KR100814193B1 - 바이오 센서 및 그 제조 방법 - Google Patents

바이오 센서 및 그 제조 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR100814193B1
KR100814193B1 KR1020067007785A KR20067007785A KR100814193B1 KR 100814193 B1 KR100814193 B1 KR 100814193B1 KR 1020067007785 A KR1020067007785 A KR 1020067007785A KR 20067007785 A KR20067007785 A KR 20067007785A KR 100814193 B1 KR100814193 B1 KR 100814193B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
buffer
acid
surfactant
mediator
biosensor
Prior art date
Application number
KR1020067007785A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20060063996A (ko
Inventor
히데아키 야마오카
도모미치 츠지모토
Original Assignee
아크레이 가부시키가이샤
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 아크레이 가부시키가이샤 filed Critical 아크레이 가부시키가이샤
Publication of KR20060063996A publication Critical patent/KR20060063996A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR100814193B1 publication Critical patent/KR100814193B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/001—Enzyme electrodes
    • C12Q1/004—Enzyme electrodes mediator-assisted
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
  • Silicates, Zeolites, And Molecular Sieves (AREA)

Abstract

메디에이터에 대한 산소의 영향을 회피하고, 또한 시료 용액 중의 측정 대상물을, 신속하고 또한 간편하게, 높은 정밀도로 측정할 수 있는 바이오 센서를 제공한다. 전극을 가지는 기판을 준비하고, 상기 전극 표면에, 메디에이터와 계면활성제와 완충제와 층 형상 무기 화합물을 함유하는 용매를 도포하여, 상기 메디에이터의 자연 산화를 방지하는 무기겔층을 형성하고, 또한, 상기 층 위에, 산화 환원 효소를 포함하는 효소 시약층을 형성하여 바이오 센서를 제조할 수 있다. 이 바이오 센서는, 상기 무기겔층에 의해서, 측정 대상물과 산화 환원 요소와의 반응에 의해서 환원된 메디에이터가, 용존 산소 등에 의해 재산화되는 일 없이, 전기 화학적으로 측정된다.

