JPH05281228A - 発癌遺伝子の解明およびそれに基づく検定法 - Google Patents
発癌遺伝子の解明およびそれに基づく検定法Info
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 本発明は、特に突然変異体対立遺伝子および
その対応する野生型の対立遺伝子、特に発癌遺伝子と始
原発癌遺伝子の相違を明らかにし、その相違を利用して
検定することに関する。 【構成】 宿主に免疫したとき、野生型対立遺伝子と変
異型対立遺伝子の機能の相違の原因となるＤＮＡ構造を
検出する能力のある抗体を生じる抗原を製造し、該宿主
が該抗体を製造する条件下で該宿主を免疫することより
なる、野生型対立遺伝子が変異型対立遺伝子に変異した
かどうかを検出できる抗体を製造する。
その対応する野生型の対立遺伝子、特に発癌遺伝子と始
原発癌遺伝子の相違を明らかにし、その相違を利用して
検定することに関する。 【構成】 宿主に免疫したとき、野生型対立遺伝子と変
異型対立遺伝子の機能の相違の原因となるＤＮＡ構造を
検出する能力のある抗体を生じる抗原を製造し、該宿主
が該抗体を製造する条件下で該宿主を免疫することより
なる、野生型対立遺伝子が変異型対立遺伝子に変異した
かどうかを検出できる抗体を製造する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は分子生物学の分野であ
り、特に突然変異体対立遺伝子およびその対応する野生
型の対立遺伝子特に発癌遺伝子および始原発癌遺伝子間
の相違を明らかにし、その相違を利用して検定する事に
関する。
り、特に突然変異体対立遺伝子およびその対応する野生
型の対立遺伝子特に発癌遺伝子および始原発癌遺伝子間
の相違を明らかにし、その相違を利用して検定する事に
関する。
【０００２】
【従来の技術】化学発癌に関連した従来の研究成果は化
合物の発癌力がしばしばその変異誘発素としての能力と
相関する事を示してきた。ＭｃＣａｎｎ，Ｊ．Ｃｈｏ
ｉ，Ｅ．，Ｙａｍａｓａｋｉ，Ｅ．およびＡｍｅｓ，
Ｂ．Ｎ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ，Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ ７２：５１３５−５１３９（１９７５）；ＭｃＣａ
ｎｎ，Ｊ．およびＡｍｅｓ，Ｂ．Ｎ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ，Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７３：９５０−９５４
（１９７６）；Ｂｒｉｄｇｅｓ，Ｂ．Ａ．Ｎａｔｕｒｅ
２６１：１９５−２００（１９７６）；およびＢｏｕ
ｃｋ，Ｎ．およびｄｉＭａｙｏｒｃａ，Ｇ．Ｎａｔｕｒ
ｅ ２６４：７２２−７２７（１９７６）を参照された
い。この事はＤＮＡが発癌活性化の終局の標的である事
を示唆している。このため、研究者はしばしば“発癌遺
伝子”と称され、その変化が発癌への変化に決定的に重
要である癌細胞中のＤＮＡセグメントの同定および研究
を試みてきた。
合物の発癌力がしばしばその変異誘発素としての能力と
相関する事を示してきた。ＭｃＣａｎｎ，Ｊ．Ｃｈｏ
ｉ，Ｅ．，Ｙａｍａｓａｋｉ，Ｅ．およびＡｍｅｓ，
Ｂ．Ｎ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ，Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ ７２：５１３５−５１３９（１９７５）；ＭｃＣａ
ｎｎ，Ｊ．およびＡｍｅｓ，Ｂ．Ｎ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ，Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７３：９５０−９５４
（１９７６）；Ｂｒｉｄｇｅｓ，Ｂ．Ａ．Ｎａｔｕｒｅ
２６１：１９５−２００（１９７６）；およびＢｏｕ
ｃｋ，Ｎ．およびｄｉＭａｙｏｒｃａ，Ｇ．Ｎａｔｕｒ
ｅ ２６４：７２２−７２７（１９７６）を参照された
い。この事はＤＮＡが発癌活性化の終局の標的である事
を示唆している。このため、研究者はしばしば“発癌遺
伝子”と称され、その変化が発癌への変化に決定的に重
要である癌細胞中のＤＮＡセグメントの同定および研究
を試みてきた。
【０００３】最近の発癌遺伝子の単離の１つの試みにお
いて、非トランスフォームＮＩＨ３Ｔ３マウス線維芽細
胞内へＥＪ膀胱癌細胞株からの腫瘍細胞ＤＮＡが導入さ
れた。この方法により細胞から細胞へ細胞トランスフォ
ーメーションの表現型が移せる事が発見された。腫瘍Ｄ
ＮＡは受容ＮＩＨ単層培養においてトランスフォームし
た細胞のフォーカスを誘導できるが、正常の非トランス
フォーム供与細胞からのＤＮＡはフォーカスを生成しな
い。Ｓｈｉｈ，Ｃ．，Ｓｈｉｌｏ，Ｂ．，Ｇｏｌｄｆａ
ｒｂ，Ｍ．Ｐ．，Ｄａｎｎｅｎｂｅｒｇ，Ａ．およびＷ
ｅｉｎｂｅｒｇ，Ｒ．Ａ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７６：５７１４−５７１８（１９
７９）；Ｃｏｏｐｅｒ，Ｇ．Ｍ．，Ｏｋｅｎｑｉｓｔ，
Ｓ．およびＳｉｌｖｅｒｍａｎ，Ｌ．Ｎａｔｕｒｅ ２
８４：４１８−４２１（１９８０）；Ｓｈｉｈ，Ｃ．，
Ｐａｄｈｙ，Ｌ．Ｃ．，Ｍｕｒｒａｙ，Ｍ．Ｊ．および
Ｗｅｉｎｂｅｒｇ，Ｒ．Ａ．Ｎａｔｕｒｅ ２９０：２
６１−２６４（１９８１）；Ｋｒｏｎｔｉｒｉｓ，Ｔ．
Ｇ．およびＣｏｏｐｅｒ，Ｇ．Ｍ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：１１８１−１１
８４（１９８１）；およびＰｅｒｕｃｈｏ，Ｍ．らＣｅ
ｌｌ ２７：４６７−４７６（１９８１）を参照された
い。
いて、非トランスフォームＮＩＨ３Ｔ３マウス線維芽細
胞内へＥＪ膀胱癌細胞株からの腫瘍細胞ＤＮＡが導入さ
れた。この方法により細胞から細胞へ細胞トランスフォ
ーメーションの表現型が移せる事が発見された。腫瘍Ｄ
ＮＡは受容ＮＩＨ単層培養においてトランスフォームし
た細胞のフォーカスを誘導できるが、正常の非トランス
フォーム供与細胞からのＤＮＡはフォーカスを生成しな
い。Ｓｈｉｈ，Ｃ．，Ｓｈｉｌｏ，Ｂ．，Ｇｏｌｄｆａ
ｒｂ，Ｍ．Ｐ．，Ｄａｎｎｅｎｂｅｒｇ，Ａ．およびＷ
ｅｉｎｂｅｒｇ，Ｒ．Ａ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７６：５７１４−５７１８（１９
７９）；Ｃｏｏｐｅｒ，Ｇ．Ｍ．，Ｏｋｅｎｑｉｓｔ，
Ｓ．およびＳｉｌｖｅｒｍａｎ，Ｌ．Ｎａｔｕｒｅ ２
８４：４１８−４２１（１９８０）；Ｓｈｉｈ，Ｃ．，
Ｐａｄｈｙ，Ｌ．Ｃ．，Ｍｕｒｒａｙ，Ｍ．Ｊ．および
Ｗｅｉｎｂｅｒｇ，Ｒ．Ａ．Ｎａｔｕｒｅ ２９０：２
６１−２６４（１９８１）；Ｋｒｏｎｔｉｒｉｓ，Ｔ．
Ｇ．およびＣｏｏｐｅｒ，Ｇ．Ｍ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：１１８１−１１
８４（１９８１）；およびＰｅｒｕｃｈｏ，Ｍ．らＣｅ
ｌｌ ２７：４６７−４７６（１９８１）を参照された
い。
【０００４】これらの結果はＥＪ腫瘍細胞株ＤＮＡ中に
存在する発癌遺伝子因子は明らかに正常細胞のＤＮＡに
は存在しない事を示している。
存在する発癌遺伝子因子は明らかに正常細胞のＤＮＡに
は存在しない事を示している。
【０００５】種々の部位−特異性エンドヌクレアーゼの
処理による、ＥＪ膀胱癌細胞株からの発癌遺伝子の感受
性または抵抗性を検討した研究は、その細胞トランスフ
ォーメーションにはある種の特別な供与ＤＮＡ配列が関
係している事を示した。Ｌａｎｅ，Ｍ．Ａ．，Ｓａｉｎ
ｔｅｎ，Ａ．およびＣｏｏｐｅｒ，Ｇ．Ｍ．Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：５１８５
−５１８９（１９８１）；およびＳｈｉｌｏ，Ｂ．およ
びＷｅｉｎｂｅｒｇ，Ｒ．Ａ．Ｎａｔｕｒｅ．２８９：
６０７−６０９（１９８１）を参照されたい。分離およ
び特定可能な発癌遺伝子のこの概念は、後にＲｏｂｅｒ
ｔ Ａ．Ｗｅｉｎｂｅｒｇの名前で１９８２年５月１９
日付で出願中の出願番号３７９，７２１号に記載されて
いる方法により、ＥＪヒト膀胱癌細胞株から独立したト
ランスフォーミング遺伝子の分子単離により直接示され
た。
処理による、ＥＪ膀胱癌細胞株からの発癌遺伝子の感受
性または抵抗性を検討した研究は、その細胞トランスフ
ォーメーションにはある種の特別な供与ＤＮＡ配列が関
係している事を示した。Ｌａｎｅ，Ｍ．Ａ．，Ｓａｉｎ
ｔｅｎ，Ａ．およびＣｏｏｐｅｒ，Ｇ．Ｍ．Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：５１８５
−５１８９（１９８１）；およびＳｈｉｌｏ，Ｂ．およ
びＷｅｉｎｂｅｒｇ，Ｒ．Ａ．Ｎａｔｕｒｅ．２８９：
６０７−６０９（１９８１）を参照されたい。分離およ
び特定可能な発癌遺伝子のこの概念は、後にＲｏｂｅｒ
ｔ Ａ．Ｗｅｉｎｂｅｒｇの名前で１９８２年５月１９
日付で出願中の出願番号３７９，７２１号に記載されて
いる方法により、ＥＪヒト膀胱癌細胞株から独立したト
ランスフォーミング遺伝子の分子単離により直接示され
た。
【０００６】この出願中の出願に記載されている如く、
ＥＪ細胞株から単離されたＤＮＡを、ヒト膀胱癌発癌遺
伝子およびマーカーのみを実質的に含有するマウス線維
芽細胞が選別されるまでＮＩＨ３Ｔ３マウス線維芽細胞
にトランスフェクションして連続的に取り込ませる。こ
の作業で用いられたマーカーはＡｌｕ ＤＮＡ配列であ
り、ヒトＤＮＡにおいては約３００，０００回繰り返し
ているがマウス線維芽細胞ＤＮＡには存在しない。この
ような種間トランスフェクションにより最終的にマーカ
ーを伴った目的とする発癌遺伝子を含有する細胞が選別
される。このトランスフェクトされた細胞からの全ての
ＤＮＡを用いラムダファージ内にゲノムライブラリーを
つくり、適当なキメララムダファージをヒトＡｌｕマー
カーに特異的なプローブを用いて選択する。
ＥＪ細胞株から単離されたＤＮＡを、ヒト膀胱癌発癌遺
伝子およびマーカーのみを実質的に含有するマウス線維
芽細胞が選別されるまでＮＩＨ３Ｔ３マウス線維芽細胞
にトランスフェクションして連続的に取り込ませる。こ
の作業で用いられたマーカーはＡｌｕ ＤＮＡ配列であ
り、ヒトＤＮＡにおいては約３００，０００回繰り返し
ているがマウス線維芽細胞ＤＮＡには存在しない。この
ような種間トランスフェクションにより最終的にマーカ
ーを伴った目的とする発癌遺伝子を含有する細胞が選別
される。このトランスフェクトされた細胞からの全ての
ＤＮＡを用いラムダファージ内にゲノムライブラリーを
つくり、適当なキメララムダファージをヒトＡｌｕマー
カーに特異的なプローブを用いて選択する。
【０００７】この研究により、エンドヌクレアーゼＢａ
ｍ ＨＩにより生じる６．６Ｋｂの長さのＤＮＡセグメ
ントにＥＪ膀胱癌ＤＮＡの発癌遺伝子の活性が位置して
いる事が解明された。６．６Ｋｂセグメントをプラスミ
ドベクターｐＢＲ３２２にクローン化し、サザーン・ブ
ロット分析における配列プローブに使用する。これによ
り正常ヒトゲノムに存在する類似の構造の配列から該発
癌遺伝子が誘導された事が示された。Ｇｏｌｄｆａｒ
ｂ，Ｍ．，Ｓｈｉｍｉｚｕ，Ｐｅｒｕｃｈｏ，Ｍ．およ
びＷｉｇｌｅｒ，Ｍ．Ｎａｔｕｒｅ ２９６：４０４−
４０９（１９８２）；およびＳｈｉｈ，Ｃ．およびＷｅ
ｉｎｂｅｒｇ，Ｒ．，Ｃｅｌｌ ２９：１６１−１６９
（１９８２）を参照されたい。このように、発癌過程の
間に正常細胞遺伝子の突然変異によりヒト膀胱発癌遺伝
子が生じると思われる。
ｍ ＨＩにより生じる６．６Ｋｂの長さのＤＮＡセグメ
ントにＥＪ膀胱癌ＤＮＡの発癌遺伝子の活性が位置して
いる事が解明された。６．６Ｋｂセグメントをプラスミ
ドベクターｐＢＲ３２２にクローン化し、サザーン・ブ
ロット分析における配列プローブに使用する。これによ
り正常ヒトゲノムに存在する類似の構造の配列から該発
癌遺伝子が誘導された事が示された。Ｇｏｌｄｆａｒ
ｂ，Ｍ．，Ｓｈｉｍｉｚｕ，Ｐｅｒｕｃｈｏ，Ｍ．およ
びＷｉｇｌｅｒ，Ｍ．Ｎａｔｕｒｅ ２９６：４０４−
４０９（１９８２）；およびＳｈｉｈ，Ｃ．およびＷｅ
ｉｎｂｅｒｇ，Ｒ．，Ｃｅｌｌ ２９：１６１−１６９
（１９８２）を参照されたい。このように、発癌過程の
間に正常細胞遺伝子の突然変異によりヒト膀胱発癌遺伝
子が生じると思われる。
【０００８】ＥＪ膀胱発癌遺伝子とその対応する正常細
胞配列（“始原発癌遺伝子”）の比較は、この発癌遺伝
子がラット由来のＨａｒｖｅｙラット肉腫ウイルスのト
ランスフォーメーション遺伝子と類似しているという続
いての発見により促進された。Ｄｅｒ，Ｃ．，Ｋｒｏｎ
ｔｉｒｉｓ，Ｔ．Ｇ．およびＣｏｏｐｅｒ，Ｇ．Ｍ．Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃｓｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７９：
３６３７−３６４０（１９８２）；Ｐａｒａｄａ，Ｌ．
Ｆ．，Ｔａｂｉｎ，Ｃ．Ｊ．，Ｓｈｉｈ，Ｃ．およびＷ
ｅｉｎｂｅｒｇ，Ｒ．Ａ．Ｎａｔｕｒｅ ２９７：４７
４−４７９（１９８２）；およびＳａｎｔｏｓ，Ｅ．ら
Ｎａｔｕｒｅ ２９８：３４３−３４７（１９８２）を
参照されたい。このラット肉腫ウイルス遺伝子（ｖ−Ｈ
ａ−ｒａｓと名付けられている）はキメラウィルスゲノ
ムの形成の過程においてラットゲノムから得られたもの
である。Ｓｃｏｌｎｉｃｋ，Ｅ．Ｍ．およびＰａｒｋ
ｓ，Ｗ．Ｐ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１３：１２１１−１２１
９（１９７４）；およびＳｈｉｈ，Ｔ．Ｙ．，Ｗｉｌｌ
ｉａｍｓ，Ｄ．Ｒ．，Ｗｅｅｋｓ，Ｍ．Ｏ．，Ｍａｒｙ
ａｋ，Ｊ．Ｍ．，Ｖａｓｓ，Ｗ．Ｃ．およびＳｃｏｌｎ
ｉｃｋ，Ｅ．Ｍ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２７：４５−５５
（１９７８）を参照されたい。この遺伝子の研究の過程
において、ｖ−Ｈａ−ｒａｓのラットおよびヒト細胞相
同体が単離された。ＤｅＦｅｏ，Ｄ．，Ｇｏｎｄａ，
Ｍ．Ａ．，Ｙｏｕｎｇ，Ｈ．Ａ．，Ｃｈａｎｇｅ，Ｅ．
Ｈ．，Ｌｏｗｙ，Ｄ．Ｒ．，Ｓｃｏｌｎｉｃｋ，Ｅ．
Ｍ．およびＥｌｌｉｓ，Ｒ．Ｗ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ，Ｓｃｉ，ＵＳＡ ７８：３３２８−３３３２
（１９８１）；および、Ｃｈａｎｇ，Ｅ．Ｈ．，Ｇｏｎ
ｄａ，Ｍ．Ａ．，Ｅｌｌｉｓ，Ｒ．Ｗ．Ｓｃｏｌｎｉｃ
ｋ，Ｅ．Ｍ．およびＬｏｗｙ，Ｄ．Ｒ．Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ，Ｓｃｉ，ＵＳＡ ７９，４８４８−４
８５２（１９８２）を参照されたい。ヒト細胞ｖ−Ｈａ
−ｒａｓ相同体はＥＪ膀胱発癌遺伝子の正常前駆体と正
確に対応する事が見い出された。Ｐａｒａｄａ，Ｌ．
Ｆ．，Ｔａｂｉｎ，Ｃ．Ｊ．，Ｓｈｉｈ，Ｃ．およびＷ
ｅｉｎｂｅｖｇ，Ｒ．Ａ．Ｎａｔｕｒｅ ２９７：４７
４−４７９（１９８２）を参照されたい。
胞配列（“始原発癌遺伝子”）の比較は、この発癌遺伝
子がラット由来のＨａｒｖｅｙラット肉腫ウイルスのト
ランスフォーメーション遺伝子と類似しているという続
いての発見により促進された。Ｄｅｒ，Ｃ．，Ｋｒｏｎ
ｔｉｒｉｓ，Ｔ．Ｇ．およびＣｏｏｐｅｒ，Ｇ．Ｍ．Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃｓｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７９：
３６３７−３６４０（１９８２）；Ｐａｒａｄａ，Ｌ．
Ｆ．，Ｔａｂｉｎ，Ｃ．Ｊ．，Ｓｈｉｈ，Ｃ．およびＷ
ｅｉｎｂｅｒｇ，Ｒ．Ａ．Ｎａｔｕｒｅ ２９７：４７
４−４７９（１９８２）；およびＳａｎｔｏｓ，Ｅ．ら
Ｎａｔｕｒｅ ２９８：３４３−３４７（１９８２）を
参照されたい。このラット肉腫ウイルス遺伝子（ｖ−Ｈ
ａ−ｒａｓと名付けられている）はキメラウィルスゲノ
ムの形成の過程においてラットゲノムから得られたもの
である。Ｓｃｏｌｎｉｃｋ，Ｅ．Ｍ．およびＰａｒｋ
ｓ，Ｗ．Ｐ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１３：１２１１−１２１
９（１９７４）；およびＳｈｉｈ，Ｔ．Ｙ．，Ｗｉｌｌ
ｉａｍｓ，Ｄ．Ｒ．，Ｗｅｅｋｓ，Ｍ．Ｏ．，Ｍａｒｙ
ａｋ，Ｊ．Ｍ．，Ｖａｓｓ，Ｗ．Ｃ．およびＳｃｏｌｎ
ｉｃｋ，Ｅ．Ｍ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２７：４５−５５
（１９７８）を参照されたい。この遺伝子の研究の過程
において、ｖ−Ｈａ−ｒａｓのラットおよびヒト細胞相
同体が単離された。ＤｅＦｅｏ，Ｄ．，Ｇｏｎｄａ，
Ｍ．Ａ．，Ｙｏｕｎｇ，Ｈ．Ａ．，Ｃｈａｎｇｅ，Ｅ．
Ｈ．，Ｌｏｗｙ，Ｄ．Ｒ．，Ｓｃｏｌｎｉｃｋ，Ｅ．
Ｍ．およびＥｌｌｉｓ，Ｒ．Ｗ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ，Ｓｃｉ，ＵＳＡ ７８：３３２８−３３３２
（１９８１）；および、Ｃｈａｎｇ，Ｅ．Ｈ．，Ｇｏｎ
ｄａ，Ｍ．Ａ．，Ｅｌｌｉｓ，Ｒ．Ｗ．Ｓｃｏｌｎｉｃ
ｋ，Ｅ．Ｍ．およびＬｏｗｙ，Ｄ．Ｒ．Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ，Ｓｃｉ，ＵＳＡ ７９，４８４８−４
８５２（１９８２）を参照されたい。ヒト細胞ｖ−Ｈａ
−ｒａｓ相同体はＥＪ膀胱発癌遺伝子の正常前駆体と正
確に対応する事が見い出された。Ｐａｒａｄａ，Ｌ．
Ｆ．，Ｔａｂｉｎ，Ｃ．Ｊ．，Ｓｈｉｈ，Ｃ．およびＷ
