es ist der stärkste
Aufspalter von Alpha-Helices. Man vergleiche Cantor, C.R. und
Schimmel, P.R. "Biophysical Chemistry, Vol. 1", Seite 303,
W.H. Freeman und Co., San Francisco (1980). Somit stellen
Ersetzungen von Glycin durch Valin oder Arginin abrupte
Veränderungen in der örtlichen Stereochemie eines Proteins dar.
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Man ist der Auffassung, daß der Verlust von Glycin am Rest
12 eine signifikante Veränderung in der wesentlichen Domäne
des Proteins p21 darstellt. Eine Folge dieser Veränderung kann
eine Konformationsverschiebung des Proteins sein, die
ihrerseits zu der anomalen elektrophoretischen Migration oder
Reifung von p21-Proteinen führt. Eine zweite, bedeutendere Folge
ist ein tiefgehender Einfluß auf die Funktion des p21-Proteins.
Es ist wahrscheinlich, daß diese Veränderung die Wechselwirkung
des p21 mit zellulären Zielen beeinflußt. Es existieren
Präzedenzfälle für andere Einzelaminoveränderungen, die weitgehende
Auswirkungen auf die Zell- und Organphysiologie nehmen. Der
bekannteste von ihnen ist das Sichelzellensyndrom, bei dem
eine Umwandlung von Glutamin zu Valin die Löslichkeit von
Hämoglobin in Erythrozyten beeinflußt.
-
Die hier beschriebenen Entdeckungen scheinen einer Reihe von
Versuchen der letzten Jahre zu widersprechen, die als zentrales
Ereignis bei der Karzinogenese Aufregulierung angeben.
Derartige Experimente umfassen die Aktivierung des
MYC-Proto-Onkogens, das bei der Leukemogenese aviärer Retroviren auftritt -
man vergleiche Neel, B.G., Hayward, W.S., Robinson, H.L.,
Fang, J. und Astrin, S.M. "Cell 23", 323-324 (1981), und Payne,
G.S., Courtneidge, S.A., Crittendon, L.B., Fadly, A.M., Bishop,
J.M. und Varmus, H.E. "Cell 23", 311-322 (1981) - und die
Demonstration, daß eine in-vitro-Verschmelzung eines Retrovirus-
LTR-Promoters und eines zellulären Proto-Onkogens zu einem
aktiv transformierenden Gen führt - man vergleiche DeFeo, D.,
Gonda, M.A., Young, H.A., Chang, E.H., Lowy, D.R., Scolnick,
E.M. und Ellis, R.W. "Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78", 3328-
3332 (1981), Blair, D.G., Oskarsson, M., Wood, T.G., McClements,
W.L., Fischinger, P.J. und Vandewoude, G. "Science 212", 941-
943 (1981), und Change, E.J., Furth, M.E., Scolnick, E.M. und
Lowy, D.R. "Nature 297", 479-483 (1982). Diese letzteren
Ergebnisse fügen sich besonders gut ein, da einige von ihnen
eine Aktivierung von Klonen der Ratten- und Human-c-Ha-RAS-
Proto-Onkogene demonstrieren. Es ist unwahrscheinlich, daß
die proteincodierenden Sequenzen dieser c-Ha-RAS-Gene
irgendwelche Strukturveränderungen bei der Konstruktion dieser Virus-
Zellen-Chimären erfahren haben. Eher hat es den Anschein, daß
der einzige wesentliche Unterschied zwischen den Proto-Onkogenen
und ihren LTR-aktivierten Gegenstücken in den Expressionsraten
liegt. Dies bedeutet, daß das RAS-Proto-Onkogen durch einen
zweiten unabhängigen Mechanismus aktiviert werden kann, der
im Prinzip genauso wirksam ist wie die Schaffung eines Onkogens
wie das hier beschriebene.
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Onkogene anderer Tumore sind ebenfalls auf RAS-Gene untersucht
worden. Speziell wurde bei Kolon- und Lungenkarzinomen
festgestellt, daß sie Onkogene enthalten, die aus der Aktivierung
zellulärer Ki-RAS-Gene abgeleitet sind. Man vergleiche Der,
C., Krontiris, T.G. und Cooper, G.M. "PRoc. Natl. Acad. Sci.
