JPS60500002A - 発癌遺伝子の解明およびそれに基づく検定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の名称 発癌遺伝子の解明およびそれに基づく検定法政府の支持 本明細書て記載する研究成果は、米国予防衛生研究所（ＮＩＨ）の許可により支 持されている。

技術分野 本発明は分子生物学の分野であり、特に突然変異体対立遺伝子およびその対応す る野生型の対立遺伝子特に発癌遺伝子および始原発癌遺伝子間の相違を明らかに し、その相違を利用して検定する事に関する。

背景技術 化学発癌に関連した従来の研究成果は化合物の発癌力がしばしばその変異誘発素 としての能力と相関する事を示してきた。

ＭｃＣａｎｎ、　Ｊ、　Ｃｈａｔ、　Ｅ＋、　Ｙａｍａｓａｋｉ、　Ｅ、および Ａｍｅｓ、　Ｂ、　Ｎ、　Ｐｒｏｃ、’Ｎａｔ１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　 ７２：　５１３５−５１３９（１９７５）；ＭｃＣａｎｎ、　Ｊ、およびＡｍｅ ｓ、　Ｂ＋Ｎ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ−Ｓｃｉ。

ＵＳＡ　７３　：　９５０−９５４　（１９７６）　；　Ｂｒ１１ｇ１ｅｓ、　 Ｂ、　Ａ、　Ｎａｔｕｒｅ２６１　：　１９５−２００　（１９７６）　；およ びＢｏｕｃｋ、　Ｎ、およびｄｉＭａｙｏｒｃａ、　Ｃｒ、　Ｎａｔｕｒｅ　２ ６４　：　７２２−７２７　（１９７６）を参照されたい。この事ｊ主ＤＮＡが 発癌活性化の終局の標的である事を示そしている。このため、研究者はしばしば ”発癌遺伝子“と称さ几、その変ｆヒが発癌への変化に決定的に重要である癌細 胞中のＤＮＡセグメントの同定２よひ研究を試みてきた。

２ フオームＮ工Ｈ３Ｔ３マウス線維芽細胞内へＥＪ膀胱癌細胞株からの腫瘍細胞Ｄ ＮＡが導入された。この方法により細胞から細胞へ細胞トランスフ万一メーショ ンの表現型が移せる事が発見された。腫瘍ＤＮＡは受容ＮＩＨ単層培養において トランスフオームした細胞のフォーカスを誘導できるが、正常の非トランスフオ ーム供与細胞７１）らのＤＮＡはフォーカスを生成しない。

５ｈｉｈ、　Ｇ、、　５ｈｉｌｏ、　Ｂ、、　Ｇｏｌｄｆａｒｂ、　Ｍ、　Ｐ、 、　Ｄａｎｎｅｎｂｅｒｇ、　Ａ、およびＷｅｉｎｂｅｒｇ、　Ｒ，Ａ、　Ｐｒ ｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａａ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７６　：５７１４−５７ １８　（１９７９）　；　Ｃｏｏｐｅｒ、　Ｇ、　Ｍ、、　０ｋｅｎｑｉｓｔ、 　Ｓ、およびＳｉｌｖｅｒｍａｎ、　Ｌ、　Ｎａｔｕｒｅ　２８４　：　４１８ ４２１　（１９８０）　；５ｈｉｈ、　Ｃ，、Ｐａｄ、ｈｙ、　Ｌ、　Ｃ，、Ｍ ｕｒｒａｙ、　Ｍ、　Ｊ、およびＷｅｉｎｂｅｒｇ。

Ｒ，Ａ、　Ｎａｔｕｒｅ　２９０：　２６１−２６４（１９８１）　；　Ｋｒｏ ｎｔｉｒｉｓ。

２７：　４６７−４７６（１９８１）を参照されたい。

これらの結果はＥＪ肺腫瘍細胞株ＤＮＡ中存在する発癌遺伝子因子は明らかに正 常細胞のＤＮＡには存在しない事を示している。

種々の部位−特異性エンドヌクレアーゼの処理による、ＥＪ膀胱癌細胞株からの 発癌遺伝子の感受性または抵抗性を検討した研究は、その細胞トランスフォーメ ーションにはある種の特別な供与Ｉ）ＮＡ配列が関係している事を示した。Ｌａ ｎｅ、　Ｍ、　Ａ、。

５ａｉｎｔｅｎ、　Ａ、およびＣｏｏｐｅｒ、　Ｃｒ、　Ｍ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎ ａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

ＵＳＡ７８　：　５１８５−５１８９（１９８１）　；　ｍよび５ｈｉ１ｏ、　 Ｂ、およびＷｅｉｎｂｅｒｇ、　Ｒ，Ａ、　Ｎａｔｕｒｅ、２８９　：　６０７ −６０９　（１９８１）３ｉ１’＋Ｍｊ６０−５００（１０２（３）を参照され たい。分離および特定可能な発癌遺伝子のこの概念は、後にＲｏｂｅｒｔ　Ａ、 　Ｗｅｉｎｂｅｒｇの名前で１９８２年５月１９日付で出願中の出願番号３７９ ，７２１号に記載されている方法により、ＥＪヒト膀胱癌細胞株から独立したト ランスフォーミング遺伝子の分子単離により直接示された。

この出願中の出願に記載されている如く、ＥＪ細胞株から単離されたＤＮＡを、 ヒト膀胱癌発癌遺伝子およびマーカーのみを実質的に含有するマウス線維芽細胞 が選別されるまでＮＩＨ３Ｔ３マウス線維芽綱胞にトランスフェクションして連 続的に取り込ませる。この作業で用いられたマーカーはＡｌｕ　ＤＮＡ配列であ り、ヒ）ＤＮＡにおいては約３００，０００回繰り返しているがマウス線維芽細 胞ＤＮＡには存在しない。このような種間トランスフェクションにより最終的に マーカーを伴った目的とする発癌遺伝子を含有する細胞が選別される。このトラ ンスフェクトされた細胞からの全てのＤＮＡを用いラムグファージ内にゲノムラ イブラリーをつくり、適当なキメララムダファージをヒトＡ１ｕマーカーに特異 的なプローブを用いて選択する。

この研究により、エンドヌクレアーゼＢａｍＨ丁により生じる６６Ｋｂの長さの ＤＮＡセグメントにＥＪ膀胱ｉ％ＤＮＡの発癌遺伝子の活性が位置している事が 解明された。６，６ＫｂセグメントをプラスミドベクターｐＢＲ３２２にクロー ン化し、サザーン・プロット分析における配列プローズｊ′Ｃ使用する。これに より正常ヒトゲノムに存在する類似の構造の配列から該発癌遺伝子が誘導された 事が示された。Ｇｏｌｄｆａｒｂ、　Ｍ、、　Ｓｈｉｍｉｚｕ、　Ｐｅｒｕｃｈ ｏ。

Ｍ、およびＷｉｇｌｅｒ、　Ｍ、　Ｎａｔｕｒｅ　２９６　：　４０４−４０９ 　（］　９８２）　；および５ｈｉｈ、　Ｃ，およびＷｅｉｎｂｅｒｇ、　Ｒ， 、Ｃｅ１ｌ　２９　：　１６１−１６９（１９８２）を参照されたい。このよう に、発癌過程の間に正常細胞遺伝子の突然変異によりヒト膀胱発癌遺伝子が生じ ると思われる。

ＥＪ膀胱発癌遺伝子とその対応する正常細胞配列（″始原発癌遺伝子“）の比較 は、この発癌遺伝子がラット由来のＨａ　ｒｖｅｙラット肉腫ウィルスのトラン スフォーメーション遺伝子と類似しているという続いての発見により促進された 。Ｄｅｒ、　Ｇ、。

Ｋｒｏｎｔｉｒｉｓ、　’ｒ、　Ｇ、およびＣｏｏｐｅｒ、　Ｃｒ、　Ｍ、　Ｐ ｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７９　：　３６３７−３６４０　（１９８２）　；　Ｐａｒ ａａａ、　Ｌ、　Ｆ、。

３４３−３４７（１９８２）を参照されたい。このラット肉腫ウィルス遺伝子（ ｙ−Ｈａ−ｒａｓと名付けられている）はキメラウィルスゲノムの形成の過程に おいてラットゲノムから得られたものである。５ｃｏ１ｎｉｃｋ、　Ｅ、　Ｍ、 およびＰａｒｋｓ、　Ｗ、　Ｐ、Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ。

１３：　１２１１−１２１９（１９７４）；および５ｈｉｈ、　Ｔ、　Ｙ、、　 Ｗｉｌｌｉａｍｓ。

Ｄ、　Ｒ−、Ｗｅｅｋｓ、　Ｍ、○、、　Ｍａｒｙａｋ、　Ｊ、　Ｍ、、　Ｖａ ｓｓ、　Ｗ、　Ｃ，および５ｃｏ１ｎｉｃｋ、　Ｅ、　Ｍ、Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、 　２７：　４５−５５（１９７８）を参照されたい。この遺伝子の研究の過程に ８いて、ｖ　−Ｈａ　−ｒａｓ　フラットおよびヒト細胞相同体が単離された。

ＤｅＦｅｏ、　Ｄ、、　Ｇｏｎｄａ。

Ｍ、　Ａ、、　Ｙｏｕｎｇ、　Ｈ，Ａ、、　Ｃｈａｎｇｅ、　Ｅ、Ｈ，、Ｌｏｗ ｙ、　Ｄ、　Ｒ，、５ｃｏｌｎｉｃｋ。

Ｅ、　Ｍ、およびＥｘｌｉｓ、　Ｒ，Ｗ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａａ 、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ７８：　３３２８−３３３２（１９８１）；および、Ｃｈ ａｎｇ、　Ｅ、　Ｈ，、Ｇｏｎｄａ。

Ｍ、　Ａ、、　Ｅｌｌｉｓ、　Ｒ，Ｗ、、　５ｃｏｌｎｉｃｋ、　Ｅ、　Ｍ、お よびＬｏｗｙ、　Ｄ、Ｒ１Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　ＵＳ Ａ　７９．　４８４８−４８５２　（１９ｉ３２）を参照されたい。ヒト細胞ｙ 　−Ｈａ−ｒａｅ相同体はＥＪ膀胱発癌遺伝子の正常前１駆体と正確に対応する 事が見い出された。

Ｐａｒａｄａ、　Ｌ、　Ｆ、、　Ｔａｂｉｎ、　Ｃ，Ｊ、、　５ｈｉｈ、　ｃ、 およびＷｅｉｎｂｅｖｇ。

Ｒ，Ａ、Ｎａｔｕｒｅ　２９７：　４７４−４７９（１９８２）を参朋されたい 。

ＥＪ発癌遺伝子およびその正常細胞対応物（ｃ−Ｈａ−ｒａｓと名付けられてい る）の予備的な比較がなされた。Ｅｌｌｉｓ、　Ｒ。

Ｗ、、　ＤｅＦｅｏ、　Ｄ、、　Ｍａｒｙａｋ、　Ｊ、　Ｍ、、　Ｙｏｕｒ＋ｇ 、　Ｈ，Ａ、、　５ｎｉｈ、　Ｔ、　Ｙ、。

Ｃｈａｎｇ、　Ｅ、　Ｈ，、Ｌｏｗｙ、　Ｄ、　Ｒ，および５ｃｏｌｎｉｃｋ、 　Ｅ、　Ｍ。

Ｊ、　Ｖｉｖｏｌ、　３６　：　４０８−４２０　（１９８０）。この研究に２ いて、ＮＩＨ３Ｔ３単層に塀えた場合正常ＭＪ胞遺伝子からの分子クローンはフ ォーカスを誘導しないのに対し、膀胱発癌遺伝子はトランスフェクトしたＤＮＡ マイクロダラム当り約５Ｘ１０”のフォーカスを形成させる生物活性を持つ事が 示されている。５ｈｉｈ。