Description

바이오 센서 및 그 제조 방법{BIOSENSOR AND METHOD FOR PREPARATION THEREOF}
본 발명은, 시료 중의 측정 대상물을 전기 화학적으로 측정하는 바이오 센서에 관한 것이다.
종래, 특정한 측정 대상물을 포함하는 시료액에 관해서, 예를 들어, 시료액의 희석이나 교반 등을 행하지 않고서, 간편하고 또한 신속하게 상기 측정 대상물을 정량할 수 있는 바이오 센서가 널리 사용되고 있다. 이러한 바이오 센서는, 예를 들어, 전기 절연성의 기판 상에, 스크린 인쇄 등의 방법에 의해서 작용극(作用極)(측정극이라고도 한다)과 대극을 가지는 전극계를 형성하고, 그 위에, 상기 측정 대상물과 반응하는 산화 환원 효소 및 메디에이터(전자 전달 물질) 등을 포함하는 시약층을 형성함으로써 제작할 수 있다(예를 들어, 특허문헌 1 참조). 이 시약층에, 상기 측정 대상물을 포함하는 시료액을 접촉시키면, 상기 산화 환원 효소의 촉매 작용에 의해서, 예를 들어, 상기 측정 대상물이 산화되어, 상기 메디에이터가 환원된다. 이 환원된 메디에이터(이하, 「환원형 메디에이터」라고 한다)를, 상기 전극계를 이용한 전기 화학적 수법에 의해 재산화하고, 이에 의해 얻어진 산화 전류값으로부터 상기 시료액 중의 측정 대상물의 농도를 산출할 수 있다.
그러나, 반응분위기 중에 산소가 존재하거나, 시료액 중에 용존 산소가 존재하는 경우, 상기 환원형 메디에이터는, 전술과 같이 전기 화학적으로 재산화될 뿐만 아니라, 상기 산소에 의해서도 재산화되어 버린다. 이 때문에, 전기 화학적인 재산화에 의한 산화 전류값에 오차가 생겨, 측정 정밀도가 저하한다는 문제가 있었다.
이러한 문제를 회피하는 방법으로서, 예를 들어, 질소 분위기 하에서의 측정 등을 고려할 수 있으나, 수고가 들고 조작도 번잡해진다. 또한, 전혀 산소가 없는 조건 하에서는, 효소 반응에 산소를 필요로 하는 산화 환원 효소를 사용할 수 없다는 문제도 있어, 적용 범위가 매우 좁아진다.
특허문헌 1: 일본국 특개평 1-291153호 공보
그래서, 본 발명의 목적은, 메디에이터에 대한 산소의 영향을 회피하고, 또한 시료액 중의 측정 대상물을, 신속하고 또한 간편하게, 높은 정밀도로 측정할 수 있는 바이오 센서의 제공이다.
상기 목적을 달성하기 위해서, 본 발명의 바이오 센서의 제조 방법은, 전극을 가지는 기판을 준비하고, 상기 전극 표면에, 적어도 메디에이터와 계면활성제와 완충제와 층 형상 무기 화합물을 함유하는 무기겔층을 형성하는 공정을 포함하는 제조 방법이다.
또한, 본 발명의 바이오 센서는, 상기 본 발명의 제조 방법에 의해 제조한 바이오 센서이다.
본 발명자들은, 바이오 센서에 관해서, 시료 중의 측정 대상물과 산화 환원 효소와의 반응에 의해서 환원된 메디에이터(환원형 메디에이터)가 자연 산화되는 것을 방지하기 위해, 예의 연구를 행하였다. 그 결과, 일반적으로, 예를 들어, 층 형상 무기 화합물에 의해서 무기겔층이 형성되는 것은 알려져 있으나, 무기겔층이 계면활성제 및 완충제를 더 함유함으로써, 상기 환원형 메디에이터의 자연 산화를 방지하는 효과를 발휘하는 무기겔층을 형성할 수 있다는 것을 발견하였다. 이러한 방법에 의해서, 상기 자연 산화 방지 효과를 얻을 수 있다는 것은, 본 발명자들이 처음으로 발견한 것이다. 전술과 같은 방법으로 무기겔층을 형성하면, 시료 중의 측정 대상물을 간접적으로 측정하기 위한 상기 환원형 메디에이터가, 예를 들어, 측정 분위기 중의 산소나 시료 중의 용존 산소 등에 의해서 재산화되는 것을 방지할 수 있다. 이 때문에, 상기 환원형 메디에이터의 재산화에 의한 측정 오차가 해소된, 측정 정밀도가 우수한 바이오 센서를 제공할 수 있다. 또, 본 발명에서, 「상기 메디에이터의 자연 산화」란, 예를 들어, 바이오 센서를 사용할 때 액체 시료 중의 용존 산소나, 공기 중의 수분에 흡수된 산소(예를 들어, 보존 시에 공기 중 수분이 공기 중 산소를 흡수한다)에 의해서, 상기 메디에이터가 산화되는 것을 말한다.
계면활성제 및 완충제 존재 하에서 무기겔층을 형성함으로써, 산화 방지 기능이 발휘되는 것은, 이하에 나타내는 메커니즘에 의하면 추측할 수 있다.
예를 들어, 상기 메디에이터와 계면활성제와 완충제와 층 형상 무기 화합물을 함유하는 분산액을 도포하여 형성된 상기 무기겔층 내에서는, 상기 메디에이터가 상기 층 형상 무기 화합물의 시트 내에 확실하게 들어간 복합체를 형성하여, 상기 메디에이터가 액체 시료 등에 포함되는 용존 산소와 접촉하는 것을 방지하고 있다고 생각된다. 통상, 시료액 중에는 산소가 용존하고 있기 때문에, 전술과 같이 층 형상 무기 화합물이 물을 셧아웃함으로써, 상기 메디에이터에 대한 상기 용존 산소의 공격을 방지할 수 있는 것이다. 그리고, 전술과 같이 계면활성제가 더 존재함으로써, 층 형상 무기 화합물과 메디에이터가 중합하여 불용화하지 않고, 이들 복합체가 분산된 상태가 되어, 상기 효과를 충분히 발휘할 수 있는 무기겔층을 형성할 수 있는 것이다.
또한, 상기 분산액이 완충제를 포함함에 따라, 균일한 무기겔층의 형성이 가능해져, 산화 방지 기능을 한층 더 향상시킬 수 있는 것이다. 이는, 상기 완충제가, 상기 메디에이터와 층 형상 무기 화합물의 복합체를 형성할 때에 바인더로서 작용하기 때문이라고 생각된다. 이 바인더로서의 작용에 의해서, 메디에이터와 층 형상 무기 화합물의 결합이 한층 더 강고해진 복합체가 형성되기 때문에, 예를 들어, 용존 산소를 포함하는 액체를 더 셧아웃할 수 있어, 산소에 의한 메디에이터의 재산화를 방지할 수 있다. 한편, 이 경우, 상기 계면활성제는, 상기 완충제와, 층 형상 무기 화합물 및 메디에이터가, 중합체를 형성하여 분산 불가능하게 되는 것을 방지하는, 소위 블록제로서의 기능도 한다고 생각된다.
본 발명의 바이오 센서는, 전술과 같은 방법으로 제조함으로써, 예를 들어, 메디에이터가, 측정 분위기 중의 산소나 시료 중의 용존 산소 등에 의해서 재산화되는 것을 방지할 수 있다. 이 때문에 본 발명의 바이오 센서는, 상기 환원형 메디에이터의 재산화에 의한 측정 오차가 해소되어, 측정 정밀도가 우수하다.
본 발명의 제조 방법에 의해서 얻어지는 바이오 센서는, 산화 환원 효소로부터 메디에이터로 전자를 수수하는 것은, 물이 아니라, 상기 층 형상 무기 화합물의 층간, 즉 전기 이중층을 통하여 행하여진다고 생각된다. 이 때문에, 수분이 상기 무기겔층에 의해서 셧아웃되는 본 발명의 바이오 센서에 의하면, 예를 들어, 습도가 높은 환경 등에서도 열화를 방지할 수 있는 효과를 나타내는 것이다. 또한, 상기 층 형상 무기 화합물의 전기 이중층은, 물보다도 전자를 통과시키기 쉽기 때문에, 반응 속도의 증대로도 이어진다고 생각된다.
또한, 본 발명의 제조 방법에 의한 바이오 센서는, 상술과 같은 산소의 차단에 의해서, 예를 들어, 산화에 의해 전극에 녹이 발생하는 것 등도 방지할 수 있다.
또, 본 발명에서, 상기 메디에이터의 자연 산화를 방지하는 무기겔층을, 「산화 방지층」이라고도 한다.
도 1은 본 발명의 실시형태에서, 바이오 센서의 제조 방법의 일례를 도시하는 공정도이고, (A)∼(F)는, 각각, 각 공정을 도시한다.
도 2는 상기 실시형태에서의 바이오 센서의 단면도이다.
도 3은 본 발명의 실시예에서, 글루코오스 센서로 시료를 측정한 경우의 전류값의 경시 변화를 도시하는 그래프로서, 동 도(A)가 실시예, 동 도(B)가 비교예의 결과를 각각 도시한다.
도 4는 본 발명의 다른 실시예에서, 시료 중에서의 용존 산소 농도와 변화율(%)과의 관계를 도시하는 그래프이다.
도 5는 본 발명의 또 다른 실시예에서, 시료 중에서의 용존 산소 농도와 변화율(%)과의 관계를 도시하는 그래프이다.
도 6은 본 발명의 또 다른 실시예에서, 시료 중에서의 용존 산소 농도와 변화율(%)과의 관계를 도시하는 그래프이다.
본 발명에서, 상기 층 형상 무기 화합물은, 층 형상 점토 광물인 것이 바람직하고, 특히 바람직하게는 팽윤성 점토 광물이다.
상기 층 형상 무기 화합물이란, 예를 들어, 무기물의 다면체가 평면 형상으로 연속하여 시트 구조를 형성하고, 이 시트 구조가 다시 층 형상으로 겹쳐져 결정 구조를 형성한 것이라고 할 수 있다. 상기 다면체의 형상으로는, 예를 들어, 사면체 시트, 팔면체 시트 등이 있고, 구체적으로는, 예를 들어, Si사면체, Al팔면체 등을 들 수 있다. 이러한 층 형상 무기 화합물로는, 예를 들어, 층 형상 점토 광물, 하이드로탈사이트(hydrotalcite), 스멕타이트(smectite), 할로이사이트(halloysite), 카올린(kolin) 광물, 운모 등이 포함된다.
상기 층 형상 점토 광물이란, 일반적으로, 점토(고운 흙 형상의 무기 입상물로, 물로 습윤해진 상태에서 가소성을 나타내는 것)의 대부분을 차지하는 알루미늄규산염 광물을 들 수 있고, 이것은, 통상, Si가 4개의 산소 원자(O)로 둘러싸인 Si 사면체와, Al 또는 Mg가 6개의 수산기(OH기) 또는 6개의 산소 원자에 둘러싸인 Al 팔면체 또는 Mg팔면체를 최소 구성 단위로 하고 있다.
상기 층 형상 점토 광물의 구조로는, 예를 들어, 상기 Si 사면체가 다른 Si 사면체와 1개의 면을 공유하고, 남는 정점의 산소 원자를 같은 방향을 향하게 하여 육각망 형상의 시트를 형성하고(이하「사면체 시트」라고 한다), 한편, Al팔면체 또는 Mg팔면체가 다른 팔면체와 능각을 공유하여 시트를 형성하고(팔면체 시트), 상기 사면체 시트와 상기 팔면체 시트가 층 형상으로 적층된 구조를 들 수 있다. 구체적으로는, 예를 들어, 상기 사면체 시트와 상기 팔면체 시트가 1매씩 겹쳐진 1:1층이, 몇 층이나 더 적층된 구조의 광물을 1:1형 광물; 2매의 사면체 시트로 1매의 팔면체 시트를 끼운 2:1층이, 몇 매나 더 적층된 구조의 광물을 2:1형 광물; 상기 2:1층의 층간에, 또 1매의 팔면체 시트가 더 끼워진 구조의 광물을 2:1형 광물로, 각각 부르고 있다. 또한, 예를 들어, 팔면체 시트가, Mg(OH)2이고 모든 팔면체 위치에 금속 이온을 가지는 것을 3팔면체형(Trioctahedral)이라고 하고, 팔면체 시트가, Al(OH)3이고 1/3이 빈 구멍으로 되어 있는 것을 2팔면체형(Dioctahedral)이라고 한다. 이 중에서도, 본 발명에서의 상기 층 형상 무기 화합물로는, 2:1형 광물이 바람직하다.
상기 층 형상 무기 화합물을 구성하는 원소로는, 예를 들어, 리튬, 나트륨, 칼륨, 마그네슘, 알루미늄, 규소, 산소, 수소, 불소, 탄소 등을 들 수 있으며, 어느 1종류이어도 되고, 2종류 이상으로 구성되어도 된다. 특별히 제한되지는 않지만, 구체예로서, 예를 들어, 하기 식(1)∼(9)에 나타내는 화합물 등을 들 수 있고, 이들 화합물은, 예를 들어, 결정수를 포함하여도 된다. 이들 하기식은, 광물학적 또는 화학적으로 순수한 화합물로서의 식이지만, 실제로는, 예컨대, 규산나트륨 등의 불순물을 포함하는 경우가 있다. 이 때문에, 원소 분석 등에 의해서 화학식을 정한 경우, 이들 식과 반드시 일치하지는 않는 것은, 예를 들어, 문헌(D. W, Thompson, J. T. Butterworth, J. Colloid Interf. Sci., 151, 236-243(1992)) 등에도 기재되어 있다.
MxSi4(Al2-xMgx)O10X2 …(1)
상기 식(1)에서, 바람직하게는, M은, H, Li, Na 및 K로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 하나이고, X는 OH 및 F 중 적어도 한쪽이며, x는 2미만의 정수이다.
Mx(Si4 - xAlx)Al12O10X2 …(2)
상기 식(2)에서, 바람직하게는, M은, H, Li, Na 및 K로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 하나이고, X는 OH 및 F 중 적어도 한쪽이며, x는 4미만의 정수이다.
MxSi4(Mg3-xLix)O10X2 …(3)
상기 식(3)에서, 바람직하게는, M은, H, Li, Na 및 K로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 하나이고, X는 OH 및 F 중 적어도 한쪽이며, x는 3미만의 정수이다.
Mx(Si4-xAlx)Mg3O10X2 …(4)
상기 식(4)에서, 바람직하게는, M은, H, Li, Na 및 K로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 하나이고, X는 OH 및 F 중 적어도 한쪽이며, x는 4미만의 정수이다.
MSi4Mg2.5O10X2 …(5)
상기 식(5)에서, M은, 바람직하게는 Li 및 Na 중 적어도 한쪽이고, 보다 바람직하게는 Na이며, X는, 바람직하게는 OH 및 F 중 적어도 한쪽이며, 보다 바람직하게는 F이다.
M2Si4Mg2O10X2 …(6)
상기 식(6)에서, M은, 바람직하게는 Li 및 Na 중 적어도 한쪽이고, 보다 바람직하게는 Li이며, X는, 바람직하게는 OH 및 F 중 적어도 한쪽이며, 보다 바람직하게는 F 이다.
Mg6Al12(OH)16Xx …(7)
상기 식(7)에서, X는, 바람직하게는 할로겐, NO3, SO4, CO3 및 OH로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 기 및 아니온형 유기산 중 적어도 한쪽이고, 보다 바람직하게는 CO3이며, x는, X가 할로겐, OH, NO3 또는 1가 유기산일 때, 바람직하게는 2이고, X가 SO4, CO3 또는 2가의 유기산일 때, 바람직하게는 1이다.
Na0.33Si4(Mg2.67Li0.33)O10X2 …(8)
상기 식(8)에서, X는, 바람직하게는 OH 및 F 중 적어도 한쪽이고, 바람직하게는 OH이다.
Naa-b(Si4-aAla)(Mg3-bAlb)O10X2 …(9)
상기 식(9)에서, X는, 바람직하게는 OH 및 F 중 적어도 한쪽이며, 바람직하게는 OH이고, a는, 바람직하게는 4미만의 정수이고, b는, 바람직하게는 3미만의 정수이며, a-b>O인 것이 바람직하다.