ｅｉｎｂｅｖｇ，Ｒ．Ａ．Ｎａｔｕｒｅ ２９７：４７
４−４７９（１９８２）を参照されたい。
【０００９】ＥＪ発癌遺伝子およびその正常細胞対応物
（ｃ−Ｈａ−ｒａｓと名付けられている）の予備的な比
較がなされた。Ｅｌｌｉｓ，Ｒ．Ｗ．，ＤｅＦｅｏ，
Ｄ．，Ｍａｒｙａｋ，Ｊ．Ｍ．，Ｙｏｕｎｇ，Ｈ．
Ａ．，Ｓｈｉｈ，Ｔ．Ｙ．，Ｃｈａｎｇ，Ｅ．Ｈ．，Ｌ
ｏｗｙ，Ｄ．Ｒ．およびＳｃｏｌｎｉｃｋ，Ｅ．Ｍ．
Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．３６：４０８−４２０（１９８０）。
この研究において、ＮＩＨ３Ｔ３単層に加えた場合正常
細胞遺伝子からの分子クローンはフォーカスを誘導しな
いのに対し、膀胱発癌遺伝子はトランスフェクトしたＤ
ＮＡマイクログラム当り約５×１０4のフォーカスを形
成させる生物活性を持つ事が示されている。Ｓｈｉｈ，
Ｃ．およびＷｅｉｎｂｅｒｇ，Ｒ．Ａ．Ｃｅｌｌ ２
９：１６１−１６９（１９８２）；およびＣｈａｎｇ，
Ｅ．Ｈ．，Ｇｏｎｄａ，Ｍ．Ａ．，Ｅｌｌｉｓ，Ｒ．
Ｗ．，Ｓｃｏｌｎｉｃｋ，Ｅ．Ｍ．およびＬｏｗｙ，
Ｄ．Ｒ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ７９：４８４８−５２（１９８２）を参照されたい。
（ｃ−Ｈａ−ｒａｓと名付けられている）の予備的な比
較がなされた。Ｅｌｌｉｓ，Ｒ．Ｗ．，ＤｅＦｅｏ，
Ｄ．，Ｍａｒｙａｋ，Ｊ．Ｍ．，Ｙｏｕｎｇ，Ｈ．
Ａ．，Ｓｈｉｈ，Ｔ．Ｙ．，Ｃｈａｎｇ，Ｅ．Ｈ．，Ｌ
ｏｗｙ，Ｄ．Ｒ．およびＳｃｏｌｎｉｃｋ，Ｅ．Ｍ．
Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．３６：４０８−４２０（１９８０）。
この研究において、ＮＩＨ３Ｔ３単層に加えた場合正常
細胞遺伝子からの分子クローンはフォーカスを誘導しな
いのに対し、膀胱発癌遺伝子はトランスフェクトしたＤ
ＮＡマイクログラム当り約５×１０4のフォーカスを形
成させる生物活性を持つ事が示されている。Ｓｈｉｈ，
Ｃ．およびＷｅｉｎｂｅｒｇ，Ｒ．Ａ．Ｃｅｌｌ ２
９：１６１−１６９（１９８２）；およびＣｈａｎｇ，
Ｅ．Ｈ．，Ｇｏｎｄａ，Ｍ．Ａ．，Ｅｌｌｉｓ，Ｒ．
Ｗ．，Ｓｃｏｌｎｉｃｋ，Ｅ．Ｍ．およびＬｏｗｙ，
Ｄ．Ｒ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ７９：４８４８−５２（１９８２）を参照されたい。
【００１０】この純然たる機能上の相違は２つのクロー
ン間の明らかな構造的相違としては相関しない。ＥＪ発
癌遺伝子クローンおよび非クローン化関連ヒト始原発癌
遺伝子の大まかな制限エンドヌクレアーゼ部位地図作成
では、ＥＪ発癌遺伝子のトランスフォーミング活性を含
有する６．６Ｋｂ配列のすべてにわたって、この２つは
基本的に区別できない事が示された。Ｓｈｉｈ，Ｃ．お
よびＷｅｉｎｂｅｒｇ，Ｒ．Ａ．Ｃｅｌｌ ２９：１６
１−１６９（１９８２）を参照されたい。後になされた
精密な地図作成は２つの遺伝子の分子クローンの直接の
比較を可能にしたが、やはり遺伝子の暗号付け領域の
３’（下流）の１つの相違を除いては一連の異ったエン
ドヌクレアーゼを用いても相違は観察されなかった。こ
の相違は他の研究者により以前に証明されたタイプの、
遺伝子プール中に存在する遺伝子の機能とは無関係な多
形性を現わすものとして説明された。Ｇｏｌｄｆａｒ
ｂ，Ｍ．，Ｓｈｉｍｉｚｕ，Ｐｅｒｕｃｈｏ，Ｍ．およ
びＷｉｇｌｅｒ，Ｍ．Ｎａｔｕｒｅ ２９６：４０４−
４０９（１９８２）を参照されたい。
ン間の明らかな構造的相違としては相関しない。ＥＪ発
癌遺伝子クローンおよび非クローン化関連ヒト始原発癌
遺伝子の大まかな制限エンドヌクレアーゼ部位地図作成
では、ＥＪ発癌遺伝子のトランスフォーミング活性を含
有する６．６Ｋｂ配列のすべてにわたって、この２つは
基本的に区別できない事が示された。Ｓｈｉｈ，Ｃ．お
よびＷｅｉｎｂｅｒｇ，Ｒ．Ａ．Ｃｅｌｌ ２９：１６
１−１６９（１９８２）を参照されたい。後になされた
精密な地図作成は２つの遺伝子の分子クローンの直接の
比較を可能にしたが、やはり遺伝子の暗号付け領域の
３’（下流）の１つの相違を除いては一連の異ったエン
ドヌクレアーゼを用いても相違は観察されなかった。こ
の相違は他の研究者により以前に証明されたタイプの、
遺伝子プール中に存在する遺伝子の機能とは無関係な多
形性を現わすものとして説明された。Ｇｏｌｄｆａｒ
ｂ，Ｍ．，Ｓｈｉｍｉｚｕ，Ｐｅｒｕｃｈｏ，Ｍ．およ
びＷｉｇｌｅｒ，Ｍ．Ｎａｔｕｒｅ ２９６：４０４−
４０９（１９８２）を参照されたい。
【００１１】このように、ヒト膀胱癌発癌遺伝子および
その正常始原発癌遺伝子の２つの構造的に同様の遺伝子
の劇的な機能上の相違が示されてきた。２つの遺伝子の
構造上の相違は従来未知であるが、機能的相違を生み出
す相違は次の２つのうちの何れかの仕組によるものと推
測された。即ち、機能上の変化は、遺伝子の発現を調節
している配列の変化によるか、もしくはトランスフォー
ムした発現型の変化は遺伝子の蛋白質をコードする部分
の変化によるかである。第１の仮説は遺伝子の転写また
は翻訳を上昇させ、高水準の普通ならば正常の蛋白質を
産生するに違いないし、一方第２の仮説は変った蛋白質
の合成を示唆している。両方の型の変化もまた観察され
る機能上の相違を創造する事に関係するように働くかも
知れない。
その正常始原発癌遺伝子の２つの構造的に同様の遺伝子
の劇的な機能上の相違が示されてきた。２つの遺伝子の
構造上の相違は従来未知であるが、機能的相違を生み出
す相違は次の２つのうちの何れかの仕組によるものと推
測された。即ち、機能上の変化は、遺伝子の発現を調節
している配列の変化によるか、もしくはトランスフォー
ムした発現型の変化は遺伝子の蛋白質をコードする部分
の変化によるかである。第１の仮説は遺伝子の転写また
は翻訳を上昇させ、高水準の普通ならば正常の蛋白質を
産生するに違いないし、一方第２の仮説は変った蛋白質
の合成を示唆している。両方の型の変化もまた観察され
る機能上の相違を創造する事に関係するように働くかも
知れない。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、従来ヒト膀
胱癌を起こすことが示されているＥＪ発癌遺伝子および
その始原発癌遺伝子間の相違を調べる事に関する。示さ
れる方法はどんな変異体対立遺伝子およびその対応する
野生型対立遺伝子間の相違を決定するのに応用できる；
この方法は発癌遺伝子および始原発癌遺伝子間の相違を
決定するのに特に有効である。
胱癌を起こすことが示されているＥＪ発癌遺伝子および
その始原発癌遺伝子間の相違を調べる事に関する。示さ
れる方法はどんな変異体対立遺伝子およびその対応する
野生型対立遺伝子間の相違を決定するのに応用できる；
この方法は発癌遺伝子および始原発癌遺伝子間の相違を
決定するのに特に有効である。
【００１３】
【課題を解決するための手段】最初に、ＥＪ発癌遺伝子
およびその始原発癌遺伝子間の劇的な機能の相違が調節
機構によるものか、または配列の相違によるものかを決
定する実験を実施した。これらの実験により、前記遺伝
子の調節の促進が細胞トランスフォーメーションの原因
ではない事を示すデータが提供された。それ故、劇的な
機能変化は前記遺伝子のＤＮＡ配列の変化によるに違い
ないと決定された。
およびその始原発癌遺伝子間の劇的な機能の相違が調節
機構によるものか、または配列の相違によるものかを決
定する実験を実施した。これらの実験により、前記遺伝
子の調節の促進が細胞トランスフォーメーションの原因
ではない事を示すデータが提供された。それ故、劇的な
機能変化は前記遺伝子のＤＮＡ配列の変化によるに違い
ないと決定された。
【００１４】ＮＩＨ３Ｔ３線維芽細胞の細胞トランスフ
ォーメーションの原因となる６．６Ｋｂ ｐＥＪの範囲
を一連のイン ビトロでの遺伝子組換えにより３５０塩
基対のセグメントにしぼった。この３５０塩基対セグメ
ントについて、発癌遺伝子および始原発癌遺伝子の配列
が求められ、ＸｍａＩ制限部位から６０番目ヌクレオチ
ドの相違で説明される単一の塩基の置換が観察された。
この通常ＧＧＣとして存在するグリシン（Ｇｌｙ12）の
ためのコドンが置換され、バリンを発現するコドンのＧ
ＴＣ配列に変化していた。それ故、ＥＪおよびその始原
発癌遺伝子からの細胞ＤＮＡ中の特定の相違の場所がつ
きとめられ、対応するｐ２１蛋白質のアミノ酸配列の相
違もまた決定された。
ォーメーションの原因となる６．６Ｋｂ ｐＥＪの範囲
を一連のイン ビトロでの遺伝子組換えにより３５０塩
基対のセグメントにしぼった。この３５０塩基対セグメ
ントについて、発癌遺伝子および始原発癌遺伝子の配列
が求められ、ＸｍａＩ制限部位から６０番目ヌクレオチ
ドの相違で説明される単一の塩基の置換が観察された。
この通常ＧＧＣとして存在するグリシン（Ｇｌｙ12）の
ためのコドンが置換され、バリンを発現するコドンのＧ
ＴＣ配列に変化していた。それ故、ＥＪおよびその始原
発癌遺伝子からの細胞ＤＮＡ中の特定の相違の場所がつ
きとめられ、対応するｐ２１蛋白質のアミノ酸配列の相
違もまた決定された。
【００１５】次に、ＤＮＡ配列内のそのような変化を検
出する検定法を開発した。一つの型の検定法では発癌遺
伝子または始原発癌遺伝子の一方の部位に特有の制限酵
素（しかし、他のものにはそうではない）を用い、その
ＤＮＡ配列中の相違を検出する。これらの遺伝子により
暗号化されたｐ２１蛋白質もまた異っているので、ｐ２
１蛋白質中の変化した、または正常配列領域に、または
発癌の間に生じる変化には含まれないアミノ酸配列に特
異的なポリクローナルまたはモノクローナル抗体の如き
血清学の試薬もまた開発できた。そのような血清学試薬
はヒト膀胱発癌のための非常に感度の良い試験を提供す
る種々のプロトコールに用いる事ができる。同様に、こ
れらの検定は他の変異体対立遺伝子により起こされる野
生株の対立遺伝子の変化を検出するのに用いる事ができ
る。
出する検定法を開発した。一つの型の検定法では発癌遺
伝子または始原発癌遺伝子の一方の部位に特有の制限酵
素（しかし、他のものにはそうではない）を用い、その
ＤＮＡ配列中の相違を検出する。これらの遺伝子により
暗号化されたｐ２１蛋白質もまた異っているので、ｐ２
１蛋白質中の変化した、または正常配列領域に、または
発癌の間に生じる変化には含まれないアミノ酸配列に特
異的なポリクローナルまたはモノクローナル抗体の如き
血清学の試薬もまた開発できた。そのような血清学試薬
はヒト膀胱発癌のための非常に感度の良い試験を提供す
る種々のプロトコールに用いる事ができる。同様に、こ
れらの検定は他の変異体対立遺伝子により起こされる野
生株の対立遺伝子の変化を検出するのに用いる事ができ
る。
【００１６】
【実施例】前に指摘した如く、出願中の米国特許出願第
３７９，７２１号に記載されている方法により、ＥＪ膀
胱癌細胞株から発癌遺伝子が単離された。発癌遺伝子は
６．６Ｋｂを含みＮＩＨ３Ｔ３マウス線維芽細胞に対し
トランスフォームさせる活性を持つ事が示された。ここ
に記載した研究はこの従来の研究の続きであるから、こ
の先行する出願中の出願番号第３７９，７２１号はその
ため説明的に本明細書に含まれる。
３７９，７２１号に記載されている方法により、ＥＪ膀
胱癌細胞株から発癌遺伝子が単離された。発癌遺伝子は
６．６Ｋｂを含みＮＩＨ３Ｔ３マウス線維芽細胞に対し
トランスフォームさせる活性を持つ事が示された。ここ
に記載した研究はこの従来の研究の続きであるから、こ
の先行する出願中の出願番号第３７９，７２１号はその
ため説明的に本明細書に含まれる。
【００１７】ここにおいて“発癌遺伝子”の用語は細胞
中での発現型が細胞を正常細胞から癌細胞へ変換する事
を誘導する遺伝子配列を意味するものとして用いる。同
様に、用語“始原発癌遺伝子”は正常、非癌細胞の正常
ゲノム中に存在しており、適当な方法で変化させた場合
発癌遺伝子になる能力を持つ遺伝子配列を意味する。米
国特許出願第３７９，７２１号に記載されている方法で
単離した完全な発癌遺伝子クローン（ｐＥＪ）およびそ
の正常ヒト相同体クローン（ｐＥＣ）の配列決定は、こ
れら２つの遺伝子の配列の単純な比較には用いられな
い。発癌遺伝子およびその正常始原発癌遺伝子相対物配
列は別々の個体から得られたＤＮＡｓであるので、これ
らの間の多くの配列の相違はこの座位における自然に存
在する単なる多形性を反映しているかもしれない。他の
配列の相違は発癌の間に受ける突然変異傷害の結果かも
しれず、それは機能的に不活性であり、活性化過程には
重要性を持たない。
中での発現型が細胞を正常細胞から癌細胞へ変換する事
を誘導する遺伝子配列を意味するものとして用いる。同
様に、用語“始原発癌遺伝子”は正常、非癌細胞の正常
ゲノム中に存在しており、適当な方法で変化させた場合
発癌遺伝子になる能力を持つ遺伝子配列を意味する。米
国特許出願第３７９，７２１号に記載されている方法で
単離した完全な発癌遺伝子クローン（ｐＥＪ）およびそ
の正常ヒト相同体クローン（ｐＥＣ）の配列決定は、こ
れら２つの遺伝子の配列の単純な比較には用いられな
い。発癌遺伝子およびその正常始原発癌遺伝子相対物配
列は別々の個体から得られたＤＮＡｓであるので、これ
らの間の多くの配列の相違はこの座位における自然に存
在する単なる多形性を反映しているかもしれない。他の
配列の相違は発癌の間に受ける突然変異傷害の結果かも
しれず、それは機能的に不活性であり、活性化過程には
重要性を持たない。
【００１８】発癌遺伝子および始原発癌遺伝子間の有意
な相違が調節の相違によるかどうかを決定する為、正常
ヒト膀胱上皮細胞株からのｃ−Ｈａ−ｒａｓ始原発癌遺
伝子（ＥＣ）の発現と、ＥＪでトランスフォームされた
膀胱細胞中の発癌遺伝子の発現の比較を行った。用いた
Ｈｂ１−５膀胱上皮細胞は、５ケ月のヒト膀胱から得ら
れた不活性化ＮＩＨ３Ｔ３フィーダーレヤー上で増殖さ
せた初代組織培養のものである。この培養細胞を新鮮ヒ
ト膀胱組織から成長させると、遷移的な膀胱上皮に期待
されるいくつかの性質を示した。それは基礎にある間質
物質がなく、その結果、膀胱癌の由来した細胞に厳密に
相当するものである。
な相違が調節の相違によるかどうかを決定する為、正常
ヒト膀胱上皮細胞株からのｃ−Ｈａ−ｒａｓ始原発癌遺
伝子（ＥＣ）の発現と、ＥＪでトランスフォームされた
膀胱細胞中の発癌遺伝子の発現の比較を行った。用いた
Ｈｂ１−５膀胱上皮細胞は、５ケ月のヒト膀胱から得ら
れた不活性化ＮＩＨ３Ｔ３フィーダーレヤー上で増殖さ
せた初代組織培養のものである。この培養細胞を新鮮ヒ
ト膀胱組織から成長させると、遷移的な膀胱上皮に期待
されるいくつかの性質を示した。それは基礎にある間質
物質がなく、その結果、膀胱癌の由来した細胞に厳密に
相当するものである。
【００１９】総細胞ＲＮＡが正常およびトランスフォー
ムした膀胱細胞から調製された。ホルムアルデヒドゲル
上でＲＮＡを展開し、ニトロセルロースフィルターに移
行し、ニック−トランスレートしたＥＪ発癌遺伝子クロ
ーンでフィルターをプローブし、転写ＲＮＡを分析し
た。用いた具体的方法は以下の如くである。
ムした膀胱細胞から調製された。ホルムアルデヒドゲル
上でＲＮＡを展開し、ニトロセルロースフィルターに移
行し、ニック−トランスレートしたＥＪ発癌遺伝子クロ
ーンでフィルターをプローブし、転写ＲＮＡを分析し
た。用いた具体的方法は以下の如くである。
【００２０】総ポリアデニル化ＲＮＡはＶａｒｍｕｓら
の技術により調製した。Ｖａｒｍｕｓ，Ｈ．Ｅ．，Ｑｕ
ｉｎｔｒｅｌｌ，Ｎ．およびＯｒｔｉｚ，Ｓ．Ｃｅｌｌ
２５：２３−３６（１９８１）を参照されたい。次
に、４マイクログラムのＲＮＡをホルムアルデヒド含有
２パーセントアガロースゲルを通した電気泳動により分
画し、ニトロセルロースへ移行させる。ｒａｓ−特異プ
ローブは、ｐＥＪをＢａｍＨＩで切断し、生じる断片を
１パーセントアガロースを通して分画し、６．６Ｋｂ断
片をＮａＩおよびガラスビーズで抽出することにより調
製した。ニック−トランスレートしたフラグメント
（６．６×１０7ｃｐｍ／マイクログラム）を固定化し
たＲＮＡにアニールした。Ｒｉｇｂｙ，Ｐ．Ｗ．らＪ．
Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１３：２３７−２５１（１９７
７）；およびＷａｈｌ，Ｇ．Ｍ．，Ｓｔｅｒｎ，Ｍ．お
よびＳｔａｒｋ，Ｇ．Ｒ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ，Ｓｃｉ．ＵＳＡ７６：３６８３−３６８７（１９７
９）を参照されたい。プローブと相同のバンドはオート
ラジオグラフィーにより視覚化する。分子量は、アデノ
ウィルスレイトプロモーターのイン ビトロ ラン−オ
フ転写により得られたマーカーとの比較により決定し
た。Ｍａｎｌｅｙ，Ｊ．Ｌ．らＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ，Ｓｃｉ．ＵＳＡ７７：３８５５−３８５９（１
９８０）を参照されたい。図１Ａは２つの細胞型中のｃ
−Ｈａ−ｒａｓ特異ＲＮＡの相対レベルを示す：レーン
１，ＥＪ細胞からのＲＮＡ；レーン２，Ｈｂ１−５細胞
からのＲＮＡ。観察される如く、同じレベルのＲＮＡが
２つの培養細胞で検出され、転写されたサイズは１．２
Ｋｂであった。
の技術により調製した。Ｖａｒｍｕｓ，Ｈ．Ｅ．，Ｑｕ
ｉｎｔｒｅｌｌ，Ｎ．およびＯｒｔｉｚ，Ｓ．Ｃｅｌｌ
２５：２３−３６（１９８１）を参照されたい。次
に、４マイクログラムのＲＮＡをホルムアルデヒド含有
２パーセントアガロースゲルを通した電気泳動により分
画し、ニトロセルロースへ移行させる。ｒａｓ−特異プ
ローブは、ｐＥＪをＢａｍＨＩで切断し、生じる断片を
１パーセントアガロースを通して分画し、６．６Ｋｂ断
片をＮａＩおよびガラスビーズで抽出することにより調
製した。ニック−トランスレートしたフラグメント
（６．６×１０7ｃｐｍ／マイクログラム）を固定化し