Ｃ３およびＷｅｉｎｂｅｒ［！、、　Ｒ，Ａ、Ｃｅｘ１２９：　１６１−１６９ （１９８２）；およびＣｈａｈｇ、　Ｅ、　Ｈ，、Ｃｏｎｄａ、　Ｍ、　Ａ、、 　Ｅｌｌｉｓ、　Ｒ，Ｗ、、　５ｃｏ１．ｎ１ｃｋ。

Ｅ、　Ｍ、およびＬｏｗｙ、　Ｄ、　Ｒ，Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、 、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡヱ旦：　４８４８−５２（１９８２）を参照されたい。

この純然たる機能上の相違は２つのクローン間の明らかな構造的相違としては相 関しない。ＥＪ発癌遺伝子クローンおよび非クローン化関連ヒト始原発癌遺伝子 の大まかな制限エンドヌクレアーゼ部泣地図作成では、ＥＪ発癌遺伝子のトラン スフォーミンダ活性を含有する６、６　Ｋｂ配列のすべてにわたって、この２つ は基本的に区別できない事が示された。５ｈｉｈ、　ｃ、およびＷｅｉｎｂｅｒ ｇ、　Ｒ，Ａ、　Ｃｅ１ｌ　２９：　１６１−１６９（１９８２）を参照さ６ れたい。後になされた精密な地図作成は２つの遺伝子の分子クローンの直接の比 較を可能に１−だが、やはり遺伝子の暗号付はヌクレアーゼを用いても相違は観 察されなかった。この相違は他の研究者により以前に証明されたタイプの、遺伝 子プール中に存在する遺伝子の機能とは無関係な多形性を現わすものとして説明 された。Ｇｏｌｄｆａｒｂ、　Ｍ、、　Ｓｉ１１ｍ１ｚｕ、　Ｐｅｒｕｃｈｏ、 　Ｍ、およびＷｉｇｌｅｒ、　Ｍ、　Ｎａｔｕｒｅ　２９６　：　４０４−４０ ９　（１９８２）を参照されたい。

このように、ヒト膀胱癌発癌遺伝子およびその正常始原発癌遺伝子の２つの構造 的に同様の遺伝子の劇的な機能上の相違が示されてきた。２つの遺伝子の構造上 の相違は従菊朱知であるが、機能的相違を産み出す相違は次の２つのうちの何れ かの仕組による＋つと推測された。即ち、機能上の変化は、遺伝子の発現を調節 している配列の変化によるか、もしくはトランスフ丁−ムした発現型の変化は遺 伝子の蛋白質をコードする部分の変化によるかである。第１の仮説は遺伝子の転 写または翻訳を上昇させ、高水準の普通ならば正常の蛋白質を産生ずるに違いな いし、一方第２の仮説は変った蛋白質の合成を水製している。

両方の型の変化もまた観察される機能上の相違を創造する事に関係するように働 くかも知れない。

発明の開示 本発明は、従来ヒト膀胱癌を起こすことが示されているＥＪ発癌遺伝子およびそ の始原発癌遺伝子間の相違を調べる事に関する。示される方法はどんな変異体対 立遺伝子およびその対応７ｊ、１．胸６０−５００００２　（４）する野生型対 立遺伝子間の相違を決定するのに応用できる；この方法は発癌遺伝子および始原 発癌遺伝子間の相違を決定するのに特に有効である。

最初に、ＥＪ発癌遺伝子およびその始原発癌遺伝子間の劇的な機能の相違が調節 機構によるものか、または配列の相違にはるものかを決定する実験を実施した。

これらの実験により、前記遺伝子の調節の促進が細胞トランスフォーメーション の原因ではない事を示すデータが提供された。それ故、劇的な機能変化は前記遺 伝子のＤＮＡ配列の変化によるに違いないと決定された。

Ｎ工Ｈ３Ｔ３線維芽細胞の細胞トランスフォーメーションの原因となる６、６Ｋ ｂｐＥＪの範囲を一連のヱＺ（Σ二での遺伝子組換えにより３５０塩基対のセグ メントにしぼった。この３５０塩基対セグメントについて、発癌遺伝子および始 原発癌遺伝子の配列がめられ、Ｘｍａ　Ｉ制限部位から６０番目のヌクレオチド の相違で説明される単一の塩基の置換が観察された。この通常Ｃｚ　Ｇ　Ｃとし て存在するグリシン（Ｇ１ｙ１２）のためのコドンが置換され、バリンを発現す るコドンのＣＴＣ配列に変化していた。

それ故、ＥＪおよびその始原発癌遺伝子からの細胞ＤＮＡ中の特定の相違の場所 がつきとめられ、対応するｐ２１蛋白質のアミノ酸配列の相違もまた決定された 。

次に、ＤＮＡ配列内のそのような変化を検出する検定法を開発した。一つの型の 検定法では発癌遺伝子または始原発癌遺伝子の両方の部位に特有の制限酵素（し かし、他のものにはそうではない）を用い、そのＤＮＡ配列中の相違を検出する 。

これらの遺伝子により暗号化されたｐ２１蛋白質もまた異っているので、ｐ２１ 蛋白質中の変化した、または正常配列領域に、または発癌の間に生じる変化には 含まれないアミノ酸配列に特異的なポリクローナルまたはモノクローナル抗体の 如き血清学の試薬もまた発展できた。そのような血清学試薬はヒト膀胱発癌のた めの非常に感度の良い試験を提供する種々のプロトコールに用いる事ができる。

同様に、これらの検定は他の変異体対立遺伝子により起こされる野生株の対立遺 伝子の変化を検出するのに用いる事ができる。

図面の簡単な説明 図ＩＡは正常およびトランスフオーム膀胱細胞の両方から得られた総細胞ＲＮＡ の電気泳動ゲルパターンを示し、そのパターンはオートラジオグラフィーにより 視覚化した；旦すハ、ｖ−Ｈａ−μｉｓ　ｐ２１蛋白質に対するモノクローナル 抗血清を用い、ＥＪおよび正常膀胱細胞両方からの代謝的標識蛋白質溶解物の沈 降により得られた電気泳動ゲル・ｅターンを示す； 図８Ａは、ｐＥＪまたはｐＥＣでトランスフェクトした４つの細胞株からの細胞 ＤＮＡの電気泳動ゲルパターンを示す。

図２Ｂは、同一の４つのトランスフェクトした細胞株からの総ポリアデニル化Ｒ ＮＡの電気泳動ゲルパターンを示す；図２Ｃは同一の４つのトランスフェクトし た細胞株の細胞溶解物かもｐ２１蛋白質免疫沈降した電気泳動ゲルパターンを示 す； の細胞株を５００倍の倍率の位相差顕微鏡を通して得た写真である； 図４はｐＥＪまたはｐＥＣでトランスフエツトした細胞からの免疫沈降１）２１ 蛋白質の電気泳動ゲルパターンを示す；・・に示したものであり、その遺伝子組 み換え体で実施した実験のトランスフェクションおよびトランスフォーメーショ ンのデータの概要もまた含んでいる； 図６はインビトロでＥＪ発癌遺伝子クローン（ｐＥＪ）およびその相同始原発癌 遺伝子クローン（ｐＥＣ）の組み換え体でトランスフェクトした細胞から免疫沈 降したｐ２１蛋白質の移動の電気泳動ゲルパターンを示す； 図７はＥＪ、）ランスフォーミング遺伝子およびその非−トランスフォーミング 細胞相同体の分子クローンのＤＮＡ配列の比較を示しており、また各々の発現す るアミノ酸配列も示す；図８はＮａｅＩ制限酵素で切断されるＥＪおよびＥＣ遺 伝子のクローンのフラグメントの相違を示した電気泳動ゲルレバターンはトラン スフォーミング遺伝子で暗号化された蛋白質に対する抗血清を用いる検定プロト コールを示したブロックグイアグラ前（Ｃ指摘した如く、出願中の米国特許出願 第３７９，７：０号に１０ 記載されている方法により、ＥＪ膀胱癌細胞株から発癌遺伝子が単離された。発 癌遺伝子は６．６Ｋｂを含みＮＩＨ３Ｔ３マウス線維芽細胞線維上細胞ンスフ万 一ムさせる活性を持つ事が示された。ここに記載した研究はこの従来の研究の続 きであるから、この先行する出、頭巾の出頭番号第３７９．７２１号はそのため 説明的に本明細書に含まれる。

ここにおいてパ発癌遺伝子”の用語は、細胞中での発現型が細胞を正常細胞から 癌細胞へ変換する事を誘導する遺伝子配列を意味するものとして用いる。同様に 、用語゛始原発癌遺伝子′。

は正常、非癌細胞の正常ゲノム中に存在しており、適当な方法で変化させた場合 発癌遺伝子になる能力を持つ遺伝子配列を意味する。

米国特許出願第３７９．７２１号に記載されている方法で単離した完全な発癌遺 伝子クローン（ｐＥＪ）およびその正常ヒト相同体クローン（ｐＥｃ）の配列決 定は、これら２つの遺伝子の配列の単純な比較には用いられない。発癌遺伝子お よびその正常始原発癌遺伝子相対物配列は別々の個体から得られたＤＮＡ５であ るので、これらの間の多くの配列の相違はこの座位における自然に存在する単な る多形性を反映しているかもしれない。他の配列の相違は発癌の間に受ける突然 変異傷害の結果・フ・もじれず、それは機能的に不活性であり、活性化過程、に は重要性を持たない。

発癌遺伝子および始原発癌遺伝子間の有意な相違が調節の相違（（よるかどうか を決定する為、正常ヒト膀胱上皮細胞株からのｃ−ＰＬａ−ｒａｓ始原発癌遺伝 子（ＥＣ）の発現と、ＥＪでトランスフ万一ムされた膀胱細胞中の発癌遺伝子の 発現の比較を行った。用いたＨｂｌ−５膀胱上皮＠胞は、５ケ月のヒト膀胱から 得られた不活性化ＮＩＨ３Ｔ３フィーダーし・キー上で増殖させた初代組織培養 のものである。この培養細胞を新鮮ヒト膀胱組織から成長させると、遷堅的な膀 胱上皮（τ期待さ肚るいくつかの性（質を示した。それは基礎にある間質１質が なく、その結果、膀胱癌の由来した細胞に厳密に相当するものである。