상기 층 형상 무기 화합물의 구체예로는, 예를 들어, 카올리나이트(kaolinite), 할로이사이트, 사문석 등의 1:1형 점토 광물; 활석(talc), 파이로필라이트(pyrophyllite), 스멕타이트, 질석(vermiculite)(상기 식(2)으로 나타내는 것, 이하 동일), 불소4규소운모(상기 식(5))나 테니오나이트(상기 식(6))를 포함하는 운모 등의 2:1형 점토 광물; 녹니석(chlorite) 등의 2:1:1형 점토 광물; 2:1∼2:1:1형의 중간 광물; 이모고라이트(imogolite) 등의 준정질 점토 광물; 앨러페인(allophane) 등의 비정질 점토 광물; 하이드로탈사이트(hydrotalcite)(상기 식(7)) 등을 들 수 있다.
또한, 스멕타이트에는, 예를 들어, 동형 치환된 사면체, 팔면체 격자 중의 이온종에 따라서 몬모릴로라이트(montmorillonite)(상기 식(1)), 몬모릴로라이트가 40∼80% 포함되는 천연물인 벤토나이트(bentonite), 베이델라이트(beidelite)(상기 식(2)) 등의 2팔면체형; 헥토라이트(hectorite)(상기 식 (3), 바람직하게는 상기 식(8)), 사포나이트(saponite)(상기 식(4), 바람직하게는 상기 식(9)), 논트로나이트(nontronite) 등의 3팔면체형 등이 포함된다.
하이드로탈사이트는, 예를 들어, 상기 식(7)으로 나타난다. 구체적으로는, 예를 들어, Mg6Al2(OH)16CO3·4H2O로 나타내는 층 형상 광물로서, Mg(OH)2(블루사이트: 중심에 Mg2 +를 가지는 산소 팔면체의 층이 겹쳐져 쌓인 구조를 가진다)의 Mg2 +의 일부가, A3+로 동형 치환되어 있다. 이는 양전하를 가지지만, 층간의 CO3 2 -에 의해서 전기적 중성을 유지하고 있고, 음이온 교환능을 가지는 것이다. 또, 규산염 광물이 아니지만, 통상, 점토 광물로서 취급된다.
전술과 같은 층 형상 무기 화합물의 조성의 예를, 하기 표 1에 나타낸다. 또, 하기 표 1에서, 「MI」는, 1가 양이온으로 대표시킨 교환성 양이온을 나타내고, 예를 들어, H+, Na+, K+, Li+ 등이다.
[표 1]
Figure 112006028041870-pct00001
상기 층 형상 무기 화합물의 평균 구멍 지름은, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어, 용매에 대하여 균일하게 분산할 수 있는 정도의 입경인 것이 바람직하다. 상기 층 형상 무기 화합물은,일반적으로 판 형상의 입자이고, 또한, 복수의 입자가 응집과 벽개(劈開)를 되풀이하는 동적 평형에 있기 때문에, 평균 입경을 정의하는 것 자체가 곤란하지만, 예를 들어, 광 산란법이나 전자현미경을 이용한 관찰 등의 수단에 의해 측정한 경우에, 수중에 분산시킨 상태로, 1㎚∼20㎛의 범위인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 10㎚∼2㎛의 범위이다.
이들 점토 광물 등의 층 형상 무기 화합물은, 예를 들어, 4급 암모늄염 등의 필러를 세워, 층간 거리나 층간의 전하나 극성을 미리 조정할 수 있다.
전술과 같은 층 형상 무기 화합물 중, 보다 바람직하게는 2:1형 점토 광물이고, 특히 바람직하게는 이온 교환능을 가지는 팽윤성 점토 광물이다.
상기 팽윤성 점토 광물 중, 보다 바람직하게는 벤토나이트, 스멕타이트, 질석, 합성 불소 운모 등이고, 특히 바람직하게는 합성 헥토라이트나 합성 사포나이트 등의 합성 스멕타이트; 합성 불소 운모로 대표되는 팽윤성 합성 운모; Na형 운모 등의 합성 운모(천연 운모는, 통상, 비팽윤성의 점토 광물이다) 등이다. 이들 층 형상 무기 화합물은, 단독으로 사용하여도 되고, 2종 이상을 병용하여도 된다.
이러한 층 형상 무기 화합물로는, 예를 들어, 시판품을 사용할 수 있고, 코프 케미칼(주)제의 상품명 루센타이트SWN, 상품명 루센타이트SWF(합성 헥토라이트), 상품명 ME(불소운모), 쿠니미네고교(주)제의 상품명 스멕톤SA(합성 사포나이트), 교와가가쿠고교(주)제의 상품명 치키소피W(합성 헥토라이트), 상품명 쿄와도 500(합성 하이드로탈사이트), 라포샤제의 상품명 라포나이트(합성 헥토라이트), (주)나카라이테스크샤제의 천연 벤토나이트, (주)호쥰고교가부시키가이샤제의 상품명 멀티겔(벤토나이트) 등을 들 수 있다.
본 발명에서, 상기 계면활성제로는 양성(兩性) 계면활성제가 바람직하고, 보다 바람직하게는, 예를 들어, 동일 분자 내에 양전하와 음전하를 가지는 양성 계면활성제이고, 예를 들어, 알킬아미노카르복시산(또는 그의 염), 카르복시베타인, 술포베타인 및 포스포베타인 등을 들 수 있다. 이들 중에서도, 더 바람직하게는, 동일 분자 내에 양전하와 음전하를 가지고, 또한, 상기 양전하와 음전하가 이간하고 있는 양성 계면활성제로서, 예를 들어, 카르복시베타인, 술포베타인 및 포스포베타인 등이다. 구체적으로는, 상기 카르복시베타인으로서, 알킬디메틸아미노아세트산베타인 등, 상기 술포베타인으로서, CHAPS (3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate), CHAPSO (3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-2-hydroxy-1-propanesulfonate) 및 알킬히드록시술포베타인 등을 사용할 수 있다. 이들 중에서도 바람직하게는, 술포베타인이고, 보다 바람직하게는 CHAPS, CHAPSO, 특히 바람직하게는 CHAPS 이다.
본 발명에서, 상기 완충제로는, 아민계 완충제가 바람직하고, 예를 들어, Tris (Tris(hydroxymethyl)aminomethane), ACES (N-(2-Acetamido)-2-aminoethanesulfonic acid), CHES (N-Cyclohexyl-2-aminoethanesulfonic acid), CAPSO (N-Cyclohexyl-2-hydroxy-3-aminopropanesulfonic acid), TAPS (N-Tris(hydroxymethyl)methyl-3-aminopropanesulfonic acid), CAPS (N-Cyclohexyl-3-aminopropanesulfonic acid), Bis-Tris (Bis(2-hydroxyethyl)iminotris(hydroxymethyl)methane), TAPSO (2-Hydroxy-N-tris(hydroxymethyl)methyl-3-aminopropanesulfonic acid), TES (N-Tris(hydroxymethyl)methyl-2-aminoethanesulfonic acid), Tricine (N-[Tris(hydroxymethyl)methyl]glycine) 및 ADA (N-(2-Acetamido)iminodiacetic acid) 등을 들 수 있고, 바람직하게는 ACES, Tris이고, 더 바람직하게는 ACES이다. 이들 물질은, 1종류이어도 되고 2종류 이상을 병용하여도 된다.
또한, 상기 완충제로는, 카르복시기를 가지는 완충제도 바람직하고, 예를 들어, 아세트산-아세트산Na 완충제, 말산-아세트산Na 완충제, 말론산-아세트산Na 완충제, 숙신산-아세트산Na 완충제 등을 들 수 있고, 그 중에서도 숙신산-아세트산Na 완충제가 바람직하다.
상기 아민계 완충제와 상기 계면활성제와의 조합으로는, 예를 들어, Tris와 CHAPS, ACES와 CHAPS, ACES와 CHAPSO의 조합 등을 들 수 있고, 보다 바람직하게는 CHAPS와 ACES이다. 또한, 카르복시기를 가지는 완충제와 상기 계면활성제와의 조합으로는, 예를 들어, 숙신산-아세트산Na와 CHAPS 또는 CHAPSO, 말론산-아세트산Na와 CHAPS, 말산-아세트산Na와 CHAPS 또는 CHAPSO, 아세트산-아세트산Na와 CHAPS 등을 들 수 있고, 바람직하게는 숙신산-아세트산Na와 CHAPS의 조합이다.
본 발명에서, 상기 메디에이터로는, 예를 들어, 후술과 같은 산화 환원 효소와 측정 대상물과의 반응에 의해서 환원형이 되고, 전기 화학적으로 산화되어, 산화 전류에 의해서 검출할 수 있는 것이 바람직하고, 종래 공지의 것을 사용할 수 있다.
구체적으로는, 페리시안화칼륨(potassium ferricyanide), p-벤조퀴논 및 그 유도체, 페나진메토설페이트, 인도페놀, 2,6-디클로로페놀인도페놀 등의 인도페놀 유도체, β-나프토퀴논-4-술폰산칼륨, 페로신, 페로신카르복시산 등의 페로신 유도체, 오스뮴 착체, 루테늄 착체, NAD+ (Nicotinamide adenine dinucleotide), NADP+ (Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate), 피롤로퀴놀린퀴논(PQQ)(4,5-Dihydro-4,5-dioxo-1H-pyrrolo[2,3-f]quinoline-2,7,9-tricarboxylic acid), 메틸렌블루, 시토크롬 c(cytochrome c), 시토크롬 b(cytochrome b), 구리 착체 등을 사용할 수 있다. 이들 중에서도, 바람직하게는 페리시안화칼륨, 페로신, 오스뮴 착체, 루테늄 착체, NAD+, NADP+ 등을 사용할 수 있다.
또한, 이 밖에도, 예를 들어, 1,1’-디메틸-4,4’-비피리딜리움염, 1,1’-디 벤질-4,4’-비피리딜리움염, 1,4-디아미노벤젠, 2-메틸-1,4-나프토퀴논, N-메틸페나지니움염, 1-히드록시-5-메틸페나지니움염, 1-메톡시-5-메틸페나지니움염, 9-디메틸아미노벤조알파페녹사진-7-이움염, 헥사시아노철(II)염, 7-히드록시-3H-페녹사진-3-온10-옥사이드, 3,7-디아미노-5-페닐페나지니움염, 3-(디에틸아미노)-7-아미노-5-페닐페나지니움염, 1,4-벤젠디올, 1,4-디히드록시-2,3,5-트리메틸벤젠, N,N,N’,N’-테트라메틸-1,4-벤젠디아민, Δ2,2-비-1,3-디티올, 2,6-디메틸벤조퀴논, 2,5-디메틸벤조퀴논, 2,3,5,6-테트라메틸-2,5-시클로헥사디엔-1,4-디온, 2,6-디클로로-4-[(4-히드록시페닐)이미노]-2,5-시클로헥사디엔-1-온, 2,6-디클로로-4-[(3-클로로-4-히드록시페닐)이미노]-2,5-시클로헥사디엔-1-온, 7-(디에틸아미노)-3-이미노-8-메틸-3H-페녹사진염, 3,7-비스(디메틸아미노)페노티아진-5-이움염 등을 메디에이터로서 사용할 수 있다.
본 발명의 제조 방법에서, 상기 무기겔층은, 적어도 메디에이터와 계면활성제와 완충제와 층 형상 무기 화합물을 함유하는 분산액을 도포함으로써, 형성하는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명에서는, 상기 무기겔층의 위에, 산화 환원 효소를 함유하는 층을 형성하여, 적층체의 시약층으로 하여도 되고, 또는, 상기 분산액에 산화 환원 효소를 더 함유시켜, 상기 산화 환원 효소를 함유하는 무기겔층을 전극 표면에 형성하여, 단층의 시약층으로 하여도 된다. 이와 같이 단층의 시약층을 형성하는 경우, 산화 환원 효소를 함유하는 층과 메디에이터를 함유하는 층을 별도로 형성할 필요가 없기 때문에, 제조가 한층 더 간편해진다. 이러한 바이오 센서는, 예를 들 어, 글루코오스 디히드로게나아제(glucose dehydrogenase)(GDH)와 같이, 효소 반응에, 산소를 필요로 하지 않는 효소를 사용하는 경우, 특히 바람직하다.
상기 산화 환원 효소로는, 예를 들어, 시료 중의 측정 대상물 및 상기 메디에이터와 산화 환원 반응하는 것이라면 특별히 제한되지 않고, 측정 대상물의 종류 등에 따라서 적절히 결정할 수 있다.
구체적으로는, 예를 들어, 글루코오스 옥시다아제(glucose oxidase)(GOD), 피라노오즈 옥시다아제(pyranose oxidase), 글루코오스 디히드로게나아제(GDH), 젖산 옥시다아제, 젖산 디히드로게나아제, 과당 디히드로게나아제, 갈락토오스 옥시다아제, 콜레스테롤 옥시다아제, 콜레스테롤 디히드로게나아제, 알코올 옥시다아제, 알코올 디히드로게나아제, 피루빈산 옥시다아제, 글루코오스-6-인산 디히드로게나아제, 아미노산 디히드로게나아제, 포름산 디히드로게나아제, 글리세롤 디히드로게나아제, 아실-CoA 옥시다아제, 콜린 옥시다아제, 4-히드록시안식향산 히드록시라세, 말레산 디히드로게나아제, 사르코신 옥시다아제, 유리카제(uricase) 등을 들 수 있다.
상기 산화 환원 효소와 상기 메디에이터의 조합은, 특별히 제한되지 않지만, 예를 들어, GOD와 페리시안화칼륨, GDH와 루테늄 착체, 콜레스테롤 디히드로게나아제와 페로신, 알코올 디히드로게나아제와 구리 착체의 조합 등을 들 수 있다.
(실시형태 1)
본 발명의 제1 바이오 센서 제조 방법의 일례에 관해서, 도 1 및 도 2에 기초하여 설명한다. 도 1(A)∼(F)는, 바이오 센서를 제조하는 일련의 공정을 도시한 사시도이다. 또한, 도 2는, 상기 도 1(F)에 도시하는 바이오 센서의 Ⅰ-Ⅰ방향 단면도이다. 또한, 도 1(A)∼(F) 및 도 2에서, 동일 개소에는 동일 부호를 붙이고 있다.
도 1(F) 및 도 2에 도시하는 바와 같이, 이 바이오 센서(1)는, 기판(11), 리드부(12a)를 가지는 작용극(12)과 리드부(13a)를 가지는 대극(13)으로 구성된 전극계, 절연층(14), 메디에이터와 층 형상 무기 화합물과 계면활성제를 포함하는 무기겔층(산화 방지층)(16), 산화 환원 효소를 포함하는 효소 시약층(17), 개구부를 가지는 스페이서(18) 및 관통 구멍(20)을 가지는 커버(19)를 구비하고 있다. 도 1(B)에 도시하는 바와 같이, 기판(11)의 한쪽의 단부(양 도면에서 우측) 상에는, 검출부(15)가 설치되어 있고, 검출부(15)에는, 작용극(12)과 대극(13)이, 기판(11)의 폭 방향에 병행하여 배치되어 있다. 상기 양 전극의 일단은, 각각 리드부(12a, 13a)(양 도면에서 좌측)가 되고, 이들과, 검출부(15)에서의 타단이, 수직이 되도록 배치되어 있다(도 1(A)). 또한, 작용극(12)과 대극(13)의 사이는, 절연부로 되어 있다. 이러한 전극계를 구비한 기판(11)의 위에는, 도 1(B)에 도시하는 바와 같이, 리드부(12a, 13a) 및 검출부(15)를 제외하고, 절연층(14)이 적층되어 있고, 절연층(14)이 적층되어 있지 않은 상기 검출부(15) 상에는, 무기겔층(16) 및 효소 시약층(17)이 이 순서로 적층되어 있다. 그리고, 절연층(14)의 위에는, 도 1(E)에 도시하는 바와 같이, 검출부(15)에 대응하는 개소가 개구부로 되어 있는 스페이서(18)가 배치되어 있다. 또한 스페이서(18)의 위에는, 상기 개구부에 대응하는 일부에 관통 구멍(20)을 가지는 커버(19)가 배치되어 있다(도 1(F)). 이 바이오 센 서(1)에서, 상기 개구부의 공간 부분이고, 또한, 상기 효소 시약층(17) 및 절연층(14)과 커버(19)에 끼워진 공간 부분이, 캐필러리(capillary) 구조의 시료 공급부(21)가 된다. 그리고, 상기 관통 구멍(20)이, 시료를 모관 현상에 의해 흡입하기 위한 공기 구멍이 된다.