たＲＮＡにアニールした。Ｒｉｇｂｙ，Ｐ．Ｗ．らＪ．
Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１３：２３７−２５１（１９７
７）；およびＷａｈｌ，Ｇ．Ｍ．，Ｓｔｅｒｎ，Ｍ．お
よびＳｔａｒｋ，Ｇ．Ｒ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ，Ｓｃｉ．ＵＳＡ７６：３６８３−３６８７（１９７
９）を参照されたい。プローブと相同のバンドはオート
ラジオグラフィーにより視覚化する。分子量は、アデノ
ウィルスレイトプロモーターのイン ビトロ ラン−オ
フ転写により得られたマーカーとの比較により決定し
た。Ｍａｎｌｅｙ，Ｊ．Ｌ．らＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ，Ｓｃｉ．ＵＳＡ７７：３８５５−３８５９（１
９８０）を参照されたい。図１Ａは２つの細胞型中のｃ
−Ｈａ−ｒａｓ特異ＲＮＡの相対レベルを示す：レーン
１，ＥＪ細胞からのＲＮＡ；レーン２，Ｈｂ１−５細胞
からのＲＮＡ。観察される如く、同じレベルのＲＮＡが
２つの培養細胞で検出され、転写されたサイズは１．２
Ｋｂであった。
【００２１】ｒａｓ遺伝子のただ１つ知られている生成
物は約２１，０００ダルトンの質量の蛋白質（ｐ２１と
名付けられている）である。ＥＪおよび正常膀胱細胞の
両方からのｐ２１蛋白質溶解物の泳動速度を分析する実
験を行った。ｖ−Ｈａ−ｒａｓ ｐ２１蛋白質に対する
モノクローナル抗血清を用いた。Ｆｕｒｔｈ，Ｍ．
Ｅ．，Ｄａｖｉｓ，Ｌ．Ｊ．，Ｆｌｅｕｒｄｅｌｙｓ，
Ｂ．およびＳｃｏｌｎｉｃｋ，Ｅ．Ｍ．Ｊ．Ｖｉｒｏ
ｌ．４３：２９４−３０４（１９８２）を参照された
い。存在する抗原の免疫沈降が必要とするより過剰の抗
体量を使用した事は対照実験により確認した。結果を図
１Ｂに示す。
物は約２１，０００ダルトンの質量の蛋白質（ｐ２１と
名付けられている）である。ＥＪおよび正常膀胱細胞の
両方からのｐ２１蛋白質溶解物の泳動速度を分析する実
験を行った。ｖ−Ｈａ−ｒａｓ ｐ２１蛋白質に対する
モノクローナル抗血清を用いた。Ｆｕｒｔｈ，Ｍ．
Ｅ．，Ｄａｖｉｓ，Ｌ．Ｊ．，Ｆｌｅｕｒｄｅｌｙｓ，
Ｂ．およびＳｃｏｌｎｉｃｋ，Ｅ．Ｍ．Ｊ．Ｖｉｒｏ
ｌ．４３：２９４−３０４（１９８２）を参照された
い。存在する抗原の免疫沈降が必要とするより過剰の抗
体量を使用した事は対照実験により確認した。結果を図
１Ｂに示す。
【００２２】具体的には、培養細胞を１２時間35Ｓ−メ
チオニンで標識した。その後溶解物を調製し、非免疫血
清（レーン１ａおよび２ａ）、Ｈａ−ＭｕＳＶでコード
されたｐ２１を沈降させ、しかしＫｉ−ＭｕＳＶでコー
ドされたｐ２１は沈降させないモノクローナル抗血清
（Ｙ１３−２３８）（レーン１ｂおよび２ｂ）またはＨ
ａ−ＭｕＳＶおよびＫｉ−ＭｕＳＶのｐ２１を両方検出
するモノクローナル抗血清（Ｙ１３−２５９）（レーン
１ｃおよび２ｃ）で免疫沈降させる。Ｓｈｉｈ，Ｔ．
Ｙ．，Ｗｅｅｋｓ，Ｍ．Ｏ．，Ｙｏｕｎｇ，Ｈ．Ａ．お
よびＳｃｏｌｎｉｃｋ，Ｅ．Ｍ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ９
６：６４−７９（１９７９）を参照されたい。試料当り
２０×１０6ｃｐｍの溶解物を１２．５パーセントＳＤ
Ｓ−アクリルアミドゲルの電気泳動で分離した。
チオニンで標識した。その後溶解物を調製し、非免疫血
清（レーン１ａおよび２ａ）、Ｈａ−ＭｕＳＶでコード
されたｐ２１を沈降させ、しかしＫｉ−ＭｕＳＶでコー
ドされたｐ２１は沈降させないモノクローナル抗血清
（Ｙ１３−２３８）（レーン１ｂおよび２ｂ）またはＨ
ａ−ＭｕＳＶおよびＫｉ−ＭｕＳＶのｐ２１を両方検出
するモノクローナル抗血清（Ｙ１３−２５９）（レーン
１ｃおよび２ｃ）で免疫沈降させる。Ｓｈｉｈ，Ｔ．
Ｙ．，Ｗｅｅｋｓ，Ｍ．Ｏ．，Ｙｏｕｎｇ，Ｈ．Ａ．お
よびＳｃｏｌｎｉｃｋ，Ｅ．Ｍ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ９
６：６４−７９（１９７９）を参照されたい。試料当り
２０×１０6ｃｐｍの溶解物を１２．５パーセントＳＤ
Ｓ−アクリルアミドゲルの電気泳動で分離した。
【００２３】図１ＢはＥＪ細胞クローン（レーン１，ａ
−ｃ）およびＨｂ１−５細胞（レーン２，ａ−ｃ）の細
胞溶解物から免疫沈降したｐ２１蛋白質の比較を示す。
これらのデータは正常膀胱細胞からの抗−ｐ２１血清に
より放射標識蛋白質の少くとも２つのバンドが特異的に
免疫沈降した事を示す。膀胱癌細胞の蛋白質パターンの
詳細な解析によりバンドの複雑な配列が明らかになっ
た：近い間隔の２重バンドが２対。ｐ２１バンドの強度
を非特異的に沈降させたバックグラウンドのバンドの強
度の比較により、正常および癌細胞のｐ２１蛋白質は同
程度の量存在する事が明らかとなった。
−ｃ）およびＨｂ１−５細胞（レーン２，ａ−ｃ）の細
胞溶解物から免疫沈降したｐ２１蛋白質の比較を示す。
これらのデータは正常膀胱細胞からの抗−ｐ２１血清に
より放射標識蛋白質の少くとも２つのバンドが特異的に
免疫沈降した事を示す。膀胱癌細胞の蛋白質パターンの
詳細な解析によりバンドの複雑な配列が明らかになっ
た：近い間隔の２重バンドが２対。ｐ２１バンドの強度
を非特異的に沈降させたバックグラウンドのバンドの強
度の比較により、正常および癌細胞のｐ２１蛋白質は同
程度の量存在する事が明らかとなった。
【００２４】上記のデータは転写の活発化がＥＪ発癌遺
伝子により示される新しい活性の原因ではない事を示し
ている。この結論は用いたハイブリダイゼーションの条
件下、発癌遺伝子プローブがヒトｃ−Ｈａ−ｒａｓ遺伝
子の転写物に独占的に反応するという事実に一部依存し
ている。蛋白質のデータの解釈はあまり明確ではない
が、両方の細胞がＨａｒｖｅｙー特異血清に反応性のあ
る同じような量の蛋白質を持ち、これらの蛋白質は集合
的に“ｐ２１”と称される事は明らかである。
伝子により示される新しい活性の原因ではない事を示し
ている。この結論は用いたハイブリダイゼーションの条
件下、発癌遺伝子プローブがヒトｃ−Ｈａ−ｒａｓ遺伝
子の転写物に独占的に反応するという事実に一部依存し
ている。蛋白質のデータの解釈はあまり明確ではない
が、両方の細胞がＨａｒｖｅｙー特異血清に反応性のあ
る同じような量の蛋白質を持ち、これらの蛋白質は集合
的に“ｐ２１”と称される事は明らかである。
【００２５】膀胱上皮細胞が膀胱癌細胞の正常前駆体の
代表ではないという可能性が残っている。ｒａｓ遺伝子
は一つの細胞種においてはトランスフォーメーションを
誘導する事なく高い水準で発現され、第２の細胞種にお
いて不適当に発現される場合にのみこの表現型を達成す
る可能性があるので、上記可能性は解釈を難かしくす
る。それ故、２つの遺伝子を同じ細胞のバックグラウン
ド下において転写および翻訳の程度を測定した。
代表ではないという可能性が残っている。ｒａｓ遺伝子
は一つの細胞種においてはトランスフォーメーションを
誘導する事なく高い水準で発現され、第２の細胞種にお
いて不適当に発現される場合にのみこの表現型を達成す
る可能性があるので、上記可能性は解釈を難かしくす
る。それ故、２つの遺伝子を同じ細胞のバックグラウン
ド下において転写および翻訳の程度を測定した。
【００２６】両方の遺伝子の分子クローンをＮＩＨ３Ｔ
３細胞に導入した。ＥＪ発癌遺伝子を獲得したコロニー
は容易にそのトランスフォームした形態から同定され
る。しかしながら、正常対立遺伝子のクローンを獲得し
た細胞は、挙動上の明瞭な変化による同定をすることが
できない。
３細胞に導入した。ＥＪ発癌遺伝子を獲得したコロニー
は容易にそのトランスフォームした形態から同定され
る。しかしながら、正常対立遺伝子のクローンを獲得し
た細胞は、挙動上の明瞭な変化による同定をすることが
できない。
【００２７】この為、優性で選択できるＥｃｏｇｐｔ遺
伝子のクローンを１０倍過剰量のクローン化ＥＪ発癌遺
伝子またはクロン化始原発癌遺伝子（ｐＥＣ）と一緒に
ＮＩＨ３Ｔ３細胞にトランスフェクトした。特に２×１
０6細胞当り、７５マイクログラムのＮＩＨ３Ｔ３キャ
リアＤＮＡ、５００ｎｇのｐＥＪまたはｐＥＣ ＤＮ
Ａ、および５０ｎｇのｐＳＶＺｇｐｔを用い、既知の技
術を用いてトランスフェクションを実施した。Ｇｒａｈ
ａｍ，Ｆ．Ｌ．およびＶａｎ ｄｅｒ Ｅｂ，Ａ．Ｊ．
Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２：４５６−４７１（１９７
３）；およびＡｎｄｅｒｓｓｏｎ，Ｐ．，Ｇｏｌｄｆａ
ｒｂ，Ｍ．Ｐ．およびＷｅｉｎｂｅｒｇ，Ｒ．Ａ．Ｃｅ
ｌｌ １６：６３−７５（１９７９）を参照されたい。
各々の場合、Ｅｃｏｇｐｔ遺伝子により与えられるミコ
フェノール酸への抵抗性でコロニーを選択した。Ｍｕｌ
ｌｉｇａｎ，Ｒ．およびＢｅｒｇ，Ｐ．Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７３：２０７２−２
０７６（１９８１）を参照されたい。
伝子のクローンを１０倍過剰量のクローン化ＥＪ発癌遺
伝子またはクロン化始原発癌遺伝子（ｐＥＣ）と一緒に
ＮＩＨ３Ｔ３細胞にトランスフェクトした。特に２×１
０6細胞当り、７５マイクログラムのＮＩＨ３Ｔ３キャ
リアＤＮＡ、５００ｎｇのｐＥＪまたはｐＥＣ ＤＮ
Ａ、および５０ｎｇのｐＳＶＺｇｐｔを用い、既知の技
術を用いてトランスフェクションを実施した。Ｇｒａｈ
ａｍ，Ｆ．Ｌ．およびＶａｎ ｄｅｒ Ｅｂ，Ａ．Ｊ．
Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２：４５６−４７１（１９７
３）；およびＡｎｄｅｒｓｓｏｎ，Ｐ．，Ｇｏｌｄｆａ
ｒｂ，Ｍ．Ｐ．およびＷｅｉｎｂｅｒｇ，Ｒ．Ａ．Ｃｅ
ｌｌ １６：６３−７５（１９７９）を参照されたい。
各々の場合、Ｅｃｏｇｐｔ遺伝子により与えられるミコ
フェノール酸への抵抗性でコロニーを選択した。Ｍｕｌ
ｌｉｇａｎ，Ｒ．およびＢｅｒｇ，Ｐ．Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７３：２０７２−２
０７６（１９８１）を参照されたい。
【００２８】非選択セグメントの導入が選択可能遺伝子
との共トランスフェクションにより確められるのでこの
戦略を用いた。Ｗｉｇｌｅｒ，Ｍ．らＣｅｌｌ １６：
７７７−７８５（１９７９）を参照されたい。この例で
は、ＥｃｏｇｐｔおよびｐＥＪの共トランスフェクショ
ンにより誘導される７５パーセントのミコフェノール酸
耐性コロニーが形態的にトランスフォームしている事が
観察された；予期した通り、ｐＥＣによる共トランスフ
ェクション後現われるコロニーはトランスフォームして
いなかった。
との共トランスフェクションにより確められるのでこの
戦略を用いた。Ｗｉｇｌｅｒ，Ｍ．らＣｅｌｌ １６：
７７７−７８５（１９７９）を参照されたい。この例で
は、ＥｃｏｇｐｔおよびｐＥＪの共トランスフェクショ
ンにより誘導される７５パーセントのミコフェノール酸
耐性コロニーが形態的にトランスフォームしている事が
観察された；予期した通り、ｐＥＣによる共トランスフ
ェクション後現われるコロニーはトランスフォームして
いなかった。
【００２９】両方の種類のコロニーの細胞ＤＮＡをｐＥ
ＣまたはｐＥＪ配列が存在するか否かのために分析し
た。クローン化発癌遺伝子または始原発癌遺伝子の各々
の無傷のコピーから６．６Ｋｂフラグメントを遊離する
事が期待されるエンドヌクレアーゼＢａｍＨＩで各々の
ＤＮＡ１０マイクログラムを消化した。消化されたＤＮ
Ａは１パーセントアガロースゲルを通して分画し、ニト
ロセルロースペーパーに移す。５×１０6ｃｐｍのｒａ
ｓ−特異プローブ（前に記載したものと同じ）をフィル
ターに結合したＤＮＡとインキュベートする。結果は図
２Ａに示してありレーンは：レーン１、ＮＩＨ３Ｔ３
ＤＮＡ；レーン２および３、ｐＥＪでトランスフェクト
した細胞株からのＤＮＡ：ＥＪ／Ｇｐｔ−２（２）およ
びＥＪ／Ｇｐｔ−３（３）；レーン４および５、ｐＥＣ
でトランスフェクトした細胞株からのＤＮＡ：ＥＣ／Ｇ
ｐｔ−１（４）およびＥＣ／Ｇｐｔ−５（５）。
ＣまたはｐＥＪ配列が存在するか否かのために分析し
た。クローン化発癌遺伝子または始原発癌遺伝子の各々
の無傷のコピーから６．６Ｋｂフラグメントを遊離する
事が期待されるエンドヌクレアーゼＢａｍＨＩで各々の
ＤＮＡ１０マイクログラムを消化した。消化されたＤＮ
Ａは１パーセントアガロースゲルを通して分画し、ニト
ロセルロースペーパーに移す。５×１０6ｃｐｍのｒａ
ｓ−特異プローブ（前に記載したものと同じ）をフィル
ターに結合したＤＮＡとインキュベートする。結果は図
２Ａに示してありレーンは：レーン１、ＮＩＨ３Ｔ３
ＤＮＡ；レーン２および３、ｐＥＪでトランスフェクト
した細胞株からのＤＮＡ：ＥＪ／Ｇｐｔ−２（２）およ
びＥＪ／Ｇｐｔ−３（３）；レーン４および５、ｐＥＣ
でトランスフェクトした細胞株からのＤＮＡ：ＥＣ／Ｇ
ｐｔ−１（４）およびＥＣ／Ｇｐｔ−５（５）。
【００３０】正常マウスｒａｓ遺伝子相同体はｐＥＪプ
ローブと非常に弱くハイブリダイズする。Ｐａｒａｄ
ａ，Ｌ．Ｆ．，Ｔａｂｉｎ，Ｃ．Ｊ．，Ｓｈｉｈ，Ｃ．
およびＷｅｉｎｂｅｒｇ，Ｒ．Ａ．Ｎａｔｕｒｅ ２９
７：４７４−４７９（１９８２）を参照されたい。従っ
て、その存在は結果に不鮮明さをもたらさない。トラン
スフェクトしたｐＢＲ３２２配列がデータの解釈を妨害
しない事を確めるため、ｒａｓ−特異配列をｐＥＪから
作り、プローブとして使用した。始原発癌遺伝子でトラ
ンスフェクトされた非トランスフォームコロニーの７５
％およびトランスフォームした発癌遺伝子でトランスフ
ェクトされたコロニーの全てが、６．６Ｋｂの泳動部に
ｐＥＪ−相同体配列の存在を示した。
ローブと非常に弱くハイブリダイズする。Ｐａｒａｄ
ａ，Ｌ．Ｆ．，Ｔａｂｉｎ，Ｃ．Ｊ．，Ｓｈｉｈ，Ｃ．
およびＷｅｉｎｂｅｒｇ，Ｒ．Ａ．Ｎａｔｕｒｅ ２９
７：４７４−４７９（１９８２）を参照されたい。従っ
て、その存在は結果に不鮮明さをもたらさない。トラン
スフェクトしたｐＢＲ３２２配列がデータの解釈を妨害
しない事を確めるため、ｒａｓ−特異配列をｐＥＪから
作り、プローブとして使用した。始原発癌遺伝子でトラ
ンスフェクトされた非トランスフォームコロニーの７５
％およびトランスフォームした発癌遺伝子でトランスフ
ェクトされたコロニーの全てが、６．６Ｋｂの泳動部に
ｐＥＪ−相同体配列の存在を示した。
【００３１】陽性のコロニーはまたプローブにアニール
された他のサイズのＢａｍＨＩフラグメントを持つ。こ
れらはトランスフェクション過程の間に分解したクロー
ンのコピーである。
された他のサイズのＢａｍＨＩフラグメントを持つ。こ
れらはトランスフェクション過程の間に分解したクロー
ンのコピーである。
【００３２】発癌遺伝子の無傷のコピーを含有する２つ
の細胞株および始原発癌遺伝子の無傷のコピーと殆んど
等しいものを含有する２つの細胞株を更に別の分析の為
に選択する。図３に５００Ｘの倍率での位相差顕微鏡で
撮ったこれらの細胞株の写真を示した。ｐＥＪでトラン
スフェクトした細胞株はコンフルエントの状態（ＥＪ／
Ｇｐｔ−２，写真３Ａ）およびサブコンフルエント（Ｅ
Ｊ／Ｇｐｔ−３，写真３Ｂ）で示してある。ｐＥＣでト
ランスフェクトした細胞株もまたコンフルエント（ＥＣ
／Ｇｐｔ−５，写真３Ｃ）およびサブコンフルエント
（ＥＣ／Ｇｐｔ−１，写真３Ｄ）で示してある。
の細胞株および始原発癌遺伝子の無傷のコピーと殆んど
等しいものを含有する２つの細胞株を更に別の分析の為
に選択する。図３に５００Ｘの倍率での位相差顕微鏡で
撮ったこれらの細胞株の写真を示した。ｐＥＪでトラン
スフェクトした細胞株はコンフルエントの状態（ＥＪ／
Ｇｐｔ−２，写真３Ａ）およびサブコンフルエント（Ｅ
Ｊ／Ｇｐｔ−３，写真３Ｂ）で示してある。ｐＥＣでト
ランスフェクトした細胞株もまたコンフルエント（ＥＣ
／Ｇｐｔ−５，写真３Ｃ）およびサブコンフルエント
（ＥＣ／Ｇｐｔ−１，写真３Ｄ）で示してある。
【００３３】細胞総ＲＮＡをすべてのトランスフェクト
した細胞株から調製する。次いで、ＲＮＡ調製物をホル
ムアルデヒドゲル上で泳動し、ニトロセルロースフィル
ターに移し、ｒａｓ−特異ＤＮＡでプローブした。前に
記載した方法を用い、結果を図２Ｂに示した（図中のレ
ーンにおいて：レーン１，ＮＩＨ３Ｔ３細胞からのＲＮ
Ａ；レーン２，ＥＪ／Ｇｐｔ−２細胞；レーン３，ＥＪ
／Ｇｐｔ−３細胞；レーン４，ＥＣ／Ｇｐｔ−１細胞；
レーン５，ＥＣ／Ｇｐｔ−５細胞）。
した細胞株から調製する。次いで、ＲＮＡ調製物をホル
ムアルデヒドゲル上で泳動し、ニトロセルロースフィル
ターに移し、ｒａｓ−特異ＤＮＡでプローブした。前に
記載した方法を用い、結果を図２Ｂに示した（図中のレ
ーンにおいて：レーン１，ＮＩＨ３Ｔ３細胞からのＲＮ
Ａ；レーン２，ＥＪ／Ｇｐｔ−２細胞；レーン３，ＥＪ
／Ｇｐｔ−３細胞；レーン４，ＥＣ／Ｇｐｔ−１細胞；
レーン５，ＥＣ／Ｇｐｔ−５細胞）。
【００３４】これらの細胞中のｐ２１のレベルもまた試
験した。細胞溶解物を調製し、免疫沈降させ、前に記載
した方法で分析した。結果を図２Ｃに示した：非−免疫
血清（レーン１，２，７，８）またはＨａ−ＭｕＳＶ
ｐ２１を沈降させるモノクローナル抗血清（Ｙ１３−２
３８）（レーン３−６）を用いて免疫沈降した。細胞溶
解物はＥＪ／Ｇｐｔ−２（レーン１，３）；ＥＣ／Ｇｐ
ｔ−１（レーン２，４）；ＥＪ／Ｇｐｔ−３（レーン
５，７）およびＥＣ／Ｇｐｔ−５（レーン６，８）から
調製した。観察される如く、ｐ２１に対するモノクロー
ナル血清はｐＥＣおよびｐＥＪトランスフェクト細胞中
の同量のｐ２１蛋白質を沈降させる。
験した。細胞溶解物を調製し、免疫沈降させ、前に記載
した方法で分析した。結果を図２Ｃに示した：非−免疫
血清（レーン１，２，７，８）またはＨａ−ＭｕＳＶ
ｐ２１を沈降させるモノクローナル抗血清（Ｙ１３−２
３８）（レーン３−６）を用いて免疫沈降した。細胞溶