総細胞ＲＮＡが正常およびトランスフオームした膀胱細胞から調製された。ホル ムアルデヒドゲル上でＲＮＡを展開し、ニトロセルロースフィルターに８ｂし、 ニック〜トランスレートシたＥＪ発癌遺伝子クローンでフィルターをプローブし 、転写ＲＮＡを分析した。用いた具体的方法は以下の如くである。

総ポリアデニル化ＲＮ１．まＶａｒｍｕ８らの技術：Ｃより調製した。

Ｖａｒｍｕｓ、　Ｈ，Ｅ、、　Ｑｕｉｎｔｒｅｌｌ、　Ｎ、および０ｒｔｉｚ、 　Ｓ、　Ｃｅ１ｌ　２５　：２３−３６（１９８１）を参照さり、たい。次に、 ４マイクログラムのＲＮＡをホルムアルデヒドゝ含有２パーセントアガロースゲ ルを通した電気泳動により分画し、ニトロセルロースへ移行させる。ニー特異プ ローブは、ｐＥＪをＢａｍＨＩで切断し、生じる断片を１パーセントアガロース を通して分１面し、６．６Ｋｂ断片をＮａＩおよびガラスピーズで抽出すること により調製した。

ニック−トランスレートしたフラグメント（６，６Ｘ　１１０７ｃｐ／マイクロ グラム）を固定ｒヒしたＲＮＡＫアニールした。Ｒｉｇｂｙ。

２ い。プローブと相同のバンドはオートラジオグラフィーにより視覚化する。分子 量は、アデノウィルスレイトプロモーターのインビトロ　ラン−オフ転写（Ｃよ り得られたマーカーとの比較尾より決定した。Ｍａｎｌｅｙ、　Ｊ、　Ｌ、らＰ ｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

ＵＳＡ　７７：　３８５５−３８５９（１９８０）を参照されたい。

図ＩＡＩ、１２つの細胞型中のｃ−Ｈａ−三二特異ＲＮＡの相対レベルを示す： レーン１、ＥＪ！：ｆＢ胞からのＲＮＡ；レーン２、Ｈｂｌ−５細胞からのＲＮ Ａ０観察される如く、同じレベルのＲＮＡが２つの培＠１剖胞で検出され、転写 されたサイズは１．２　Ｋ１：＋でルトンの質量の蛋白質（ｐ２１と名付レナら れている）である。

ＥＪ：Ｉ；よび正常膀胱細胞の両方からのｐ２１蛋白質溶解物の泳動速度を分析 する実験を行った。ｖ−Ｈａ−ｒａｓ　ｐ２１蛋白３７（（対するモノクローナ ル抗血清を用いた。Ｆｕｒｔｈ、　Ｍ、　Ｅ、、　Ｄａｖｉｓ。

免疫沈降が必要とするより過剰の抗体量を使用した事は対照実験（・こより確認 した。結果を図ＩＢに示す。

具体的には、培養細胞を１２時間３５Ｓ−メチオニンで標識した。その後１容弊 物を調製し、非免疫皿清（レーン１ａおよび２ａ）、Ｈａ、　−Ｍｕ　Ｓ　Ｖで コードされたｐ２−１を沈降させ、しがしＫｉ−ＭｕＳＶてコードされたｐ２１ は沈降させないモノクローナル抗血清（Ｙｉ３−２３８）（レーン１ｂおよび２ ｂ）またばＨａ＝ＭｕＳＶおよびＫ〕−ＭｕＳＶのｐ２１を両方検出するモノク ローナル抗血清３ （Ｙ１３−２５９）（レーンＩＣおよび２ｃ）で免疫沈降させる。

５ｈｉｈ、　Ｔ＋Ｙ、、　Ｗｅｅｋｓ、　Ｍ、○、、　Ｙｏｕｎｇ、　Ｈ，Ａ、 および５ｃｏｌｎｉｃｋ。

Ｅ、　Ｍ、　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　９６　：　６４−７９　（１９７９）を参照さ れタイ。試料当り２０Ｘ１０６ｃｐｍの溶解物を１２５パーセント５ＤＳ−７ク リルアミトゝゲルの電気泳動で分離した。

図ＩＢはＥＪ細胞クローン（レーン１、ａ−ｃ）およびＨｂｌ−５細胞（レーン ２、ａ−Ｃ）の細胞溶解物から免疫沈降したｐ２１蛋白質の比較を示す。これら のデータは正常膀胱１＠胞からの抗−ｐ２１血清により放射原職蛋白質の少くと も２つのバンドが特異的に免疫沈降した事を示す。膀胱癌細胞の蛋白質パターン の詳細な解析によりバンドの複雑な配列が明らかになった：近い間隔の２重バン ドが２対。ｐ２１バンドの強度を非特異的に沈降させたバックグラワンドゝのバ ンドの強度の比較により、正常Ｓよび癌削胞のｐ２］蛋白質は同程度の計存在す る事が明らかとなった。

上記のデータは転写の活発化がＥＪ発癌遺伝子により示される新しい活を生の原 因ではない事を示している。この結論は用いたハイプリグイゼーノヨンの灸訃下 、発癌遺伝子プローブがヒトｃ−Ｈａ−ｒａｓ遺伝子の転写物に独占的に反応す るという事実に一部依存している。蛋白質のデータの解釈はあまり明確ではない が、両方の細胞がＨａｒｖｅｙ　−！Ｉ′ｔ−異血清に反１Ｌ性のある同しよう な量の蛋白質を持ち、これらの蛋白質は集合的にｐ２１″′と称される事は明ら かである。

膀胱上皮細胞が膀胱癌細胞の正常前駆体の代表ではないとい１４ トランスフォーメーションを誘導する事なく高い水準で発現され、第２の細胞種 に１６いて不適当に発現される場合にのみこの表現型を達成する可能性があるの で、上記可能性は解釈を難がしくする。それ故、２つの遺伝子を同じ細胞のバッ クグラワンド下において転写および翻訳の程度を測定した。

両方の遺伝子の分子クローンをＮＩＨ３Ｔ３細胞に導入した。

ＥＪ発癌遺伝子を獲得したコロニーは容易にそのトランスフオームした形態から 同定される。しかしながら、正常対立遺伝子のクローンを獲得した細胞は、挙動 上の明瞭な変化による同定をすることができない。

この為、優性で選択できるＥｃｏｇｐｔ遺伝子のクローンを１０倍過剰量のクロ ーン化ＥＪ発癌遺伝子またはクロン化始原発癌遺伝子（ｐＥＣ）と−緒にＮＩＨ ３Ｔ３細胞にトランスフェクトした。特に２×１０６細胞当り、７５マイクログ ラムのＮＩＨ３Ｔ３キャリアＤＮＡ、５００ｎｇのｐＥＪまたはｐＥｃ　ＤＮＡ 、および５０ｎ７のｐｓＶＺｇｐｔを用い、既知の技術を用いトランスフェクシ ョンを実施した。Ｇｒａｈａｍ、　Ｆ、　Ｌ、およびＶａｒ＋　ｄｅｒ　Ｅｂ、 　Ａ、　Ｊ。

Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　５２：　４５６−４７１（１９７３）　；およびＡｎｄｅｒ ｓｓｏｎ。

Ｐ、、　Ｃｏ１ａｆａｒｂ、　Ｍ、　Ｐ、およびＷｅｊｎｂｅｒｇ、　Ｒ，Ａ、 　Ｃｅ１ｌ　１６　：　６３−７５（１９７９）を参照されたい。各々の場合、 Ｅｃｏｇｐｔ；遺伝子により与えられるミコフェノール酸への抵抗性でコロニー を選択ＵＳＡ　７３：　２０７２−２０７６　（１９８１）を参、照されたい。

非運がセグメントの導入が選択可能遺伝子との共トランスフェクションにより確 められるのでこの戦略を用いた。Ｗｉｇｌｅｒ。

Ｍ、らＣｅ１１４６：　７７７−７８５（１，９７９）を参照されたい。この例 では、ＥｃｏｇｐｔおよびｐＥＪの共トランスフェクションにより誘導すれる７ ５パーセントのミコフェノール酸耐性コロニーが形態的にトランスフオームして いる事が観察された：予期した通り、ｐＥＣによる共トランスフェクション後現 われろコロニーはトランスフオームしていなう１つだ。

両方の種類のコロニーの細胞ＤＮＡをｐＥＣまたはｐ、　Ｅ　Ｊ配列が存在する か否かのために分析した。クローン化発癌遺伝子または始原発癌遺伝子の各々の 無傷のコピーから６．６Ｋｂフラグメントを遊離する事が期待されるエンドゝヌ クレアーゼＢａｍＨＩで各々のＤＮＡＩＱマイクログラムを消化した。消化され たＤＮＡは１パーセントアガロースゲルを通して分画し、ニトロセルロース−ぐ −・ξ−に移す。５Ｘ１０６ｃｐｍのニー特異プローブ（＠に記載したものと同 じ）をフィルターに結合したＤＮＡとインキュベートする。結果は図２Ａに示し てありレーンは：レーン１、ＮＩＨ３Ｔ３　ＤＮＡ；レーン２および３、ｐＥＪ でトランスフェクトした細胞株からのＤＮＡ：　ＥＪ／Ｇｐｔ−２ｔ２）および ＥＪ／Ｇｐｔ　−３（３）　ｙレーン４および５、ｐＥＣでトランスフェクトし た細胞株からのＤＮＡ　：　ＥＣ／Ｇｐｔ　−１’４）およびＥＣ：／Ｇｐｔ− ５・：５）。

正常マウスｒａｓ遺伝子相同体はｐＥＪプローブと非常に弱くハイブリダイズす る。Ｐａｒａｄａ、　Ｌ、　Ｆ、、Ｔａ、ｂｉｎ、　Ｇ、　Ｊ、、　５ｈｉｈ。

Ｃ０およびＷｅｉｎｂｅｒｇ、　Ｒ，Ａ、　Ｎａｔｕｒｅ　２９７　：　４７４ −４７９　（１９８２）を参照されたい。従って、その存在・は結果に不鮮明さ をもたらさない。トランスフェクションたｐＢＲ３２２配列がデータの解釈６ す、プローブとして使用した。始原発癌遺伝子でトランスフェクトされた非トラ ンスフオームコロニーの７５係およびトランスフオームした発癌遺伝子でトラン スフェクトされたコロニーの全てが、６．６Ｋｂの泳動部にｐＥＪ−相同体配列 の存在を示した。

陽性のコロニーはまたプローブにアニールされた他のサイズのＢａｍＨＩフラグ メントを持つ。これらはトランスフェクション過程の間に分解したクローンのコ ピーである。

発癌遺伝子の無傷のコピーを含有する２つの細胞株および始原発癌遺伝子の無傷 のコピーと殆んど等しいものを含有する２つの細胞株を更に別の分析の為に選択 する。図３　ｉｃ　５０　Ｑ　Ｘの倍率での位相差顕微鏡で撮ったこれらの細胞 株の写真を示した。