이 바이오 센서(1)의 크기는, 특별히 제한되지 않고, 공급하는 시료의 양 등에 따라 적절히 설정할 수 있지만, 예를 들어, 전체 길이 5∼50㎜, 전체 폭 1∼50㎜, 최대 두께 2000∼500㎛, 최소 두께 50∼500㎛이다. 또, 「길이」란, 바이오 센서의 길이 방향의 길이를 말하며, 「폭」이란, 폭 방향의 길이를 말한다(이하, 동일).
기판(11)의 크기는, 예를 들어, 길이 5∼50㎜, 폭 1∼50㎜, 두께 1000∼10㎛이고, 절연층(14)의 크기는, 예를 들어, 길이 5∼50㎜, 폭 1∼50㎜, 두께 10∼200㎛이고, 검출부(15)의 크기는, 예를 들어, 길이 0.1∼10㎜, 폭 0.1∼10㎜이고, 무기겔층(16)의 크기는, 예를 들어, 길이 0.1∼10㎜, 폭 0.1∼10㎜, 두께 0.001∼500㎛이고, 효소 시약층(17)의 크기는, 길이 0.1∼10㎜, 폭 0.1∼10㎜, 두께 0.001∼500㎛이다. 스페이서의 크기는, 예를 들어, 길이 1∼50㎜, 폭 1∼50㎜, 두께 10∼1000㎛이고, 그 개구부는, 예를 들어, 길이 0.1∼10㎜, 폭 0.01∼10㎜이다. 커버(19)의 크기는, 예를 들어, 길이 5∼50㎜ ,폭 1∼50㎜, 두께 10∼1000㎛이고, 그 관통 구멍은, 예를 들어, 지름 0.1∼10㎜이다.
무기겔층(16)에서의 층 형상 무기 화합물의 함유량은, 공급하는 시료의 종류나 그 양, 검출부(15)의 면적 등에 따라서 적절히 결정할 수 있지만, 예를 들어, 검출부(15)의 면적 1㎠당, 0.003∼30㎎의 범위, 바람직하게는 0.1∼10㎎의 범위, 보다 바람직하게는 0.3∼3㎎의 범위이다. 구체적으로, 상기 층 형상 무기 화합물이 스멕타이트인 경우, 예를 들어, 상기 면적 1㎠당, 0.003∼30㎎의 범위, 바람직하게는 O.1∼10㎎의 범위, 보다 바람직하게는 O.3-3㎎의 범위이다. 상기 함유량이 면적 1㎠당 0.003㎎ 이상이라면, 예를 들어, 충분히 산소 차단 효과를 발휘할 수 있고, 또한, 면적 1㎠당 30㎎ 이하라면, 효소 차단 효과 및 재현성, 반응성을 한층 더 향상시킬 수 있다. 또한, 상기 면적당 층 형상 무기 화합물의 양은, 무기겔층(16)의 두께에 관계되어 있고, 전술과 같이, 층의 두께는, 0.001∼500㎛의 범위가 바람직하다.
또한, 무기겔층(16)에서의 계면활성제(예를 들어, 양성 계면활성제)의 함유량은, 예를 들어, 상기 층 형상 무기 화합물의 양에 따라서 적절히 결정할 수 있지만, 층 형상 무기 화합물 300㎎에 대하여, 예를 들어, 0.1m㏖∼100m㏖의 범위, 바람직하게는 0.5m㏖∼10m㏖, 보다 바람직하게는 0.5m㏖∼1m㏖의 범위이다.
또한, 무기겔층(16)에서의 메디에이터의 함유량은, 예를 들어, 측정 시료의 종류, 측정 대상물의 종류, 후술하는 효소 시약층에서의 산화 환원 효소의 양 등에 따라서 적절히 결정할 수 있지만, 예를 들면, 검출부(15)의 면적 1㎠당, 10m㏖∼100㏖이 바람직하고, 보다 바람직하게는 10m㏖∼50m㏖, 특히 바람직하게는 15m㏖∼20m㏖의 범위이다.
이 무기겔층(16)은, 완충제를 더 함유하여도 된다. 무기겔층(16)에서의 상기 완충제의 함유량은, 예를 들어, 상기 층 형상 무기 화합물의 양에 따라서 적절 히 결정할 수 있고, 층 형상 무기 화합물 0.3g에 대하여, 완충제는, 예를 들어, 0.1m㏖∼100m㏖이 바람직하고, 보다 바람직하게는 1m㏖∼50m㏖,특히 바람직하게는 10m㏖∼20m㏖의 범위이다.
상기 효소 시약층(17)에서의 산화 환원 효소의 함유량은, 특별히 제한되지 않고, 시료의 종류나 그 양, 측정 대상물의 종류나 양 등에 따라서 적절히 결정할 수 있다. 구체적으로는, 검출부(15)의 면적 1㎠당, 예를 들어, 0.1U∼100KU의 범위이고, 바람직하게는, 1U∼10KU의 범위이며, 보다 바람직하게는 1U∼100U의 범위이다.
또한, 효소 시약층(17) 중의 효소량과 상기 무기겔층(16) 중의 메디에이터와의 비율은, 예를 들어, 효소 1000U당, 메디에이터 0.01∼1M의 범위, 바람직하게는 0.01∼0.5M의 범위, 더 바람직하게는 50mM∼200mM의 범위이다.
이러한 바이오 센서는, 예를 들어, 이하와 같이 하여 제작할 수 있다.
우선, 전극계를 형성하기 위한 기판(11)을 준비한다. 상기 기판(11)의 재료로는, 전기 절연성 재료가 바람직하고, 예를 들어, 플라스틱, 유리, 종이, 세라믹스, 고무 등을 들 수 있다. 상기 플라스틱으로는, 예를 들어, 폴리에틸렌테레프탈레이트(PET), 폴리스티렌(PS), 폴리메타크릴레이트(PMMA), 폴리프로필렌(PP), 아크릴 수지, 유리에폭시 등을 들 수 있다.
다음에, 도 1(A)에 도시하는 바와 같이, 기판(11) 상에 리드부(12a)를 가지는 작용극(12) 및 리드부(13a)를 가지는 대극(13)으로 이루어지는 전극계를 형성한다. 또, 전극의 형상은, 도 1(A)에 도시하는 형상에는 전혀 제한을 받지 않는다. 상기 전극으로는, 카본 전극, 금 전극, 팔라듐 전극, 백금 전극 등이 바람직하고, 그 종류에 따라서, 예를 들어, 스크린 인쇄, 코팅법, 증착법 등의 공지 방법에 의해 형성할 수 있다.
카본 전극의 경우에는, 예컨대, 카본 잉크를 상기 기판(11) 상에 스크린 인쇄하는 수단, 코팅하는 수단 등에 의해 형성할 수 있다.
또한, 상기 금 전극은, 예를 들어, 증착법, 도금법, 스퍼터법, 금박 부착법 등에 의해 형성할 수 있다. 상기 증착법은, 예를 들어, 이온 플레이팅법에 의해, 진공도 1.33×10-4㎩, 입력 파워 300W, 레이트 5×10-1㎚/초, 시간 2분의 조건에서, 예를 들어, PET 등의 플라스틱 시트 상에 금을 증착하고, 또한 키스 컷 장치를 이용하여, 상기 시트 상에 증착된 금박층에 절단선을 만드는 방법이다. 이에 의해, 절단선 부분이 절연부가 되어, 작용극 및 대극으로 이루어지는 전극계를 형성할 수 있다.
계속해서, 도 1(B)에 도시하는 바와 같이, 상기 전극계(12, 13)를 형성한 기판(11) 상에 절연층(14)을 형성한다. 이 절연층은, 전극의 리드부(12a, 13a)(도 1(B)에서 좌측)에서, 후술하는 무기겔층 등을 형성하는 검출부(15)를 제외한 기판(11)상에 형성한다.
상기 절연층(14)은, 예를 들어, 절연성 수지를 용매에 용해한 절연 페이스트를 상기 기판(11)상에 인쇄하고, 이것을 가열 처리 또는 자외선 처리하여 형성할 수 있다.
상기 절연성 수지로는, 예를 들어, 폴리에스테르, 부티랄 수지, 페놀 수지 등을 들 수 있고, 상기 용매로는, 예를 들어, 카르비톨아세테이트, 2염기산 에스테르계 혼합용제(DBE솔벤트) 등을 들 수 있다. 상기 페이스트에서의 상기 절연성 수지의 농도는, 예를 들어, 65∼95중량%의 범위가 바람직하고, 보다 바람직하게는 75∼90중량%의 범위이고, 특히 바람직하게는 80∼85중량%의 범위이다.
상기 가열 처리의 조건은, 사용하는 상기 절연성 수지의 종류에 따라서 적절히 결정할 수 있다.
또, 상기 절연층(14)은, 상기 인쇄법 이외에, 예를 들어, 코팅, 막 접착, 에칭 등의 방법에 의해서도 형성할 수 있다.
다음에, 도 1(C)에 도시하는 바와 같이, 절연층(14)이 형성되어 있지 않은 검출부(15)에서, 기판(11) 및 전극(12, 13) 상에, 무기겔층(16)을 형성한다. 무기겔층(16)은, 예를 들어, 메디에이터 및 계면활성제를 포함하고, 또한 상기 층 형상 무기 화합물이 분산된 분산액을 조제하고, 이것을 상기 검출부(15)에 나누어 주입하여, 건조함으로써 형성할 수 있다. 또, 이 무기겔층(16)은, 반드시 상시 겔 형상일 필요는 없고, 사용 전에는, 상기 건조 공정에 의해서 건조한 상태이어도 되고, 액체 시료 등을 함침(含浸)한 경우에, 겔 형상이 되는 것이 바람직하다.
상기 분산액의 조제에 사용하는 용매로는, 예컨대, 물, 완충액 알코올, N,N-디메틸포름아미드(DMF), 디메틸술폭시드(DMSO) 등을 사용할 수 있고, 그 중에서도 바람직하게는 초순수이다.
상기 분산액에서의 상기 층 형상 무기 화합물의 농도는, 예를 들어, O.1∼ 100㎎/mL의 범위이고, 바람직하게는 1∼100㎎/mL의 범위이고, 보다 바람직하게는 10∼30㎎/mL의 범위이다. 또한, 상기 분산액에서의 상기 계면활성제의 농도는, 예를 들어, 1∼200mM의 범위이고, 바람직하게는 1∼100mM의 범위이고, 보다 바람직하게는 1∼10mM의 범위이다.
또한, 분산액에서의 층 형상 무기 화합물과 계면활성제와의 첨가 비율로는, 상기 층 형상 무기 화합물 300㎎에 대하여, 계면활성제가, 예를 들어, 0.1m㏖∼100m㏖의 범위, 바람직하게는 0.5m㏖∼10m㏖, 더 바람직하게는 0.5m㏖∼1m㏖의 범위이다.
또한, 상기 분산액에서의 상기 메디에이터의 농도는, 예를 들어, 1∼1000mM의 범위이고, 바람직하게는 100∼800mM의 범위이고, 더 바람직하게는 200∼500mM의 범위이고, 특히 바람직하게는 300mM 부근이다.
상기 분산액은, 전술과 같은 아민계 등의 완충제를 더 포함하는 것이 바람직하고, 이 경우, 상기 완충제의 농도는, 예를 들어, 1∼1000mM의 범위이고, 바람직하게는 10∼500mM의 범위이며, 더 바람직하게는 50∼200mM의 범위이다. 또한, 층 형상 무기 화합물에 대한 상기 완충제의 첨가 비율로는, 상기 층 형상 무기 화합물 0.3g에 대하여, 상기 완충제가, 예를 들어, 0.1m㏖∼100m㏖가 바람직하고, 보다 바람직하게는 1m㏖∼50m㏖, 특히 바람직하게는 10m㏖∼20m㏖의 범위이다.
또한, 상기 계면활성제와 상기 완충제의 첨가량은, 예를 들어, 전술과 같이 무기 미립자에 대한 비율로 결정할 수 있기 때문에, 상기 계면활성제와 상기 완충제의 첨가 비율(㏖비 A:B)은, 특별히 제한되지 않지만, 예를 들어, A:B=1:1∼1:250 의 범위이고, 바람직하게는 1:10∼1:100의 범위이며, 더 바람직하게는 1:25∼1:50의 범위이다.
상기 용매에 대한, 상기 메디에이터, 상기 층 형상 무기 화합물 및 계면활성제 등의 각 성분의 첨가 순서는 특별히 제한되지 않지만, 예를 들어, 우선, 상기 용매에 층 형상 무기 화합물을 첨가하고, 충분히 교반한 후, 계면활성제를 첨가한다. 그리고, 상기 완충제를 더 첨가한 후에, 마지막으로 메디에이터를 용해하는 것이 바람직하다. 이 순서에 의하면, 메커니즘은 불분명하지만, 한층 더 균일하고, 산소와의 접촉이 방지되는 무기겔층을 형성할 수 있다. 또, 상기 완충제는, 계면활성제와 함께 첨가하여도 되지만, 특히 바람직하게는, 계면활성제의 첨가 후이다.
또한, 상기 분산액의 조제 방법은 특별히 제한되지 않지만, 예를 들어, 사용하는 메디에이터의 종류 등에 따라서, pH의 조정이나 사용하는 완충제의 종류를 선택하는 것이 바람직하다. 이하에, 메디에이터의 종류에 따른 구체적인 예를 든다.
우선, 중성 부근에서의 사용이 바람직한 메디에이터를 사용하는 경우의 예를 설명한다. 일반적으로, 스멕타이트와 같은 층 형상 무기 화합물(무기 겔)은, 물 등의 용매에 용해하면 투명화하지만, 그 분산액의 pH는 고 알칼리성(pH10 부근)이다. 한편, 중성 부근에서의 사용이 바람직한 메디에이터나 효소 등은, 안정된 pH조건 하, 즉, 중성 부근에서 첨가하는 것이 바람직하다. 그런데, 무기겔은, 중성 부근에서 백탁하거나 침전이 생기는 경우가 있다. 이 경우에, 완충제로서 전술과 같은 아민계 완충제를 첨가하면, 상기 분산액의 pH를 중성 부근으로 조정할 수 있고, 또한, 메커니즘은 불분명하지만, 중성 부근임에도 불구하고, 침전이 발생하는 일도 없이, 메디에이터를 첨가할 수 있는 것이다. 그리고, 결과적으로, 전술과 같이, 메디에이터의 재산화를 충분히 방지할 수 있는 무기겔층을 확실히 형성할 수 있는 것이다. 또, 양성 계면활성제와 같은 계면활성제를 첨가한 후에, 아민계 완충제를 첨가함으로써, 조제하는 분산액의 백탁이나 침전을 충분히 방지할 수 있다는 것도, 본 발명자 등이 처음으로 발견한 것이다. 구체적인 첨가 순서로는, 층 형상 무기 화합물의 분산액에, 계면활성제를 첨가한 후, 아민계 완충제를 첨가하는 것이 바람직하다. 아민계 완충제를 첨가한 후의 분산액의 pH는, 예를 들어, 9∼5의 범위이고, 바람직하게는 8∼6이며, 더 바람직하게는 7.5∼7이다.
중성 부근에서의 사용이 바람직한 메디에이터로는, 예를 들어, 페리시안화칼륨, 시토크롬C(cytochromeC), PQQ, NAD+, NADP+, 구리 착체 등을 들 수 있다.
또한, 산성 부근에서의 사용이 바람직한 메디에이터를 사용하는 경우에는, 이하와 같은 조제 방법이 바람직하다. 전술과 같이, 일반적으로, 층 형상 무기 화합물(무기겔)을 용매에 용해하면 투명화하고, 그 분산액의 pH는 강알칼리성이 된다. 이 경우, 산성 부근에서의 사용이 바람직한 메디에이터를 첨가하기 위해서는, 예를 들어, 상기 분산액에 HCl과 같은 산을 첨가하여, 상기 분산액의 pH를 산성 측으로 조정하고, 상기 계면활성제를 첨가한 후에, 전술과 같은 카르복시기를 가지는 완충제를 첨가하여 pH조정을 행하고, 메디에이터를 첨가하는 것이 바람직하다.
이러한 방법이 바람직한 것은 이하의 이유 때문이다. 스멕타이트와 같은 무 기 층 형상 화합물은, 그 분산액에 HCl 등의 산을 첨가하여, 강산성 조건으로 하면(예를 들어, pH2 부근), 일단은 백탁하여 응집을 발생시키지만, 교반을 더 계속함으로써(예를 들어, 24시간 정도), 산성 측이어도 분산액을 투명화할 수 있음을, 본 발명자 등은 발견하였다. 그러나, 이 상태의 분산액에서는, 전술과 같이 바인더가 되는 완충제가 들어가 있지 않아, 완충제에 의한 효과를 얻을 수 없을 뿐 아니라, 효소를 사용하는 것을 고려하면, pH2 등의 강산성에서는, 효소가 실활(失活)될 우려가 있다. 그래서, 한층 더 검토함으로써, 본 발명자들은, 강산성 부근에서 투명화되어 있는 분산액에, 양성 계면활성제와 같은 계면활성제를 첨가한 후, 카르복시기를 가지는 완충제를 첨가하여, 메디에이터나 효소의 각 성분에 지장을 초래하지 않는 pH(예를 들어, pH4.5 부근)로 설정함으로써, 침전의 발생을 충분히 방지하여, 메디에이터나 효소를 충분히 안정된 상태로 사용할 수 있음을 발견한 것이다.