解物はＥＪ／Ｇｐｔ−２（レーン１，３）；ＥＣ／Ｇｐ
ｔ−１（レーン２，４）；ＥＪ／Ｇｐｔ−３（レーン
５，７）およびＥＣ／Ｇｐｔ−５（レーン６，８）から
調製した。観察される如く、ｐ２１に対するモノクロー
ナル血清はｐＥＣおよびｐＥＪトランスフェクト細胞中
の同量のｐ２１蛋白質を沈降させる。
【００３５】これらのデータは、これら特定のｐＥＪト
ランスフェクト細胞中で、獲得されたｐＥＪのコピーの
一部のもののみが活性であり、一方で他の細胞中のトラ
ンスフェクトされたｐＥＣ遺伝子の全てのコピーが活性
である可能性も形式上では否定できないので、細胞中で
２つのクローン化遺伝子が同じ速度で転写されるかどう
かという質問に完全に答えるわけではない。そのような
場合、観察される蛋白質またはＲＮＡの同じようなレベ
ルが正確に２つの遺伝子の固有の転写活性を反映してい
るわけではない。
ランスフェクト細胞中で、獲得されたｐＥＪのコピーの
一部のもののみが活性であり、一方で他の細胞中のトラ
ンスフェクトされたｐＥＣ遺伝子の全てのコピーが活性
である可能性も形式上では否定できないので、細胞中で
２つのクローン化遺伝子が同じ速度で転写されるかどう
かという質問に完全に答えるわけではない。そのような
場合、観察される蛋白質またはＲＮＡの同じようなレベ
ルが正確に２つの遺伝子の固有の転写活性を反映してい
るわけではない。
【００３６】しかしながら、一つの点は明確になった：
ＥＪ−特定ｐ２１のあるレベルでトランスフォーメーシ
ョンが誘導され、一方同じレベルの始原発癌遺伝子−特
定のｐ２１は細胞の表現型に影響を及ぼさない。ｐ２１
蛋白質はこれらの遺伝子で暗号されるただ１つの明らか
な遺伝子産物であるので、ＥＪ発癌遺伝子および始原発
癌遺伝子間の機能の相違はｐ２１蛋白質中の構造変化に
誘導されるに違いないと結論される。反対に、調節的変
化は発癌遺伝子のトランスフォーム化活性に決定的でな
いように思われる。
ＥＪ−特定ｐ２１のあるレベルでトランスフォーメーシ
ョンが誘導され、一方同じレベルの始原発癌遺伝子−特
定のｐ２１は細胞の表現型に影響を及ぼさない。ｐ２１
蛋白質はこれらの遺伝子で暗号されるただ１つの明らか
な遺伝子産物であるので、ＥＪ発癌遺伝子および始原発
癌遺伝子間の機能の相違はｐ２１蛋白質中の構造変化に
誘導されるに違いないと結論される。反対に、調節的変
化は発癌遺伝子のトランスフォーム化活性に決定的でな
いように思われる。
【００３７】このため、以前に検出されていた異った細
胞からのｐ２１蛋白質の移動速度の僅かな変化（図１ｂ
および２ｃ）に新たな重要性が与えられる。それ故、ｐ
２１蛋白質を移動の相違がより容易に分離できるような
条件下で再分析した。結果を図４に示した。詳細には、
細胞を３時間35Ｓ−メチオニンで代謝的に標識する；細
胞溶解物を調製し、免疫沈降させ、前に記載した如く分
析する。細胞株ＥＪ／Ｇｐｔ−３（レーン１，３）およ
び細胞株ＥＣ／Ｇｐｔ−１（レーン２，４）からの溶解
物をモノクローナル抗ｐ２１抗血清Ｙ１３−２３８（レ
ーン１，２）または非免疫血清（レーン３，４）で沈降
させる。模式的泳動図（レーン５：ＥＪ／Ｇｐｔ−３；
レーン６：ＥＣ／Ｇｐｔ−１）に動力学的データおよび
以前に公表された実験に基づいての検出されたｐ２１バ
ンドの相対的位置およびこれらのバンドの関係（矢印）
の両方を示した。Ｓｈｉｈ，Ｔ．Ｙ．らＪ．Ｖｉｒｏ
ｌ．４２：２５３−２６１（１９８２）を参照された
い。
胞からのｐ２１蛋白質の移動速度の僅かな変化（図１ｂ
および２ｃ）に新たな重要性が与えられる。それ故、ｐ
２１蛋白質を移動の相違がより容易に分離できるような
条件下で再分析した。結果を図４に示した。詳細には、
細胞を３時間35Ｓ−メチオニンで代謝的に標識する；細
胞溶解物を調製し、免疫沈降させ、前に記載した如く分
析する。細胞株ＥＪ／Ｇｐｔ−３（レーン１，３）およ
び細胞株ＥＣ／Ｇｐｔ−１（レーン２，４）からの溶解
物をモノクローナル抗ｐ２１抗血清Ｙ１３−２３８（レ
ーン１，２）または非免疫血清（レーン３，４）で沈降
させる。模式的泳動図（レーン５：ＥＪ／Ｇｐｔ−３；
レーン６：ＥＣ／Ｇｐｔ−１）に動力学的データおよび
以前に公表された実験に基づいての検出されたｐ２１バ
ンドの相対的位置およびこれらのバンドの関係（矢印）
の両方を示した。Ｓｈｉｈ，Ｔ．Ｙ．らＪ．Ｖｉｒｏ
ｌ．４２：２５３−２６１（１９８２）を参照された
い。
【００３８】図４のデータはｐＥＪおよびｐＥＣでトラ
ンスフェクトされたものでは各々ｐ２１の２つのバンド
が現われる事を示している。より高い分子量のｐＥＪト
ランスフェクトｐ２１蛋白質はより高い分子量のｐＥＣ
トランスフェクト蛋白質よりゆっくりと移動し、より低
い分子量のｐＥＪトランスフェクトｐ２１はより低い分
子量のｐＥＣトランスフェクトｐ２１よりよりゆっくり
移動した。各々の場合よりゆっくり移動するバンドはよ
り急速に移動するバンドの動力学的前駆体の如く行動し
た。ｖ−Ｈａ−ｒａｓのｐ２１蛋白質についての相当す
る従来データは、高分子量側のバンドは翻訳後に切断を
受けて低分子量側のより速く移動するバンドに変ること
を示している。Ｓｈｉｈ，Ｔ．Ｙ．らＪ．Ｖｉｒｏｌ．
４２：２５３−２６１（１９８２）を参照されたい。
ンスフェクトされたものでは各々ｐ２１の２つのバンド
が現われる事を示している。より高い分子量のｐＥＪト
ランスフェクトｐ２１蛋白質はより高い分子量のｐＥＣ
トランスフェクト蛋白質よりゆっくりと移動し、より低
い分子量のｐＥＪトランスフェクトｐ２１はより低い分
子量のｐＥＣトランスフェクトｐ２１よりよりゆっくり
移動した。各々の場合よりゆっくり移動するバンドはよ
り急速に移動するバンドの動力学的前駆体の如く行動し
た。ｖ−Ｈａ−ｒａｓのｐ２１蛋白質についての相当す
る従来データは、高分子量側のバンドは翻訳後に切断を
受けて低分子量側のより速く移動するバンドに変ること
を示している。Ｓｈｉｈ，Ｔ．Ｙ．らＪ．Ｖｉｒｏｌ．
４２：２５３−２６１（１９８２）を参照されたい。
【００３９】これらｐ２１蛋白質は全部少しもリン酸化
されていないと思われるので、ｐＥＪおよびｐＥＣ蛋白
質間の移動速度の相違にはアミノ酸の数またはコンホメ
ーションの変化が寄与する可能性が最も高い。
されていないと思われるので、ｐＥＪおよびｐＥＣ蛋白
質間の移動速度の相違にはアミノ酸の数またはコンホメ
ーションの変化が寄与する可能性が最も高い。
【００４０】図４のデータおよび模式図は正常およびト
ランスフォームした膀胱細胞で観察されるｐ２１蛋白質
の複雑さ（図１ｂ）の説明を提供する：正常細胞は始原
発癌遺伝子の発現による２つのバンドを示し；癌細胞は
４つのバンドを示すように思われ、２つはこれらの細胞
の発癌遺伝子により特定され、２つは他の相同染色体の
正常始原発癌遺伝子による。
ランスフォームした膀胱細胞で観察されるｐ２１蛋白質
の複雑さ（図１ｂ）の説明を提供する：正常細胞は始原
発癌遺伝子の発現による２つのバンドを示し；癌細胞は
４つのバンドを示すように思われ、２つはこれらの細胞
の発癌遺伝子により特定され、２つは他の相同染色体の
正常始原発癌遺伝子による。
【００４１】発癌遺伝子および始原発癌遺伝子からのｐ
２１蛋白質間に観察される物理的相違は、ｐ２１蛋白質
における機能的に重要な変化を反映するか、またはそう
ではなく、トランスフォーメーションの過程に影響を及
ぼさない相違を反映している可能性もある。これを決定
する為、蛋白質の移動速度の変化を支配し、遺伝子機能
の変化を起こすような発癌遺伝子の遺伝子領域をつきと
めるための一連の独立した実験を計画した。これらの実
験はイン ビトロでの２つの遺伝子のクローン間の相同
的組換えに基づくものである。
２１蛋白質間に観察される物理的相違は、ｐ２１蛋白質
における機能的に重要な変化を反映するか、またはそう
ではなく、トランスフォーメーションの過程に影響を及
ぼさない相違を反映している可能性もある。これを決定
する為、蛋白質の移動速度の変化を支配し、遺伝子機能
の変化を起こすような発癌遺伝子の遺伝子領域をつきと
めるための一連の独立した実験を計画した。これらの実
験はイン ビトロでの２つの遺伝子のクローン間の相同
的組換えに基づくものである。
【００４２】実験の原理は、発癌遺伝子クローン（ｐＥ
Ｊ）から制限フラグメントを取り出し、これを用いて始
原発癌遺伝子クローン（ｐＥＣ）の相同部分と置き換え
ることである。同時に、始原発癌遺伝子クローンのフラ
グメントを発癌遺伝子クローン中にスプライシングし、
逆の組み換えも実施する。これらの組み換え構成物のト
ランスフォーム活性をトランスフェクション検定で試験
する。検定は発癌遺伝子のフラグメントを始原発癌遺伝
子クローン中に組込んだときトランスフォーム活性を発
揮し、反対に、逆の組換えにおいて、対応する始原発癌
遺伝子フラグメントを発癌遺伝子クローン中に挿入した
場合活性を喪失する事を測定する。図５に実施した特定
の構成のダイヤグラムおよび得られたトランスフェクシ
ョンおよびトランスフォーメーションのデータを示し
た。
Ｊ）から制限フラグメントを取り出し、これを用いて始
原発癌遺伝子クローン（ｐＥＣ）の相同部分と置き換え
ることである。同時に、始原発癌遺伝子クローンのフラ
グメントを発癌遺伝子クローン中にスプライシングし、
逆の組み換えも実施する。これらの組み換え構成物のト
ランスフォーム活性をトランスフェクション検定で試験
する。検定は発癌遺伝子のフラグメントを始原発癌遺伝
子クローン中に組込んだときトランスフォーム活性を発
揮し、反対に、逆の組換えにおいて、対応する始原発癌
遺伝子フラグメントを発癌遺伝子クローン中に挿入した
場合活性を喪失する事を測定する。図５に実施した特定
の構成のダイヤグラムおよび得られたトランスフェクシ
ョンおよびトランスフォーメーションのデータを示し
た。
【００４３】図５の制限地図は、ｐＢＲ３２２に挿入し
た６．６Ｋｂ ＢａｍＨＩ断片内の種々の酵素に対する
切断部位を示した。明瞭に特定されていない幾つかの他
の部位にも作用するＸｍａＩを除いて、酵素に対する全
ての特異的部位を示した。ＢｓｔＥIIの最初の部位とＫ
ｐｎＩ部位との間のＸｍａＩ部位のみを示した。地図上
の黒く塗りつぶした箱型部分は暗号付けしているエクソ
ンの場所を示している。
た６．６Ｋｂ ＢａｍＨＩ断片内の種々の酵素に対する
切断部位を示した。明瞭に特定されていない幾つかの他
の部位にも作用するＸｍａＩを除いて、酵素に対する全
ての特異的部位を示した。ＢｓｔＥIIの最初の部位とＫ
ｐｎＩ部位との間のＸｍａＩ部位のみを示した。地図上
の黒く塗りつぶした箱型部分は暗号付けしているエクソ
ンの場所を示している。
【００４４】図５において、ｐＥＪから誘導されたセグ
メントを塗りつぶした帯として、ｐＥＣからのセグメン
トを白抜帯としてｐＥＪ／ｐＥＣキメラを示した。各々
の示したフラグメントを得るために必要とされる完全ま
たは部分消化によって、示した酵素でｐＥＪおよびｐＥ
Ｃを切断する。生成物を１．２パーセントアガロースを
通す電気泳動により分離し、ＮａＩを溶融して溶離さ
せ、ガラスビーズに吸着させる。ｐＢＲ３２２を含むフ
ラグメントを子牛腸ホスファターゼで処理する。図５に
示したフラグメントは酵素Ｔ４−ＤＮＡリガーゼにより
または酵素を用いないモック連結で結合した。ａ−ｅの
構成は２分子の連結で行った。ｆの構成は同時に３つの
フラグメントを混合し、ｇおよびｈにおいては同時に４
つのフラグメントを混合した。連結混合物は直接大腸菌
のＨＢ１０１株中へトランスフォームした。モック連結
からのコロニーが連結の２パーセント以下であるような
コロニーについて、適当な制限地図を持つコロニーの存
在を分析した。各々のクローンの２０ｎｇでＮＩＨ３Ｔ
３細胞を前に記載した如くトランスフェクトし、１０−
１４日でフォーカスが見えてくるまで選別せずに保持し
た。トランスフェクションの結果は図５の第１欄に示し
た。第２欄はスクリーンされ、その後ＮＩＨ３Ｔ３細胞
にトランスフェクトされた独立したバクテリアコロニー
の数を示している。
メントを塗りつぶした帯として、ｐＥＣからのセグメン
トを白抜帯としてｐＥＪ／ｐＥＣキメラを示した。各々
の示したフラグメントを得るために必要とされる完全ま
たは部分消化によって、示した酵素でｐＥＪおよびｐＥ
Ｃを切断する。生成物を１．２パーセントアガロースを
通す電気泳動により分離し、ＮａＩを溶融して溶離さ
せ、ガラスビーズに吸着させる。ｐＢＲ３２２を含むフ
ラグメントを子牛腸ホスファターゼで処理する。図５に
示したフラグメントは酵素Ｔ４−ＤＮＡリガーゼにより
または酵素を用いないモック連結で結合した。ａ−ｅの
構成は２分子の連結で行った。ｆの構成は同時に３つの
フラグメントを混合し、ｇおよびｈにおいては同時に４
つのフラグメントを混合した。連結混合物は直接大腸菌
のＨＢ１０１株中へトランスフォームした。モック連結
からのコロニーが連結の２パーセント以下であるような
コロニーについて、適当な制限地図を持つコロニーの存
在を分析した。各々のクローンの２０ｎｇでＮＩＨ３Ｔ
３細胞を前に記載した如くトランスフェクトし、１０−
１４日でフォーカスが見えてくるまで選別せずに保持し
た。トランスフェクションの結果は図５の第１欄に示し
た。第２欄はスクリーンされ、その後ＮＩＨ３Ｔ３細胞
にトランスフェクトされた独立したバクテリアコロニー
の数を示している。
【００４５】トランスフォーム活性のあるクローンは、
ｐＥＪおよびｐＥＣの一方または他方から由来する夾雑
物によるものでなく、ｐＥＪおよびｐＥＣの結合物由来
のキメラであることを立証することが重要である。これ
は３つの方法で行った。２つのフラグメントを同時に連
結するより単純な構成においては、増幅された組換えク
ローンにより得られた結果は、連結反応での未増幅生成
物およびリガーゼで処理されていない単離されたフラグ
メントを含むモック連結での未増幅生成物を直接トラン
スフェクトする事により立証される。第２の確証は、そ
れぞれの細胞遺伝子を含むプラスミドｐＥＪおよびｐＥ
Ｃは、ｐＢＲ３２２プラスミドベクターに反対方向に挿
入されるという事実に依存している。それ故、組み換え
遺伝子の一つの両親の起源はフランキングプラスミド領
域の特徴的制限消化により決定される。ｐＥＣの混在は
それ自体では偽陽性の結果を与え得ないので、始原発癌
遺伝子フランキング配列を持つ活性クローンはトランス
フォーム活性の遺伝子部分を得た結果生じたに違いな
い。最後に、その結果は連結反応から得られる幾つかの
独立したクローンで確認された。
ｐＥＪおよびｐＥＣの一方または他方から由来する夾雑
物によるものでなく、ｐＥＪおよびｐＥＣの結合物由来
のキメラであることを立証することが重要である。これ
は３つの方法で行った。２つのフラグメントを同時に連
結するより単純な構成においては、増幅された組換えク
ローンにより得られた結果は、連結反応での未増幅生成
物およびリガーゼで処理されていない単離されたフラグ
メントを含むモック連結での未増幅生成物を直接トラン
スフェクトする事により立証される。第２の確証は、そ
れぞれの細胞遺伝子を含むプラスミドｐＥＪおよびｐＥ
Ｃは、ｐＢＲ３２２プラスミドベクターに反対方向に挿
入されるという事実に依存している。それ故、組み換え
遺伝子の一つの両親の起源はフランキングプラスミド領
域の特徴的制限消化により決定される。ｐＥＣの混在は
それ自体では偽陽性の結果を与え得ないので、始原発癌
遺伝子フランキング配列を持つ活性クローンはトランス
フォーム活性の遺伝子部分を得た結果生じたに違いな
い。最後に、その結果は連結反応から得られる幾つかの
独立したクローンで確認された。
【００４６】図５に観察される如く、３５０ヌクレオチ
ドの長さの遺伝子領域が発癌遺伝子から始原発癌遺伝子
の対応する領域に移された時、後者に活性を与える事が
最終的に同定された。この領域はＸｍａＩエンドヌクレ
アーゼの最初の部位からＫｐｎＩ部位に拡がっている。
この領域の５５パーセントは暗号付けしている最初のエ
クソンであり、１０パーセントはエクソンへの５’であ
り、３５パーセントは最初のイントロンの一部である。
ドの長さの遺伝子領域が発癌遺伝子から始原発癌遺伝子
の対応する領域に移された時、後者に活性を与える事が
最終的に同定された。この領域はＸｍａＩエンドヌクレ
アーゼの最初の部位からＫｐｎＩ部位に拡がっている。
この領域の５５パーセントは暗号付けしている最初のエ
クソンであり、１０パーセントはエクソンへの５’であ
り、３５パーセントは最初のイントロンの一部である。
【００４７】先行実験は発癌遺伝子および始原発癌遺伝
子で暗号付けされたｐ２１蛋白質の移動の相違を同定し
た。今、トランスフォーム化障害を含む短い領域の遺伝
子が決定された。従って、この領域がまた蛋白質を変化
させる特異性を持っているかどうかを確める事が重要に
なってきた。それ故、イン ビトロで組み換えた生成物
でトランスフェクトした細胞の免疫沈降を行った。
子で暗号付けされたｐ２１蛋白質の移動の相違を同定し
た。今、トランスフォーム化障害を含む短い領域の遺伝
子が決定された。従って、この領域がまた蛋白質を変化
させる特異性を持っているかどうかを確める事が重要に
なってきた。それ故、イン ビトロで組み換えた生成物
でトランスフェクトした細胞の免疫沈降を行った。
【００４８】ＮＩＨ３Ｔ３細胞をＥＪ膀胱癌発癌遺伝
子、その正常始原発癌遺伝子、または２つの遺伝子間の
組換え体でトランスフォームし、まず生物学的に０．３
５パーセント寒天中でクローン化し、その後１８時間35
Ｓ−メチオニンで代謝的に標識した。溶解物を調製し、
Ｈａ−ＭｕＳＶで暗号付けされたｐ２１を検出し、Ｋｉ
−ＭｕＳＶで暗号付けされたｐ２１は検出しないモノク
ローナル抗体（Ｙ１３−１７２）で免疫沈降する（ＴＣ
Ａ−沈澱可能物のカウントは５×１０6ｃｐｍ）。Ｆｕ
ｒｔｈ，Ｍ．Ｅ．，Ｄａｖｉｄ，Ｌ．Ｊ．，Ｆｌｅｕｒ
ｄｅｌｙｓ，Ｂ．およびＳｃｏｌｎｉｃｋ，Ｅ．Ｍ．
Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４３：２９４−３０４（１９８２）；