USA 79", 3637-3640 (1980). Daher ist es wahrscheinlich, daß
die Aktivierung vieler dieser Onkogene auch von
Strukturveränderungen abhängig ist, ähnlich den oben berichteten.
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Wie oben beschrieben, macht die Veränderung des Gly¹²-Kodons
im EJ-Onkogen eine einfache Diagnosebestimmung für Karzinogenese
oder eine Umwandlung möglich, die durch eine Veränderung dieses
Kodons im Onkogen hervorgerufen worden ist.
-
Eine Konsequenz der Veränderung der Aminosäuresequenz des durch
das Proto-Onkogen codierten p21-Proteins vom durch das Onkogen
codierten p21-Protein bezieht sich auf die Erkennung von
jedem durch spezifische serologische Reagentien. Die
serologischen Reagentien können spezifisch sein für die normale,
protoonkogen-spezifizierte Aminosäuresequenz an diesem Ort des
Proteins, oder spezifisch sein für die veränderte,
onkogenspezifizierte Aminosäuresequenz an diesem Ort des Proteins. Andere
serologische Reagentien könnten eingesetzt werden, die mit
einem Bereich des Proteins zur Reaktion gebracht werden, der
unverändert ist, und die folglich sowohl mit normalen als auch
anomalen Formen des p21-Proteins reaktionsfähig sind.
-
Unter Verwendung von Klonierungsverfahren können bedeutsame
Mengen von durch den normalen Ort des Proto-Onkogens oder durch
den veränderten Ort des Onkogens codiertem p21-Protein
isoliert werden. Solche Proteinsegmente könnten zur Herstellung
von Antikörpern durch
Standard-Antikörperherstellungs-Verfahren verwendet werden. Somit würden für das Herstellen
polyklonaler Antikörper solche Proteine eingesetzt werden, um einen
Wirt, wie ein Kaninchen oder eine Ratte, zu immunisieren, und
Antikörper zu dem Protein würden aus von dem Wirt erhaltenem
Serum gesammelt.
-
Alternativ könnten monoklonale Antikörper hergestellt werden
unter Verwendung von Zellen, die Antikörper zu dem Protein
produzieren, das von dem isolierten Gensegment in typischen
Verschmelzungsverfahren zur Bildung von Hybridomzellen
hergestellt wurde. Grundlegend beinhalten diese Verfahren das
Verschmelzen der Antikörper produzierenden Zelle mit einer
Zelle mit Unsterblichkeit, wie eine Myelomzelle, um ein
Fusionszellhybrid zu erhalten, das Unsterblichkeit aufweist und in
der Lage ist, den gewünschten Antikörper zu produzieren, in
diesem Fall einen Antikörper zu dem normalen oder veränderten
Segment des durch das isolierte Gensegment codierten
p21-Proteins. Die Hybridzellen werden dann unter die
Antikörperbildung förderlichen Bedingungen kultiviert, nach denen
Antikörper aus dem Zellkulturmedium gesammelt werden. Solche
Verfahren für die Herstellung monoklonaler Antikörper sind in der
Literatur hinlänglich beschrieben worden. Man vergleiche zum
Beispiel die US-Patente Nr. 4.172.124 und 4.196.265,
ausgegeben an Hilary Koprowski et al, deren Lehren hiermit durch
den Hinweis aufgenommen sind.
-
Insbesondere können solche serologischen Reagentien durch die
bekannten Verfahren entwickelt werden. Man vergleiche Walter,
G., Scheidtmann, K.H., Carbone, A., Laudaro, A.P. und Doolittle,
R.F. "Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77", 5197-5200 (1980); Lerner,
R.A., Green, N., Alexander, H., Liu, F.T., Sutcliffe, J.G.
und Schinnick, T.M. "Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78", 3403-3407
(1981).
-
In der Praxis kann ein Peptidsegment durch ein organisches
Synthese-Standardverfahren synthetisiert werden, wobei die
Sequenz dieses Peptids präzise der Aminosequenz des
interessanten Bereichs des zu untersuchenden Proteins entspricht.