ｐＥＪでトランスフェクトした細胞株はコンフルエントの状態（ＥＪ／Ｇｐｔ− ２，写真３Ａ）およびサブコンフルエント（ＥＪ／Ｇｐｔ−３，写真３Ｂ）で示 しである。ｐＥＣでトランスフェクトした細胞株もまたコンフルエン）　（ＥＣ ／Ｇ　ｐｔ　−５−写真３Ｇ）およびザブコンフルエン）　（ＥＣ／Ｇｐｔ　− Ｌ写真３Ｄ）で示しである。

細胞総ＲＮＡをすべてのトランスフェクトした細胞株から調製する。次いで、Ｒ ＮＡ調製物をホルムアルデヒドゲル上で泳ｉａＬ、ニトロセルロースフィルター に移し、ヱー特１ＤＮＡでプローブした。前に記載した方法を用い、結果を図２ Ｂに示した（図中のレーン（Ｃおいて：レーン１．ＮＩ’Ｈ３Ｔ３細胞ρ）らの ＲＮＡ；レーン２．　Ｅ　Ｊ、、／Ｇｐｔ　−２細月包；し′−ン３．ＥＪ／Ｇ ｐｔ−’３細バ包；レーン４．ＥＣ／Ｇｐｔ−１細戸包；レーンｓ、ＥＣ／Ｇｐ ｔ−５細胞）。

これらの細胞中のｐ２１のレベルもまた試、験した。細胞溶解７ 物を調製し、免疫沈降させ、前に記載した方法で分析した。結果を図２Ｇに示し た：非−免疫血清（レーン１．２．７．８　）またはＨａ　−ＭｕＳＶ　ｐ２１ を沈降させるモノクローナル抗血清（Ｙ１３−２３８）　（レーン３−６）を用 いて免疫沈降した。細胞溶解物ばＥＪ／Ｇｐｔ−２（レーン１．３　）　；　Ｅ ＣＭ、／Ｇｐｔ　−１（レーン２，４．）；ＥＪ・弓ｐｔ−３Ｃレーン５，７） およびＥＣ／Ｇｐｔ　−５（レーン６．８）から調製した。観察される如く、ｐ ２１に対する。モノクローナル血清はｐＥＣおよびｐＥＪ　トランスフェクト細 胞中の同量のｐ２１蛋白質を沈降させる。

これらのデータは、これら特定のｐ、ＥＪトランスフェクト細胞中で、獲得され たｐＥＪのコピーの一部のもののみが活性であり、一方で他の細胞中のトランス フェクトされたｐ　Ｅ　Ｇ遺伝子の全てのコピーが活団である可能性も形式上は 否定できないので、細胞中で２つのクローンｒヒ遺伝子が同じ速度で転写される かどうかという質問だ完全に答えるわけではない。そのような場合、壊察される 蛋白質またはＦｆＮＡの同じようなレベルが正確に２つの遺伝子の固有の転写活 性を反茨（−ているわけではない。

しかしながら、一つの点は明確になつ１こ：Ｅ　Ｊ　−％定ｐ２１　ノアルレベ ルでトランスフ万一メーゾヨンが誘導さ、？ｔ１一方１同じレベルの始原発ｍ遺 伝子−特定のｐ２］は細胞の表現型に影響を及ぼさない。ｐ２］蛋白質はこれら の遺伝子で暗号さイするたた１つの明らかな遺伝子産物てちるのて、ＥＪ発癌遺 伝子および始原発癌遺伝子間の機能の相違はｐ２］蛋白質中の調造変化１（誘導 されるに違いないと結論される。反対］８ （て、調節的変化は発癌遺伝子のトランスフオーム化活性に決定的でないように 思われる。

このため、以前に検出されていた異った細胞からのｐ２１蛋白質の移動速度の僅 かな変化（図１ｂおよび２ｃ）に新たな重要性が与えられる。それ故、ｐ２１蛋 白質を移動の相違がより容易に分離できるような条件下で再分析した。結果を図 ４に示した。詳細には、細胞を３時間３５３−メチオニンで代謝的に標識する： 細胞溶解物を調製し、免疫沈降させ、前に記載した如く分析する。細胞株ＥＪ／ Ｇｐｔ−３（レーン１，３）および細胞株ＥＣ、／Ｇｐｔ　−１，（レーン２， ４）からの溶解物をモノクローナル抗ｐ２１抗血清Ｙ１３−２３８（レーン１． ２）または非免疫血清（レーン３゜４）で沈降させる。模式的泳動図（レーン５ 　：　ＥＪ／Ｇｐｔ　−３；レーン６　：　ＥＣ／Ｇｐｔ−１）に動力学的デー タおよび以前（で公表された実験に基づいての検出されたｐ２１バンドの相対的 位置およびこれらのバンドの関係（矢印）の両方を示Ｉ−た。５ｈｉｈ。

Ｔ、　Ｙ、らＪ、Ｖｉｒｏｌ、４２：　２５３−２６１（１９８２）を参照され たい。

図４のデータはｐＥＪおよびｐＥＣでトランスフェクトされたものでは各々ｐ２ １の２つのバンドが現われる事を示している。

より高い分子量のｐＥＪトランスフエク）ｐ２１蛋白質はより高い分子量のｐＥ Ｃトランスフェクト蛋白質よりゆっくりと移動し、より低い分子量のｐＥＪトラ ンスフェクトｐ２１；まより低い。

分子量のｐＥＣＥＣトランスフエフトル２りより（りつ（り移動した。各々の場 合よりゆっくり移動するバンドばより急速に移動するバンドの動力学的前、…体 の如く行動した。ｖ−Ｈａ−ｒａｓのｐ２１蛋白質についての相当する従来デー タは、高分子量側のバンドは翻訳後に切断を受けて低分子量側のより速く移動す るバンドに変ることを示している。５ｈｉｈ　Ｔ、　Ｙ、らＪ、　ＶｉｒｏＩ４ ２　：２５３−２６１（１９８２）を参照されたい。

これらｐ２１蛋白質は全部少しもリン酸化されていないと思われるので、ｐＥＪ およびｐＥＣ蛋白質間の移動速度の相違にはアミノ酸の数まｆ暑まコンホメーシ ョンの変化が寄与する可能性が最も高い。

図４のデータＳよび模式図は正常およびトランスフ万一ムした膀胱細胞で観察さ れるｐ２１蛋白質の複雑さく図１ｂ）の説明を提供する：正常細胞は始原発癌遺 伝子の発現による２つのバンドを示し；癌細胞は４つのバンドを示すように思わ れ、２つはこれらの細胞の発癌遺伝子により特定され、２つは他の相同染色体の 正常始原発癌遺伝子による。

発癌遺伝子および始原発癌遺伝子からのｐ２１２１蛋白質観察される物理的相違 は、ｐ２１蛋白質における機能的に重要な変化を反映するか、またはそうではな く、トランスフォーメーションの過程に影響を及；ぼさない相違を反映している 可能性もある。これを決定する為、蛋白質の移動速度の変ｆヒを支配し、遺伝子 機能の変化を起こすような発癌遺伝子の遺伝子領域をつきとめるための一連の独 立した実験を計画した。これらの実験はインビトロでの２つの遺伝子のクローン 間の相同的＋ＩＪ１換えに基づ（ものである。

実検の原理は、発癌遺伝子クローン（ｐＥＪ）から制限フラグメントを取り出し 、これを用いて始原発癌遺伝子クローン（ｐＥＣ）０ の相同部分と置き換えることである。同時に、始原発癌遺伝子クローンのフラグ メントを発癌遺伝子クローン中にスプライシングし、逆の組み変えも実施する。

これらの組み換え構成物のトランスフオーム活性をトランスフェクション検定で Ｅ％Ｊｊる。

検定は発癌遺伝子のフラグメントを始原発癌遺伝子クローン中に組込んだときト ランスフオーム活性を発揮し、反対：・こ、逆の組換えにおいて、対応する始原 発癌遺伝子フラグメントを発癌遺伝子クローン中に挿入した場合活性を喪失する 事を測定する。

図５に実施した特定の構成のダイヤグラムおよび得られたトランスフェクション およびトランスフォーメーションのデータを示した。

図５の制限地図は、１）ＢＲ３２２ｉｌこ挿入した５６Ｋｂ　Ｂａ、ｍＨ工断片 内の種々の酵素に対する切断部位を示した。明瞭に４定されていない幾つかの他 の部位にも作用するＸｒｎａ　丁を除いて、酵素に対する全ての特異的部位を示 した。１３ｓｔＥ　ＩＩの最初の部位とＫｐｎ１部位との間のＸｍａ１部位のみ を示した。地図上の黒く塗りつぶした箱型部分は暗号付けしているエフノンの場 所を示している。

図５において、ｐＥＪから誘導されたセグメントを塗りつぶした帯として、ｐＥ Ｃかものセグメントを白抜帯としてＩ）ＥＪ／ｐＥＣキメラを示した。各々の示 したフラグメントを得るために必嘔とされる完全または部分消化によって、示し た酵素てｐＥＪ＠ｄよびｐＥＣを切断する。生成物を１２パーセントアガロース を通す電気泳動により分離し、Ｎ訂を溶融して溶離させ、ガラスピーズ：ｆＣ吸 着させる。ｐＢＲ３２２を含むフラグメントを子牛腸ホスファターゼで処理する 。図５・ンて示したフラグメントは酵素Ｔ４−ＤＮＡＩＪガーゼによりまには酵 素を用いないモノク連結で結合した。ａ−Ｂの構成は２分子の連結で行った。ｆ の構成は同時（（３つのフラグメントを混合し、ｇおよび）１においては同時に ４つのフラグメントを混合ニーた。連結混合物は直接大腸菌のＨＢＩＯＩ味中ヘ トランスフオームした。モック連結からのコロニーが連結の２パーセント以下で あるようなコロニーについて、適当な制限地図を持つコロニーの存在を分析した 。

各々のクローンの２０１］ｆでＮ工Ｈ３Ｔ３細胞を前に記載した如くトランスフ ェクトし、１０−１４日でフォーカスカー見えてくるまで選別せずに保持（−だ 。トランスフェクションの結果は図５の第１欄に示した。第２欄はスクリーンさ れ、その後ＮＩＨ３Ｔ３細胞にトランスフェクトされた独立したバクテリアコロ ニーの数を示している。

トランスフオーム活性のあるクローンは、ｐＥＪ：ｔｇよひＩ）ＥＣの一方また は他方から由来する夾雑物によるものでｒく、ｐＥＪおよびｐＥＣの結合物由来 のモメラであることを立証することが重要でちる。これは３つの方法で行った。

２つの７ラグメントを同時（て連結するより単純な構成：て名いては、増幅さ７ ｔた組換えクローンにより得られた結果は、連結反応での来増幅生成物およびリ ガーゼで処理されていない単流されたフラグメン１、を含むモノク連結での未増 幅生成′吻を直接トランスフェクトする事により立証される。第２の確証は、そ れぞれの細胞遺伝子を含むプラスミドｐ　Ｅ　Ｊ　ＪｖよひｐＥＧは、ｐＢＲ３ ２２プラスミド゛ベクターに反対方向罠挿入されるという事実に開存している。