およびＳｈｉｈ，Ｔ．Ｙ．，Ｗｅｅｋｓ，Ｍ．Ｏ．，Ｙ
ｏｕｎｇ，Ｈ．Ａ．およびＳｃｏｌｎｉｃｋ，Ｅ．Ｍ．
Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ９６：６４−７９（１９７９）を参
照されたい。溶解した免疫沈降物は、次に１２パーセン
トＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで分離する。その結
果を図６に示す：レーン１−７ａ、抗体なし；レーン１
−７ｂ、抗Ｈａｒｖｅｙ ｐ２１モノクローナル抗体。
細胞溶解物は：ＮＩＨ３Ｔ３細胞（レーン１）；始原発
癌遺伝子［Ｐａｙｎｅ，Ｇ．Ｓ．，Ｃｏｕｒｔｎｅｉｄ
ｇｅ，Ｓ．Ａ．，Ｃｒｉｔｔｅｎｄｏｎ，Ｌ．Ｂ．，Ｆ
ａｄｌｙ，Ａ．Ｍ．，Ｂｉｓｈｏｐ，Ｊ．Ｍ．およびＶ
ａｒｍｕｓ，Ｈ．Ｅ．Ｃｅｌｌ ２３：３１１−３２２
（１９８１）に記載されているＬＴＲ−活性化３Ｋｂ
ＳａｃＩフラグメント］でトランスフォームされた細胞
（レーン２）；ＥＪ発癌遺伝子（ｐＢＲ中の６．６Ｋｂ
フラグメント）でトランスフォームされたクローン５０
４−１７（レーン３）；始原発癌遺伝子１Ｋｂ Ｓａｃ
ＩフラグメントをＥＪ発癌遺伝子３Ｋｂ ＳａｃＩフラ
グメントに連結したものでトランスフォームされたクロ
ーン５１１−７４（レーン４）；ＥＪ発癌遺伝子のＸｈ
ｏＩ部位から第２のＢｓｔＥII部位に拡がるフラグメン
トを相同フラグメントが除去された始原発癌遺伝子のク
ローンに連結したものでトランスフォームしたクローン
５１０−９および５１０−１３（レーン５，６）；およ
びＫｐｎＩ部位の左側のＥＪ発癌遺伝子をこの部位の右
側の始原発癌遺伝子に連結したものでトランスフォーム
したクローン５０８−８（レーン７）。
子、その正常始原発癌遺伝子、または２つの遺伝子間の
組換え体でトランスフォームし、まず生物学的に０．３
５パーセント寒天中でクローン化し、その後１８時間35
Ｓ−メチオニンで代謝的に標識した。溶解物を調製し、
Ｈａ−ＭｕＳＶで暗号付けされたｐ２１を検出し、Ｋｉ
−ＭｕＳＶで暗号付けされたｐ２１は検出しないモノク
ローナル抗体（Ｙ１３−１７２）で免疫沈降する（ＴＣ
Ａ−沈澱可能物のカウントは５×１０6ｃｐｍ）。Ｆｕ
ｒｔｈ，Ｍ．Ｅ．，Ｄａｖｉｄ，Ｌ．Ｊ．，Ｆｌｅｕｒ
ｄｅｌｙｓ，Ｂ．およびＳｃｏｌｎｉｃｋ，Ｅ．Ｍ．
Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４３：２９４−３０４（１９８２）；
およびＳｈｉｈ，Ｔ．Ｙ．，Ｗｅｅｋｓ，Ｍ．Ｏ．，Ｙ
ｏｕｎｇ，Ｈ．Ａ．およびＳｃｏｌｎｉｃｋ，Ｅ．Ｍ．
Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ９６：６４−７９（１９７９）を参
照されたい。溶解した免疫沈降物は、次に１２パーセン
トＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで分離する。その結
果を図６に示す：レーン１−７ａ、抗体なし；レーン１
−７ｂ、抗Ｈａｒｖｅｙ ｐ２１モノクローナル抗体。
細胞溶解物は：ＮＩＨ３Ｔ３細胞（レーン１）；始原発
癌遺伝子［Ｐａｙｎｅ，Ｇ．Ｓ．，Ｃｏｕｒｔｎｅｉｄ
ｇｅ，Ｓ．Ａ．，Ｃｒｉｔｔｅｎｄｏｎ，Ｌ．Ｂ．，Ｆ
ａｄｌｙ，Ａ．Ｍ．，Ｂｉｓｈｏｐ，Ｊ．Ｍ．およびＶ
ａｒｍｕｓ，Ｈ．Ｅ．Ｃｅｌｌ ２３：３１１−３２２
（１９８１）に記載されているＬＴＲ−活性化３Ｋｂ
ＳａｃＩフラグメント］でトランスフォームされた細胞
（レーン２）；ＥＪ発癌遺伝子（ｐＢＲ中の６．６Ｋｂ
フラグメント）でトランスフォームされたクローン５０
４−１７（レーン３）；始原発癌遺伝子１Ｋｂ Ｓａｃ
ＩフラグメントをＥＪ発癌遺伝子３Ｋｂ ＳａｃＩフラ
グメントに連結したものでトランスフォームされたクロ
ーン５１１−７４（レーン４）；ＥＪ発癌遺伝子のＸｈ
ｏＩ部位から第２のＢｓｔＥII部位に拡がるフラグメン
トを相同フラグメントが除去された始原発癌遺伝子のク
ローンに連結したものでトランスフォームしたクローン
５１０−９および５１０−１３（レーン５，６）；およ
びＫｐｎＩ部位の左側のＥＪ発癌遺伝子をこの部位の右
側の始原発癌遺伝子に連結したものでトランスフォーム
したクローン５０８−８（レーン７）。
【００４９】図６に観察される如く、Ｘｈｏ−ＢｓｔＥ
II，ＳａｃＩ−ＳａｃＩ，およびＢｓｔＥII−ＫｐｎＩ
組換え体でトランスフェクトされた細胞からの溶解物に
含まれる蛋白質はすべてＥＪ蛋白質と一緒に移動し、Ｅ
Ｃ蛋白質からのものと異った移動度であった。培養物を
１８時間標識すると、より低い分子量の形のｐ２１が高
いレベルで標識され、動力学的に不安定なより高い分子
量の形へ標識された量は検出不能であった。得られたデ
ータから、発癌遺伝子によるトランスフォーメーション
の表現型および電気泳動移動の分離の変化には関連があ
り、およびこの２つはＤＮＡの同じ３５０ｎｔ（ヌクレ
オチド）セグメントで暗号されていると結論される。変
化した移動速度は機能的に重要な蛋白質の変化を反映し
ているのではないかと考えられる。
II，ＳａｃＩ−ＳａｃＩ，およびＢｓｔＥII−ＫｐｎＩ
組換え体でトランスフェクトされた細胞からの溶解物に
含まれる蛋白質はすべてＥＪ蛋白質と一緒に移動し、Ｅ
Ｃ蛋白質からのものと異った移動度であった。培養物を
１８時間標識すると、より低い分子量の形のｐ２１が高
いレベルで標識され、動力学的に不安定なより高い分子
量の形へ標識された量は検出不能であった。得られたデ
ータから、発癌遺伝子によるトランスフォーメーション
の表現型および電気泳動移動の分離の変化には関連があ
り、およびこの２つはＤＮＡの同じ３５０ｎｔ（ヌクレ
オチド）セグメントで暗号されていると結論される。変
化した移動速度は機能的に重要な蛋白質の変化を反映し
ているのではないかと考えられる。
【００５０】短い（３５０Ｋｂ）フラグメントが生物的
意味を持っている事が示されたので発癌遺伝子および始
原発癌遺伝子からのＤＮＡの配列を決めた。Ｓｅｉｆら
の前後ジデオキシＤＮＡ配列決定方法およびＭａｘａｍ
およびＧｉｌｂｅｒｔの化学的方法で配列を決定した。
Ｓｅｉｆ，Ｉ．，Ｋｈｏｕｒｙ，Ｇ．およびＤｈａｒ，
Ｒ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．８：２２２５−２２
３８（１９８０）；およびＭａｘａｍ，Ａ．Ｈ．および
Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｗ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７４：５６０−５６４（１９７７）を
参照されたい。結果を図７に示した、図中暗号付けＤＮ
Ａストランドを相当するアミノ酸配列と共に示してあ
る。ＥＪと始原発癌遺伝子とは、コドンおよびアミノ酸
の双方が異なることが示されている。
意味を持っている事が示されたので発癌遺伝子および始
原発癌遺伝子からのＤＮＡの配列を決めた。Ｓｅｉｆら
の前後ジデオキシＤＮＡ配列決定方法およびＭａｘａｍ
およびＧｉｌｂｅｒｔの化学的方法で配列を決定した。
Ｓｅｉｆ，Ｉ．，Ｋｈｏｕｒｙ，Ｇ．およびＤｈａｒ，
Ｒ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．８：２２２５−２２
３８（１９８０）；およびＭａｘａｍ，Ａ．Ｈ．および
Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｗ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７４：５６０−５６４（１９７７）を
参照されたい。結果を図７に示した、図中暗号付けＤＮ
Ａストランドを相当するアミノ酸配列と共に示してあ
る。ＥＪと始原発癌遺伝子とは、コドンおよびアミノ酸
の双方が異なることが示されている。
【００５１】図７に観察される如く、既知の最初のエク
ソンのｐ２１暗号付け領域中（特にＸｍａ切断部位から
６０番目のヌクレオチド）に２つのＤＮＡセグメント間
の唯一の相違があった。それは正常ラットおよびヒトｃ
−ｈａ−ｒａｓ遺伝子においてグリシンを暗号化するト
リプレットに起こっている。ＥＪ発癌遺伝子に観察され
る配列はバリンを暗号化している。それ故、この変化は
ｐ２１蛋白質の機能の変化およびＥＪ膀胱癌で起こるｃ
−Ｈａ−ｒａｓ遺伝子の発癌遺伝子活性化に対応する。
ソンのｐ２１暗号付け領域中（特にＸｍａ切断部位から
６０番目のヌクレオチド）に２つのＤＮＡセグメント間
の唯一の相違があった。それは正常ラットおよびヒトｃ
−ｈａ−ｒａｓ遺伝子においてグリシンを暗号化するト
リプレットに起こっている。ＥＪ発癌遺伝子に観察され
る配列はバリンを暗号化している。それ故、この変化は
ｐ２１蛋白質の機能の変化およびＥＪ膀胱癌で起こるｃ
−Ｈａ−ｒａｓ遺伝子の発癌遺伝子活性化に対応する。
【００５２】この唯一の塩基変化の結果、２つの異った
部位−特異性エンドヌクレアーゼの切断部位が変化す
る。始原発癌遺伝子にはＧＣＣＧＧＣ配列が現れ、これ
がエンドヌクレアーゼＮａｅＩの認識部位となる。この
配列はまたエンドヌクレアーゼＨｐａＩの認識部位ＣＣ
ＧＧも含んでいる。これら両方が発癌遺伝子では変化す
る。何故ならば、相当領域の配列がＧＣＣＧＴＣになっ
ているからである。
部位−特異性エンドヌクレアーゼの切断部位が変化す
る。始原発癌遺伝子にはＧＣＣＧＧＣ配列が現れ、これ
がエンドヌクレアーゼＮａｅＩの認識部位となる。この
配列はまたエンドヌクレアーゼＨｐａＩの認識部位ＣＣ
ＧＧも含んでいる。これら両方が発癌遺伝子では変化す
る。何故ならば、相当領域の配列がＧＣＣＧＴＣになっ
ているからである。
【００５３】ＮａｅＩエンドヌクレアーゼを個々に用い
２つの配列の間の相違を立証する。ＮａｅＩはＨｐａＩ
よりＤＮＡを頻繁に切断しないのでＨｐａＩの代りにＮ
ａｅＩを用いた。期待される如く、ｐＥＣクローンの挿
入断片はｐＥＪ相対物より１つ多い切断部位を示す。こ
の事はまたイン ビトロ組換えクローンの遡及検定を提
供する。トランスフォーメーションおよび異常なｐ２１
移動を指令する対立遺伝子は、この部位でのＮａｅＩ切
断を許さない対立遺伝子と正確に同一視される。
２つの配列の間の相違を立証する。ＮａｅＩはＨｐａＩ
よりＤＮＡを頻繁に切断しないのでＨｐａＩの代りにＮ
ａｅＩを用いた。期待される如く、ｐＥＣクローンの挿
入断片はｐＥＪ相対物より１つ多い切断部位を示す。こ
の事はまたイン ビトロ組換えクローンの遡及検定を提
供する。トランスフォーメーションおよび異常なｐ２１
移動を指令する対立遺伝子は、この部位でのＮａｅＩ切
断を許さない対立遺伝子と正確に同一視される。
【００５４】図８はＥＪ発癌遺伝子およびその対応する
始原発癌遺伝子のＮａｅＩ制限酵素検定の結果を示す。
記載した方法により、始原発癌遺伝子にはＮａｅＩ制限
部位が存在し、発癌遺伝子により生じる変化でそれが消
失している事が決定された。発癌遺伝子（ｐＥＪ）およ
び始原発癌遺伝子（ｐＥＣ）および各々がクローン化さ
れているプラスミド（ｐＢＲ３２２）の分子クローンを
既知の方法で各々純化する。各々１マイクログラムを酵
素ＮａｅＩにて切断し、生じるフラグメントを１５パー
セントビス−アクリルアミドゲルを通しての電気泳動に
より分離する。ゲルは色素エチジウムブロミドを入れる
事により染色し、紫外線下に写真撮影した。
始原発癌遺伝子のＮａｅＩ制限酵素検定の結果を示す。
記載した方法により、始原発癌遺伝子にはＮａｅＩ制限
部位が存在し、発癌遺伝子により生じる変化でそれが消
失している事が決定された。発癌遺伝子（ｐＥＪ）およ
び始原発癌遺伝子（ｐＥＣ）および各々がクローン化さ
れているプラスミド（ｐＢＲ３２２）の分子クローンを
既知の方法で各々純化する。各々１マイクログラムを酵
素ＮａｅＩにて切断し、生じるフラグメントを１５パー
セントビス−アクリルアミドゲルを通しての電気泳動に
より分離する。ゲルは色素エチジウムブロミドを入れる
事により染色し、紫外線下に写真撮影した。
【００５５】図８のレーンは次の通りである：レーン１
は既知のサイズのバンドを産生するマーカーレーンとし
てφ×１７４ＤＮＡを酵素ＨａｅIIIで切断；レーン２
はｐＢＲ３２２をＮａｅＩで切断し、プラスミドベクタ
ー由来のフラグメントを示し；レーン３はｐＥＪ ＤＮ
ＡをＮａｅＩで切断；および、レーン４はｐＥＣ ＤＮ
ＡをＮａｅＩで切断。
は既知のサイズのバンドを産生するマーカーレーンとし
てφ×１７４ＤＮＡを酵素ＨａｅIIIで切断；レーン２
はｐＢＲ３２２をＮａｅＩで切断し、プラスミドベクタ
ー由来のフラグメントを示し；レーン３はｐＥＪ ＤＮ
ＡをＮａｅＩで切断；および、レーン４はｐＥＣ ＤＮ
ＡをＮａｅＩで切断。
【００５６】ｐＥＪ ＤＮＡには分子量１２００塩基対
と同じ移動をするバンドが含まれるが、それはｐＥＣレ
ーンでは消失している。しかしながら、ｐＥＣレーンは
２つの余分のバンドがあり、１つは４００塩基であり、
そして他方は８００塩基の長さであり、それはｐＥＪレ
ーンでは消失している。このように、ｐＥＣ中のＮａｅ
Ｉ部位（１２００ｂｐバンドを４００および８００塩基
の２つのバンドに切断する事を許す）はＥＪ発癌遺伝子
の創造により失なわれる。ｐ２１蛋白質におけるバリン
のグリシンへの単純な置換では、ｐ２１蛋白質の機能面
におけるそのような重大な変化が起こるとは考え難いか
も知れない。それにも拘わらず、幾つかの考察によれ
ば、この構造変化には重要性があるように思われる。そ
の第１の根拠は、ヒトｃ−Ｈａ−ｒａｓ遺伝子、ラット
ｃ−Ｈａ−ｒａｓ遺伝子およびＨａｒｖｅｙ肉腫ウイル
スのｖ−Ｈａ−ｒａｓ発癌遺伝子で暗号化されたｐ２１
のこの領域の比較から生じる。上記２つの細胞遺伝子の
第１のエクソンで暗号化された３７残基のアミノ酸配列
は同一であり、この領域の偉大な進化の保存を示してい
る。しかしながら、Ｈａｒｖｅｙ肉腫ウイルス発癌遺伝
子の分析でラットの遺伝子とこの領域でただ一つの位置
が異っている事が明らかになり、それはＥＪ発癌遺伝子
で変化していたものと正確に同じ残基がグリシンからア
ルギニンに変換していた。従ってこの決定的残基の変化
はそのラット細胞前駆体からのｖ−Ｈａ−ｒａｓ遺伝子
の活性化および正常ヒト相対物からのＥＪ膀胱発癌遺伝
子の活性化の両方に重要だと推測される。同様の変化が
ｒａｓ遺伝子ファミリーの他のメンバーのＫｉｒｓｔｅ
ｎネズミ肉腫のｖ−Ｋｉ−ｒａｓ遺伝子の発癌遺伝子活
性化においても重要である。Ｋｉｒｓｔｅｎトランスフ
ォーム活性遺伝子は非常にｖ−Ｈａ−ｒａｓ遺伝子に類
似している。Ｄｈａｒ，Ｒ．，Ｅｌｌｉｓ，Ｒ．Ｗ．，
Ｓｈｉｈ，Ｔ．Ｙ．，Ｏｒｏｓｚｌａｎ，Ｓ．，Ｓｈａ
ｐｉｒｏ，Ｂ．，Ｍａｉｚｅｌ，Ｊ．，Ｌｏｗｙ，Ｄ．
Ｒ．およびＳｃｏｌｎｉｃｋ，Ｅ．Ｍ．Ｓｃｉｅｎｃｅ
２１７：９３４−９３６（１９８２）を参照された
い。ｖ−Ｋｉ−ｒａｓのｐ２１およびｖ−Ｈａ−ｒａｓ
のｐ２１間の唯一の相違は最初の３６アミノ酸の１２番
目でありＫｉｒｓｔｅｎにおける残基はセリンである。
Ｔｓｕｃｈｉｄａ，Ｎ．，Ｒｙｄｅｒ，Ｔ．およびＯｈ
ｔｓｕｂｏ，Ｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２１７：９３７−９
３９（１９８２）を参照されたい。これはＥＪおよびＨ
ａｒｖｅｙ肉腫ウイルスが暗号化したｐ２１における変
化と正確に同じ部位である。ｖ−Ｋｉ−ｒａｓの細胞相
同体の配列情報は調べられていないけれども、このｒａ
ｓ発癌遺伝子の活性化には１２番目のグリシンの他の新
しいアミノ酸残基への変換が含まれている事が推測され
ている。
と同じ移動をするバンドが含まれるが、それはｐＥＣレ
ーンでは消失している。しかしながら、ｐＥＣレーンは
２つの余分のバンドがあり、１つは４００塩基であり、
そして他方は８００塩基の長さであり、それはｐＥＪレ
ーンでは消失している。このように、ｐＥＣ中のＮａｅ
Ｉ部位（１２００ｂｐバンドを４００および８００塩基
の２つのバンドに切断する事を許す）はＥＪ発癌遺伝子
の創造により失なわれる。ｐ２１蛋白質におけるバリン
のグリシンへの単純な置換では、ｐ２１蛋白質の機能面
におけるそのような重大な変化が起こるとは考え難いか
も知れない。それにも拘わらず、幾つかの考察によれ
ば、この構造変化には重要性があるように思われる。そ
の第１の根拠は、ヒトｃ−Ｈａ−ｒａｓ遺伝子、ラット
ｃ−Ｈａ−ｒａｓ遺伝子およびＨａｒｖｅｙ肉腫ウイル
スのｖ−Ｈａ−ｒａｓ発癌遺伝子で暗号化されたｐ２１
のこの領域の比較から生じる。上記２つの細胞遺伝子の
第１のエクソンで暗号化された３７残基のアミノ酸配列
は同一であり、この領域の偉大な進化の保存を示してい
る。しかしながら、Ｈａｒｖｅｙ肉腫ウイルス発癌遺伝
子の分析でラットの遺伝子とこの領域でただ一つの位置
が異っている事が明らかになり、それはＥＪ発癌遺伝子
で変化していたものと正確に同じ残基がグリシンからア
ルギニンに変換していた。従ってこの決定的残基の変化
はそのラット細胞前駆体からのｖ−Ｈａ−ｒａｓ遺伝子
の活性化および正常ヒト相対物からのＥＪ膀胱発癌遺伝
子の活性化の両方に重要だと推測される。同様の変化が
ｒａｓ遺伝子ファミリーの他のメンバーのＫｉｒｓｔｅ
ｎネズミ肉腫のｖ−Ｋｉ−ｒａｓ遺伝子の発癌遺伝子活
性化においても重要である。Ｋｉｒｓｔｅｎトランスフ
ォーム活性遺伝子は非常にｖ−Ｈａ−ｒａｓ遺伝子に類
似している。Ｄｈａｒ，Ｒ．，Ｅｌｌｉｓ，Ｒ．Ｗ．，
Ｓｈｉｈ，Ｔ．Ｙ．，Ｏｒｏｓｚｌａｎ，Ｓ．，Ｓｈａ
ｐｉｒｏ，Ｂ．，Ｍａｉｚｅｌ，Ｊ．，Ｌｏｗｙ，Ｄ．
Ｒ．およびＳｃｏｌｎｉｃｋ，Ｅ．Ｍ．Ｓｃｉｅｎｃｅ
２１７：９３４−９３６（１９８２）を参照された
い。ｖ−Ｋｉ−ｒａｓのｐ２１およびｖ−Ｈａ−ｒａｓ
のｐ２１間の唯一の相違は最初の３６アミノ酸の１２番
目でありＫｉｒｓｔｅｎにおける残基はセリンである。
Ｔｓｕｃｈｉｄａ，Ｎ．，Ｒｙｄｅｒ，Ｔ．およびＯｈ