상기 분산액의 pH는, 처음에 1∼3의 강산성으로 하는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 1.5∼2이다. 사용하는 산으로는, 특별히 제한되지 않지만, 예를 들어, 염산, 인산, 아세트산 등이다. 강산성 하에서의 상기 분산액의 교반 조건은, 특별히 제한되지 않지만, 교반 시간이, 예를 들어, 12∼72시간이고, 바람직하게는 18∼48시간이며, 특히 바람직하게는 24∼30시간이다. 또한, 카르복시기를 가지는 완충제의 첨가에 의해서, 상기 분산액의 pH는, 3∼6으로 설정하는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 4∼5이고, 특히 바람직하게는 4.5∼4.8이다.
산성 부근에서의 사용이 바람직한 메디에이터로는, 예를 들어, 루테늄 착체, 오스뮴 착체, 페로신, 페나진 메토설페이트(phenazine methosulfate), 인도페놀, 메틸렌블루 등을 들 수 있다.
상기 용매에, 층 형상 무기 화합물, 계면활성제 및 완충제를 첨가한 후에는, 일시 정치해두는 것이 바람직하고, 정치 시간은, 예를 들어, 24시간 이상이 바람직하며, 보다 바람직하게는 3일 이상이다.
이 분산액을 검출부(15)에 주입하는 비율은, 예를 들어, 검출부(15)의 크기, 분산액에서의 상기 층 형상 무기 화합물 등의 함량, 상기 층 형상 무기 화합물의 종류 등에 따라서 적절히 결정할 수 있다. 구체적으로는, 검출부(15)의 면적당(㎠), 예를 들어, 상기 층 형상 무기 화합물 0.003∼30㎎의 범위가 되도록 상기 분산액을 주입하는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 0.1∼10㎎의 범위이며, 특히 바람직하게는 0.3∼3㎎의 범위이다. 따라서, 분산액의 층 형상 무기 화합물의 농도가, 0.3중량%인 경우, 검출부의 면적당(㎠), 예를 들어, 0.001∼10mL의 범위를 주입하는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 O.03∼3.3mL의 범위이며, 특히 바람직하게는 O.1∼1mL의 범위이다.
또한, 상기 분산액을 검출부(15)에 주입하는 방법은, 특별히 제한되지 않지만, 예를 들어, 자동 구동식 분주기(分注機) 등을 이용하여 행할 수 있다.
주입한 상기 분산액을 건조하는 수단은, 특별히 제한되지 않지만, 예를 들어, 자연 건조, 풍건(風乾), 감압 건조, 동결 감압 건조 등의 방법을 채용할 수 있다. 또한, 이들 수단을 조합하여도 된다. 그 처리 온도는, 10∼60℃에서의 범위가 바람직하고, 보다 바람직하게는 25∼50℃의 범위이고, 특히 바람직하게는 30∼40℃의 범위이다. 또한, 상대 습도(RH)는, 5∼40%의 범위가 바람직하고, 보다 바 람직하게는 10∼20%의 범위이며, 특히 바람직하게는 10∼15%의 범위이다. 또, 처리 시간은, 예를 들어, 건조 수단에 따라서 적절히 결정할 수 있지만, 1∼60분의 범위가 바람직하고, 보다 바람직하게는 5∼30분의 범위이며, 특히 바람직하게는 5∼10분의 범위이다.
또한, 도 1(D)에 도시하는 바와 같이, 상기 무기겔층(16)의 위에, 효소시약층(17)을 형성한다. 이 효소 시약층(17)은, 상기 산화 환원 효소를 함유하는 효소액을 조제하여, 이것을 상기 무기겔층(16) 상에 주입하고, 건조함으로써 형성할 수 있다. 또한, 상기 산화 환원 효소로는, 예를 들어, 전술과 같은 것을 사용할 수 있다.
상기 효소액은, 예를 들어, 효소를 용매에 충분히 용해시켜 조제할 수 있다. 상기 용매로는, 특별히 제한되지 않지만, 예를 들어, 물, 완충액, 에탄올, 메탄올, 부탄올, 디메틸술폭시드(DMSO) 및 테트라히드로푸란 등의 유기 용제 등을 사용할 수 있다. 상기 완충액으로는, 예를 들어, 인산 완충액, 구연산 완충액, 아세트산 완충액, 트리스염산 완충액, 굿 완충액(Good's buffer) 등을 들 수 있고, 그 pH는, 효소의 종류에 따라서 적절히 결정할 수 있지만, 예를 들어, 5∼10의 범위가 바람직하고, 보다 바람직하게는 6∼9의 범위, 특히 바람직하게는 7∼8의 범위이다. 또한, 물로는, 예를 들어, 정제물, 증류수, 초순수 등을 들 수 있고, 그 중에서도 불순물이 극히 적어 고정밀도의 바이오 센서가 제작 가능하다는 점 때문에 초순수가 바람직하다.
상기 효소액 중의 시약의 농도는, 특별히 제한되지 않지만, 예를 들어, 1∼ 10KU/mL의 범위가 바람직하고, 보다 바람직하게는 3∼6KU/mL의 범위이다.
또한, 상기 효소액은, 계면활성제를 더 포함하는 것이 바람직하고, 특히 양성 계면활성제를 포함하는 것이 바람직하다. 상기 양성 계면활성제로는, 예를 들어, 전술과 같은 것을 사용할 수 있다.
이 효소액은, 산화 환원 효소 외에, 예를 들어, 산화 환원 효소의 기질이 되지 않는 당류나, 아미노산 및 그 유도체, 이미다졸 등의 아민화합물, 베타인 등을 포함하여도 된다. 상기 당류로는, 예를 들어, 수크로오스(sucrose), 라피노오스(raffinose), 락티톨(lactitol), 리비톨(ribitol), 아라비톨(arabitol) 등을 들 수 있다. 이들 중에서도, 상기 당류는, 예를 들어, 효소의 안정성 향상에, 상기 아미노산, 그 유도체 및 베타인은, 예를 들어, 시약의 건조에 의한 고화의 방지, 이미다졸은, 예를 들어, 메디에이터의 안정화 등의 목적으로 첨가할 수 있다.
상기 효소액의 주입량은, 형성하는 효소 시약층(17)의 크기, 시약의 농도, 시료의 양, 측정 대상물의 종류 등에 따라 적절히 결정할 수 있다.
주입한 상기 효소액의 건조 수단은, 특별히 제한되지 않지만, 예를 들어, 자연 건조, 풍건, 감압 건조, 동결 감압 건조 등의 방법을 채용할 수 있고, 이들 수단을 조합하여도 된다. 건조 조건으로는, 예를 들어, 온도 10∼60℃의 범위, 상대 습도 RH5∼40%의 범위, 시간 1∼60분의 범위이다. 또한, 시약으로서 효소를 사용하는 경우에는, 효소의 종류에 따라서, 실활하지 않도록 적절히 온도를 설정하면 된다.
다음으로, 도 1(E)에 도시하는 바와 같이, 절연층(14) 상에 스페이서(18)를 배치한다. 도시와 같이, 스페이서(18)는, 상기 효소 시약층(17)에 대응하는 개소가 개구부로 되어있다.
상기 스페이서(18)의 재료로는, 예를 들어, 수지제 필름이나 테이프 등을 사용할 수 있다. 또한, 양면 테이프라면, 상기 절연막(14)과의 접착 뿐만 아니라, 후술하는 커버(19)도 용이하게 접착할 수 있다. 그 밖에도, 예를 들어, 레지스트 인쇄 등의 수단에 의해 스페이서를 형성하여도 된다.
다음으로, 도 1(F)에 도시하는 바와 같이, 상기 스페이서(17) 상에 커버(19)를 배치한다. 상기 커버(19)의 재료로는, 특별히 제한되지 않지만, 예를 들어, 각종 플라스틱 등을 사용할 수 있고, 바람직하게는, PET 등의 투명 수지를 들 수 있다.
이와 같이 하여 제작한 바이오 센서(1)는, 장기간 보존하는 경우, 습기의 영향을 막기 위해서, 예를 들어, 분자체(molecular sieve), 실리카겔, 산화칼슘 등의 건조제와 함께 밀봉 보존하는 것이 바람직하다.
이 바이오 센서(1)는, 예를 들어, 어떤 일정한 시간에 소정의 전압을 가하는 수단, 상기 바이오 센서로부터 전달되는 전기 신호를 측정하는 수단, 상기 전기 신호를 측정 대상물 농도로 연산하는 연산 수단 등의 다양한 수단을 구비한 측정 기기와 조합하여 사용할 수 있다.
이 바이오 센서(1)의 사용 방법에 관해서, 시료가 전혈(全血), 측정 대상물이 글루코오스, 산화 환원 효소가 GDH, 메디에이터가 페리시안화칼륨인 예를 들어 설명한다.
우선, 전혈 시료를 바이오 센서(1)의 개구부(21)의 일단에 접촉시킨다. 이 개구부(21)는, 전술과 같이 모세관 구조로 되어 있고, 그 타단에 대응하는 커버(19)에는 공기 구멍(20)이 형성되기 때문에, 모관 현상에 의해서 상기 시료가 내부에 흡인된다. 흡인된 상기 시료는, 검출부(15) 상에 설치된 효소 시약층(17)에 침투하여, 효소 시약층(17) 중의 GDH를 용해하고, 또한 효소 시약층(17)의 하층인 무기겔층(16) 표면에 도달한다. 그리고, 표면에 도달한 시료 중의 글루코오스와, GDH와, 무기겔층(16) 중의 페리시안화칼륨이 반응한다. 구체적으로는, 측정 대상물인 글루코오스는 GDH에 의해 산화되고, 그 산화 반응에 의해 이동한 전자에 의해서, 페리시안화칼륨이 환원되어, 페로시안화 칼륨(potassium ferrocyanide)(페로시안 이온)이 생성된다.
이 때, 시료는 효소 시약층(17)을 통과하여 무기겔층(16)에 도달하지만, 무기겔층(16)을 통과하여 전극 표면에 도달하는 일은 없다. 이 때문에, 환원된 페로시안화 칼륨이 시료 중의 용존 산소에 의해서 재산화하는 것을 방지할 수 있다고 생각되며, 이에 의해서 측정 정밀도의 저하가 억제된다. 또, 전극 표면에 수분이 도달하지 않는 것은, 전자현미경에 의해서 확인되어 있다. 또한, 상기 시료 중에 포함되는 적혈구 등의 불순물도, 층 형상 무기 화합물의 사이를 통과할 수 없기 때문에, 이 무기겔층(16)을 통과하지 않고서, 전극(12, 13) 표면에 흡착하는 것도 방지된다.
그리고, 무기겔층(16) 중에서 환원된 페로시안화 칼륨과, 무기겔층(16)의 아래에 위치하는 전극과의 사이에서, 전자 수수가 행하여지고, 이것에 의해서 글루코 오스 농도를 측정할 수 있는 것이다. 구체적으로는 이하와 같이 행할 수 있다.
전혈 시료의 공급으로부터 일정 시간 경과 후, 상기 전압을 가하는 수단에 의해 대극(13)과 작용극(12)과의 사이에 전압을 인가하여, 전극과 접촉하고 있는 상기 환원형의 페로시안화 칼륨(페로시안 이온)을 전기 화학적으로 페리시안화 칼륨으로 산화하고, 그때의 산화 전류를, 작용극(12)의 리드부(12a)를 통해 상기 전기 신호를 측정하는 수단 등에 의해서 검출한다. 이 산화 전류의 값은, 시료 중의 글루코오스 농도에 비례하기 때문에, 이를 상기 연산 수단에 의해 글루코오스 농도로 연산하면, 시료 중의 글루코오스 농도를 구할 수 있다.
이러한 바이오 센서에 의하면, 전술과 같이 용존 산소 등의 영향에 의한, 환원형 메디에이터의 재산화가 방지되어, 측정의 정밀도나 재현성을 향상시킬 수 있다.
본 실시형태에서는, 본 발명의 바이오 센서를 글루코오스 측정에 적용하는 예를 나타내었으나, 이것에는 제한되지 않고, 예를 들어, 측정 대상물에 따라서 시약을 적절히 결정하여, 각종 측정 대상에 관한 바이오 센서로 할 수 있다. 구체적으로는, 예를 들어, 젖산 측정용 바이오 센서의 경우에는 락테이트 옥시다아제(lactate oxidase), 알코올 측정용 바이오 센서의 경우에는 알코올 옥시다아제, 콜레스테롤 측정용 센서의 경우에는 콜레스테롤 옥시다아제 등을 사용할 수 있다. 또한, 글루코오스 측정용 바이오 센서의 경우, 예를 들어, 피라노오즈 옥시다아제나 글루코오스 옥시다아제 등도 시약으로서 사용할 수 있다.
또한, 상기 무기겔층과 효소시약층을 적층하는 대신에, 전술한 층 형상 무기 화합물 등을 분산한 분산액에, 산화 환원 효소를 더 첨가하여, 검출부(15)에, 효소 시약층과 무기겔층을 겸하는 단층을 형성하여도 된다. 이 경우, 상기 분산액에서의 산화 환원 효소량 등은 특별히 제한되지 않고, 예를 들어, 전술과 같은 첨가량을 참고로 할 수 있다.
실시예 1
이하에 나타내는 바와 같이, 상기 도 1(F)와 같은 구조의 글루코오스 센서를 제작하였다.
우선, 글루코오스 센서의 절연 기판(11)으로서, PET제 기판(길이 50㎜, 폭 6㎜, 두께 250㎛)을 준비하고, 그 한쪽의 표면에, 스크린 인쇄에 의해, 리드부를 각각 가지는 작용극(12) 및 대극(13)으로 이루어지는 카본 전극계를 형성하였다.
다음에, 이하에 나타내는 바와 같이 하여 상기 전극 상에 절연층(14)을 형성하였다. 우선, 절연성 수지 폴리에스테르를, 농도 75중량%가 되도록 용매 카르비톨 아세테이트에 용해시켜 절연성 페이스트를 조제하고, 이것을 상기 전극 상에 스크린 인쇄하였다. 인쇄 조건은, 300메시(mesh) 스크린, 스퀴지압 40㎏이고, 인쇄하는 양은, 전극 면적 1㎠당 0.002mL로 하였다. 또, 검출부(15) 상과, 리드부(12a, 13a) 상에는, 스크린 인쇄를 행하지 않았다. 그리고, 90℃에서 60분간 가열 처리함으로써 절연층(14)을 형성하였다.
계속해서, 상기 절연층(14)을 형성하지 않는 상기 검출부(15)에, 이하에 도시하도록 하여 무기겔층(16)을 형성하였다. 우선, 합성 스멕타이트인 상품명 「루센타이트SWN」(코프 케미칼(주)제) 0.6g을 정제수 100mL에 현탁하고, 약 8∼24시간 교반하였다. 이 합성 스멕타이트 현탁액의 pH는, 약 10이었다. 이 합성 스멕타이트 현탁액 10mL에, 10%(w/v) CHAPS(도진카가쿠겐큐쇼제) 수용액 0.1mL, 1.0M ACES 완충액(pH7.4:도진카가쿠겐큐쇼제) 5.0mL 및 정제수 4.0mL를 이 순서로 첨가하고, 메디에이터로서 [Ru(NH3)6]Cl3(아루도리치샤제) 1.0g을 혼합하였다. 이 혼합액을 무기겔층 형성액으로 한다(pH7.5). 또, 이 무기겔 형성액에서의 조성물의 최종 농도를 이하에 나타낸다.
루센타이트SWN 0.3%(w/v)
CHAPS 0.3%(w/v)
ACES 완충액(pH7.5) 100mM
[Ru(NH3)6]Cl3 5.0%(w/v)
이 무기겔 형성액 1.0μL를, 검출부(15)에 나누어 주입하였다. 또, 검출부(15)의 표면적은 약 O.1㎠이고, 상기 검출부(15)에서의 전극(12, 13)의 표면적은 약 O.12㎠이었다. 그리고, 이것을, 30℃, 상대 습도 10%의 조건 하에서 10분간 건조시켜, 무기겔층(16)을 형성하였다.
또한, 상기 무기겔층(16)의 위에, 효소 시약층(17)을 형성하였다. 이것은, 5000U/mL GDH 수용액 1.0μL를, 검출부(15)의 상기 무기겔층(16)의 위에 나누어 주입하고, 30℃, 상대 습도 10%의 조건하에서 10분간 건조시켜 형성하였다.
마지막으로, 개구부를 가지는 스페이서(18)를 절연층(14) 상에 배치하고, 또한, 상기 스페이서(18) 상에 공기 구멍이 되는 관통 구멍(20)을 가지는 커버(19)를 배치하여 바이오 센서(1)를 제작하였다. 상기 커버(19)와 절연층(14)에 끼워진 스페이서(18)의 개구부의 공간이, 모세관 구조가 되기 때문에, 이것을 시료 공급부(21)로 하였다.