２２ それ故、組み換え遺伝子の一つの両親の起源はフランキングプラスミド領域の特 徴的制限消化により決定される。ｐＥｃの混在はそれ自体では為両回の結果を与 え得ないので、始原発癌遺伝子フランキング配列を持つ活性クローンはトランス フオーム活性の遺伝子部分を得た結果生じたに違いない。最後に、その結果は連 結反応から得られる幾つかの独立したクローンで確認された。

図５に観察される如く、３５０ヌクレオチド８の長さの遺伝子領域が発癌遺伝子 から始原発癌遺伝子の対応する領域に移された時、後者に活性を与える事が最終 的に同定された。この領域はＸｍａ　エンドヌクレアーゼの最初の部位がらＫｐ ｎＩ部位に拡がっている。この領域の５５パーセントは暗号付けしている最初の エクソンであり、１０パーセントはエクソンへの５′であり、３５パーセントは 最初のイントロンの一部である。

先行実験は発癌遺伝子および始原発癌遺伝子で暗号付（すされたｐ２１蛋白質の 移動の相違を同定した。今、トランスフオーム化障害を含む短い領域の遺伝子が 決定された。従って、この領域がまた蛋白質を変化させる特異性を持っているか どうかを確める事が重要になってきた。それ故、±ｙｅ五二で組み換えた生成物 でトランスフェクトした細胞の免疫沈降を行った。

ＮＩＨ３Ｔ３細胞をＥＪ膀胱癌発癌遺伝子、その正常始原発癌遺伝子、または２ つの遺伝子間の組換え体でトランスフ万一ムし、まず生物学的に０３５パーセン ト寒天甲でクローン化し、その後１８時間３５３−メチオニンで代謝的に標識し た。溶解物を調製し、Ｈａ−ＭｕＳＶで暗号付げされたｐ２１を検出し、Ｋ１− ２３１、ＦＳＢａ６０−５０［１００２（８））、４ｕＳＶで暗号付けされたｐ ２１は検出しないモノクローナル抗体（Ｙ１３−１７２）で免疫沈降する（ＴＣ Ａ−沈澱可能物のカウントは５Ｘ１０６ｃｐｍ）。Ｆｕｒｔｈ、Ｍ、Ｅ、、Ｄａ ｖｉ、ｄ、Ｌ、Ｊ、、Ｆｌｅｕｒｄｅｌｙｓ。

Ｂ、および５ｃｏｌｎｉｃｋ、　Ｅ、　Ｍ、　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、、　４３：　 ２９４−ｖ３０４（１９８２）；巧よび５ｈｉｈ、　Ｔ、　Ｙ、、　Ｗｅｅｋｓ 、　Ｍ、　０．、　Ｙｏｕｎｇ、　Ｈ，Ａ。

および５ｃｏｌｎｉｃｋ、　Ｅ、　Ｍ、　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　９６　：　６４− ’７９（１９７９）を参照されたい。溶解した免疫沈降物は、次に１２パーセン ）ＳＤＳ−ホリアクリルアミドゲルで分離する。その結果を図６に示す：レーン １−７ａ、抗体なし；レーン１−７Ｊ抗Ｈａｒｖｅｙ　ｐ２１　モノクローナル 抗体。細胞溶解物ば：　ＮＩＨ３Ｔ３細胞（レーン１）；始原発癌遺伝子［：　 Ｐａｙｎｅ、　Ｇ、　Ｓ、、　Ｃｏｕｒｔｎｅｉｄｇｅ、　ｓ、　Ａ、、　Ｃｒ １ｔｔ−ｅｎｄｏｎ、　Ｌ、　Ｂ、、　Ｆａｄｌｙ、　Ａ、　Ｍ、、　Ｂ１５ｈ ｏｐ、　Ｊ、　Ｍ、およびＶａｒｍｕｓ。

Ｈ，Ｅ、Ｃｅ１１２３：　３１１−３２２（１９８１）に記載されているＬＴＲ −活性ｒｂ３Ｋｂ　Ｓａｃ　Ｉフラグメント〕でトランスフェクトサれた細胞（ レーン２）；ＥＪ発癌遺伝子（ｐＢＦｌ中の６６Ｋｂフラグメント）でトランス フオームされたクローン５０４−１７（レーン３）；始原発癌遺伝子ＩＫｂＳａ ｃｌフラグメントをＥＪ発癌遺伝子３ＫｂＳａｃｌフラグメンＩ・に連結したも のでトランス７２ｒ−ムされたクローン５１１−７４（レーン４）；ＥＪ発癌遺 伝子のＸ）１．０１部位から第２のＢｓｔＥ　■部位に拡がるフラグメントを相 同フラグメントが除去された始原発癌遺伝子のクローンに連結したものでトラン スフオームしたクローン５１０−９および５　］−０−１３（レーン５．６）； 充よびＫｐｎ１部位の左側のＥＪ発癌遺伝子をこの部位の右側の始原発癌遺伝子 に連結したものでトランスフオームしたクローン５０８−８　（し〜ン７）。

図６に観察される如く、Ｘｈｏ−ＢｓｔＥｌ［、Ｓａｃ　Ｉ　−８ａｃ　Ｉ、お よびＢｓ　ｔ　Ｅ　ＩＩ−Ｋｐｎ１組換え体でトランスフェクトされた細胞から の溶解物に含まれる蛋白質はすべてＥＪ蛋白質と一緒に９動し、ＥＣ蛋白質から のものと異った移動度であった。培養物を１８時間標識すると、より低い分子量 の形のｐ２１が高いレベルで標識され、動力学的に不安定なより高い分子量の形 へ標識された量は検出不能であった。得られたデータから、発癌遺伝子（でよる トランスフォーメーションの表現型および電気泳動移動の分離環化には関連があ り、およびこの２つはＤＮＡの同じ３５０ｎｔ（ヌクレオチド）セグメントで暗 号されていると結論される。変化した移動速度は機能的に重要な蛋白質の変化を 反映しているのではないかと考えられる。

短い（３５０Ｋｂ）フラグメントが生物的意味を持っている事が示されたので発 癌遺伝子および始原発癌遺伝子からのＤ　Ｎ　Ａの配列を決めた。５ｓｉｆらの 前後ジデオキシＤＮＡ配列決定方法およびＭａｘａｍおよびＧ１１ｂｅｒｔの化 学的方法で配列を決定した。５ｅｉｆ、　１．、　Ｋｈｏｕｒｙ、　Ｇ、および Ｄｈａｒ、　Ｒ，Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ。

８　：２２２５２２３８　（１９８０）　；およびＭａｘａｍ、　Ａ、　Ｈ，お よびＧ１１ｂｅｒｔ、　ｗ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、 　ＵＳＡ　７４　：　５６０−５６４（１９７７）を参照されたい。結果を図７ に示した、図中暗号付けＤＮＡストランドを相当するアミノ酸配列と滲に示しで ある。

ＥＪと始原発癌遺伝子とは、コト゛ンおよびアミノ酸の双方が異なることが示さ れている。

図７に観察される如く、既知の最初のエクソンのｐ２１暗号付は領域中（特にＸ ｍａ切断部位から６０番目のヌクレオチド゛）５ に２つのＤＮＡセグメント間の唯一の相違があった。それは正常ラットおよびヒ トｃ　−Ｈａ−ｒａｓ遺伝子においてグリシンを暗号化するトリプレットに起こ っている。ＥＪ発癌遺伝子に観察される配列はバリンを暗号化している。それ故 、この変化はｐ２１蛋白質の機能の変化およびＥＪ膀胱癌で起こるｃ　−Ｈａ− ｒａｓ遺伝子の発癌遺伝子活性化に対応する。

この唯一の塩基変化の結果、２つの異った部位−特異性エンドヌクレアーゼの切 断部位が変化する。始原発癌遺伝子にはＧＣＣＧＧＧ配列が現れ、これがエンド ヌクレアーゼＮａｅｌの認識部位となる。この配列はまたエンドヌクレアーゼＨ ｐａｌの認識部（ＱＣＣＣＧも含んでいる。これら両方が発癌遺伝子では変化す る。何故ならば、相当領域の配列がＧＣＣＧＴＣになっているからである。

Ｎａｅ　ｌエンドヌクレアーゼを個々に用い２つの配列の間の相違を立証する。

ＮａｅｌはＨｐａＪよりＤＮＡを頻繁に切ｊ析しないのでＨｐａ　ｌの代りにＮ ａｅ　［を用いた。期待される如く、ｐＥＣクローンの挿入断片はｐＥＪ相対物 より１つ多い切断部位を示す。この事はまたヱｙｅムｏ組換えクローンの遡及検 定を提供する。

トランスフ万一メージョンおよび異常なｐ２］啓動を指令する対立遺伝子は、こ の都立でのＮａｅ■切断を許さない対立ａ嵌子と正確に同一視される。

図８はＥＪ発癌遺伝子およびその対応する始原発癌じ■成子のＮａｅ　Ｉ　ｆｊ ｌｌ限酵素検定の結果を示す。記載した方法ｉＬ′Ｃより、始原発癌遺伝子には Ｎａｅｌ制限゛部位が存在し、発癌遺伝子ｉＣより生じる変化でそれが消失して いる事か決定された。発癌遺云子２６ （ｐＥＪ）および始原発癌遺伝子（ｐＥｃ）および各々がクローン化されている プラスミド簀ｐＢＲ３２２）の分子クローンを既知の方法で各々純化する。各々 １マイクログラムを酵素ＮａｅＩにて切断し、生じるフラグメントを１５パーセ ントビス−アクリルアミドゲルを通しての電気泳動により分離する。ゲルは色素 エチジウムプロミドを入れる事により染色し、紫外線下に写真撮影した。

図８のレーンは次の通りであるニレ−７１は既知のサイズのパン［パを産生ずる マーカーレーンとしてφＸ１７４ＤＮＡを酵素ＨａｅｌＩＩで切断；Ｌ／−７２ はｐＢＲ３２２をＮａｅｌで切断し、プラスミドゝベクター由来のフラグメント を示し；レーン３はｐＥＪＤＮＡをＮａｅｌで切断；２よび、レーン４はｐＥｃ 　ＤＮＡをＮａｅ　１で切断。

ｐＥＪ　ＤＮＡには分子量１２００塩基対と同じ移動をするバンドが含まれるが 、それはｐＥＣレーンでは消失している。しかしながら、ｐＥＣレーンは２つの 余分のパン［゛があり、１つは４００塩基であり、そして他方は８００塩基の長 さであり、それはｐＥＪレーンでは消失している。このように、ｐＥｃ中のＮａ ｅ１部位（１２００ｂｐバントゝを４００および８００塩基の２つの〕Ｓンドに 切断する事を許す）はＥＪ発癌遺伝子の創造により失なわれる。