Dieses Peptid kann dann an ein Trägerprotein gekoppelt und
einem geeigneten Wirt (z. B. einer Maus) injiziert werden, um
eine Immunantwort auszulösen. Das Serum des auf diese Weise
immunisierten Tieres wird dann verwendet, um sowohl das
immunisierende Peptid als auch, was wichtiger ist, das Protein
immunzufällen, das diese Aminosäuresequenz in einer seiner
Domänen trägt. Folglich kann ein Serum hergestellt werden
gegen eine Oligopeptidsequenz (z. B. ein Decapeptid), welche den
Aminosäurerest-Ort umspannt, der während der Konversion des
normalen Proto-Onkogens in das Onkogen verändert wird. Solch
ein Serum kann gegen die normale Peptidsequenz oder
alternativ
gegen die veränderte Sequenz hergestellt werden. Die
Spezifität der Immunglobulin-Antigen-Wechselwirkung wird
sicherstellen, daß das mit dem Oligopeptid reagierende Serum nur
mit dem Protein reagieren wird, das dieselbe, entsprechende
Sequenz in einer seiner Domänen trägt und nicht mit einem
Protein, das eine veränderte Version dieser Sequenz in einer
seiner Domänen trägt, kreuzreagiert.
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p21-Protein kann aus einer Tumorprobe oder aus einem
Gewebehomogenat oder aus einer von einem autolysierenden
Tumorfragment freigesetzten Flüssigkeit immungefällt werden unter
Verwendung des allgemeinen, nicht-spezifischen p21-Serums, das
mit Domänen des Proteins (z. B. C-Terminus) kreuzreagiert, die
von den hier beschriebenen mutationsinduzierten Veränderungen
unberührt bleiben. Unabhängig davon kann das Serum mit
Spezifität gegen den N-terminalen, normale Peptide umgebenden
Rest 12 verwendet werden, um Protein aus demselben Lysat
immunzufällen. Wenn dieses N-Terminus-spezifische Serum,
welches in der Lage ist, normales p21 aus dem
nicht-pathologischen Gewebe immunzufällen, nicht in der Lage ist, p21 aus
einem interessanten Testgewebe immunzufällen, dann kann von
dem p21 aus diesem Testgewebe angenommen werden, daß es in
einer Weise verändert ist, die seine Fähigkeit, mit mit der
normalen N-Terminus-Sequenz reaktivem Serum zu reagieren,
beeinflußt. Die Menge des aus diesem Gewebe durch das allgemeine,
nicht-spezifische Serum immungefällten p21 dient als eine
Kontrolle für die Menge des p21, die aus dem mit der normalen
N-Terminus-Sequenz reaktivem Serum fällbar sein sollte.
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Die obige Immunfällung kann als ein Maß für das Vorhandensein
von verändertem p21 in einer Gewebeprobe verwendet werden.
Unabhängig davon kann eine Reihe peptid-spezifischer Sera
entwickelt werden zum Erkennen, welcher spezifische Typ der
Veränderung aufgetreten ist, um die normale Aminosäuresequenz
dieser Region in eine abnorme Sequenz umzuwandeln. Zum
Beispiel
kann ein Liste der Aminosäuren-Austausche gemacht
werden, die durch einfache Punktmutation an dem den Rest 12
codierenden Kodon auftreten können. Für jeden dieser Austausche
kann eine neue Version der Oligopeptid-Sequenz dieser Region
abgeleitet und ein entsprechendes Peptid zur oben
beschriebenen Verwendung synthetisiert werden. Jedes dieser Sera wäre
spezifisch reaktiv mit dem veränderten p21, das dem zum
Induzieren des fraglichen Serums verwendeten
Oligopeptid-Fragment entspricht.