또, 비교예 1로는, 무기겔층 형성액의 조제에서, 상기 합성스멕타이트현탁액의 대신에 정제수를 이용한 것 이외에는, 실시예 1과 동일하게 하여 글루코오스 센서를 제작하였다.
실시예 2
상기 실시예 1에서 제작한 글루코오스 센서를 이용하여, 글루코오스 농도에 따른 응답 전류의 경시 변화를 측정한 예이다.
액체 시료로는, 인간 전혈을 이용하였다. 우선, 채혈 후의 전혈을 37℃에서 약 1일 방치하여, 글루코오스 농도 0㎎/100mL로 조정하였다. 다음에, 이것에 글루코오스를 첨가하여, 각종 글루코오스 농도(약 200, 400, 600㎎/100mL)의 시료를 조제하였다. 또, 글루코오스 무첨가의 전혈을 글루코오스 농도 0㎎/100mL로 하였다. 그리고, 실시예 2로서, 상기 글루코오스 센서(1)에 200㎷의 전압을 가한 후에, 시료를 시료 공급부(21)에 점착(点着)하고, 그 점착 5초 후의 응답 전류의 타임 코스를 측정하였다. 비교예 2로서, 비교예 1의 글루코오스 센서에 대해서도 동일하게 하여 측정을 행하였다. 또한, 실시예 및 비교예 모두, 총 3회씩 측정을 행하였다(n=3). 이들 결과를 도 3(A), (B)에 도시한다. 도 3은, 글루코오스 센서로 시료를 측정한 경우의 전류값의 경시 변화를 도시하는 그래프로서, 동 도(A)가 실시예 2, 동 도(B)가 비교예 2의 결과를 각각 나타낸다.
동 도(A)에 도시하는 바와 같이, 실시예 1의 글루코오스 센서에 의하면, 동 도(B)에 도시하는 비교예 1의 글루코오스 센서보다도 응답 전류값의 피크가 더 빠른 시간에 나타나고, 또한 피크 전류값도 높은 값이 얻어졌다. 이와 같이 높은 피크 전류값이 얻어지는 것은, 실시예 1의 글루코오스 센서에 의하면, 무기겔층에서 산소가 차단되기 때문에, 글루코오스와 GDH와의 반응에 의해서 환원된 메디에이터가, 산소에 의해서 재산화되지 않고, 전기 화학적으로 산화되어, 그 산화 전류를 측정할 수 있었기 때문이라고 생각된다. 또한, 전류값의 피크가 빠른 시간에 나타난 것은, 전극상의 무기겔층 중에서, 스멕타이트의 시트 내에 메디에이터인 [Ru(NH3)6]Cl3이 들어가 강고하게 고정화되어 있기 때문에, 전극 표면에 스멕타이트를 통해 메디에이터가 느슨히 고정화된 상태가 되어, 전극 근방의 메디에이터 농도가 커져, 반응 속도가 증대한 것으로 생각된다.
실시예 3
본 발명의 글루코오스 센서를 이용하여, 시료의 점착으로부터 일정 시간 경과 후의 응답 전류값의 재현성을 확인한 예이다.
인간 전혈에 글루코오스를 첨가하고, 글루코오스 농도 0, 103, 415, 616, 824㎎/100mL의 시료를 각각 조제하였다.
실시예 3으로서, 상기 무기겔층 형성액에서의 스멕타이트 농도(루센타이트SWN)를 0.24%(w/v)로 한 것 이외에는, 상기 실시예 1과 동일하게 하여 글루코오스 센서를 제작하였다. 상기 글루코오스 센서의 전극 간에 200㎷의 전압을 가한 후 에, 시료를 점착하고, 점착 5초 후의 응답 전류값을 측정하였다. 상기 측정은, 같은 글루코오스를 이용하여, 각 시료에 관해서, 각각 총 10회(n=10) 행하였다. 또한, 비교예 3으로서, 상기 비교예 1의 글루코오스 센서를 이용하여, 상기 실시예 3과 동일하게 하여 측정을 행하였다(n=10).
측정한 실시예 3 및 비교예 3의 응답 전류값(n=10)으로부터, 측정의 재현성을 나타내는 CV값을 구하였다. 이들 결과를 하기 표 2에 나타낸다.
[표 2]
Figure 112006028041870-pct00002
상기 표 2의 결과로부터, 비교예 3은, 특히 시료 중의 글루코오스 농도를 824㎎/100mL로 증가시킴으로써, CV값이 7.30으로 대폭 변화한 데 대하여, 실시예 3에 의하면, CV값은 2.34∼3.02의 사이에서 안정되어 있어, 상기 글루코오스 농도의 증가에 관계없이, 재현성 높게 측정할 수 있음을 알 수 있다. 이 결과로부터, 실시예의 글루코오스 센서에 의하면, 스멕타이트를 포함하지 않는 비교예의 바이오 센서보다도 높은 재현성으로 측정할 수 있다고 할 수 있다.
실시예 4
상기 실시예 3에서 제작한 글루코오스 센서에 관해서, 일정 습도 및 온도에 폭로(暴露)하는 것에 의한 영향을 확인한 예이다.
상기 글루코오스 센서를, 상대 습도 80%, 온도 40℃로 유지한 실내에 17시간 방치하여 폭로한 후, 전극 사이에 200㎷의 전압을 가하였다. 그리고, 글루코오스 농도 0, 600㎎/100mL가 되도록 글루코오스를 첨가한 인간 전혈 시료를 점착하고, 점착 5초 후의 응답 전류값을 측정하였다. 이것을 실시예 4로 한다. 또한, 비교예 4로서, 상기 비교예 1의 글루코오스 센서에 관해서도 동일하게 하여 측정을 하였다. 또, 실시예 4 및 비교예 4의 컨트롤로서, 각각 상기 글루코오스 센서를 이용하여, 상기 통상 실온 습도(약 25℃, 약 60%Rh) 조건 하에서, 상기 시료에 관한 응답 전류값을 측정하였다. 그리고, 컨트롤의 전류값을 100%로 한 경우의, 상기 실시예 4 및 비교예 4의 감도(%)를 구하였다. 이하의 표 3에 결과를 나타낸다.
[표 3]
Figure 112006028041870-pct00003
상기 표 3에 도시하는 바와 같이, 실시예 3의 글루코오스 센서에 의하면, 고습도 조건에 폭로하여도, 비교예 1의 글루코오스 센서에 비하여 폭로 후의 감도 저하가 작음을 알 수 있다. 즉, 실시예 3의 글루코오스 센서는, 전술과 같이, 무기겔층에 의해서, 예를 들어, 공기 중의 수분이나 시료 중의 용존 산소가 차단되어, 메디에이터가 산소와 접하는 것을 방지할 수 있기 때문에, 습도에 대한 내성을 지니고 있다고 할 수 있다.
실시예 5
본 발명의 글루코오스 센서에 관해서, 시료 중의 용존 산소에 의한 영향을 확인한 예이다.
인간 전혈에 글루코오스를 첨가하고, 글루코오스 농도를 111㎎/100mL가 되도록 시료를 조제하고, 또한 용존 산소가 25.1㎜Hg 부근(미조정), 92.0㎜Hg 부근, 및 171.6㎜Hg 부근이 되도록 각각 조절하였다. 용존 산소 농도는, 용존 산소 미조정(25.1㎜Hg)의 상기 시료를, 시험관 내에서 산소와 혼화함으로써, 고농도(92.0㎜Hg, 171.6㎜Hg)로 조정하였다.
실시예 5로서, 상기 무기겔층 형성액에서의 스멕타이트 농도(루센타이트SWN)를, 0.12%, 0.24%, 0.36%, 0.48%(w/v)로 한 것 이외에는, 상기 실시예 1과 동일하게 하여 4종류의 글루코오스 센서를 제작하였다. 그리고, 상기 글루코오스 센서의 전극 사이에 200㎷의 전압을 인가한 후에, 상기 시료를 점착하여, 점착 5초 후의 응답 전류값을 측정하였다. 이들 각 글루코오스 센서에 관해서, 용존 산소 미조정(25.1㎜Hg)의 시료에 대한 상기 응답 전류값을 기준으로 하여, 하기 식(10)으로부터, 각 시료(용존 산소 92.0㎜Hg, 171.6㎜Hg)의 응답 전류값의 변화율(%)을 구하였다. 또한, 비교예 5로서, 상기 비교예 1의 글루코오스 센서에 관해서도 동일하게 하여 측정을 행하여, 변화율(%)을 구하였다. 이들 결과를 도 4에 나타낸다. 도 4는, 시료 중에서의 용존 산소 농도와 변화율(%)과의 관계를 도시하는 그래프이고, 도면에서 △, ○, □, ▽는 각각 실시예 5이고, ●는 비교예 5이다. 또, 변화율(%)은, 절대값이 클수록, 응답 전류가 변화한 것이 된다.
변화율(%)=[(A/B)-1]×100 …(10)
A : 용존 산소 조정 시료의 응답 전류
B : 용존 산소 미조정 시료의 응답 전류
도 4에 도시하는 바와 같이, 실시예 5에 의하면, 시료의 용존 산소를 증가시키더라도, 비교예 5에 비하여, 변화율(%)의 절대값은 작았다. 이로부터, 스멕타이트를 포함하는 실시예의 글루코오스 센서에 의하면, 용존 산소에 의한 감도 저하가 작아, 시료 등의 용액 중의 용존 산소의 영향을 경감할 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 6
산화 환원 효소로서 GOD를 이용한 본 발명의 글루코오스 센서에 관해서, 시료 중의 용존 산소에 의한 영향을 확인한 예이다.
무기겔층 형성액으로서, 이하의 최종 농도가 되도록 조제한 분산액을 사용하고 효소 용액으로서, GDH 수용액 대신에 1200U/mL의 GOD 용액(아마노사제)를 사용하고, [Ru(NH3)6]Cl3의 대신에 페리시안화칼륨(와코쥰야쿠고교샤제)를, ACES 완충액 대신에 Tris-HCl완충액(pH7.4: 도진가가쿠고교샤제)를 사용한 것 이외에는, 상기 실시예 1과 동일하게 하여 글루코오스 센서를 제작하였다.
루센타이트SWN 0.3%(w/v)
CHAPS 0.1%(w/v)
Tris-HCl완충액 100mM
페리시안화칼륨 3.0%(w/v)
또, 비교예 6에서는, 무기겔층 및 효소시약층을 형성하는 대신에, GOD120OU/mL 및 페리시안화칼륨 3.0%(w/v)을 포함하는 용액 1μL을 검출부에 주입하고, 건조하는 것 이외에는, 상기 실시예 6과 동일하게 하여 바이오 센서를 제작 하였다.
인간전혈에 글루코오스를 첨가하여, 글루코오스 농도를 600㎎/100OmL이 되도록 시료를 조제하고, 또한 용존 산소가 48.9㎜Hg(미조정), 106.4㎜Hg, 및 180.4㎜Hg이 되도록 각각 조절하였다. 용존 산소 농도는, 상기 실시예 5와 마찬가지로, 용존 산소 미조정의 상기 시료를, 시험관 내에서 산소와 혼화함으로써, 고농도로 조정하였다.
인간 전혈에 글루코오스를 첨가하여, 글루코오스 농도 600㎎/100mL의 시료를 조제하였다. 그리고, 상기 글루코오스 센서의 전극 사이에 500㎷의 전압을 인가하고, 시료 점착 5초 후의 응답 전류값을 측정하였다. 비교예 6의 글루코오스 센서에 관해서도 동일하게 하여 측정을 행하였다. 그리고, 실시예 6 및 비교예 6에 관해서, 상기 실시예5와 같이, 용존 산소 미조정(48.9㎜Hg)의 시료에 대한 상기 응답 전류값을 기준으로 하여, 상기 식(10)로부터, 각 시료(용존 산소 106.4㎜Hg, 180.4㎜Hg)에 대한 응답 전류값의 변화율(%)을 구하였다. 이들 결과를 도 5에 나타낸다. 도 5는, 시료 중에서의 용존 산소 농도와 변화율(%)과의 관계를 도시하는 그래프이고, 동 도면에서 ○이 실시예 6, ●이 비교예 6의 결과이다.
도 5에 도시하는 바와 같이, 산화 환원 효소로서 GOD를 이용한 실시예 6에 의해서도, 비교예 6에 비하여, 시료 중의 용존 산소에 의한 감도 저하가 작고, 용존 산소의 영향을 경감할 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 7
실시예 7은, 계면활성제로서 CHAPS(양성 계면활성제)를, 아민계 완충제로서 ACES 완충액을 각각 이용한 실시예 1에서 제작한 글루코오스 센서를 사용하였다. 한편, 비교예 7에서는, 계면활성제로서 CHAPS 대신에 담즙산(cholic acid)(아니온계 계면활성제)을 사용하고, 완충제로서 ACES 대신에 인산나트륨을 사용한 것 이외에는, 상기 실시예 1과 동일하게 하여 글루코오스 센서를 제작하여, 이것을 이용하였다.
인간전혈에 글루코오스를 첨가하여, 글루코오스 농도 100㎎/100mL의 시료를 조제하고, 또한 용존 산소가 34.7㎜Hg(미조정), 117.1㎜Hg, 및 185.3㎜Hg 부근이 되도록 각각 조절하였다. 용존 산소 농도는, 상기 실시예 5와 마찬가지로, 용존 산소 미조정의 상기 시료를, 시험관내에서 산소와 혼화함으로써, 고농도로 조정하였다.
그리고, 글루코오스 센서의 전극 사이에 200㎷의 전압을 가한 후에, 상기 시료를 점착하고, 점착 5초 후의 응답 전류값을 측정하였다. 이들 각 글루코오스 센서에 있어서, 용존 산소 미조정의 시료에 대한 상기 응답 전류값을 기준으로 하여, 상기 식(10)으로부터, 다른 시료에 대한 응답 전류값의 변화율(%)을 구하였다. 또한, 비교예 7도, 상기 글루코오스 센서를 이용하여 동일하게 하여 측정을 행하고, 변화율(%)을 구하였다. 이들 결과를 도 6에 도시한다. 도 6은, 시료 중에서의 용존 산소 농도와 변화율(%)과의 관계를 도시하는 그래프이고, 동 도면에서 ○가 실시예 7, ●가 비교예 7의 결과이다.
도 6에 도시하는 바와 같이, 양성 계면활성제가 아니라 아니온성 계면활성제를 이용하고, 완충제로서 아민계 완충제가 아니라 인산나트륨을 이용한 비교예 7의 글루코오스 센서에서는, 스멕타이트를 함유하고 있음에도 불구하고, 실시예 7과 비교하여, 용존 산소의 영향을 크게 받고 있음을 알 수 있다. 이로부터, 실시예와 같이, 양성 계면활성제 및 아민계 완충제의 존재 하에서, 스멕타이트를 포함하는 무기겔층을 형성함으로써, 시료 중의 산소에 의한 영향을 방지할 수 있음을 알 수 있다 또한, 비교예와 같이 아니온성 계면활성제를 이용한 경우, 분산액을 전극 상에 싣기 어려워, 제작 자체가 곤란하였다.
실시예 8
이하에 도시하는 방법에 의해, 무기겔 형성액을 조제한 것 이외에는, 상기 실시예 1과 동일하게 하여 바이오 센서를 제작하였다.
합성스멕타이트(상품명 루센타이트SWN, 코프케미칼사제) 0.6g, 10%(w/v) CHAPS(도진카가쿠겐큐쇼제)수용액 1g 및 정제수 98.4g을 혼합하여 (합계 100g), 이 스멕타이트 현탁액을 하룻밤 교반하였다. 교반 후의 현탁액 40g에, 2N의 HCl(4g)를 첨가하여 하룻밤(약 24시간) 교반하였다(교반기: 상품명 마그네틱 스터러(stirrers)HS-3E:가부시키가이샤 이우찌하네이도제). HCl의 첨가에 의해서, 상기 현탁액은 백탁하였지만, 하룻밤 교반한 후, 투명해졌다. 또한, 이 현탁액에, 200mM 숙신산-아세트산Na 완충액(pH4.5)을, 1:1이 되도록 혼합하였다. 이 완충액을 혼합한 후의 현탁액은, 그 pH가 약 4.5이었다. 상기 완충제를 가한 현탁액에, 메디에이터로서 [Ru(NH3)6]Cl3(알드릿치샤제)를 5%(w/v)가 되도록 더 첨가하여, 이것을 무기겔층 형성액으로 하였다. 또, 이 무기겔 형성액에서의 조성물의 최종 농도 를 이하에 나타낸다.
루센타이트SWN 0.3%(w/v)
CHAPS 0.3%(w/v)
숙신산-아세트산Na 완충액 100mM
[Ru(NH3)6]Cl3 5.0%(w/v)
이상과 같이, 본 발명의 바이오 센서의 제조 방법에 의하면, 예를 들어, 시료 중의 측정 대상물을 간접적으로 측정하기 위한 환원형 메디에이터가, 측정 분위기 중의 산소나 시료 중의 용존 산소 등에 의해서 재산화되는 것을 방지할 수 있기 때문에, 상기 환원형 메다에이터의 재산화에 의한 측정 오차가 해소되어, 측정 정밀도가 우수한 바이오 센서를 제공할 수 있다.