ｐ２１蛋白質ににニー１−るバリンのグリシンへの羊純な置換では、ｐ２１蛋白 質の機能面にどけるそのような重大な変化が起こるとは考え難いかも知れない。

それにも拘わらず、幾つ０・の考察によ扛ば、この構造変［ヒンては重要性があ るように思われる。その第１の根拠は、ヒ）　ｃ−Ｈａ−ｒａｓ遺伝子、ラット ｃ−Ｈａ−ｒａｓ遺伝子およびＨａｒｙｓｙ肉腫ウィルスのｖ−Ｈａ−ｒａ、ｓ 発癌潰伝子で暗号化されたｐ２１のこの領域の比較から生じる。上記２つの細胞 遺伝子の第１のエクソンで暗号化された３７残基のアミノ酸配列は同一であり、 この領域の偉人な進化の保存を示している。しかしながら、Ｈａｒｖｅｙ肉腫ウ ィルス発つ遺伝子の分析でラットの遺伝子とこの領域でただ一つの位置が異って いる事が明らかｊ（なり、それはＥＪ発癌遺伝子で変化していたものと正確同じ 残基がグリシンからアルギニンに変換していた。従ってこの決定的残基の変化は そのラット細胞前駆体からのｖ−Ｈａ−ｒａｓ遺伝子の活性化および正常ヒト相 対物からのＥＪ膀胱発癌遺伝子の活性化の両方に重要だと推測される。同様の変 化が二遺伝子ファミＩＪ−の他のメンバーのＫｉｒｓｔｅｎネズミ肉腫のＶ−に １−＝遺伝子の発癌遺伝子活性化においても重要である。

Ｋｉｒｓｔｅｎ　）ランスフ万一ム活性遺伝子は非常１ｃ　ｖ　−Ｈａ　−ｒａ ｓ遺伝子：テ類似している。Ｄｈａｒ、　Ｒ，、Ｅｌｌｉｓ、　Ｒ，Ｗ、、　５ ｈｉｈ、　’ｒ、　ｙ、。

○ｒｏｓｚｌａｎ、　Ｓ、、　５ｈａｐｉｒｏ、　Ｂ、、　Ｍａｉｚｅｌ、、　 Ｊ、、　Ｌｏｗｙ、　Ｄ、　Ｒ，および５ｃｏｌｎｊ、ｃｋ、　Ｅ、　Ｍ、　５ ｃｉｅｎｃｅ　２１７：　９３４−９３６（１９８２）を参照されたい。ｖ　− Ｋｉ　−ｒａｓのｐ２１およびｖ　−Ｈａ−ｒａｓのｐ２１間の唯一の相違：ま 最初の３６アミノ酸の１２番目でありＫｊ、ｒ　Ｓ　ｔｅｎにおける残基はセリ ンである。Ｔｓｕｃｈｉｄａ、　Ｎ、、　Ｒｙｄｅｒ、　Ｔ、および０ｈｔｓｕ ｂｏ、　Ｅ、　５ｃｉｅｎｃｅ　２１７　：　９３７−９３９（１９８２）を参 照されたい。これはＥＪおよびＨａｒｖｅｙ肉腫ウィルスが暗号化したｐ２１に ２６ける変化と正確に同じ部位である。ｖ−Ｋｉ−ｒａｓ８ 発癌遺伝子の活性化には１２番目のグリシンの他の新しいアミノ酸残基への変換 が含まれている事が推測されている。

前記推測の第２の根拠は、観察された特定のアミノ酸変化の側鎖を欠いているの で２０のアミノ酸の中では池と異なる構造の代表である。その結果、ポリハプチ ド鎖は極端におれたり、たたみ込まれる事を可能ならしめ、アルファーヘソック スの破壊に最も関与する。Ｃａｎｔｏｒ、　Ｇ、　Ｒ，およびＳｃｈｉｍｍｅｌ 、　Ｐ、　Ｒ。

Ｂｉ、ｏｐｈｙｓｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　Ｖｏｗ、Ｉ、　ｐ　３０３ ．　Ｗ、　Ｈ，Ｆｒｅｅｍａｎａｎｄ　Ｃｏ、、　Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ （１９８０）を参照された℃１゜それ故、バリンまたはアルギニンによるグリシ ンの置換は蛋白質の局部的立体化学に急激な変化を示す。

１２番目の残基のグリシンの消失はｐ２１蛋白質の必須な領域の有意な変化を示 す事が信じられている。その第１の結果として、この変化は蛋白質のコンホメー ションのずれを起こし、それが更にｐ２１蛋白質の異常な電気泳動の移動や生合 成の変化につながる。第２のより重大な結果として、ｐ２１蛋白質の機能に対す る重大な影響が生ずる。この変化がｐ２１と細胞標的との相互作用に影響するの はありそうな事でちる。他の嚇−のアミノ酸変化が細胞および生体生理学に絶大 な効果を示した先例が存在する。これらの内最もよく知られているのは鎌状赤血 球圭侯群であり、それはグルタミンのバリンへの変換が赤血球内のヘモグロビン の溶罫俳に影響を及、・了している。

ここに記載した発見は、発癌：Ｃおいてかなめとなる出来事と９ しての過剰調節を示す一連の最近の実験に反駁するように思える。そのような実 験には、鳥類のレトロウィルスの白血病誘発の間にｍｙｃ始原発癌遺伝子の活性 化［：Ｎｅｅｌ、　Ｂ、　Ｇ、、　Ｈａｙｗａｒｄ−。

Ｗ、　Ｓ、、　Ｒｏｂｉｎｓｏｎ、　Ｈ，Ｌ、、　Ｆａｎｇ、　Ｊ、およびＡｓ ｔｒｉｎ、　ｓ、　％。

Ｃｅ１１２３：　３２３−３３４（１９８１）　：およびＰａｙｎｅ、　Ｃｒ、 　Ｓ、、　Ｃｏｕｒｔ−ｎｅｉａｇｅ、　Ｓ、　Ａ、、　Ｃｒ１ｔｔｅｎｄ、ｏ ｎ、　Ｌ、　Ｂ、、　Ｆａａｌｙ、　Ａ−Ｍ、、　Ｂ１５ｈｏｐ。

Ｊ、　Ｍ、およびＶａｒｍｕｅ、　Ｈ，Ｅ、　Ｃｅ１１２３：　３１１−３２２ （１９８１）を参照されたい〕；およびレトロウィルスのＬＴＲプロモーターお よび細胞始原発癌遺伝子のヱ臣旦二での融合でトランスフオーム活性遺伝子が生 ずることの実証１：　ＤｅＦｅｏ、　Ｄ、。

Ｇ、）ｎｄａ、　Ｍ、　Ａ、、　Ｙｏｕｎｇ、　Ｈ，Ａ、、　Ｃｈａ、ｎｇ、　 Ｅ、　Ｈ，、Ｌｏｗｙ、　Ｄ、　Ｒ，。

５ｃｏｌｎｉｃｋ、　Ｅ、　Ｍ、およびＥｌｌｉｓ、　Ｒ，Ｗ、　Ｐｒｏｃ、　 Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ　ＵＳＡ　７８：　３３２８−３３３２（１９８１）　；　Ｂｌａｉ、ｒ 、　Ｄ、　Ｇ、。

０ｓｋａｒｓｓｏｎ、　Ｍ、、、　ｗｏｏｄ、、　’ｒ、　Ｃｒ、、　ＭｃＣｌ ｅｍｅｎｔｓ、　Ｗ、　Ｌ、、　Ｆｊ、ｓｃｈｉｎｇｅｒ。

Ｐ、　Ｊ、およびＶａｎｄ、ｅｗｏｕｄ、ｅ、　Ｇ、　Ｓｃｉ、ｅｎｃｅ　２１ ２　：　９４１−９４３（１９８１）；：ｒ、、−よびＣｈａｎｇｅ、　Ｅ、　 Ｊ、、　Ｆｕｒｔｈ、　Ｍ、　Ｅ、、　５ｃｏｌｎｉｃｋ。

Ｅ、　Ｍ、およびＬｏｗｙ、　Ｄ、　Ｒ，Ｎａｔｕｒｅ　２９７：　４７９−４ ８３（１９８２）を参照されたい〕がある。これらの後者の結果はその幾つかは ラットおよびヒ）　ｃ−Ｈａ−ｒａｓ始原発癌遺伝子のクローンの活性化を実証 しているので特：（密凄な関係がある。これらのＣ−Ｈａ−ｒａｓ遺伝子の蛋白 質暗号化配列がこれらウィルス−１細胞ギメラ構成の間に構造的変化を受ける事 は考え：（＜い。むしろ始原発癌遺伝子およびそのＬＴＲ−活ｊ生化相対吻の唯 一の本質的相違は発現の速度（（ある事は明らかである。この事は工始原発卒遺 成子は第２の独立した機構てｌ和牛化できる事を意味３０ し、その機構も原理的に不明、！＋ｌｌ書に記載した機構と同様に発癌遺伝子形 成に重要である。

他の癌の発癌遺伝子もまた辿るとニー遺伝子である。特に結腸および肺癌は細胞 Ｋｉ　−ｒａｓ遺伝子の活圀化による発癌遺伝子を有している事が観察されてい る。Ｄｅｒ、　Ｃ，、Ｋｒｏｎｔｉｒｉｓ、　Ｔ。

３６３７−３６４０（１９８０）を参照されたい。それ故、多くのこれらの発癌 遺伝子の活性化もまた前に報告さハているものと同様に構造的変化に依存するよ うである。

前に記載した如く、ＥＪ発癌遺伝子中のＧ１ｙ１２のコドンの変化は、発癌遺伝 子に２けるこのコドンの変化により超こされる発癌またシまトランスフオーメー シヨンの簡単な診断用検定法を可能にする。発癌またシま関連する過程の間に起 こったＧ］、ｙ１２コトゝンのどんな突然変異もＮａｅしυよびＨｐａｌエンド ゝヌクレアーゼの切断認識部位を変化させ、発癌遺伝子の変化したＤＮＡはこの 部位での切断に抵抗するようになる。それ故、これらのエンド９ヌクレアーゼ： （よるこの部位（ＣおけるＤＮＡの切断され易さの試験は、始原発癌遺伝子のこ の領域の突然変異変化の特徴的な試験となる。

この試険は、目的のＤＮＡを例えばＮａｅ■で処理し、生じるフラグメントをア ガロースゲル電気泳動により分離し、硝酸セルロースのフィルターに分離したフ ラグメントを移し、配列特異性の放射１されたプローブとフィルター・をイン千 ユベートし、続いてラジオオートグラフィーにより移さｎたフラグメントを検出 する。方法はよく知ら、ｌｔているものである。５ｏｕｔｈｅｒｎ。

３１１ン４．ｔ＋冗０−５００００２　（１０）Ｊ、Ｍｏ２．Ｂｉｏｌ、９８： 　５０３−１７（１９７５）を参照されたい。

そのような実験で吏用する配列プローブは、始原発癌遺伝子の領域と重なるか、 またシま始原発癌遺伝子のこの領域に非常に隣接した所にある多数のＤＮＡセグ メントから誘導できる。記載する実施例では、プローブは、変化したコドンの左 糎１のＮａｅ１部位から始まり、その右のＮａｅ　Ｉ部位で終る発癌遺伝子のＮ ａＢＩフラグメントであってよい。正常始原発癌遺伝子を持つ細胞のＤＮＡはこ の部位でＮａｅ　Ｉにより２つの部分に切断され、一方ＥＪ膀胱癌発癌遺伝子の ＤＮＡはＮａｅｌエンドヌクレアーゼによる処理ではこの部位は影響を受けない 。