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Der Begriff "Immunfällung" wird durch eine Reihe
alternativer technischer Verfahren beschrieben. Ein allgemein
verwendetes Verfahren ist das der Immunfällung eines metabolisch
markierten Proteins, gefolgt von Gelelektrophorese und
Autoradiographie des resultierenden Gels. Wegen der
Schwierigkeiten, Gewebeproben metabolisch zu markieren, wird hier eine
Alternative bevorzugt, die in der Verwendung der
Gelelektrophorese von nicht-markierten Proteinen, Übertragung der
aufgelösten Proteine auf ein Nitrozellulose-Filter und Detektion
der interessanten Proteine durch Inkubation des Filters mit
radioaktiv markiertem Immunglobulin besteht. Das
Immunglobulin kann entweder durch direkte Jodinierung radioaktiv
markiert werden oder indirekt durch Inkubation des
Immunglobulins mit einem zweiten, radioaktiv markierten Immunglobulin,
das mit konstanten Regionen des ersten Immunglobulins reagiert.
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Obgleich die Diskussion in der vorliegenden Anmeldung und ein
großer Teil der Versuchsarbeiten der Feststellung von
Unterschieden im EJ-Gen für Humanblasenkrebs und das Proto-Onkogen,
c-Ha-RAS, galten, sind die Techniken zur Feststellung dieser
Unterschiede sowie die darauf basierenden Bestimmungen von
weit allgemeinerer Natur. Tatsächlich wird angenommen, daß
sich solche Techniken und Bestimmungen auf jedem Wildtyp-Gen
oder -Allel, welches mutiert worden ist, um ein mutiertes
Allel oder Gen zu erzeugen, welches eine von dem Wildtyp-Allel
drastisch verschiedene Funktion hat, anwenden lassen. Zum
Beispiel würde man von solchen Techniken und Bestimmungen
erwarten, daß sie geeignet sind für die Verwendung beim Erkennen
von Unterschieden in dem Wildtyp-Gen und dem für das Lesch-
Nyan-Syndrom verantwortlichen mutierten Gen.
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Die Techniken haben natürlich einen besonderen Nutzen und
Vorteil beim Erkennen von Unterschieden zwischen Onkogenen und
Proto-Onkogenen. Mitglieder der RAS-Familie der Gene sind
bereits diskutiert worden. Jedoch bieten sich die hier
beschriebenen Techniken auch dazu an, Unterschiede zwischen anderen
Proto-Onkogenen und Onkogenen als den Mitgliedern der
RAS-Familie zu ermitteln. Zum Beispiel könnten Unterschiede zwischen
dem Onkogen in der HL-60-Zellinie, das als verantwortlich für
promylozytische Leukämie, bestimmte Kolonkrebse und
Haarzellleukämie bekannt ist, und dessen Proto-Onkogene unter
Verwendung der hier beschriebenen Verfahren ermittelt werden.
Diese Unterschiede könnten dann in Bestimmungen der beschriebenen
Art verwendet werden.
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Ein sehr allgemeines Protokoll zur Bestimmung von
Unterschieden in einem Wildtyp-Gen und dessen korrespondierendem
mutierten Gen ist wie folgt:
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A. Man entwickle eine in-vitro-Bestimmung für die
Aktivität eines Gens, dessen Funktion oder Fehlfunktion für den
Phenotyp einer genetischen Erkrankung verantwortlich ist. Eine
derartige in-vitro-Bestimmung ist im allgemeinen von einer
beobachtungsfähigen Veränderung im Verhalten einer
gezüchteten Zelle abhängig, die das Gen durch eine Genübertragung
erworben hat.
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B. Man verwende die in in-vitro-Bestimmung zur
Isolierung eines Allels des obigen Gens als Molekularklon. Ein
derartiges Allel kann entweder ein Wildtyp-Allel oder eine
Fehlfunktionsallelvariante
des Wildtyp-Allels sein.
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C. Man verwende das isolierte Allel aus Absatz B zur
Isolierung anderer Allelformen des Gens unter Verwendung der
Rekombinations-DNA-Techniken. Somit kann das normale Allel
als Sequenzprobe zur Ermöglichung der Identifizierung und
Isolierung einer Allelvariante des Nicht-Wildtyps verwendet werden.
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D. Man demonstriere die beobachtungsfähigen
verschiedenen und charakteristischen Verhalten des Wildtyp-Allels und
einer Nicht-Wildtyp-Variante in dem in-vitro-Bestimmungssystem.