Claims (31)

  1. 바이오 센서의 제조 방법으로서,
    전극을 가지는 기판을 준비하고, 상기 전극 표면에, 메디에이터와 계면활성제와 완충제와 층 형상 무기 화합물을 함유하는 무기겔층을 형성하는 공정을 포함하고, 상기 계면활성제가 양성(兩性) 계면활성제인, 바이오 센서의 제조 방법.
  2. 삭제
  3. 청구항 1에 있어서,
    상기 양성 계면활성제가, 동일 분자 내에 양전하와 음전하를 가지는 계면활성제인 제조 방법.
  4. 청구항 3에 있어서,
    상기 양성 계면활성제가, 알킬아미노카르복시산염, 카르복시베타인, 술포베타인 또는 포스포베타인으로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 계면활성제인 제조 방법.
  5. 청구항 1에 있어서,
    상기 양성 계면활성제가, 동일 분자 내에 양전하와 음전하를 가지고, 또한, 상기 양전하와 음전하가 이간(離間)하고 있는 계면활성제인 제조 방법.
  6. 청구항 5에 있어서,
    상기 양성 계면활성제가, 카르복시베타인, 술포베타인 또는 포스포베타인으로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 계면활성제인 제조 방법.
  7. 청구항 1에 있어서,
    상기 양성 계면활성제가, 알킬디메틸아미노아세트산베타인인 제조 방법.
  8. 청구항 1에 있어서,
    상기 양성 계면활성제가, CHAPS (3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate), CHAPSO (3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-2-hydroxy-1-propanesulfonate) 또는 알킬히드록시술포베타인으로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 술포베타인인 제조 방법.
  9. 청구항 1에 있어서,
    상기 완충제가 아민계 완충제인 제조 방법.
  10. 청구항 9에 있어서,
    상기 아민계 완충제가, Tris (Tris(hydroxymethyl)aminomethane), ACES (N-(2-Acetamido)-2-aminoethanesulfonic acid), CHES (N-Cyclohexyl-2-aminoethanesulfonic acid), CAPSO (N-Cyclohexyl-2-hydroxy-3-aminopropanesulfonic acid), TAPS (N-Tris(hydroxymethyl)methyl-3-aminopropanesulfonic acid), CAPS (N-Cyclohexyl-3-aminopropanesulfonic acid), Bis-Tris (Bis(2-hydroxyethyl)iminotris(hydroxymethyl)methane), TAPSO (2-Hydroxy-N-tris(hydroxymethyl)methyl-3-aminopropanesulfonic acid), TES (N-Tris(hydroxymethyl)methyl-2-aminoethanesulfonic acid), Tricine (N-[Tris(hydroxymethyl)methyl]glycine) 또는 ADA (N-(2-Acetamido)iminodiacetic acid)로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 물질인 제조 방법.
  11. 청구항 1에 있어서,
    상기 완충제가 카르복시기를 가지는 완충제인 제조 방법.
  12. 청구항 11에 있어서,
    상기 카르복시기를 가지는 완충제가, 아세트산-아세트산Na 완충제, 말산-아세트산Na 완충제, 말론산-아세트산Na 완충제, 또는 숙신산-아세트산Na 완충제로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 완충제인 제조 방법.
  13. 청구항 1에 있어서,
    메디에이터와 계면활성제와 완충제와 층 형상 무기 화합물을 함유하는 분산액을 도포함으로써, 상기 무기겔층을 형성하는 제조 방법.
  14. 청구항 13에 있어서,
    계면활성제와 층 형상 무기 화합물을 분산매(分散媒)에 분산시킨 후, 완충제를 첨가하고, 메디에이터를 더 첨가함으로써 상기 분산액을 조제하는 제조 방법.
  15. 청구항 14에 있어서,
    층 형상 무기 화합물을 분산매에 분산시킨 후, 계면활성제를 첨가하고, 이어 서, 아민계 완충제를 첨가한 후에, 메디에이터를 더 첨가함으로써 상기 분산액을 조제하는 제조 방법.
  16. 청구항 15에 있어서,
    상기 메디에이터가, 페리시안화칼륨, 시토크롬C, PQQ (4,5-Dihydro-4,5-dioxo-1H-pyrrolo[2,3-f]quinoline-2,7,9-tricarboxylic acid), NAD+ (Nicotinamide adenine dinucleotide), NADP+ (Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate), 구리 착체, 또는 루테늄 착체로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 물질인 제조 방법.
  17. 청구항 15에 있어서,
    상기 아민계 완충제를 첨가한 후의 분산액의 pH가, 5∼9의 범위인 제조 방법.
  18. 청구항 14에 있어서,
    층 형상 무기 화합물을 분산매에 분산시켜, 강산성 조건 하에서 교반한 후, 계면활성제를 첨가하고, 이어서 카르복시기를 가지는 완충제를 첨가한 후에, 메디에이터를 더 첨가함으로써 상기 분산액을 조제하는 제조 방법.
  19. 청구항 18에 있어서,
    상기 메디에이터가, 루테늄 착체, 오스뮴 착체, 페로신, 페나진 메토설페이트, 인도페놀 또는 메틸렌블루로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 물질인 제조 방법.
  20. 청구항 18에 있어서,
    상기 강산성 조건이, pH1∼3의 범위인 제조 방법.
  21. 청구항 18에 있어서,
    카르복시기를 가지는 완충제를 첨가한 후의 분산액의 pH가, 3∼6의 범위인 제조 방법.
  22. 청구항 1에 있어서,
    상기 무기겔층이, 상기 메디에이터의 자연 산화를 방지하는 층인 제조 방법.
  23. 청구항 1에 있어서,
    상기 무기겔층 상에, 산화 환원 효소를 함유하는 층을 더 형성하는 제조 방법.
  24. 청구항 13에 있어서,
    상기 분산액에, 산화 환원 효소를 더 함유시켜, 상기 산화 환원 효소를 함유하는 무기겔층을 형성하는 제조 방법.
  25. 청구항 1에 있어서,
    상기 층 형상 무기 화합물이, 층 형상 점토 광물인 제조 방법.
  26. 청구항 25에 있어서,
    상기 층 형상 점토 광물이, 팽윤성 층 형상 점토 광물인 제조 방법.
  27. 청구항 13에 있어서,
    상기 분산액에서의 층 형상 무기 화합물과 계면활성제와의 첨가 비율이, 층 형상 무기 화합물 0.3g에 대하여, 계면활성제 0.1∼100m㏖의 범위인 제조 방법.
  28. 청구항 13에 있어서,
    상기 분산액에서의 층 형상 무기 화합물과 완충제와의 첨가 비율이, 층 형상 무기 화합물 0.3g에 대하여, 완충제 1∼1000mM의 범위인 제조 방법.
  29. 청구항 23 또는 24에 있어서,
    상기 산화 환원 효소가, 글루코오스 옥시다아제(GOD), 피라노오즈 옥시다아제, 글루코오스 디히드로게나아제(GDH), 젖산 옥시다아제, 젖산 디히드로게나아제, 과당 디히드로게나아제, 갈락토오스 옥시다아제, 콜레스테롤 옥시다아제, 콜레스테롤 디히드로게나아제, 알코올 옥시다아제, 알코올 디히드로게나아제, 피루빈산 옥시다아제, 글루코오스-6-인산 디히드로게나아제, 아미노산 디히드로게나아제, 포름산 디히드로게나아제, 글리세롤 디히드로게나아제, 아실-CoA 옥시다아제, 콜린 옥시다아제, 4-히드록시안식향산 히드록시라제, 말레산 디히드로게나아제, 사르코신 옥시다아제, 또는 유리카제로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 효소인 제조 방법.
  30. 청구항 1에 있어서, 상기 메디에이터가, 페리시안화칼륨, p-벤조퀴논 및 그 유도체, 인도페놀 유도체, β-나프토퀴논-4-술폰산칼륨, 페로신 유도체, 오스뮴 착체, 루테늄 착체, NAD+, NADP+, 피롤로퀴놀린퀴논(PQQ), 메틸렌블루, 시토크롬 c(cytochrome c), 시토크롬 b(cytochrome b) 또는 구리 착체로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 물질인 제조 방법.
  31. 청구항 1에 기재된 바이오 센서의 제조 방법에 의해 제조한 바이오 센서.
KR1020067007785A 2003-10-30 2004-10-29 바이오 센서 및 그 제조 방법 KR100814193B1 (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JPJP-P-2003-00371198 2003-10-30
JP2003371198 2003-10-30