この検定は、始原発癌遺伝子のＤＮＡのその対応する発癌遺伝子への変化に対し て一般的に応用できる。始原発癌遺伝子または発癌遺伝子の何れが一方のみのＤ ＮＡ配列が制限エンド９ヌクレアーゼの切断に感受性で、他の配列ｌま感受性で ないことが検定法の基本原理である。

発癌遺伝子により暗号ｆヒされたｐ２１蛋白質から始原発癌遺伝子により暗号化 されたｐ２１蛋白質へのアミノ酸配列の変化の他の結果：ま、両方の特異的な血 清学の試薬での検出を可能にする。そのような血清学試薬：′！、正常始原発癌 遺伝子が特定するアミノ酸配列ぞ蛋白質のこの部位で特定てき、または発癌遺伝 子が特定する変化したアミノ酸配列を蛋白質のこの部位で特定できる。未変化の 蛋白質領域と反応し、その結果ｐ２１蛋白質の正常または異常な形の一方と反応 性の、らるような他の血清学試薬も用いる事ができる。

クローニング技術を用い、始原発癌遺伝子の正常部位または２ 発癌遺伝子の変化部位で１暗号（ｌされるｐ２１蛋白質を有意の量単離できる。

そのような蛋白質セグメントを用い標準的な抗体産生技術により抗体を産生ずる 。すなわち、ポリクローナル抗体の産生のため、その蛋白質を用い、ウサギまた ）まラットの如き宿主に免疫し、該蛋白質洸対する抗体を宿主から得られる血清 β・ら集める。

さらに、ハイブリド−マ細胞を形成する典壓的な融合技術で単離された遺伝子セ グメントの産生ずる蛋白質に対する抗体を産生ずる細胞を用い、モノクローナ） ｖ抗体を産生できる。基本的に、これらの技術は抗体産生細胞をミエローマ細胞 の如き不滅の細胞と融合せしめ、希望する抗体を産生ずる永久増殖性融合細胞ハ イブリッドを提供する事からなり；本願の場合、希望する抗体とは、単離された 遺伝子セグメントにより暗号化されたｐ２１蛋白質の正常または変異セグメンＩ Ｉ／ｃ対する抗体である。ハイブリッド細胞を抗体産生の助けとなるような条件 下で培養１２、その後、細胞培養培地から抗体を集める。そのようなモノクロー ナル抗体を産生ずる技術は文献によく記載されている。例えば、米国特許第４， １７２．ｉ２４号および第４，１９６，２６５号（Ｈｉ］、ａｒｙ　Ｋｏｐｒｏ ｗｓｋｉらに特許された）を参照されたい。その技術はここでは参照のたぬ含ま れる。

より具体的（・こｔ−よ、そのような血清学試薬は既知の方法ＹＣより得る事が できる。Ｗａｌｔｅｒ、　Ｃｘ、、　Ｓｃｂｅｉｄｔｍａｎｎ、　Ｋ、　Ｈ，、 Ｃａｒｂｏｎｅ。

Ｒ，Ａ、、　Ｇｒｅｅｎ、　Ｎ、、　Ａｌｅｘａｎｄ、ｅｒ、　Ｈ＋、　Ｌｉｕ 、　Ｆ、　Ｔ、、　５ｕｔ−ｃｌｉｆｆｅ。

３ Ｊ、　Ｇ、、および５ｃｈｉｎｎｉｃｋ、　’ｒ、Ｍ＋、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ ｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

ＵＳＡ、７８：　３４０３−３４０７　（１９８１）を参照されたい。

実際に、はゾチドセグメントを標準的な有機合成技術で合成し、合成された（プ チド配列が研究している目的の蛋白質領域のアミノ酸配列に正確に対応するよう にすることができる。次いでこのにプチドをキャリヤ蛋白質と結合させ、適切な 宿主（例えばマウス）に注射し、免疫応答を起こす。この方法で免疫された動物 の血清を免疫した〈プチドおよびより重要であるが、その一つの領域にこのアミ ノ酸配列を持つ蛋白質の両方に対して免疫沈降させるために用いる事ができる。

従って、正常な始原発癌遺伝子から発癌遺伝子に転換する際に変化するアミノ酸 残基部位を持つオリゴ゛はプチド配列（例えばデカはゾチｌ−゛）に対する血清 が作れる。そのような血清は正常の投プチド配列か、または変化した配列に対し て作る事ができる。免疫グロ７′リンー抗原相互作用の特異性は、あるオリゴ（ プチドと反応する血清はその一つの領域に同じ対応した配列を持つ蛋白質とのみ 反応し、その一つの領域に変化したこの配列を持つ蛋白質とは交叉反応しない事 を保証する。

腫瘍試料または組織ホモジネートまたは目已融解した腫瘍片からの遊離液から、 ここに記載した突然変異変化変叱に影響されない蛋白質の領域（列えＢｆ−Ｃ− 末端）と交叉反応ずろ一般の非特異的ｐ２１血清を用い、ｐ２１蛋白質を免疫沈 降する事ができる。別個に、１２番目の残基を取り囲むＮ末端正常〈プチドに対 して特異的な血清を同じ溶屏夜からの蛋白質の免疫沈降（・Ｃ使用できる。もし 非病理組玉からの正常ｐ２１を免疫沈降ずろ３４ 事ができるこのＮ末：＠特異的血清が目的の試験Ｍｉ織よりｐ２１を免疫沈降で きないなら、この試験組織のｐ２１は正常のＮ末端配列に反応性のある血清と反 応する能力に影響する形の変化があったと考えられる。一般の非特異的血清でこ の組織より免疫沈降するｐ２１の量が正常Ｎ末端配列と反応性のある血清により 沈降しうるｐ２１の量の対照となる。

上記の免疫沈降は、組織試料中の変化したｐ２１の存在の測定に用いる事ができ ろ。これと別個に、この領域の正常のアミノ酸配列が異常配列に変化する時どの 型の特異変化が起きているかを診断するため、一連のＲプチドに特異的血清を開 発できる。例えば、１２＠残基を暗号化するコドンで単一の点突然変異による起 こるアミノ酸置換のリストを作る事ができろ。これらの各々の置換に対し、この 領域の新しい翻訳のオリコ゛投プチドを推論でき、前忙記載した使用のための対 応するはプチト８が合成される。これらの血清の各々は、各血清を誘導するのに 使用したオリゴ深プチド片に対応する変化したｐ２１と特異的に反応する。

用語“免疫沈降”は更に一連の変化した技術操作により更に記述する。通常使用 される技術は、代、謝的に標識した蛋白質を免疫沈降し、続いてゲル電気泳動お Ｊ：び得られたゲルのオートラジオグラフィーを行うものである。組織試料を代 謝的に簿識するのが困難であるので、ここでは他の方法が良好である；即ち、非 標識蛋白質をゲル電気泳動し、分離した蛋白質をニトロセルロースフィルターに 移し、目的の蛋白質を、放射−標識免疫グロブリンとフィルターをインキュベー ）卜する事により検出３５’＋話＆ＵＥｉＯ−５００００２（１１）する。免疫 グロブリンは直接三−ド化によりま１暑ま間接的に第１のイムノグロブリンの定 常領域と反応する第２の放射標識イムノグロブリンとインキュに一トすることに より放射標識ｒヒされる。

本発明の応用についての議論および多くの実験的仕事は、ヒトの膀胱癌のＥＪ遺 伝子およびその始原発癌遺伝子（ｃ−Ｈａ−二ｋ）との相違を検出することに向 けられたが、これらの相違を検出する技術ならびにそれらに基づく検定、去は、 非常に普遍性を有する。事実、そのような技術と検定（・ま、突然変異して野生 株の対立遺伝子とは劇的に異なる機能を帯びた変異対立遺伝子またはジーンを生 じた如何なる野生株ジーンまたは対立遺伝子に対しても適用可能と信じられる。

例えばそのような技術と検定は、野生株遺伝子およびＬｅｓｃｈ−Ｎｙａｎ症挨 詐【関連する突然変異遺伝子の差を検出するのに適していると期待さｎる。

本発明方法は、発癌遺伝子と始原発癌遺伝子の差異を検出するのに勿論特別の応 用と有用性を持つ。一連のｒａｓファ、？　ＩＪ−のメンバーについては前に記 載した。しかしながら、ここに記載された技術は二二ファミリーのメンバー以外 の始原発癌細胞σ相違の発見も可能とする。例えば、ＨＬ−６０細胞株（（存在 する、前骨髄注白血病、ある種の結腸癌およびＨａｉｒｙ細胞白血病に関連する 事が知られている発１俗遺云子とその始原発癌遺伝子との差異はここに記載した 方法を用いて決定できる。これらの差異は記載された型の検定に用いられる。

野生型遺伝子とそれに対応する容態変異遺伝子の差異を検定する非常に一般的な 手１頂は以下の如くである：％ Ａ、遺伝病の発現に対して遺伝子の正常機能または異常機能が関連するような遺 伝子の４：ｙ　山ｏ検定法を開発する：そのようなインビトロでの検定は、一般 に、遺伝子移植により遺伝子を受けた培養細胞の行動の観察できる変化に依存す る。

Ｂ、上述の遺伝子の対立遺伝子を分子クローンとして単離するため（・Ｃ１上述 のインビトロ検定を用いる。そのような対立遺伝子は野生型対立遺伝子かまたは その野生型対立遺伝子の機能不全性変異対立遺伝子である。

Ｃ，Ｂ項からの単離対立遺伝子を用い、組換えＤＮＡ技術を１重用して遺伝子の 他の対立遺伝子の形を単離する。即ち、正常対立遺伝子を配列プローブとして使 用し、変異−非野生型遺伝子に子の同定および単離が可能になる。

Ｄ、インビトロ検定系において、野生型対立遺伝子および非野生型変異遺伝子の 観察できる差異および別個の挙動を実証する。

Ｅ、インビトロで野生型および非野生型対立遺伝子のクローン間で遺伝子組換え を行い、野生型および非野生型の対立遺伝子による表現型を検定する（Ｄ項）こ とにより立ヨ検出系で組換え体を試験する。このようにして、２つの対立遺伝子 間の機能の差に関与する非野生型対立遺伝子の領域を遺伝的な地図にする。

Ｆ、２つの対立遺伝子の間の機能の相違をコートゝすることがＥ項で証明された 非野生型対立遺伝子の領域の構造的配列分析を実施する。

Ｇ、その伴狂が非野生型遺伝子の変イヒした表現型を決定する、７ 決定的に変化した配列を同定した後（Ｆ項）、野生型対立遺伝子を非野生型変異 遺伝子シて変換した過程で切断認識都立が変化□した部位特異性制限酵素（エン ドヌクレアーゼ）を決定する。