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E. Man führe in vitro eine genetische Rekombination
zwischen den Klonen des Wildtyp- und Nicht-Wildtyp-Allels durch,
gefolgt von einer Untersuchung der Rekombinanten im in-vitro-
Bestimmungssystem und Bestimmung des durch ein Wildtyp- oder
Nicht-Wildtyp-Allel in diesem System (Teil D) herbeigeführten
Phenotyps. Auf diese Weise kartiere man genetisch die Region
des Nicht-Wildtyp-Allels, das für die Unterschiede in der
Funktion zwischen den beiden Allelen verantwortlich ist.
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F. Man führe eine Struktursequenzanalyse der Region
des nachgewiesenen Nicht-Wildtyp-Allels (Teil E) durch, um
den Funktionsunterschied zwischen den beiden Allelen zu
codieren.
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G. Nach der Identifizierung einer geänderten
Schlüsselsequenz (Teil F), deren Existenz den geänderten Phenotypen
des Nicht-Wildtyp-Gens bestimmt, identifiziere man eine oder
mehrere ortsspezifische Endonukleasen (Restriktionsenzyme),
deren Spaltungserkennungsort während des Prozesses verändert
wurde, der ein Wildtyp-Allel in ein Nicht-Wildtyp-Allel
umwandelt.
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H. Man verwende das klonierte Wildtyp-Gen als
Sequenzprobe
zum Auslesen von DNAs von Versuchsproben oder
Versuchsgewebe zur Feststellung, ob oder nicht die Test-DNA eine
Sequenzveränderung in jenem Gen trägt und jenem Bereich des Gens,
der oben (Teil E) als kritisch bei der Beeinflussung der
Funktion des Gens und seiner Nicht-Wildtyp-Allelvarianten gezeigt
worden ist, und Prüfung auf das Vorhandensein oder Fehlen des
Restriktionsendonukleaseorts (Teil G), dessen Veränderung oben
als die Funktion des Gens beeinflussend gezeigt wurde.
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I. Man leite die durch das normale Wildtyp-Allel des
Gens und seine Nicht-Wildtypvarianten-Formen codierten
Aminosäuresequenzen ab. Man bestimme, ob der zuvor kartierte
Nukleotidsequenz-Unterschied, der zuvor als das Funktionieren
des Gens beeinflussend gezeigt wurde, auch die
Aminosäuresequenzen der Proteine beeinflußt, die durch Wildtyp- und Nicht-
Wildtyp-Allele codiert werden.
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J. Sollten Aminosäuresequenzen beeinflußt sein,
entwickle man für die Wildtyp- und Nicht-Wildtyp-Proteine
spezifische Antisera. Zum Beispiel könnte man ein Oligopeptid-
Fragment synthetisieren, dessen Sequenzen die Sequenz der
Domäne des Nicht-Wildtyp-Proteins reproduzieren, welche es
funktionell vom Wildtyp-Protein (Teil I) unterscheiden; man
synthetisiere das entsprechende Wildtyp-Oligopeptid; man
verwende beide als Immunogene, um Antisera zu bilden, die spezifisch
für die Reaktion mit den Wildtyp- und Nicht-Wildtyp-Proteinen
sind.
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K. Man benutze die spezifischen Antisera (Teil J), um
die Proteine von Testzellen oder Testgewebe auf das
Vorhandensein von Wildtyp- oder Nicht-Wildtyp-Versionen des
besagten Proteins zu untersuchen.
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L. Man benutze die Protein-Untersuchung (Teil K), um
das Vorhandensein von Proteinen zu erkennen, deren Struktur
wichtig für die Vermittlung des Phenotyps einer genetischen
seit ist.
Gewerbliche Anwendbarkeit
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Die hier beschriebene Erfindung ist bei der Definition der
Unterschiede zwischen Proto-Onkogenen und ihren
entsprechenden Onkogenen, den durch derartige Gene codierten Proteinen,
der Herstellung von Antikörpern zu solchen Proteinen oder
Anteilen davon und der Verwendung solcher Antikörper bei
Bestimmungen für das Vorhandensein derartiger Proto-Onkogene oder
Onkogene als ein Maßstab für Karzinogenese nützlich.