ｔｓｕｂｏ，Ｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２１７：９３７−９
３９（１９８２）を参照されたい。これはＥＪおよびＨ
ａｒｖｅｙ肉腫ウイルスが暗号化したｐ２１における変
化と正確に同じ部位である。ｖ−Ｋｉ−ｒａｓの細胞相
同体の配列情報は調べられていないけれども、このｒａ
ｓ発癌遺伝子の活性化には１２番目のグリシンの他の新
しいアミノ酸残基への変換が含まれている事が推測され
ている。
【００５７】前記推測の第２の根拠は、観察された特定
のアミノ酸変化の解析により与えられる。両者の場合と
も、グリシンが比較的かさばった側鎖を持つアミノ酸に
置き換えられている。グリシンは側鎖を欠いているので
２０のアミノ酸の中では他と異なる構造の代表である。
その結果、ポリペプチド鎖は極端におれたり、たたみ込
まれる事を可能ならしめ、アルフア−ヘリックスの破壊
に最も関与する。Ｃａｎｔｏｒ，Ｃ．Ｒ．およびＳｃｈ
ｉｍｍｅｌ，Ｐ．Ｒ．ＢｉｏｐｈｙｓｉｃａｌＣｈｅｍ
ｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．Ｉ，ｐ３０３，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅ
ｍａｎ ａｎｄＣｏ．，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ
（１９８０）を参照されたい。それ故、バリンまたはア
ルギニンによるグリシンの置換は蛋白質の局部的立体化
学に急激な変化を示す。
のアミノ酸変化の解析により与えられる。両者の場合と
も、グリシンが比較的かさばった側鎖を持つアミノ酸に
置き換えられている。グリシンは側鎖を欠いているので
２０のアミノ酸の中では他と異なる構造の代表である。
その結果、ポリペプチド鎖は極端におれたり、たたみ込
まれる事を可能ならしめ、アルフア−ヘリックスの破壊
に最も関与する。Ｃａｎｔｏｒ，Ｃ．Ｒ．およびＳｃｈ
ｉｍｍｅｌ，Ｐ．Ｒ．ＢｉｏｐｈｙｓｉｃａｌＣｈｅｍ
ｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．Ｉ，ｐ３０３，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅ
ｍａｎ ａｎｄＣｏ．，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ
（１９８０）を参照されたい。それ故、バリンまたはア
ルギニンによるグリシンの置換は蛋白質の局部的立体化
学に急激な変化を示す。
【００５８】１２番目の残基のグリシンの消失はｐ２１
蛋白質の必須な領域の有意な変化を示す事が信じられて
いる。その第１の結果として、この変化は蛋白質のコン
ホメーションのずれを起こし、それが更にｐ２１蛋白質
の異常な電気泳動の移動や生合成の変化につながる。第
２のより重大な結果として、ｐ２１蛋白質の機能に対す
る重大な影響が生ずる。この変化がｐ２１と細胞標的と
の相互作用に影響するのはありそうな事である。他の単
一のアミノ酸変化が細胞および生体生理学に絶大な効果
を示した先例が存在する。これらの内最もよく知られて
いるのは鎌状赤血球症候群であり、それはグルタミンの
バリンへの変換が赤血球内のヘモグロビンの溶解性に影
響を及ぼしている。
蛋白質の必須な領域の有意な変化を示す事が信じられて
いる。その第１の結果として、この変化は蛋白質のコン
ホメーションのずれを起こし、それが更にｐ２１蛋白質
の異常な電気泳動の移動や生合成の変化につながる。第
２のより重大な結果として、ｐ２１蛋白質の機能に対す
る重大な影響が生ずる。この変化がｐ２１と細胞標的と
の相互作用に影響するのはありそうな事である。他の単
一のアミノ酸変化が細胞および生体生理学に絶大な効果
を示した先例が存在する。これらの内最もよく知られて
いるのは鎌状赤血球症候群であり、それはグルタミンの
バリンへの変換が赤血球内のヘモグロビンの溶解性に影
響を及ぼしている。
【００５９】ここに記載した発見は、発癌においてかな
めとなる出来事としての過剰調節を示す一連の最近の実
験に反駁するように思える。そのような実験には、鳥類
のレトロウイルスの白血病誘発の間にｍｙｃ始原発癌遺
伝子の活性化［Ｎｅｅｌ，Ｂ．Ｇ．，Ｈａｙｗａｒｄ，
Ｗ．Ｓ．，Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｈ．Ｌ．，Ｆａｎｇ，
Ｊ．およびＡｓｔｒｉｎ，Ｓ．Ｍ．Ｃｅｌｌ ２３：３
２３−３３４（１９８１）；およびＰａｙｎｅ，Ｇ．
Ｓ．，Ｃｏｕｒｔｎｅｉｄｇｅ，Ｓ．Ａ．，Ｃｒｉｔｔ
ｅｎｄｏｎ，Ｌ．Ｂ．，Ｆａｄｌｙ，Ａ．Ｍ．，Ｂｉｓ
ｈｏｐ，Ｊ．Ｍ．およびＶａｒｍｕｓ，Ｈ．Ｅ．Ｃｅｌ
ｌ ２３：３１１−３２２（１９８１）を参照された
い］；およびレトロウイルスのＬＴＲプロモーターおよ
び細胞始原発癌遺伝子のイン ビトロでの融合でトラン
スフォーム活性遺伝子が生ずることの実証［ＤｅＦｅ
ｏ，Ｄ．，Ｇｏｎｄａ，Ｍ．Ａ．，Ｙｏｕｎｇ，Ｈ．
Ａ．，Ｃｈａｎｇ，Ｅ．Ｈ．，Ｌｏｗｙ，Ｄ．Ｒ．，Ｓ
ｃｏｌｎｉｃｋ，Ｅ．Ｍ．およびＥｌｌｉｓ，Ｒ．Ｗ．
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ７
８：３３２８−３３３２（１９８１）；Ｂｌａｉｒ，
Ｄ．Ｇ．，Ｏｓｋａｒｓｓｏｎ，Ｍ．，Ｗｏｏｄ，Ｔ．
Ｇ．，ＭｃＣｌｅｍｅｎｔｓ，Ｗ．Ｌ．，Ｆｉｓｃｈｉ
ｎｇｅｒ，Ｐ．Ｊ．およびＶａｎｄｅｗｏｕｄｅ，Ｇ．
Ｓｃｉｅｎｃｅ ２１２：９４１−９４３（１９８
１）；およびＣｈａｎｇｅ，Ｅ．Ｊ．，Ｆｕｒｔｈ，
Ｍ．Ｅ．，Ｓｃｏｌｎｉｃｋ，Ｅ．Ｍ．およびＬｏｗ
ｙ，Ｄ．Ｒ．Ｎａｔｕｒｅ ２９７：４７９−４８３
（１９８２）を参照されたい］がある。これらの後者の
結果はその幾つかはラットおよびヒトｃ−Ｈａ−ｒａｓ
始原発癌遺伝子のクローンの活性化を実証しているので
特に密接な関係がある。これらのｃ−Ｈａ−ｒａｓ遺伝
子の蛋白質暗号化配列がこれらウイルス−細胞キメラ構
成の間に構造的変化を受ける事は考えにくい。むしろ始
原発癌遺伝子およびそのＬＴＲ−活性化相対物の唯一の
本質的相違は発現の速度にある事は明らかである。この
事はｒａｓ始原発癌遺伝子は第２の独立した機構で活性
化できる事を意味し、その機構も原理的に本明細書に記
載した機構と同様に発癌遺伝子形成に重要である。
めとなる出来事としての過剰調節を示す一連の最近の実
験に反駁するように思える。そのような実験には、鳥類
のレトロウイルスの白血病誘発の間にｍｙｃ始原発癌遺
伝子の活性化［Ｎｅｅｌ，Ｂ．Ｇ．，Ｈａｙｗａｒｄ，
Ｗ．Ｓ．，Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｈ．Ｌ．，Ｆａｎｇ，
Ｊ．およびＡｓｔｒｉｎ，Ｓ．Ｍ．Ｃｅｌｌ ２３：３
２３−３３４（１９８１）；およびＰａｙｎｅ，Ｇ．
Ｓ．，Ｃｏｕｒｔｎｅｉｄｇｅ，Ｓ．Ａ．，Ｃｒｉｔｔ
ｅｎｄｏｎ，Ｌ．Ｂ．，Ｆａｄｌｙ，Ａ．Ｍ．，Ｂｉｓ
ｈｏｐ，Ｊ．Ｍ．およびＶａｒｍｕｓ，Ｈ．Ｅ．Ｃｅｌ
ｌ ２３：３１１−３２２（１９８１）を参照された
い］；およびレトロウイルスのＬＴＲプロモーターおよ
び細胞始原発癌遺伝子のイン ビトロでの融合でトラン
スフォーム活性遺伝子が生ずることの実証［ＤｅＦｅ
ｏ，Ｄ．，Ｇｏｎｄａ，Ｍ．Ａ．，Ｙｏｕｎｇ，Ｈ．
Ａ．，Ｃｈａｎｇ，Ｅ．Ｈ．，Ｌｏｗｙ，Ｄ．Ｒ．，Ｓ
ｃｏｌｎｉｃｋ，Ｅ．Ｍ．およびＥｌｌｉｓ，Ｒ．Ｗ．
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ７
８：３３２８−３３３２（１９８１）；Ｂｌａｉｒ，
Ｄ．Ｇ．，Ｏｓｋａｒｓｓｏｎ，Ｍ．，Ｗｏｏｄ，Ｔ．
Ｇ．，ＭｃＣｌｅｍｅｎｔｓ，Ｗ．Ｌ．，Ｆｉｓｃｈｉ
ｎｇｅｒ，Ｐ．Ｊ．およびＶａｎｄｅｗｏｕｄｅ，Ｇ．
Ｓｃｉｅｎｃｅ ２１２：９４１−９４３（１９８
１）；およびＣｈａｎｇｅ，Ｅ．Ｊ．，Ｆｕｒｔｈ，
Ｍ．Ｅ．，Ｓｃｏｌｎｉｃｋ，Ｅ．Ｍ．およびＬｏｗ
ｙ，Ｄ．Ｒ．Ｎａｔｕｒｅ ２９７：４７９−４８３
（１９８２）を参照されたい］がある。これらの後者の
結果はその幾つかはラットおよびヒトｃ−Ｈａ−ｒａｓ
始原発癌遺伝子のクローンの活性化を実証しているので
特に密接な関係がある。これらのｃ−Ｈａ−ｒａｓ遺伝
子の蛋白質暗号化配列がこれらウイルス−細胞キメラ構
成の間に構造的変化を受ける事は考えにくい。むしろ始
原発癌遺伝子およびそのＬＴＲ−活性化相対物の唯一の
本質的相違は発現の速度にある事は明らかである。この
事はｒａｓ始原発癌遺伝子は第２の独立した機構で活性
化できる事を意味し、その機構も原理的に本明細書に記
載した機構と同様に発癌遺伝子形成に重要である。
【００６０】他の癌の発癌遺伝子もまた辿るとｒａｓ遺
伝子である。特に結腸および肺癌は細胞Ｋｉ−ｒａｓ遺
伝子の活性化による発癌遺伝子を有している事が観察さ
れている。Ｄｅｒ，Ｃ．，Ｋｒｏｎｔｉｒｉｓ，Ｔ．
Ｇ．およびＣｏｏｐｅｒ，Ｇ．Ｍ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７９：３６３７−３６
４０（１９８０）を参照されたい。それ故、多くのこれ
らの発癌遺伝子の活性化もまた前に報告されているもの
と同様に構造的変化に依存するようである。
伝子である。特に結腸および肺癌は細胞Ｋｉ−ｒａｓ遺
伝子の活性化による発癌遺伝子を有している事が観察さ
れている。Ｄｅｒ，Ｃ．，Ｋｒｏｎｔｉｒｉｓ，Ｔ．
Ｇ．およびＣｏｏｐｅｒ，Ｇ．Ｍ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７９：３６３７−３６
４０（１９８０）を参照されたい。それ故、多くのこれ
らの発癌遺伝子の活性化もまた前に報告されているもの
と同様に構造的変化に依存するようである。
【００６１】前に記載した如く、ＥＪ発癌遺伝子中のＧ
ｌｙ12のコドンの変化は、発癌遺伝子におけるこのコド
ンの変化により起こされる発癌またはトランスフォーメ
ーションの簡単な診断用検定法を可能にする。発癌また
は関連する過程の間に起こったＧｌｙ12コドンのどんな
突然変異もＮａｅＩおよびＨｐａＩエンドヌクレアーゼ
の切断認識部位を変化させ、発癌遺伝子の変化したＤＮ
Ａはこの部位での切断に抵抗するようになる。それ故、
これらのエンドヌクレアーゼによるこの部位におけるＤ
ＮＡの切断され易さの試験は、始原発癌遺伝子のこの領
域の突然変異変化の特徴的な試験となる。
ｌｙ12のコドンの変化は、発癌遺伝子におけるこのコド
ンの変化により起こされる発癌またはトランスフォーメ
ーションの簡単な診断用検定法を可能にする。発癌また
は関連する過程の間に起こったＧｌｙ12コドンのどんな
突然変異もＮａｅＩおよびＨｐａＩエンドヌクレアーゼ
の切断認識部位を変化させ、発癌遺伝子の変化したＤＮ
Ａはこの部位での切断に抵抗するようになる。それ故、
これらのエンドヌクレアーゼによるこの部位におけるＤ
ＮＡの切断され易さの試験は、始原発癌遺伝子のこの領
域の突然変異変化の特徴的な試験となる。
【００６２】この試験は、目的のＤＮＡを例えばＮａｅ
Ｉで処理し、生じるフラグメントをアガロースゲル電気
泳動により分離し、硝酸セロルースのフィルターに分離
したフラグメントを移し、配列特異性の放射標識された
プローブとフィルターをインキュベートし、続いてラジ
オオートグラフィーにより移されたフラグメントを検出
する。方法はよく知られているものである。Ｓｏｕｔｈ
ｅｒｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９８：５０３−１７
（１９７５）を参照されたい。
Ｉで処理し、生じるフラグメントをアガロースゲル電気
泳動により分離し、硝酸セロルースのフィルターに分離
したフラグメントを移し、配列特異性の放射標識された
プローブとフィルターをインキュベートし、続いてラジ
オオートグラフィーにより移されたフラグメントを検出
する。方法はよく知られているものである。Ｓｏｕｔｈ
ｅｒｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９８：５０３−１７
（１９７５）を参照されたい。
【００６３】そのような実験で使用する配列プローブ
は、始原発癌遺伝子の領域と重なるか、または始原発癌
遺伝子のこの領域に非常に隣接した所にある多数のＤＮ
Ａセグメントから誘導できる。記載する実施例では、プ
ローブは、変化したコドンの左側のＮａｅＩ部位から始
まり、その右のＮａｅＩ部位で終る発癌遺伝子のＮａｅ
Ｉフラグメントであってよい。正常始原発癌遺伝子を持
つ細胞のＤＮＡはこの部位でＮａｅＩにより２つの部分
に切断され、一方ＥＪ膀胱癌発癌遺伝子のＤＮＡはＮａ
ｅＩエンドヌクレアーゼによる処理ではこの部位は影響
を受けない。
は、始原発癌遺伝子の領域と重なるか、または始原発癌
遺伝子のこの領域に非常に隣接した所にある多数のＤＮ
Ａセグメントから誘導できる。記載する実施例では、プ
ローブは、変化したコドンの左側のＮａｅＩ部位から始
まり、その右のＮａｅＩ部位で終る発癌遺伝子のＮａｅ
Ｉフラグメントであってよい。正常始原発癌遺伝子を持
つ細胞のＤＮＡはこの部位でＮａｅＩにより２つの部分
に切断され、一方ＥＪ膀胱癌発癌遺伝子のＤＮＡはＮａ
ｅＩエンドヌクレアーゼによる処理ではこの部位は影響
を受けない。
【００６４】この検定は、始原発癌遺伝子のＤＮＡのそ
の対応する発癌遺伝子への変化に対して一般的に応用で
きる。始原発癌遺伝子または発癌遺伝子の何れか一方の
みのＤＮＡ配列が制限エンドヌクレアーゼの切断に感受
性で、他の配列は感受性でないことが検定法の基本原理
である。
の対応する発癌遺伝子への変化に対して一般的に応用で
きる。始原発癌遺伝子または発癌遺伝子の何れか一方の
みのＤＮＡ配列が制限エンドヌクレアーゼの切断に感受
性で、他の配列は感受性でないことが検定法の基本原理
である。
【００６５】発癌遺伝子により暗号化されたｐ２１蛋白
質から始原発癌遺伝子により暗号化されたｐ２１蛋白質
へのアミノ酸配列の変化の他の結果は、両方の特異的な
血清学の試薬での検出を可能にする。そのような血清学
試薬は正常始原発癌遺伝子が特定するアミノ酸配列を蛋
白質のこの部位で特定でき、または発癌遺伝子が特定す
る変化したアミノ酸配列を蛋白質のこの部位で特定でき
る。未変化の蛋白質領域と反応し、その結果ｐ２１蛋白
質の正常または異常な形の一方と反応性のあるような他
の血清学試薬も用いる事ができる。
質から始原発癌遺伝子により暗号化されたｐ２１蛋白質
へのアミノ酸配列の変化の他の結果は、両方の特異的な
血清学の試薬での検出を可能にする。そのような血清学
試薬は正常始原発癌遺伝子が特定するアミノ酸配列を蛋
白質のこの部位で特定でき、または発癌遺伝子が特定す
る変化したアミノ酸配列を蛋白質のこの部位で特定でき
る。未変化の蛋白質領域と反応し、その結果ｐ２１蛋白
質の正常または異常な形の一方と反応性のあるような他
の血清学試薬も用いる事ができる。
【００６６】クローニング技術を用い、始原発癌遺伝子
の正常部位または発癌遺伝子の変化部位で暗号化される
ｐ２１蛋白質を有意の量単離できる。そのような蛋白質
セグメントを用い標準的な抗体産生技術により抗体を産
生する。すなわち、ポリクローナル抗体の産生のため、
その蛋白質を用い、ウサギまたはラットの如き宿主に免
疫し、該蛋白質に対する抗体を宿主から得られる血清か
ら集める。
の正常部位または発癌遺伝子の変化部位で暗号化される
ｐ２１蛋白質を有意の量単離できる。そのような蛋白質
セグメントを用い標準的な抗体産生技術により抗体を産
生する。すなわち、ポリクローナル抗体の産生のため、
その蛋白質を用い、ウサギまたはラットの如き宿主に免
疫し、該蛋白質に対する抗体を宿主から得られる血清か
ら集める。
【００６７】さらに、ハイブリドーマ細胞を形成する典
型的な融合技術で単離された遺伝子セグメントの産生す
る蛋白質に対する抗体を産生する細胞を用い、モノクロ
ーナル抗体を産生できる。基本的に、これらの技術は抗
体産生細胞をミエローマ細胞の如き不滅の細胞と融合せ
しめ、希望する抗体を産生する永久増殖性融合細胞ハイ
ブリッドを提供する事からなり；本願の場合、希望する
抗体とは、単離された遺伝子セグメントにより暗号化さ
れたｐ２１蛋白質の正常または変異セグメントに対する
抗体である。ハイブリッド細胞を抗体産生の助けとなる
ような条件下で培養し、その後、細胞培養培地から抗体
を集める。そのようなモノクローナル抗体を産生する技
術は文献によく記載されている。例えば、米国特許第
４，１７２，１２４号および第４，１９６，２６５号
（Ｈｉｌａｒｙ Ｋｏｐｒｏｗｓｋｉらに特許された）
を参照されたい。その技術はここでは参照のため含まれ
る。
型的な融合技術で単離された遺伝子セグメントの産生す
る蛋白質に対する抗体を産生する細胞を用い、モノクロ
ーナル抗体を産生できる。基本的に、これらの技術は抗
体産生細胞をミエローマ細胞の如き不滅の細胞と融合せ
しめ、希望する抗体を産生する永久増殖性融合細胞ハイ
ブリッドを提供する事からなり；本願の場合、希望する
抗体とは、単離された遺伝子セグメントにより暗号化さ
れたｐ２１蛋白質の正常または変異セグメントに対する
抗体である。ハイブリッド細胞を抗体産生の助けとなる
ような条件下で培養し、その後、細胞培養培地から抗体
を集める。そのようなモノクローナル抗体を産生する技
術は文献によく記載されている。例えば、米国特許第
４，１７２，１２４号および第４，１９６，２６５号
（Ｈｉｌａｒｙ Ｋｏｐｒｏｗｓｋｉらに特許された）
を参照されたい。その技術はここでは参照のため含まれ
る。
【００６８】より具体的には、そのような血清学試薬は
既知の方法により得る事ができる。Ｗａｌｔｅｒ，
Ｇ．，Ｓｃｈｅｉｄｔｍａｎｎ，Ｋ．Ｈ．，Ｃａｒｂｏ
ｎｅ，Ａ．，Ｌａｕｄａｒｏ，Ａ．Ｐ．およびＤｏｏｌ
ｉｔｔｌｅ，Ｒ．Ｆ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：５１９７−５２００（１９