Ｈｌその変化が遺伝子の機能、シて影響することが前に示されたエンドヌクレア ーゼ部位（０項）の存在または不存在をスクリーニングすることによって、試験 ＤＮＡがその遺伝子中の該遺伝子およびその非野生型対立遺伝子変異体の機能の 支配を決定することが前記Ｅ項で示された遺伝子部分中に、配列変化を有するか 否かを決定するために、試験サンプルまたは試験組織をスクリーニングするだめ の配列プローブとして、クローン化した野生型遺伝子を使用する。

Ｔ、正常野生型対立遺伝子の遺伝子およびその非野生型変異形により暗号比され たアミノ酸配列を推論する。前に地図にし、遺伝子の機能に影響がある事（Ｆ項 ）がわかっているヌクレオチド配列の差異が、同様に野生型と非野生型対立遺伝 子が暗号付ける蛋白質のアミノ酸の配列に影響があるか否かを決定する。

Ｊ、もし、アミノ酸配列に影響があれば、野生型と非野生型の蛋白質（（対する 特異的な血清を開発する。例えば野生型蛋白質と機能的に異なる非野生型蛋白質 の領域の配列で、ちる（１項）オリゴ″はプチド片を合成する事ができる：対応 する野生型オリゴＲゾチドを合成する。野生型または非野生型蛋白・盲と反応す る特異的な抗血清を引き出すための免疫原として両者を用いる。

Ｋ、前記特異的抗血ａ（Ｊ項）を利用し、前記蛋白質の野生型または非野生型の 存在：Ｃ関して試＠細胞または試験組織の蛋白貴うでスクリーニングスル。

■・、前記蛋白質スフ）ルーニングを利用（〜（Ｋ項）、遺伝病の表現型を媒介 するのに重要な構造の蛋白質の存在を診断する。

産業上の利用ｉ牛 こごに記載されている本発明は始原発癌遺伝子およびその対１心ずう発′Ｉ■遺 伝子、そのような遺伝子で暗号ｒヒされた蛋白質の間の差異の決定、そのような 蛋白質ま、ｒこ）まその一部の抗体の製造、および発癌を調べるたぬそのような 始原発癌遺伝子または発癌遺伝子の存在をそのような抗体を利用し２て検定する のに有′！屁首者は日常的試験を行なうだけで、ここに記載した本発明の特定の 具体例に多くの均等節ノｌをｌめ、確認できる。そのような均等範囲は以下の請 求の範囲：ｆこ含まれろ事を−をし１する。

浄彊ζカ“′−′ニーｒ断ニジ） ２ し　◆　薯 シ １２３４５ 、　（実　！ ｔ″ｉｇ、　、；Ｃ ｊＦ７ｇ、　、？Ｄ Ｆｉｇ、１ 〇　二　（−）　”’ＯＣ）　に　σ　−口Ｐ（ニア／（ｌＧ　Ｓｊ　／　ＯＩ Ｆ／〕５．補正命令の日付　昭和釣竿　宿月　９日（発送日）６、補正の対象 ・国際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　野生型対立−を云子の突然変異遺伝子への突然変異の検定法に３いて； 野生型対立遺伝子頂た（ま突然変異対立遺伝子の一方のみに存在する切断部位に 対する特定の制限酵素を用いる改良法。 ２、前記野生型対立遺伝子が始原発癌遺伝子であり、および前記突然変異対立遺 伝子が発癌遺伝子である請求の範囲第１項記載の改良法。 ３　前記始原遺伝子がｒａｓ遺伝子である請求の範囲第２項記載の改良法。 ４　前記発癌遺伝子がヒト膀胱癌の発癌遺伝子である請求の範囲第３項記載の改 良法。 ５　下記ａ、　−ＣＩの工程からなる始原発癌遺伝子が発癌遺伝子忙突然変異し たかどうかを検出する方法：ａ、前記始原発癌遺伝子および前記発癌遺伝子を含 む細胞からのＤＮＡを車力「シ； ｂ、前記の単離したＤ　Ｉ’Ｊ　Ａの領域を発癌遺伝子化の原因となるＤＮＡ溝 造の相違の−７−（を含む短いセグメントにせげめ；Ｃ１前記発癌遺伝子および 前記始原全県遺伝子の前記短いセグメントのＤＮＡ１列の相違を決定し；ｄ、前 記始原発癌遺伝子ぢよひ前記発情遺伝子の何れか一方のＤＮＡ記列相違５分：て １動らくが、他方のＤＮＡ配列相当部′：：＋）ては働らかないような制限酵素 を選択し；およびｅ、前記始原全県遺伝子が前記発癌遺伝子に突然変異したかど うかの検定に前記の選択した制限酵素を用いて検出する。 ０ ６　前記始原発癌遺伝子がｒａｓ遺伝子ファミリーの構成員である請求の範囲第 ５項記載の方法。 ７、前記始原発癌遺伝子および前記発癌遺伝子からの一連のエコ化での組換体を 用いて、前記ｐＮＡ中の唯一の相違部を含む前記短いＤＮＡセグメントを単離す ることにより、遺伝子の相違を決定する請求の範囲第６項記載の方法。 ８　前記発癌遺伝子がヒト膀胱癌発癌遺伝子またはその対立遺伝子の変異体であ る請求の範囲第７項記載の方法。 ９、前記Ｄ　Ｎ　Ａ配列の相違が始原発癌遺伝子のＧ］、ｙ　］　２コビンに位 置する請求の範囲第８項記載の方法。 １０　前記制限酵素がＮａｅｌエンドヌクレアーゼである請求の範囲第９項記載 の方法。 ＩＩ　前記制限酵素がＨｐａ、ｌエンドヌクレアーゼである請求の範囲第９項記 唯の方法。 １２４　下記ａ−ｂの工程からなる試験７刑胞のヒト膀胱癌の検定法： ａ、前記試験細胞からＤＮＡを単離し：およびす、前記ヤ碓ＤＮＡがｃ−Ｈａ− 二豆Ｉ始原発癌遺伝子のたａＩおよびＫｐｎ　ｌ切断部位の間の３５０ヌクレオ チド配列中に制限酵素Ｎａｅｌに対する切断部位があるがどうかを決定する。 １３　下記ａ−’２の工程からなる野生型対立遺伝子が変異対立遺伝子に突然変 異したかを検出できる抗体を産生する方法：ａ、変異したとき前記変異対立遺伝 子を生ずる前記野生型対立遺伝子のＤ　Ｎ　Ａセグメントを単離し、ｂ、前記野 生型対立遺伝子および前記変異対立遺伝子、間の４１ 機能の相違）て関係するＤ　Ｎ　Ａ配列の相違を反映する抗体の産生を宿主に免 疫したとき誘発しうる抗原をっくり；およびＣ０前記宿主が前記抗体を産生ずる ような条件で宿主に免疫する。 １４、前記野生型対立遺伝子が始原発癌遺伝子であり、前記変異対立遺伝子が発 癌遺伝子である請求の範囲第１３項記載の方法。 １５、前記始原発癌遺伝子が＝始原発癌遺伝子である請求の範囲第１４項記載の 方法。 １６　前記ヨ始原発癌遺伝子がヒト膀胱癌の始原発癌遺伝子である請求の範囲第 １５項記載の方法。 １７、前記ＤＮＡのセグメントが前記始原発癌遺伝子から発現されるｐ２１蛋白 質のＧ１ｙ１２のためのコドンを含む請求の範囲第１６項記載の方法。 １８、前記抗原がポリ投プチドキャリアに結合したオリコ゛投プテドである請求 の範囲第１７項記載の方法。 １９、抗体産生細胞を前記宿主から選択し、モノクローナル抗体産生細胞し）る 請求の範囲第１８項記載の方法。 ２０、前記の選択された抗体産生細胞を他の細胞と融合せしめ、モノクローナル 抗体産生ができる融合雑種細胞を産生ずる請求の範囲第１９項記載の方法。 ２１、請求の範囲１３，１５．１８または２０項に記載した方法とより生産され た抗体。 ２２、始原発布遺伝子の発癌遺伝子への突然変異により起こされる発癌の検定法 において； ４２ｊ、込５１１ＧＯ−５００００２（２）前記発癌遺伝子により発現される蛋 白質および前記始原発癌遺伝子により発現さ２する蛋白質間の相違を検出する改 良法。 ２３、前記遺伝子がｒａｓ遺伝子ファミリーの構成員である請求の範囲第２２項 記載の方法。 ２４　検出される蛋白質の相違がｐ２１蛋白質のＮ−末端部にある請求の範囲第 ２３項記載の方法。 ２５゜前記発癌遺伝子がヒト膀胱癌をひき起こすものである請求の範囲第２４項 記載の方法。 ２６、前記検出される相違がｐ２１蛋白質中のＣ１ｙ　Ｉ　２、特許請求の範囲 第２５項記載の方法。 ２７、ｒａｓ始原発癌遺伝子の相同部分と相違する！発癌遺伝子の部分により発 現されるアミノ酸配列と結合したポリペプチドキャリアよりなることを特徴とす る免疫した宿主中で抗体生産可能な抗原。 ２８、二発癌遺伝子により発現され、単離されたｐ２１蛋白質。 ２９　前記工発癌遺云子がヒト膀胱癌をひき起こすものである請求の範囲第２８ 項記載の単離されたｐ２１蛋白質。 ３０　請求の範囲第２８または２９項記載の単離さｎたｐ２１蛋白質に対する抗 体。 ３１、請求の範囲第２８または２９項記載の単離されたｐ’２１蛋白質に対する モノクローナル抗体。 ３２、始原発癌遺伝子の発癌遺伝子−１の突然変異を検定するための試薬の集合 よりなる医学診膚のためのスクリーニングキット。 ３ ３３　下記ａ−ｈの工程からなる始原発癌遺伝子の発癌遺伝子への突然変異によ り起こされる発癌を検出できる抗体を産生ずる方法： ａ、前記始原発癌遺伝子と前記発癌遺伝子とで異なっているＤＮＡセグメントを 単離し； ｂ、２つの遺伝子により特定されている蛋白質を暗号化しているヌクレオチド９ 配列を決定し； Ｃ，２つの暗号化されている蛋白質のアミノ酸配列を推定し； ｄ、その機能の相違に２つの暗号化された蛋白質間のアミノ酸配列のどの相違が 決定的であるかを決定し；ｅ、始原発癌遺伝子で暗号化された蛋白質の残基であ って、その変化が始原発癌遺伝子の発癌遺伝子への活性比に重大な関連がある残 基を取り囲みおよび含むアミノ酸配列を直接反映するオリゴにプテドを合成し； ｆ、同定された発癌遺伝子に暗号化された蛋白質の対応する領域のオリゴイプチ ドを合成し； ｇ、前記始原発癌遺伝子または前記発癌遺伝子の一方に暗号化されたアミノ酸配 列に対応する前記オリコ゛投プチドで宿主を、前記宿主の細胞：゛こより前記セ グメントに対する抗体が産生される条件下で免疫し；および り、前記宿主を始原発布遺伝子の他方の変異体型の対立遺伝子に暗号比されたオ リゴ梗プチドで前記宿主を免疫する（各々の前記変異体は変化したアミノ酸残基 を暗号化したヌ１　浄乞（内γｆに変更なし）