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20060063996A KR20060063996A (ko) 2006-06-12
KR100814193B1 true KR100814193B1 (ko) 2008-03-17

Family

ID=34543937

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020067007785A KR100814193B1 (ko) 2003-10-30 2004-10-29 바이오 센서 및 그 제조 방법

Country Status (8)

Country Link
US (1) US20070034512A1 (ko)
EP (1) EP1679508B1 (ko)
JP (1) JP4088312B2 (ko)
KR (1) KR100814193B1 (ko)
CN (1) CN100456032C (ko)
AT (1) ATE475085T1 (ko)
DE (1) DE602004028267D1 (ko)
WO (1) WO2005043146A1 (ko)

Families Citing this family (52)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20020048425A (ko) * 1999-09-30 2002-06-22 해리 제이. 레온 하르트 마이크로전자 어레이 상의 생체분자 부착 부위
US6960298B2 (en) 2001-12-10 2005-11-01 Nanogen, Inc. Mesoporous permeation layers for use on active electronic matrix devices
JP2006349412A (ja) * 2005-06-14 2006-12-28 National Institute Of Advanced Industrial & Technology クレアチニンバイオセンサ
TW200718785A (en) * 2005-11-10 2007-05-16 Toyo Boseki A process for improving the thermal stability of a composition containing a soluble coenzyme conjugated glucose dehydrogenase (GDH)
WO2008007719A1 (fr) * 2006-07-12 2008-01-17 Arkray, Inc. Électrode à enzyme
US7816025B2 (en) * 2006-08-23 2010-10-19 Canon Kabushiki Kaisha Enzyme electrode, enzyme electrode producing method, sensor and fuel cell each using enzyme electrode
US7687103B2 (en) * 2006-08-31 2010-03-30 Gamida For Life B.V. Compositions and methods for preserving permeation layers for use on active electronic matrix devices
WO2008036516A1 (en) 2006-09-22 2008-03-27 Bayer Healthcare Llc Biosensor system having enhanced stability and hematocrit performance
KR100890988B1 (ko) * 2007-10-29 2009-03-31 주식회사 아이센스 일정 소량의 시료를 균일하게 도입할 수 있는 시료도입부를구비한 전기화학적 바이오센서
EP2222866A1 (en) 2007-12-10 2010-09-01 Bayer HealthCare LLC Reagents and methods for detecting analytes
JP5133756B2 (ja) * 2008-03-31 2013-01-30 シーシーアイ株式会社 バイオセンサ
JP5380888B2 (ja) * 2008-04-08 2014-01-08 東洋紡株式会社 グルコースの定量方法ならびに定量組成物
JP5204590B2 (ja) * 2008-08-28 2013-06-05 株式会社タニタ グルコースセンサおよびその製造方法
RU2546862C2 (ru) * 2008-12-08 2015-04-10 БАЙЕР ХЕЛТКЭА ЭлЭлСи Биосенсорная система и тестовые сенсоры для определения концентрации анализируемого вещества (варианты)
US20100273249A1 (en) * 2009-04-24 2010-10-28 Lifescan Scotland Limited Analytical test strips
US8025788B2 (en) * 2009-04-24 2011-09-27 Lifescan Scotland Limited Method for manufacturing an enzymatic reagent ink
WO2012042903A1 (ja) * 2010-09-30 2012-04-05 パナソニック株式会社 試薬組成物、センサ、センサシステム及びセンサの製造方法
US8956518B2 (en) * 2011-04-20 2015-02-17 Lifescan, Inc. Electrochemical sensors with carrier field
JP5834599B2 (ja) * 2011-08-01 2015-12-24 オムロンヘルスケア株式会社 センサヘッド、電気化学的センサおよび電気化学的センサの使用方法
JP5584740B2 (ja) 2011-09-26 2014-09-03 アークレイ株式会社 グルコースセンサ
JP5684767B2 (ja) * 2011-09-26 2015-03-18 アークレイ株式会社 乳酸センサ
US20130098775A1 (en) * 2011-10-20 2013-04-25 Nova Biomedical Corporation Glucose biosensor with improved shelf life
US9372167B2 (en) * 2012-04-19 2016-06-21 Aytu Bioscience, Inc. Oxidation-reduction potential test device including a multiple layer gel
US9606080B2 (en) 2012-09-06 2017-03-28 Amrita Vishwa Vidyapeetham Non-enzymatic glucose sensor
CN102914571B (zh) * 2012-09-13 2014-07-09 华南师范大学 一种葡萄糖检测装置及其检测方法
US9788765B2 (en) 2012-09-28 2017-10-17 Dexcom, Inc. Zwitterion surface modifications for continuous sensors
WO2014066533A2 (en) 2012-10-23 2014-05-01 Luoxis Diagnostics, Inc. Methods and systems for measuring and using the oxidation-reduction potential of a biological sample
US9487811B2 (en) * 2013-03-15 2016-11-08 Abbott Point Of Care Inc. Biosensor structures for improved point of care testing and methods of manufacture thereof
US9737250B2 (en) 2013-03-15 2017-08-22 Dexcom, Inc. Membrane for continuous analyte sensors
TWI637167B (zh) 2013-08-07 2018-10-01 日商愛科來股份有限公司 Substance measuring method and measuring device using electrochemical biosensor
JP6402887B2 (ja) * 2014-01-27 2018-10-10 東洋紡株式会社 グルコースデヒドロゲナーゼ組成物
CN103884757A (zh) * 2014-04-18 2014-06-25 苏州怡拓生物传感技术有限公司 一种用于葡萄糖检测的酶电极连续化生产的方法
US20160017399A1 (en) * 2014-07-17 2016-01-21 Lifescan Scotland Limited Electrochemical-based analytical test strip with enzymatic reagent layer containing a naphthoquinone-based mediator and fad-gdh
JP6773406B2 (ja) * 2014-12-24 2020-10-21 アークレイ株式会社 酵素電極
GB201507507D0 (en) * 2015-04-30 2015-06-17 Inside Biometrics Ltd Electrochemical test device
TWI579562B (zh) * 2015-11-11 2017-04-21 Method of Making Electrochemistry Test Specimen
EP4218566A1 (en) 2015-12-30 2023-08-02 Dexcom, Inc. Enzyme immobilized adhesive layer for analyte sensors
JP6773507B2 (ja) * 2016-09-30 2020-10-21 アークレイ株式会社 バイオセンサ、その製造方法、グルコース又はラクテートの濃度測定方法及び濃度測定システム
CN106525939B (zh) * 2016-11-04 2018-07-06 北京农业信息技术研究中心 原位实时监测植物中果糖含量的微电极生物传感器及其应用
KR101749904B1 (ko) * 2016-12-13 2017-06-23 환인제약 주식회사 바이오센서용 산화환원반응 시약조성물
US10359344B2 (en) * 2017-04-21 2019-07-23 Korea Research Institute Of Chemical Technology Composition for clearing of biotissue and clarity method for biotissue using thereof
JP2019002738A (ja) 2017-06-13 2019-01-10 アークレイ株式会社 バイオセンサおよびそれを用いた測定方法
GB2566516A (en) 2017-09-15 2019-03-20 Univ Oxford Innovation Ltd Electrochemical recognition and quantification of cytochrome c oxidase expression in bacteria
CN108802157A (zh) * 2018-06-22 2018-11-13 桂林中辉科技发展有限公司 一种总胆汁酸检测试剂、试纸及检测方法与应用
EP3947710A1 (en) * 2019-04-05 2022-02-09 Instrumentation Laboratory Company Multi-enzymatic biosensors and stabilization of multi-enzymatic biosensors at room temperature
CN111154126B (zh) * 2020-01-16 2022-05-24 哈尔滨工业大学 一种纳米金刚石修饰氮化硼高柔性高导热复合薄膜的制备方法
KR102411089B1 (ko) * 2020-03-06 2022-06-20 (주)케어포유 바이오 센서용 조성물 및 이를 포함하는 바이오 센서
CN113447541A (zh) * 2020-03-27 2021-09-28 爱科来株式会社 生物传感器和使用了该生物传感器的测定方法
JP2023136725A (ja) 2022-03-17 2023-09-29 アークレイ株式会社 バイオセンサを用いた酸化還元酵素の電気化学的測定方法及びそれに用いるバイオセンサ
US20230341347A1 (en) 2022-04-21 2023-10-26 Arkray, Inc. Biosensor
US20230338945A1 (en) 2022-04-21 2023-10-26 Arkray, Inc. Biosensor and method of manufacturing biosensor
CN116144390B (zh) * 2022-12-02 2024-06-21 西安工程大学 相间转移型油泥处理剂及其应用

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE68924026T3 (de) * 1988-03-31 2008-01-10 Matsushita Electric Industrial Co., Ltd., Kadoma Biosensor und dessen herstellung.
US5205920A (en) * 1989-03-03 1993-04-27 Noboru Oyama Enzyme sensor and method of manufacturing the same
JP2796983B2 (ja) * 1989-03-03 1998-09-10 テルモ株式会社 グルコースセンサ
EP0860695B1 (en) * 1995-10-30 2006-01-04 Arkray, Inc. Method for measuring an analyte and corresponding device
EP0884392B1 (en) 1997-06-03 2002-12-18 Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. Cholesterol sensor
JPH112618A (ja) * 1997-06-11 1999-01-06 Matsushita Electric Ind Co Ltd コレステロールセンサおよびその製造方法
US6258229B1 (en) * 1999-06-02 2001-07-10 Handani Winarta Disposable sub-microliter volume sensor and method of making
ATE316651T1 (de) * 1999-11-15 2006-02-15 Arkray Inc Biosensor
ATE543092T1 (de) 2000-10-27 2012-02-15 Arkray Inc Biosensor
JP2003015168A (ja) * 2001-04-27 2003-01-15 Canon Inc 電気泳動粒子、電気泳動粒子の製造方法、および電気泳動表示素子
CN1372137A (zh) * 2002-04-05 2002-10-02 中国科学院长春应用化学研究所 用于生物化学需氧量生物传感器的微生物有机－无机杂化材料膜
JP3910148B2 (ja) * 2003-03-14 2007-04-25 アークレイ株式会社 排気口付き分析用具

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
대한민국 공개특허 제2005-3653호(2005.01.12.)

Also Published As

Publication number Publication date
DE602004028267D1 (de) 2010-09-02
WO2005043146A1 (ja) 2005-05-12
ATE475085T1 (de) 2010-08-15
CN100456032C (zh) 2009-01-28
US20070034512A1 (en) 2007-02-15
EP1679508B1 (en) 2010-07-21
KR20060063996A (ko) 2006-06-12
CN1875265A (zh) 2006-12-06
EP1679508A4 (en) 2009-04-08
EP1679508A1 (en) 2006-07-12
JPWO2005043146A1 (ja) 2007-05-10
JP4088312B2 (ja) 2008-05-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR100814193B1 (ko) 바이오 센서 및 그 제조 방법
US6916410B2 (en) Biosensor
EP1336839B1 (en) Biosensor
Wang et al. Silica sol–gel composite film as an encapsulation matrix for the construction of an amperometric tyrosinase-based biosensor
Turan et al. An effective surface design based on a conjugated polymer and silver nanowires for the detection of paraoxon in tap water and milk
Yang et al. Horseradish peroxidase biosensor based on layer-by-layer technique for the determination of phenolic compounds
KR20130033330A (ko) 락트산 센서
EP3301183B1 (en) Biosensor, production method thereof, and method and system for measuring glucose or lactate
EP2623974A1 (en) Reagent composition, sensor, sensor system, and sensor manufacture process
Rusling et al. Multilayer films of cationic surfactants on electrodes. Control of charge transport by phase
Mousty et al. Alkaline phosphatase biosensors based on layered double hydroxides matrices: Role of LDH composition
Zaitseva et al. Electrochemical property of methylene blue redox dye immobilized on porous silica–zirconia–antimonia mixed oxide
Besombes et al. Improvement of poly (amphiphilic pyrrole) enzyme electrodes via the incorporation of synthetic laponite-clay-nanoparticles
Grinyte et al. Biocatalytic etching of semiconductor cadmium sulfide nanoparticles as a new platform for the optical detection of analytes
Widera et al. Electrochemical oxidation of aniline in a silica sol–gel matrix
JP2021061240A (ja) 新規メディエータ
JP2009294038A (ja) 酵素センサ
Hu et al. Facilitated electron transfer for myoglobin in surfactant–polymer 2C12N+ PVS− composite films on pyrolytic graphite electrodes
Barmin et al. Cyclic voltammetry of ferrocenecarboxylic acid monomolecular films and their reaction with glucose oxidase
Katsuki et al. Biosensor
US20030118735A1 (en) Hybrid organic-inorganic composite film and method for the manufacture thereof
WO2022064177A1 (en) Electrochemical sensor
Tatsuma et al. Controllable electrocatalytic activity of heme peptide in a phase transition gel
WO2002029092A2 (de) Thermostabile, photoinduzierbar redoxaktive einheit zur elektrochemischen detektion von nukleinsäure-oligomer-hybridisierungsereignissen
Ekanayake et al. Fabrication and characterization of nano-structured conducting polymer electrodes for glucose biosensor applications

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
G170 Re-publication after modification of scope of protection [patent]
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20130304

Year of fee payment: 6

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20140228

Year of fee payment: 7

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20150227

Year of fee payment: 8

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20160302

Year of fee payment: 9

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20170303

Year of fee payment: 10

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20180302

Year of fee payment: 11

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20190304

Year of fee payment: 12