８０）；Ｌｅｒｎｅｒ，Ｒ．Ａ．，Ｇｒｅｅｎ，Ｎ．，
Ａｌｅｘａｎｄｅｒ，Ｈ．，Ｌｉｕ，Ｆ．Ｔ．，Ｓｕｔ
−ｃｌｉｆｆｅ，Ｊ．Ｇ．，およびＳｃｈｉｎｎｉｃ
ｋ，Ｔ．Ｍ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ，７８：３４０３−３４０７（１９８１）を
参照されたい。
既知の方法により得る事ができる。Ｗａｌｔｅｒ，
Ｇ．，Ｓｃｈｅｉｄｔｍａｎｎ，Ｋ．Ｈ．，Ｃａｒｂｏ
ｎｅ，Ａ．，Ｌａｕｄａｒｏ，Ａ．Ｐ．およびＤｏｏｌ
ｉｔｔｌｅ，Ｒ．Ｆ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：５１９７−５２００（１９
８０）；Ｌｅｒｎｅｒ，Ｒ．Ａ．，Ｇｒｅｅｎ，Ｎ．，
Ａｌｅｘａｎｄｅｒ，Ｈ．，Ｌｉｕ，Ｆ．Ｔ．，Ｓｕｔ
−ｃｌｉｆｆｅ，Ｊ．Ｇ．，およびＳｃｈｉｎｎｉｃ
ｋ，Ｔ．Ｍ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ，７８：３４０３−３４０７（１９８１）を
参照されたい。
【００６９】実際に、ペプチドセグメントを標準的な有
機合成技術で合成し、合成されたペプチド配列が研究し
ている目的の蛋白質領域のアミノ酸配列に正確に対応す
るようにすることができる。次いでこのペプチドをキャ
リヤ蛋白質と結合させ、適切な宿主（例えばマウス）に
注射し、免疫応答を起こす。この方法で免疫された動物
の血清を免疫したペプチドおよびより重要であるが、そ
の一つの領域にこのアミノ酸配列を持つ蛋白質の両方に
対して免疫沈降させるために用いる事ができる。従っ
て、正常な始原発癌遺伝子から発癌遺伝子に転換する際
に変化するアミノ酸残基部位を持つオリゴペプチド配列
（例えばデカペプチド）に対する血清が作れる。そのよ
うな血清は正常のペプチド配列か、または変化した配列
に対して作る事ができる。免疫グロブリン−抗原相互作
用の特異性は、あるオリゴペプチドと反応する血清はそ
の一つの領域に同じ対応した配列を持つ蛋白質とのみ反
応し、その一つの領域に変化したこの配列を持つ蛋白質
とは交叉反応しない事を保証する。
機合成技術で合成し、合成されたペプチド配列が研究し
ている目的の蛋白質領域のアミノ酸配列に正確に対応す
るようにすることができる。次いでこのペプチドをキャ
リヤ蛋白質と結合させ、適切な宿主（例えばマウス）に
注射し、免疫応答を起こす。この方法で免疫された動物
の血清を免疫したペプチドおよびより重要であるが、そ
の一つの領域にこのアミノ酸配列を持つ蛋白質の両方に
対して免疫沈降させるために用いる事ができる。従っ
て、正常な始原発癌遺伝子から発癌遺伝子に転換する際
に変化するアミノ酸残基部位を持つオリゴペプチド配列
（例えばデカペプチド）に対する血清が作れる。そのよ
うな血清は正常のペプチド配列か、または変化した配列
に対して作る事ができる。免疫グロブリン−抗原相互作
用の特異性は、あるオリゴペプチドと反応する血清はそ
の一つの領域に同じ対応した配列を持つ蛋白質とのみ反
応し、その一つの領域に変化したこの配列を持つ蛋白質
とは交叉反応しない事を保証する。
【００７０】腫瘍試料または組織ホモジネートまたは自
己融解した腫瘍片からの遊離液から、ここに記載した突
然変異誘発変化に影響されない蛋白質の領域（例えばｃ
−末端）と交叉反応する一般の非特異的ｐ２１血清を用
い、ｐ２１蛋白質を免疫沈降する事ができる。別個に、
１２番目の残基を取り囲むＮ末端正常ペプチドに対して
特異的な血清を同じ溶解液からの蛋白質の免疫沈降に使
用できる。もし非病理組織からの正常ｐ２１を免疫沈降
する事ができるこのＮ末端特異的血清が目的の試験組織
よりｐ２１を免疫沈降できないなら、この試験組織のｐ
２１は正常のＮ末端配列に反応性のある血清と反応する
能力に影響する形の変化があったと考えられる。一般の
非特異的血清でこの組織より免疫沈降するｐ２１の量が
正常Ｎ末端配列と反応性のある血清により沈降しうるｐ
２１の量の対照となる。
己融解した腫瘍片からの遊離液から、ここに記載した突
然変異誘発変化に影響されない蛋白質の領域（例えばｃ
−末端）と交叉反応する一般の非特異的ｐ２１血清を用
い、ｐ２１蛋白質を免疫沈降する事ができる。別個に、
１２番目の残基を取り囲むＮ末端正常ペプチドに対して
特異的な血清を同じ溶解液からの蛋白質の免疫沈降に使
用できる。もし非病理組織からの正常ｐ２１を免疫沈降
する事ができるこのＮ末端特異的血清が目的の試験組織
よりｐ２１を免疫沈降できないなら、この試験組織のｐ
２１は正常のＮ末端配列に反応性のある血清と反応する
能力に影響する形の変化があったと考えられる。一般の
非特異的血清でこの組織より免疫沈降するｐ２１の量が
正常Ｎ末端配列と反応性のある血清により沈降しうるｐ
２１の量の対照となる。
【００７１】上記の免疫沈降は、組織試料中の変化した
ｐ２１の存在の測定に用いる事ができる。これと別個
に、この領域の正常のアミノ酸配列が異常配列に変化す
る時どの型の特異変化が起きているかを診断するため、
一連のペプチドに特異的血清を開発できる。例えば、１
２番残基を暗号化するコドンで単一の点突然変異により
起こるアミノ酸置換のリストを作る事ができる。これら
の各々の置換に対し、この領域の新しい翻訳のオリゴペ
プチドを推論でき、前に記載した使用のための対応する
ペプチドが合成される。これらの血清の各々は、各血清
を誘導するのに使用したオリゴペプチド片に対応する変
化したｐ２１と特異的に反応する。
ｐ２１の存在の測定に用いる事ができる。これと別個
に、この領域の正常のアミノ酸配列が異常配列に変化す
る時どの型の特異変化が起きているかを診断するため、
一連のペプチドに特異的血清を開発できる。例えば、１
２番残基を暗号化するコドンで単一の点突然変異により
起こるアミノ酸置換のリストを作る事ができる。これら
の各々の置換に対し、この領域の新しい翻訳のオリゴペ
プチドを推論でき、前に記載した使用のための対応する
ペプチドが合成される。これらの血清の各々は、各血清
を誘導するのに使用したオリゴペプチド片に対応する変
化したｐ２１と特異的に反応する。
【００７２】用語“免疫沈降”は更に一連の変化した技
術操作により更に記述する。通常使用される技術は、代
謝的に標識した蛋白質を免疫沈降し、続いてゲル電気泳
動および得られたゲルのオートラジオグラフィーを行う
ものである。組織試料を代謝的に標識するのが困難であ
るので、ここでは他の方法が良好である；即ち、非標識
蛋白質をゲル電気泳動し、分離した蛋白質をニトロセル
ロースフィルターに移し、目的の蛋白質を、放射−標識
免疫グロブリンとフィルターをインキュベートする事に
より検出する。免疫グロブリンは直接ヨード化によりま
たは間接的に第１のイムノグロブリンの定常領域と反応
する第２の放射標識イムノグロブリンとインキュベート
することにより放射標識化される。
術操作により更に記述する。通常使用される技術は、代
謝的に標識した蛋白質を免疫沈降し、続いてゲル電気泳
動および得られたゲルのオートラジオグラフィーを行う
ものである。組織試料を代謝的に標識するのが困難であ
るので、ここでは他の方法が良好である；即ち、非標識
蛋白質をゲル電気泳動し、分離した蛋白質をニトロセル
ロースフィルターに移し、目的の蛋白質を、放射−標識
免疫グロブリンとフィルターをインキュベートする事に
より検出する。免疫グロブリンは直接ヨード化によりま
たは間接的に第１のイムノグロブリンの定常領域と反応
する第２の放射標識イムノグロブリンとインキュベート
することにより放射標識化される。
【００７３】本発明の応用についての議論および多くの
実験的仕事は、ヒトの膀胱癌のＥＪ遺伝子およびその始
原発癌遺伝子（ｃ−Ｈａ−ｒａｓ）との相違を検出する
ことに向けられたが、これらの相違を検出する技術なら
びにそれらに基づく検定法は、非常に普遍性を有する。
事実、そのような技術と検定は、突然変異して野生株の
対立遺伝子とは劇的に異なる機能を帯びた変異対立遺伝
子またはジーンを生じた如何なる野生株ジーンまたは対
立遺伝子に対しても適用可能と信じられる。例えばその
ような技術と検定は、野生株遺伝子およびＬｅｓｃｈ−
Ｎｙａｎ症候群に関連する突然変異遺伝子の差を検出す
るのに適していると期待される。
実験的仕事は、ヒトの膀胱癌のＥＪ遺伝子およびその始
原発癌遺伝子（ｃ−Ｈａ−ｒａｓ）との相違を検出する
ことに向けられたが、これらの相違を検出する技術なら
びにそれらに基づく検定法は、非常に普遍性を有する。
事実、そのような技術と検定は、突然変異して野生株の
対立遺伝子とは劇的に異なる機能を帯びた変異対立遺伝
子またはジーンを生じた如何なる野生株ジーンまたは対
立遺伝子に対しても適用可能と信じられる。例えばその
ような技術と検定は、野生株遺伝子およびＬｅｓｃｈ−
Ｎｙａｎ症候群に関連する突然変異遺伝子の差を検出す
るのに適していると期待される。
【００７４】本発明方法は、発癌遺伝子と始原発癌遺伝
子の差異を検出するのに勿論特別の応用と有用性を持
つ。一連のｒａｓファミリーのメンバーについては前に
記載した。しかしながら、ここに記載された技術はｒａ
ｓファミリーのメンバー以外の始原発癌細胞の相違の発
見も可能とする。例えば、ＨＬ−６０細胞株に存在す
る、前骨髄性白血病、ある種の結腸癌およびＨａｉｒｙ
細胞白血病に関連する事が知られている発癌遺伝子とそ
の始原発癌遺伝子との差異はここに記載した方法を用い
て決定できる。これらの差異は記載された型の検定に用
いられる。
子の差異を検出するのに勿論特別の応用と有用性を持
つ。一連のｒａｓファミリーのメンバーについては前に
記載した。しかしながら、ここに記載された技術はｒａ
ｓファミリーのメンバー以外の始原発癌細胞の相違の発
見も可能とする。例えば、ＨＬ−６０細胞株に存在す
る、前骨髄性白血病、ある種の結腸癌およびＨａｉｒｙ
細胞白血病に関連する事が知られている発癌遺伝子とそ
の始原発癌遺伝子との差異はここに記載した方法を用い
て決定できる。これらの差異は記載された型の検定に用
いられる。
【００７５】野生型遺伝子とそれに対応すると突然変異
遺伝子の差異を検定する非常に一般的な手順は以下の如
くである： Ａ．遺伝病の発現に対して遺伝子の正常機能または異常
機能が関連するような遺伝子のイン ビトロ検定法を開
発する：そのようなイン ビトロでの検定は、一般に、
遺伝子移植により遺伝子を受けた培養細胞の行動の観察
できる変化に依存する。
遺伝子の差異を検定する非常に一般的な手順は以下の如
くである： Ａ．遺伝病の発現に対して遺伝子の正常機能または異常
機能が関連するような遺伝子のイン ビトロ検定法を開
発する：そのようなイン ビトロでの検定は、一般に、
遺伝子移植により遺伝子を受けた培養細胞の行動の観察
できる変化に依存する。
【００７６】Ｂ．上述の遺伝子の対立遺伝子を分子クロ
ーンとして単離するために、上述のイン ビトロ検定を
用いる。そのような対立遺伝子は野生型対立遺伝子かま
たはその野生型対立遺伝子の機能不全性変異対立遺伝子
である。
ーンとして単離するために、上述のイン ビトロ検定を
用いる。そのような対立遺伝子は野生型対立遺伝子かま
たはその野生型対立遺伝子の機能不全性変異対立遺伝子
である。
【００７７】Ｃ．Ｂ項からの単離対立遺伝子を用い、組
換えＤＮＡ技術を使用して遺伝子の他の対立遺伝子の形
を単離する。即ち、正常対立遺伝子を配列プローブとし
て使用し、異変−非野生型対立遺伝子の同定および単離
が可能になる。
換えＤＮＡ技術を使用して遺伝子の他の対立遺伝子の形
を単離する。即ち、正常対立遺伝子を配列プローブとし
て使用し、異変−非野生型対立遺伝子の同定および単離
が可能になる。
【００７８】Ｄ．イン ビトロ検定系において、野生型
対立遺伝子および非野生型変異遺伝子の観察できる差異
および別個の挙動を実証する。
対立遺伝子および非野生型変異遺伝子の観察できる差異
および別個の挙動を実証する。
【００７９】Ｅ．イン ビトロで野生型および非野生型
対立遺伝子のクローン間で遺伝子組換えを行い、野生型
および非野生型の対立遺伝子による表現型を検定する
（Ｄ項）ことによりイン ビトロ検出系で組換え体を試
験する。このようにして、２つの対立遺伝子間の機能の
差に関与する非野生型対立遺伝子の領域を遺伝的な地図
にする。
対立遺伝子のクローン間で遺伝子組換えを行い、野生型
および非野生型の対立遺伝子による表現型を検定する
（Ｄ項）ことによりイン ビトロ検出系で組換え体を試
験する。このようにして、２つの対立遺伝子間の機能の
差に関与する非野生型対立遺伝子の領域を遺伝的な地図
にする。
【００８０】Ｆ．２つの対立遺伝子の間の機能の相違を
コードすることがＥ項で証明された非野生型対立遺伝子
の領域の構造的配列分析を実施する。
コードすることがＥ項で証明された非野生型対立遺伝子
の領域の構造的配列分析を実施する。
【００８１】Ｇ．その存在が非野生型遺伝子の変化した
表現型を決定する、決定的に変化した配列を同定した後
（Ｆ項）、野生型対立遺伝子を非野生型対立遺伝子に変
換した過程で切断認識部位が変化した部位特異性制限酵
素（エンドヌクレアーゼ）を決定する。
表現型を決定する、決定的に変化した配列を同定した後
（Ｆ項）、野生型対立遺伝子を非野生型対立遺伝子に変
換した過程で切断認識部位が変化した部位特異性制限酵
素（エンドヌクレアーゼ）を決定する。
【００８２】Ｈ．その変化が遺伝子の機能に影響するこ
とが前に示されたエンドヌクレアーゼ部位（Ｇ項）の存
在または不存在をスクリーニングすることによって、試
験ＤＮＡがその遺伝子中の該遺伝子およびその非野生型
対立遺伝子変異体の機能の支配を決定することが前記Ｅ
項で示された遺伝子部分中に、配列変化を有するか否か
を決定するために、試験サンプルまたは試験組織をスク
リーニングするための配列プローブとして、クローン化
した野生型遺伝子を使用する。
とが前に示されたエンドヌクレアーゼ部位（Ｇ項）の存
在または不存在をスクリーニングすることによって、試
験ＤＮＡがその遺伝子中の該遺伝子およびその非野生型
対立遺伝子変異体の機能の支配を決定することが前記Ｅ
項で示された遺伝子部分中に、配列変化を有するか否か
を決定するために、試験サンプルまたは試験組織をスク
リーニングするための配列プローブとして、クローン化
した野生型遺伝子を使用する。
【００８３】Ｉ．正常野生型対立遺伝子の遺伝子および
その非野生型変異形により暗号化されたアミノ酸配列を
推論する。前に地図にし、遺伝子の機能に影響がある事
（Ｆ項）がわかっているヌクレオチド配列の差異が、同
様に野生型と非野生型対立遺伝子が暗号付ける蛋白質の
アミノ酸の配列に影響があるか否かを決定する。
その非野生型変異形により暗号化されたアミノ酸配列を
推論する。前に地図にし、遺伝子の機能に影響がある事
（Ｆ項）がわかっているヌクレオチド配列の差異が、同
様に野生型と非野生型対立遺伝子が暗号付ける蛋白質の
アミノ酸の配列に影響があるか否かを決定する。
【００８４】Ｊ．もし、アミノ酸配列に影響があれば、
野生型と非野生型の蛋白質に対する特異的な血清を開発
する。例えば野生型蛋白質と機能的に異なる非野生型蛋
白質の領域の配列である（Ｉ項）オリゴペプチド片を合
成する事ができる：対応する野生型オリゴペプチドを合
成する。野生型または非野生型蛋白質と反応する特異的
な抗血清を引き出すための免疫源として両者を用いる。
野生型と非野生型の蛋白質に対する特異的な血清を開発
する。例えば野生型蛋白質と機能的に異なる非野生型蛋
白質の領域の配列である（Ｉ項）オリゴペプチド片を合
成する事ができる：対応する野生型オリゴペプチドを合
成する。野生型または非野生型蛋白質と反応する特異的
な抗血清を引き出すための免疫源として両者を用いる。
【００８５】Ｋ．前記特異的抗血清（Ｊ項）を利用し、
前記蛋白質の野生型または非野生型の存在に関して試験
細胞または試験組織の蛋白質をスクリーニングする。
前記蛋白質の野生型または非野生型の存在に関して試験
細胞または試験組織の蛋白質をスクリーニングする。
【００８６】Ｌ．前記蛋白質スクリーニングを利用し
（Ｋ項）、遺伝病の表現型を媒介するのに重要な構造の
蛋白質の存在を診断する。
（Ｋ項）、遺伝病の表現型を媒介するのに重要な構造の
蛋白質の存在を診断する。
【図１】図１Ａは正常およびトランスフォーム膀胱細胞
の両方から得られた総細胞ＲＮＡの電気泳動ゲルパター
ンを示し、そのパターンはオートラジオグラフィーによ
り視覚化した；
の両方から得られた総細胞ＲＮＡの電気泳動ゲルパター
ンを示し、そのパターンはオートラジオグラフィーによ
り視覚化した；
【図２】図１Ｂは、ｖ−Ｈａ−ｒａｓ ｐ２１蛋白質に
対するモノクローナル抗血清を用い、ＥＪおよび正常膀
胱細胞両方からの代謝的標識蛋白質溶解物の沈降により
得られた電気泳動ゲルパターンを示す；
対するモノクローナル抗血清を用い、ＥＪおよび正常膀
胱細胞両方からの代謝的標識蛋白質溶解物の沈降により
得られた電気泳動ゲルパターンを示す；
【図３】図２Ａは、ｐＥＪまたはｐＥＣでトランスフェ
クトした４つの細胞株からの細胞ＤＮＡの電気泳動ゲル
パターンを示す。
クトした４つの細胞株からの細胞ＤＮＡの電気泳動ゲル
パターンを示す。
【図４】図２Ｂは、同一の４つのトランスフェクトした
細胞株からの総ポリアデニル化ＲＮＡの電気泳動ゲルパ
ターンを示す；
細胞株からの総ポリアデニル化ＲＮＡの電気泳動ゲルパ
ターンを示す；
【図５】図２Ｃは同一の４つのトランスフェクトした細
胞株の細胞溶解物からｐ２１蛋白質を免疫沈降した電気
泳動ゲルパターンを示す；
胞株の細胞溶解物からｐ２１蛋白質を免疫沈降した電気
泳動ゲルパターンを示す；
【図６】図３ＡはｐＥＪまたはｐＥＣでトランスフェク
トした１つの細胞株を５００倍の倍率の位相差顕微鏡を
通して得た写真である；
トした１つの細胞株を５００倍の倍率の位相差顕微鏡を
通して得た写真である；
【図７】図３ＢはｐＥＪまたはｐＥＣでトランスフェク
トした１つの細胞株を５００倍の倍率の位相差顕微鏡を
通して得た写真である；
トした１つの細胞株を５００倍の倍率の位相差顕微鏡を
通して得た写真である；
【図８】図３ＣはｐＥＪまたはｐＥＣでトランスフェク
トした１つの細胞株を５００倍の倍率の位相差顕微鏡を
通して得た写真である；
トした１つの細胞株を５００倍の倍率の位相差顕微鏡を
通して得た写真である；
【図９】図３ＤはｐＥＪまたはｐＥＣでトランスフェク
トした１つの細胞株を５００倍の倍率の位相差顕微鏡を
通して得た写真である；
トした１つの細胞株を５００倍の倍率の位相差顕微鏡を
通して得た写真である；
【図１０】図４はｐＥＪまたはｐＥＣでトランスフェク
トした細胞からの免疫沈降ｐ２１蛋白質の電気泳動ゲル
パターンを示す；
トした細胞からの免疫沈降ｐ２１蛋白質の電気泳動ゲル
パターンを示す；
【図１１】図５はＥＪトランスフォーミング遺伝子およ
びその正常細胞相同体から構成されたイン ビトロ遺伝
子組み換え体を図式的に示したものであり、その遺伝子
組み換え体で実施した実験のトランスフェクションおよ
びトランスフォーメーションのデータの概要もまた含ん
でいる；
びその正常細胞相同体から構成されたイン ビトロ遺伝
子組み換え体を図式的に示したものであり、その遺伝子
組み換え体で実施した実験のトランスフェクションおよ
びトランスフォーメーションのデータの概要もまた含ん
でいる；
【図１２】図６はイン ビトロでＥＪ発癌遺伝子クロー
ン（ｐＥＪ）およびその相同始原発癌遺伝子クローン
（ｐＥＣ）の組み換え体でトランスフェクトした細胞か
ら免疫沈降したｐ２１蛋白質の移動の電気泳動ゲルパタ
ーンを示す；
ン（ｐＥＪ）およびその相同始原発癌遺伝子クローン
（ｐＥＣ）の組み換え体でトランスフェクトした細胞か
ら免疫沈降したｐ２１蛋白質の移動の電気泳動ゲルパタ
ーンを示す；
【図１３】図７はＥＪトランスフォーミング遺伝子およ
びその非−トランスフォーミング細胞相同体の分子クロ
ーンのＤＮＡ配列の比較を示しており、また各々の発現
するアミノ酸配列も示す；
びその非−トランスフォーミング細胞相同体の分子クロ
ーンのＤＮＡ配列の比較を示しており、また各々の発現
するアミノ酸配列も示す；
【図１４】図８はＮａｅＩ制限酵素で切断されるＥＪお
よびＥＣ遺伝子のクローンのフラグメントの相違を示し
た電気泳動ゲルパターンを示し；および
よびＥＣ遺伝子のクローンのフラグメントの相違を示し
た電気泳動ゲルパターンを示し；および
【図１５】図９は抗血清を用いる検定プロトコールを示
したブロックダイアグラムである。
したブロックダイアグラムである。
【図１６】図１０は抗血清を用いる検定プロトコールを
示したブロックダイアグラムである。
示したブロックダイアグラムである。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成５年４月２８日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正内容】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、正常およびトランスフォーム膀胱細胞
の両方から得られた総細胞ＲＮＡの電気泳動ゲルパター
ンを示し、そのパターンはオートラジオグラフィーによ
り視覚化した。
の両方から得られた総細胞ＲＮＡの電気泳動ゲルパター
ンを示し、そのパターンはオートラジオグラフィーによ
り視覚化した。
【図２】図２は、ｖ−Ｈａ−ｒａｓ ｐ２１蛋白質に対
するモノクローナル抗血清を用い、ＥＪおよび正常膀胱
細胞両方からの代謝的標識蛋白質溶解物の沈降により得
られた電気泳動ゲルパターンを示す。
するモノクローナル抗血清を用い、ＥＪおよび正常膀胱
細胞両方からの代謝的標識蛋白質溶解物の沈降により得
られた電気泳動ゲルパターンを示す。
【図３】図３は、ｐＥＪまたはｐＥＣでトランスフェク
トした４つの細胞株からの細胞ＤＮＡの電気泳動ゲルパ
ターンを示す。
トした４つの細胞株からの細胞ＤＮＡの電気泳動ゲルパ
ターンを示す。
【図４】図４は、同一の４つのトランスフェクトした細
胞株からの総ポリアデニル化ＲＮＡの電気泳動ゲルパタ
ーンを示す。
胞株からの総ポリアデニル化ＲＮＡの電気泳動ゲルパタ
ーンを示す。
【図５】図５は、同一の４つのトランスフェクトした細
胞株の細胞溶解物からｐ２１蛋白質を免疫沈降した電気
泳動ゲルパターンを示す。
胞株の細胞溶解物からｐ２１蛋白質を免疫沈降した電気
泳動ゲルパターンを示す。
【図６】図６は、ｐＥＪまたはｐＥＣでトランスフェク
トした１つの細胞株を５００倍の倍率の位相差顕微鏡を
通して得た、生物の形態写真である。
トした１つの細胞株を５００倍の倍率の位相差顕微鏡を
通して得た、生物の形態写真である。
【図７】図７は、ｐＥＪまたはｐＥＣでトランスフェク
トした１つの細胞株を５００倍の倍率の位相差顕微鏡を
通して得た、生物の形態写真である。
トした１つの細胞株を５００倍の倍率の位相差顕微鏡を
通して得た、生物の形態写真である。
【図８】図８は、ｐＥＪまたはｐＥＣでトランスフェク
トした１つの細胞株を５００倍の倍率の位相差顕微鏡を
通して得た、生物の形態写真である。
トした１つの細胞株を５００倍の倍率の位相差顕微鏡を
通して得た、生物の形態写真である。
【図９】図９は、ｐＥＪまたはｐＥＣでトランスフェク
トした１つの細胞株を５００倍の倍率の位相差顕微鏡を
通して得た、生物の形態写真である。
トした１つの細胞株を５００倍の倍率の位相差顕微鏡を
通して得た、生物の形態写真である。
【図１０】図１０は、ｐＥＪまたはｐＥＣでトランスフ
ェクトした細胞からの免疫沈降ｐ２１蛋白質の電気泳動
ゲルパターンを示す。
ェクトした細胞からの免疫沈降ｐ２１蛋白質の電気泳動
ゲルパターンを示す。
【図１１】図１１は、ＥＪトランスフォーミング遺伝子
およびその正常細胞相同体から構成されたイン ビトロ
遺伝子組換え体を図式的に示したものであり、その遺伝
子組み換え体で実施した実験のトランスフェクションお
よびトランスフォーメーションのデータの概要もまた含
んでいる。
およびその正常細胞相同体から構成されたイン ビトロ
遺伝子組換え体を図式的に示したものであり、その遺伝
子組み換え体で実施した実験のトランスフェクションお
よびトランスフォーメーションのデータの概要もまた含
んでいる。
【図１２】図１２は、イン ビトロでＥＪ発癌遺伝子ク
ローン（ｐＥＪ）およびその相同始原発癌遺伝子クロー
ン（ｐＥＣ）の組み換え体でトランスフェクトした細胞
から免疫沈降したｐ２１蛋白質の移動の電気泳動ゲルパ
ターンを示す。
ローン（ｐＥＪ）およびその相同始原発癌遺伝子クロー
ン（ｐＥＣ）の組み換え体でトランスフェクトした細胞
から免疫沈降したｐ２１蛋白質の移動の電気泳動ゲルパ
ターンを示す。
【図１３】図１３は、ＥＪトランスフォーミング遺伝子
およびその非−トランスフォーミング細胞相同体の分子
クローンのＤＮＡ配列の比較を示しており、また各々の
発現するアミノ酸配列も示す。
およびその非−トランスフォーミング細胞相同体の分子
クローンのＤＮＡ配列の比較を示しており、また各々の
発現するアミノ酸配列も示す。
【図１４】図１４は、ＮａｅＩ制限酵素で切断されるＥ
ＪおよびＥＣ遺伝子のクローンのフラグメントの相違を
示した電気泳動ゲルパターンを示す。
ＪおよびＥＣ遺伝子のクローンのフラグメントの相違を
示した電気泳動ゲルパターンを示す。
【図１５】図１５は、抗血清を用いる検定プロトコール
を示したブロックダイアグラムである。
を示したブロックダイアグラムである。
【図１６】図１６は、抗血清を用いる検定プロトコール
を示したブロックダイアグラムである。
を示したブロックダイアグラムである。
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１】
【図２】
【図４】
【図３】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１４】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１５】
【図１６】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/00 8214−4Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｐ 7055−2Ｊ (72)発明者 タービン，クリフォード・ジェームズ アメリカ合衆国マサチューセッツ州02139, ケンブリッジ，オーティス・ストリート 59，ルート ３ (72)発明者 ブラッドレィ，スコット・エム アメリカ合衆国バージニア州22101，マッ クリーン，ベンジャミン・ストリート 6801
Claims (13)
- 【請求項１】 （ａ） 宿主に免疫した時、野性型対立
遺伝子と変異型対立遺伝子の機能の相違の原因となるＤ
ＮＡ構造の相違を検出する能力のある抗体を生じ得る抗
原を製造し、そして （ｂ） 該宿主が該抗体を製造する条件下で該宿主を免
疫する、ことよりなる野性型対立遺伝子が変異型対立遺
伝子に変異したかどうかを検出できる抗体を製造する方
法。 - 【請求項２】 野性型対立遺伝子が始原発癌遺伝子であ
り、変異型対立遺伝子が発癌遺伝子である、請求項１記
載の方法。 - 【請求項３】 始原発癌遺伝子がｒａｓ始原発癌遺伝子
であり、そして発癌遺伝子がｒａｓ発癌遺伝子である、
請求項２記載の方法。 - 【請求項４】 ｒａｓ始原発癌遺伝子がヒトｒａｓ始原
発癌遺伝子であり、そしてｒａｓ発癌遺伝子がヒトｒａ
ｓ発癌遺伝子である、請求項３記載の方法。 - 【請求項５】 抗原がポリペプチド支持体に結合したオ
リゴペプチドである、請求項４記載の方法。 - 【請求項６】 抗体産生細胞が宿主から選択され、モノ
クローナル抗体の生産に採用される、請求項５記載の方
法。 - 【請求項７】 選択された抗体産生細胞が、モノクロー
ナル抗体の生産能力を持つ融合ハイブリッド細胞を製造
するために他の細胞と融合される、請求項６記載の方
法。 - 【請求項８】 ｒａｓ始原発癌遺伝子の類似部分とは相
違するｒａｓ発癌遺伝子の部分により発現されるアミノ
酸配列と結合したポリペプチド支持体からなり、免疫さ
れた宿主中で抗体を生産する能力を有する抗原。 - 【請求項９】 ｒａｓ発癌遺伝子により発現される単離
されたｐ２１蛋白質。 - 【請求項１０】 ｒａｓ発癌遺伝子がヒト膀胱癌をひき
おこすものである、請求項９記載の単離されたｐ２１蛋
白質。 - 【請求項１１】 請求項９または請求項１０記載の単離
されたｐ２１蛋白質に対する抗体。 - 【請求項１２】 請求項９または請求項１０記載の単離
されたｐ２１蛋白質に対するモノクローナル抗体。 - 【請求項１３】 （ａ） 始原発癌遺伝子と発癌遺伝子
との間で相違するＤＮＡセグメントを決定し、 （ｂ） 該二つの遺伝子で特定される蛋白質をコードす
るヌクレオチド配列を決定し、 （ｃ） 該二つのコード蛋白質のアミノ酸配列を推定
し、 （ｄ） 該二つのコード蛋白質のアミノ酸配列における
相違のどれが、機能上の相違に必須であるかを決定し、
そして （ｅ） 抗原として用いるために、（ｄ）工程で決定さ
れた配列を含み且つ直接囲むアミノ酸配列よりなるオリ
ゴペプチドを合成する、ことにより抗原を調製すること
よりなる、請求項１記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US432337 | 1982-10-01 | ||
| US06/432,337 US4535058A (en) | 1982-10-01 | 1982-10-01 | Characterization of oncogenes and assays based thereon |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58503483A Division JPH0642840B2 (ja) | 1982-10-01 | 1983-09-29 | 発癌遺伝子の解明およびそれに基づく検定法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05281228A true JPH05281228A (ja) | 1993-10-29 |
| JP2573770B2 JP2573770B2 (ja) | 1997-01-22 |
Family
ID=23715723
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58503483A Expired - Lifetime JPH0642840B2 (ja) | 1982-10-01 | 1983-09-29 | 発癌遺伝子の解明およびそれに基づく検定法 |
| JP4051821A Expired - Lifetime JP2573770B2 (ja) | 1982-10-01 | 1992-03-10 | 発癌遺伝子の解明およびそれに基づく検定法 |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58503483A Expired - Lifetime JPH0642840B2 (ja) | 1982-10-01 | 1983-09-29 | 発癌遺伝子の解明およびそれに基づく検定法 |
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| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US4535058A (ja) |
| EP (4) | EP0241961B1 (ja) |
| JP (2) | JPH0642840B2 (ja) |
| AT (3) | ATE115588T1 (ja) |
| DE (3) | DE3382765T2 (ja) |
| WO (1) | WO1984001389A1 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
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| US4699877A (en) * | 1982-11-04 | 1987-10-13 | The Regents Of The University Of California | Methods and compositions for detecting human tumors |
| USRE35491E (en) * | 1982-11-04 | 1997-04-08 | The Regents Of The University Of California | Methods and compositions for detecting human tumors |
| US5591587A (en) * | 1983-08-17 | 1997-01-07 | The Scripps Research Institute | Polypeptide-induced monoclonal receptors to protein ligands |
| US5733738A (en) * | 1983-08-17 | 1998-03-31 | Ligand Pharmaceuticals | Polypeptide-induced monoclonal receptors to protein ligands |
| US5030565A (en) * | 1983-08-17 | 1991-07-09 | Scripps Clinic And Research Foundation | Polypeptide-induced monoclonal receptors to protein ligands |
| US4681840A (en) * | 1984-01-18 | 1987-07-21 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of Commerce | Deoxyribonucleic acid molecules useful as probes for detecting oncogenes incorporated into chromosomal DNA |
| US4725550A (en) * | 1984-01-19 | 1988-02-16 | Research Foundation Of State University Of New York | Novel mutation of the c-K-ras oncogene activated in a human lung carcinoma |
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| US5087571A (en) * | 1984-06-22 | 1992-02-11 | President And Fellows Of Harvard College | Method for providing a cell culture from a transgenic non-human mammal |
| US4866166A (en) * | 1984-08-31 | 1989-09-12 | Cold Spring Harbor Laboratory | Bioassay for transforming genes and genes detected thereby |
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| US4762706A (en) * | 1984-10-17 | 1988-08-09 | Cetus Corporation | Peptide antibodies and their use in detecting oncogene products |
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